regi.tankonyvtar.hu · Web viewa volt Jugoszlávia területén mintegy 16 millió szilvafát betegített meg és pusztított el. A növényvírusok által előidézett termésveszteségekre

A vírusok osztályozásadr. Horváth, József

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerekdr. Horváth, József

Ez a könyv a Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium támogatásával, az Intézményközi Tankönyvkiadási Szakmai Bizottsága jóváhagyásával készült.Szerzői jog © 1999 dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard

Minden jog fenntartva. Bármilyen másolás, sokszorosítás, illetve adatfeldolgozó rendszerben való tárolás a kiadó előzetes írásbeli hozzájárulásához van kötve.


Tartalom1. Előszó ............................................................................................................................................... 12. Bevezetés a virológiába ......................................................... Error: Reference source not found

1. A vírusok jelentősége .............................................................................................................. 22. A vírusok morfológiája és felépítése ...................................................................................... 23. A vírusok replikációja ............................................................................................................. 24. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák) ................................................ 35. A vírusok átvitele, terjedése .................................................................................................... 36. A vírusok diagnosztikája ......................................................................................................... 47. A vírusok elleni védekezés ..................................................................................................... 48. A vírusok eredete .................................................................................................................... 5

3. A vírusok osztályozása és rendszertana ........................................................................................... 61. ................................................................................................................................................ 8

1.1. ................................................................................................................................... 81.1.1. ....................................................................................................................... 8

2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése .......................................................... 93. A vírusnemzetségek általános jellemzése ............................................................................. 234. Új rendszertani javaslatok .................................................................................................... 35

4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb tulajdonságai ................................................................................................................... 354.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusok ............................................................... 45

4. A vírusok adatbázisa ...................................................................................................................... 461. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban ....................................................................... 46

1.1. Az adatbázis elvi szempontjai .................................................................................. 461.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjai ....................................................................... 461.3. A vírusidentifikálás stratégiája ................................................................................. 471.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők) ............................................................................ 47

5. A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai .................................................................... 526. A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai .......................................................... 667. A vírusátvitel módszerei ................................................................................................................. 68

1. Állatvektor nélküli vírusátvitel ............................................................................................. 681.1. Oltással történő átvitel ............................................................................................. 681.2. Mechanikai átvitel ................................................................................................... 69

1.2.1. ..................................................................................................................... 701.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel .................................................. 711.4. Maggal és pollennel történő átvitel ......................................................................... 711.5. Vírusátvitel a talajban .............................................................................................. 72

1.5.1. Gyökérrel történő átvitel ............................................................................. 721.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel ............................................ 72

1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal .................................................................................. 731.7. Vízzel történő vírusátvitel ........................................................................................ 74

2. Állatvektorokkal történő vírusátvitel ................................................................................... 742.1. Levéltetvek .............................................................................................................. 74

2.1.1. ..................................................................................................................... 752.2. Kabócák ................................................................................................................... 762.3. Nematódák (fonálférgek) ......................................................................................... 772.4. Atkák ........................................................................................................................ 772.5. Tripszek ................................................................................................................... 78


A vírusok osztályozása

2.6. Poloskák ................................................................................................................... 792.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék) ...................................................................... 792.8. Pajzstetvek ............................................................................................................... 802.9. Levélbolhák ............................................................................................................. 802.10. Aknázólegyek ........................................................................................................ 812.11. Bogarak .................................................................................................................. 812.12. Sáskák .................................................................................................................... 812.13. Lepkék ................................................................................................................... 812.14. Ászkák ................................................................................................................... 822.15. Fülbemászók .......................................................................................................... 822.16. Csigák .................................................................................................................... 82

3. A vírusátvitel módszertana ................................................................................................... 823.1. Vírusátvitel levéltetvekkel ....................................................................................... 82

3.1.1. ..................................................................................................................... 823.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal .......................................................... 91

3.2.1. ..................................................................................................................... 913.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel) ............................................................ 92

3.3.1. ..................................................................................................................... 923.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkal ............................................................................. 983.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal .................................................................................. 99

4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai ...................................................... 994.1. Köpenyfehérje (CP) ................................................................................................. 994.2. Helper komponens (HC) ....................................................................................... 101

5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai ............................................... 1018. A biotesztek virológiai alkalmazása ............................................................................................ 104

1. A növény–vírus kapcsolat típusai ....................................................................................... 1041.1. ............................................................................................................................... 104

1.1.1. .................................................................................................................. 1042. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia) ....................................................................... 105

2.1. ............................................................................................................................... 1052.1.1. .................................................................................................................. 105

3. A vírusfertőzés mértékének meghatározása ....................................................................... 1114. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei ....................................................................... 1125. A vírusok differenciálása tesztnövényekkel ....................................................................... 1136. A vírusok fenntartása tesztnövényeken .............................................................................. 1157. Gazdanövénykörök ............................................................................................................ 1188. A fás szárú növények virológiai ellenőrzése ...................................................................... 118

8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere ......................................................... 1188.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése ....................................................................... 1198.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése ................................................................... 120

8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszere .......................................... 1218.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése ...................... 1218.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése ....................................... 1228.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése ................................... 125

9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzése ..................................................................... 1269.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjai ................................ 126

9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere ............................................... 1279. Elektronmikroszkópos módszerek ............................................................................................... 128

1. Negatív festéses módszer ................................................................................................... 1282. Immuno-elektronmikroszkópos módszer ........................................................................... 1303. Dekorációs módszer ........................................................................................................... 131



4. Kicsapásos (precipitációs) módszer ................................................................................... 1325. Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei ............................................................................. 1326. Citokémiai vizsgálatok ....................................................................................................... 1347. Immunokémiai vizsgálatok ................................................................................................ 134

10. A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete ....................................................................... 1351. Sejtek és sejtalkotók ........................................................................................................... 1352. Zárványok .......................................................................................................................... 138

2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványok ................................................................... 1382.2. Amorf citoplazmatikus zárványok ......................................................................... 1392.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványok ...................... 1402.4. Kristályos sejtmagzárvány .................................................................................... 141

11. Fénymikroszkópos festéses módszerek ..................................................................................... 1421. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés) ......................................... 1432. Nukleoproteidek azúrkék festése ....................................................................................... 143

2.1. ............................................................................................................................... 1442.1.1. .................................................................................................................. 144

12. A vírusok izolálása és tisztítása ................................................................................................. 1451. A virionok tisztítása fertőzött növényekből ....................................................................... 145

1.1. A vírusok biológiai tisztasága ................................................................................ 1451.2. A vírusok felszaporítása fogékony növényben ...................................................... 1451.3. A feltárás és kivonás körülményei ......................................................................... 1461.4. A vírusoldat szűrése ............................................................................................... 1471.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől ..................................................... 1471.6. A növényi fehérjék elkülönítése ............................................................................ 1471.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése ............................................. 1471.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása ........................................... 148

2. A vírusfehérjék izolálása és tisztítása ................................................................................. 1533. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása ......................................................................... 154

3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból .......................................................... 1543.1.1. .................................................................................................................. 154

3.2. Vírus-DNS kivonása .............................................................................................. 1563.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből .......................................... 157

13. A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja ............................................................... 1601. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei ................................................................ 160

1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata ......................... 1601.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből ............. 1601.3. A protoplasztok virológiai alkalmazása ................................................................. 1611.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek ............................................ 161

2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusai ....................................................................... 1612.1. A nukleinsavak jellemző végei .............................................................................. 1622.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek ...................................................... 1622.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános menete ..................................................... 1622.4. A génkifejeződés általános módjai ........................................................................ 163

3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben ........................................ 1643.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek ....................................................................................................................................... 1643.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinek ................................................................................................................ 1653.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNS .......................................................................................................... 1663.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ek .................................................................................................... 167



3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció ........................................ 1683.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia ................................................ 1683.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációja .................................................................... 1703.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja ............ 1713.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei ............................ 172

4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése ................................................................... 1724.1. Vírus-„szupercsaládok” ......................................................................................... 1724.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről ............................................................. 174

14. Szerológiai vizsgálati módszerek .............................................................................................. 1771. Immunológiai alapfogalmak .............................................................................................. 177

1.1. Az immunválasz .................................................................................................... 1771.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai .................................... 1781.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai ............................................... 1781.4. Antigén–antitest kölcsönhatások ........................................................................... 179

2. Poliklón antitestek előállítása ............................................................................................. 1802.1. A kísérleti állat kiválasztása .................................................................................. 1802.2. Az immunizálás ..................................................................................................... 1802.3. Injektálási módszerek ............................................................................................ 1802.4. Vérvétel és szérumnyerés ...................................................................................... 1812.5. Az IgG tisztítása az antiszérumból ........................................................................ 181

3. Monoklón antitestek előállítása ......................................................................................... 1813.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei .............................................. 183

4. A szerológiai reakciók alaptípusai ...................................................................................... 1864.1. Precipitáció ............................................................................................................ 1864.2. Agglutináció .......................................................................................................... 1874.3. Immunodiffúziós tesztek ....................................................................................... 1874.4. Immunoelektroforézis ........................................................................................... 1894.5. ELISA-módszerek ................................................................................................. 1894.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA) .............................................................................. 1934.7. Immunoblotting ..................................................................................................... 194

5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikában ........................... 19515. A nukleinsavak jellemzésének módszerei .................................................................................. 196

1. Gél-elektroforézis ............................................................................................................... 1962. Nukleinsav-hibridizáció ..................................................................................................... 197

2.1. Dot-blot hibridizáció ............................................................................................. 1982.2. Southern-hibridizáció ............................................................................................ 1992.3. Northern-hibridizáció ............................................................................................ 2002.4. Szendvics-hibridizáció .......................................................................................... 2012.5. Próbakészítés ......................................................................................................... 201

3. Nukleinsav-szekvencia meghatározása .............................................................................. 2034. Polimeráz láncreakció (pcr) ............................................................................................... 204

16. Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok Error: Reference source not found1. A növényi hormonok jellemzése ........................................................................................ 208

1.1. Juvenilhormonok ................................................................................................... 2081.2. Szeneszcenciahormonok ....................................................................................... 210

2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásai ..................................................................... 2113. A növényi hormonok meghatározása ................................................................................. 212

3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása ............................................................ 2143.2. A gibberellinek meghatározása .............................................................................. 2193.3. A citokininek meghatározása ................................................................................. 2223.4. Az etilén meghatározása ........................................................................................ 227



3.5. Az abszcisszinsav meghatározása ......................................................................... 23017. Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek ............................................................... 233

1. Az aktív oxigénformák ....................................................................................................... 2341.1. Szuperoxid gyök (•O2

–) ........................................................................................... 2341.2. Hidrogén-peroxid (H2O2) ....................................................................................... 2351.3. Hidroxil gyök (•OH) .............................................................................................. 2361.4. Egyéb aktív oxigénformák .................................................................................... 236

2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsok 2372.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) ................................................................................. 2372.2. Aszkorbát ............................................................................................................... 2372.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidok ...................................................................... 2382.4. Kataláz ................................................................................................................... 238

3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módja .......................................... 2384. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe ................................................. 241

4.1. Antimikrobiális aktivitás ....................................................................................... 2414.2. Fitoalexinek termelődése ....................................................................................... 2414.3. Hiperszenzitív reakció ........................................................................................... 2414.4. Szisztemikus szerzett rezisztencia ......................................................................... 2414.5. Indukált sejtfal-megszilárdítás .............................................................................. 241

5. Mérési módszerek és értékelésük ....................................................................................... 2425.1. KJ / keményítő módszer ........................................................................................ 2435.2. CeCl3 módszer ....................................................................................................... 2455.3. Ti(IV)Cl4 módszer .................................................................................................. 2465.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer ................................................................. 2475.5. Diaminobenzidin (DAB) módszer ......................................................................... 2475.6. Kemilumineszcenciás módszer ............................................................................. 2485.7. Egyéb mérési módszerek ....................................................................................... 248

18. A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei ....................................................... 2521. A rezisztenciára nemesítés fő irányai ................................................................................. 252

1.1. ............................................................................................................................... 2521.1.1. .................................................................................................................. 252

2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokban ...................................................... 2532.1. ............................................................................................................................... 258

2.1.1. .................................................................................................................. 2583. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei ............................................. 262

3.1. ............................................................................................................................... 2633.1.1. .................................................................................................................. 263

19. A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei .................................................... 2671. Szomatikus hibridizáció ..................................................................................................... 267

1.1. ............................................................................................................................... 2671.1.1. .................................................................................................................. 267

1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai .......... 2702. Molekuláris genetikai módszerek ...................................................................................... 270

2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésével ................................. 2712.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás ..................................... 2712.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás ............................................................. 272

2.2. A kórokozótól származtatott rezisztencia .............................................................. 2742.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia ................................... 2742.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia .................................................... 2782.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia ........................................... 2782.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia ........................... 279



2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia .................. 2792.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa .................. 2792.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa ............................... 280

2.3. Egyéb rezisztenciagének ....................................................................................... 2802.3.1. .................................................................................................................. 281

3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba ............................................................ 2823.1. Az agrobaktériumos transzformálás ...................................................................... 2823.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal ...................... 2853.3. Génátvitel biolisztikus módszerrel ........................................................................ 285

3.3.1. .................................................................................................................. 28520. Függelék .................................................................................................................................... 286

1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének) ellenőrzése és megakadályozása ............................................................................................ 286

1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatok 2861.1.1. .................................................................................................................. 2861.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok ....................................................................... 2871.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma kórokozók ........................................................................................................... 2891.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett zónákban tilos ..................................................................................................... 2891.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak ............. 2891.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus, vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók ......................................................... 290

1.2. Egyéb határozatok ................................................................................................. 2922. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok Európában ............ 2923. Az ábrák eredete ................................................................................................................. 295

Irodalom ........................................................................................................................................... 298


Az ábrák listája1. A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C: bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja) .................................................................................................. 22. A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum cv. Samsun mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) inokulált Brassica rapa var. rapa levelén ............................................................................................................. 63. Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása. dsDNA = kettős szálú dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav, dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav, ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100 nm [Murphy et al., 1995 után] ............................................................................................................. 74. A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127 000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényen; C: Cucumis sativus növény levelén ................................................................................. 115. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) partikulumainak elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán] ............................................................... 126. A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis partikulumai [J. Brandes szívessége folytán] ............................................................................................................................. 147. A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730 nm x 11 nm); B: a rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora (Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi szívessége folytán] .............................................................. 178. A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) természetes úton fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B: egészséges növény .............................................. 199. A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) lövedékszerű partikulumai (230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán] ............................................................................ 2010. A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus) izometrikus partikulumai (31 nm) [A.F. Murant szívessége folytán] ....................................................................................................... 2111. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális) nekrózisokat idéz elő a növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C: Solanum ochroleucum; D: Ocimum gratissimum ........................................................................................................................................ 2312. A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és szisztemikus tünetei Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C) növényeken ........................................... 2413. Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm × 12 nm); B: burgonya S-vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J. Brandes szívessége folytán] ....................................... 2514. A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J. Brandes szívessége folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális léziókat mutató gazdanövényének (Gomphrena globosa) levele .............................................................................................................. 2915. A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28 nm) részecskéinek elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált, urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a vírusrészecskék hexagonális elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett vizsgálat alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C: C.I. Kado, D: A.J. Gibbs szívessége folytán] .................................................................................................................. 3116. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú virionjai (300 nm × 18 nm); B: dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun növény mozaikos és deformált levelei ............................................................................................................................................................ 3217. A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és rövid (B) (46–115 nm) partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel reagáló diagnosztikai növénye ........................................................................................................... 3218. A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) propagatív gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm) [A.J. Gibbs szívessége folytán] .................................... 33



19. A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm) [L.F. Salazar szívessége folytán] ............................................................................................................................................... 3520. A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja. GVL = gazda–vírus lista, VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al., 1990 után] ........................................ 4721. A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után] .................. 6822. A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán] ............................. 6923. A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán] .............. 7024. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán] 7125. Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után] .... 7326. A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán] ............................................................................................................................................................ 7427. Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) átvitel sematikus ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik. JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél [A. Miller szívessége folytán] .............................................. 7528. Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai A-B: Macrosteles fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N. Chiykowski szívessége folytán] ......................................................................................................... 7729. A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával és a petefészekkel. Fg = előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs = utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal és Slykhuis, 1967 után]; B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött búza levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége folytán] ............................................................................................................................................................ 7730. Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán] ..................................... 7831. Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) levélpoloska-vektora [G. Proeseler szívessége folytán] ....................................................................................................... 7932. A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes vaporariorum) populációja dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán] ............................................................... 8033. Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica campestris növény levele [Horváth József szívessége folytán] .................................................................................................. 8134. A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán] ............................................................................................................................. 8235. A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után] ....................................... 8536. A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva [Kunkel, 1977 után] ........................................................................................................................... 8637. A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam (1973) után] ........................................................................................................................................ 9238. A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után] .. 94



39. A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után] ................................ 9440. A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után] ............................ 9441. Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján Noordam, 1973 után] ......................................................................................................................... 9542. A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után] ........................................................... 9643. Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán] 9744. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége folytán] ..... 9845. A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic potyvirus) és B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow fleck bromovirus) szemben [Horváth József szívessége folytán] ........................................................................................................................... 10446. Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált levelein. A: klorotikus léziók belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók dohány gyűrűsfoltosság vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József szívessége folytán] ........................................................................................................................... 10647. Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) inokulált Solanum marginatum mozaikos levele; B: paradicsom magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus) inokulált Nicotiana glutinosa deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált burgonya (Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán] .................................... 10848. A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum szárnekrózisa; B: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik vírussal (turnip mosaic potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A és D: Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán] ................................ 10849. A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek Libertas burgonyafajta gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) által előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás) cukorrépán [Horváth József szívessége folytán] .. . . 10950. A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és B: burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája [Horváth József szívessége folytán] .......... 11451. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán] ......................... 11952. Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán] .... 12853. BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. : normál hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]⇓ ..................... 13054. Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó szétnyomja a gránumokat, a felső halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR = gránum, V = vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968 után] .......................................................................................................................................................... 13555. A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött kínai kel (Brassica pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes széli vezikulumok (V) a kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli vezikulumok kinagyított képe. Nyilak jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét, amely a citoplazmába nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után] .......... 13656. A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus) fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott keményítőszemcsék (nyíllal jelölve) szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja megváltozott, a belső membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt kloroplasztiszban



plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó szakaszában a külső burokkal rendelkező virionok az egész citoplazmában megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók egy közös membránban ................................................................................................................... 13757. Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika alakú virionok egymással párhuzamosan, sorokba rendeződve, számos réteget képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA = központi vakuólum, W = sejtfal [Esau, 1968 után] ......................................................................... 13958. Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a nyalábok egymással szöget bezárva rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA = üregek, V = virionok [Esau, 1968 után] ....................................................................................... 14059. Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes aggregátumok, P = plasztid (kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel) zárvány [Horváth József szívessége folytán] ................................................................................... 14060. Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) fertőzött dohánylevél (Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a zárvány síkjára; B: a metszet egy bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska) [Francki et al., 1985 után] .................................................. 14161. A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N = sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán] ............................................................................................................................................. 14262. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán] ....................... 14663. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után] .................................................................................... 14964. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán] 15465. Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán] ........................................................................................................................... 15566. Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok ............................................................................ 16167. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a növényi sejtben. A: fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D: vírusreplikáz (vagy egy része), E: a replikatív forma keletkezése, F: replikatív intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H: összeépülés, I: kész virionok, RF: replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi) RNS [Érsek és Gáborjányi, 1998 után] ........................................................................................... 16368. A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al., 1991 után] ........................................................................................ 16469. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után] ............................................................................ 16570. A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után] ................................... 16674. A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et al., 1984 után] .................................................................................................................................. 16975. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után] ...................................................................... 17076. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok fehérjegénjeinek hasonló elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus).



VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat jelölik [Matthews, 1985 után] .......................................................................................................... 17277. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) genomszerveződésének hasonlósága a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV = lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus, TMV = dohány mozaik vírus, CP = köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok [Matthews, 1985 után] ..................................................................................................................... 17378. Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után] ........................................................................................................................................ 17779. Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990 után] ................................................................................................................................................. 17980. A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után] ............................................................................................................. 18281. A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után] ................................................................................................................................................. 18882. A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után] ......................................................................................... 19083. A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után] ....................................................................... 19784. A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után] ...................................................... 19985. A blottolás [Sambrook et al., 1989 után] ................................................................................... 20086. A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán] ........................................ 20187. A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után] ....................................................................... 20188. Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, : Végső nick pozíció, →→→→ : Jelölt ⇓szál [Brown, 1990 után] ................................................................................................................... 20289. A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után] ................................................................................... 20390. A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után] ................. 20491. Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS (cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után] .................................................................................................... 20592. Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete ........................................................................................ 20893. A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete ....................................................................................... 20994. A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti képlete ............. 20995. Az etilén szerkezeti képlete ....................................................................................................... 21096. Az abszcisszinsav szerkezeti képlete ......................................................................................... 21197. A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány ............................................................................................................................ 22498. A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után] ............................................ 23399. Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok aktiválásában. RP = receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA• = szalicilát gyök, BA2H = benzoesav-2-hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-Kosack és Jones, 1996 után módosítva] 239100. Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény kapcsolatban [Baker és Orlandi, 1995 után] ........................................................................................................................................ 239101. Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas syringae pv. tabaci) és P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os rasszával fertőzött dohány- és szója-sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok) és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita kapcsolatok [Baker és Orlandi, 1995 után] ..................................................................................... 240102. A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után] .......... 243



103. H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után] .......................................................................................................................................................... 245104. Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után] ................................................ 247105. Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött, jobbról egészséges, kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív rezisztenciája a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben. Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum annuum cv. Bogyiszlói szisztemikus tünetei (D) ............................................................................. 253106. A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív reakció (az inokulált leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237) vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben ............... 260107. A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns rezisztenciagént (R gén) homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont hordozó növényt olyan növénnyel keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént hordozza annak érdekében, hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm elem transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további keresztezésekkel eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó kromoszómarészt, illetve szelektálják a mutáns, vírusfogékony növényeket. P = promóter régió ................................................................. 271108. Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem izogén vonalak analízise (Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént hordozó, vírusellenálló növényt (P1) keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel visszakeresztezik. Az utódnövények közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd azokat újból a homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik nemzedékben szinte a teljes genom – a rezisztenciagént tartalmazó szűk régió kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát majdnem tökéletesen izogén vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A domináns (rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1 hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján két csoportra osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a rezisztenciagénnel azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek átrendeződnek. C: a molekuláris markereket (polimorfizmusokat) összehasonlítják a hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával együtt hasadó markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó szekvenciarészletek, amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a rezisztenciagének ................................ 273109. A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után] ......... 282110. A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött ................................................................... 283


A táblázatok listája1. Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma ................................................................. 102. Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok ........................................................................ 123. A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott vírusrendszer ..................... 354. Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb tulajdonságai .............................. 385. A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló tulajdonságai1 .................. 446. A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ....................................... 527. A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1 .......................................... 668. A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után) 879. Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után) .......................................................................................................................... 8810. Lokális növény-vírus kapcsolatok ............................................................................................. 10611. Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok .................................................................................... 10712. Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel ...................................................................... 11113. Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel ..................................................... 11214. A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása differenciáló tesztnövényekkel (Horváth, 1993a után) ...................................................................................................................... 11415. Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának optimális ideje (Noordam, 1973 után) ........................................................................................................................................ 11516. Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben ................................................................. 11617. A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal kimutatható szőlőpatogén vírusok1 ........................................................................................................................................... 12018. Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996 után)1 ........ 12219. A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után) .................................................................................................... 14220. Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva) ...................................................................................................................... 18321. Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában előforduló jellegzetes ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil, Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision. .......... 21722. Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses tömegspektrumát alkotó fontosabb ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-adenin, [9R]iP = izopentenil-adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil, perMe = permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision. ................................................................. 22523. Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után módosítva) ........... 24224. Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája ........................................................... 25425. A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után módosítva) .................... 25526. A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolat (Boukema, 1984 után) ........................................................................................................................................ 25627. A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után) ............................. 25728. Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága ................................................................................... 25829. A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988 után) 1, 2, 3 ................ 25930. Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után) ..................................................... 26031. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe, 1992 után) .............. 26132. Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva) .................................. 26433. Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei .................................................... 26934. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus növényekben (Miller és Hemenway, 1998) ................................................................................................................................................ 27535. Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1 ............................................................ 28736. Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve fontos vírus, vírusszerű és



viroid kórokozók .............................................................................................................................. 28937. Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve fontos károsítók .......... 29038. Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok) az EPPO-régióban (Smith et al., 1997 után) .................................................................................................................................. 293


1. fejezet - ElőszóA Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tan- és kézikönyv megírását az tette szükségessé, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Georgikon Mezőgazdaságtudományi Karának (Keszthely) Növényvédelmi Intézete elnyerte az Országos Akkreditációs Bizottsághoz benyújtott pályázatát „Növényvirológiai Iskola” (Ph.D.-képzés) megteremtésére. Tekintettel arra, hogy magyar nyelvű vírusmódszertani kiadvány – eltekintve a korábbi években megjelent növényvirológiai könyvekben és folyóiratokban közzétett szűkebb körű ismeretektől – nem áll korszerű formában rendelkezésre a Ph.D. hallgatók számára, ezért nélkülözhetetlennek tartottuk ennek a könyvnek a kiadását. Úgy gondoljuk, hogy Ph.D. hallgatóinkon kívül az agrármérnök, az agrárkémikus agrármérnök, a növényvédelmi szakmérnök és a növényorvosi szak hallgatóinak régi kívánsága teljesül azzal, hogy a Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. tankönyv megjelenik. Reméljük, hogy ezt a könyvet nemcsak az agráregyetemi és főiskolai képzésben, hanem a biológusképzésben részt vevő hallgatók is örömmel fogadják.

Az egyetemi tankönyvet „kigondoló” szerkesztők részéről talán merész vállalkozásnak tűnhet, hogy a módszertani könyv megírását nagyobb részben virológus Ph.D. hallgatóinkra bíztuk. Ezzel azt kívántuk elérni, hogy saját tudományterületük témáiban minél jobban elmélyedjenek, megismerjék a legalapvetőbb módszereket, és azokat úgy írják meg, ahogyan megálmodták egy hazai, „még nem létező” tankönyvben. Az egyes fejezetek végén megtalálható Irodalom az ismeretek szélesebb körű elsajátításában kí-ván segítséget nyújtani.

A szerkesztők és a szerzők köszönetüket fejezik ki mindazoknak, akik a könyv kéziratának elkészülte során hasznos észrevételeket tettek. A kézirat előkészítésében, szerkesztésében nyújtott technikai segítségért hálás köszönetünket fejezzük ki Hun Lajosné, Ihász Zoltánné és Molnár Katalin munkatársainknak. Messzemenő köszönetünket fejezzük ki Balázs Ervin, Barna Balázs, Király Zoltán és Klement Zoltán professzor uraknak azért, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Virológiai Doktori Iskola munkájában közreműködtek és segítették a virológus doktorjelöltek tudományos tevékenységét és e tankönyvben való közreműködését. Köszönetet mondunk azoknak a hazai és külföldi kollégáinknak és kiadóknak, akik eredeti és már megjelent értékes ábráikat rendelkezésünkre bocsátották. Nem utolsó sorban köszönetettel tartozunk a könyv lektorainak, akik észrevételeikkel és tanácsaikkal gazdagították a könyvet. Köszönet illeti a Mezőgazda Kiadót és minden pártfogó támogatót, hogy e könyv megjelentetését elősegítették.

A Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tankönyvet azzal a gondolattal bocsátjuk útjára, hogy felhívjuk vele a figyelmet a rohamosan fejlődő növényvirológia fontosságára és elősegítjük az egyetemi hallgatóknak és a Doktori Iskola Ph.D. hallgatóinak munkáját, ismereteik gyarapodását, továbbá a tudományba vetett hitük megőrzését és továbbadását.

Keszthely–Budapest, 1998 novemberében

Horváth József Gáborjányi Richard

intézetigazgató egyetemi tanár, egyetemi magántanár,

az MTA lev. tagja az MTA doktora

Pannon Agrártudományi Egyetem Magyar Tudományos Akadémia

Növényvédelmi Intézet, Növényvédelmi Kutatóintézete,

Keszthely Budapest


2. fejezet - Bevezetés a virológiába1. A vírusok jelentőségeA vírusok az élővilág olyan parazitái, amelyek növényekben, emberekben, állatokban, rovarokban és különböző mikroorganizmusokban többnyire súlyos megbetegedéseket idéznek elő. A vírusbetegségek (himlő, veszettség, sárgaláz, sertéspestis, Eupatorium sárgalevelűség, tulipán színtörés) hosszú idők óta ismertek, bár etiológiai kutatásuk és fertőzőképességük bizonyítása csak a XIX. század végén kezdődött el. Finlay 1881-ben igazolta a sárgaláz víruskórokozójának átvitelét Aedes aegypti csípőszúnyoggal, Mayer 1886-ban a dohány mozaik betegséget okozó vírus átvitelét fertőző dohánynövény szövetnedvével, Loeffler és Frosch pedig 1898-ban bizonyította a szarvasmarhák száj- és körömfájás-betegség víruskórokozójának szűrhetőségét. Jelenlegi ismereteink szerint a vírusok a Földön mindenütt előfordulnak. Csupán Európában mintegy ezer növényi vírusbetegség ismert; a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a volt Jugoszlávia területén mintegy 16 millió szilvafát betegített meg és pusztított el. A növényvírusok által előidézett termésveszteségekre vonatkozóan (több mint 30 vírus esetében) Pennazio et al. (1996) közölt legújabban összefoglaló tanulmányt. Az ember- és állatpatogén influenzavírusok (A és B típus) 8–10 évenként igen jelentős epidémiákat, néha pandémiákat okoznak. A XX. században három, nagy morbiditással és gyors terjedéssel járó vírus-influenzapandémiát figyeltek meg. Az első az ún. „spanyolnátha” volt, amely 1918 áprilisában lépett fel, és mintegy 20 millió ember halálát okozta. A második, az ún. „ázsiaiinfluenza”-járvány 1957-ben alakult ki (Bakács és Farkas, 1965). A harmadik járványt – amely 1968/1969-ben az Amerikai Egyesült Államokban lépett fel – az influenzavírus ún. „Hongkong” típusa idézte elő.

2. A vírusok morfológiája és felépítéseA vírusok olyan fertőzőképes, szubmikroszkopikus obligát sejtparaziták, amelyeknek szférikus (izometrikus) formái 20–200 nm átmérőjűek, megnyúlt pálcika, ill. fonál alakú formái 100–2000 nm hosszúságúak és 10–20 nm átmérőjűek. A vírusok nagyobb része helikális szimmetriájú; egyes baktériumvírusok (bakteriofágok) binálisak (1. ábra). A geminivirusoknak iker virionjaik vannak. A vírusok a genetikai információt hordozó egyszálú, kétszálú, lineáris vagy cirkuláris ribonukleinsavból (RNS) vagy dezoxiribonukleinsavból (DNS) és a nukleinsav védelmi funkcióját ellátó fehérjeburokból (kapszid) állnak. A nukleinsav és a kapszid együttesen alkotja a nukleokapszidot. Az ilyen összetételű vírusokat burok nélküli (non-enveloped) vírusoknak nevezzük [pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), rovarpatogén iridovirus stb.]. A vírusok egy másik részénél a nukleokapszidot még egy külső glükoproteid burok (peplon) veszi körül [pl. paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus), valamint néhány növény- és rovarpatogén rhabdovirus]. Egyes vírusok még különböző mértékben lipideket, cukrot és nyomokban poliaminokat is tartalmaznak.

1. ábra - A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C: bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja)

3. A vírusok replikációja


Bevezetés a virológiába

A vírusok saját anyagcserével nem rendelkeznek, replikációjukhoz a gazdasejt fehérje- és nukleinsav-szintetizáló képességét használják fel. A replikáció során a gazdasejt tevékenységét úgy programozzák át, hogy a sejt saját anyagai elősegítsék új virionok bioszintézisét (produktív infekció). Bizonyos ember-, ill. állatpatogén vírusok képesek a gazdasejt rosszindulatú átalakítására is (malignus transzformáció); ebben az esetben a sejtek a rákos sejtekhez válnak hasonlóvá. Produktív infekció esetén a vírusok replikációja hat szakaszra osztható: (1) adszorpció, (2) penetráció, (3) dekapszidáció, (4) eklipszis, (5) maturáció, (6) kiszabadulás. Az adszorpciós fázisban a sejt felszíne és a virion között stabil kötődés jön létre. A penetráció során a virion különböző mechanizmusokkal (növényvírusoknál vektorok segítségével, állatpatogén vírusoknál fagocitózis-szerű folyamattal, baktériumvírusok esetében nukleinsav-„belövéssel”) jut be a sejtbe. A penetráció után a virion dekapszidálódik. E folyamatban egyes vírusoknál ún. kapszid fehérjéket bontó enzim vesz részt, más vírusoknál (pl. influenzavírus) pedig a peplon egyesül a sejtmembránnal és a citoplazmába csak a nukleokapszid hatol be. Az eklipszis szakaszban a vegetatív vírus nukleinsavban tárolt információi nukleinsav-polimerázok segítségével új nukleinsavak képződését eredményezik (replikáció). Hasonlóan fontos a nukleinsavat bontó nukleázoknak (RNázok, DNázok) és a nukleinsavtöréseket összekapcsoló, valamint a vírusnukleinsavnak a sejtgenomba történő beépítését végző ligázoknak a szerepe. A vírusnukleinsav replikációjával párhuzamosan kezdődik a vírusfehérjék szintézise. A maturációs (érési) szakaszban a szintetizálódott nukleinsav-, a fehérje- és az egyéb komponensek érett, fertőző vírusokká egyesülnek. Az összeépülés az izometrikus RNS-tartalmú vírusoknál a nukleinsav- és a fehérjealegységek fizikokémiai konfigurációjából adódóan csak egyféle virion kialakulásához vezethet. Más vírusok spontán is aggregálódhatnak, de ismertek olyanok is (pl. adenovirusok), amelyeknek az alkotórészei nem tudnak minden esetben komplett virionná összeépülni, és ún. „üres” köpenyfehérje-burkok jönnek létre. A vírusok replikációjáról A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja című fejezetben találhatók részletes ismeretek.

4. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák)A vírussal fertőzött gazdaszervezetben morfológiai, citológiai, fiziológiai stb. elváltozások figyelhetők meg, amelyek külső és belső tünetekben nyilvánulnak meg. A növényvírusok a fertőzött sejtek plazmodezmáin keresztül hatolva fertőzik meg a szomszédos sejteket (4–80 µm/óra terjedési sebesség), majd a szállítószövetekben, a floemben és a xylemben 0,1–1,8 cm/óra sebességgel képesek terjedni. A hiperszenzitíven reagáló növényi szövetekben a vírusok terjedése a nekrotizálódó sejtek miatt megáll. Az állatpatogén vírusok a nyirok- és véredényekben vagy az idegpályákon keresztül terjednek. A rovarpatogén vírusok orális felvételt követően a gyomorba jutva lokalizálódhatnak, vagy a hemolimfán keresztül más szövetbe (zsírszövet, szaporítószervek, idegrendszer) jutnak. A tünetek a fertőzést követő néhány nap múlva megjelenhetnek (növény-, ember- és állatpatogén vírusok), míg a bakteriofágok esetében néhány perc alatt. Ismeretesek ún. „lassú” vírusok is, amelyek néhány hónap (veszettség vírus), ill. 1–2 év alatt (fás szárú növények vírusai) manifesztálódnak. A növényvírusok külső tünetei szín- és formaelváltozásokban jutnak kifejezésre (abnormális kalluszképződés, sejtfalvastagodás, amorf és kristályos zárványok). Az ember- és állatpatogén vírusok által előidézett betegségtünetek (láz, fej- és izomfájás, étvágytalanság, fokozott váladékképződés), hasonlóan a növényvírusok tüneteihez, nem specifikusak. A legfontosabb betegségszindrómák az alábbi csoportokba sorolhatók: idegrendszeri, légúti, légzőszervi, bőr- és nyálkahártya-, szem-, máj-, emésztőszervi, nyirok- és lázas betegségek.

5. A vírusok átvitele, terjedéseMinden növényvírus átvihető fogékony gazdanövényére kertészeti oltással, de természetes terjedésük főképpen vektorokkal (levéltetvek, kabócák, fonálférgek, talajban élő gombák) és parazita növényekkel (Cuscuta spp.) történik. A vektormentes átvitelen kívül a vegetatív szaporítószervekkel (gumó, hagyma, rizóma), a generatív szaporítószervekkel (mag, pollen) és a mechanikai úton történő terjedésnek van jelentősége. Az ember- és állatpatogén vírusok terjedésében a kontakt átvitelnek, a csepp- és bőrfertőzésnek, a transzplantációnak és a passzázsnak (tojás, anyatej) van jelentősége. A vírusok igen széles körű elterjedése, tág gazdaköre, valamint a kedvező ökológiai körülmények sok esetben időben és térben egybeeső epidémiák kialakulását, vagy olyan pandémiák kialakulását eredményezi, amelyek kiterjedése és időtartama határtalan. Az epidémiák és pandemiák kialakulásában az ember direkt és indirekt szerepén kívül igen fontos szerepet játszik a növények esetében a rezisztencia hiánya, a megnövekedett nemzetközi forgalom stb. Az ember- és állatpatogén vírusoknál az ökoszisztémában bekövetkezett változások, a széles körben elterjedt háziállat–ember kapcsolattal együttjáró víz- és táplálékkontaminációk, valamint a vektorpopulációk által terjesztett számos vírus olyan betegségek epidémiáját és pandemiáját képes előidézni, mint pl. a veszettség, influenza stb.



6. A vírusok diagnosztikájaVírusbetegségnek csak az tekinthető, aminek víruskórokozóját sikerül izolálni, antigénjeit a gazdaszervezetben kimutatni és/vagy a betegséget mesterséges inokulációval reprodukálni. A vírusfertőzés következtében fellépő tünetek (szimptómák) alapján bizonyos vírusokra lehet következtetni, de a gazda–vírus reakciókat befolyásoló környezeti tényezők jelentős volta, továbbá a számos látens és lassú fertőzés (slow vírusok) miatt a szimptomatológia egyedül igen megbízhatatlan a vírusok diagnosztikájában. A vírusok mesterséges átvitele tesztnövényekre, tesztállatokra, valamint olyan objektív diagnosztikai eljárások, mint pl. az ELISA-módszer, a komplementkötési reakció, a hemaglutináció, a neutralizáció, az elektronmikroszkópia, az immuno-elektronmikroszkópia, az RNS-DNS hibridizáció, a polimeráz láncreakció (PCR) stb. jelentős szerepet játszanak a vírusok azonosításában. A vírusok fizikai tulajdonságain (hőinaktiválási pont, in vitro eltarthatóság, hígíthatóság stb.) alapuló diagnosztika megbízhatatlan.

7. A vírusok elleni védekezésA vírusokkal mint fertőző betegségekkel szembeni védekezés két csoportba osztható: (1) megelőzés (profilaxis) és (2) gyógyítás (terápia). A növényvírusokkal szembeni preventív eljárások közül a rezisztenciára nemesítésnek (rezisztens fajták előállításának), a vírusmentes szaporítóanyagok használatának, a fertőzési források (gyomnövények), a vírusátvitelben szerepet játszó vektorok elpusztításának és a karantén rendszabályok betartásának a legnagyobb a jelentősége. Újabban eredményeket értek el a gyenge vagy gyengített vírustörzsek preimmunizálásával kapcsolatban. A keresztvédettség (cross protection) jelenség néven ismertté vált biológiai védekezés lényege az, hogy egy vírus gyenge, enyhe megbetegedést okozó törzse védelmet nyújt ugyanazon vírus súlyos betegséget előidéző törzsének fertőzésével szemben, és ez utóbbi vírus szaporodása is jelentősen csökken. A biotechnológiai módszerek közül figyelmet érdemel a köpenyfehérjegénnel, a szatellit RNS-sel, az értelmetlen (antiszensz) nukleinsavval és a defektív interferáló molekulákkal kialakított indukált rezisztencia. A biotechnológiai módszerek alkalmazását a növényvírusok ellen azok az elmúlt években történt biológiai, biokémiai és molekuláris biológiai felfedezések tették lehetővé, amelyekkel ismertté vált az egyes szervezetek működését ellenőrző gének megismerése és megváltoztatása. A génsebészeti, ill. a génátültetési módszerek felhasználásával forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben. Egyes vélemények szerint 1–2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a genetikailag módosított, azaz transzgénikus növény lesz. A transzgénikus növények előállításával kapcsolatban részletes adatok találhatók A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei c. fejezetben.

A terápiai eljárások közül főképpen a hőterápiának és a regenerációs terápiának (merisztéma kultúra) van jelentősége. A növényvírusok – és általában a vírusok – elleni kemoterápiát (vírusellenes anyagok) igen nagy mértékben hátráltatja az a tény, hogy a vírusoknak nincs önálló anyagcseréjük, ezért az in vivo végzett kemoterápikumok nemcsak a kórokozót, hanem a gazdasejtet is károsítják. Ennek ellenére egyes vírusellenes szerek (pl. Ribavirin, Tiazofurin, Pyrazofurin) tápoldatba adásával sikerült egyes vírusok [pl. burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus)] szaporodását merisztéma kultúrában gátolni, vagy megszüntetni. Újabban metil-benzimidazol-2il-karbamát tartalmú gombaölő szerekkel is (pl. Benlate, Bartstin) sikerült mérsékelni egyes növényvírusok tünettani hatását.

A növényvírusok elleni védekezéssel kapcsolatos antivirális, kémiai anyagokról Gáborjányi és Tóbiás (1986a,b), Hansen (1988, 1989), Schuster (1988), Kluge et al. (1990), Tallóczy és Gáborjányi (1990), Yordanova et al. (1996), valamint Horváth (1999) munkái adnak összefoglaló áttekintést.

Az ember- és állatpatogén vírusok elleni preventív védekezésben az a lényeges különbség, hogy a gerincesekben, beleértve az embert is, a vírusfertőzésre immunreakció lép fel, amelyet igen hatásosan lehet felhasználni. A preventív védekezés a vírus terjedésének megakadályozására (hygiene, fertőtlenítő rendszabályok betartása, vektorok elleni védekezés, az emberre veszélyes állati gazdák eliminálása), védőoltásokra, premunizálásra és a karantén-rendszabályok betartására terjed ki, míg a terápia (gyógyítás) a tüneti kezelésre és a kémiai gyógyításra szorítkozik. Az aktív immunizálás (védőoltás) humorális immunitást és a celluláris immunreakció aktiválását indukálja, ezáltal a legfontosabb profilaktikus eljárás. Ilyen pl. az influenza elleni védőoltás (kisgyermekeknek, 65 év feletti és veszélyeztetett személyeknek), amely 1 évig, vagy a sárgaláz elleni védőoltás (fertőzött területekre utazóknak), amely 10 évig jelent védettséget. A járványos gyermekbénulás ellen az 1970-es években bevezetett „Kiterjesztett Immunizációs Program” (Expanded Programme on Immunization = EPI) eredményeként a WHO becslése szerint több mint 400 ezer gyermeket sikerült megmenteni attól, hogy nyomorékká váljon, és remélhetőleg ez a járványos betegség az ezredfordulóra megszűnik. A premunizálás (nem specifikus védelmi szisztéma) mind profilaktikusan, mind terápikusan rövid



idejű védelmet jelent az emberre és az állatra egyaránt. Ezt igazolják az interferonnal végzett kutatási eredmények, amelyeket a különböző daganatokat előidéző vírusok ellen használnak. Az interferon nincs hatással a vironra; hatását úgy fejti ki, hogy egy másik mRNS transzkripcióját depresszálja. Ez a mRNS a riboszómákban egy sejtfehérjének (antivirális protein, AVP) a transzlációját segíti elő, ami gátolja a vírusfehérjék transzlációját úgy, hogy a vírus-mRNS-t nem engedi a riboszómákhoz kötődni. Széles körű használatának gátat szab a toxikusság, a toleranciafázis és a szelektivitás (arra a szervezetre hat, amely termelte). A tüneti kezelésre irányuló terápia a betegség klinikai megjelenését (pl. láz, vérnyomásváltozás) veszi figyelembe, noha jól ismert, hogy vírusellenes szer nem áll rendelkezésre. Krónikus és látens vírusfertőzések egyáltalán nem befolyásolhatók, mivel nem ismeretes, hogy a vírust, ill. a vírusgenomot a sejtből hogyan lehet eltávolítani.

Ennél sokkal fontosabb és egyben igen veszélyes probléma az, hogy az antivirális anyagok gyakran rezisztens vírusmutánsok kialakulásához vezetnek. Az antivirális terápia megválasztásánál fontos szempont a fertőzési stádiumnak és a replikáció stádiumának megfelelő antivirális anyagok kiválasztása. A penetrációs szakaszban a fehérje kapszid gátlására influenza A-vírus esetén ciklikus aminok használata javasolt. Az orthomyxo- és togavirusok penetrációs folyamatát gátolja pl. az amantadin, amelynek sósavas sója Viregyt néven ismert Magyarországon. A ciklikus aminok (pl. Amantadin) gátolják az influenza A-vírust a korai fertőzési szakaszban, és emellett jó profilaktikus hatásuk is van. A transzkripciót gátló szerek közül ismert a Rifampicin, amely a mRNS átírásához szükséges polimeráz enzimeket gátolja. A transzlációt gátló kemoterapikumok közül legismertebb a Marboran, amely főleg az adeno- és herpesvírusok ellen hatásos. A nukleinsav-szintézis gátlására alkalmasak a polimeráz enzimek szintézisére ható moroxidinszármazékok és a Virazol, amely kísérleti állatokban gátolja a herpesvírus és több influenzavírus szaporodását. A pirimidin-analógok a purinanalógokkal ellentétben toxikus mellékhatást eredményeznek, noha egyes vírusfertőzések (pl. herpes simplex) ellen hatásosak. A purinanalógok (Acyclovir) hatásosak a herpesvírusok ellen és kevésbé toxikusak.

A növényvírusok (vírusbetegségek) elleni védekezési lehetőségeket Hadidi et al. (1998) legújabb kézikönyve tárgyalja.

8. A vírusok eredeteA vírusok eredete extrém alkalmazkodóképességük és gyors változékonyságuk miatt ma még ismeretlen, de számos lehetséges teória van arra vonatkozóan, hogy a növény- és állatvírusok közös eredetűek (Goldbach, 1986; Roossinck, 1997). Tekintettel arra, hogy a vírusok obligát sejtparaziták, létezésük csak a sejtes élőlények megjelenésével együtt vagy azok megjelenését követően képzelhető el, és mint genetikai szintű paraziták, csak az élettel párhuzamos evolúciós múltra tekinthetnek vissza. Ezt bizonyítja az a tény is, hogy a jelenleg ismert növényvírus-nemzetségből 52-nek (több mint 80%) a genomja RNS, és leginkább (46) egyszálú RNS. Egyre több bizonyíték van arra, hogy a vírusok vagy azok egy része a sejtből alakult ki úgy, hogy a sejtek hosszú időn át, egymást követő mutációk eredményeképpen elvesztették enzimrendszereiket és emiatt függő viszonyba kerültek egy másik sejttel szemben, amelynek enzimjeit a reprodukcióhoz felhasználhatta. A sejtből származás elvét támogatja az, hogy például egyes pozitív szálú RNS-vírusok és az RNS-tartalmú bakteriofágok nukleinsava inkább hasonlít a gazdasejthez, mint egymáshoz. Ismert az is, hogy a gazdasejtben szaporodó vírus-RNS molekulák és a gazdasejt nukleinsava között a riboszómakötő helyek számát tekintve hasonlóság van. A szomszédos nukleotid párok gyakoriságának vizsgálata során összefüggések mutathatók ki a vírus-DNS és a sejt-DNS szerkezete között.

A vírusokban és a különböző élőlényekben a nukleinsavak kapcsolatai és kölcsönhatásai igen szorosak és sokrétűek. A vírusok evolúciójában a kapszidnak alapvető jelentősége van, ui. a fertőzés természetes körülmények között csakis a védett génállományú virion útján lehetséges. A vírusok evolúciója tehát az élet evolúciójával párhuzamos genetikai információ-evolúciónak az eredménye. Érdemes megjegyezni, hogy morfológia, replikációs stratégia és vektortípusok alapján történő víruscsoportosítás valószínűleg tükrözi evolúciós kapcsolataikat, mivel a közös jegyek (tulajdonságok) azok, amelyeket a közös „őstől” örököltek. Az a tény, hogy kevés víruscsoportnak (nemzetségnek) van hasonló tulajdonság-együttese, arra utal, hogy a különböző csoportoknak (nemzetségeknek) különböző az eredete. Ez azt jelenti, hogy a vírusok polifiletikus eredetűek. Az a tény, hogy az egyes víruscsoportok tagjai különböznek egymástól a gazdanövénykörben és a vektorokban arra utal, hogy a növényi vírusfajok létrejöttének oka (vagy eredménye) az új gazda-, ill. vektorfajok megszerzése.

A vírusok evolúciójában kétséget kizáróan a mutáció, a rekombináció és a gének újrarendeződése (génkicserélődés) játszotta a legfontosabb szerepet (Chenault és Melcher, 1994; White et al., 1995; Hu és Ghabriel, 1996; Roossinck, 1997).


3. fejezet - A vírusok osztályozása és rendszertanaA vírusok fejlődéstörténeti rokonsága még nem tisztázott, csak egyes részletei ismertek, ezért egységes osztályozásuk nehézségekbe ütközik. Tekintettel arra, hogy a vírusok egy része (pl. rhabdovirusok) növényekben és rovarokban is szaporodik, ezért a gazdák szerinti osztályozás tudományos szempontból nem elfogadható. Ennek ellenére a könnyebb áttekinthetőség, valamint számos alapvető ismeret hiánya miatt a vírusokat gyakorlati szempontból a következők szerint csoportosíthatjuk: (1) növény-, (2) ember-, (3) állat-, (4) rovar-, (5) baktérium-, (6) gomba-, (7) alga- és (8) fitoplazmavírusok.

A vírusokkal kapcsolatos kezdeti kutatások során megállapítást nyert, hogy a virionok fénymikroszkóppal nem láthatók, táptalajon nem tenyészthetők és nem szűrhetők. A szűrhetőség volt az egyetlen olyan fiziko-kémiai tulajdonság, amelyből következtetni lehetett a vírus méretére. A legtöbb tanulmány ebben az időben a vírusok fertőzőképességével foglalkozott. Ezért a vírusok osztályozásának kezdeti próbálkozásai az általános patogén tulajdonságokat, ökológiai tulajdonságokat és az átvitel lehetőségeit vették figyelembe. A vírusokat a növényvírusok által előidézett tünetek (szimptómák) alapján csoportosították (vulgáris nevezéktan). Az azonos tüneteket mutató vírusokat egy csoportba sorolták („mozaik vírusok”), ahova olyan vírusok tartoztak (pl. dohány mozaik vírus = tobacco mosaic tobamovirus, karfiol mozaik vírus = cauliflower mosaic caulimovirus) (2. ábra), amelyekről ma már tudjuk, hogy tulajdonságaikban teljesen eltérnek egymástól.

2. ábra - A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum cv. Samsun mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) inokulált Brassica rapa var. rapa levelén

A vulgáris nevezéktant később az ún. számkatalogizáló nevezéktan váltotta fel. A számkatalogizáló nevezéktan sem vitte előbbre a fejlődést, és lényegében alig jelentett változást a vulgáris nevezéktanhoz képest. A számkatalogizáló nevezéktanra jellemző, hogy a vírust a fő gazdanövény vulgáris (pl. tobacco = dohány), vagy latin genusznevével (pl. Nicotiana) és a vírus szóhoz csatolt számmal jelölte (pl. tobacco virus 1 vagy Nicotiana virus 1).

A számkatalogizáló nevezéktant később egy újabb nómenklatúra-rendszer váltotta fel, illetve egészítette ki. Ez az új nevezéktan csak annyiban tért el a számkatalogizáló nevezéktantól, hogy azt még a vírus egy speciális tulajdonságával egészítette ki. Így pl. a tobacco virus 1, illetve Nicotiana virus 1 az új nevezéktan alapján nagyfokú hőtoleranciája miatt a Nicotiana virus altathernus nevet kapta.

Az 1930-as évek végén Holmes (1939) egy újabb rendszert dolgozott ki. A kettős nevezéktan vagy binominális nómenklatúra az élő szervezetek elnevezéséhez hasonlóan nemzetség- és fajnevet használ. Az elnevezések alapját azonban ebben a rendszerben is a fő gazdanövényeken okozott tünetek képviselik. A mozaik típusú betegségeket a binominális rendszer pl. „Marmor” néven csoportosította, és a tobacco mosaic virust Marmor tabaci névvel jelölte.

A növénypatogén vírusoknak a fenti elvek alapján történt elnevezése egyre inkább tarthatatlanná vált. Bebizonyosodott ti., hogy a vírusok által előidézett szimptómák még ugyanabban a gazdanövényben is eltérőek


A vírusok osztályozása és rendszertana

lehetnek, amelyet a külső környezeti feltételek is lényegesen befolyásolhatnak, továbbá ugyanahhoz a vírusfajhoz tartozó különböző törzsek szimptomatológiailag ugyanabban a gazdanövényben eltérően viselkedhetnek. A fő szimptómákra alapozott vírusnevezéktan tehát nem bizonyulhatott véglegesnek. Először Bawden (1950) vetette fel, hogy a vírusok csoportosítására a virion tulajdonságai a legalkalmasabbak. Ennek figyelembevétele alapján született meg a növénypatogén vírusok újabb csoportosítása, amelynek alapját a pálcika alakú vírusok (rod-shaped viruses), ill. a fonal alakú vírusok (filamentous viruses) képezték (Brandes és Bercks, 1965). A pálcika, ill. a fonal alakú vírusokat hat csoportba sorolták, és mindegyik csoportot egy-egy jól ismert, reprezentatív vírusról nevezték el: (1) tobacco rattle virus csoport, (2) tobacco mosaic virus csoport, (3) potato virus X csoport, (4) potato virus S csoport, (5) potato virus Y csoport és (6) beet yellows virus csoport.

Lwoff et al. (1962), Lwoff és Tournier (1966) véleménye szerint a virion szerkezetére vonatkozó négy jellemző tulajdonság alapján is lehetőség van a vírusok osztályozására. Ez a „lényeges integránsnak” nevezett négy jellemző tulajdonság a következő: (1) genetikai anyag, DNS vagy RNS, (2) virion-szimmetria, (3) nukleokapszid: csupasz vagy burkolt és (4) mennyiségi adatok (a nukleokapszid átmérője, a kapszomérek száma).

Az Ideiglenes Vírus Nómenklatúra Bizottság (Provisional Committee of Nomenclature of Viruses, P.C.N.V.) 1966-ban újabb ajánlatokat terjesztett elő, amelyet Pereira (1966) a következőkben körvonalazott: a) az állatok, növények és baktériumok vírusait egyetlen törzsben (Vira) kell csoportosítani, b) a törzset altörzsekbe, osztályokba, rendekbe, családokba, nemzetségekbe és fajokba kell beosztani, c) a nemzetségeknek latin vagy latinos nevet kell adni „virus” szóvégződéssel. Mindegyik nemzetséget egy jól ismert, autentikus fajjal kell tipizálni. A típusfajt nemzetközi kultúra-kollekcióban kell fenntartani, d) minden családot egy típusnemzetségről kell elnevezni, amelyhez az „idae” toldalékszócskát kell csatolni, e) a kódban ne legyen elsőbbségi jog, f) a P.C.N.V. elé olyan hagyományos névjegyzéket kell terjeszteni, amelyben fenntartják a közhasználatban levő vírusneveket, g) személyek neveivel, anagrammákkal, betűjelzésekkel, hibridnevekkel vagy értelmetlen nevekkel megjelölt taxonok nem fogadhatók el, és h) az elfogadható új neveket jogi bizottság útján a Nemzetközi Nómenklatúra Bizottság (International Committee of Nomenclature, I.C.N.) elé kell terjeszteni.

A Gibbs et al. (1966), Gibbs (1969) által előterjesztett alternatív rendszer nem kísérli meg a vírusoknak mint konvencionális organizmusoknak a kezelését. Rendszerük az ún. Adanson-féle elveken alapszik, azaz az organizmusok csoportosításának olyan módszerén, amely a legtöbb közös vonást veszi figyelembe. Gibbs és munkatársai (1966) azzal indokolják elképzelésüket, hogy jelenleg nem ismerik eléggé az egyes tulajdonságok relatív fontosságát, ezért valamennyi jellegzetesség egyformán fontos. Gibbs et al. (loc. cit.) szerint a vírusokat népnyelvi, triviális nevekkel és az egyes ismert és még nem ismert tulajdonságokat tartalmazó kriptogrammal kell megjelölni.

A Vírusok Nemzetközi Nómenklatúra Bizottsága (ICNV) 1973-ban Vírustaxonómiai Nemzetközi Bizottsággá (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) alakult. Az ICTV jelenleg 6 albizottságból, 45 csoportból és mintegy 400 virológusból áll. Az ICTV mexikói értekezletén két víruscsalád és 24 vírusnemzetség elnevezését fogadta el (Wildy, 1971). Ezt követően az ICTV 1971 és 1991 között öt jelentést állított össze, amelyben megtalálhatóak azok az újabb eredmények, amelyek a vírusok osztályozásával és elnevezésével kapcsolatosak (Wildy, 1971; Francki et al., 1991). Az ICTV hatodik jelentésében már 164 nemzetségbe és 24 nem végleges nemzetségbe tartozó, több mint 3600 vírusfajról számol be (Murphy et al., 1995).

A jelenlegi univerzális vírustaxonómiai rendszer az alábbi négy kritériumra épül: (1) a vírusgenom típusa, (2) a vírusgenom egy- vagy kétszálúsága, (3) a fordított transzkripció (átírás) lehetősége, (4) a vírusgenom polaritása (Murphy et al., 1995; Mayo, 1996; Pringle, 1998; Mayo és Pringle, 1998).

A legújabb vírustaxonómiai kiadvány (Murphy et al., 1995) vázlatosan, diagramokban szemlélteti a víruscsaládokat és nemzetségeket, a vírus fő gazdája (primer gazda) szerint. A növényeket (primer gazdákat) fertőző vírusok kettős szálú dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsDNA) és egyszálú dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (ssDNA), valamint egyszálú ribonukleinsav-tartalmú (ssRNA) és kettős szálú ribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsRNA) csoportosíthatók (3. ábra).

3. ábra - Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása. dsDNA = kettős szálú dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav, dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav, ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100 nm [Murphy et al., 1995 után]



Az egyszálú RNS-vírusok (ssRNA) tovább csoportosíthatók negatív (–) értelmű [ssRNA(–)] és pozitív (+) értelmű [ssRNA(+)] vírusokra. A negatív (–) jelölés azt fejezi ki, hogy a negatív szálú vírusok esetében szükség van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A pozitív (+) jelölés azt fejezi ki, hogy a vírus-RNS hírvivő (messenger) RNS-ként viselkedik, ami arra utal, hogy sejtmentes transzlációs rendszerekben közvetlenül képes fehérjék átírására.

1.1.1.1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Vírusrendek

A vírusrend a víruscsaládok csoportjából áll. A vírusrendeket a -virales képző (rag) fejezi ki. A növénypatogén vírusok jelenlegi ismereteink szerint két rendbe (Mononegavirales, Nidovirales) sorolhatók (Pringle, 1998).

1.1.1.1.2. Víruscsaládok és alcsaládok

A víruscsaládok a vírusnemzetségek csoportjából állnak; közös tulajdonságokkal rendelkeznek és megkülönböztethetők más víruscsaládok tagjaitól. A víruscsaládokat a -viridae képző (rag) fejezi ki, pl. Potyviridae, ahova több vírusfaj is tartozik (burgonya Y-vírus = potato Y potyvirus). A víruscsaládok nagy része különbözik a virion morfológiájában, a genomstruktúrában, a replikációs stratégiában stb. Négy családban (Poxviridae, Herpesviridae, Parvoviridae és Paramyxoviridae) ún. alcsaládok bevezetésére került sor, amelyek jelölésére a -virinae képzőt használják, pl. Alphaherpesvirinae.

1.1.1.1.3. Vírusnemzetségek

A vírusnemzetségek a vírusfajok csoportjából állnak; közös tulajdonságaik vannak, és különböznek más nemzetségek vírustagjaitól. A vírusnemzetségeket a -virus képző (rag) fejezi ki, pl. Potyvirus.

A vírusnemzetségek vírusfajaira egyaránt az alábbiak jellemzőek: a) a vírusrészecskék szerkezete azonos, összetételük nagyon hasonló, b) a genom stratégiája hasonló, c) ökológiai életciklusuk hasonló, d) eltérnek természetes és mesterséges gazdanövénykörükben, e) eltérnek a gazdanövényeiken okozott tünetekben (szimptómákban), f) eltérnek vektoraikban.

1.1.1.1.4. Vírusfajok

Az osztályozásban a legfontosabb hierarchikus szint a vírusfaj, amelyet 1991-ben az ICTV elfogadott (Francki et al., 1991; Van Regenmortel, 1991, 1997).

1.1.1.1.5. Vírustörzsek

A gazdanövénykör és a tünetek nem taxonómiai értékűek. Ennek ellenére, ha két vírusfaj virulenciában különbözik egymástól, de gazdanövénykör tekintetében nem, akkor azok minden valószínűséggel ugyanazon



vírus különböző törzseinek tekintendők.

1.1.1.1.6. Vírusizolátumok

Egy vírusfaj gazdanövényköre és a gazdanövényeken létrehozott tünetek a vírusok igen változó tulajdonságainak tekintendők. Ugyanis ismert, hogy akár egyetlen nukleotid megváltozása (mutáció) megváltoztathatja az izolátum virulenciáját. Tehát ha két vírusizolátumnak ugyanaz a gazdanövényköre és azokon ugyanazokat a tüneteket idézik elő, akkor feltehetően ugyanannak a vírusnak az izolátumairól van szó. Ez a következtetés annál meggyőzőbb, minél több gazdanövényre terjed ki a fenti megállapítás.

A vírusok tulajdonságainak felhasználása a taxonómiában

A laboratóriumi technika tökéletesedése következtében a vírusok jellemzése gyors előrehaladást és ugyanakkor a taxonómiában is változásokat idézett elő. A vírustaxonómia jelenleg a következő tulajdonságokat veszi figyelembe:

Morfológia (a virion alakja és mérete, a peplomérek megléte vagy hiánya, a peplomérek természete, a burok jelenléte vagy hiánya, a kapszid szimmetriája és struktúrája).

Fizikokémiai és fizikai tulajdonságok [a virion molekulatömege, a virionsűrűség (céziumkloridban, cukoroldatban), a virion ülepedési állandója, a pH-tűrés, a hőtűrés, a kationtűrés, az oldhatósági stabilitás, a detergens ellenállóság, a besugárzási stabilitás, a nukleinsav típusa (RNS vagy DNS), a genom mérete, a nukleinsavszálak (egyszálú, kétszálú), a nukleinsav térbeli szerkezete (lineáris vagy cirkuláris), a nukleinsav polaritása (pozitív, negatív vagy ambiszenz), a szegmentek száma és mérete, a nukleinsav-szekvencia, ismétlődő szekvenciák jelenléte, az izomerizáció megléte, a G+C arány, az 5’-végi szekvencia jellege, az 5’-véghez kovalens kötéssel kapcsolódó genomhoz kötött fehérje megléte vagy hiánya, a 3’-vég poli-adenilált farok megléte vagy hiánya].

Fehérjék (a strukturális fehérjék száma, mérete és működése, a nem strukturális fehérjék száma, mérete és működése, az enzimfehérjék működése, mint pl. a transzkriptáz, reverz transzkriptáz működése stb.).

Lipidek.

Szénhidrátok.

Antigén tulajdonságok.

Biológiai tulajdonságok [a természetes gazdakör, az átvitel módja a természetben, a vektorkapcsolatok, a földrajzi elterjedés, a patogenitás, a betegséggel való kapcsolat, a szövetek tropizmusa, a patológia, a szövetpatológia, a genomszerveződés és -replikáció, -replikációs stratégia, a nyitott olvasási keret (open reading frame, ORF) helyzete és száma, a transzkripciós sajátosságok, a transzlációs sajátosságok, a poszt-transzlációs folyamatok, a virion proteinek felhalmozódási helye, a virion összeépülésének helye, a virion kialakulásának és kiszabadulásának helye és természete].

2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzéseA növénypatogén vírusok 12 jól definiált víruscsaládba tartoznak (Murphy et al., 1995). E családokba 51 vírusnemzetség tartozik; a növényvírusok azonban csak 34 nemzetségre terjednek ki (1. táblázat). Az egyes víruscsaládok, nemzetségeik és típus vírusfajaik tulajdonságairól – kiemelve a növénypatogén vírusokat – az alábbiakban számolunk be.

Bromoviridae család

Alfamovirus nemzetség

Bromovirus nemzetség

Cucumovirus nemzetség

Ilarvirus nemzetség



Oleavirus nemzetség

1. táblázat - Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma

Víruscsalád neve1,2

Vírusnemzetségek száma3

Bromoviridae 5/5

Bunyaviridae 5/1

Closteroviridae 2/2

Comoviridae 3/3

Geminiviridae 3/3

Luteoviridae4 3/3

Partitiviridae 4/2

Potyviridae 5/3

Reoviridae 9/3

Rhabdoviridae 5/2

Sequiviridae 2/2

Tombusviridae 5/5

Összesen: 12 51/34

1 A Bunyaviridae, a Reoviridae és a Rhabdoviridae családokban a növénypatogén vírusokon kívül gerinceseket és gerincteleneket fertőző, a Partitiviridae családban növénypatogén vírusokon kívül gombákat fertőző vírusok is vannak.

2 Újabban – a könyv kéziratának elkészülte után – lényeges változások következtek be egyrészt a már ismert víruscsaládokba (Geminiviridae, Tombusviridae) sorolt vírusnemzetségek nevét és számát, másrészt új víruscsaládok (Arenaviridae, Barnaviridae, Caulimoviridae, Luteoviridae, Partitiviridae) és vírusnemzetségek elnevezését illetően (pl. Begomovirus, Benyvirus, Crinivirus, Curtovirus, Enamovirus, Mastrevirus, Polerovirus). A könyv Új rendszertani javaslatok c. fejezete tájékoztat a növénypatogén vírusok rendszertanában bekövetkezett változásokról, amelyek részletesen a 11. Nemzetközi Virológiai Kongresszust (Sydney, Ausztrália, 1999) követően, az ICTV hetedik jelentésében, várhatóan 2000-ben látnak napvilágot.

3 A számlálóban a víruscsalád összes nemzetségének száma, a nevezőben a növénypatogén nemzetségek száma van feltüntetve.

4 Új víruscsalád (vö.: Smith és Baker, 1999)

A Bromovirus, Cucumovirus és Ilarvirus nemzetségbe tartozó izometrikus vírusok virionjai 26–35 nm átmérőjűek, ikozaéder szimmetriájúak. A virionok belsejében három genomi és egy szubgenomi egyszálú RNS molekula van. A cucumovirusoknál legalább két szubgenomi RNS van. Az RNS1 és RNS2 külön partikulumokban, az RNS3 és RNS4 (szubgenomi) egy víruspartikulumban található. Az Alfamovirus nemzetség (részben az Ilarvirus nemzetség is) virionjai többnyire bacilus formájúak, 30–57 nm hosszúságúak és 18 nm átmérőjűek. A virion RNS-tartalma 14–15%, a köpenyfehérje molekulatömege 20–26 × 103. A



köpenyfehérje gyengén immunogén. A nemzetségek között szerológiai rokonság nincs.

A Bromovirus és a Cucumovirus nemzetségekbe tartozó vírusok szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek [kivételt képez a Cucumovirus nemzetségbe tartozó uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], ezek gazdanövényei több mint ezer növényfajra terjednek ki. Az Alfamovirus gazdanövényköre tág, az ilarvirusok főleg a fás növényekre patogének.

A Bromoviridae család tagjai mechanikailag átvihetők. A Cucumovirus és Alfamovirus nemzetség fajai nem-perzisztens módon levéltetvekkel terjednek. Az ilarvirusok számos gazdanövény magjával és pollennel, a bromovirusok közül egyesek bogárvektorokkal, mások levéltetvekkel és fonálférgekkel terjednek. A Bromoviridae családba és az egyes nemzetségekbe tartozó legismertebb és legjelentősebb növénypatogén vírusok az alábbiak: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus), uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) (4. ábra).

4. ábra - A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127 000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényen; C: Cucumis sativus növény levelén

Az Oleavirus nemzetség a Bromoviridae család újabb nemzetségeként vált ismertté (Martelli és Grieco, 1997). A monotípusos nemzetség tagja az olajfa látens vírus 2 (olive latent 2 oleavirus), amely korábban az Ourmia nemzetség tagjaként volt ismert. A vírus mechanikailag könnyen átvihető, de levéltetvekkel nem terjed. Az izometrikus, ill. bacillus alakú virionok mérete 37–55 × 18 nm. A vírus 19% egyszálú RNS-t és 81% fehérjét tartalmaz. A Chenopodium quinoa és a Gomphrena globosa diagnosztikailag a legismertebb növény a vírus kimutatására. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Nicotiana benthamiana.

Bunyaviridae család

Bunyavirus nemzetség

Hantavirus nemzetség



Nairovirus nemzetség

Phlebovirus nemzetség

Tospovirus nemzetség

A virionok morfológiai tulajdonságai eltérőek az öt nemzetségben, de általában izometrikusak (vagy változó alakúak) és 80–120 nm nagyságúak. A virion molekulatömege 300–400 × 106. A virionok magas hőmérséklettel, detergensekkel és formaldehiddel szemben igen érzékenyek. A virionban negatív vagy ambiszensz jellegű egyszálú RNS-ek vannak. A családba tartozó összes vírus négy strukturális fehérjét tartalmaz [2 külső glikoprotein (G1 és G2), nukleokapszid protein (N) és egy nagy transzkriptáz protein (L)].

A Bunyaviridae családban gerinceseket, gerincteleneket és növényeket fertőző vírusok egyaránt megtalálhatók. A Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus és Phlebovirus nemzetségekben növénypatogén vírus nem ismert. A Tospovirus nemzetségbe tartozó vírusok növényekben is szaporodnak. A Tospovirus nemzetségbe tartozó típus vírus a paradicsom bronzfoltosság vírus [syn.: paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)] (5. ábra), amelynek mintegy 82 növénycsaládba tartozó 800 gazdanövénye ismert. A Tospovirus nemzetségbe tartozó vírusok (12 vírusfaj) nyolc tripszfajjal terjednek (2. táblázat).

5. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) partikulumainak elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán]

2. táblázat - Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok



TospovirusokVektorok1

A B C D E F G H

Paradicsom bronzfoltosság

(tomato spotted wilt)+ + + + + +

Paradicsom klorotikus foltosság (tomato chlorotic spot)

+ + +

Földimogyoró gyűrűsfoltosság (groundnut ringspot)

+ +

Impatiens nekrotikus foltosság (Impatiens necrotic spot)

+ +

Földimogyoró rügynekrózis (groundnut bud necrosis)

+

Görögdinnye ezüstfoltosság (watermelon silver mottle)

+

Dinnye foltos hervadás

(melon spotted wilt)+

Chrysanthemum szárnekrózis (Chrysanthemum stem necrosis)

ni ni ni ni ni ni ni ni

Cukkini letális klorózis

(zucchini lethal chlorosis)ni ni ni ni ni ni ni ni

Iris sárga foltosság

(Iris yellow spot)+ +

Földimogyoró klorotikus foltosság (peanut chlorotic fan-spot)

+

Görögdinnye rügynekrózis (watermelon bud necrosis) ni ni ni ni ni ni ni ni

1 A = Frankliniella occidentalis, B = F. schulzei, C = F. fusca, D = F. intonsa, E = Thrips tabaci, F = T. setosus, G = T. palmi, H = Scirtothrips dorsalis, ni = nem ismert (vö.: Brunt et al., 1996a; Peters és Goldbach 1998).



Feltehetően a Bunyaviridae családba tartozik még hét csoportba tartozó 19 vírus és 22, csoportba nem sorolható vírus; ezek pontos rendszertani helye még nem ismert.

Closteroviridae család

Closterovirus nemzetség

Crinivirus nemzetség

A Closteroviridae családra vonatkozó ismeretek az elmúlt néhány évben jelentősen megszaporodtak. A családba tartozó tipikus vírusokra általában jellemző, hogy az erősen flexibilis, helikális szimmetriájú virionok mérete extrém nagy (1200–2000 nm × 12 nm) és levéltetvekkel átvihetők (Agranovsky, 1996). Ismert poloskákkal terjedő closterovirus [cukornád enyhe mozaik vírus (sugarcane mild mosaic closterovirus)] is (Murphy et al., 1995). A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amely a virion tömegének 5–6%-a, a köpenyfehérje molekulatömege 23–28 × 103. A virion mérsékelten immunogén. Az újabb kutatások során vált ismertté, hogy a Closteroviridae családba tartozó atipikus vírusok a floemben lokalizálódnak, rövid virionokkal (700–800 nm) rendelkeznek és molytetvekkel (liszteskékkel) terjednek (Agranovsky, 1996). Az említett tulajdonságok alapján a Closteroviridae család két nemzetségbe (Closterovirus, Crinivirus) sorolható (Dolja et al., 1994; Wisler et al., 1998a).

A Closterovirus nemzetségbe tartozó vírusok egykomponensűek és levéltetvekkel terjednek. A Closterovirus nemzetség típustagja a répa sárgaság vírus (beet yellows closterovirus), amely a levéltetűvel történő átvitelen kívül mechanikailag nehezen, maggal és pollennel pedig nem terjed. A flexibilis virionok mérete 1250 × 10 nm (6. ábra). A virion 5% egyszálú RNS-t tartalmaz. A vírus gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai növénye a Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Beta vulgaris. A Closterovirus nemzetségbe feltételesen tartozó, levéltetvekkel terjedő vírusok a következők: citrus tristeza vírus (citrus tristeza closterovirus), a Dendrobium érnekrózis vírus (Dendrobium vein necrosis closterovirus?) és a Heracleum vírus 6 (Heracleum 6 closterovirus?) (Murphy et al., 1995).

6. ábra - A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis partikulumai [J. Brandes szívessége folytán]

A Crinivirus nemzetségbe tartozó vírusok kétkomponensűek és molytetvekkel terjednek. A Crinivirus nemzetség legjobban ismert tagja (típustag) a saláta fertőző sárgaság vírus (lettuce infectious yellows crinivirus), amely széles gazdanövénykörrel (15 növénycsalád 45 faja) rendelkezik és Bemisia tabaci



molytetvekkel (A-biotípus) szemiperzisztens módon terjed (Duffus et al., 1986). Diagnosztikai és propagatív gazdanövényei közül legismertebb a saláta (Lactuca sativa) és a Nicotiana clevelandii. A flexibilis virionok egyszálú RNS-t tartalmaznak. A vírus gazdasági jelentősége igen nagy. Az Amerikai Egyesült Államok dél-nyugati területein salátában, uborkában és cukorrépában okozott évi termésveszteség 20 millió dollárra becsülhető (Duffus et al., 1986). A Crinivirus nemzetségbe – ismereteink szerint – a típustagon kívül még 6 rendes tag [répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus), uborka klorotikus foltosság vírus (cucumber chlorotic spot crinivirus), tök sárga törpülés rendellenesség vírus (cucurbit yellow stunting disorder crinivirus), saláta klorózis vírus (lettuce chlorosis crinivirus), paradicsom fertőző klorózis vírus (tomato infectious chlorosis crinivirus), paradicsom klorózis vírus (tomato chlorosis crinivirus)] és 4 feltételezett tag [édesburgonya klorotikus törpülés vírus (sweet potato chlorotic stunt ? crinivirus), Abutilon sárgaság vírus (Abutilon yellows ? crinivirus), uborka sárgaság vírus (cucumber yellows ? crinivirus), Diodia érklorózis vírus (Diodia vein chlorosis ? crinivirus), sárgadinnye sárgaság vírus (muskmelon yellows ? crinivirus)] tartozik. A paradicsom fertőző klorózis vírus és a legújabban leírt paradicsom klorózis vírus sok tulajdonságban hasonlít egymáshoz (a virionok hosszúsága 800–850 nm, a virionok a floem szövetekben helyezkednek el, citoplazmahólyagocskák képződése, a két nem homológ RNS enkapszidációja, szekvencia-azonosság), de a vektorfajok tekintetében eltérések vannak közöttük (Wisler et al., 1998b). A paradicsom fertőző klorózis vírus csak a Trialeurodes vaporariorummal, a paradicsom klorózis vírus pedig 4 molytetűfajjal vihető át: Trialeurodes vaporariorum, T. abutilonea, Bemisia tabaci (A és B biotípus = ? B. argentifolii).

1991 óta nyolc újabb, molytetvekkel terjedő vírust írtak le, ami feltehetően arra vezethető vissza, hogy pl. Kaliforniában 1970–1990 között a Bemisia tabaci populációja az 1600-szorosára növekedett. Ennek oka ismeretlen, de feltételezhetően a globális felmelegedésre, a szintetikus, szerves inszekticidek használata következtében fellépő vegyszer-rezisztenciára és a nemzetközi szaporítóanyag-csere megnövekedésére vezethető vissza (Cohen et al., 1992; Wisler et al., 1998a).

Comoviridae család

Comovirus nemzetség

Fabavirus nemzetség

Nepovirus nemzetség

A burok nélküli virionok átmérője 28–30 nm. A hőstabil virionok szerves oldószerekkel szemben is ellenállóak. A vírusrészecskék molekulatömege 3,2–3,8 × 106. A genom a lineáris, pozitív egyszálú RNS két típusát tartalmazza. Mindkét RNS-re szükség van a fertőzés létrejöttében. Az RNS-ek mérete eltér az egyes nemzetségekben. A Nepovirus RNS1 = 7,2–8,4 kb, RNS2 = 3,9–7,2 kb, Fabavirus és Comovirus RNS1 = 5,9–7,2 kb, RNS2 = 3,5–4,5 kb. A Comovirus és Fabavirus nemzetség fajai két köpenyfehérjét (molekulatömege = 40–43 × 103 és 22–27 × 103), a Nepovirus nemzetség tagjai egyféle köpenyfehérjét tartalmaznak (55–60 × 103).

A Comovirus nemzetség tagjai jó immunogének. A nemzetségen belül az egyes tagok szerológiailag gyakran távoli rokonságot mutatnak. A Comovirus nemzetség tagjainak gazdanövényköre szűk, míg a Fabavirus és Nepovirus nemzetség fajai tág gazdanövénykörrel rendelkeznek. A Comoviridae család nemzetségeinek eltérő vektoraik vannak: a Comovirus nemzetség tagjai bogárvektorokkal [Ceratoma spp., Diabrotica spp.: tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a Fabavirus nemzetség tagjai levéltetvekkel [Aphis spp., Myzus spp.: lóbab hervadás vírus (broad bean wilt fabavirus)], a Nepovirus nemzetség több tagja fonálférgekkel [Longidorus spp., Xiphinema spp.: dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus)] és pollennel terjednek.

A Comovirus nemzetség típustagja a tehénborsó mozaik vírus, amelyhez még 15 állandó vírusfaj tartozik. A Fabavirus nemzetség típustagja a lóbab hervadás vírus. A nemzetségbe 3 további rendes vírusfaj tartozik. A Nepovirus nemzetség típustagja a dohány gyűrűsfoltosság vírus. Ide tartozik még 28 állandó és 8 feltételezett vírusfaj.

Geminiviridae család

Bigeminivirus nemzetség (újabb neve: Begomovirus nemzetség)

Hybrigeminivirus nemzetség (újabb neve: Curtovirus nemzetség)

Monogeminivirus nemzetség (újabb neve: Mastrevirus nemzetség)

Ikerpartikulumú virionokkal (18 × 30 nm) rendelkeznek, amelyekben a genom cirkuláris (kör alakú), egyszálú



DNS molekulákból áll. A családon belüli felosztás alapja az, hogy az ikervirionok egyféle (Monogeminivirus), két különböző (Bigeminivirus) vagy két egymáshoz hasonló (Hybrigeminivirus) szekvenciájú DNS-t tartalmaznak. A virion egyszerű strukturális fehérjeköpenyt tartalmaz (molekulatömege 28–34 × 10 3). A Geminiviridae családba tartozó vírusnemzetségek elnevezésében jelentős változások történtek az utóbbi évben (Pringle, 1998).

A Bigeminivirus (újabban Begomovirus) nemzetségbe 49 állandó vírusfaj [típustag = bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)] és 9 feltételezett vírusfaj tartozik (Murphy et al., 1995; Polston és Anderson, 1997). A fehérlegyekkel átvihető begomovirusok cirkuláris, egyszálú, egykomponensű vagy kétkomponensű DNS-ből állnak. A nemzetségbe tartozó vírusfajok szerológiailag viszonylag szoros kapcsolatban vannak. A Begomovirus nemzetség fajai szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek és kétszikű növényeket fertőznek. A vírusok Bemisia tabaci vektorokkal terjednek. Néhány vírus mechanikailag is átvihető [pl. bab törpülés mozaik vírus (bean dwarf mosaic begomovirus)]. A Begomovirus nemzetség új tagja a fehérlegyekkel (Bemisia tabaci, A-biotípus) perzisztens módon terjedő, Mexikóban (Sinaloa) izolált Sinaloa paradicsom levélgöndörödés vírus (Sinaloa tomato leaf curl begomovirus) (Brown et al., 1993; Idris és Brown, 1998). A Solanaceae és Malvaceae családba tartozó néhány növényfajban mutatták ki. A vírus mechanikailag nehezen átvihető Nicotiana benthamiana növényre. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl bigeminivirus) – amely újabb nemzetségnéven (Begomovirus) vált ismertté – jelenleg a kutatások középpontjába került azáltal, hogy vele kapcsolatban először sikerült szatellit DNS-t (sat-DNS; 682 nt cirkuláris DNS) kimutatni (Dry et. al., 1998).

A Hybrigemini (újabban Curtovirus) nemzetségbe egy állandó vírusfaj [típustag = répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top curtovirus)] és két feltételezett növénypatogén vírus tartozik. A répa levélcsúcs fodrosodás vírus gazdanövényköre széles (44 növénycsalád 300 faja). A nemzetségbe tartozó fajok viszonylag szoros szerológiai rokonságot mutatnak. A répa levélcsúcs fodrosodás vírus terjedése Circulifer spp. kabócafajokkal, a paradicsom ál-levélgöndörödés vírus (tomato pseudo-curly top hybrigeminivirus) terjedése Micrutalis kabócafajokkal történik.

A Monogeminivirus (újabban Mastrevirus) nemzetségbe tartozó típustag [kukorica csíkosság vírus (maize streak mastrevirus)] szűk gazdanövénykörrel rendelkezik, ami a Gramineae családba tartozó növényekre terjed ki. A vírus kabócákkal (Cicadulina spp.), cirkulatív, nem propagatív módon terjed. E nemzetségbe tartozó növénypatogén vírusok mechanikailag nem vihetők át.

Luteoviridae család

Luteovirus nemzetség

Polerovirus nemzetség

Enamovirus nemzetség

A luteovirusok osztályozásával Smith és Baker (1999), valamint Mayo és D’Arcy (1999) legújabb munkái foglalkoznak. Ezek a tanulmányok a könyv kéziratának leadása után jelentek meg és a Luteoviridae új víruscsalád tulajdonságait és rendszerbe foglalását tartalmazzák. E könyvben a luteovirusokkal a Luteovirus nemzetség ismertetésénél foglalkozunk.

Partitiviridae család

Alphacryptovirus nemzetség

Betacryptovirus nemzetség

Chrysovirus nemzetség

Partitivirus nemzetség

Az izometrikus virionok 30–40 nm átmérőjűek. A virionok butanolban és kloroformban stabilak. A virionok két, nem hasonló, lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virionok jó antigén tulajdonsággal rendelkeznek.

A Partitiviridae családba tartozó vírusok között gombákat és növényeket fertőző vírusok vannak. A Partitivirus és a Chrysovirus nemzetségbe tartozó vírusok gombapatogének. Az Alphacryptovirus és Betacryptovirus nemzetségbe tartozó vírusok növényekre patogének. Az Alphacryptovirus nemzetség típustagja a fehérhere



rejtett vírus 1 (white clover 1 alphacryptovirus), amely mechanikailag, maggal és pollennel terjed. A vírusnemzetségbe 16 állandó és 10 feltételezett vírusfaj tartozik. A Betacryptrovirus nemzetség típustagja a fehérhere rejtett vírus 2 (white clover 2 betacryptovirus), amely mechanikailag nem, de maggal átvihető. A vírusnemzetségbe 4 állandó vírusfaj és 1 feltételezett vírusfaj tartozik.

Potyviridae család

Bymovirus nemzetség

Potyvirus nemzetség

Rymovirus nemzetség

Ipomovirus feltételezett nemzetség

Macluravirus feltételezett nemzetség

A családra jellemző hajlékony fonál alakú virionok 11–15 nm átmérőjűek, hosszúságuk az egyes nemzetségekben azonban eltérő. Az Ipomovirus, Potyvirus, Rymovirus és Macluravirus nemzetségbe tartozó vírusfajok hosszúsága 900, 750, 700, ill. 650 nm. A Bymovirus nemzetség osztott virionjainak hosszúsága 250–300, ill. 500–600 nm. A Potyvirus és Rymovirus nemzetség vírusfajai egyszálú, lineáris RNS-t tartalmaznak, míg a Bymovirus nemzetség tagjainak genomja két egyszálú RNS-ből áll. A virion köpenyfehérje-molekulatömege 30–40 × 103. A virionok 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaznak. A család tagjai mérsékelten immunogének, és szerológiailag rokonság van a tagok között. A Potyviridae család tagjaira jellemző, hogy a fertőzött növényekben intracelluláris, hengeres, forgókerék, ill. szélkerék formájú zárványokat (pinwheels) képeznek. A gazdanövénykörök nagysága tekintetében eltérések vannak az egyes vírusfajok között. Mechanikailag könnyen átvihetők, egyes vírusok maggal is terjednek. A Potyvirus nemzetség fajai nem perzisztens módon levéltetvekkel (pl. Myzus persicae), a Rymovirus nemzetség fajai levélatkákkal (pl. Abacarus hystrix), a Bymovirus nemzetség fajai gombával (Polymyxa graminis) terjednek.

A Potyviridae család két feltételezett nemzetsége közül az Ipomovirus nemzetség két tagja [édesburgonya enyhe foltosság vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus) és édesburgonya sárga törpülés vírus (sweet potato yellow dwarf ipomovirus)] molytetvekkel terjed. A feltételezett Macluravirus nemzetség tagjai [Maclura mozaik vírus (Maclura mosaic macluravirus) és a Narcissus látens vírus (Narcissus latent macluravirus)] nem perzisztens módon levéltetvekkel terjednek.

A Potyviridae családba mintegy 184 vírusfaj tartozik, amelyből 85 vírusfaj állandó tag és 99 feltételezett tag (Potyvirus 75/93, Rymovirus 5/2, Bymovirus 5/0, Ipomovirus 2/0, Macluravirus 2/0). Az egyes nemzetségek típustagjai az alábbiak: Potyvirus nemzetség [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) (7A ábra), Rymovirus nemzetség [angolperje mozaik vírus (ryegrass mosaic rymovirus), Bymovirus nemzetség [árpa sárga mozaik vírus (barley yellow mosaic bymovirus)], feltételezett Ipomovirus nemzetség [édesburgonya enyhe foltosság vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus)], feltételezett Macluravirus nemzetség [Maclura mozaik vírus (Maclura mosaic macluravirus)].

7. ábra - A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730 nm x 11 nm); B: a rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora (Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi szívessége folytán]



Stenger et al. (1998), valamint Choi et al. (1999) újabb molekuláris és filogenetikai analízis vizsgálatai alapján a búza csíkos mozaik vírus (wheat streak mosaic rymovirus) és a rozsnok csíkos mozaik vírus (brome streak mosaic rymovirus) nem a Potyviridae család Rymovirus nemzetségébe, hanem egy újonnan javasolt nemzetségbe, a Tritimovirus nemzetségbe sorolandó.

Reoviridae család

Aquareovirus nemzetség

Coltivirus nemzetség

Cypovirus nemzetség

Fijivirus nemzetség

Orbivirus nemzetség

Orthoreovirus nemzetség

Oryzavirus nemzetség

Phytoreovirus nemzetség

Rotavirus nemzetség

A virionok felépítése ikozaéder, alakjuk szférikus. Általában 60–80 nm átmérőjűek és kettős fehérjeburokkal rendelkeznek. A virion molekulatömege 120 × 106. Lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virion 15–20%-a RNS, 80–85%-a fehérje. A vírusok antigén tulajdonsága csoportspecifikus. Az egyes nemzetségek között nincs szerológiai rokonság. A gazdafogékonyság tekintetében különbség van a nemzetségek között. Egyes vírusok (orthoreovirusok, rotavirusok) csak gerincesekben, mások ízeltlábúakban és gerincesekben is szaporodnak (orbivirusok, coltivirusok). A Cypovirus nemzetségbe rovarpatogén vírusok, az Aquareovirus nemzetségbe főleg édes- és tengervízi halakat fertőző vírusok tartoznak. A növénypatogén vírusok (Fijivirus, Oryzavirus, Phytoreovirus) növényekben és ízeltlábúakban szaporodnak.

A Fijivirus nemzetség típus tagja a Fiji betegség vírus (Fiji disease fijivirus), amely mechanikailag nehezen, de kabócákkal (Laodelphax spp., Javasella spp., Sogatella spp.) könnyen átvihető; áttelelése a diapauzában levő kabócákban és néhány vad növényfajban történik. A nemzetségbe 5 állandó vírusfaj tartozik.

Az Oryzavirus nemzetség típustagja a rizs érdes törpülés vírus (rice ragged stunt oryzavirus), amely a Gramineae növényekre patogén, és kabócákkal (pl. Nilaparvata lugens) terjed. A nemzetségbe két rendes vírusfaj tartozik.

A Phytoreovirus nemzetség típustagja a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus). A vírus mindenekelőtt a kétszikű növényekre patogén, és kabócákkal (Agallia spp., Agalliopsis spp., Nephotettix spp.) terjed. A vírus mechanikailag nem vihető át. A nemzetségbe két vírusfaj tartozik [pl. rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus)] (7B,C ábra). A vírus beteg növények magjával nem terjed.

Rhabdoviridae család



Cytorhabdovirus nemzetség

Ephemerovirus nemzetség

Lyssavirus nemzetség

Nucleorhabdovirus nemzetség

Vesiculovirus nemzetség

A virionok mérete 100–430 nm hosszúságú és 45–100 nm átmérőjű. A defektív vírusrészecskék mérete arányosan kisebb lehet. A Vesiculovirus nemzetségbe tartozó vírusfajok állatpatogének (emlősök, halak, rovarok). Ide tartozik az egyik legrégebb óta ismert sertés vírusbetegség, a hólyagos szájgyulladás vírus (vesicular stomatitis vesiculovirus). A Lyssavirus nemzetség vírusfajai szintén állatokra patogének. Legismertebbek a nyulakat megbetegítő vírus (rabies lyssavirus) és az európai denevér vírus (European bat lyssavirus). Ezek az állatok jelentős szerepet játszanak a fertőző nyállal háziállatokra (kutya) és vadon élő állatokra terjedő lyssavirusok átvitelében. Az Ephemerovirus nemzetségbe tartozó vírusok állatpatogének (viziló, szarvasmarha). Főleg a trópusokon és szubtropikus övezetekben fordulnak elő. A vírusok átvitelében (terjedésében) az ízeltlábúak játszanak fontos szerepet; a vírusokat szúnyogokból is sikerült izolálni.

A Rhabdoviridae család két nemzetsége (Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus) növénypatogén. Elnevezésüket a vírus kialakulási helye szerint különböztették meg. A citoplazmában kialakuló Cytorhabdovirus nemzetség típustagja a saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus). Ide tartozik még 8 állandó vírusfaj. Általában levéltetvekkel (pl. Hyperomyzus lactucae) terjednek (pl. saláta nekrotikus sárgaság vírus), de ismertek kabócákkal (pl. Laodelphax striatellus) terjedő vírusok is [árpa sárga csíkos mozaik vírus (barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus)].

A sejtmagban replikálódó növénypatogén vírusnemzetség a Nucleorhabdovirus nemzetség. Típustagja a burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus). Ide tartozik a Pittosporum érsárgulás vírus (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) (8. ábra) és még 6 állandó vírusfaj. Ismertek közöttük levéltetvekkel terjedők [csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) (9. ábra), és kabócákkal terjedők (burgonya sárga törpülés vírus)]. A Rhabdoviridae családba tartozik még mintegy 60 rovarpatogén és 61 növénypatogén rhabdovirus; ezek pontos rendszertani helye azonban még nem ismert.

Sequiviridae család

Sequivirus nemzetség

Waikavirus nemzetség

8. ábra - A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) természetes úton fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B: egészséges növény



9. ábra - A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) lövedékszerű partikulumai (230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán]



A virion izometrikus, 30 nm átmérőjű. A virion 40% pozitív, egyszálú RNS-t és három fő fehérjét tartalmaz (CP1, 32 × 103; CP2, 26 × 103; CP3, 23 × 103). Jó immunogén, a poliklón antiszérum tartalmazza az összes ellenanyagot a virion proteinjeivel szemben. A családba tartozó növénypatogén vírusok gazdanövényköre szűk. A vírusok szemiperzisztens módon levéltetvekkel (Sequivirus nemzetség vírusfajai) vagy kabócákkal terjednek (Waikavirus nemzetség vírusfajai). A vírusátvitelhez ún. segítő (helper) proteinre (Waikavirus), vagy a segítő, helper vírus (Sequivirus) átkódolására van szükség. Mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. A Sequivirus nemzetség típustagja a paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus), amely mechanikailag és levéltetvekkel (Cavariella spp.) szemiperzisztens módon átvihető (10. ábra). A nemzetségbe három állandó vírusfaj tartozik. A Waikavirus nemzetség típustagja a rizs tungro szférikus vírus (rice tungro spherical waikavirus), amely szemiperzisztens módon kabócákkal (pl. Nephotettix virescens) terjed. Segítő (helper) vírus [rizs tungro bacilus alakú vírus (rice tungro bacilliform badnavirus)] a vírusátvitelt megkönnyíti (Druka és Hull, 1998). A Waikavirus nemzetségbe három állandó vírusfaj tartozik.

10. ábra - A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus) izometrikus partikulumai (31 nm) [A.F. Murant szívessége folytán]



A kukorica klorotikus törpülés vírus (maize chlorotic dwarf waikavirus) szekvenciaanalízise alapján hasonlóságot mutat a Sesquiviridae, Comoviridae és Potyviridae családok néhány vírusfajával. A genomszerveződés alapján a vírus a Sesquiviridae család Waikavirus nemzetségébe tartozik (Reddick és Habera, 1997).

Tombusviridae család

Carmovirus nemzetség

Dianthovirus nemzetség (újabb nemzetség)

Machlomovirus nemzetség

Necrovirus nemzetség

Tombusvirus nemzetség

A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok virionjai ikozaéder szimmetriájúak, 180 fehérjealegységből állnak és 30 nm átmérőjűek. A virionok hőstabilak (a hőinaktiválási pont 80 °C felett van). A virion molekulatömege 8,2–8,9 × 106. A virion pozitív, lineáris, egyszálú, 4,7 kb nagyságú RNS-t tartalmaz. A fertőzött sejtekben a genomi RNS-en kívül két kisebb, ún. szubgenomi RNS van jelen. Defektív interferáló (DI) és szatellit RNS-ek előfordulása ismert. A DI RNS erősen gátolja a helper vírus (segítő vírus) replikációját a növényben, aminek jelentős tünetcsökkentő hatása van. A DI és a szatellit RNS-ek csak helper vírus jelenlétében képesek replikációra.

Az egyes vírusfajok természetes gazdanövényköre viszonylag szűk, és főleg a kétszikű növényekre terjed ki. A mesterséges gazdanövények köre kiterjedt. A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok mechanikailag könnyen átvihetők, egyesek közülük maggal is terjednek. A vektorok között megtalálható az Olpidium spp. gomba [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] és bogárvektor (Diabrotica spp.) is [bab enyhe mozaik vírus (bean mild mosaic carmovirus). Természetes vizekből is kimutathatók [paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus)].

A Carmovirus nemzetség típustagja a szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus). Vektora nem ismert. Az állandó tagok száma 12, a feltételezett tagok száma 7. A Tombusvirus nemzetség típustagja a paradicsom bokros törpülés vírus. Az állandó tagok száma 13; feltételezett tag nem ismert.

A Tombusviridae családba a korábban ismert két nemzetségen (Carmovirus, Tombusvirus) kívül három újabb



nemzetséget (Dianthovirus, Machlomovirus, Necrovirus) soroltak. A Dianthovirus nemzetség típustagja a szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus). A Machlomovirus nemzetségnek egyetlen tagja ismert [kukorica klorotikus foltosság vírus (maize chlorotic mottle machlomovirus)]. Az ikozaéder típusú virion 30 nm átmérőjű, részletes struktúrája nem ismert. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A fehérje molekulatömege 25,1 × 103. A virion 18% nukleinsavat és 82% fehérjét tartalmaz. Mechanikailag és maggal terjed. A vírus ún. Kansas- és Nebraska-izolátumai bogárvektorokkal (Diabrotica spp.) kísérleti úton átvihetőek. A Hawai-izolátum tripszekkel terjed. A vírus természetes gazdája a Zea mays L. Kísérleti gazdanövényei között a Zea mays (hibridek) és a Triticum aestivum a legjelentősebb. Hasonlóság figyelhető meg a Tombusviridae családba tartozó nemzetségek (Machlomovirus, Necrovirus, Luteovirus, valamint a Sobemovirus) között (Lesemann, 1998). A Necrovirus nemzetségbe tartozó vírusok ikozaéder szimmetriájúak és megközelítőleg 28 nm átmérőjűek. A virionnal kapcsolatos szatellit vírus 16,8 nm átmérőjű. A virion molekulatömege 7,6 × 10 6 (szatellit vírus, 1,64 × 106). A virion lineáris, pozitív egyszálú RNS. A köpenyfehérje molekulatömege 29–30 × 103.

A Necrovirus nemzetség tagjai mérsékelten immunogének, széles gazdanövénykörrel rendelkeznek, az egy- és kétszikű növényekre egyaránt kiterjednek. Mechanikailag és talajban élő gombával (Olpidium brassicae) terjednek.

A Necrovirus nemzetség típustagja a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) (Pringle, 1998). A vírus (tobacco necrosis necrovirus) 19% nukleinsavat és 81% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre közepesen kiterjedt. Természetes fertőzések során a gazdanövények gyökérrendszerét károsítja. Kísérleti gazdanövényein (Phaseolus vulgaris, Vigna spp., Nicotiana spp., Solanum spp., Datura spp., Ocimum spp.) nekrotikus léziókat okoz (11. ábra). Szisztemikus fertőzés igen ritkán fordul elő [kivételt képez a vírus ún. bab rajzos mintázatú törzse (bean stipple streak strain)].

11. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális) nekrózisokat idéz elő a növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C: Solanum ochroleucum; D: Ocimum gratissimum

A Necrovirus nemzetségbe három rendes és két feltételezett vírusfaj tartozik. A 30 nm átmérőjű, RNS-tartalmú, 3662 nukleotidát és öt nyitott olvasási keretet (open reading frame, ORF) tartalmazó, mechanikailag átvihető, szűk gazdanövénykörrel rendelkező póréhagyma fehér csíkos vírus (leek white stipe necrovirus) a Necrovirus nemzetség legújabban leírt tagja (Lot et al., 1996). A polimerázok (ORF I, ORF II) a szekvenciahasonlóság magas fokát mutatják a Tombusviridae család nemzetségeinek (Necrovirus, Tombusvirus, Carmovirus, Dianthovirus, Machlomovirus) vírusfajaival.

A Tombusviridae család eddig ismert öt nemzetségét újabban kiegészítették egy 6. nemzetséggel is, amelyet Auereusvirus nemzetségnek neveztek el (Martelli et al., 1998). Ide tartozik a Pothos látens vírus (Pothos latent aureusvirus) és a korábban Carmovirus nemzetségbe sorolt uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot aureusvirus).

3. A vírusnemzetségek általános jellemzéseEddigi ismereteink szerint 34 olyan növénypatogén vírusnemzetség van, amely víruscsaládokba sorolható. Ezekről a vírusnemzetségekről az előzőekben A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése című fejezetben számoltunk be. Ismert 24 olyan vírusnemzetség is, amelynek tagjai növényekre patogének; víruscsaládokba történő besorolásuk folyamatban van. Ezekről a nemzetségekről és típus vírusfajaik



tulajdonságairól az alábbiakban számolunk be.

Badnavirus nemzetség

A virionok bacilus alakúak, párhuzamos oldalakkal és lekerekített végekkel. Általában 130 nm hosszúak és 30 nm szélesek, de a vírusrészecskék hosszúsága 60–900 nm között váltakozhat. A virion kétszálú DNS-t és fő szerkezeti fehérjét (35–37 × 103) tartalmaz. A virionok közepesen antigének. A poliklón antiszérum-titer elérheti az 1/128–1/512 értéket. A nemzetségbe tartozó vírusoknak általában szűk gazdanövénykörük van. Elsősorban vegetatív úton terjednek; egyes vírusok átvitelében a poloskáknak [Planococcoides spp., kakaó duzzadt hajtás vírus (cacao swollen shoot badnavirus)], a kabócáknak [Nephotettix spp., rizs tungro bacilus alakú vírus (rice tungro bacilliform badnavirus)] és a levéltetveknek [Aphis fabae, Myzus persicae, Dioscorea bacilus alakú vírus (Dioscorea bacilliform badnavirus)] van szerepe. Ismertek maggal és/vagy pollennel terjedő badnavirusok is.

A Badnavirus nemzetség típustagja a Commelina sárga foltosság vírus (Commelina yellow mottle badnavirus), amely kertészeti oltással vihető át, mechanikailag nem terjed. A bacilus alakú virion 133 nm hosszú és 24 nm széles. A nemzetségbe 10 állandó vírusfaj és 4 feltételezett faj tartozik. A badnavirusok hasonlítanak a genom típusában (kétszálú DNS) a caulimovirusokhoz, de a genom méretében, a virion morfológiájában, a vektorokban és a hisztopatológiában különböznek egymástól.

A Badnavirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Caulimovirus nemzetség

A burok nélküli izometrikus vírusok mérete 50 nm. A virion kétszálú DNS-t tartalmaz. A burokfehérje a negyedik nyitott olvasási keretből (open reading frame, ORF IV) íródik át és szerveződik köpenyfehérjévé (57 × 103). Az ORF I leolvasási szakasz felelős a vírus sejtről sejtre történő terjedéséért, az ORF II pedig a levéltetű-átvitelt segítő faktort kódolja. A vírus immunogén, az egyes vírusfajok között szerológiai rokonság van. A vírusok gazdanövényköre szűk. Mechanikailag átvihetők, levéltetvekkel szemiperzisztens vagy nem perzisztens (stylet-borne) módon terjednek.

A Caulimovirus nemzetség típustagja a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) (12A ábra), amely a mechanikai átvitelen kívül mintegy 25 levéltetű fajjal nem perzisztens módon terjed. A vírus diagnosztikai és propagatív gazdája a Brassica campestris, a Brassica rapa var. rapa és a Crambe strigosa (12B, C ábra). A nemzetségbe 11 állandó és 6 feltételezett vírusfaj tartozik. A Caulimovirus – hasonlóan a Badnavirushoz – olyan vírusnemzetség (2 ilyen növénypatogén vírusnemzetség ismert), amelynek tagjai ún. fordított transzkripcióval valósítják meg a nukleinsavak szintézisét. A m-RNS-DNS átírását a reverz transzkriptáz (reserve transcriptase) enzim végzi. A két nemzetség azonban a virion morfológiájában, a genomszerveződésben, a gazdanövénykörben és a vektorokban különbözik egymástól.

12. ábra - A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és szisztemikus tünetei Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C) növényeken

A Caulimovirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Capillovirus nemzetség

A flexibilis virionok mérete 640 × 12 nm. A virion lineáris, pozitív értelmű, egyszálú RNS, amely a virion



súlyának 5%-a. A virionok közepes antigén tulajdonsággal rendelkeznek. A vírusok gazdanövényköre általában szűk. Rovarvektorok nem ismertek. Egyes vírusok maggal [alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus)], mások oltással [Nandina szár himlő vírus (Nandina stem pitting capillovirus)] vihetők át.

A Capillovirus nemzetség típus vírusfaja a hajlékony (flexibilis), 600–700 nm hoszszúságú és 12 nm szélességű alma törzsbarázdáltság vírus. Mechanikailag, oltással és maggal terjed. Gazdanövényköre szűk-közepes (kilenc növénycsalád 20 faja). A vírus izolálására és fenntartására a legjobb növény a Chenopodium quinoa. A Capillovirus nemzetségbe 3 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. Ezek a vírusok morfológiailag és aminosav-szekvenciájukban hasonlítanak a closterovirusokhoz és a trichovirusokhoz, de a genomszerveződésben és a replikációs stratégiájukban eltérnek egymástól.

A Capillovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Carlavirus nemzetség

A flexibilis virionok mérete 610–700 nm × 12–15 nm. A virionok lineáris, egyszálú RNS-ből és egyszerű polipeptidből (31–36 × 103) állnak. A vírusoknak erős immunogén tulajdonsága van. Egyes vírusok szűk, más vírusok széles gazdanövénykörrel rendelkeznek. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők. Általában nem perzisztens módon, levéltetvekkel [burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus), vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus)] (13. ábra) terjednek. Két feltételezett vírusfaj [cassava barna csíkossággal társult vírus (cassava brown streak-associated carlavirus), tehénborsó enyhe foltosság vírus (cowpea mild mottle carlavirus)] molytetvekkel (liszteskékkel) terjed (Bemisia tabaci).

13. ábra - Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm × 12 nm); B: burgonya S-vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J. Brandes szívessége folytán]

A Carlavirus nemzetség típustagja a szegfű látens vírus (carnation latent carlavirus), amely levéltetvekkel (Myzus persicae) nem perzisztens módon terjed. Mechanikailag átvihető, de maggal nem terjed. A vírus lokális-léziós gazdája (assay host) a Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Dianthus barbatus. A Carlavirus nemzetségbe 29 állandó vírusfaj és 29 levéltetvekkel, valamint 2 fehérlegyekkel terjedő feltételezett vírusfaj tartozik.

A Carlavirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).



A carlavirusok vírusreplikációs génje szekvenciahasonlóságot mutat az alphamovirusokhoz, tobamovirusokhoz, tobravirusokhoz és a furovirusokhoz, de szorosabb homológiát mutat a potex-, a tymo- és a closterovirusokkal is. A flexibilis Narcissus látens vírust (Narcissus latent macluravirus) korábban a Carlavirus nemzetségbe sorolták. Újabban kimutatott intracelluláris zárványai (pinwheels), valamint a 103 molekulatömegű köpenyfehérjéje alapján a Maclura mozaik vírussal (Maclura mosaic macluravirus) mutatott szerológiai rokonsága miatt a Potyviridae család feltételezett Macluravirus nemzetségébe sorolandó.

Enamovirus nemzetség

A poliéder alakú virionok két különböző méretben (25 nm és 28 nm) fordulnak elő. A vírus két típusú lineáris, pozitív értelmű RNS-t tartalmaz (RNS1, RNS2). Egyes vírustörzsekben egy harmadik típusú RNS is található (RNS3). A strukturális fehérjéket az RNS1 típusú nukleinsav kódolja. Az egyes izolátumokban lévő kis fehérjék (minor protein) – amelyeknek molekulatömege 54 × 103 – összefüggésben vannak a vírus levéltetű-átvihetőségével. A vírusok közepesen immunogének.

A nemzetségbe tartozó eddig ismert egyetlen vírus (típustag), a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) 28% lineáris, egyszálú RNS-t és 72% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre főleg a Leguminosae családra terjed ki. A vírus mechanikailag és perzisztens, nem propagatív módon levéltetvekkel terjed. Figyelemre méltó, hogy a vírus levéltetvekkel történő átvihetősége a mechanikai sorozat-passzázsok következtében megszűnik. A vektorátvitel hatékonysága egyéb vírus [bab sárga érszalagosodás vírus (bean yellow vein banding umbravirus)] jelenlétében fokozódik. A vírus legjelentősebb diagnosztikai növénye a Nicotiana clevelandii. Propagatív gazdája a Pisum sativum, lokális-léziós gazdanövénye a Chenopodium quinoa.

Az Enamovirus nemzetségnek – amely újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik (Pringle, 1998) – eddig egyetlen tagja ismert.

Dianthovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú virionok átmérője 32–35 nm. A virionok teljes (részletes) struktúrája még nem ismert. A virion pozitív, egyszálú RNS. Molekulatömege 8,6 × 106. A köpenyfehérje molekulatömege 37 × 103. A nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Természetes gazdanövénykörük közepes, főleg a kétszikű növényekre terjed ki. Mesterséges gazdanövénykörük széles, főképpen a Solanaceae, a Leguminosae, a Cucurbitaceae és a Compositae családokat foglalja magában. A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag könnyen átvihetők, maggal, rovarokkal és talajban élő gombákkal nem terjednek. Fonálférgekkel történő terjedésük kérdéses.

A Dianthovirus nemzetség típustagja a szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), amely 20,5% nukleinsavat és 79,5% fehérjét tartalmaz. A vírus diagnosztikai és propagatív növénye a Phaseolus vulgaris, Gomphrena globosa, lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A nemzetségbe két rendes és egy feltételezett vírusfaj tartozik.

A Dianthovirus nemzetséget újabban a Tombusviridae családba sorolták (Pringle, 1998).

A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok köpenyfehérje-szekvenciája hasonlóságot mutat a Tombusviridae Necrovirus és Machlomovirus, valamint a Barnaviridae család Luteovirus nemzetségébe tartozó vírusfajaival.

Furovirus nemzetség

A pálcika alakú virionok általában kétféle méretűek; 92–160 nm, ill. 250–300 nm hoszszúak és 20 nm átmérőjűek. A nemzetség két feltételes vírusfaja 380–390 nm hosszú. A multikomponensű virionok általában két lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t (RNS1, RNS2) tartalmaznak. Kivételt képez a négy RNS-t tartalmazó répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein furovirus). Az egyszerű burokfehérje molekulatömege 19,7–23,0 × 103. A nemzetségbe tartozó legtöbb vírusfaj jó immunogén. A természetes gazdanövénykör nagyon szűk. A vírusok mechanikailag és talajban élő gombákkal (Polymyxa graminis, P. betae, Spongospora subterranea) terjednek.

A Furovirus nemzetség típustagja a búza talajlakó mozaik vírus (wheat soil-borne mosaic furovirus), amely 5% RNS-t és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A diagnosztikai és propagatív gazdák közül jelentősek a Triticum-fajok. A furovirusok szerológiailag különbözőek, ugyanakkor szerológiailag rokonságot mutatnak a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus). A Furovirus nemzetség jelenlegi ismereteink szerint öt állandó vírusfajból és öt feltételezett vírusfajból áll.



A Furovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Megemlítjük, hogy a legújabb molekuláris eredmények (nukleotid szekvenciaanalízis, génszerveződés, fehérjeburok-kompozíció stb.) alapján a Furovirus nemzetségen belüli osztályozásában feltehetően változások következnek be (Torrance és Mayo, 1997). Javaslat született arra, hogy a búza talajlakó mozaik vírus, a zab arany csíkos vírus (oat golden stripe furovirus) és a Sorghum klorotikus foltosság vírus (Sorghum chlorotic spot furovirus) képezze változatlanul a Furovirus nemzetséget. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus), a répa talajlakó vírus (beet soil-borne furovirus) és a lóbab nekrózis vírus (broad bean necrosis furovirus) kerüljön át az újonnan javasolt Pomovirus nemzetségbe. A földimogyoró bokrosodás vírus (peanut clump virus) és az indiai földimogyoró bokrosodás vírus (Indian peanut clump virus) tartozzon az új Pecluvirus nemzetségbe. A répa nekrotikus sárgaerűség vírus és a búza talajlakó mozaik vírus az új Benyvirus, az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic virus) pedig a már ismert Hordeivirus nemzetségbe tartozzon.

Javaslat született arra is, hogy a pálcika alakú vírusokat hét nemzetségbe (Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Hordeivirus, Furovirus, Tobravirus és Tobamovirus) és a nemzetségeket összefoglaló új Barnaviridae családba sorolják. Az új javaslatot a Nemzetközi Vírusnomenklatúra és Taxonomiai Bizottság 1996-ban beterjesztette, és 1997-ben elfogadta (Pringle, 1998).

Hordeivirus nemzetség

A helikális szimmetriájú pálcika alakú multikomponensű virionok mérete 110–150 nm × × 20 nm. A stabil virionok növényi szövetnedvben néhány napig, esetleg néhány hétig is megőrzik fertőzőképességüket. A virion pozitív, három egyszálú RNS-t tartalmaz, amely 3,8 kb (RNSα), 3,3 kb (RNSβ) és 3,2 vagy 2,8 kb (RNSγ). Egy negyedik RNS (2,5 kb) az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) argentínai izolátumában fordul elő. A vírus RNSα és RNSγ 70 nukleotidája közötti szoros szekvenciaazonosság arra mutat, hogy az RNS-rekombináció szignifikáns szerepet játszott az árpa csíkos mozaik vírus evolúciójában. A köpenyfehérje-alegységek molekulatömege 22 × 103. A Hordeivirus nemzetségbe tartozó vírusok jó immunogének, egymás között távoli szerológiai rokonságot mutatnak.

A nemzetség típustagja az árpa csíkos mozaik vírus, amelynek természetes gazdanövényköre – az Anthoxanthum látens halvány vírussal (Anthoxanthum latent blanching hordeivirus) és a Poa szemilátens vírussal (Poa semilatent hordeivirus) együtt – a Gramineae családba tartozó fűfélékre terjed ki. A Hordeivirus nemzetségbe tartozó negyedik vírus [Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus)] gazdái a Caryophyllaceae és a Labiatae családban találhatók meg. A nemzetség típustagja, az árpa csíkos mozaik vírus 3,8–4% nukleinsavat és 96% fehérjét tartalmaz. A vírus mechanikailag átvihető; terjedésében a maggal történő átvitel (90–100%) igen jelentős. A vírus diagnosztikai és propagatív gazdája a Triticum aestivum, Hordeum vulgare, lokális-léziós gazdája pedig a Chenopodium quinoa.

A Hordeivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Idaeovirus nemzetség

A nemzetségbe tartozó egyetlen izometrikus vírus [málna bokros törpülés vírus (raspberry bushy dwarf idaeovirus)] mérete 33 nm. A virion három lineáris, pozitív RNS-t tartalmaz. Az RNS1 5,4 kb, az RNS2 2,2 kb, az RNS3 1,0 kb. A köpenyfehérje molekulatömege 30 × 103. A virion 24% nukleinsavat és 76% fehérjét tartalmaz. A vírus közepesen immunogén. Átvitelében vektoroknak nincs szerepe. A mechanikai terjedésen kívül fontos szerepe van a magátvitelnek (70%), és feltehetően pollennel is terjed. Természetes gazdanövénye a Rubus fajokra terjed ki. Kísérleti gazdanövényei között fon-tos szerepe van a Chenopodium amaranticolor, valamint a C. quinoa fajoknak. Az inokulált növények lokálisan (klorotikus léziók) és szisztemikusan is fogékonyak (klorotikus gyűrűk).

Az Ideovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Luteovirus nemzetség

Az izometrikus virionok mérete 25–30 nm. A virionok pozitív értelmű egyszálú RNS-t tartalmaznak, amelyben 28% a nukleinsav és 72% a fehérje. A fehérjék funkciója részben ismeretlen, részben tartalmazzák a köpenyfehérjét és részben szerepet játszanak a vírus levéltetű-átvitelében. A nemzetségbe tartozó vírusok erősen immunogének. A luteovirusok nagyobb részének gazdanövényköre szűk: csupán egyetlen növénycsaládra terjed ki. Átvitelük mechanikailag, maggal és pollennel nem lehetséges. Cirkulatív, nem propagatív módon törzsspecifikus levéltetűfajokkal terjednek.



A nemzetség típustagja az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), amelynek kísérleti gazdanövényköre szűk. A diagnosztikai és propagatív gazdák között legnagyobb az Avena sativa és a Hordeum vulgare fajok jelentősége.

A Luteovirus nemzetségbe 11 állandó vírusfaj (és több vektorspecifikus vírustörzs), valamint 14 feltételezett vírusfaj tartozik.

A Luteovirus nemzetség újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik (Pringle, 1998).

A borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) nukleinsav- (RNS1-) molekulaszerveződése hasonlít a Luteovirus nemzetségbe tartozó árpa sárga törpülés vírus II. alcsoportjába tartozó vírusokhoz. A borsó enációs mozaik vírus RNS2-szerveződése pedig emlékeztet az árpa sárga törpülés vírus I. alcsoportjába tartozó vírusokhoz. A Luteovirus nemzetségbe tartozó vírusok fejlődéstani rokonságot mutatnak a Sobemovirus és Carmovirus nemzetségbe tartozó vírusokkal.

D’Arcy és Mayo (1997) a Cirencesterben (Nagy-Britannia) megtartott Luteovirus Konferencián a luteovirusokkal kapcsolatos legújabb taxonómiai és osztályozási javaslatokról számolt be. Tekintettel arra, hogy a luteovirusok két különböző polimeráz génnel rendelkeznek (Mayo és Ziegler-Graf, 1996), az eredeti Luteovirus nemzetséget három nemzetségre kívánják osztani. Az eredeti Luteovirus nemzetséget típustagként képviselné az árpa sárga törpülés vírus MAV-törzse (barley yellow dwarf luteovirus MAV strain = BYDV-MAV). A másik nemzetség elnevezésére javasolják a Betaluteovirus nemzetségnevet. Ebbe a nemzetségbe tartozna a répa nyugati sárgaság vírus (beet western yellows betaluteovirus), amely az új nemzetség típustagja. A harmadik javasolt nemzetség neve a Polerovirus vagy Potleavirus nemzetség, ahova a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) mint típustag tartozna. A luteovirusok taxonómiájára vonatkozóan rövidesen újabb határozatok születnek (lásd D’Arcy és Mayo, 1997). A luteovirusokról – könyvünk kéziratának leadása után – megjelent mű (Smith és Baker, 1999) Luteoviridae családot különített el, amelybe három nemzetség tartozik (Luteovirus, Polerovirus, Enamovirus). Ezek típustagjai az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) és a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) (Mayo és D’Arcy, 1999).

Macluravirus nemzetség

A flexibilis virionok mérete 657–664,5–672 nm × 13–13,7 nm. A virionok 3–4,25% nukleinsavat és 95–97% fehérjét tartalmaznak. Az RNS egyszálú. A Macluravirus nemzetségbe tartozó Maclura mozaik vírus (Maclura mosaic macluravirus) levéltetvekkel nem perzisztens módon és mechanikailag átvihető. A Maclura mozaik vírus (típustag) természetes gazdája a Maclura pomifera. A kísérleti gazdanövények közül legjelentősebb a Chenopodium album (klorotikus lokális léziók) és a Nicotiana clevelandii (szisztemikus mozaik).

A Maclura mozaik vírus szerológiai rokonságban van a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic potyvirus), a Narcissus látens vírus pedig a liliom tünetmentes vírussal (lily symptomless carlavirus).

Marafivirus nemzetség

Az ikozaéder virion 28–32 nm. A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amelynek molekulatömege 2,0–2,4 × 106. A köpenyfehérje molekulatömege 27 × 103–22 × 103. A nemzetségbe tartozó vírusok szűk gazdanövénykörrel (Gramineae család) rendelkeznek [kivételt képez a kétszikű növényeket is fertőző zab kék törpülés vírus (oat blue dwarf marafivirus), és közepesen immunogének.

A Marafivirus nemzetség típustagja a kukorica finom csíkozottság vírus (maize rayado fino marafivirus), amely 33% nukleinsavat és 67% fehérjét tartalmaz. A vírus kabócákkal (Dalbulus spp.) vihető át perzisztens módon; mechanikailag és maggal nem terjed. Gazdanövényköre szűk, természetes és kísérleti gazdanövénye a Zea mays. A vírus a legtöbb esetben fitoplazmával és spiroplazmával együtt fordul elő. A Marafivirus nemzetségbe három állandó vírusfaj tartozik.

A Marafivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Nanavirus nemzetség

Az izometrikus vírusok mérete 17–26 nm. A vírus-nukleinsav egyszálú, cirkuláris DNS. A virionok 16-17% nukleinsavat és 83-84% fehérjét tartalmaznak. Levéltetvekkel szemiperzisztens vagy perzisztens módon vihetők át. A vírusok mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. Gazdanövénykörük szűk.



A Nanavirus nemzetségbe öt rendes vírusfaj tartozik: banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top nanavirus), kókusz hajtás leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus), lóbab nekrotikus sárgaság vírus (faba bean necrotic yellows nanavirus), baktövis (Astragalus) törpeség vírus (milk vetch dwarf nanavirus), here földalatti törpülés vírus (subterranean clover stunt nanavirus).

Ourmiavirus nemzetség

A bacilus alakú virionok mérete 24–41,6–76 nm × 18–21,1–26 nm. A virionok 15–25% nukleinsavat (egyszálú, lineáris RNS) és 75–85% fehérjét tartalmaznak. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők. A Pelargonium foltosság vírus (Pelargonium zonale spot ourmiavirus) maggal, pollennel és tripszekkel is átvihető.

Az Ourmiavirus nemzetségbe négy állandó vírus [manioka Ivoriai bacilus formájú vírus (cassava ivorian bacilliform ourmiavirus), epirusz cseresznye vírus (epirus cherry ourmiavirus), ourmia dinnye vírus (ourmia melon ourmiavirus), Pelargonium foltosság vírus] tartozik. A nevezett vírusok gazdanövényköre közepesen nagy. A nemzetségbe tartozó vírusok legjobb diagnosztikai és propagatív növényei közé tartozik a Chenopodium quinoa, a Gomphrena globosa, a Nicotiana glutinosa és a N. clevelandii.

Potexvirus nemzetség

A fonál alakú virionok mérete 470–580 nm × 13 nm. A genom lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 3,5 × 106. A virion fehérjeburka 1000–1500 fehérjealegységből áll, amelynek molekulatömege 18–27 × 103. A köpenyfehérje erősen immunogén, számos, a nemzetségbe tartozó vírusfaj között szerológiai rokonság van. A vírusok gazdanövényköre kiterjedt. Mechanikailag könnyen átvihetők, vektorok nem ismertek.

A Potexvirus nemzetségbe 20 állandó és 21 feltételezett vírusfaj tartozik. A Potexvirus nemzetség típustagja a burgonya X-vírus (potato X potexvirus), amely 515 nm hosszú és 13 nm átmérőjű (14. ábra). A virion 6% nukleinsavat és 94% fehérjét tartalmaz. Diagnosztikai növényei közül a Nicotiana tabacum, Datura stramonium és a Gomphrena globosa a legismertebb (14. ábra).

14. ábra - A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J. Brandes szívessége folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális léziókat mutató gazdanövényének (Gomphrena globosa) levele



A Potexvirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).

Sobemovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú virion 30 nm átmérőjű. A virionok 180 alegységből állnak, molekulatömegük 6,6 × 106. A vírusrészecskék pozitív, lineáris egyszálú RNS-t tartalmaznak. A köpenyfehérje molekulatömege 30 × 103. A fehérje jó immunogén. Az egyes vírusok törzsei között és a nemzetség néhány vírusfaja között szerológiai rokonság van.

A Sobemovirus nemzetségbe tartozó vírusok gazdanövényköre viszonylag szűk. A vírusok mechanikailag könnyen átvihetők. Egyes vírusok [Solanum nodiflorum foltosság vírus (Solanum nodiflorum mottle sobemovirus)] átvitelében a bogaraknak (Epilachna spp.) vagy egyéb rovaroknak (Cyrtopeltis nicotianae) van jelentősége [bársonyos dohány foltosság vírus (velvet tobacco mottle sobemovirus)].

A Sobemovirus nemzetségbe 10 állandó és 5 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), amely 21% nukleinsavat és 79% fehérjét tartalmaz. A vírus bogárvektorokkal (Ceratoma spp.) szemiperzisztens módon, valamint maggal és pollennel terjed. Gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai és propagatív növényei között a Phaseolus és Vigna fajoknak van a legnagyobb jelentőségük. A vírus egyes törzsei gazdaspecifikusságot mutatnak. A vírus típus „babtörzse” megfertőzi a Phaseolus vulgaris fajtákat, de apatogén a Vigna sinensis növényre. A vírus ún. „tehénborsó” (cowpea) törzse megbetegíti a legtöbb Vigna fajtát, de nem képes megbetegíteni a Phaseolus vulgaris fajtákat. A Sobemovirus nemzetségbe tartozik a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus) és a csomós



ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) (15. ábra).

15. ábra - A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28 nm) részecskéinek elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált, urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a vírusrészecskék hexagonális elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett vizsgálat alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C: C.I. Kado, D: A.J. Gibbs szívessége folytán]

A Sobemovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

A Sobemovirus nemzetség vírusfajaihoz hasonlóságot (morfológiai, az egyszálú genomikus RNS enkapszidációja stb.) mutatnak a Tombusviridae család Tombusvirus és Carmovirus nemzetségeibe tartozó vírusok. Ugyanakkor a sobemovirusok köpenyfehérjéjének molekulatömege és genomszerveződése eltér a fenti nemzetségek vírusfajaitól.

Tenuivirus nemzetség

A virionok vékonyak, fonál alakúak, 3–10 nm szélesek és spirálisak. A virion egyszálú, osztott RNS-t tartalmaz, amelynek négy típusa ismert. A kukorica sávos mozaik vírusnak (maize stripe mosaic tenuivirus) öt típusú RNS-e van. A nukleokapszidban levő fehérje molekulatömege 31–34 × 103, a beteg növényekben és kabócavektorokban kimutatott, nem strukturális protein molekulatömege 20 × 103. A nemzetségbe tartozó vírusok immunogének, de a tagok között csak a rizs csíkosság vírus (rice stripe tenuivirus) és a kukorica sávos mozaik vírus között van szerológiai rokonság. A Tenuivirus nemzetség vírusainak gazdanövényköre szűk, és csupán a Gramineae növénycsalád néhány fajára terjed ki. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, kabócákkal perzisztens módon terjednek.

A Tenuivirus nemzetségbe 4 állandó és 3 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a rizs csíkosság vírus, amely 12% RNS-t és 88% fehérjét tartalmaz. A vírus átvitelében a Laodelphax striatellus kabóca játssza a legfontosabb szerepet. Az átvitel perzisztens módon történik, a vírus a vektorban szaporodik (propagatív vírus). A vírus diagnosztikai és propagatív növénye az Oryza sativa, a Zea mays és a Triticum aestivum.

A Tenuivirus nemzetséget újabban a Mononegavirales rend Arenaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).



Tobamovirus nemzetség

A merev, pálcika alakú, helikális szimmetriájú virionok [pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] mérete 300 nm × 18 nm (16A ábra). A virion pozitív, lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 2 × 10 6. A köpenyfehérje molekulatömege 17–18 × 103. Az e nemzetségbe tartozó vírusok erősen immunogének. A legtöbb fajnak korlátozott gazdanövényköre van, vektor nélkül, mechanikailag terjednek, egyes vírusfajok terjedésében fontos szerepe van a maggal történő vírusátvitelnek.

16. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú virionjai (300 nm × 18 nm); B: dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun növény mozaikos és deformált levelei

A Tobamovirus nemzetségbe 13 állandó vírusfaj és 2 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus mechanikailag és maggal átvihető, de pollennel nem. Gazdanövényköre igen kiterjedt. Diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós gazdanövényei közül a Nicotiana tabacum cvs Samsun (16B ábra), Xanthi-nc, a N. glutinosa és a Chenopodium quinoa a legjelentősebb.

A nemzetség összes tagja szerológiailag különböző mértékben rokon.

A Tobamovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).

Tobravirus nemzetség

A cső alakú, merev, helikális szimmetriájú virionok alapvetően – az egyes izolátumoktól függően – nagy (180–215 nm) és kis partikulumokban (46–115 nm) nyilvánulnak meg (17A, B ábra). A virionok 21,3–23,1 nm átmérőjűek, amelyben a központi üreg átmérője 4–5 nm. A nagy virionok molekulatömege 48–50 × 10 6, a kis virionok molekulatömege 11–29 × 106. A virionok a különböző pH-értékekkel, szerves oldószerekkel szemben igen ellenállóak, de EDTA-kezeléssel szemben igen érzékenyek. A genom osztott, két lineáris, pozitív, egyszálú RNS-molekulát (RNS1, RNS2) tartalmaz. A strukturális fehérje molekulatömege 22–24 × 10 3. A Tobravirus nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Szerológiai rokonság a nemzetség tagjai között nincs, vagy ha van, igen kis mértékű. A gazdanövénykör mind az egyszikű, mind a kétszikű növényekre igen kiterjedt. Mechanikailag átvihetők, fonálférgekkel (Trichodorus spp., Paratrichodorus spp.) terjednek. A vírusok replikációja a vektor fonálférgekben nem bizonyított.

17. ábra - A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és rövid (B) (46–115 nm) partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel reagáló diagnosztikai növénye



A Tobravirus nemzetségbe 3 állandó vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus gazdanövényköre kiterjedt, mechanikailag, fonálférgekkel és néhány növény magjával (Viola arvensis, Capsella bursa-pastoris, Solanum tuberosum) kis mértékben átvihető. Diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós növényei közül jelentős a Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii, a Phaseolus vulgaris, a Solanum capsicastrum (17C ábra).

A Tobravirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).

Trichovirus nemzetség

A helikális szimmetriájú, fonál alakú virionok mérete 640–800 nm × 12 nm. A virionok mérsékelten toleránsak a hőmérséklettel (55–60 °C) és a szerves oldószerekkel szemben. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A köpenyfehérje molekulasúlya 22–27 × 103.

A Trichovirus nemzetségbe tartozó vírusok gyengén vagy mérsékelten immunogének. Gazdanövénykörük szűk, mechanikailag általában átvihetők.

A Trichovirus nemzetség típustagja az alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus).

A Trichovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringler, 1998).

Tymovirus nemzetség

Az ikozaéder szimmetriájú, burok nélküli vírusok átmérője 30 nm. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t tartalmaz, amely éterrel, kloroformmal és butanollal szemben stabil. A vírus közepesen immunogén; a nemzetség tagjai között részben szoros vagy távoli rokonság van, egyes vírusok között pedig szerológiai kapcsolat nem mutatható ki.

A Tymovirus nemzetség tagjainak gazdái a kétszikű növényekre terjednek ki. A viszonylag szűk gazdanövénykör magyarázatul szolgálhat a tymovirusok korlátozott elterjedéséhez. Mechanikailag és bogárvektorokkal terjednek (Phyllotreta spp., Psylloides spp., Phaedon cochleariae).

A Tymovirus nemzetségbe 17 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), amely 37% nukleinsavat és 63% fehérjét tartalmaz. A vírus gazdanövényköre szűk, mechanikailag, bogárvektorokkal és maggal (Camelina sativa) terjed. A Brassica chinensis (18A ábra), a B. rapa var. rapa és a Raphanus sativus a vírus diagnosztikai és propagatív gazdái. Ebbe a nemzetségbe tartozik a burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus), amely Dél- és Közép-Amerikában igen elterjedt burgonyapatogén vírus (18B ábra).

18. ábra - A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) propagatív gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm)



[A.J. Gibbs szívessége folytán]

A Tymovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998). A nemzetség tagjai morfológiailag hasonlítanak a Marafivirus nemzetség (Tymoviridae család) tagjaihoz. Ez utóbbi nemzetség tagjai azonban – ellentétben a tymovirusokkal – mechanikailag nem, csak kabócákkal vihetők át.

Umbravirus nemzetség

Burokkal határolt, 52 nm átmérőjű vírusrészecskéket sikerült eddig kimutatni a nemzetségbe tartozó sárgarépa foltosság vírussal (carrot mottle umbravirus) fertőzött növényi sejtek vakuoláiban. A fertőző nukleinsav egyszálú RNS, és feltehetően nem poliadenilált. Lipid előfordulása nem kizárt. A vírusok antigén tulajdonságai nem ismertek.

Az egyes umbravirusok természetes gazdái csak néhány növényre terjednek ki. A kísérleti gazdanövénykör szélesebb, de mindenképpen szűk. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, de specifikus segítő vírus (helper vírus) jelenlétében [levéltetvekkel nem perzisztens módon terjedő sárgarépa vörös levelűség vírus (carrot red leaf luteovirus)] az átvihetőség biztosított.

Az Umbravirus nemzetségbe 5 állandó és 4 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a sárgarépa foltosság vírus levéltetvekkel (Cavariella aegopodii) perzisztens módon terjed. Mechanikailag igen, de maggal és pollennel nem átvihető. A diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós gazdanövények közül legjelentősebb a Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii és a Phaseolus vulgaris.

A legújabb aminosav-szekvencia vizsgálatok hasonlóságot állapítottak meg az Umbravirus nemzetség, valamint a Carmo, a Tombus és a Luteovirus nemzetségek között. Az Umbravirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).

Varicosavirus nemzetség

A pálcika alakú, burok nélküli vírusok mérete 120–268,3–300 nm × 18–22–30 nm. A genom kettősszálú RNS. A nemzetségbe tartozó vírusok talajban élő gombával (Olpidium brassicae) terjednek. A nemzetségbe tartozó állandó vírusfajok közül a Freesia levél nekrózis vírus (Freesia leaf necrosis varicosavirus) mechanikailag nehezen, a saláta érvastagodás vírus (lettuce big-vein varicosavirus) és a dohány satnyulás vírus (tobacco stunt varicosavirus) mechanikailag könnyen átvihető.

A Varicosavirus nemzetségbe 3 állandó tag és 1 feltételezett tag [Camellia sárga foltosság vírus (Camellia yellow mottle ? varicosavirus)] tartozik.

Vitivirus nemzetség

A Vitivirus nemzetség (Nidovirales rend, Barnaviridae család) egy újabban ismertté vált vírusnemzetség (Martelli et al., 1997), amelynek típustagja a szőlő A-vírus (grapevine A vitivirus). Ide tartozik a burgonya T-vírus (potato T vitivirus) (19. ábra), amely korában a morfológiailag és fizikokémiailag hasonló Trichovirus nemzetségbe volt sorolva (Murphy et al., 1995). E vírusfajok újabb nemzetségbe sorolását és a trichovirusoktól történő elválasztását a legújabban megismert tropizmus, a génszerveződés és az epidemiológiai különbségek indokolják, amelyek között a legnagyobb jelentőségű volt a vitivirusokra jellemző két extra cisztron kódolta polipeptid. A fent említett két vitivirus természetes gazdanövényköre egy-egy fajra korlátozódik. Mindkét vírus



mechanikailag átvihető. A burgonya T-vírus maggal is terjed. A diagnosztikai és a propagatív gazdanövények közül legjelentősebb a Chenopodium quinoa, valamint a Phaseolus vulgaris.

19. ábra - A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm) [L.F. Salazar szívessége folytán]

4. Új rendszertani javaslatok4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb tulajdonságaiAz ICTV (Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság) 6. jelentését (vö. Murphy et al., 1995) követően több javaslat született a vírusok taxonómiájával kapcsolatban. Ezek közül az ICTV plenáris ülése a 10. Nemzetközi Virológiai Kongresszuson (Jeruzsálem, 1996) és az ICTV Végrehajtó Bizottsági Ülésén (Strasbourg, 1997) számos új javaslatot fogadott el (Pringle, 1998). Az elfogadott új javaslatokat (vírusrendek, víruscsaládok, vírusnemzetségek és típus vírusfajok) és a jelenleg érvényben lévő vírusrendszert a 3. táblázatban foglaljuk össze (Pringle, 1998; de Kochko et al., 1988; Smith és Baker, 1999).

3. táblázat - A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott vírusrendszer

Vírusrend Víruscsalád1 Vírusnemzetség Típustag angol (magyar) neve

Egyszálú

DNS vírusok

Geminiviridae Begomovirus

Curtovirus

Beán golden mosaic begomovirus

(Bab aranysárga mozaik vírus)



Mastrevirus Béét curly top curtovirus

(Répa levélcsúcs fodrosodás vírus)

Maize streak mastrevirus

(Kukorica csíkosság vírus)

DNS és RNS

fordított transz-

kripciójú

vírusok

Caulimoviridae Badnavirus

Caulimovirus

„Cassava vein mottle-like

viruses "

„Legume-infecting viruses"

„Rice tungro bacilliform-

like viruses "

Commelina yellow mottle badnavirus

(Commelina sárga foltosság vírus)

Cauliflower mosaic caulimovirus

(Karfiol mozaik vírus)

Cassava vein mosaic virus

(Cassava érmozaik vírus)

Soybean chlorotic mottle virus

(Szójabab klorotikus foltosság vírus)

Rice tungro bacilliform badnavirus

(Rizs tungro bacilus alakú vírus)

Kétszálú RNS

vírusok

Reoviridae Fijivirus

Oryzavirus

Phytoreovirus

Fiji disease/i/i'vi'nw

(Fiji betegség vírus)

Rice ragged stunt oryzavirus

(Rizs érdes törpülés vírus)

Clover wound tumor phytoreovirus

(Here seb tumor vírus)

Parti ti viridae Alphacrypto-

virus

Betacrypto-

virus

White clover cryptic alphacryptovirus

[=White clover 1 alphacryptovirus

(Fehérhere rejtett vírus 1)]

White clover cryptic betacryptovirus

[= White clover 2 betacryptovirus

(Fehérhere rejtett vírus 2]

Negatív szálú

RNS vírusok

Mono-

negavirales

Rhabdoviridae Cytorhabdo-

virus

Nucleorhabdo-

Lettuce necrotic yellows cytorhabdo-

virus (Saláta nekrotikus sárgaság vírus)



virus Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus

(Burgonya sárga törpülés vírus)

Arenaviridae Tenuivirus Rice stripe tenuivirus

(Rizs csíkosság vírus)

Bunyaviridae Tospovirus Tomato spotted wilt tospovirus

(Paradicsom bronzfoltosság vírus)

Pozitív szálú RNS vírusok

Nidovirales Barnaviridae Benyvirus

Capillovirus

Carlavirus

Furovirus

Hordeivirus

Idaeovirus

Marafivirus

Pecluvirus

Pomovirus

Potexvirus

Sobemovirus

Tobamovirus

Tobravirus

Trichovirus

Tymovirus

Umbravirus

Vitivirus

Beet necrotic yellow vein benyvirus (Répa nekrotikus sárgaerűség vírus)

Apple stem grooving capillovirus

(Alma törzsbarázdáltság vírus)

Carnation latent carlavirus

(Szegfű látens vírus)

Wheat soil-borne mosaic furovirus

(Búza talaj lakó mozaik vírus)

Barley stripe mosaic hordeivirus

(Árpa csíkos mozaik vírus)

Raspbery bushy dwarf idaeovirus

(Málna bokros törpülés vírus)

Maize rayado fino marafivirus

(Kukorica finom csíkozottság vírus)

Peanut clump pecluvirus

(Földimogyoró bokrosodás vírus)

Potato mop-topjromovi'nw

(Burgonya szártörpülés vírus)

Potato Xpotexvirus (Burgonya X- vírus)

Beán southern mosaic sobemovirus

(Bab déli mozaik vírus)

Tobacco mosaic tobamovirus

(Dohány mozaik vírus)



Tobacco rattle tobravirus

(Dohány rattle vírus)

Apple chlorotic leaf spot trichovirus (Alma klorotikus levélfoltosság vírus)

Turnip yellow mosaic tymovirus (Tarlórépa sárga mozaik vírus)

Carrot mottle umbravirus

(Sárgarépa foltosság vírus)

Grapevine A vitivirus (Szőlő A-vírus)

Bromoviridae Alfamovirus

Bromovirus

Cucumovirus

Ilarvirus

Oleavirus

Alfalfa mosaic alfamovirus

(Lucerna mozaik vírus)

Brome mosaic bromovirus

(Rozsnok mozaik vírus)

Cucumber mosaic cucumovirus

(Uborka mozaik vírus)

Tobacco streak ilarvirus

(Dohány csíkosság vírus)

Olive latent oleavirus [Olive latent 2 oleavirus (Olajfa látens vírus 2)]

1 A Tombusviridae családba egy újabb vírusnemzetséget (Aureusvirus) soroltak, amelybe a Pothos látens vírus (Pothos latent aureusvirus) tartozik (Martelli et al., 1998).

A vírusok jelenlegi ismereteink szerint 189 nemzetségbe sorolhatók. Ezek közül 166 nemzetség 55 víruscsaládba tartozik. A maradék 23 vírusnemzetség családi hovatartozása még nem nyert megállapítást. A növénypatogén vírusok a legújabb vírusrendszer alapján (3. táblázat) 16 családba tartoznak (Pringle, 1998). A növénypatogén vírusnemzetségek száma jelenlegi ismereteink szerint 57 (61). Minden nemzetséget egyetlen típus vírusfaj (tag) képvisel. A vírusnemzetségekre és típus vírusfajokra vonatkozó fontosabb adatok a 4. táblázatban találhatók meg. A 4. táblázat adatai alapján látható, hogy a nukleinsav típusában, a morfológiában, a vektorokban és a vírusátviteli lehetőségekben igen jelentős eltérések vannak a vírusnemzetségek és a típus vírusfajok között.

4. táblázat - Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb tulajdonságai


Vírusnemzetségek

Nukleinsav1'2

Morfológia Vektor/átvitel3 Típustag magyar (angol) neve4

típus konfiguráció

Alfamovirus ssRNS lineáris bacilus A/Me,S,P Lucerna mozaik vírus

(Alfalfa mosaic alfamovirus)

Alphacryptovirus

dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/Me,S Fehérhererejtettvírus 1

(White clover cryptic 1 alphacryptovirus)

Badnavirus dsDNS cirkuláris bacilus M,LH,?/- Commelina sárga foltosság vírus

(Commelina yellow mottle badnavirus)

Begomovirus ssDNS cirkuláris izometrikus (gemini)

T/Me(?) Bab aranysárga mozaik vírus

(Beán golden mosaic begomovirus)

Benyvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Répa nekrotikus sárgaerűség vírus

(Beet necrotic yellow vein benyvirus)

Betacryptovirus

dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/S Fehérhere rejtett vírus 2

(White clover cryptic 2 betacryptovirus)

Bromovirus ssRNS lineáris izometrikus A(?),N(?)/Me Rozsnok mozaik vírus

(Brome mosaic bromovirus)

Bymovirus ssRNS lineáris fonál F/Me Árpa sárga mozaik vírus

(Barley yellow mosaic bymovirus)

Capillovirus ssRNS lineáris fonál Nk,?/Me,S Alma törzsbarázdáltság vírus

(Apple stem grooving capillovirus)

Carlavirus ssRNS lineáris pálcika A/Me(?) Szegfű látens vírus

(Carnation latent carlavirus)

Carmovirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me Szegfű foltosság vírus

(Carnation mottle carmovirus)



„Cassava vein

mottle-like viruses"

dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Cassava érmozaik vírus

(Cassava vein mosaic virus)

Caulimovirus dsDNS cirkuláris izometrikus A/Me Karfiol mozaik vírus

(Cauliflower mosaic caulimovirus)

Closterovirus ssRNS lineáris fonál A,M/Me(?) Répa sárgaság vírus

(Beet yellows closterovirus)

Comovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tehénborsó mozaik vírus

(Cowpea mosaic comovirus)

Crinivirus ssRNS lineáris fonál W/Me(?) Saláta fertőző sárgaság vírus

(Lettuce infectious yellows crinivirus)

Cucumovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S Uborka mozaik vírus

(Cucumber mosaic cucumovirus)

Curtovirus ssDNS cirkuláris izometrikus (gemini)

LH/Me(?),Cu(?)_

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus

(Beet curly top curtovirus)

Cytorhabdovirus

ssRNS lineáris lövedék A,LH/Me Saláta nekrotikus sárgaság vírus

(Lettuce necrotic yellows virus)

Dianthovirus ssRNS lineáris izometrikus N(?)/Me Szegfű gyűrűsfoltosság vírus

(Carnation ringspot dianthovirus)

Enamovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S(?) Borsó enációs mozaik vírus

(Pea enation mosaic enamovirus)

Fabavirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Lóbab hervadás vírus

(Broad bean vfütfabavirus)

Fijivirus dsRNS lineáris izometrikus LH/Me(?) Fiji betegség vírus (Fiji disease/i/mmj)

Furovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Búza talaj lakó mozaik vírus



(Wheat soil-borne mosaic furovirus)

Hordeivirus ssRNS lineáris pálcika Nk,?/Me,S,P Árpa csíkos mozaik vírus

(Barley stripe mosaic hordeivirus)

Idaeovirus ssRNS lineáris izometrikus NK,?/Me,S,P(?)

Málna bokros törpülés vírus

(Raspberry bushy dwarf idaeovirus)

Ilarvirus ssRNS lineáris izometrikus (bacilus)

T/Me,S,P Dohány csíkosság vírus

(Tobacco streak ilarvirus)

„ Legume-infecüng

viruses "

dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Szójabab klorotikus foltosság vírus

(Soybean chlorotic mottle virus)

Luteovirus ssRNS lineáris izometrikus A/- Árpa sárga törpülés vírus

(Barley yellow dwarf luteovirus)

Machlomovirus

ssRNS lineáris izometrikus B,T/Me,S Kukorica klorotikus foltosság vírus

(Maize chlorotic mottle machlomovirus)

Macluravirus ssRNS lineáris fonál A/Me Maclura mozaik vírus

(Maclura mosaic macluravirus)

Maraflvirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Kukorica finom csíkozottság vírus

(Maize rayado fino marqflvirus)

Mastrevirus ssDNS cirkuláris izometrikus (gemini)

LH/- Kukorica csíkosság vírus

(Maize streak mastrevirus)

Nanavirus ssDNS cirkuláris izometrikus A/- Lóbab nekrotikus sárgaság vírus

(Fába bean necrotic yellows nanavirus)

Necrovirus ssRNS lineáris izometrikus F/Me Dohány nekrózis vírus



(Tobacco necrosis necrovirus)

Nepovirus ssRNS lineáris izometrikus N,A(?)T(?)/Me,S,P

Dohány gyűrűsfoltosság vírus

(Tobacco ringspot nepovirus)

Nucleorhabdovirus

ssRNS lineáris bacilus (lövedék)

A,LH/Me, Tu Burgonya sárga törpülés vírus

(Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)

Oleavirus ssRNS lineáris izometrikus ?/Me Olajfa látens vírus 2

(Olive latent 2 oleavirus)

Oryzavirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs érdes törpülés vírus

(Rice ragged stunt oryzavirus)

Ourmiavirus ssRNS lineáris bacilus Nk,?/Me,S,P Dinnye ourmia vírus

(Melón ourmia ourmiavirus)

Pecluvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me,S Földimogyoró bokrosodás vírus

(Peanut clump pecluvirus)

Phytoreovirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Here seb tumor vírus

(Clover wound tumor phytoreovirus)

Polerovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Tu Burgonya levélsodródás vírus

(Potato \eafro\\polerovirus)

Pomovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me, Tu Burgonya szártörpülés vírus

(Potato mop-top pomovirus)

Potexvirus ssRNS lineáris fonál Mi,A,?/Me, Tu

Burgonya X- vírus (Potato X potexvirus)

Potyvirus ssRNS lineáris fonál A/Me, Tu Burgonya Y- vírus (Potato Y potyvirus)

Rymovirus ssRNS lineáris fonál Mi/Me Angolperje mozaik vírus

(Ryegrass mosaic rymovirus)

„Rice tungro bacilli-form-like viruses "

dsDNS cirkuláris bacilus LH/- Rizs tungro bacilus alakú vírus

(Rice tungro bacilliform badnavirus)



Sequivirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Paszternák sárga foltosság vírus

(Parsnip yellow fleck sequivirus)

Sobemovirus ssRNS lineáris izometrikus A,LH,B/Me,S,P

Bab déli mozaik vírus

(Beán southern mosaic sobemovirus)

Tenuivirus ssRNS lineáris amorf LH/Me(?) Rizs csíkosság vírus

(Rice stripe tenuivirus)

Tobamovirus ssRNS lineáris pálcika NK,?/Me,S Dohány mozaik vírus

(Tobacco mosaic tobamovirus)

Tobravirus ssRNS lineáris pálcika N/Me,S Dohány rattle vírus

(Tobacco rattle tobravirus)

Tombusvirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me,S(?),P(?)

Paradicsom bokros törpülés vírus (Tomato bushy stunt tombusvirus)

Trichovirus ssRNS lineáris fonál M/Me(?) Alma klorotikus levélfoltosság vírus (Apple chlorotic leaf spot trichovirus)

Tospovirus ssRNS lineáris izometrikus T/Me Paradicsom foltos hervadás vírus [syn.: paradicsom bronzfoltosság vírus

(Tomato spotted wilt tospovirus)]

Tymovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tarlórépa sárga mozaik vírus

(Turnip yellow mosaic tymovirus)

Umbravirus ssRNS lineáris nem ismert A/Me Sárgarépa foltosság vírus

(Carrot mottle umbravirus)

Varicosavirus dsRNS lineáris pálcika F/Me Dohány satnyulás vírus

(Tobacco stunt varicosavirus)

Vitivirus ssRNS lineáris fonál M/Me Szőlő A-vírus (Grapevine A vitivirus)

Waikavirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs tungro szférikus vírus



(Rice tungro spherical waikavirus)

1 ss = single stranded (egyszálú).

2 ds = double stranded (kétszálú).

3 A számlálóban a vektorra, a nevezőben az egyéb átviteli lehetőségekre (különös tekintettel a típus vírusfajra) vonatkozó adatok vannak feltüntetve. Számlálóban: A = aphids (leveltetvek), B = beetles (bogarak), F = fungus (gombák), LH = leafhoppers (kabócák), M = mealybugs (vandorpajzstetvek), Mi = mites (atkák), N = nematodes (fonálférgek), Nk = nőt known (nem ismert), T = thrips (tripszek), W = whiteflies (molytetvek), - = a típus vírusfaj vektora (aláhúzva), 2 = a típus vírusfaj vektora ismeretlen (aláhúzva), (?) = a vektor bizonytalan, vagy a vektorral és egyéb átviteli módszerrel történő terjedés bizonytalan (esetleg csak speciális eljárással lehetséges). Nevezőben: Cu = Cuscuta spp., Me = mechanical transmission (mechanikai átvitel), P = pollen (virágpor), S = seeds (magvak),Tu = tuber (burgonyagumó), -= az oltással történő átvitelen kívül egyéb terjedés nem ismert.

4 A Nanavirus nemzetség típustagja nincs definiálva. A lóbab nekrotikus sárgaság vírus (fába bean necrotic yellows nanavirus) az öt nanavirus egyik tagja (Brunt ét ál., 1996a,b).

Az összefoglaló áttekintés alapján megállapítható, hogy a 61 növénypatogén vírusnemzetségből 52 RNS-t és 9 DNS-t tartalmaz (5. táblázat). Az 5. táblázatban jelentős többségben vannak az izometrikus vírusok (34), a levéltetvekkel átvihető vírusok (18), valamint a mechanikailag átvihető vírusok (50). A típus vírusfajok között vannak fonál, pálcika, bacilus, amorf és lövedék alakú vírusok is. Egyetlen vírusnak [sárgarépa foltosság vírus (carrot mottle umbravirus)] ismeretlen egyelőre a pontos morfológiája. A típus vírusfajok egy része levéltetűvektorokon kívül még kabócákkal, bogarakkal, fonálférgekkel, atkákkal, tripszekkel és fehérlegyekkel (liszteskékkel), valamint gombavektorokkal és maggal, továbbá pollennel is átvihetőek (4. és 5. táblázatok).

5. táblázat - A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló tulajdonságai1

Tulajdonságok A típus vírusfajok száma Tulajdonságok A típus vírusfajok száma

Nukleinsav:

ssRNS

dsRNS

ssDNS

dsDNS

46

6

4

5

Vektor (állati):

levéltetvek

kabócák

bogarak

fonálférgek

atkák

tripszek

fehérlegyek

vándorpajzstetvek

18

11

6

3

o

5

2

1

Morfológia:

izometrikus

fonál

pálcika

bacilus

izometrikus (gemini)

izometrikus (bacilus)

amorf

30

10

9

4

3

1

1

1



lövedék

bacilus lövedék

nem ismert

1

1

1 A táblázatban csak azokat az ismereteket tettük közzé, amelyek az egyes típus vírusfajok esetében bizonyítást nyertek. Tehát az olyan adatok, mint pl. a Cuscuta-fajokkal bizonytalanul, vagy nem igazolhatóan átvihető vírus [répa levélcsúcs fodrosodás vírus (béét curly top curtovirus)], vagy a mechanikailag nehezen átvihető vírus [bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)] nem szerepel a táblázatban.

4.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusokA vírusok egy része – tulajdonságaik ismeretének hiányos volta miatt – családokba, nemzetségekbe még nem sorolható. Murphy et al. (1995) legújabb vírustaxonómiai munkája 24 olyan növény-, állat-, gomba- és rovarpatogén vírust ismertet, amelyek rendszertanilag még nem sorolhatók be. Ebben a kiadványban 11 rendszertanilag nem ismert növénypatogén vírus van, amelyek között mind RNS-, mind DNS-tartalmú vírusok megtalálhatók. A molekuláris virológiai és biológiai kutatások intenzitását jellemzi, hogy Brunt et al. (1996a) – az előző kiadványt követő egy év múlva – a korábban rendszertanilag nem ismert vírusból nyolcat rendszertanilag besorolt legalapvetőbb tulajdonságaik megismerése után.

Jelenlegi ismereteink szerint az egyszálú RNS-növényvírusok közül a kukorica fehérvonalas vírus (maize white line mosaic virus, MWLMV) és a szőlő foltosodás vírus (grapevine fleck virus, GFkV) rendszertani helye nem ismert (de Zoten és Reddick, 1984; Boulila et al., 1990). A kétszálú DNS-növényvírusok közül az uborka érsárgulás vírus (cucumber vein yellowing virus, CVYV) rendszertani besorolásra vár (Sela et al., 1980).

Milne et al. (1996) az Ophiovirus csoport (nemzetség) elfogadását javasolja. Ennek a javasolt új nemzetségnek (csoportnak) a tagjai a tulipán enyhe foltosság vírus (tulip mild mottle ? ophiovirus), a Ranunculus 3 vírus (Ranunculus 3 ? ophiovirus), a citrus sömör-gyűrűsfoltosság vírus (citrus psorosis-ringspot ? ophiovirus) hasonlítanak a Tenuivirus nemzetség tagjaihoz, de gazdanövényei a Gramineae családba nem tartoznak. Mindhárom vírusfaj egyszálú RNS-t tartalmaz, a fehéjeburok 42–50 kD, mechanikailag kétszikű növényekre vihetők át. A virionok nemcsak a floemben, hanem a parenhimasejtekben is megtalálhatók. A fenti három vírus szerológiailag nem rokon. Kígyószerű (snaky) virionjaik és fenti tulajdonságaik alapján Milne et al. (1996) szerint ophiovirusnak tekintendők.


4. fejezet - A vírusok adatbázisaAz újabb és újabb gazda–vírus kapcsolatok megállapításával lényegesen kiszélesedett a vírusok földrajzi elterjedése is. A vírusdiagnosztikai technikák és a molekuláris virológiai vizsgálatok egyre biztonságosabbá váltak. Az ICTV 50 víruscsaládot, 9 alcsaládot, 164 nemzetséget és több mint 3600 vírusfajt regisztrál, és jelentősen több a vírustörzsek, altípusok és a kellőképpen nem identifikált vírusok száma. Megállapítható, hogy jelenleg a világ víruslaboratóriumaiban mintegy 30 000 víruskultúrát tartanak nyilván. A vírusok adatbázisa mintegy 500–1000 tulajdonságot vesz figyelembe (cf. Boswell et al., 1986). Ezeket a tulajdonságokat az Univerzális Vírus Adatbank az ICTVDB (International Committee on Taxonomy on Viruses Database) őrzi. A növényvírusok adatbázisát (VIDE Project = Virus Identification Data Exchange) az Ausztráliai Nemzeti Egyetem (Australian National University, Canberra, Australia) az angol Nemzetközi Kertészeti Kutatási Központtal (Horticulture Research International, Littlehampton, UK) és a Mezőgazdasági és Élettudományi Nemzetközi Központtal (Centre for Agriculture and Biosciences International, Wallingford, UK) együtt kezeli. A VIDE adatbázis jelenleg 55 nemzetségbe tartozó, több mint 890 vírusfaj 569 jellemzőjét tartalmazza (Boswell et al., 1986; Brunt et al., 1990; Brunt et al., 1996b).

1. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban1.1. Az adatbázis elvi szempontjaiA vírusokat – mint obligát sejtparazitákat – két, nem összefüggő fázisból álló biokémiai életciklus különbözteti meg a mikroorganizmusoktól. A diszperzív fázisban (1) a vírusok olyan részecskék, amelyek a genomot egy fehérjeburokban (köpenyfehérje) tartalmazzák. Egyes vírusok virionjai még enzimeket is tartalmaznak, gyakran vírus-transzkriptázokat, de sohasem katabolikus enzimeket vagy transzfer-RNS-t (t-RNS). A reproduktív fázisban (2) a vírus a fogékony gazdanövénybe kerül és ott szétbomlik. Ekkor a vírusgének metabolikusan aktívvá válnak, megváltoztatják a gazdanövény anyagcseréjét úgy, hogy az lemásolja a vírusgenomot és vírusfehérjéket hoz létre. Ezt követően az „utód” genomok és a vírusfehérjék egyesülnek, virionokat hoznak létre. A fentiekre tekintettel tehát a vírusok életciklusában metabolikusan inaktív virionok és reprodukálódó vírus-makromolekulák váltakoznak. Mindkét fázis (diszperzív és reproduktív) olyan információkat szolgáltat, amelyek a vírusok (egy új vírus) meghatározásához és jellemzéséhez feltétlen szükségesek. A diszperzív fázisban lévő virionok biokémiailag jellemezhetők, a reproduktív fázis pedig információt nyújt a vírus gazdanövénykörére, a tünetekre és a replikációs stratégiára (Boswell és Gibbs, 1983).

1.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjaiEgy új vírus identifikálása abból áll, hogy megállapítjuk az ismeretlen vírus tulajdonságait és azokat összehasonlítjuk a már ismert vírusok tulajdonságaival; ennek alapján eldönthető, hogy az „ismeretlen” vírust korábban leírták-e. A korábban leírt vírusok nagy része megfelelően jellemzett, és ezek a jellemzők (specifitások) az ún. „Adatbázis”-ban vannak tárolva (Boswell és Gibbs, 1983; Boswell et al., 1986; Brunt et al., 1990, 1996). Az „Adatbázis”-ban tárolt vírus-jellemzők összehasonlíthatók az „ismeretlen” vírusról szerzett információkkal. Ennek alapján kerülhet meghatározásra az a víruscsoport, ahova az „ismeretlen vírusfaj” tartozik. A víruscsoportnak és a vírusfajnak azonban nincsenek abszolút kritériumai, csupán a célszerűség miatt került sor ilyen taxonok megállapítására. A vírusnemzetség (csoport) olyan vírusok kollekciója, amelyeknek közös tulajdonságaik vannak; egy ilyen csoportosítás már nagymértékben segíti az „ismeretlen” vírus meghatározását.

Az egyes vírusnemzetségeket az alábbi közös tulajdonságok jellemzik: (1) a víruspartikulumok azonos szerkezete és csaknem azonos összetétele, (2) hasonló genomstratégia, (3) hasonló ökológiai életciklus, (4) hasonló természetes és mesterséges gazdanövénykör, (5) azonos növényfajokon okozott azonos tünetek, (6) azonos vektorfajok. A víruspartikulumok azonos szerkezetére (összetételére), a hasonló genomstratégiára és a hasonló ökológiai életciklusra vonatkozó adatok igen hasznosak az „ismeretlen” vírus faji hovatartozásának az előrejelzésére; ezek a tulajdonságok azért is fontosak, mert tükrözik evolúciós kapcsolatukat, azokat a tulajdonságokat, amelyeket a közös őstől örököltek.

A természetes és mesterséges gazdanövénykörre, a tünetekre és a vektorokra vonatkozó adatok egymagukban nem adnak elégséges információt az identifikáláshoz. Az „Adatbázis” kétharmada mégis a gazdanövények vírusfogékonyságára vonatkozó ismereteket tartalmazza annak ellenére, hogy minden virológus egyetért


A vírusok adatbázisa

Hamilton et al. (1981) véleményével, mely szerint a tesztnövények és a tünetek a vírusidentifikálásban nem a legfontosabbak, de a vírusok standardizálásában nélkülözhetetlenek. Ezt bizonyítja az a tény, hogy a tünetek, amelyeket az „ismeretlen” vírus egy standard indikátornövény-soron létrehoz, feltehetően a leghasznosabb információk arra vonatkozóan, hogy az adott vírus nem tagja-e egy bizonyos víruscsoportnak.

1.3. A vírusidentifikálás stratégiájaEgy „ismeretlen” vírus identifikálása során a diagnosztikai stratégiának három követelményt kell kielégítenie: (1) a víruspartikulumok szerkezete, összetétele, a genomstratégia és az ökológiai életciklus alapján megállapítani, hogy az „ismeretlen” vírus melyik vírusnemzetségbe (csoportba) tartozik, (2) a gazdanövénykörökben, a tünetekben és a vektorokban megnyilvánuló eltérések alapján különbséget kell tenni az egyes vírusfajok között, (3) a provizórikus diagnózist specifikus vírusdiagnosztikai módszerek-kel (szerológia, nukleinsav-hibridizáció, nukleotid- vagy aminosav-sorrend, immuno-elektronmikroszkópos vizsgálat stb.) kell kiegészíteni.

Egy ismeretlen vírus identifikálása során a vírust jellemző tulajdonságok megállapításán kívül szükség van a korábban leírt vírusokról szerzett információkra is, amelyeket az „Adatbázis” tartalmaz. A pragmatikus, vagy logikai identifikációs stratégia a különböző forrásokból szerzett információkra épül (20. ábra). A pragmatikus stratégia azon a tényen alapul, hogy mindegyik vírus egy meghatározott gazdanövénykörrel rendelkezik, ami kiterjed egynéhány vagy több növénycsaládra, és ezeket a növényeket könynyebb identifikálni, mint a vírusokat. Először a vírus természetes gazdájának meghatározására kerül sor, majd ezt követően meg kell állapítani, hogy az adott gazdanövényből korábban milyen vírust vagy vírusokat izoláltak, és ezeknek a vírusoknak a tulajdonságait össze kell hasonlítani az ismeretlen vírus tulajdonságaival. Bizonytalan esetekben szerológiai és nukleinsav-hibridizációs vizsgálatot kell végezni. A fentiekre tekintettel az identifikációs stratégia iránya a 20. ábra felső részén kezdődik, és folytatódik a specifikus összehasonlító tesztekkel. A logikai identifikációs stratégia első lépése annak a megállapítása, hogy az ismeretlen vírus melyik víruscsoport csoportspecifikus tulajdonságaihoz (víruspartikulumok alakja és mérete) hasonlít. Ezt követik a specifikus identifikálási módszerek (lásd 20. ábra).

20. ábra - A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja. GVL = gazda–vírus lista, VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al., 1990 után]

1.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők)Az individuális vírusok „Adatbázisa” 18 fő szempontra van tekintettel, ezen belül pedig több mint 500 tulajdonságkaraktert foglal magában. A 18 fő szempont a következő: (1) a vírus neve, (2) bevezetés, (3) természetes gazdanövénykör és tünetek, (4) átvitel és ökológia, (5) geográfia és elterjedés, (6) kísérleti gazdanövénykör, (7) a víruspartikulum stabilitása és koncentrációja növényi szövetnedvben, (8) vírustisztítás, (9) morfológia, (10) fizikai tulajdonságok, (11) kémiai összetétel, (12) replikáció, (13) citopatológia, (14) szerológia, (15) rokonsági kapcsolatok, (16) diagnózis, (17) irodalom, (18) megjegyzés (ha van). A fő szempontokon belül több mint 500 ismert karaktert tárol az „Adatbázis”. A „Vírusátvitel és ökológia” című pont a fő szemponton belül pl. a következő karaktereket (jellemzőket) is tartalmazza:

A vírus terjedése a természetben:



1. Vektorral?

2. Vektor nélkül?

3. Egyéb módszerrel? Ha igen, megnevezni!

Ha a vírus vektorral átvihető:

Vektorok:

1. A vektorok rovarok?

2. A vektorok atkák?

3. A vektorok fonálférgek?

4. A vektorok gombák?

5. A vektorok egyéb organizmusok?

A vektorok hova tartoznak?

1. Aleyrodidae?

2. Aphididae?

3. Cicadellidae?

4. Delphacidae?

5. Gymnocerata?

6. Psyllidae?

7. Membracidae?

8. Pseudococcidae?

9. Coleoptera?

10. Thysanoptera?

11. Eryophidae?

12. Tetranychidae?

13. Dorylamidae?

14. Trichodoridae?

15. Plasmodiophorales?

16. Chytridiales?

17. Egyéb? Ha igen, megnevezni!

Ha a vektor rovar, milyen kapcsolata van a vírussal?

1. Nem perzisztens?

2. Szemiperzisztens?

3. Perzisztens (cirkulatív)?



A vírust:

1. Megőrzi a vektor, ha vedlik?

2. Elveszíti a vektor, ha vedlik?

A vírus:

1. Szaporodik a vektorban?

2. Nem szaporodik a vektorban?

A vírus:

1. Átvihető az utódokkal (pl. tojás)?

2. Nem vihető át az utódokkal?

Szükség van, vagy nincs szükség helper (segítő) komponensre az átvitelnél?

1. Szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?

2. Nem szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?

3. Szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?

4. Nem szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?

Ha a vírus nem vektorral vihető át, akkor:

A vírus:

1. Mechanikailag terjed?

2. Nem terjed mechanikailag?

A vírus:

1. Oltással vihető át?

2. Nem vihető át oltással?

A vírus:

1. Átvihető kontaktérintkezéssel?

2. Nem vihető át kontaktérintkezéssel?

A vírus:

1. Átvihető maggal?

2. Nem vihető át maggal?

A vírus:

1. Átvihető pollennel és maggal?

2. Átvihető pollennel történő beporzással?

3. Nem vihető át pollennel?

A „Morfológia” című, 9. pontba tartozó fő szemponton belül pl. a következő karakterek vannak:



A víruspartikulumok:

1. Izometrikusak?

2. Ikerpartikulumok (gemini)?

3. Bacilus formájúak?

4. Pálcika vagy fonál alakúak?

5. Rhabdovirus-szerűek?

6. Szokatlan alakúak? Megnevezni!

A vírus:

1. Rendelkezik lipid burokkal?

2. Nem rendelkezik lipid burokkal?

Izometrikus, kvázi-izometrikus, gemini vagy bacilus formájú víruspartikulumok:

Víruspartikulumok:

1. Mekkora az átmérő nm-ben?

2. Mi a hosszúsága a bacilus formájú víruspartikulumoknak, vagy mi a tengelyhosszúsága az ikerpartikulumoknak nm-ben?

Profil:

1. Lekerekített?

2. Angularis (szögletes)?

3. Átmeneti?

Kapszomer elrendeződés:

1. Jól látható?

2. Nem látható jól?

Pálcika alakú, fonál alakú vagy rhabdovirus alakú víruspartikulumok:

Partikulumok:

1. Pálcika?

2. Fonál?

Partikulumok:

1. Hosszúsága tisztán látható?

2. Hosszúsága nem látható tisztán?

Partikulumok:

1. Mekkora a tiszta hosszúság nm-ben?

2. Mekkora az átmérő nm-ben?

Axiális csatorna:



1. Látható?

2. Homályos?

Mekkora az axiális csatorna átmérője nm-ben?

A vírusrészecske fő spirálja:

1. Látható?

2. Homályos?

Mekkora a fő spirál emelkedése nm-ben?

A nukleotidák/köpenyfehérje-alegységek száma?

Fehérjealegységek/spirál fordulatszáma?

Minden partikulumtípusra vonatkozóan:

A fertőzött növény szövetnedve:

1. Kevés partikulumot (kevesebb mint 10 partikulum/látómező, 20 000-szeres nagyításnál) tartalmaz?

2. Sok partikulumot (több mint 10 partikulum/látómező, 20 000 szeres nagyításnál) tartalmaz?

Szükséges-e fixálni a víruspartikulumokat a negatív festés előtt?

A 18 fő szempontot és több mint 500 tulajdonságot magában foglaló „Adatbázis” több szempontból is igen jelentős: a) „ismeretlen” vírusok tulajdonságainak egzakt megállapításánál nélkülözhetetlen, b) új vírusok elismertetése összehasonlító tulajdonságok nélkül nem lehetséges, c) a víruskutatásban és a vírusok egyetemi oktatásában nélkülözhetetlen.


5. fejezet - A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjaiA vírusok elnevezése és a vírusnevek gyakran pontatlan használata számos problémát és félreértést okozott. Az idegen nyelvekből magyarra fordított vírusnevek a hazai irodalomban sem egységesek, és sok esetben hibásak. Több hazai virológus megkísérelte közreadni a vírusok magyar neveit azzal a céllal, hogy a hazai nómenklatúra egységes legyen. Az első ilyen összefoglaló munka Horváth (1972) nevéhez fűződik. Ebben a munkában mintegy 700 növényvírus javasolt magyar neve található meg. Ezt követte V. Németh (1979) munkája, amely elsősorban a gyümölcsfapatogén vírusok magyar neveit adta közre. Ez a két kézikönyv a növényvírusok magyar neveit illetően ma is alapműnek tekinthető. Tekintettel azonban arra, hogy az egyes nyelvek (többek között a magyar) nem tudják minden esetben pontosan visszaadni az eredetileg legtöbbször angol nyelven leírt vírusok nevét, a növényvirológiában a vírusnevek írását illetően az angol nómenklatúra az elfogadott, amely minden nemzet virológusai számára azonos értelmű és kötelező.

A növényvírusok nevei többnyire három [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] vagy négy szóból állnak [Dandelion sárga mozaik vírus (Dandelion yellow mosaic sequivirus)], de ismertek öt szóból álló vírusnevek is [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus)]. Ezek írása, esetleg többször ismétlése egy tanulmányon belül szükségessé tette olyan betűszavak (akronímok) használatát, amelyekkel a vírusok nevei lerövidíthetőek. Az akronímoktól elvárandó követelmények a következők: legyenek egyszerűek, kerüljék az ismétléseket és a vírus szót, ill. nemzetségnevet „V” betűvel fejezzék ki (a viroidoknál ez „Vd”). A vírusok standard akronímjairól elsőként Hull et al. (1991) közölt listát. Ebben a listában több mint 500 növényvírus akronímja található meg. Az akronímok fellelhetők még Matthews (1991), Horváth (1993a, b, c) és Brunt et al. (1996a, b) összefoglaló munkáiban.

Az e könyvben előforduló vírusok magyar és angol hivatalos neveit, valamint akronímjait a 6. táblázat tartalmazza.

6. táblázat - A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

Magyar név Angol név Akroním

Abutilon sárgaság vírus Abutilon yellows ? crinivirus* AYV

Alma 227 epinasztia és pusztulás vírus

Apple spy 227 epinasty and decline virus (syn.: Quince sooty ring spot virus); (syn.: Apple stem pitting virus)

ASEDV

Alma klorotikus levélfoltosság vírus

Apple chlorotic leaf spot trichovirus**

ACLSV

Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus ApMV

Alma törzsgöndörödés vírus Apple stem pitting virus****** ASPV

Alma törzsbarázdáltság vírus Apple stem grooving capillovirus ASGV

Ananász klorotikus levélcsíkosság vírus

Pineapple chlorotic leaf streak ? nucleorhabdovirus

PCLSV

Angolperje mozaik vírus Ryegrass mosaic rymovirus RGMV

Anthoxanthum látens halvány Anthoxanthum latent blanching ALBV


A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai

vírus hordeivirus

Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus ArMV

Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus AVB

Articsóka tarka fodrosodás vírus

Artichoke mottled crinkle tombusvirus

AMCV

Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus BLMV

Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus BSMV

Árpa sárga csíkos mozaik vírus

Barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus

BYSMV

Árpa sárga mozaik vírus Barley yellow mosaic bymovirus BaYMV

Árpa sárga törpülés vírus Barley yellow dwarf luteovirus BYDV

Árpa sárga törpülés vírus MAV törzs

Barley yellow dwarf luteovirus (MAV strain)***

BYDV-MAV

Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic begomovirus**

BGMV

Bab déli mozaik vírus Bean southern mosaic sobemovirus

SBMV

Bab enyhe mozaik vírus Bean mild mosaic carmovirus BMMV

Babhüvely foltosság vírus Bean pod mottle comovirus BPMV

Bab közönséges mozaik vírus Bean common mosaic potyvirus BCMV

Bab sárga érszalagosodás vírus

Bean yellow vein banding umbravirus

BYVBV

Bab sárga mozaik vírus Bean yellow mosaic potyvirus BYMV

Bab törpülés mozaik vírus Bean dwarf mosaic begomovirus BDMV

Baktövis (Astragalus) törpeség vírus

Milk vetch dwarf nanavirus MVDV

Banán csúcscsokrosodás vírus Banana bunchy top nanavirus BBTV

Bársonyos dohány foltosság vírus

Velvet tobacco mottle sobemovirus

VTMoV

Beléndek mozaik vírus Henbane mosaic potyvirus HMV

Borsó ál-levélsodródás vírus Pea false leaf roll virus PFLV*



Borsó enációs mozaik vírus Pea enation mosaic enamovirus PEMV

Borsó korai barnulás vírus Pea early browning tobravirus PEBV

Borsó súlyos mozaik vírus Pea severe mosaic potyvirus PeSMV

Burgonya andeszi foltosság vírus

Potato Andean mottle comovirus APMoV

Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus APLV

Burgonya A-vírus Potato A potyvirus PVA

Burgonya fekete gyűrűsfoltosság vírus

Potato black ringspot nepovirus PBRSV

Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll luteovirus PLRV

Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll polerovirus PLRV

Burgonya M-vírus Potato M carlavirus PVM

Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus PYV

Burgonya S-vírus Potato S carlavirus PVS

Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus

PYDV

Burgonya szártarkulás vírus Tobacco rattle tobravirus TRV

Burgonya szártörpülés vírus Potato mop-top pomovirus** PMTV

Burgonya T-vírus Potato T vitivirus** PVT

Burgonya X-vírus Potato X potexvirus PVX

Burgonya Y-vírus Potato Y potyvirus PVY

Burgonya V-vírus Potato V potyvirus PVV

Búza csíkos mozaik vírus Wheat streak mosaic tritimovirus***

WSMV

Búza talajlakó mozaik vírus Wheat soil-borne mosaic furovirus

SBWMV

Búza törpülés vírus Wheat dwarf monogeminivirus WDV

Camellia sárga foltosság vírus Camellia yellow mottle ? varicosavirus

CYMV

Cassava afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic ACMV



bigeminivirus

Cassava barna csíkossággal-társult vírus

Cassava brown streak-associated carlavirus

CBSaV

Cassava érmozaik vírus Cassava vein mosaic virus CsVMV

Chenopodium mozaik vírus Sowbane mosaic sobemovirus SoMV

Chrysanthemum szárnekrózis vírus

Chrysanthemum stem necrosis tospovirus

CSNV*

Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus CVEV

Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus CRSV

Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus CiLV

Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus CiMV

Citrus psorozis vírus Citrus psorosis virus CiPV

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus CTLV

Citrus sömör-gyűrűsfoltosság vírus

Citrus psorosis-ringspot ? ophiovirus

CPsRSV

Citrus tarkaság vírus Citrus variegation ilarvirus CVV

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus CTV

Commelina sárga foltosság vírus

Commelina yellow mottle badnavirus

ComYMV

Cukkini letális klorózis vírus Zucchini lethal chlorosis tospovirus

ZLCV*

Cukkini sárga mozaik vírus Zucchini yellow mosaic potyvirus ZYMV

Cukornád enyhe mozaik vírus Sugarcane mild mosaic closterovirus

SMMV

Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus

Cymbidium ringspot tombusvirus CymRSV

Cseresznye aprógyümölcsűség vírus

Cherry little cherry virus CLCV

Cseresznye érdeslevelűség vírus

Cherry rasp leaf nepovirus CRLV

Cseresznye levélsodródás vírus

Cherry leafroll nepovirus CLRV



Csomós ebír foltosság vírus Cocksfoot mottle sobemovirus CoMV

Csorbóka sárgaerűség vírus Sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus

SYVV

Dandelion sárga mozaik vírus Dandelion yellow mosaic sequivirus

DYMV

Dália mozaik vírus Dahlia mosaic caulimovirus DMV

Dendrobium érnekrózis vírus Dendrobium vein necrosis ? closterovirus

DVNV

Dinnye foltos hervadás vírus Melon spotted wilt tospovirus* MSWV

Dinnye ourmia vírus Melon ourmia ourmiavirus OuMV

Diodia érklorózis vírus Diodia vein chlorosis ? crinivirus DVCV

Dioscorea bacilus alakú vírus Dioscorea bacilliform badnavirus DBV

Dohány csíkosság vírus Tobacco streak ilarvirus TSV

Dohány enyhe zöld mozaik vírus

Tobacco mild green mosaic tobamovirus

TMGMV

Dohány érfoltosság vírus Tobacco vein mottling potyvirus TVMV

Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco ringspot nepovirus TRSV

Dohány karcolatos vírus Tobacco etch potyvirus TEV

Dohány mozaik vírus Tobacco mosaic tobamovirus TMV

Dohány nekrotikus törpülés vírus

Tobacco necrotic dwarf luteovirus TNDV

Dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis necrovirus TNV

Dohány rattle vírus Tobacco rattle tobravirus TRV

Dohány sárga törpülés vírus Tobacco yellow dwarf monogeminivirus

TYDV

Dohány satnyulás vírus Tobacco stunt varicosavirus TStV

Édesburgonya enyhe foltosság vírus

Sweet potato mild mottle ipomovirus

SPFMV

Édesburgonya klorotikus törpülés vírus

Sweet potato chlorotic stunt ? crinivirus

SPVSV

Édesburgonya sárga törpülés Sweet potato yellow dwarf SPMMV



vírus ipomovirus

Epirusz cseresznye vírus Epirus cherry ourmiavirus EpCV

Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus EuMV

Fehérhere mozaik vírus White clover mosaic potexvirus WClMV

Fehérhere rejtett vírus 1 White clover cryptic alphacryptovirus

WCCV-1

Fehérhere rejtett vírus 2 White clover cryptic betacryptovirus

WCCV-2

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus BRLV

Fiji betegség vírus Fiji disease fijivirus FDV

Földieper enyhe sárga levélszélűség

Strawberry mild yellow edge ? potexvirus vírus

SMYEaV

Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ? caulimovirus*******

SVBV

Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle cytorhabdovirus

SCrV

Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus SLV

Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus

Strawberry latent ringspot ? nepovirus

SLRSV

Földimogyoró bokrosodás vírus

Peanut clump pecluvirus** PCV

Földimogyoró foltosság vírus Peanut mottle potyvirus PeMoV

Földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus

Groundnut ringspot tospovirus GRSV*

Földimogyoró klorotikus legyező-foltosság vírus

Peanut chlorotic fan-spot tospovirus

PCSV

Földimogyoró rügynekrózis vírus

Groundnut bud necrosis tospovirus*

GBNV

Földimogyoró satnyulás vírus Peanut stunt cucumovirus PSV

Freesia levél nekrózis vírus Freesia leaf necrosis varicosavirus

FLNV*

Görögdinnye ezüstfoltosság vírus

Watermelon silver mottle tospovirus*

WSMV



Görögdinnye mozaik vírus Watermelon mosaic potyvirus WMV

Görögdinnye mozaik 2-vírus Watermelon mosaic 2 potyvirus WMV-2

Görögdinnye rügynekrózis vírus

Watermelon bud necrosis tospovirus

WBNV*

Heracleum látens vírus Heracleum latent ? trichovirus HLV

Heracleum vírus 6 Heracleum 6 ? closterovirus HV-6*

Here földalatti törpülés vírus Subterranean clover stunt nanavirus

SCSV

Here nekrotikus mozaik vírus Sweet clover necrotic mosaic dianthovirus

SCNMV

Here sárga erűség vírus Clover yellow vein potyvirus ClYMV

Here seb tumor vírus Clover wound tumor phytoreovirus

WTV

Impatiens nekrotikus foltosság vírus

Impatiens necrotic spot tospovirus INSV*

Indiai földimogyoró bokrosodás virus

Indian peanut clump pecluvirus** IPCV*

Iris sárga foltosság vírus Iris yellow spot tospovirus IYSV*

Kakaó duzzadt hajtás vírus Cacao swollen shoot badnavirus CSSV

Karfiol mozaik vírus Cauliflower mosaic caulimovirus CaMV

Kókusz hajtás leromlás vírus Coconut foliar decay nanavirus CFDV

Körte érsárgulás vírus Pear vein yellows virus (syn.: Apple stem pitting virus)

ASPV

Körte kövecsesedés vírus Pear stony pit virus PSPV*

Kukorica csíkos mozaik vírus Maize dwarf mosaic potyvirus (syn.: Kukorica törpe mozaik vírus)

MDMV

Kukorica csíkosság vírus Maize streak mastrevirus** MSV

Kukorica fehérvonalas mozaik vírus

Maize white line mosaic virus MWLMV

Kukorica finom csíkozottság vírus

Maize rayado fino marafivirus MRFV



Kukorica klorotikus foltosság vírus

Maize chlorotic mottle machlomovirus

MCMV

Kukorica klorotikus törpülés vírus

Maize chlorotic dwarf waikavirus MCDV

Kukorica sávos mozaik vírus Maize stripe mosaic tenuivirus MSpV

Kukorica finom csíkozottság vírus

Maize rayado fino marafivirus MRFV

Liliom tünetmentes vírus Lily symptomless carlavirus LSV

Lóbab enyhe foltosság vírus Broad bean mild mottle bromovirus

BBMMV

Lóbab foltosság vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV

Lóbab hervadás vírus Broad bean wilt fabavirus BBWV

Lóbab nekrotikus sárgaság vírus

Faba bean necrotic yellows nanavirus

FBNYV*

Lóbab nekrózis vírus Broad bean necrosis furovirus BBNV

Lóbab tarkulás vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV

Lucerna látens vírus Alfalfa latent carlavirus ALV

Lucerna mozaik vírus Alfalfa mosaic alfamovirus AMV

Lychnis gyűrűsfoltosság vírus Lychnis ringspot hordeivirus LRSV

Maclura mozaik vírus Maclura mosaic macluravirus MacMV

Manióka afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic bigeminivirus

ACMV

Manioka Ivoriai bacilus formájú vírus

Cassava Ivorian bacilliform ourmiavirus

CIBV*

Málna bokros törpülés vírus Raspberry bushy dwarf idaeovirus

RBDV

Málna levélgöndörödés vírus (amerikai)

Raspberry leaf curl ? luteovirus RLCV

Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus RpRSV

Melandrium sárga foltosság vírus

Melandrium yellow fleck bromovirus

MYFV

Nandina szár himlő vírus Nandina stem pitting capillovirus NSPV



Narcissus látens vírus Narcissus latent macluravirus NLV

Odontoglossum gyűrűsfoltosság vírus

Odontoglossum ringspot tobamovirus

ORSV

Olajfa látens vírus 2 Olive latent 2 oleavirus** OLV-2

Ourmia dinnye vírus Ourmia melon ourmiavirus OuMV

Őszibarack (amerikai) mozaik vírus

Peach (American) mosaic vírus PAMV

Őszibarack rozettás mozaik vírus

Peach rosette mosaic nepovirus PRMV

Papaya gyűrűsfoltosság vírus Papaya ringspot potyvirus PRSV

Paprika enyhe foltosság vírus Paprika mild mottle tobamovirus PaMMV

Paprika enyhe „tigré” vírus Pepper mild tigré ? bigeminivirus PepMTV

Paprika érfoltosság vírus Pepper veinal mottle potyvirus PVMV

Paprika érszalagosodás vírus Pepper vein banding virus PVBV*

Paprika foltosság vírus Pepper mottle potyvirus PepMoV

Paradicsom ál-levélgöndörödés vírus

Tomato pseudo-curly top hybrigeminivirus

RPCTV

Paradicsom bokros törpülés vírus

Tomato bushy stunt tombusvirus TBSV

Paradicsom bronzfoltosság vírus

Tomato spotted wilt tospovirus TSWV

Paradicsom fekete gyűrűs vírus

Tomato black ring nepovirus TBRV

Paradicsom fertőző klorózis vírus

Tomato infectious chlorosis crinivirus

TICV*

Paradicsom Florida vírus Tomato Florida virus* ToFV

Paradicsom foltos hervadás vírus

Tomato spotted wilt tospovirus (syn.: Paradicsom bronzfoltosság vírus)

TSWV

Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus ToMoV

Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus

Tomato ringspot nepovirus ToRSV



Paradicsom klorotikus foltosság vírus

Tomato chlorotic spot tospovirus TCSV*

Paradicsom klorózis vírus Tomato chlorosis crinivirus ToCV*

Paradicsom levélgöndörödés vírus

Tomato leaf curl bigeminivirus

(-begomovirus)

TLCV

Paradicsom levélráncosodás vírus

Tomato leaf crumple bigeminivirus

TLCV

Paradicsom magtalanság vírus Tomato aspermy cucumovirus TAV

Paradicsom mozaik vírus Tomato mosaic tobamovirus ToMV

Paradicsom sárga levélgöndörödés vírus

Tomato yellow leaf curl bigeminivirus

TYLCV

Paszternák sárga foltosság vírus

Parsnip yellow fleck sequivirus PYFV

Pelargonium foltosság vírus Pelargonium zonale spot ourmiavirus

PZSV

Pittosporum érsárgulás vírus Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus

PVYV

Poa szemilátens vírus Poa semilatent hordeivirus PSLV

Póréhagyma fehér csíkos vírus Leek white stripe necrovirus LWSV*

Pothos látens vírus Pothos latent aureovirus* PoLV

Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus

Prunus necrotic ringspot ilarvirus PNRSV

Ranunculus 3 vírus Ranunculus 3 ? ophiovirus RnV3*

Retek mozaik vírus Radish mosaic comovirus RaMV

Répa álsárgaság vírus Beet pseudo yellows crinivirus* BPYV

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus

Beet curly top curtovirus** BCTV

Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus BLCV

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus

Beet necrotic yellow vein benyvirus****

BNYVV

Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows ? betaluteovirus***

BWYV



Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows luteovirus BWYV

Répa sárgaság vírus Beet yellows closterovirus BYV

Répa talajlakó vírus Beet soil-borne furovirus BSBV

Rizs csíkosság vírus Rice stripe tenuivirus RSV

Rizs érdes törpülés vírus Rice ragged stunt oryzavirus RRSV

Rizs törpülés vírus Rice dwarf phytoreovirus RDV

Rizs tungro bacilus alakú vírus Rice tungro bacilliform badnavirus

RTBV

Rizs tungro szférikus vírus Rice tungro spherical waikavirus RTSV

Rozsnok csíkos mozaik vírus Brome streak mosaic tritimovirus***

BrSMV*

Rozsnok mozaik vírus Brome mosaic bromovirus BMV

Saláta érvastagodás vírus Lettuce big-vein varicosavirus LBVV

Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows crinivirus**

LIYV

Saláta klorózis vírus Lettuce chlorosis crinivirus LCV*

Saláta mozaik vírus Lettuce mosaic potyvirus LMV

Saláta nekrotikus sárgaság vírus

Lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus

LNYV

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus SDV

Sárgadinnye sárgaság vírus Muskmelon yellows ? crinivirus MYV

Sárgarépa foltosság vírus Carrot mottle umbravirus CMoV

Sárgarépa vörös levelűség vírus

Carrot red leaf luteovirus CRLV

Seb tumor vírus Wound tumor phytoreovirus WTV

Sinaloa paradicsom levélgöndörödés

Sinaloa tomato leaf curl begomovirus vírus

STLCV

Solanum nodiflorum foltosság vírus

Solanum nodiflorum mottle sobemovirus

SNMV

Sorghum klorotikus foltosság vírus

Sorghum chlorotic spot furovirus SgCSV



Szatellit dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis satellivirus satTNV

Szatellit köles mozaik vírus Panicum mosaic satellivirus PMV

Szegfű foltosság vírus Carnation mottle carmovirus CarMV*

Szegfű gyűrűsfoltosság vírus Carnation ringspot dianthovirus CRSV

Szegfű karcolatos gyűrűs vírus Carnation etched ring caulimovirus

CERV

Szegfű látens vírus Carnation latent carlavirus CLV

Szegfű nekrotikus foltosság vírus

Carnation necrotic fleck closterovirus

CNFV

Szegfű vírus 1 Carnation 1 alphacryptovirus CCV-1

Szilva (amerikai) vonalas mintázottság

Plum (American) line pattern ilarvirus vírus

APLPV

Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus PPV

Szilva törpülés vírus Prune dwarf ilarvirus PDV

Szójabab klorotikus foltosság vírus

Soybean chlorotic mottle virus SbCMV

Szójabab mozaik vírus Soybean mosaic potyvirus SMV

Szójabab törpülés vírus Soybean dwarf luteovirus SbDV

Szőlő A-vírus Grapevine A vitivirus** GAV

Szőlő bulgáriai látens vírus Grapevine Bulgarian latent nepovirus

GBLV

Szőlő enációs vírus Grapevine enation virus* GEnV

Szőlő érmenti mozaik vírus Grapevine veinal mosaic virus* GVMV

Szőlő érnekrózis vírus Grapevine veinal necrosis virus* GVNV

Szőlő faszöveti barázdáltság vírus

Grapevine stem pitting closterovirus

GSPV

Szőlő fertőző leromlás vírus Grapevine fanleaf nepovirus (syn.: Szőlő páfránylevelűség vírus)

GFLV

Szőlő foltosodás vírus Grapevine fleck virus GFkV

Szőlő króm mozaik vírus Grapevine chrome mosaic GCMV



nepovirus

Szőlő parakérgűség vírus Grapevine corky bark-associated ? closterovirus*

GCBaV

Szőlő páfránylevelűség vírus Grapevine fanleaf nepovirus (syn.: Szőlő leromlás vírus)

GFLV

Szőlő vonalas mintázottság vírus

Grapevine line pattern ? ilarvirus GLPV

Tarlórépa göndörödés vírus Turnip crinkle carmovirus TCV

Tarlórépa mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV

Tarlórépa rozettás vírus Turnip rosette sobemovirus TRoV

Tarlórépa sárga mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV

Tehénborsó enyhe foltosság vírus

Cowpea mild mottle carlavirus CPMMV

Tehénborsó klorotikus foltosság vírus

Cowpea chlorotic mottle bromovirus

CCMV

Tehénborsó mozaik vírus Cowpea mosaic comovirus CPMV

Tehénborsó súlyos mozaik vírus

Cowpea severe mosaic comovirus CPSMV

Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus SLCV

Tök mozaik vírus Squash mosaic comovirus SqMV

Tök sárga törpülés rendellenesség vírus

Cucurbit yellow stunting disorder crinivirus

CYSDV*

Tulipán enyhe foltosság vírus Tulip mild mottle ? ophiovirus TMMV*

Tulipán színtörés vírus Tulip breaking potyvirus TBV

Uborka érsárgulás vírus Cucumber vein yellowing virus CVYV

Uborka klorotikus foltosság vírus

Cucumber chlorotic spot crinivirus**

CCSV

Uborka levélfoltosság vírus Cucumber leaf spot carmovirus*****

CLSV

Uborka mozaik vírus Cucumber mosaic cucumovirus CMV

Uborka nekrózis vírus Cucumber necrosis tombusvirus CuNV



Uborka sárgaság vírus Cucumber yellows ? crinivirus CuYV

Uborka zöldfoltosság mozaik vírus

Cucumber green mottle mosaic tobamovirus

CGMMV

Vad uborka mozaik vírus Wild cucumber mosaic tymovirus WCMV

Vöröshere érmozaik vírus Red clover vein mosaic carlavirus RCVMV

Vöröshere tarkulás vírus Red clover mottle comovirus RCMV

Vöröshere vírus 2 Red clover 2 betacryptovirus RCCV-2

Zab arany csíkos vírus Oat golden stripe furovirus OGSV

Zab kék törpülés vírus Oat blue dwarf marafivirus OBDV

1 E helyen azoknak a vírusoknak a felsorolása található, amelyek a könyvben előfordulnak. Részletesebb adatok Hull et al. (1991), Matthews (1991), Horváth (1993a,b,c), Brunt et al. (1996a,b) és Pringle (1998) munkáiban találhatók.

2 A *-gal megjelölt vírusok akronímjai Brunt et al. (1996a,b) munkájában nem szerepelnek.

3 A ?-lel megjelölt vírusok taxonómiai helye még bizonytalan.

4 A **-gal jelölt vírusok új taxonómiai helye.

5 A ***-gal nevezett vírusok újabban javasolt taxonómiai helye.

6 A ****-gal jelölt vírus [répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein virus)] újabban a Benyvirus nemzetségbe tartozik.

7 A *****-gal jelölt vírus [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] újabb taxonómiai helye a Tombusviridae család Aureusvirus nemzetségben van; újabb tudományos neve: cucumber leaf spot aureusvirus (Martelli et al., 1998).

8 A ******-gal elölt vírus [alma törzsgöndörödés vírus (apple stem pitting virus)] a legújabb vizsgálatok szerint a Foveavirus nemzetségbe tartozik (Martelli és Jelkmann, 1998).

9 A *******-gal jelölt vírus földieper érszalagosodás vírus (strawberry vein banding ? caulimovirus)], a Caulimovirus nemzetség definitív tagja (Petrzik et al., 1998).


6. fejezet - A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjaiNéhány évvel korábban javaslatot tettünk a növényvirológiában használt diagnosztikai, propagatív, általános próbanövények (assay host), lokális gazdanövények (local assay host) és szisztemikus gazdanövények (systemic assay host), valamint a nem gazdanövények (non-hosts) kódjaira vonatkozóan (Horváth, 1993a, b, c). A kódrendszert az Amerikai és Japán Gyomnövénykutató Társaság (Weed Science Society of America, WSSA, Weed Science Society of Japan, WSSJ) javasolt komputerkódjainak adaptálásával és kiterjesztésével készítettük el. Tekintettel arra, hogy ezek a komputerkódok nem terjedtek ki a növényfajták és hibridek neveire, valamint a gazdanövények legfontosabb tulajdonságaira (diagnosztikai, propagatív és assay-növények) – holott ezeknek a növényvirológiában igen nagy a jelentőségük –, ezekre vonatkozóan is javaslatot tettünk.

A növények kódja öt betűből áll. Az első három betű a növény nemzetségnevét (LAC = Lactuca), az utolsó két betű pedig a fajnevet (SA = sativa) fejezi ki; Lactuca sativa = LACSA. Ha a fajnév nincs megjelölve, akkor az ismeretlen fajnév jelölésére az SS kódot kell használni (pl. Lactuca species = LACSS).

A növényfajták és -hibridek nevének rövidítésére olyan három betűt javasolunk, amely a szó, ill. a szavak összetételében a legkönnyebben kiejthető, és amelyet kötőjellel elválasztva adunk meg. A saláta (Lactuca sativa = LACSA) Valmaine fajta (VAL) kódja a következő: LACSA-VAL.

A növények családi hovatartozására – amelynek ismerete nagyon fontos a virológiában – hárombetűs kódot ajánlunk, amelyet kötőjel választ el a faj, ill. a fajta vagy hibrid nevétől: Compositae család = COM. Az említett példa alapján a családba tartozó Lactuca sativa Valmaine fajta kódja a következő: LACSA-VAL-COM (Horváth, 1993c).

A gazdanövények a virológiában lényeges tulajdonságaik alapján öt csoportba sorolhatók: (1) általános próba- (assay-) növények, (2) lokális próbanövények, (3) szisztemikus próbanövények, (4) diagnosztikai növények, (5) propagatív növények. A gazdanövényeknek eme tulajdonságai igen fontosak, ezért a fenti tulajdonságok kódjaira a következő 2–4 betűs kódot javasoljuk: AH = általános próbanövény, AHL = lokális próbanövény, AHLS = lokális és szisztemikus próbanövény, AHL(S) = lokális próbanövény, de egyes vírustörzsekre szisztemikus is, AHS = szisztemikus próbanövény, DH = diagnosztikai gazda, PH = propagatív gazda (Horváth, 1993c).

A fentiek alapján a növényvirológiában előforduló fontosabb növények kódrendszerét a 7. táblázatban közöljük.

7. táblázat - A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1

A növény latin neve Növénykód

Fajta- vagy

hibridkód

Családkód2

Gazdatulajdonság

kódja3

Ammi majus AMINA UMB DH, PH

Beta vulgaris cv. Monobusch BEAVA MOB CHE PH

Brassica campestris cv. Just Right BRSCA JTR CRU PH

Chenopodium quinoa CHEQU CHE AHL, AHS

Cucumis melo CUMME CUC DH, PH

C. sativus cv. Delicatess CUMSA DEL CUC DH, PH


A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai

Datura metel DATME SOL DH, PH

D. stramonium DATST SOL AHL

Gomphrena globosa GOMGL AMA DH, PH, AHL

Lactuca sativa cv. Valmaire LACSA VAL COM DH, PH

Lycium spp. LYUSS SOL AHL, DH

Lycopersicon esculentum LYPES SOL PH

Nicotiana benthamiana NIOBE SOL DH, PH

N. clevelandii NIOCL SOL DH, PH

N. glutinosa NIOGT SOL AHL, DH, PH

N. tabacum cv. Samsun NIOTA SAM SOL DH, PH

N. tabacum cv. White Burley NIOTA WHB SOL DH, PH

N. tabacum cv. Xanthi-nc NIOTA XNC SOL AHL, DH, PH

Petunia hybrida PEUHY SOL DH, PH

Phaseolus vulgaris cv. Pinto PHSVX PIN LEG AHL, DH, PH

P. vulgaris cv. Red Kidney PHSVX RKY LEG DH, PH

Physalis floridana PHYFL SOL DH, PH

Pisum sativum PIBSA LEG DH, PH

Solanum demissum x S. tuberosum ‘A6’ SOLHY TUA SOL AH. AHL, DH

Tetragonia expansa TEATE AIZ DH, PH

Tropaeolum majus TOPMA TRP PH

Vigna sinensis VIGSI LEG DH, PH

Zinnia elegans ZITEL COM PH

1 Részletesebb adatok találhatók Horváth (1993a, b) munkáiban.

2 AIZ, Aizoaceae; AMA, Amaranthaceae; CHE, Chenopodiacea; COM, Compositae; CRU, Cruciferae; CUC, Cucurbitaceae; LEG, Leguminosae; SOL, Solanaceae; TRP, Tropaeolaceae; UMB, Umbelliferae.

3 AH, kvantitatív vizsgálatokra alkalmas lokális gazda; AHL, lokális gazda; AHS, kvantitatív vizsgálatokra alkalmas szisztemikus gazda; AHLS, lokális és szisztemikus kvantitatív vizsgálatokra alkalmas növény; DH, diagnosztikai célokra alkalmas növény; PH, a vírus felszaporítására alkalmas gazdanövény. A növények eme tulajdonságai gazda–vírus kapcsolatok szerint váltakoznak.


7. fejezet - A vírusátvitel módszereiA vírusok átvihetőségének (terjedésének) ismerete – a betegségeket kiváltó egyéb kórokozókhoz hasonlóan – alapvető jelentőségű. A vírusok élő szervezetbe jutása passzív folyamat. A vírusoknak ui. nincsenek olyan enzimei, amelyek lehetővé tehetnék a növényi sejtekbe történő aktív bejutását. Az átvitel többnyire külső segítséggel történik. A vírusátvitel lehetőségei alapvetően két nagy csoportba sorolhatóak: (1) állatvektor nélküli vírusátvitel és (2) állatvektorokkal történő vírusátvitel. Az egyes terjedési, vírusátviteli módok vírusoktól függően eltérőek lehetnek, de az egyes átviteli lehetőségek kombinálódhatnak is egymással (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972; Schmelzer, 1980; Jones, 1993a,b; Dijkstra és De Jager, 1998; Horváth, 1999).

1. Állatvektor nélküli vírusátvitel1.1. Oltással történő átvitelAlapvetően minden növényvírus oltással átvihető; ennek feltétele, hogy a vírus szisztemikus megbetegedést legyen képes kiváltani, és hogy a vírusbeteg, valamint egészséges növények között szöveti kompatibilitás legyen. Az oltás, a szemzés, a dugvá-nyozás igen kiterjedt módszere a vírusátvitelnek. Az alany vagy az oltóvessző fertőzöttsége az egész növényre egyaránt átterjed. Az oltás különböző módjait a 21. ábra szemlélteti.

21. ábra - A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után]

Az oltás módszere (Noordam, 1973)

a. Egy vízszintesen félbevágott Nicotiana tabacum növény szárán tegyünk kb. 3 cm mély metszést. Ez képezi majd az oltás alapját, és ez akadályozza meg az oltóág és az alany elmozdulását egymástól.

b. Vágjuk le egy N. glutinosa növény hajtását. Távolítsunk el róla 1–2 alsó levelet, ezzel megelőzhetjük az oltóvessző elhervadását. Túl sok levelet nem érdemes eltávolítani, mert ez megakadályozhatja a további növekedést. Nyessük meg a szár végét úgy, hogy kb. 2 cm hosszú ék keletkezzen rajta.

c. Helyezzük a N. glutinosa szárának ék alakú végét a N. tabacum bevágott szárába. Tekerjük körbe rafiával vagy kötözőhánccsal, amelyet előzőleg vízzel hajlékonnyá tettünk. A kötözéshez használhatunk gumiszalagot vagy parafilmet is.

d. Címkézzük fel a cserepeket és különítsük el a növényt a többitől.

e. Ugyanilyen módszerrel helyezzünk el három N. tabacum alanyra egy N. glutinosa és két N. tabacum hajtást. Hagyjunk meg két N. glutinosa és két N. tabacum növényt teljesen sértetlenül. Valamennyi dohánynövényt helyezzük biztonságba, páradús helyre.


A vírusátvitel módszerei

f. Egy hét elteltével inokuláljuk az alanyon lévő leveleket 5 mg/l dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) és ugyanígy a kontrollnövények alsó leveleit.

g. Szellőztessük a növényeket, óvjuk őket a befülledéstől. Először három nap múlva, majd rövid periódusonként, később rendszeresen, hosszabb időközönként szellőztessünk.

h. Távolítsuk el az alsó levelek új hajtásait.

i. Ellenőrizzük a vírusátvitel eredményességét.

A Nicotiana tabacum cv. Samsun növények levelein (akár alany volt akár nem) egy hét után érkivilágosodás vagy mozaik jelenik meg. A N. glutinosa növények inokulált alsó levelein két nap múlva lokális léziók tűnnek fel. A N. glutinosa oltóvesszők csúcsi levelein nekrózisok fejlődnek ki, míg a kifejlett levelek tünetmentesek maradnak. Ebből arra következtethetünk, hogy a vírustranszport a floemen keresztül valósul meg, valamint láthatóvá válnak a rezisztenciában megmutatkozó különbségek is.

1.2. Mechanikai átvitelA mechanikai átvitel a vírusok legegyszerűbb terjedési módja, amely sebzéseken keresztül történik. Eredményessége függ a vírus környezeti hatásokkal szembeni ellenállóságától, a vírusgazdanövény adottságaitól (inhibitorok) és a fertőzendő tesztnövény fogékonyságától. Ez utóbbit befolyásolják a külső környezeti feltételek, a növény kora és fiziológiai állapota (Schmelzer et al., 1980; Gáborjányi, 1991; Horváth, 1993 a, b; Jones, 1993 a, b). A növény inhibitorai a fertőzés során általában csak ahhoz a családhoz tartozó növények esetében hatnak, amelyekhez maga az inhibitort tartalmazó növény is tartozik. Ezért ezek a gátló anyagok inkább gazda-, mint vírusspecifikusak. A mesterséges mechanikai átvitel (inokulálás) előnye, hogy kis koncentrációban előforduló vírusok is átvihetők a beteg növény szövetnedvével és általában könnyen felismerhető tüneteket okoznak a tesztnövényeken. A természetes mechanikai átvitelre klasszikus példa a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely a szomszédos növények leveleinek érintkezésével is terjed. A talajművelés, ill. a növényápolás is gyakran elősegíti a vírusok terjesztését (traktorok, kaszálógépek).

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohánynövények mechanikai inokulálása dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)

A dohány mozaik vírus fogékony gazdanövényen (Nicotiana tabacum cv. Samsun) mozaikfoltokat, míg rezisztens növényen (Nicotiana tabacum cv. Érdi) lokális léziókat okoz (22. ábra).

a. A mozaiktüneteket mutató N. tabacum cv. Samsun legfelső leveleiből egy gramm mennyiséget helyezzünk dörzsmozsárba, és adjunk hozzá 2,5 ml 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Alaposan dörzsöljük el.

b. Szórjuk be finoman karborundumporral (500 mesh = 50 µm) egy egészséges N. tabacum cv. Xanthi-nc fertőzni kívánt leveleit. Legegyszerűbb, ha a műveletet lakkfújóval végezzük. A karborundumpor helyett használhatunk Cellitet (kovaföld) is. Ezek az úgynevezett abrazívumok olyan szemcsés anyagok, amelyek segítik a levélfelület felsértését. A levélfelületen keletkezett mikrosérüléseken keresztül jutnak a virionok a levél epidermiszsejtjeibe.

c. Egyik kezünket helyezzük a levél alá, a másikba fogjunk egy sterilezett spatulát. Az üvegspatula segítségével a levél csúcsától az alap felé közepes erősséggel, körkörös mozdulatokkal vigyük fel a vírusos szövetnedvet. A kezünk és a levél közé helyezhetünk kivágott szűrőpapír-darabkákat is. Érdemes az inokulált leveleket megjelölni (pl. steril műanyag szívószállal kis lyukat fúrunk a levél csúcsába).

d. Az inokulálást követő 2–3 nap múlva lokális, nekrotikus léziók jelennek meg a megjelölt leveleken.

22. ábra - A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán]



Megjegyzés: Mesterséges mechanikai átvitelt lehetőség szerint mindig a reggeli vagy a kora délelőtti órákban végezzünk. A mechanikai vírusátvitelhez különböző segédeszközökre van szükség (23. ábra).

23. ábra - A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán]

1.2.1.

1.2.1.1.

1.2.1.1.1. Egyléziós kultúrák kialakítása

Ha tiszta, tehát azonos populációt képviselő tenyészetet szeretnénk kapni, egyetlen lézióból kell kiindulni. Az így kapott vírusizolátumot egyléziós kultúrának nevezzük.

a. A levél felületét 2%-os NaOH-val fertőtleníteni kell.

b. Szakítsuk le egy lokális tüneteket mutató Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc egyik levelét, és vágjunk ki belőle



egy léziót.

c. A léziót helyezzük porcelán dörzsmozsárba és adjunk hozzá pár csepp 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Dörzsöljük szét.

d. A kapott szövetnedvet óvatosan vigyük fel a 2–3 leveles N. tabacum cv. Xanthi-nc növény levelére.

e. Ha a levélen pár nap múlva megjelennek a tünetek, már a teljes levelet eldörzsölhetjük, és a szövetnedvet átvihetjük egészséges dohánynövényekre.

1.2.1.1.2. Petricsésze-módszer

A módszer előnye, hogy nem kell egy teljes növényt használni a vizsgálathoz a kórokozó tesztelésekor, elegendő hozzá a tesztnövény egyetlen levele is. Ezt a vizsgálatot Petri-csészében, nedves szűrőpapíron végezzük (Horváth és Pocsai, 1971). A módszert lokális tüneteket okozó vírusoknál alkalmazzuk.

1.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitelIsmert, hogy továbbszaporításhoz felhasznált szervek (gumók, hagymák, rizómák stb.) – az anyanövényhez hasonlóan – vírussal fertőződhetnek. Ezért a vegetatív úton történő növényszaporítással vírusterjedés érhető el a leghatékonyabb vírusátvitel.

A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) fertőzött anyanövény alól származó gumók többnyire vírusfertőzöttek lesznek, de előfordul az is, hogy nem mindegyik gumó fertőződik, ezért ezekből egészséges növények is kifejlődhetnek. A gumókkal átvihető burgonyavírusok súlyos gazdasági problémát jelenthetnek a termesztésben. A vegetatív szaporítószervekkel történő átvitelben szerepet játszhat a gumón kívül a módosult föld alatti megvastagodott szár, a rizóma, a szamóca indája vagy a tulipán hagymája. A tulipán színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) átvitelében és terjedésében a legnagyobb szerepe a vírusfertőzött tulipánhagymának van.

Rügydugványteszt (Horváth, 1962)

A burgonya nyugalmi állapotát megszakító vegyi készítmények alkalmazásával lehetővé vált a rügydugványok vizsgálata már az ültetések megkezdése előtt. Ennél a módszernél a gumók dugófúróval kivájt csíráit virágcserepekbe ültetjük. Ha a burgonya pl. levélsodródás vírust (potato leafroll polerovirus) tartalmazott, akkor megfigyelhető a fiatal növények leveleinek főér menti sodródása, kanalasodása. Biztosabb eredményt érhetünk el, ha a rügyeket a gumó csúcsi részéből vesszük és azokat gibberellinnel (10–50 mg/l) kezeljük.

1.4. Maggal és pollennel történő átvitelA maggal és pollennel történő átvitel a vírusok természetes elterjedésének gyakori lehetőségei. A maggal történő vírusátvitel gazdaságilag nagyon jelentős problémákat okoz (Mink, 1993; Schmidt, 1994). Jelenlegi ismereteink szerint több mint száz, maggal átvihető vírus ismert; ezek a vírusok 25 taxonómiai csoportba (nemzetségbe) tartoznak. Öt vírusnemzetségben [alfamovirus (1) cucumovirus (4), waikavirus (1), enamovirus (1), tospovirus (1)] 8 olyan vírus található, amelyek maggal 100%-ban átvihetők. Az összes cryptovirus [pl. szegfű vírus 1 (carnation 1 alphacryptovirus), vöröshere vírus 2 (red clover 2 betacryptovirus)] maggal könnyen átvihető, és eltekintve a növények vegetatív szaporításától, ez az egyetlen vírusterjedési lehetőség a fenti vírusok esetében. A maggal terjedő vírusok mechanikailag is átvihetőek, és parenchimasejteket fertőznek. A floem-fertőző vírusok [pl. burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus)] maggal nem terjednek. A magátvitel szempontjából fontos a vírusszaporodás, -terjedés és a gazdanövény növekedésének mértéke közötti egyensúly (Johansen et al., 1994). Befolyásoló tényező többek között a növények fiziológiai állapota, a vírusstabilitás, a hőmérséklet, a fajta és a tárolási idő is. Ha a kórokozó a mag felületén tapad meg, külső magátvitelről beszélünk. Ilyenkor a csíranövény a talajban, a talajrögök által ejtett apró sérülések következtében fertőződik. Az átvitelnek ez a formája főleg stabil vírusoknál lehetséges [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) (24A ábra)].

24. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán]



A belső magátvitel bonyolultabb folyamat. Feltétele – többek között – az, hogy a vírus bejuthasson a csírakezdeménybe vagy azok sejtjeibe. A bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) is ezzel a módszerrel terjed (24B ábra). Ez egyes esetekben sterilitást is eredményezhet [paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)].

A maggal átvihető vírusok a vírusbeteg növények pollenjével is terjednek. A kontaminálódott virágpor nemcsak az embriózsákot, hanem a magkezdeményeket is fertőzi. Ilyen kórokozó a bab közönséges mozaik vírus (bean common mosaic potyvirus). A vírusok pollennel történő terjedésének jelentős epidemiológiai szerepe van (Schmelzer, 1980).

1.5. Vírusátvitel a talajbanA talajban történő vírusátvitel általában gyökérrel, alacsonyabb rendű gombákkal és nematódákkal (fonálférgekkel) történhet; ez utóbbi átvitelről a Nematódák (fonélférgek) c. alfejezetben számolunk be. Ismeretesek azonban olyan vírusok is, amelyek talajban vektor nélkül terjednek. A jelenleg ismert 13, talajjal terjedő vírus [pl. szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus), Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus), szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus)] hat vírusnemzetségbe tartozik. Az említett vírusok mindegyike nagy koncentrációban fordul elő a növényekben, igen stabil, széles gazdanövénykörrel rendelkezik, és mechanikailag könnyen átvihető. A növények talajból, abiotikus körülmények között történő fertőződésének mechanizmusa nem ismert.

1.5.1. Gyökérrel történő átvitel

A vírusfertőzött növény gyökere jelentős szerepet játszik néhány vírus átvitelében. Feltétele az, hogy a fertőzött növényben a víruskoncentráció elég nagy legyen, gyökerei pedig szorosan érintkezzenek az egészséges növény gyökereivel. Ez az átviteli lehetőség különösen nagy gondot okoz a faiskolákban [pl. alma mozaik vírus (apple mosaic ilarvirus)], valamint a szőlőkultúrákban és a többéves hüvelyes takarmánynövények köré-ben is.

1.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel



A gyökérfertőző Olpidium gomba az egyik legismertebb vírusvektor, amely több vírus [dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), uborka nekrózis vírus (cucumber necrosis tombusvirus), saláta érvastagodás vírus (lettuce big vein varicosavirus), dohány satnyulás vírus (tobacco stunt varicosavirus)] átvitelére képes (25. ábra). Egy másik gomba, a Polymyxa betae a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) terjesztésében vesz részt. Az árpa sárga mozaik vírust (barley yellow mosaic bymovirus) a gabonaféléken élő Polymyxa graminis terjeszti. A Spongospora spp. a burgonya szártörpülés vírust (potato mop-top pomovirus), míg a Pythium spp. a borsó ál-levélsodródás vírust (pea false leaf roll virus) képes átvinni (Horváth, 1972).

25. ábra - Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után]

A vírusok gombaátvitelének kritériumai a következők: a) légszáraz talajban a fertőzőképesség megmaradása; b) a jelenlevő vírus mechanikai átvitellel vagy oltással történő kimutatása; c) kapcsolat a gomba és a vírus között; d) a gombamentes vírusfertőzött gazdanövényekről a vírussteril gomba által történő vírusfelvétel és vírusátvitel.

1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkalA Cuscuta nemzetségbe tartozó fajok levél nélküli, megnyúlt, fonalszerű szárral rendelkező gyomnövények, amelyek klorofillban szegények, ezért más növények parazitálására kényszerülnek. Az arankafajok a száron kifejlődő szívógyökerek (hausztórium) segítségével veszik fel a gazdanövényből a táplálékot és ezzel gyakran a vírusokat is. A vírus átvitele rendszerint passzívan történik, a parazita növény táplálékáramlása közben. A tápanyagok a hausztóriumokon keresztül mind a fertőzött, mind az egészséges növény edénynyaláb-rendszeréből az aranka floemjébe jutnak, és itt keverednek egymással. Számos Cuscuta faj alkalmas az átvitelre, de a hatékonyság fajonként különböző. Legnagyobb jelentőségűek a C. subinclusa és a C. campestris fajok (Schmelzer, 1956; Hosford, 1967; Jones, 1993a). Mindkét faj közismert vírus-gazdanövény is. Olyan növényekre is átvihető a vírus arankával, amelyek a szövet-inkompatibilitás miatt nem mutatják az átvitelt oltással vagy szemzéssel. Az aranka-átvitel különösen jelentős akkor, amikor mechanikai vagy vektorátvitellel



nem érhető el eredmény [pl. orgona boszorkányseprűsödés fitoplazma (lilac witches broom phytoplasma)].

1.7. Vízzel történő vírusátvitelCsaknem négy évtizedre nyúlnak vissza azok a vizsgálatok, amelyek alapján megállapítást nyert, hogy öntöző- és vízleeresztő csatornák (vízfolyások) vizéből növényvírus [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) (26A ábra)] izolálható (Van Dorst, 1961). Megállapítást nyert az is, hogy az öntözővízben jelen lévő vírus és az uborka vírusfertőzöttsége között szoros összefüggés van (26B ábra). Az elmúlt évtizedekben számos stabil növénypatogén vírust izoláltak folyók és tavak vizeiből (Koenig és Lesemann, 1985; Koenig, 1986; Horváth et al., 1986; Juretiæ et al., 1986; Koenig et al., 1988), valamint vízinövényekből (Horváth, 1994). Ezek a kutatási eredmények felvetették azt a lehetőséget – amely később bizonyítottá vált –, hogy növények vektormentes úton (állatvektorok és/vagy talajban élő gombák nélkül), gyökéren keresztül, vírussal kontaminálódott vízzel (pl. öntözővízzel) is fertőződhetnek. Ezáltal a víz mint „vektor” szerepet játszik stabil vírusok átvitelében és a növények megbetegítésében (Meyer-Kahsnitz, 1993). Ismert az is, hogy a bentonit és az agyagásványok proteineket (vírusrészecskéket) képesek adszorbeálni, és ezáltal a növényekből a kórokozó vírusok a talajkomponensekhez adszorbeálódva víz közvetítésével további fertőzést indukálhatnak (Gibbs és Harrison, 1976; Blanco-Sanches et al., 1986; Juretiæ és Horváth, 1991).

26. ábra - A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán]

2. Állatvektorokkal történő vírusátvitelA vírusok terjedésének talán legjelentősebb formája az állat-, rovarvektorokkal történő átvitel. Vektoroknak nevezzük azokat az élő szervezeteket, amelyek egyes vírusok terjesztésében közvetítő szerepet játszanak. Legfontosabb természetes vírusvektorok a szúró-szívó és rágó szájszervű rovarok, valamint a nematódák (fonálférgek).

2.1. LevéltetvekA növénypatogén vírusok terjesztésének kétségtelenül legáltalánosabb és gazdaságilag legfontosabb módja a rovarvektorokkal történő vírusátvitel (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A Homoptera rend – amely magában foglalja többek között a levéltetveket (Aphididae) és a mezei kabócákat (Cicadellidae) – tartalmazza a legnagyobb számú és a legjelentősebb növényi vírusvektort. A Homoptera rendbe



tartozó más családok bizonyos fajai szintén terjesztik a növénypatogén vírusokat, de sem számukban, sem jelentőségükben nem hasonlíthatók össze a levéltetvekkel és a kabócákkal. Ezen családok közé tartoznak a levélbolhák (Psylloidae), a molytetvek (liszteskék vagy fehérlegyek) (Aleurodoidae), a pajzstetvek (Coccoidae), valamint a púpos kabócák (Membracidae). A növénypatogén vírusok néhány rovarvektora más rendbe tartozik, mint pl. a poloskák (Heteroptera), a tripszek (Thysanoptera), a bogarak (Coleoptera) és a szöcskék, sáskák (Orthoptera) (Agrios, 1988). A szúró-szívó szájszervvel rendelkező rovarokhoz képest a rágó szájszervű rovarok vírusátvitele kisebb jelentőségű. A vírusok terjesztésében a rovarok közül a levéltetvek játsszák a legnagyobb szerepet. Az átvitelnek négy speciális formáját ismerjük (Horváth, 1972).

2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. Nem-perzisztens (stylet-borne) vírusok

A fertőzött növény szövetnedvével való táplálkozás közben vírusrészecskék tapadnak a rovar szipókájára (styletum). Ez esetben a rovar egészséges növényre kerülve azonnal fertőzőképes lesz, nincs szükség lappangási időre. A vektorok hamar, egy-két szívás után elveszítik vírusátviteli képességüket. A stylet-borne vírusok a levélparenchimában lokalizálódnak, mozaikos tüneteket okoznak, és mechanikailag könnyen átvihetők. A védekezés ellenük szinte lehetetlen, leginkább a levéltetvek számának csökkentésére korlátozódik. Erre az átviteli módra példa a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a zöld őszibarack levéltetű (Myzus persicae) kapcsolata.

A vírus és a vektor alapvető tulajdonságai a következőkben foglalhatók össze: 1. a felvételi szívás után a rovar azonnal fertőzőképes lesz, inkubációs idő nincs; 2. A forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a vektor fertőzőképessége csökken; 3. a vírusátviteli képesség a felvételi szívást megelőző éheztetéssel növelhető; 4. a vektorok egészséges növényen való szívogatás közben fertőzőképességüket hamar elveszítik; 5. a vírusok a vektor szipókájának csúcsi barázdáiban helyezkednek el; 6. a vírus felvételét követő vedlés a fertőzőképességet nagymértékben csökkenti; 7. a vektor testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal a rovart nem lehet fertőzővé tenni; 8. a vírusok a rovar hemolimfájából nem nyerhetők vissza; 9. a nem-perzisztens vírusoknak nincsenek speciális vektoraik.

2.1.1.1.2. Cirkulatív (perzisztens) vírusok

Ezek a vírusok abban különböznek az előző csoporttól, hogy rendszerint a floemben vagy a xylemben lokalizálódnak, sárgaság típusú tüneteket okoznak, és mechanikailag alig, vagy nehezen vihetők át. Legismertebb cirkulatív vírus az árpa sárga törpülés vírus [barley yellow dwarf luteovirus (27. ábra)] és a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), amelyek leghatékonyabban Macrosiphum (Sitobion) avenae, Rhopalosiphum spp. és Myzus persicae levéltetűvel terjednek.

27. ábra - Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) átvitel sematikus ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik. JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél [A. Miller szívessége folytán]



A vírus–vektor kapcsolat főbb jellemzői: 1. a forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a vektor fertőzőképessége nő; 2. a vírusátviteli képességet a felvételi szívás előtti éheztetés nem befolyásolja; 3. a vírus felvétele és az első eredményes fertőzés között meghatározott idő telik el, ezalatt a vektor még fertőzésképtelen. Az inkubációs idő addig tart, amíg a kórokozó az utóbélből a hemolimfa rendszeren keresztül a melléknyálmirigybe jut; 4. az inkubációs idő letelte után a vektorok fertőzőképességüket sokáig, gyakran életük végéig megőrzik; 5. a vektor fertőzőképességét a vedlés nem befolyásolja; 6. a vektor fertőzővé tehető a testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal; 7. a vírus visszanyerhető a vektor hemolimfájából; 8. a cirkulatív vírusok vektorspecifikusak (általában egy, vagy kevés vektorral rendelkeznek).

2.1.1.1.3. Szemiperzisztens vírusok

Az ide tartozó vírusok a perzisztens és a nem-perzisztens csoport közötti átmenetet képviselik. A szemiperzisztens vírusok mechanikailag általában nem vihetők át, vagy átvitelük nehéz [répa sárgaság vírus (beet yellows closterovirus)].

A vírus–vektor kapcsolat főbb tulajdonságai: 1. a vektor rövidebb és hosszabb felvételi szívás után is képes a kórokozót leadni; 2. a vektor felvételi szívás előtti éheztetése a vírusátvitel eredményességét nem érinti; 3. a vektor fertőzőképességére a vedlés nincs hatással.

2.1.1.1.4. Propagatív vírusok

Ezek a vírusok a cirkulatív vírusokhoz tartoznak, de annak legmagasabb szinten specializálódott fokát mutatják. A propagatív név abból adódik, hogy a vektor a vírust mintegy szaporítja, vagyis „számát növeli”. A répa nyugati sárgaság vírus (beet western yellows luteovirus) így szaporodik pl. M. persicae levéltetűben. A propagatív vírusok nemcsak szaporodnak a vektor szervezetében, hanem gyakran a rovarokban betegségtüneteket is okoznak. Ez esetben már nehéz eldönteni, hogy növénypatogén (fito-) vírusról, vagy rovarpatogén (arbo-) vírusról van-e szó. Az „arbo” rövidítés az angol arthropod-borne kifejezésből származik. A saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus) például Hyperomyzus lactuce levéltetű vektorban szaporodik. A vírus jellegzetes bacilus formájú partikulumait elektronmikroszkóppal kimutatták a vektor izomszöveteiben, a zsírtestecskékben, az agyvelőben, a tracheákban, a nyálmirigyekben és az emésztőcsatornában.

A vírus–vektor kapcsolat általános jellemzői a cirkulatív vírusoknál leírtakon kívül az alábbiakban foglalhatók össze: 1. a vírus a vektor testében hosszú ideig megmarad, sőt gyakran tojásaik is fertőződnek; 2. a vírus mechanikai úton növényről növényre átvihetetlen, de a vírussal fertőzött levéltetvek szövetnedvével az egészséges levéltetvekbe átvihető.

2.2. KabócákA sárgaság típusú növénybetegségek kórokozóit (vírusok és fitoplazmák) elsősorban kabócák terjesztik (Horváth, 1972, 1974, 1999; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A fitoplazmák főképpen virágelzöldülést, virágellevelesedést és ún. boszorkánysöprűsödést idéznek elő. Hazánkban is elterjedt a sztolbur fitoplazma (stolbur phytoplasma), a here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) vagy a here törpülés fitoplazma (clover dwarf phytoplasma) (Gáborjányi és Lönhard, 1967; Horváth, 1969, 1970, 1972, 1974).

A kabócákkal átvihető vírusok a levéltetvekkel átvihető vírusokhoz hasonlóan stylet-borne, szemiperzisztens, cirkulatív és propagatív természetűek lehetnek. Ez a négy csoport azonban nem különül el egymástól olyan élesen, mint a levéltetveknél. A rizs tungro szférikus vírus (rice tungro spherical waikavirus) szemiperzisztens. A Nephotettix impicticeps kabóca az éheztetés után a vírust egy órán belül képes felvenni és leadni. Az őszirózsa sárgaság fitoplazmát (aster yellows phytoplasma) a Macrosteles fascifrons és az Elymana virescens kabóca (28. ábra) csak akkor tudja felvenni, ha a táplálkozási idő meghaladja a két órát. A felvett kórokozót viszont bármilyen rövid idő alatt le tudja adni. Tipikus cirkulatív természetű a répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top curtovirus). Szemiperzisztens a Psammotettix alienus vektor által átvihető búza törpülés vírus (wheat dwarf monogeminivirus). A kabóca a forrásnövényen való 5 perces tartózkodás után felveszi a vírust. A kórokozó inkubációs ideje egy és négy nap között ingadozik. A propagatív rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) a Nephotettix apicalis kabócában szaporodik. A nőstényvektorok hét generáción keresztül képesek a vírust átvinni. Egyes nem-vektor kabócafajok inokulációs technikával fertőzöttekké tehetők, és a vírus felszaporodása szervezetükben kimutatható. A propagatív vírusok replikációjának kezdeti helye az emésztőcsatornában van. A vírus később kimutatható a hemolimfából, a nyálmirigyekből és a petefészekből is. A sárgaság típusú betegségek kórokozói transzováriálisan (a rovar tojásával) is terjednek. Elsősorban a



zsírtestecskékben és a sejtmagban okoznak kóros elváltozásokat. A kabócák élettartama gyakran megrövidül.

28. ábra - Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai A-B: Macrosteles fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N. Chiykowski szívessége folytán]

2.3. Nematódák (fonálférgek)A talajban élő nematódák jelentős szerepet játszanak a vírusok átvitelében (Raski és Hewitt, 1967). Mintegy 20 növényi vírust képesek átvinni a talajban élő fonálférgek. Ezeket az ektoparazitákat négy nemzetség egy vagy több faja képviseli. A nematódákkal átvihető vírusok alapvetően két csoportba (NEPO-vírusok, NETU-vírusok) sorolhatók (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972). A Longidorus és a Xiphinema nemzetségbe tartozó fajok a poliéder alakú NEPO-vírusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus), a paradicsom gyűrűsfoltosság vírus (tomato ringspot nepovirus), a málna gyűrűsfoltosság vírus (raspberry ringspot nepovirus), a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus), a cseresznye levélsodródás vírus (cherry leafroll nepovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus), a szőlő páfránylevelűség vírus; syn.: szőlő fertőző leromlás vírus (grapevine fanleaf nepovirus)] vektorai. A Trichodorus és a Paratrichodorus nemzetségbe tartozó fonálférgek a hajlékony, pálcika alakú, tubuláris NETU-vírusokat képesek terjeszteni. Ilyen a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és a borsó korai barnulás vírus (pea early browning tobravirus). A talajban élő nematódák a fertőzött növény gyökerén történő táplálkozás után könnyen átvihetik a vírusokat az egészséges növényre (Harris és Maramorosch, 1980). Nemcsak az imágó, hanem a lárva is képes az átvitelre. Ha lerakja tojását vagy a lárva vedlik, ismét táplálkoznia kell a forrásnövényen ahhoz, hogy visszanyerje fertőzőképességét.

2.4. AtkákAz atkákkal átvihető vírusok terjesztésében elsősorban az Eriophyidae család egyes fajai vesznek részt. Az atkák egyik része szabadon él, levelek fonákán szívogatnak anélkül, hogy azokon különösebb kárt okoznának. Másik részük viszont toxikusan ható nyálával súlyos deformációkat, gubacsképződményeket idéz elő. A gubacsatkák közül néhány faj a növénypatogén vírusok terjesztésében is jelentős szerepet játszik. Az Aceria tulipae atka gyakran tömegesen lép fel és súlyos gubacsszerű tüneteket okoz. Részt vesz pl. a búza csíkos mozaik vírus (wheat streak mosaic tritimovirus) terjesztésében (29. ábra). A vírus–atkavektor kapcsolatban a vírus–tesztnövények nem okvetlenül gazdanövényei a vektornak, amint ez más vírus–vektor kapcsolatban természetes. Az atkavektorok fejlődési stádiuma nem határozza meg vírusátvivő képességüket (Horváth, 1972).

29. ábra - A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával és a petefészekkel. Fg = előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs = utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal és Slykhuis, 1967 után]; B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött búza levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége folytán]



2.5. TripszekA tripszek a Thysanoptera rendbe tartozó kozmopolita, polifág rovarok. A tripszfajok közül a Thrips tabaci és a Frankliniella fajok a legjelentősebb vírusvektorok (30. ábra). A tripszek nyála nem fitotoxikus. A vírus átviteli módja általában cirkulatív, de előfordul, hogy 30 perc is elég a vírus felvételére és leadására. A vírus vektorban történő szaporodása bizonyított. A mechanikailag könnyen átvihető, bár eléggé labilis paradicsom bronzfoltosság vírust (tomato spotted wilt tospovirus) a Thysanoptera rendbe tartozó vektorok csak lárvastádiumban képesek felvenni. Az imágók, amelyek vírussal fertőzött lárvákból fejlődtek ki, fertőzőképességüket életük végéig megtartják (Horváth, 1972). A paradicsom bronzfoltosság vírusnak hazánkban két vektora ismert: a Thrips tabaci és a Frankliniella occidentalis. Ezek közül a Thrips tabaci őshonos, a Frankliniella occidentalis behurcolt faj. Szabadföldi körülmények között a T. tabaci vektornak 4–6 nemzedéke fejlődhet ki. A kifejlett nőstény áttelel, ezért már kora tavasszal fertőző forrás lehet. Az üvegházakban egész évben zavartalanul szaporodik, ilyenkor 10–12 nemzedéke is kifejlődik. Az Észak-Amerikából behurcolt F. occidentalis a magyarországi körülmények között szabadföldön nem tud áttelelni. Télen csak üvegházi és hajtatóházi növényeken marad fenn. Mindkét faj széles tápnövénykörű, és közöttük több növényfaj a paradicsom bronzfoltosság vírusnak is gazdanövénye. A hazai vizsgálatokat üveg-házi körülmények között végezték a szabadföldön fertőzött gyomnövényekről gyűjtött T. tabaci egyedekkel. A rovarok jelentős mértékben átvitték a vírust Nicotiana benthamiana tesztnövényekre (Gáborjányi et al., 1993, 1994, 1995; Jenser, 1995). A paradicsom bronzfoltosság vírus szaporodását Frankliniella fusca tripszvektorban először 1998-ban igazolták (Pappu et al., 1998).

30. ábra - Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán]



2.6. PoloskákA Miridae és Piesmidae családok közül a Piesmidae családba tartozó poloskafajok vírusátvivő szerepe ismert jobban (Horváth, 1972). A Nabidae családba sorolható Nabis punctipennis és a Tingidae családba tartozó Stephanitis spp. vírusátvivő képességét nem sikerült minden kétséget kizáróan megállapítani. A répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) és a Piesma quadratum (31. ábra) levélpoloska kapcsolata a következőképpen alakul: a Piesma quadratum a növény parenchimájában és floemjében is szívogat. Szúrósertéi 5–10 perc alatt elérik a rostacsöveket. A répa levélgöndörödés vírus cirkulatív természetű. A vektor lárvái felveszik a vírust, leadni azonban nem tudják. A bélfal megcsapolásával azonban minden lárvastádium alkalmas az átvitelre. Az átte-lelt imágók nyáron sokkal jobb vírusátviteli eredményt mutatnak, mint a fiatal utódok. Ebből a vírus vektorban történő szaporodására lehet következtetni. A vírus felvételi ideje minimum 1–2 óra, leadási ideje 40 perc körül alakul. A vírus cirkulációja 3–4 hétig is eltarthat. A vírust hordozó nőnemű poloskák később rakják le tojásaikat, mint a vírust nem tartalmazó poloskák, és tojásprodukciójuk is kisebb.

31. ábra - Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) levélpoloska-vektora [G. Proeseler szívessége folytán]

2.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék)



A molytetvekkel, vagy más néven fehérlegyekkel, ill. liszteskékkel átvihető vírusok és vektoraik közötti kapcsolatok viszonylag kevéssé ismertek. Cirkulatív vagy szemiperzisztens természetűek lehetnek. A Bemisia tabaci az egyik legfontosabb szerepet játssza a vírusok terjesztésében. Vektora többek között a mechanikailag is átvihető uborka érsárgulás vírusnak (cucumber vein yellowing virus). A vektorok szívás előtti éheztetése nem befolyásolja a vírusátvitelt. A vírusfelvétel utáni éheztetés viszont rontja a vírus átvihetőségét. A vírusfelvételtől a -leadásig tartó ciklus 60 percig tart. A paradicsom sárga levélgöndörödés vírus (tomato yellow leaf curl bigeminivirus) és a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) cirkulatív természetű, a kórokozó azonban nem marad meg a vektorban annak élete végéig. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl bigeminivirus) mechanikailag is átvihető, míg a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) nem. Ez utóbbi lappangási ideje a vektorban kevesebb, mint hat óra. A Trialeurodes vaporariorum (32. ábra) egy óra alatt felveszi és ugyanennyi idő alatt át is viszi a vírust. A molytetveknél a transzováriális (tojással történő) átvitel nem bizonyított. A nőstények alkalmasabbak az átvitelre, mint a hímek (Horváth, 1972).

32. ábra - A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes vaporariorum) populációja dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán]

2.8. PajzstetvekNéhány trópusi növénypatogén vírus [kakaó duzzadt hajtás vírus (cacao swollen shoot badnavirus)] terjesztésében fontos szerepet játszanak a Pseudococcidae családba tartozó vándorpajzstetvek. A pajzstetveknek fontos szerepük van a szőlő levélsodródás vírus (grapevine leafroll closterovirus) terjesztésében is.

2.9. LevélbolhákA vektorok egészen kicsiny, viszonylag jelentéktelen csoportját képviselik a levélbolhák. A körtefapusztulást egy korábban vírusnak vélt fitoplazma (pear decline phytoplasma) okozza. A betegség csak oltással vagy a Psylla pyricola, P. piri, P. pyrisuga levélbolhákkal terjed. A fertőzés évében a körtefák levelein mozaikosodás jelentkezik, majd a fertőzést követő években a leveleken vörös pettyesség és hajtásnövekedés-gátlás alakul ki. Az egészséges körtefákon táplálkozó levélbolhák körtefára telepítése vagy toxinjaik növényekbe injekciózása nem idézett elő hasonló szimptómákat. A körtefán táplálkozó fertőzött egyedek levélhullást idéznek elő.



2.10. AknázólegyekA Diptera rendbe tartozó aknázólegyek (Agromyzidae) vírusátvitele a légyimágók tojócsövével történik. Két vektor vírusterjesztő szerepe ismeretes. Az egyik a Liriomyza langei [Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)], a másik a Phytomyza rufipes [tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus)].

2.11. BogarakA Chrysomelidae családba tartozó vektoroknak lényegesen fontosabb szerepük van a vírusok átvitelében, mint a Bruchidae és a Curculionidae családba tartozóknak. A bogarakkal átvihető vírusok tulajdonságai nagyon hasonlóak. Viszonylag stabilak, a fertőzött növényekben magas koncentrációban vannak jelen, mechanikailag átvihetők és erős antigén tulajdonságokkal rendelkeznek. A vektor vírusmegőrzése alapján a vírusok két csoportba oszthatók. Az egyik csoportban a megőrzési periódus hosszú ideig (7–20 nap), a másik csoportban csupán 24–48 óráig tart. Előbbihez tartozik a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), a tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), a tök mozaik vírus (squash mosaic comovirus), a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus). Az utóbbihoz sorolható a tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus), a tarlórépa rozettás vírus (turnip rosette sobemovirus) és a retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) (33. ábra) (Harris és Maramorosch, 1980). A vírus–bogárvektor kapcsolat specializáltságának legmagasabb fokát a levélbogarak és a levélbogárlárvák, valamint az általuk átvihető vírusok képviselik (Horváth, 1972). Ezek a rovarok nem rendelkeznek működőképes nyálmirigyekkel és nyelőcső-összeköttetéssel. Táplálkozáskor folyadékot öklendeznek ki, amely a növény nedvéből és emésztési enzimekből áll. Ha a vírusfertőzött növényen való táplálkozás közben a kórokozó az emésztőcsatornába jut, ott bizonyos ideig aktív állapotban megmarad. Az újabb táplálkozás során – kiöklendezéssel egészséges növényre kerülve – fertőzést idézhet elő.

33. ábra - Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica campestris növény levele [Horváth József szívessége folytán]

2.12. SáskákAz Acrididae családba tartozó fajok közül a Melanopus differentialis játszik aktív szerepet a vírusok átvitelében. Ez a sáska képes a burgonya X-vírus (potato X potexvirus), a dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésére. A szöcskék közül a legaktívabb vektor a Tettigonia viridissima, amely több vírus átvitelére is képes (Horváth, 1972).

2.13. LepkékA Pieridae családból a Pieris brassicae képes a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) és a tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus) átvitelére. Már 2 perces táplálkozás után felveszi a vírust. A P. brassicae hernyói a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) szájszerveiken hordozzák. A hernyók éheztetésével a vírusátvitel eredményessége csökken. A táplálkozás idejének növekedésével az átviteli képesség szintén csökken. A dohány mozaik vírus a hernyó ürülékében is kimutatható. A dohány mozaik vírus terjesztésében a Sphingidae és a Noctuidae család különböző fajai vesznek részt.



2.14. ÁszkákAz Oniscus asellus ászkafaj szerepet játszik az uborka mozaik vírus (cucumber mo-saic cucumovirus) terjesztésében. A vektornak a vírus járványtanában alárendelt szerepe van.

2.15. FülbemászókA Forficula auricularia fülbemászófaj vektora a tarlórépa sárga mozaik vírusnak (turnip yellow mosaic tymovirus).

2.16. CsigákA Gastropoda rend bizonyos fajai (Lehmannia marginata, Goniodiscus rotundatus stb.) alkalmi szerepet játszanak a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésében.

3. A vírusátvitel módszertana3.1. Vírusátvitel levéltetvekkelA vírus levéltetvekkel történő átvitele nem-perzisztens, szemiperzisztens vagy perzisztens (cirkulatív) módon lehetséges. Egy nem-perzisztens vírust tartalmazó beteg növényen a levéltetveknek optimálisan 10–60 másodpercet kell táplálkozniuk ahhoz, hogy az adott vírust felvegyék. Az ún. felvételi táplálkozás hatékonysága jelentősen csökken, ha pár perc helyett néhány napig tart. A vírus „inokulációs“ táplálkozással közvetlenül a felvételi szívás után átvihető. Az átvitel hatékonysága fokozatosan csökken néhány perc után, és kb. 1 óra múlva teljesen megszűnik. A levéltetveket az egészséges növényről (tápnövényről) levéve éheztetni kell néhány óráig, ezzel az átvitel eredményessége növelhető. Szemiperzisztens vírusoknál a felvételi táplálkozás optimuma 12–24 óra. Ezt követően 1–3 nap múlva történik meg az átvitel. Perzisztens vírusok esetén legalább félórás felvételi szívásra van szükség, de hosszabb ideig is történhet. A táplálkozás után 1–20 napos látens periódus (inkubációs idő) van; ezt követően a vírus átvihetővé válik. Ez a típusú átvitel akkor történik meg, ha a felvételi táplálkozás legalább néhány órán keresztül tart.

3.1.1.

3.1.1.1.

3.1.1.1.1. A vírusmentes levéltetvek tenyésztése

A vírusok ritkán vihetők át a levéltetvek tojásával. Az újonnan kikelő levéltetvek általában vírusmentesek, ezért egy ilyen kultúrából elindítható a tenyészet (Sylvester, 1969).

a. Tegyük egy egészséges kínaikel-palánta (Brassica pekinensis) levelét Petri-csészébe, egy kissé megnedvesített szűrőpapírra. A kifejlett, szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket finom ecset segítségével rakjuk át 1 vagy 2 levélre. Megkönnyíti a munkánkat, ha az ecsetet előtte vízbe mártjuk. Fedjük le a Petri-csészét, és néhány óra múlva tegyük át a levéltetveket egy egészséges kínai kel növényre.

b. A növényt helyezzük inszektáriumba (34A, B, C ábra), amelynek 3 oldalát háló határolja (20 mesh/cm), egyet pedig üveglap zár le. Az inszektáriumnak nincs alja, de a váz alá homokkal vagy kaviccsal teli tálcát helyezünk. Ez az inszektárium megakadályozza az állatok szökését. A szárnyas alakok kifejlődését a 16 órás megvilágítás megakadályozza. A Myzus persicae folyamatos megvilágítást igényel, az Aphis fabae esetében szükség van sötét periódusokra is. A vírusok átvitelének tanulmányozásához sok esetben ún. „miniatűr” inszektáriumokat is használnak (34D, E, F ábra).

c. A levéltetvek rendkívül érzékenyek az inszekticidekre. A környezet permetezése a rovarok pusztulását vagy fejlődésbeli visszamaradását eredményezheti. Ha mégis permeteznünk kell, használjunk olyan szert, amely toxicitását csak pár napig őrzi meg, pl. tetraetil-pirofoszfátot.

34. ábra - A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy



meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán]

3.1.1.1.2. A tesztnövények felnevelése

A Myzus persicae táplálására a legalkalmasabb a retek (Raphanus sativus) és a kínai kel (Brassica pekinensis). Ezek a növények magas páratartalmú helyiségben gyorsan csíráznak, a magvetéstől számított öt héten belül felhasználhatók, és immunisak pl. a burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szemben. A gőzöléssel sterilezett és átszitált talajba ültetett magvak magas páratartalom és 27 °C hőmérséklet mellett hamar kicsíráznak. Később elég a 20–22 °C is. Amikor az első, valódi levél eléri a sziklevelek hosszának felét, a növények alkalmasak a fertőzésre. Célszerű hetente háromszor is magot vetni, hogy a felhasznált tesztnövények egyforma fejlettségűek legyenek. A Physalis floridana tesztnövények kiváló vírusforrásai a Myzus persicae levéltetveknek.

3.1.1.1.3. A nem-perzisztens és a perzisztens vírusokkal végzett tesztvizsgálat

Ebben a vizsgálatban a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) átvitelét végezzük el, a levéltetvek egy csoportjával rövid, egy másik csoportjával pedig hosszú ideig tartó felvételi szívás esetében (Miyamoto és Miyamoto, 1966). A rövid táplálkozási idő a nem-perzisztens, a hosszú táplálkozási idő a perzisztens módon terjedő vírusok kimutatását szolgálja. A kísérlet akkor a legeredményesebb, ha a nem-perzisztens vírus (burgonya Y-vírus) transzmissziós képességét csak rövid ideig (kb. 1 óra) őrzi meg, a perzisztens vírus (burgonya levélsodródás vírus) pedig még egy nap elteltével is átvihető marad. Hogy ezt nyomon kövessük, a levéltetveket egy második tesztnövényre helyezzük át az első inokulációs táplálkozás után.

3.1.1.1.4. Háromnapos felvételi táplálkozás munkaterve

a. Tegyünk kb. 100 db szárnyatlan levéltetvet nedves ecset segítségével egy főzőpohárba. A vizsgálat alatti áthelyezések során bánjunk óvatosan a levéltetvekkel. Ha a levéltetvek szipókája éppen a levélbe süllyedt, ecsettel finoman piszkáljuk meg a potrohukat, és csak azután helyezzük át. Az átvitel sikere ettől függ. A leválasztást úgy is megkönnyíthetjük, hogy a szívogató levéltetvekre hirtelen erős fényforrást bocsátunk, és ilyenkor szipókájukat kihúzzák a növényből (Horváth, 1963).

b. A levéltetvek felét tegyük burgonya Y-vírussal, másik felét burgonya levélsodródás vírussal fertőzött Physalis floridana növényekre.

c. A növényeket levéltetvekkel együtt 3 napra helyezzük inszektáriumba.

d. Három nap múlva vizsgáljuk meg a beteg növényeket, és inszekticiddel pusztítsuk el a szárnyas egyedeket. Tegyünk 5 db szárnyatlan levéltetvet a burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növényről 1 db egészséges, majd további 5–5 db levéltetvet 4 db egészséges P. floridana tesztnövényre. Legalább 10 másik levéltetvet helyezzünk egy „tartalék” növényre. Ugyanezt ismételjük meg a burgonya Y-vírussal fertőzött levéltetvekkel is.

e. Tegyük egy napra inszektáriumba valamennyi tesztnövényt.

f. A felvételi szívást követő 5. napon mindegyik levéltetvet rakjuk át új tesztnövényre. Az elpusztult vagy szárnyassá alakult tetveket mindig a „tartalék” növényről pótoljuk.



g. Tartsuk a növényeket egy napig inszektáriumban.

h. A 6. napon ecsettel tegyük át a levéltetveket a tesztnövények utolsó sorozatára, vagy kezeljük a növényeket inszekticiddel.

Háromperces felvételi táplálkozás munkaterve

a. Tegyünk kb. 100 db levéltetvet főzőpohárba, zárjuk le egy műanyag fedővel, és éheztessük őket naptól védett helyen 1 óráig.

b. Öt levéltetvet helyezzünk egy burgonya levélsodródás vírussal fertőzött levélre. Nagyítóval megfigyelhetjük, hogy az állatok táplálkoznak-e. A próbaszívás rendszerint kevesebb mint 30 másodpercig tart. Szívás közben a szipóka merőleges a levélfelületre, a csáp pedig hátracsapva a testhez simul.

c. Három perc múlva öt levéltetvet tegyünk át egy tesztnövényre, a szondázás időtartamának figyelembevétele nélkül.

d. Ismételjük meg a b és c pontot, és vigyük át a rovarokat még négy teszt- és egy tartalék növényre. Ha a levelek lankadnának, frissítsük fel őket. A folytatás hasonló a burgonya Y-vírusnál leírtakhoz.

Az első tünetek 1–2 hét után láthatóvá válnak. A burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növények erőteljesen satnyulnak, a levelek sodródnak, sárgulnak (különösen a levél csúcsa), az erek zöldek maradnak. A burgonya Y-vírussal megbetegített növények törpülnek az egészséges növényhez képest és mozaikos tüneteket mutatnak. Jegyezzük fel a szimptómákat. Lehet, hogy a háromnapos és a háromperces felvételi táplálkozást követően az 5. napon burgonya Y-vírussal fertőzött növények, valamint a háromperces táplálkozást követően az 1. és 2. napon burgonya levélsodródás vírussal fertőzött tesztnövények mind egészségesek maradnak. A nem-perzisztens vírusok (burgonya Y-vírus) esetében az átvitel hatékonyabb, ha a felvételi szívás három nap helyett pár percig tart. A kérdést, hogy melyik vírus perzisztens és melyik nem, csak akkor dönthetjük el véglegesen, ha a különböző kísérleti feljegyzéseket összevetjük egymással.

Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) átvitele gyakran eredménytelen. Ezért fontos, hogy figyelembe vegyük a tesztnövények korát és a vírus koncentrációját a forrásnövényben (Stimman és Swenson, 1967). Ha Cucumis sativus tesztnövényt használunk, akkor a felvételi táplálkozást követően a levéltetveket a növény sziklevelére kell helyezni, kb. 2–3 nappal a kikelés után. Azokat a levéltetveket használjuk, amelyek 10–15 másodpercig tartó próbaszívást végeztek a forrásnövényen.

3.1.1.1.5. Epidemiológiai vizsgálatok nem-perzisztens vírusokat terjesztő levéltetvekkel

Ha választ szeretnénk kapni arra a kérdésre, hogy egy nagyobb területen előforduló levéltetű-populáció közül mely fajok hozhatók leginkább öszzefüggésbe egy nem-perzisztens vírus [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] természetes elterjedésével, akkor nyomon kell követnünk a szárnyas levéltetvek rajzását és a vektorok tevékenységének intenzitását (Basky és Gáborjányi, 1994).

Az intenzív vektoraktivitás idejének tesztelése fogónövényekkel

a) A vizsgálat elvégzéséhez válasszunk ki egy szilva himlő vírussal fertőzött szilvaültetvényt.

b) Áprilistól augusztus végéig 25–25 db GF 305 őszibarackmagoncot mint fogó-, illetve tesztnövényeket helyezzünk ki és cseréljünk egyhetes időközönként egy igen fogékony Besztercei szilvaállományban.

c) Az egyhetes expozíciós idő elteltével a növényeket tartsuk vektormentes üvegházban.

d) Két hónap után a vírusfertőzöttséget vizuálisan és DAS-ELISA módszerrel állapítsuk meg.

A szárnyas levéltetvek rajzásának regisztrálása

a) A szárnyas levéltetvek rajzását Rothamsted típusú szívócsapdával követhetjük nyomon. Ez a szívócsapda óránként körülbelül 3000 m3 levegőt szív be, 12,2 m ma-gasságból. Ez az a magasság, amelyen a távolsági repülés során a levéltetvek repülnek.

b) A szívócsapda által gyűjtött anyagot naponta ürítjük, jól zárható üvegekben, 75%-os alkoholban tároljuk, és sztereomikroszkóp segítségével meghatározzuk a levéltetveket. A határozáshoz mindig kérjük szakember



segítségét. A Magyarországon leggyakrabban előforduló levéltetvek leírását és a preparátumaikról készült fényképeket a Basky (1993) által írt határozóban találjuk meg.

3.1.1.1.6. Különböző levéltetűfajok vírusátviteli képességének vizsgálata

a. Gyűjtsünk legalább száz, ha lehet, kb. 300 db azonos fajú levéltetvet bármely fáról vagy lágy szárú növényről (lehet zöldség- vagy gyomnövény is). Tegyük a levéltetveket lefedhető Petri-csészébe vagy hintőporba mártott szájú főzőpohárba.

b. Kétórás éheztetés után a levéltetvekkel teli edénybe helyezzük be a forrásnövényt. Ez legtöbbször fertőzött szilvahajtás. A vizsgálatok kimutatták, hogy mirobalánról vagy dohánynövényekről az átvitel hatékonysága kisebb volt.

c. Ötperces felvételi táplálkozás után nedves ecset segítségével helyezzük át a szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket 10 db GF 305 őszibarackmagoncra. A fejletlen lárvákat csakúgy, mint a szárnyas alakokat, hagyjuk az edényben. Nagyítóval figyeljük a szipóka és a csápok állását. A magoncokon három hajtást hagyjunk, és mindegyikre 10–10 levéltetű kerüljön. A próbaszívás alatt a szipókára került vírus lehetővé teszi, hogy olyan rovarfajokat is tesztelhessünk, amelyeknek egyébként nem gazdanövénye a szilva vagy az őszibarack.

d. Két nap elteltével a megmaradt példányokat Pirimor 50 D-vel lepermetezzük, és az akceptornövényeket vírusmentes üvegházba szállítjuk. A vírusnak körülbelül 2–3 hónapra van szüksége ahhoz, hogy a növényben kimutatható mértékben felszaporodjon.

e. Az inkubációs idő elteltével a növényeket DAS-ELISA-módszerrel vizsgáljuk. A vírusfertőzött és a vírussal nem fertőződött akceptornövények aránya adja meg az adott faj százalékban kifejezett vektorhatékonyságát.

3.1.1.1.7. Membránhártyán keresztül történő mesterséges táplálás

Kunkel (1977) egy olyan módszert tökéletesített, amely különböző levéltetvek mesterséges táplálását szolgálja. Ennél az eljárásnál egy membránhártyán keresztül kínáljuk fel a tápanyagokat a rovaroknak. Az aszeptikus tasakokat két parafilm szembefordításával és felgöngyölítésével kapjuk. A parafilmből létrehozott membrán előnye, hogy könnyen megformázható, továbbá szivárgásmentes, mert a kifeszített darabok szorosan egymáshoz tapadnak. Tárolásuk mélyhűtőben egyszerűen megoldható.

Ha aszeptikus hártyákat akarunk készíteni, a parafilmdarabkákat UV-fénnyel kell besugározni. Ezért szükségünk van egy kellően felszerelt szobára. A táplálék oldatának megszűrésére mikrobiológiai szűrőt használunk. Kunkel (1977) a Millipore R-rendszert alkalmazta, amely egy fecskendőre szerelt szűrőrendszerből áll.

3.1.1.1.8. Az aszeptikus hártyák elkészítése

a. Előzőleg vágjunk le kémcsőből vagy 2,6 cm átmérőjű műanyag csőből olyan darabokat, hogy gyűrű, illetve henger alakú csöveket kapjunk. Az üveg, ill. műanyag széleit csiszoljuk le, hogy megelőzzük a film megsérülését.

b. Parafilmből vágjunk ki négyzeteket. Ezeket szétterítjük egy edény vagy egy kesztyűsdoboz aljába, és 1–2 órán keresztül besugározzuk. Az expozíciós idő befolyásolja a parafilm fizikai tulajdonságait. Ha túl hosszú ideig tesszük ki az UV-sugaraknak, a parafilm később a kinyújtás közben könnyen elszakad.

c. Készítsük elő a fertőtlenített fecskendőt (kb. 20 ml) és néhány hengert. Vegyük ki a mélyhűtőből a táplálékul szolgáló oldatot.

d. A két óra leteltével helyezzük a parafilmnégyzeteket a munkaasztalra, és miután feltöltöttük a fecskendőt, tegyük rá a szűrőrendszert.

e. Vonjuk be a hengereket a parafilmmel a 35. ábra szerint. A két négyzetlap szembefordított oldalai sterilek. A filmek keresztirányú meghúzásával egyenletes vastagságú, vékony hártyákat kapunk. Vigyázzunk, hogy a kihúzás közben a membrán középső részét ne érintsük.

35. ábra - A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára



rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után]

3.1.1.1.9. Mini-inszektáriumok készítése az átvitelekhez

a. A csövekből levágott gyűrűkből készíthetők el azok a kis üveg- vagy műanyag inszektáriumok, melyek a levéltetvek táplálkozásának helyei. Fontos, hogy a hengerek és a gyűrűk átmérője azonos legyen, mert az elkészült membránhártyákra így tudnak tökéletesen illeszkedni.

b. Ezek a mini-inszektáriumok többféle úton állíthatók elő (36. ábra). Az egyszerű gyűrűk és a választásos kamrák alja nejlon fátyolszövet. Ezt hozzáragasztjuk egy mikroszkóp-tárgylemezhez erősített parafadugó tetejéhez. A választásos kamra keresztirányú darabja üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva. Ez olyan szorosan zárja el a két oldalt egymástól, mint egy pecsét.

c. Az elkészült inszektáriumba helyezzük be a levéltetveket.

36. ábra - A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva [Kunkel, 1977 után]



Helper komponens (HC) jelenlétének kimutatása

A potyvirusok közül a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) nem-perzisztens módon terjed. Nem tudjuk azonban, hogy a levéltetvek szipókájának pontosan mely részéhez tapad a kórokozó és miért csak bizonyos levéltetűfajok képesek az átvitelre. Govier és Kassanis (1974) előzetes megfigyelései hasonló membránhártyákon történtek, mint amilyeneket az előzőekben leírtunk. Ezeknek a mesterségesen előállított hártyáknak az az előnyük, hogy a bennük lévő folyadék tetszés szerint változtatható. Govier és Kassanis (1974) burgonya Y-vírussal fertőzött növények különböző módon előkészített kivonatait töltötték a tasakokba. A levéltetvek (Myzus persicae) rövid ideig táplálkozhattak a membránokon, majd a tesztnövényekre kerültek. Amikor a levéltetvek frissen készített növényi extraktumot kaptak, a tesztnövények 3/4 része fertőződött. Ha ezt a kivonatot egy napon keresztül 4 °C-on vagy pár órán át 20 °C-on tartották, az átvitel néhány esetben pozitívnak bizonyult. Ha csak a tisztított vírussal próbálkoztak, az átvitel eredménytelen maradt akkor is, ha a fertőzött növény nagy mennyiségben tartalmazott burgonya Y-vírust. Ha azonban a tisztított vírust összekeverték a tisztítás során keletkezett felülúszóval (szupernatáns), a tesztnövények (Nicotiana tabacum cv. White Burley) többségén betegségtünetek jelentek meg. A felülúszó önmagában szintén nem volt alkalmas arra, hogy az átvitel megvalósuljon. A kérdés az, hogy vajon a vírus változik-e meg a tisztítás alatt, vagy van egy vírusidegen komponens, amely a tisztítás során a felülúszóba kerül. A 8. táblázat mutatja az elvégzett vizsgálat eredményét.

8. táblázat - A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)

VírusIsmétlés1

1. 2. 3.

Tisztított vírus 0/10 0/8 0/8

Tisztított vírus + felülúszó a fertőzött növényből 10/10 7/8 8/8

Tisztított vírus + felülúszó az egészséges növényből – – 0/8



Felülúszó a fertőzött növényből 0/10 0/8 0/8

1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

A helper komponens (HC) kimutatásának eredeti módszere (Govier és Kassanis, 1974)

a. Mielőtt a levéltetvek (Myzus persicae) a membránon keresztül táplálkozni kezdenének, minden tisztított extraktumhoz szaharózoldatot adunk (20 w/v%). Húsz perc múlva 10 db levéltetvet helyezünk mindegyik tesztnövényre (Nicotiana tabacum cv. White Burley).

b. Az extrahálás folyamán a leveleket 0,1 M ammonium-acetátot (pH 7,0), 0,02 M EDTA-t és 0,02 M Na-DIECA-t tartalmazó oldatba mártjuk és vákuum segítségével a folyadékkal átitatjuk. Ezután a leveleket dörzsmozsárban szétdörzsöljük és muszlinon átnyomkodva leszűrjük. A megszűrt oldatot 20 percig 2,5% Triton X-100-al rázatjuk, majd kétszer centrifugáljuk (90 perc, 100 000 g). A csapadékot 0,01 M borát-pufferben (pH 8,0) oldjuk vissza úgy, hogy a végső koncentrációt 1 mg/ml-re állítjuk be.

c. A burgonya Y-vírussal fertőzött növények kivonatának centrifugálása során (90 perc, 100 000 g) keletkezett felülúszó bizonyult fertőzőképesnek.

d. Ha a tisztított vírust és a felülúszót együtt vizsgáljuk, akkor 0,5 ml vírushoz 1 ml szupernatánst adjunk.

A burgonya Y-vírus levéltetvekkel történő átviteléhez tehát szükséges egy olyan komponens, amely jóval kisebb, mint a víruspartikulum. E komponens eredetét további vizsgálatokkal próbálták kideríteni (Govier et al., 1977). A vizsgálat hasonlóképpen történt, mint azt korábban leírtuk. A különbség csak annyi, hogy a szaharózoldatot (20 w/v%) nem az extraktumhoz keverjük, hanem külön membránon kínáljuk fel (5 vagy 20 percig) a levéltetveknek (9. táblázat).

9. táblázat - Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)

VírusIsmétlés1

1. 2.

Helper + vírus/5 perc táplálkozás szaharózon 8/8 8/8

Helper/5 perc táplálkozás szaharózon/vírus 8/8 7/8

Helper/20 perc táplálkozás szaharózon/vírus – 3/8

Helper/vírus 8/8 7/8

1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.

Azt a komponenst, amely elősegíti a burgonya Y-vírus átvitelét, a szerzők segítő (helper) komponensnek (HC) nevezték. Az eredmények szerint a levéltetvek akkor voltak képesek a burgonya Y-vírus felvételére és átvitelére, ha előzőleg HC-t tartalmazó preparátumon szívogattak. Abban az esetben, ha sokáig (20 perc) hagyták a rovarokat a szaharózoldatból táplálkozni, az átvitel hatékonysága jelentősen romlott.

A helper komponens (HC) kimutatásának újabb módszere (Wang et al., 1998)

Wang et al. (1998) négy levéltetűfaj potyvirus átviteli képességét vizsgálták. A levéltetvek táplálkozását, vagyis a vírus megszerzésének folyamatát elektronikus monitoringgal követték nyomon, amellyel kiderítették, hogy a különböző átviteli eredmények a levéltetvek eltérő táplálkozási magatartásából adódtak. A vírus szipókában való



megmaradását 125I-izotóppal jelölt virionokkal figyelték meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a különböző levéltetűfajok tápcsatornájának alkotóelemei más-más kölcsönhatásba lépnek a potyvirusokkal, és ez okozza az átvitelben megmutatkozó eltéréseket. Végül homológ és heterológ potyvirusok segítségével kimutatták a segítő komponens meghatározó szerepét a vírusátvitelben.

A vizsgálathoz olyan levéltetűfajokat kell választani, amelyek ismert potyvirus vektorok (pl. Myzus persicae, Aphis gossypii), illetve olyanokat, amelyek átviteli képessége a vírustól függően változik (pl. Lypaphis erysimi, Myzus ascalonicus). A M. persicae és L. erysimi fajokat Brassica, az A. gossypii fajokat Cucumis, míg a M. ascalonicus vektorokat Allium ascalonicum növényeken lehet fenntartani. A vizsgálatokban a szárnyas egyedeket és a lárvaállapotú nimfákat lehet felhasználni.

3.1.1.1.10. A szívószájszerv (szipóka, stylet) aktivitásának kimutatása elektronikus jelekkel

a. A M. persicae és a L. erysimi levéltetveket óvatosan Petri-csészébe helyezzük, és szobahőmérsékleten (23–26 °C) 1–3 órát éheztetjük.

b. A M. ascalonicus egyedeket 24–26 órán át éheztetni kell.

c. A levéltetvekhez finom vezetőképes elektródot (3 cm hosszú, 20 μm átmérőjű) kell ragasztani, amelyet egy EPG-vel (Electrical Penetration Graph) kötünk össze.

d. A másik elektródot egy cserepes, 2–3 leveles dohány tesztnövény földjéhez csatlakoztatjuk, amelyre alacsony feszültségű egyenáramot kapcsolunk.

e. Amikor a rovarok szívó szájszervüket a levél epidermiszébe helyezik, záródik az áramkör, és ez jel formájában megjelenik a monitoron.

f. Az elemzéshez a STYLET 2.0 programot kell alkalmazni (Tjallingii és Mayoral, 1992).

A vírus és a helper komponens (HC) tisztítása

a. A dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel könnyen átvihető törzsének tisztítását Murphy et al. (1990) alapján végezzük.

b. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) levéltetvekkel átvihető izolátumának tisztítására Murphy et al. (1990), valamint Sako (1980) módszere nyújt útmutatást.

c. Mivel a dohány karcolatos vírus tisztított HC-je nem mutat eredményt az átvitelek során, ezért ezt a vírust a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) HC-jével lehet a levéltetvek számára felvehetővé tenni. A burgonya Y-vírus HC-jének tisztítását Thornbury et al. (1985) szerint végezzük.

d. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) HC-jének tisztítása Sako és Ogata (1981) módszerének kis módosításával történik (lásd e–l pontok).

e. A fertőzött tarlórépalevelek 50 g-ját 100 ml K-foszfátpufferrel homogenizáljuk (pH 8,5) és 15 percig 8000 g fordulaton centrifugáljuk.

f. A felülúszót egy órán keresztül centrifugáljuk (120 000 g).

g. A felülúszóhoz (NH4)2SO4-ot adunk a 18%-os telítettség eléréséig és 4 °C-on 10 percig keverjük.

h. A kapott oldatot 20 percig jégen, keverés nélkül inkubáljuk.

i. Az inkubálás után 15 percig centrifugáljuk (8000 g) az oldatot.

j. A csapadékot 20 ml 0,02 M K-foszfát-pufferben (pH 7,5) feloldjuk és 10 percig 5000 g fordulaton centrifugáljuk.

k. A felülúszóhoz annyi cukrot adunk, hogy a végső koncentrációban az oldat 20%-os legyen.

l. Az oldatot maradék nélkül szétosztjuk és –20 °C-on fagyasztjuk.

m. A HC-preparátumok aktivitását a 100 g/ml tisztított vírushoz (dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik



vírus) adott különböző mennyiségű HC-oldatok elegyével teszteljük. A további vizsgálatokhoz azokat az elegyeket használjuk fel, amelyek a M. persicae vektorral 100%-os átvitelt mutatnak (Pirone, 1981).

n. A virionok radioaktív jódozását Wang et al. (1996) módszere alapján végezzük (lásd o–q pontok).

o. 200 μl tisztított viriont (3,5 g/l) helyezünk el egy erre a célra alkalmas IODO-GEN jódozócsőbe, és 10 percig 1 mCi Na125I-izotóppal reagáltatjuk.

p. A be nem épült Na125I-izotópokat a radioaktív virionoktól Sephadex G-25-oszlopon különítjük el.

q. A vírus koncentrációját spektrofotométerrel határozzuk meg. A jelölés akkor jó, ha a vírus aktivitása 2640–4200 beütés per perc/nanogram (drive per minute/nanogram, d.p.m./ng) (dohány karcolatos vírus), ill. 1140–1780 d.p.m./ng (tarlórépa mozaik vírus) közé esik. Ezt gammaszámlálóval kell mérni.

3.1.1.1.11. A vírusátvitel általános menete

a. A szárnyas levéltetveket üvegfiolákban tartjuk, és a felvételi táplálkozás előtt 2–3 órát éheztetjük.

b. A dohány karcolatos vírust dohánynövényről dohánynövényre, a tarlórépa mozaik vírust tarlórépanövényről tarlórépanövényre visszük át.

c. A felvételi táplálkozást sztereomikroszkóp alatt követjük nyomon.

d. A levéltetvek 20–30 másodpercig táplálkoznak a fertőzött növényeken, azután egy éjszakára áthelyezzük őket a tesztnövényekre.

e. Ha a rovarok táplálkozását nem kísérjük figyelemmel, akkor 10 percig hagyjuk őket a fertőzött növényeken, és ezután helyezzük át a tesztnövényekre, ahol egy éjszakán át maradnak.

f. Ezt követően inszekticiddel elpusztítjuk a levéltetveket.

g. A növények szimptomatológiai megfigyelését végezzük rendszeresen.

h. A 125I-izotóppal jelölt vírus felvételét mini-inszektáriumokban, membránhártyákon keresztül lehet megfigyelni.

i. A membrántasakokba 100 vagy 200 g/ml homológ vagy heterológ jelölt vírus kerül.

j. Az éheztetett levéltetvek 10 percig táplálkozhatnak. A felvételi táplálkozást befejező levéltetveket tesztnövényekre helyezzük.

k. A rovarok szívogatását sztereomikroszkóppal figyeljük meg.

l. Kontrollként olyan jelöletlen dohány karcolatos vírust használunk, amely a burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazza.

m. A radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérjük.

3.1.1.1.12. Az átviteli eredmények

A levéltetvek táplálkozása, vagyis a szívás folyamata három fázisra bontható: (1) az epidermisz (vagy membrán) átszúrása, (2) a szívó szájszerv (szipóka, stylet) levélszövetben tartása és (3) a szipóka visszahúzása a levélszövetből. A szívás időtartama (második fázis) a Myzus persicae, a M. ascalonicus és a Lipaphis erysimi fajoknál – a vizsgálatok szerint – 3–11 másodperc között változott, szignifikáns különbség a vektorok között nem mutatható ki (Wang et al., 1998).

Az elektronikus jelek feljegyzése szerint csak a második fázis szubfázisai (2/1, 2/2, 2/3) között tapasztalhatók időtartam- és frekvenciabeli különbségek. Valószínű, hogy a 2/1 szubfázis a nem-perzisztens vírusok inokulációjával, a 2/3 szubfázis a vírus megszerzésével függ össze.

A M. persicae és az Aphis gossypii levéltetűvektorok hatékonyak a dohány karcolatos vírus és a tarlórépa mozaik vírus átvitelében. A L. erysimi csak a tarlórépa mozaik vírus átvitelére képes, míg a M. ascalonicus vagy nem képes ezeket a vírusokat átvinni, vagy csak rendkívül kis hatékonysággal.



A vírus megtartásának folyamata jól nyomon követhető a 125I-izotóppal. A levéltetvek testében mért radioaktivitás erősségében azonban nem mutatható ki különbség az egyes fajok között.

A vírust sikeresen kimutatták a levelekből, ha a rovarok a membránokon keresztül megszerezhették a HC-t tartalmazó homológ vírust. Ha a membránokon keresztül történő etetéskor a heterológ vírussal (burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó tarlórépa mozaik vírus) vehették fel a HC-t, a M. persicae levéltetű nagy, a M. ascalonicus alacsony hatékonyságú vektornak bizonyult. A L. erysimi azonban eredményesen átvitte a dohány karcolatos vírust, ha az tartalmazta a tarlórépa mozaik vírus HC-jét. Az A. gossypii vektor alacsony átviteli képességet mutatott mindkét vírus esetén, ha azok a tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazták. Ezek az eredmények egyértelműen bizonyítják a HC vírusátvitelben játszott kiemelkedő szerepét.

3.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkalA kabócákkal átvihető vírusok és fitoplazmák legnagyobb része csak hosszú inkubációs idő után vihető át vektorokkal. A vírusok (és a fitoplazmák), valamint a kabócák közötti kapcsolat jellemzését célzó vizsgálatok munka- és időigényesek. Ennélfogva fontos a megfelelő felszerelés beszerzése: inszektáriumok, fényforrások és a növények egyenletes növekedésének biztosítása (Horváth, 1972).

3.2.1.

3.2.1.1.

3.2.1.1.1. A kabócák tenyésztése

Az 1–5 lárvastádiumú Euscelis plebejus kabócák táplálására a Faba vulgaris, az ötödik stádiumtól a Bromus inermis növények a legalkalmasabbak (Musil, 1965). A Bromus növények előnye a Faba vulgaris növénnyel szemben az, hogy a nőstények előszeretettel rakják levelére a tojásaikat, valamint hogy nem fogékonyak a sárgaság típusú betegségekre. A tápnövényeket 7–10 naponta cseréljük frissre. A lárvák fejlődése fehérhere növényeken meggyorsítható. Nyáron a kabócák szaporodása folyamatos. Télen a lárvák nyugalomba vonulnak, erre a 0 – mínusz 5 °C a legmegfelelőbb (Horváth, 1972). Ha aszeptikus, azaz kórokozóktól mentes környezetben szeretnénk felnevelni a rovarokat, akkor Mitsuhashi és Maramorosch (1963) szerint kell eljárnunk:

a. A kabócatojásokat mikroszkóp alatt óvatosan, tű segítségével kivágjuk a levélből. A tojásokat ezután viaszpapírcsíkokra erősítjük. A papírcsíkokat előzőleg 3 percig 0,1%-os Hiamin 2389-oldattal fertőtlenítjük.

b. A sterilezett tojásokat agar táptalajon felnevelt növényeket tartalmazó üvegpalackokba rakjuk. A nimfák néhány nap alatt kikelnek a tojásból és a növényekre másznak.

c. 30 °C-on 16 órás megvilágítás mellett kifejlődnek az imágók, amelyeket újabb steril növényeket tartalmazó üvegbe rakunk át. Itt párosodnak és lerakják tojásaikat.

d. A felesleges pára elszívására akasszunk kis szilikagéllel töltött zsákokat az üvegedénybe.

3.2.1.1.2. Steril növények termesztése

A steril növények termesztésének alapja a növényi magvak fertőtlenítése. Ezt egyperces etilalkoholos (70%), majd 5 perces Hiamin 2389- (0,1%) oldatos, végül újra etilalkoholos (70%) mosással érhetjük el. Közben mindig steril desztillált vízzel öblítsünk. A magvakat (rozs, árpa, kukorica, lucerna, saláta, hagyma, sárgarépa, bíborhere stb.) Hoagland- és Knop-oldatot (Hoagland és Arnon, 1950) tartalmazó agar táptalajba helyezzük. A kikelt csíranövényeket tenyész-kémcsövekben, 25 °C-on, hosszúnappalos megvilágítás alatt tartjuk. A Dalbulus maidis a kukoricanövényeken, az Agallia constricta a lucernán és a bíborherén tenyészthető a legeredményesebben. A Macrosteles fascifrons kabócák sárgarépa-szövetkultúrákon néhány hétig életben tarthatók.

Here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) átvitele kabócával

A kapcsolódó kísérletet a here virágelzöldülés fitoplazmával (clover phyllody phytoplasma) végezhetjük el Euscelis plebejus vektor segítségével, Trifolium pratense gazda-, ill. tesztnövényen (Peterson, 1953). A kabócákat inszektáriumban tartjuk fenn, a rács mérete 50 mesh. A nimfákat ecset segítségével helyezzük át. A



kifejlett kabócákat a 37. ábrán látható „szívókészülékkel” fogjuk, és kémcsőbe gyűjtjük. Óvatosan helyezzünk finom nejlonszűrőt az üvegcső nyílásához, hogy megakadályozzuk a kabócák kiszívását. Ha szükséges, a rovarokat immobilizálhatjuk úgy, hogy pár másodpercig belefújunk a csőbe. A kabócák a kis lyukon keresztül vihetők át egy másik növényre. Két napig tartó felvételi szívás után kb. 30 napnak kell eltelnie ahhoz, hogy a kórokozó átvihető legyen a tesztnövényre. Az eredményes fertőzést követő inkubációs idő elteltével figyeljük az indikátornövényeken megjelenő, betegségre utaló tüneteket.

37. ábra - A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam (1973) után]

3.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel)A szárazföldi fajok gyűjtéséhez nagyon kevés és egyszerű eszközre van szükség (néhány doboz vagy zacskó és kézi ásó). Nematódák mindenféle talajban élnek, amelyen növényzetet találunk. A fonálféreg-fauna 90%-a a földfelszín 5–30 cm-es rétegében található, ezért felesleges mélyebbre ásni. Ha a begyűjtött állatokkal átviteli vizsgálatokat végzünk, akkor fontos, hogy minél több példány életben maradjon. Ezért ügyelni kell arra, hogy a dobozba vagy zacskóba gyűjtött földet ne tömörítsük, és minél gyorsabban a laboratóriumba szállítsuk. Ha erre nincs mód, tegyük az anyagot pár napig hűtőszekrénybe.

3.3.1.

3.3.1.1.

3.3.1.1.1. A vírus talajban való jelenlétének bizonyítása teszt- (vagy csalogató) növényekkel

A begyűjtött földet tegyük olyan virágcserépbe, amelyben a tesztnövénypalántákat felnevelhetjük. Tekintettel arra, hogy a fonálférgek élettartama és aktivitása (különösen a Xiphinema és Longidorus fajok), valamint a vírusátvitel eredményessége a talaj nedvességétől függ, így a kísérleti növények talajának folyamatos vízellátása nagyon fontos. Ezért ajánlatos műanyag cserepet használni. Ültessük el a „csalogató” növényeket a cserépbe.

A nematódák izolálása talajból és a tesztnövények inokulálása nematódákkal

Ha a laboratóriumba vitt minta friss és abban az állatok még élnek, akkor a fonálférgek kinyerését azok aktív mozgására alapozzuk. Kétféle futtatás általános: a tölcséres és a tálcás. A tölcséres módszert Baermann-féle futtatásnak is nevezzük.

Baermann-féle futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)

a. Egy üveg- vagy műanyag tölcsért állványra rögzítünk, a végére rövid gumicsövet húzunk és azt pillanatszorítóval leszorítjuk.

b. A tölcsérbe 1,5 mm lyukbőségű fém- vagy műanyag hálót, szitát vagy teaszűrőt helyezünk. Ebben van a



kifuttatandó anyag.

c. Ha nem talajból, hanem növényről akarunk fonálférgeket nyerni, akkor a fertőzött növény gyökerét vagy a föld feletti részét daraboljuk fel és kevés vízzel turmixoljuk öszsze.

d. Az alul elzárt tölcsérbe – lehetőleg a szita mellett – töltsünk annyi vizet, hogy az a mintát 1–2 cm-nyire ellepje.

e. A mintában lévő fonálférgek aktív mozgásuk következtében kiszabadulnak a talaj- vagy a növényrészecskék közül és a víznél nagyobb fajsúlyuk miatt lesüllyednek. Kb. 12 óra elég ahhoz, hogy a nematódák összegyűljenek a gumicsőben a szorító felett.

f. Kinyitjuk a szorítót és a víz kis részét óraüvegbe vagy Petri-csészébe engedjük.

Tálcás futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)

A tálcás futtatás elve is az állatok aktív mozgásán alapszik. Ezt a módszert akkor alkalmazzuk, ha egyszerre nagyobb mennyiségű állatot akarunk kinyerni.

a) Egy lapos, 0,5–1 mm lyukbőségű szitába durva szövésű vászondarabot, gézt vagy vattát helyezünk.

b) Ezen szétterítjük a vizsgálandó anyagot.

c) A szitát lábakra állítva tálcára tesszük, majd annyi vizet töltünk rá, hogy a mintát ellepje.

d) Pár óra állás után a nematódák a tálcába kerülnek.

e) Meggyorsíthatjuk a futtatást, ha a szitát fölülről lámpával melegítjük. Ekkor a száradó anyagot a fonálférgek igyekeznek minél gyorsabban elhagyni, ezáltal az alsó, nedvesebb régiók felé mozognak.

f) A tálcában lévő vizet ezután a benne lévő nematódákkal üveghengerbe töltjük, és kb. 10 perces várakozás után a fölösleges vizet leöntve összegyűjtjük az állatokat.

g) A hengerben lévő vizet planktonhálón is átönthetjük, és a hálóban fennakadt állatokat Petri-csészébe mossuk.

Seinhorst (1956) két módszert írt le a fonálférgek izolálására, amely a fajok különböző méretéből adódik.

Első módszer: Trichodorus fajok izolálása

a. Mérjünk ki 500 g talajmintát (ha nagy a nematódák száma, elég 250 g is).

b. Tegyük a talajt 2 mm-es lyukátmérőjű, félgömb alakú szűrőbe, amelyet egy tölcsérben helyeztünk el. A tölcsér nyílását dugóval zárjuk el. Helyezzük a tölcsért egy lombikba (38. ábra).

c. Öntsünk a tölcsérbe annyi vizet, hogy a mintát ellepje.

d. Ha a talaj agyagos, adjunk hozzá egy teáskanál nátrium-oxalátot vagy „Calgont”, és óvatosan keverjük össze.

e. A keverő segítségével tördeljük a földet kicsi, 1 cm-es darabokra.

f. Mozgassuk a szűrőt fel és le, hogy a talaj átjuthasson a lyukakon.

g. A madzag segítségével húzzuk ki a dugót a tölcsérből, és mossuk a földet a lombikba, majd ezt követően töltsük tele vízzel.

h. Erősítsünk a lombikra kis műanyag tölcsért, és zárjuk le dugóval.

i. Fordítsuk meg a lombikot néhányszor oda-vissza.

j. Helyezzük a lombikot fejjel lefelé egy vízzel telt főzőpohárba, és húzzuk ki a dugót a vízben. Mindezt olyan gyorsan végezzük, amennyire csak lehet. Előzetesen próbáljuk ki, hogy a dugót elég gyorsan ki tudjuk-e húzni, és hogy a lombikot elég jól tartja-e az állvány (39. ábra).



k. 12–15 perc után újra visszahelyezzük a dugót, és a felső lombikot visszafordítjuk. Eltávolítjuk a tölcsért, és tartalmát tartályba ürítjük. A 12–15 perces időtartam alatt a homok és más részecskék lefelé, míg a víz felfelé áramlik. Ez a felfelé áramlás akadályozza meg a Trichodorus (és más kisebb nematóda fajok) leülepedését. A nagyobb Xiphinema fajoknak ez az áramlás túl lassú, ezért átkerülnek az alsó edénybe.

l. Ha szükséges, a h és k lépéseket újra megismételhetjük a főzőpohár tartalmával.

m. Öntsük át a tartály tartalmát 0,1 mm-es szűrőn keresztül egy másik tartályba.

n. Mossuk át a szűrőt gyorsan és finoman a második tartályba.

o. A szűrőn ragadt maradékot kis főzőpohárba öblítjük.

p. Az m és n lépést megismételhetjük a második tartály tartalmával. Nagyon hatékony a visszanyerés, ha a szuszpenziót legalább ötször átszűrjük, de kétszeri szűrés általában elegendő.

q. Öntsük az o pontban összegyűjtött anyagot 0,05 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe. Helyezzük a szűrőt alátámasztva egy Petri-csészébe, és csak annyi vizet adjunk hozzá, hogy benedvesedjen, de a víz ne lepje el.

r. 4–24 óra múlva ellenőrizzük a Petri-csésze tartalmát sztereomikroszkóppal (nagyítás 40×-es), és helyezzük fényre. A jobb vizsgálhatóság kedvéért használjunk négyzetrácsos műanyag dobozt. Amikor a nematódák néhány perc múlva leülepednek, távolítsuk el a vizet, és ürítsük a kis főzőpohár tartalmát a műanyag dobozba. Egy pici pálcára erősített disznószőrrel emeljük ki a fonálférgeket és tegyük vízbe egy kicsi, szállítható, sima aljú edénybe (40A–C ábra).

38. ábra - A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után]

39. ábra - A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után]

40. ábra - A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után]



Könnyen észrevehető, hogy a nematódák alakja és mérete milyen különböző (41. ábra). Az elfogott fonálférgeknek csak egy kis része tartozik azon fajokhoz, amelyek vírusátvivők (42. ábra). A Trichodorus fajoknak lekerekített farka és görbült szájszerve van. Laboratóriumi gyakorlat nélkül a nematódák határozása nehéz.

41. ábra - Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján Noordam, 1973 után]



42. ábra - A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után]

A formalinos rögzítésen kívül még ismertek többkomponensű fixálóoldatok is, de a határozás szempontjából leginkább ajánlott módszer a hőmerevítés. Ha 45–50 °C-os vizet öntünk a már kiválogatott állatokra, vagy az óraüvegben összegyűjtött szuszpenziót láng fölött párszor áthúzzuk, a fonálférgek kinyúlnak, ezáltal könnyen mérhetők és tanulmányozhatóak. Vigyázzunk, a melegítést csak addig végezzük, amíg a vízben lévő állatok erősen vibrálni nem kezdenek. A megdermedés pillanatában nyomban fixálni kell. A hazai agronematológiával foglalkozó irodalom közül Andrássy és Farkas (1988), valamint Jávor (1974) kézikönyvében találhatók a fonálférgek életmódjával, szaporodásával, vizsgálati módszereivel és határozásával kapcsolatos ismeretek.

A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele fonálférgekkel

a. Ültessünk 10 db Nicotiana tabacum növényt műanyag cserépben lévő, sterilizált földbe (legalább 3 héttel a vizsgálat előtt).

b. Ültessünk dohány rattle vírussal fertőzött Nicotiana tabacum palántákat fonálférgeket tartalmazó földbe.

c. Két nap múlva a földtől megtisztított nematódaszuszpenziót (akár szétválogattuk, akár nem) öt részre osztva ömlesszük az egészséges dohánypalánták szárához közel lévő sekély lyukba. Hagyjuk a másik öt cserepet



kezeletlenül.

d. Kb. 10 nap múlva a leveleken megjelennek a dohány rattle vírus tipikus tünetei (nekrotikus gyűrűk, érnekrózis). Ha a tünetek elmaradnak, vizsgáljuk meg, hogy a vírus a gyökérből kimutatható-e.

3.3.1.1.2. A vírus jelenlétének kimutatása gyökérből

A növényt vegyük ki a cserépből és mossuk le a földet a gyökeréről. Vágjuk le a gyökér egy darabját és mozsárban dörzsöljük szét. Inokuláljunk egy karborundummal beszórt N. tabacum tesztnövényt, mindegyik növény gyökerének szövetnedvével külön-külön. A szövetnedvet 1:10 arányban hígítsuk foszfát-pufferrel (pH 7,0). A tüneteket (nekrotikus foltok, gyűrűk) 2–5 nap elteltével ellenőrizhetjük.

Második módszer: Xiphinema és Longidorus fajok izolálása

A Xiphinema és a Longidorus fonálférgek sokkal nagyobbak, mint a Trichodorus fajok. Ezek a fonálférgek az izolálás során a homokkal, törmelékkel együtt az üledékbe kerülnek (vö. az Első módszer című módszertani leírás k pontjával). Ezeket a nematódákat csak szűrővel különítettük el a kisebb fajoktól. Az izolálást ettől a lépéstől is folytathatjuk, vagy használhatjuk az eredeti talajmintát is.

a. Öntsünk vizet a talajmintára egy megfelelő edényben, pl. vödörben. Legalább tízszeresére hígítsuk a földet és keverjük össze.

b. A durva talajdarabok pár másodperc múlva leülepednek.

c. Öntsük át a felülúszót 0,25 mm-es lyukátmérőjű szűrőn, és a maradékot gyűjtsük egy főzőpohárba.

d. Ismételjük meg a c pontot kétszer-háromszor.

e. Az így összegyűjtött maradékokat 0,1–0,2 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe töltjük, és a szűrőt sekély rétegű vizet tartalmazó Petri-csészébe helyezzük.

f. Sztereomikroszkóppal fény alatt vizsgáljuk.

g. A nematódák fertőzőképességét az előbb leírtak szerint ellenőrizzük. A vírus jelenlétét tesztnövényekkel mutatjuk ki.

h. Fonálféreggel történő átvitel, javított standard módszerrel (Fritzsche, 1967)

i. A magvető ládákban kikelt 3–4 cm-es növényeket nem cserépbe, hanem 4 × 4 cm nagyságú kimélyített üvegkockákba rakjuk (43. ábra).

j. Az üvegkockákba csak annyi sterilizált földet rakjunk, amennyi éppen ellepi a benne elültetett növény gyökerét.

k. A talajnedvesség fenntartása céljából tegyük a kockákat egy nagy Petri-csészébe. A módszer előnye, hogy így a fonálférgek közvetlenül a gyökér közelébe helyezhetők, mozgásukat a talaj nem befolyásolja. A módszer hátránya, hogy a vizsgált növények élettartama igen rövid.

43. ábra - Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán]



3.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkalA talajlakó gombák közül a legismertebb az Olpidium brassicae, amely a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) és a Spongospora subterranea, amely a burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) (44. ábra) átvitelére alkalmas (Harris és Maramorosch, 1980; Jones, 1993b).

44. ábra - A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége folytán]

A dohány nekrózis vírus átvitele Olpidium brassicae gombával

a. Az O. brassicae gombát légszáraz gyökérből vagy közvetlenül saláta- (Lactuca sativa) növény gyökeréből izolálhatjuk. A Solanum nigrum, Solanum villosum vagy a Lactuca sativa növényeket virágcserépben neveljük, durva homok és kagylózúzalék keverékén. Egy hét múlva hígítsunk Hoagland-oldatot 1:20 arányban (pH 7,0) és öntsük a virágcserépbe. További napokon vízzel öntözzük (Teakle, 1967).



b. Amikor a gyökerek elérik a 3 mm-es hosszúságot, akkor a zoospóra-szuszpenziót a palánta szárához közel lévő sekély lyukba öntjük. 5–8 nap után a zoospórák nagy tömegben vannak jelen.

c. Az inokuláláshoz kb. 60 db növény gyökerére van szükségünk, amelyet előzőleg folyóvízben gyorsan lemostunk és kb. 30 ml desztillált vizet tartalmazó Petri-csészébe raktunk. 1%-os nyúlszérumot adunk a vízhez, hogy meghosszabbítsuk a zoospórák mozgásképességét.

d. Kilenc rész zoospóra-szuszpenzióhoz (105–106 zoospóra /ml) egy rész dohány nekrózis vírust tartalmazó szövetnedvet (15 g/l) adunk.

e. Öt perc elteltével 5 db Phaseolus aureus palánta gyökerét tesszük az elegybe, 5–30 percre. Ültessük a növényeket Hoagland-féle ásványi tápoldattal átitatott homokba.

f. Az összehasonlítás kedvéért helyezzünk 5 db P. aureus növényt 5–30 percre dohány nekrózis vírust tartalmazó szövetnedvbe (1,5 g/l), és utána ültessük el. Egy-két nap elteltével nekrotikus lokális léziók jelennek meg a megfertőződött gyökereken.

3.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkalTöbb vírus is képes egy olyan „természetes hídon” keresztül átjutni a fertőzött növényből az egészségesbe, amelyet egy parazita növény, az aranka (Cuscuta spp.) indája hoz létre. Arankával nemcsak az átnövő szár segítségével tudnak a vírusok átjutni a beteg növényről az egészséges növényre, hanem akkor is, ha a fertőző növényen felnőtt aranka egy levágott hajtása rátekeredik a tesztnövény szárára és levelére.

Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele arankával

A tesztelést elvégezhetjük vírussal fertőzött Nicotiana glutinosa növényről vírusmentes növényekre (Bakos et al., 1995).

a. Tegyünk Cuscuta subinclusa magokat steril desztillált vizes, 0,5%-os agarózra (pH 5,5). Az arankamagoknak kemény burka van, ezért áztassuk a magokat 20 percig H 2SO4-ban, majd öblítsük háromszor bőséges desztillált vízzel. Ezután tegyük 20 percre 20%-os hypóba, majd legalább háromszor alaposan mossuk le desztillált vízzel. Az aranka a csírázást követően rendkívül gyorsan növekszik. A kezdetleges gyökérre csak addig van szüksége, amíg a csíranövény számára szükséges vizet felveszi, később elszárad. A további tápanyagfelvétel a hausztóriumokon keresztül történik.

b. Helyezzük a magról kelt 2–4 cm-es növényeket közvetlenül a gazdanövény szára vagy levélnyele mellé úgy, hogy érintkezzenek egymással. Mindezt párás körülmények között végezzük. Olyan növények alkalmasak gazdának, amelyeknek nincsen hosszú szőre (Beta vulgaris, Vicia faba). Mielőtt virágzásnak indulna, tegyük át a csúcstól számított 10–20 cm hosszú szárakat egy új gazdanövényre, hogy megtartsuk az arankát vegetatív stádiumban. A szárak csúcsain vannak ugyanis a gazdanövényt felismerő receptorok.

c. Az arankát fertőzhetjük úgy, hogy palántáját vagy 10–20 cm-es szárát a beteg növényre helyezzük. Ügyeljünk arra, hogy a szár csúcsa elérje a gazdanövényt. Két hét múlva vagy később tegyük olyan közel a tesztnövényhez, hogy az aranka szára átérhessen hozzá, vagy vágjunk 10–20 cm-es szárat és tekerjük ezt a tesztnövény köré.

d. Egy-két nap elteltével figyeljük meg a megjelenő tüneteket a tesztnövények gyökerein.

4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusaiA vektorokkal történő vírusátvitel valamennyi típusában a víruspartikulumok mozgását kell nyomon követni. A vírus és a vektor közötti molekuláris kölcsönhatást a víruspartikulumok felszíne határozza meg. A legtöbb vírus esetében a virionok felszíne lép kölcsönhatásba a vektorral. Ez a kölcsönhatás lehet közvetlen, vagy történhet közvetett módon is, egy másik, vírus által kódolt fehérjén keresztül (Hull, 1994). Ma már bizonyított tény, hogy a vírusgenom és a géntermékek meghatározzák az átvitelt.

4.1. Köpenyfehérje (CP)



A vírus-köpenyfehérje meghatározó az átvitel szempontjából. A köpenyfehérje pontos természete több esetben még nem tisztázott, de azt tudjuk, hogy bizonyos aminosavak és domének lényegesek a folyamatban. A köpenyfehérjét vizsgáló tanulmányok többségének középpontjában azok a módosult vagy módosított vírusváltozatok állnak, amelyek eredetileg nem képesek a vírusátvitelre, de molekuláris úton átvihetővé tehetők (Pirone, 1991).

A propagatív vírus–vektor kapcsolatok közül a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus) és a kabócák között mutatták ki – első esetben molekuláris szinten – a köpenyfehérje szerepét. A here seb tumor vírus vad típusú izolátumaiban a kettős szálú RNS 12 szegmensében hiány (deléció) található, ami az átviteli képesség elvesztését eredményezi. A 2. vagy 5. szegmens deléciója esetén megszűnik az átvitel, és ezek az izolátumok a rovarsejteket sem fertőzik. Ez a két génszakasz kódolja a vírus köpenyének 130 kD és 76 kD nagyságú fehérjéit. A külső köpeny enzimatikus eltávolítása nem okozza a vektorsejtek fertőzöttségének elvesztését. Valószínű, hogy a génszakaszok hiánya fontosabb az átvitel szempontjából, mint a külső köpeny eltávolítása. Egy másik vírus, a burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus) felszínén glükoprotein (G-protein) „tüskék” helyezkednek el, ezek okozzák a kórokozó kabócával történő átvihetőségét. A „tüskék” eltávolítása a rovar testében a vírusfertőzés csökkenését eredményezi, a növényben azonban nem. A burgonya sárga törpülés vírusnak két törzse ismert, amelyet különböző kabócavektorok terjesztenek. A két törzs G-proteinjének különböző izoelektromos pontja összefüggésben van az egyrétegű vektorsejt fertőzésének pH-optimumával.

Az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) levéltetvekkel történő terjedése cirkulatív jellegű, de a vírus a vektor testében nem szaporodik. Az árpa sárga törpülés vírus MAV-izolátuma normális körülmények között nem vihető át Rhopalosiphum padi levéltetűvel, míg a vírus RPV-izolátuma igen. Ha a MAV-izolátum RNS-ét az RPV-izolátum köpenyfehérjéjébe burkolták, akkor a MAV-RNS is átvihetővé vált R. padi által. Cirkulatív átvitel esetén a köpenyfehérje szerepét bizonyítja az a tény is, hogy luteovirusokkal történt kevert fertőzés hatására levéltetvekkel nem átvihető vírusok is átvihetővé válnak. A kevert fertőzéseknél a nem luteovirus-RNS a luteovirus köpenyfehérjébe enkapszidálódik. A kevert vírusoknak speciális vektoraik vannak, amelyeket a luteovirus eredetű köpenyfehérje határoz meg. A cirkulatív borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) átvitelét a köpenyfehérje kisebb alkotója határozza meg. Ez a 22 kD fehérje a levéltetűvel átvihető és a nem átvihető izolátumokban egyaránt túlsúlyban van. Ennek a kis fehérjének a jelenléte összefügg a levéltetűvel átvihető izolátumban egy magas molekulatömegű RNS1-gyel, amelyik a köpenyfehérjét kódolja. A genom részének elvesztése eredményezi az 56 kD-os termék hiányát, ami nélkülözhetetlen a levéltetű-átvitelben. Az árpa sárga törpülés vírus és a borsó enációs mozaik vírus esetében a kórokozónak be kell kerülnie a vektor nyálmirigyébe, és ezt követően lehetséges a vírusátvitel. A köpenyfehérje szerepét egy geminivirus vektorában génkicseréléssel bizonyították. Az egyszálú DNS-t tartalmazó geminivirusoknak két alcsoportját különböztetjük meg. Az egyik alcsoportot molytetvek, míg a másikat kabócák terjesztik. Kiméra klónokat állítottak elő úgy, hogy a konstrukcióban a molytetűvel átvihető Cassava afrikai mozaik vírus (Cassava African mosaic bigeminivirus) DNS-éhez a kabócával átvihető répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top hybrigeminivirus = curtovirus) köpenyfehérjéjét illesztették. A kimérával növényeket fertőztek, majd a tisztított víruskimérát kabócába injektálták. A rovar a vírust átvitte, a növény a Cassava afrikai mozaik vírus tüneteit mutatta.

A nem cirkulatív vírusátvitelnél a vektor–vírus kölcsönhatás nem annyira specifikus, mint a cirkulatív vírusok esetében. A nem cirkulatív vírusok mechanikailag könnyen átvihetők. Ebben a víruscsoportban is vannak levéltetűvel kevésbé és jobban átvihető izolátumok. Mindkét típust használták a köpenyfehérje szerepének kimutatására cucumovirusok és potyvirusok levéltetű átvitelében. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) eltérő izolátumaival végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az átvihetőséget az határozza meg, hogy az RNS-t melyik típusú köpenyfehérje burkolja. A paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) V törzsének köpenyfehérjéje, amely levéltetvekkel átvihető, szintén lehetővé tette az uborka mozaik vírus átvitelét. A paradicsom magtalanság vírus a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) is képes az előbb leírtak szerint a levéltetvek számára felvehetővé tenni. Az uborka mozaik vírus genomjában az RNS-3 kódolja a köpenyfehérjét. A levéltetű-átvihetőséget szintén az RNS-3 határozza meg. Az összehasonlítási vizsgálatok azt mutatták, hogy a köpenyfehérje 168. aminosava felelős a vírus terjedéséért. A köpenyfehérje szerepét közvetett módon bizonyítja a dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel nem terjeszthető izolátuma. Ezen izolátumok köpenyfehérjéjének N-végén lévő aminosav-szekvenciákat összehasonlították ugyanezen vírus magas átviteli hatékonysággal rendelkező izolátumaival és más, levéltetűvel átvihető potyvirusok N-végeivel. Az eredmény meglepő volt. A levéltetűvel átvihető izolátumokban három aminosav-szekvencia mutatkozott konzervatívnak: Asp-Ala-Gly (DAG). A nem átvihető izolátumban pedig az Asp-Ala-Ser (DAS). Ez az aminosavtriplet foglalja magában a levéltetűvel történő átvihetőséget. Más potyvirusok tripletjeivel végzett összehasonlító vizsgálatok azt mutatták, hogy a triplet 2., ill. 3. helye gyakran



változik az izolátumokban, pl. a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) esetében Asp-Ala-Leu (DAL), a papaya gyűrűsfoltosság vírusnál (papaya ringspot potyvirus) és a cukkini sárga mozaik vírusnál (zucchini yellow mosaic potyvirus) Asp-Thr-Gly (DTG), végül a szója mozaik vírusban (soybean mosaic potyvirus) Asp-Ala-Asp (DAD). A triplet harmadik aminosavjának szerepét a dohány érfoltosság vírus (tobacco vein mottling potyvirus) levéltetvekkel terjedő izolátumával bizonyították, amelyben a triplet Asp-Ala-Glu (DAE). Olyan transzkriptumokkal fertőztek növényeket, amelyekben az átvihető izolátum teljes hosszúságú cDNS klónjába a nem átvihető izolátum köpenyfehérjéjének cDNS klónját helyezték. Ezt a kiméra vírust a levéltetvek képtelenek voltak átvinni, annak ellenére hogy a kiméra mechanikai fertőzhetőségét megőrizte. Később felbecsülték a köpenyfehérje N-vég DAG-tripletjében létrejövő hiányok vagy helyettesítések jelentőségét a dohány érfoltosság vírus levéltetű-átvitelében. A molekuláris módszerrel létrehozott mutánsokat a dohány érfoltosság vírus levéltetűvel terjeszthető izolátumának teljes hosszúságú cDNS klónjába építették, és a transzkriptumokkal növényeket fertőztek. A DAG-triplet teljes deléciója pl. az átviteli képesség megszűnésével járt. Ha a triplet első aminosavját Asp-ról Asn-ra változtatták, akkor a mutáció az átvitelre nem volt hatással. A második aminosavban történt változtatás már drasztikusan érinti az átviteli képességet. Ha a relatív átviteli képességet százalékban fejezzük ki a kontroll DAG-izolátumokhoz képest, akkor ez az érték 3%. A harmadik aminosav helyettesítése az átvitel hatékonyságát 0%-ra csökkentette. A továbbiakban azt kell meghatározni, hogy a levéltetű-átvitelért felelős domain kiterjedése mekkora a genomban. Ehhez hasonló hiányok vagy helyettesítések a természetben is létrejöhetnek, bizonytalanná téve a potyvirusok átvitelét. A potyvirusok ugyanis megkötődhetnek a tápcsatornában vagy a vektor előbelében. A potyvirus-köpenyfehérje N-végének aminosavai a virion felszínén helyezkednek el, ezért alapvetően befolyásolhatják a vírus kötődését és megtartását.

4.2. Helper komponens (HC)Míg a cirkulatív cucumovirusok levéltetű-átvitelét kizárólag a köpenyfehérje határozza meg, addig a potyvirusok és caulimovirusok esetében szükség van egy vírus által kódolt, nem szerkezeti fehérjére. Ezt a fehérjét helper, azaz segítő komponensnek (HC) nevezzük, de a caulimovirusoknál megszerzési vagy levéltetű-átviteli faktornak is hívják.

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) HC-je elősegíti a klónozott vírus-DNS fertőzését. A deléciós mutánsok analízise és a karfiol mozaik vírus izolátumok különböző átviteli képességekkel rendelkező kimérájának szerkezete bizonyítja, hogy a genom nyílt leolvasási szakasza (open reading frame, ORF), az ORFII kódolja a HC-t. Az ORFII egy 18 kD (P18) fehérjét kódol, amely kimutatható a vírussal fertőzött növényben. Valószínűleg a P18 fehérje maga a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel nem átvihető izolátumával fertőzött növényekben vagy nincs P18 fehérje, vagy van, de egy kicserélődés eredményeképpen mutáció jön létre a 94. aminosav helyén. Egy deléció az ORFII rendszeren belül vagy a P18 fehérje végében a levéltetű-átvitel megszűnését okozza. Nagyon nehéz közvetlenül bizonyítani, hogy a P18 tulajdonképpen a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel átvihető izolátumával fertőzött növények nedvével végzett membrán-etetéses vizsgálatok pozitív összefüggést mutattak a P18 jelenléte és a levéltetű-átvihetőség között. Két potyvirus [dohány érfoltosság vírus (tobacco mottling potyvirus) és burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus)] HC-jét tisztították, és két fehérjét kaptak (53 kD, 58 kD). Ebből arra következtettek, hogy a HC biológiailag aktív formája valószínűleg egy dimer. Az in vitro transzláció és a nukleotidok szekvenciaanalízise alapján a dohány érfoltosság vírus HC-jét a második gén kódolja. Ha a vírus HC-jének N-terminusa blokkolt, nem lehetséges a HC-gén 5’ végének meghatározása. A vírus-HC N-vége valószínűleg szerin, míg C-terminusa a dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) analóg módon glicin. Ennek alapján a dohány érfoltosság vírus HC-gén a 947. nukleotidnál kezdődik és a 2344. nukleotidnál végződik. Bizonyos burgonya Y-vírus és cukkini sárga mozaik vírus törzsek a HC deléciója miatt váltak levéltetvekkel átvihetetlenné. A burgonya Y-vírus HC-defektív törzsének elektroforetikus és immunológiai tulajdonságai hasonlítanak a burgonya C-vírushoz [= burgonya Y-vírus C-törzse (C-strain of potato Y potyvirus)]. A burgonya Y-vírus és a C-vírus törzs aminosav szekvenciáinak és nukleotidjainak összehasonlítása a HC–PRO (helper component-protease) régióban 92%-os homológiát mutat, és csak 24 aminosavban van eltérés. A C-vírus törzs HC-szekvenciáit további öt potyvirussal összehasonlítva csak két aminosavban van eltérés (lizinről glutaminsavra és izoleucinról valinra). Az aminosavaknak a HC tevékenységében játszott szerepe a mai napig vizsgálat tárgyát képezi. A HC tehát közvetlenül vagy közvetett úton képes irányítani a vírusátvitelt. A direkt viszonyban a köpenyfehérje N-terminális aminosavai közvetlenül lépnek kölcsönhatásba a HC-vel, míg a közvetett (indirekt) viszonyban a HC csak közvetítő szerepet játszik a virionok és a vírus megőrzési helye között a vektorban.

5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai



A növényvírusok fonálférgekkel történő átvitele egyéb vektorokhoz (rovarok, gombák, stb.) hasonlóan három fázisból tevődik össze: 1. a vírus felvétele, 2. a vírus megtartása és 3. a gazdanövény sejtbe juttatása. A vírus felismerésének mechanizmusa ebben a kapcsolatban is rendkívül bonyolult és fajlagos. E folyamatban a vírusgenom által kódolt fehérjék fontos szerepet játszanak. Az eddigi tanulmányok pl. azt mutatták, hogy a tobravirusok esetében jelentősek a vírusnukleinsav által meghatározott nem-szerkezeti fehérjék (Schmitt et al., 1998). A nepovirusok gén funkciói kevésbé ismertek, de a vírus–vektor kölcsönhatás a tobravirusokéhoz hasonló (Vassilakos et al., 1997).

A nepovirusok pl. dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) osztott genomú, poliéder alakú vírusok. E nemzetségbe tartozó vírusokat a Xiphinema és a Longidorus fajok terjesztik. A tobravirusok, pl. dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus), borsó korai barnulás vírus (pea early-browing tobravirus), paprika gyűrűsfoltosság vírus (pepper ringspot tobravirus) osztott genomúak, pálcika alakú virionjaik egyszálú pozitív RNS-t tartalmaznak. A nagyobbik RNS-szál (RNS1) a replikációban játszik szerepet és a vírus sejtről sejtre történő terjedéséért felelős. A kisebbik RNS-szál (RNS2) változó hosszúságú és szekvenciájú, amely a köpenyfehérjét kódolja. Az RNS2 további géneket is tartalmazhat, amelyek nem-szerkezeti fehérjéket kódolnak. A tobravirusokat a talajban élő Trichodorus és Paratrichodorus fonálférgek terjesztik. A szerológiailag jól elkülöníthető vírusizolátumoknak speciális fonálféregfajaik vannak. Jelenleg a dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátumának Paratrichodorus pachydermus vektorral és a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátumának Trichodorus primitivus vektorral történő átvitele ismert részletesebben. A PpK20 jelű izolátumban az RNS2 két nem-szerkezeti fehérjét kódoló gént (29,4K, ill. 32,8K) tartalmaz, míg a TpA56 jelű izolátum három ilyen fehérjét határoz meg (9K, 29,6K és 23K). MacFarlane et al. (1998) szerint ugyanezen gének molekulatömege 37K, 32.8K, ill. 9K, 29K, 23K.

A dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátumával végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a vírus mechanikai inokulációját követően a két nem-strukturális fehérjét meghatározó génben bekövetkező hiányok az enkapszidációt (köpenyfehérjébe burkolást) és az RNS1 és RNS2 együttes replikációját nem gátolják. A 29,4 kD fehérjét kódoló génszakaszban fellépő mutációk megszüntetik az átvitelt, míg a 32,8 kD fehérjét kódoló régióban bekövetkező deléciók nem. Ebből arra következtettek, hogy a PpK20 izolátumban a 29,4K gén felelős a vírusátvitelért (Hernández et al., 1997).

Az RNS2 vírusátvitelben játszott meghatározó szerepét pszeudorekombináns vírusokkal bizonyították, amelyeket a vektorral könnyen átvihető dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátum és a vektorral átvihetetlen dohány rattle vírus PLB jelű izolátum RNS1 és RNS2 kicserélésével hoztak létre. A borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum RNS2-jének fertőző cDNS klónjában és egy ezzel rokon SP5 jelű izolátumban bekövetkező mutációk analízise is azt mutatta, hogy a vírusátvitelben az RNS2-nek van szerepe.

MacFarlane et al. (1998) négy különböző tobravirus izolátum genom-analízisét végezték el. A vírusizolátumok a következők voltak: a már említett TpA56 jelű borsó korai barnulás vírus izolátum és a PpK20 jelű dohány rattle vírus izolátum, valamint további két újabb dohány rattle vírus izolátum (TpO1 és PaY4). Az izolátumok nukleotid szekvenciái között történt összehasonlítások nagyfokú homológiára, de szembetűnő eltérésekre is rámutattak. A köpenyfehérjén kívül a vírusgenom további két vagy három fehérjét kódol. A TpA56 jelű izolátum és a TpO1 jelű izolátum köpenyfehérjegénje és 29K génje között helyezkedik el a 9K gén. A megelőző vizsgálatok arra mutattak, hogy ez a fehérje magában foglalja a vírusátviteli képességet. Később beigazolódott, hogy szerepe van ebben a folyamatban. A nem-szerkezeti fehérjék közül a 29K fehérjének nélkülözhetetlen szerepe van a vírusátvitelben. A borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 29K fehérjéjét kódoló gén nagyfokú homológiát mutat a többi három dohány rattle vírus izolátum ennek megfelelő génszakaszaival (PaY4 27K, TpO1 29K, PpK20 37K). Az utolsó gén hosszúsága és szekvenciái igen változatosak a különböző izolátumokat illetően (TpA56 23K, PaY4 32,1K, TpO1 18K, PpK20 32,8K). Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 23K fehérjéjét érintő nagyobb átírási szakasz mutációi meggátolják az átvitelt, míg a kisebb deléciók csökkentik a hatásfokát. Létrehoztak olyan mutánst is, amelyből teljesen hiányzik a 23K fehérje. Ez a mutáns átvihető ugyan fonálférgekkel, de csak nagyon kis hatékonysággal. A 23K gén, ill. fehérje szerepének pontos tisztázása még további vizsgálatokat igényel. Ennek a köpenyfehérjétől legtávolabb kódolt fehérjének az aminosavai és a dohány rattle vírus izolátumok megfelelő fehérjéinek az aminosavai között nem mutatható ki homológia. A dohány rattle vírus PpK20 izolátum 32,8K génjének és a PaY4 izolátum 18K génjének a hiánya a vírusátvitel gyakoriságát nem csökkenti a Paratrichodorus anemones fonálféreg alkalmazása esetében. A PaY4 izolátumot a P. anemones és a P. pachydermus fajok, míg a PpK20 izolátumot csak a P. pachydermus fajok terjesztik. A jövőbeni vizsgálatoknak az a célja, hogy megállapítsák a köpenyfehérje vagy a mellette elhelyezkedő 27K (PaY4), ill. 37K (PpK20) fehérjék szerepét az eltérő vírusátvitelben.

A fonálférgekkel történő vírusátvitellel kapcsolatban új eredményekről számolt be Brown és Trudgill (1998).



Vizsgálataik során olyan mikrotechnikát fejlesztettek ki, amely alkalmas volt a fonálférgek vírusátvitelének vizsgálatára. Négy nepovirus átvihetőségét mutatták ki a Xiphinema americanum vonalba tartozó fonálférgek közül. Ebbe a vonalba 45 szűznemzéssel szaporodó és morfológiailag hasonló X. americanum faj tartozik. Ezt a technikát alkalmazva megállapították, hogy az Európában élő Longidorus vektorfajok egy vagy két, szerológiailag jól megkülönböztethető vírustörzset képesek terjeszteni, míg az Amerikában élők akár mind a négy nepovirust. További érdekes megfigyeléseket tettek a X. americanum fajt illetően. Észak-Amerikában ugyanis a vírusterjesztő fajok csak a harmadik lárvastádiumig fejlődnek, míg a világ többi részén, ha a negyedik lárvastádium is kialakul, ezek az alakok már nem képesek a vírusátvitelre. Ezt a felfedezést biológiai jelzőként használják fel a vírus–vektor kapcsolatban.

Az 1990-es évektől kezdődően kifejlődő molekuláris technikák lehetővé tették, hogy zöld fluoreszcens fehérjék tobravirus izolátumokba építésével láthatóvá váljék a Trichodorus vektorfajok táplálkozási mechanizmusának vírusátvitelben betöltött szerepe, valamint a vírus terjedése a gyökérben. A jelenleg folyó kutatások középpontjában a fonálférgek elleni kémiai védekezés helyett a vírusátvitel megelőzése szerepel. Ennek érdekében burgonyában a fonálférgekkel terjedő vírusokkal szemben kialakított természetes rezisztencia létrehozása az elsődleges kutatási feladat.


8. fejezet - A biotesztek virológiai alkalmazásaA vírusok vizsgálatának tesztnövényes módszere egyidejűleg fejlődött a növényvirológiával. Mayer (1886) volt az első, aki a dohány mozaik betegségét vizsgálta, és megállapította, hogy a betegség kórokozója növényi nedvvel átvihető az egészséges növényre. Ez a felfedezés, valamint Johnson (1925), Holmes (1929) és Smith (1931) tesztnövényekkel végzett kísérletei, majd Price (1940) és Holmes (1946) a gazdanövénykörökről szóló tanulmányai megnyitották az utat a felbecsülhetetlen fontosságú elméleti és gyakorlati tudományos eredmények felé. Azok a vizsgálatok, amelyeket a kutatók a XX. században a vírusok tesztnövényeivel végeztek, napjainkban sem veszítették el jelentőségüket annak ellenére, hogy a tesztnövények használata a vírusdiagnosztikában drága; sok kézi munkát, helyet és időt igényel. A biotesztek jelentősége főleg abban van, hogy a vírusok patológiai tulajdonságai csak tesztnövényeken vizsgálhatók, és eredményei bizonyos esetekben megbízhatóbbak, mint a szerológiai és egyéb vizsgálatoké. A növényi nedvből a tesztnövények segítségével kis víruskoncentráció esetén is kimutathatók a vírusok. Az utóbbi években kifejlesztett gyors és megbízható víruskimutatási módszerek (ELISA-módszer, elektronmikroszkópos vizsgálatok, PCR-technika) sem zárják ki a tesztnövények használatának szükségességét, hiszen a növényi vírusok tanulmányozása növények nélkül nem lehetséges. A CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses c. kiadvány 446 növényfajt (43 család és 163 nemzetség fajait) említ mint a biotesztek során használható tesztnövényt (Murant és Harrison, 1970–1988; Horváth, 1993 a, c).

1. A növény–vírus kapcsolat típusaiA növények és vírusok közötti alternatív kapcsolat a kompatibilitásban és az inkompatibilitásban jut kifejezésre (Horváth, 1976). A növény–vírus kapcsolat egy különleges esete a túlérzékenység, ill. hiperszenzitivitás (hypersensitive reaction, HR-reaction) (45. ábra).

45. ábra - A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic potyvirus) és B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow fleck bromovirus) szemben [Horváth József szívessége folytán]

1.1.1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Kompatibilitás

Kompatibilis gazda–parazita kapcsolatban a növény gazdája a vírusnak. Az ilyen növényben a kórokozó replikációjának és elterjedésének nincs akadálya. A kompatibilis növény gyakran látható tünetekkel reagál az inokulációra. Az inokulált növények reakciója (szimptómák) attól függően, hogy a növény inokulált levelein vagy a nem inokulált (az inokuláció után képződött) új levelein mutatkozik-e, lokális vagy szisztemikus lehet.


A biotesztek virológiai alkalmazása

Egyes gazda–vírus kombinációban lokális és szisztemikus kapcsolat együtt is kialakulhat. A kompatibilis növény–vírus kapcsolat egyes esetekben nem jut kifejezésre látható tünetekben, hanem tünetmentes marad. A látens fogékonyság mind lokális, mind szisztemikus, mind pedig lokális és szisztemikus lehet. Horváth (1983) egyik összefoglaló tanulmányában 1312 új gazda–vírus kapcsolatot állapított meg, amelyből 13% látensnek bizonyult. A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a tünetek megjelenése után bekövetkezhet az ún. kigyógyulás (recovery), amely az újabb vélemények szerint a rezisztencia egyik formájának tekinthető (Pennazio et al., 1999).

1.1.1.1.2. Inkompatibilitás

Inkompatibilitás esetében a növény–vírus kapcsolatban a kórokozó ugyan eredményesen fertőzi a növényt, de nem betegíti meg. Az inkompatibilitás létrejöhet a vírus elégtelen támadóképessége vagy a növény ellenálló tulajdonsága miatt. Az inkompatibilis kapcsolatban a vírus replikációja zavart szenved, majd leáll, és a kórokozó nem terjed el a gazdanövényben (nem szisztemizálódik).

1.1.1.1.3. Hiperszenzitivitás

Az inkompatibilitás gyakran hiperszenzitivitás formájában jelentkezik. A túlérzékenységi vagy hiperszenzitív reakció esetén a gazdanövénybe juttatott vírus helyileg replikálódik ugyan, de a folyamat a gazdaszervezet aktív leküzdési reakciója következtében gátolt. Hiperszenzitív reakció (nekrózis, esetleg amputáció) esetén a növény igyekszik a kórokozót lokalizálni. A hiperszenzitív reakció attól függően, hogy a növény melyik részén lép fel, kétféle lehet: lokális és szisztemikus. A hiperszenzitív reakciónak nagy jelentősége van a növénynemesítésben.

1.1.1.1.4. A növény–vírus kapcsolatokat befolyásoló tényezők

A tesztnövények fejlettségi állapota befolyásolja fogékonyságukat a vírusfertőzéssel szemben. A Chenopodium amaranticolor, a Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii 10 leveles, a Nicotiana glutinosa 7 leveles, a Nicotiana tabacum és a Gomphrena globosa 4 leveles állapotban ideális diagnosztizálási célra. Az uborkának (Cucumis sativus) és a töknek (Cucurbita pepo) a sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) és a tehénborsónak (Vigna sinensis) a primer leveleit kell inokulálni, mert a növény idősebb levelei nem alkalmasak a fertőzésre. Az uborkát pl. a vetést követően a 10. és a 15. nap között kell fertőzni, mert a 10 napnál fiatalabb és a 15 napnál idősebb sziklevelek rezisztensek a vírusfertőzéssel szemben (Yarword, 1971).

A növény vírusfogékonyságát a levél helyzete (a levélemelet szekvenciája) is befolyásolja; a fertőzés idejében kritikus a levél mérete is (Horváth, 1969 a, b).

Fontos ismernünk a tesztnövények fotoperiódusát is. A Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii hosszúnappalosak, a Chenopodium album és a Glycine max rövidnappalosak, míg a Vicia faba, a Cucumis sativus és a Phaseolus vulgaris közömbös a napszakok hosszának változására. Harrison és Jones (1971) a hőmérséklet és a fény hatását tanulmányozták a burgonya szártörpülés vírussal (potato mop-top pomovirus) fertőzött dohányleveleken. Megállapították, hogy a vírusakkumuláció növekedett, ha a növényeket 22 °C-os megvilágított helyről 14 °C-os sötétbe helyezték. Horváth és Pocsai (1972) különböző fotoperiódusos kezelések során azt tapasztalták, hogy alacsony hőmérsékleten a lokális léziók megjelenését elősegítette a hosszabb megvilágítás, míg magas hőmérsékleten a rövidebb megvilágítás volt hatásos.

2. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia)A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a vírusfertőzés és a vírusreplikáció következtében a gazdanövény gyakran tünetekkel (szimptóma) reagál a fertőzésre. A tünetek vizsgálatával a tünettan (szimptomatológia) foglalkozik (Bos, 1970; Schmelzer, 1980). A vírusfertőzés következtében megjelenő szimptómák két nagy csoportra oszthatók: szabad szemmel látható, a növényeken megjelenő, ún. makroszkópos, ill. külső szimptómák és szabad szemmel nem látható, a növényekben megjelenő, ún. mikroszkópos, ill. belső szimptómák. E fejezetben a makroszimptómák részletezésével foglalkozunk.

2.1.2.1.1.

2.1.1.1.



2.1.1.1.1. Makroszimptómák

A vírusfertőzés hatására a növényeken jelentkező, szabad szemmel látható tünetek két csoportra oszthatók: lokális vagy primer szimptómákra és szisztemikus vagy szekunder szimptómákra. A makroszimptómák osztályozása az alapján is ismert, hogy a növény mely részén (gyökér, levél, szár, virág, termés, mag) jelennek meg a tünetek.

2.1.1.1.2. Lokális tünetek

Kompatibilis kapcsolat esetén az inokulációt követően néhány nap, esetleg néhány óra múlva a gazdanövény inokulált levelén klorotikus és/vagy nekrotikus elváltozások jelentkeznek, amelyeket lokális lézióknak nevezünk (46. ábra). A léziók mérete gombostűfej nagyságútól több centiméter átmérőjű nekrotikus vagy klorotikus foltig terjedhet. A léziók lehetnek klorotikusak (világoszöld, sárgászöld és sárgásfehér foltok) vagy nekrotikusak (fekete, barna, vörös és szürkésfehér foltok). A lokális léziók formája igen változatos; lehetnek foltszerűek, gyűrű alakúak és csíkok (10. táblázat).

10. táblázat - Lokális növény-vírus kapcsolatok

Gazda–vírus kapcsolat Lokális tünettípus

Chenopodium amaranticolor–dohány mozaik vírus1

nekrotikus léziók

Chenopodium amaranticolor–uborka mozaik vírus2

klorotikus léziók

Chenopodium quinoa–burgonya Y-vírus3 klorotikus léziók

Chenopodium quinoa–dohány mozaik vírus1 klorotikus léziók

Datura stramonium–paradicsom mozaik vírus4

nekrotikus léziók

Nicotiana glutinosa–paradicsom mozaik vírus4

nekrotikus léziók

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc–dohány mozaik vírus1

nekrotikus léziók

Phaseolus vulgaris–lucerna mozaik vírus5 nekrotikus léziók

1 tobacco mosaic tobamovirus

2 cucumber mosaic cucumovirus

3 potato Y potyvirus

4 tomato mosaic tobamovirus

5 alfalfa mosaic alfamovirus

46. ábra - Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált levelein. A: klorotikus léziók belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók dohány gyűrűsfoltosság vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József szívessége folytán]



2.1.1.1.3. Szisztemikus tünetek

A szisztemikus tünetek megjelenéséig az inokulációt követően napok, hetek vagy hónapok, sőt egyes esetekben évek kellenek. A lágy szárú növények gyorsabban reagálnak a fertőzésre, mint a fásszárúak, a fiatal növények általában fogékonyabbak, mint az idősek. A szisztemikus tünetek megjelenésénél beszélhetünk lappangó (látens) és heveny (akut) fázisról. A leggyakrabban előforduló szisztemikus tünetek: mozaik, érnekrózis, érkivilágosodás, hólyagosodás, márványozottság, levéldeformáció, páfránylevelűség, kinövések (11. táblázat).

11. táblázat - Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok

Gazda–vírus kapcsolat Szisztemikus tünettípus

Cucurbita maxima–tök mozaik vírus1 kinövések (enációk)

Datura stramonium–beléndek mozaik vírus2 levéldeformáció

Nicotiana glutinosa–uborka mozaik vírus3 márványozottság, mozaik, növekedésgátlás

N. tabacum cv. Samsun–dohány mozaik vírus4

mozaik

Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya Y-vírus5

érkivilágosodás, mozaik (C-, N-törzs)

Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya Y-vírus5

érkivilágosodás, mozaik, érnekrózis (R-, NTN-törzs)

Phaseolus vulgaris–bab közönséges mozaik vírus6

hólyagosodás, mozaik, levéldeformálódás



Vitis vinifera–szőlő páfránylevelűség vírus7 páfránylevelűség

1 squash mosaic comovirus

2 henbane mosaic potyvirus

3 cucumber mosaic cucumovirus

4 tobacco mosaic tobamovirus

5 potato Y potyvirus

6 bean common mosaic potyvirus

7 grapevine fanleaf nepovirus

2.1.1.1.4. A növényi szerveken lévő tünetek

A növényi szerveken megjelenő tünetek közül a leveleken lévők mutatják a legváltozatosabb képet. Ha a levél fejlődésében zavar áll be, elszíneződések (sárgulás, nekrózis, érkivilágosodás, mozaikfoltok, tarkulás, gyűrűk, minták, csíkok, hálózatosság stb.) és deformációk (ráncosodás, hólyagosodás, torzulás, kinövések, levélkeskenyedés, páfránylevelűség stb.) alakulhatnak ki (47. ábra).

47. ábra - Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) inokulált Solanum marginatum mozaikos levele; B: paradicsom magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus) inokulált Nicotiana glutinosa deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált burgonya (Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán]

A száron, hajtáson, terméseken és virágokon mutatkozó tünetek közül a különböző foltok, elszíneződések, nekrózisok, deformációk, internódium-megnyúlás, ill. -rövidülés, hajtáshervadás és a szártumorok a legjelentősebbek (48. ábra).

48. ábra - A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum szárnekrózisa; B: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik vírussal (turnip mosaic potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A és D: Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán]



A korai vírusfertőzés a generatív szerveken is elváltozásokat okoz. A virágtakaró levelek színtörését a tulipán színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) vagy a tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) okozza (48D ábra), de találhatunk a virágon nekrotikus foltokat, kinövéseket, létrejöhet deformáció, és gyakori tünet a pártacső felrepedése is.

A burgonya Y-vírus NTN törzsének (potato Y potyvirus, PVYNTN) fertőzése esetén a burgonyagumón és bogyóin nekrotikus foltok keletkeznek (48B és C ábra). A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) jellegzetes nekrotikus tüneteket idéz elő a burgonyagumókon (49A ábra). Kövecsesedést okoz a körte termésén a körte kövecsesedés vírus (pear stony pit virus), amely a gyümölcs minőségét jelentősen rontja. A vírusfertőzés egyes tünetei a magvak felületén is megjelennek. A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a fertőzött szilván gyűrűket, torzulásokat idéz elő.

49. ábra - A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek Libertas burgonyafajta gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) által előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás) cukorrépán [Horváth József szívessége folytán]

A növényi szervek közül a gyökéren lévő vírustünetek (valószínűleg elhelyezkedésük miatt) ismertek a legkevésbé. Az eddigi vizsgálatok nekrózist, járulékos gyökérképzést és gyökértumor-képződést mutattak ki. Járulékos gyökérképződést idéz elő a cukorrépa rizománia betegsége, amit a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) idéz elő (49B ábra).



A vírusfertőzés következtében keletkező rendkívül változatos tünetek sora szükségessé teszi azok szimbolikus jelekkel történő írását. Erre vonatkozóan nemzetközileg is egységes normák azonban nem állnak rendelkezésre. A továbbiakban néhány tünet angol és magyar nyelvű rövidítését ismertetjük:

B: browning (barnulás)

Bli: blistering (hólyagosodás)

Cb: colour breaking (színtörés)

Ch: chlorosis (klorózis)

Chl: chlorotic lesions (klorotikus léziók)

D: plant death (a növény elhalása)

E: etched patterns (tölgyfalevél-mintázat)

Fle: fern leaf (páfránylevelűség)

Gr: growth reduction (növekedésgátlás)

HR: hypersensitive local necrotic lesions (lokális hiperszenzitív reakció)

HRS: hypersensitive systemic symptoms (szisztemikus hiperszenzitív reakció)

La: latent or symptomless (tünetmentes)

Ldef: leaf deformation (levéltorzulás)

Led: leaf drop (levéllehullás)

Lo: local (lokális)

M: mosaic (mozaik)

Mo: mottling (foltosodás)

N: necrosis (nekrózis)

Nl: necrotic lesions (nekrotikus léziók)

NLL: necrotic local lesions (nekrotikus lokális léziók)

NLRi: necrotic local rings (nekrotikus lokális gyűrűk)

P: pattern (mintázottság)

S: systemic (szisztemikus)

Sledef: systemic leaf deformation (szisztemikus levéldeformáció)

SMo: systemic mosaic symptoms (szisztemikus mozaiktünetek)

Sp: spots (foltok)

Tn: top necrosis (csúcsnekrózis)

Vb: vein banding (érszalagosodás)

Vc: vein clearing (érkivilágosodás)

Vn: vein necrosis (érnekrózis)



Vnt: vein netting (érhálósodás)

Ysp: yellow spots (sárga foltok)

Megjegyzés: A szimptomatológia a tüneteket általában tört alakban írja le, ahol a számlálóban a lokális tünetek, a nevezőben a szisztemikus tünetek rövidítései találhatók. Például: Nl/Ldef (lokális nekrotikus léziók/szisztemikus levéldeformáció).

Mikroszimptómák (anatómiai elváltozások)

A vírusfertőzés hatására a növényekben megjelenő belső elváltozások a sejtek, szövetek belsejében figyelhetők meg (Horváth, 1972). Ilyenek pl. a magállomány gyors növekedése, a kloroplasztiszok degenerálódása, intracelluláris zárványok kialakulása, citoplazmatikus zárványok, a rostacsövek nekrózisa, floem hipertrófia, kromoszóma-abnormalitás (törések) (Esau, 1967; Schmidt, 1980). A mikroszimptómákat A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete, illetve a Fénymikroszkópos festéses módszerek c. fejezetek ismertetik.

3. A vírusfertőzés mértékének meghatározásaA vírusfertőzés mértékének megállapítására korábban a félleveles lokálislézió-számlálás és a latin négyzet módszerét alkalmazták. Erre ma már az ELISA-féle szerológiai módszer a megfelelőbb.

Lokálislézió-számlálás féllevél módszerrel

a. A kiválasztott vírust, pl. a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvet a megfelelő töménységűre hígítjuk (pl. 10–2).

b. Tíz darab, 8–10 leveles Nicotiana glutinosa 5 levelének a jobb, 5 levelének pedig a bal felét inokuláljuk a vírussal. A lokális léziók a kezelt leveleken jól megszámolhatók.

c. Sztereomikroszkópba szerelt okulár mikrométerrel a lokális léziók pontos területe (cm2) megmérhető.

Megjegyzés: Kellő számú ismétlés estén a módszer alkalmas különféle kezelések (hormonok, vírusgátló anyagok stb.) közvetlen fertőzésfogékonyságot befolyásoló hatásának statisztikai elemzésére is.

Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel

A tesztnövényeken keletkezett lokális léziók számának összehasonlítására különböző levélméret esetén a latin négyzet módszer alkalmazható. A kísérlet beállítását, 4 különböző vírusszuszpenziót (A, B, C, D) és 4 db tesztnövényt használva (I–IV), a 12. táblázat mutatja.

12. táblázat - Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel

A kezelt levelek

sorszáma

A tesztnövények sorszáma

I II III IV

1 A D B C

2 B A C D

3 C C A B

4 D B D A

Megjegyzés: Pontosabb eredmény kapható, ha a latin négyzet és a féllevél módszert együtt használjuk (13. táblázat). A vírusfertőzés mértékét az előző módszerhez hasonlóan a lokális léziók számával, a nekrózis mértékét a léziók területének kiszámításával állapíthatjuk meg.



13. táblázat - Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel

A kezelt levelek

sorszáma

A tesztnövények sorszáma

I II III

jobb bal jobb bal jobb bal

1 A B C B C A

2 B A B A B C

3 C C A C A B

4. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszereiA fizikai tulajdonságokat vizsgáló módszerek eredményei tájékozódást nyújtanak a vírusok fizikai tulajdonságairól (hőinaktiválási pont, hígíthatósági határ, in vitro eltarthatóság, eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten, ill. alacsony hőmérséketen) (Horváth, 1972). A fizikai tulajdonságok meghatározásával kapcsolatos módszereket Horváth (1966a,b), Noordam (1973), Schmelzer et al. (1980) és Hill (1984) alapján az alábbiakban foglaljuk össze. Dijkstra és De Jager (1998) e könyv kéziratának leadása után megjelent vírusmódszertani könyvükben a fizikai tulajdonságok meghatározását részletesen tárgyalják.

Hőinaktiválási pont meghatározása

A vírusok hőmérséklettől függő tulajdonsága a vírusra jellemző érték. A hőinaktiválási pont az a legalacsonyabb hőmérséklet, amelyen a hígítatlan présnedv tízperces kezelés után már elveszti fertőzőképességét.

a. A hígítatlan dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvből 2–2 ml-t 6 db vékonyfalú kémcsőbe pipettázunk, s a kémcsöveket parafa- vagy vattadugóval lezárjuk.

b. Egy-egy kémcsövet 10–10 percre 95, 90, 80, 70 és 60 °C-os vízfürdőbe állítunk, és hagyunk egy kezeletlen kontrollt. A kezelés után a kapott növénynedvet tesztnövényekre (pl. Nicotiana glutinosa) visszük át. Az inokulációt követően a keletkezett tünetek alapján megállapítható a vírus hőinaktiválási pontja, amely a dohány mozaik vírus esetében 90 és 95 °C között van.

Hígíthatósági határ meghatározása

A vírustartalmú növényi nedv fokozatos hígításával fokozatosan csökken a fertőzőképesség is. A hígíthatóság határa az a legnagyobb hígíthatósági érték, amelynél még kimutatható a fertőzőképesség.

a. A kísérlethez 8 db kémcső szükséges, amelyekből hétbe 9–9 ml vizet pipettázunk. A nyolcadik kémcsőbe 2 ml hígítatlan vírustartalmú szövetnedvet teszünk.

b. A hígítatlan szövetnedvből kiveszünk 1ml-t, ezt belerakjuk a következő kémcsőbe, majd ebből is kiveszünk 1ml-t és a következő kémcsőbe pipettázzuk. Ezt a műveletet addig folytatjuk, amíg az utolsó kémcsőhöz nem érünk. Így 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7 töménységű hígítási sorozatot kapunk.

c. Az így kapott oldatokkal lokális tesztnövényeket (Nicotiana glutinosa) inokulálunk, s a kifejlődött léziók alapján megállapítható a vírus szövetnedvének hígítási végpontja. A dohány mozaik vírus esetében ez 10 –6 és 10–7 között van.

In vitro eltarthatóság meghatározása

A fertőzött növényi szövetnedv szobahőmérsékleten tartva fokozatosan elveszti fertőzőképességét. A virionok stabilitását az in vitro eltarthatóság határával órákban, napokban vagy hetekben fejezzük ki.

a. Uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun leveleiből 25 g-ot dörzsmozsárban homogenálunk, majd a kapott növénynedvből 2–2 ml-t 7 db kémcsőbe



töltünk.

b. A kémcsöveket gumi- vagy vattadugóval lezárjuk, és szobahőmérsékleten, kb. 20 °C-on 0, 4, 8, 24, 48, 72 és 96 órát hagyjuk. Egyes vírusok esetében az in vitro eltarthatóság hosszabb is lehet.

c. A tárolási idő letelte után a kezelt növénynedvekkel tesztnövényeket inokulálunk, majd ellenőrizzük a fertőzőképesség csökkenését. Az uborka mozaik vírus a 72 órás, szobahőmérsékleten való tárolás után elveszti fertőzőképességét, tehát in vitro a kevésbé stabil vírusok közé tartozik.

Eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten

A vírusok inaktiválódásának vagy in vitro eltarthatóságának egyik, gyakorlati szempontból is lényeges kérdése, hogy mennyire viselik el a kiszáradás körülményeit.

a. Az uborka mozaik vírussal szisztemikusan fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun növényeket 20–22 °C-os szobahőmérsékleten felfüggesztve szárítjuk.

b. Minden 24. órában néhány levelet leveszünk a növényről, dörzsmozsárban homogenáljuk, majd pár csepp vizet hozzáadva, az oldattal Nicotiana glutinosa növényeket inokulálunk.

c. A kísérletek szerint a vírus 12–50 napi szobahőmérsékleten való tárolás után is megtartja fertőzőképességét. Egyes vírusok (pl. a dohány mozaik vírus) több évig, évtizedig is megőrzik fertőzőképességüket a száraz levelekben.

Eltarthatóság kiszárítással alacsony hőmérsékleten (Horváth, 1976; Horváth és Besada, 1980)

a. Az előzőleg vírussal inokulált és megbetegedett növények leveleit a főér kivételével zsilettel vékony csíkokra vagdossuk és hűtőszekrényben 2 °C és 5 °C között a CaCl2-tól perforált alumíniumlemezzel elválasztva steril Petri-csészékben és steril szitaszöveten tároljuk.

b. A beszárított vírustartalmú levélszövetből bizonyos idő eltelte után (hetek, hónapok, évek) mintát veszünk és a mintával azonos mennyiségű foszfát-pufferrel (0,1 M, pH 7,0) szövetpépet készítünk.

c. Az inokulációra lehetőleg lokális léziókkal reagáló tesztnövényeket használunk, s megállapítjuk a vírus fertőzőképességét, ill. eltarthatóságát.

Megyjegyzés: Az egyes vírusok eltarthatósága (19 vírus 24 izolátum esetében) 10–87 hónap között váltakozhat (Horváth és Besada, 1980).

5. A vírusok differenciálása tesztnövényekkelA vírusok differenciálásának szükségessége már akkor felmerült, amikor a virológia még az ún. szimptomatológiai korszakát élte. A növényvírusok szeparálása kezdetben mégsem tünettani ismeretekre támaszkodott – amely bizonyára a gazda–vírus kapcsolatok nem kellő ismeretéből fakadt –, hanem kémiai-fizikai ismeretekből indult ki (Horváth, 1967). A korai növényvirológiai kutatások megállapították, hogy különböző vírusok, pl. az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) elválasztására a nátrium-permanganát, az ezüst-nitrát, a fenol és a higany-klorid alkalmas. A későbbi vizsgálatok a különböző vírusok eltérő pH-val és alkohollal szembeni toleranciájának a megállapítására és a vírus differenciálásban történő felhasználhatóságára vonatkoznak.

A vírusdifferenciálás során ún. virofil növényeket, relatív virofób növényeket és intermedier vírusgazdákat használunk (Horváth, 1976). A virofil növények, pl. a Chenopodium amaranticolor (50. ábra) vagy a Nicotiana clevelandii számos vírusra fogékonyak. Ismertek azonban olyan növények is, mint pl. a Crucianella stylosa és a Ruta graveolens, amelyek viszonylag kevés vírusra fogékonyak. Az intermedier vírusgazdák jelentősége abban áll, hogy az eredeti donor vírusgazdához viszonyítva kevesebb vírusinhibitort tartalmaznak, és ennélfogva lehetővé teszik a vírusizolálást olyan virofil gazdában, amelyben egyébként a gazda nagy inhibitortartalma miatt az izolálás alig, vagy egyáltalán nem lehetséges. Ilyen növények pl. a Cucumis sativus és a Gomphrena globosa. Újabb besorolások diagnosztizáló, vírust fenntartó, ill. felszaporító, tesztelő, tisztító, szűrő és áthidaló tesztnövényeket különböztetnek meg. Az ideális tesztnövény gyors és jellegzetes választ ad az inokuláció után, amely a leveleken keletkezett lokális léziókban nyilvánul meg (Horváth, 1993a, b).



50. ábra - A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és B: burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája [Horváth József szívessége folytán]

A differenciáló tesztnövények azért lényegesek a vírusdiagnosztika szempontjából, mivel egyesek érzékenyek a vírusokra, mások pedig nem fertőzhetők, ennélfogva tehát alkalmasak arra, hogy segítségükkel elkülönítsük őket egymástól. Egyesek lokális vagy szisztemikus tünetekkel, mások lokális és szisztemikus tünetekkel reagálnak a fertőzésre (14. táblázat).

14. táblázat - A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása differenciáló tesztnövényekkel (Horváth, 1993a után)

TesztnövényekVírusok1

TMV ToMV

Nicotiana sylvestris LS2 L

Chenopodium amaranticolor L LS

Chenopodium quinoa L LS

Lycopersicon esculentum S S

Plantago major L LS

1 TMV = dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); ToMV = paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus).

2 L = lokális tünetek; S = szisztemikus tünetek; LS = lokális és szisztemikus tünetek.

Johnson (1925) és Köhler (1933) szerint a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) a Datura stramonium növényen elkülöníthető, ugyanis a burgonya X-vírusra fogékony, a burgonya Y-vírusra pedig extrém rezisztens (immunis). A Chenopodium fajok kiválóan alkalmasak bizonyos vírusok és vírustörzsek elkülönítésére. Horváth (1969c) megállapította, hogy a burgonya X-vírus a Chenopodium murale-n lokális léziókat okoz, míg a burgonya Y-vírus nem mutat tüneteket. A Chenopodium amaranticolor és a



Plantago major alkalmas két tobamovirus, a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) és a paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) elkülönítésére (vö.: 14. táblázat). A Chenopodium quinoa gazdája az arabis mozaik vírusnak (arabis mosaic nepovirus), és alkalmas arra, hogy a vírus egyes dísznövényeken előforduló törzseit a tünetek alapján szétválassza. A vírus rózsáról származó izolátuma kicsi, szisztemikus érközötti léziókat okoz a tesztnövényen, míg a tulipánról származó izolátum lokális nekrotikus tüneteket és csúcsnekrózist okoz (Thomas, 1983). A Nicotiana sylvestris szintén alkalmas vírusok szétválasztására. A paradicsom mozaik vírus csak lokális tüneteket, a dohány mozaik vírus viszont lokális és szisztemikus tüneteket mutat a tesztnövényen (14. táblázat). A Physalis minima tesztnövény segítségével szétválaszthatjuk az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) a bab közönséges mozaik vírustól (bean common mosaic potyvirus) és a bab sárga mozaik vírustól (bean yellow mosaic potyvirus), amelyek sok esetben együtt lépnek fel. A uborka mozaik vírus jól látható tüneteket mutat a Physalis minima növényen, a bab közönséges mozaik vírussal és a bab sárga mozaik vírussal való inokuláció után pedig tünetmentes marad a tesztnövény. Ma már ismertek olyan gazdanövények, amelyek nemcsak az individuális vírusfajok, hanem víruscsoportok identifikálására és elkülönítésére is alkalmasak (Horváth, 1993c).

6. A vírusok fenntartása tesztnövényekenA növényvírusok élő növényen való fenntartásának napjaink virológiai kutatásaiban is nagy jelentősége van. Olyan gazdanövényekre van szükség, amelyek laboratóriumi körülmények között is könnyen felnevelhetők, jól inokulálhatók, és bennük az adott vírus megfelelően replikálódik.

A vírusok fenntartása tesztnövényeken a megfelelő gazdanövény kiválasztásával kezdődik. A tesztnövények magvainak vetése előtt el kell végezni a szükséges magkezelési eljárásokat (koptatás, áztatás, fertőtlenítés, hideg kezelés). A munka ütemezéséhez fontos tudni, hogy a vetést követően mikor kapunk inokulálható állapotban levő növényeket (15. táblázat).

15. táblázat - Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának optimális ideje (Noordam, 1973 után)

NövényfajA mag vetésétől

eltelt idő általábanFejlettségi állapot

Beta vulgaris 5 hét 5 lomblevél

Brassica pekinensis 3–4 hét 5 lomblevél

Celosia argentea 4 hét 6 lomblevél

Chenopodium amaranticolor 2 hónap 6 lomblevél

Chenopodium quinoa 2 hónap 6 lomblevél

Cucumis sativus 10 nap szikleveles állapot

Datura stramonium 5–8 hét 1–2 lomblevél

Dianthus barbatus 6–7 hét 3 pár lomblevél

Dianthus caryophyllus 6–7 hét 3 pár lomblevél

Gomphrena globosa 10 hét 2–4 pár lomblevél

Lycopersicon esculentum 3–4 hét 2–3 lomblevél



Nicotiana glutinosa 6 hét 3–4 lomblevél

Nicotiana rustica 5 hét 3–4 lomblevél

Nicotiana tabacum cv. Samsun 5 hét 3–4 lomblevél

Petunia hybrida 5 hét 3–4 lomblevél

Phaseolus vulgaris 10 nap 2 primer lomblevél

A növény fejlettségi stádiuma az inokuláció szempontjából rendkívül fontos. A töknek (Cucurbita pepo) pl. a sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) az első két lomblevelét inokuláljuk, mert az idősebb levelek nem fogékonyak a vírusfertőzésre. A Chenopodium amaranticolor kifejlett lomblevelei a legalkalmasabbak e célra.

A tesztnövények fertőzés előtti sötétben tartása általában fokozza azok érzékenységét, s ugyanaz igaz a 36 °C-os vagy annál magasabb hőmérsékletre is. Több gazdanövény szövetnedve általában inhibitort (gátlóanyagot) tartalmaz, amely a vírusátvitelt akadályozza vagy meggátolja. Ezért a vírust tartalmazó növényi nedvet 1:10 arányban vízzel kell hígítani és 0,01 M-os foszfát-pufferrel pH 7-re beállítani. Az inokuláció előtt a növényre karborundumport szórunk, majd a vírust tartalmazó növényi nedvet finoman rádörzsöljük a tesztnövény levelére. Ezt követően az általános növényápolási munkákat (öntözés, árnyékolás, növényvédelem) kell elvégezni a következő passzálásig.

Az egyes vírusok fenntartására más és más tesztnövényeket használnak (16. táblázat). Újabban, a számítógépek használatának általános elterjedésével, előtérbe került a vírusok és víruscsaládok nevének rövidítése mellett a tesztnövények botanikai nevének (nemzetségnév, fajnév, fajtanév) és családnevének rövidítése, ill. annak nemzetközileg is elfogadott használata (Horváth, 1993a, b). Pl.: a Nicotiana tabacum cv. Xanthi fajta jelölését (NIOTA XAN SOL) a következőképpen kell értelmezni: NIO a Nicotiana nemzetség rövidítése, a TA a tabacum fajnévre utal, a XAN a fajta nevét jelenti, a SOL rövidítés pedig a Solanaceae család nevének rövidítése (16. táblázat).

16. táblázat - Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben

Vírus neve Gazdanövény és kódja1

Bab közönséges mozaik vírus

(bean common mosaic potyvirus)

Phaseolus vulgáris (PHSVX LÉG),

Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)

Beléndek mozaik vírus

(henbane mosaic potyvirus)

Chenopodium amaranticolor (CHEGI CHE),

Datura stramonium (DATST SOL),

Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTAXAN SOL)

Burgonya M-vírus (potato M carlavirus)

Lycopersicon esculentum (LYPES SOL)

Burgonya S-vírus (potato S carlavirus)

Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)

Burgonya X- vírus (potato üpotexvirus)

Datura stramonium (DAST SOL),



Gomphrena globosa (GOMGL AMA)

Burgonya Y- vírus (potato Y potyvirus)

Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA XAN SOL)


(tobacco ringspot nepovirus)



Dohány mozaik vírus

(tobacco mosaic tobamovirus)

Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),

Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA SAM SOL)

Karfiol mozaik vírus

(cauliflower mosaic caulimovirus)

Brassica campestris (BRSRA CRU)

Lucerna mozaik vírus

(alfalfa mosaic alfamovirus)

Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),

Nicotiana benthamiana (NIOBE SOL),


Melandrium sárgafoltosság vírus (Melandrium yellow fleck bromovirus)

Gomphrena globosa (GOMGL AMA),

Melandrium album (MELAL CÁR)

Paradicsom mozaik vírus

(tomato mosaic tobamovirus)

Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA SAM SOL)

Retek mozaik vírus

(radish mosaic comovirus)

Brassica campestris (BRARA CRU)

Répa mozaik vírus (beet mosaic potyvirus)

Spinacia oleracea (SPQOL CHE)

Rozsnok mozaik vírus

(brome mosaic bromovirus)

Hordeum vulgare (HORVX GRA)

Tarlórépa sárga mozaik vírus

(turnip yellow mosaic tymovirus)


Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),

Brassica rapa (BRSRA CRU)

Uborka mozaik vírus

(cucumber mosaic cucumovirus)

Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL),

Nicotiana megalosiphon (NIOSU SOL)

Zeller mozaik vírus (celery mosaic potyvirus)

Ammi május (ANIMAUMB)



1 Anövények kódja megtalálható Horváth (1993b) dolgozatában.

7. GazdanövénykörökEgyes növények általában érzékenyek, mások ellenállók (immunisak) a vírusok fertőzésére. A vírusfertőzésekre fogékony gazdanövények csaknem minden növénycsaládban megtalálhatók. Horváth (1993a) által a vírus–gazda kapcsolatok szempontjából fontosnak tartott nemzetségek az alábbiak: Amaranthus, Capsicum, Chenopodium, Cucumis, Cucurbita, Gomphrena, Lycium, Nicotiana, Phaseolus, Pisum, Physalis, Solanum, Tetragonia, Vigna. A biotesztek során a legszélesebb körben alkalmazott gazdanövények a felhasználás gyakoriságának sorrendjében a következők: Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranticolor, Nicotiana clevelandii, Phaseolus vulgaris, Nicotiana glutinosa, Gomphrena globosa, Cucumis sativus, Datura stramonium, Pisum sativum, Nicotiana tabacum, Chenopodium murale, Tetragonia expansa, Nicotiana tabacum cv. White Burley, Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc, Vigna sinensis.

A könyv korlátozott terjedelme miatt nem tudunk kitérni valamennyi gazdakör jellemzésére, így csak a tesztnövényekkel végzett virológiai vizsgálatok során példaként a leggyakrabban használt Chenopodium fajokat részletezzük. A Chenopodium fajok és a vírusok között 123 gazda–vírus kapcsolatot (99 lokális, valamint 24 lokális és szisztemikus) határoztak meg (Horváth, 1986). A Chenopodium fajok közül leggyakrabban az alábbiakat használják: C. album, C. amaranticolor, C. ambrosioides, C. capitatum, C. foetidum, C. foliosum, C. hybrida, C. murale, C. quinoa. Edwardson és Christie (1991) szerint a Potyvirus nemzetségből 141 vírus kapcsolódik a Chenopodiaceae családhoz, amelyből 68 vírus patogén a C. amaranticolor, ill. C. quinoa növényekre. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) egyike azoknak a fűféléken előforduló vírusoknak, amely lokális léziókat idéz elő a C. amaranticolor, a C. quinoa és a C. album növényeken. Ugyancsak e három növény a gazdája a lucerna mozaik vírusnak (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Vannak természetesen olyan vírusok is, amelyek nem fertőzik meg a Chenopodium fajokat, ilyen pl. a lucerna látens vírus (alfalfa latent carlavirus). A Chenopodium quinoa és a C. amaranticolor kevesebb inhibitort tartalmaznak, ezért igen jelentős vírusgazdák. Érzékeny indikátorai a fás szárú növények vírusainak, alacsonyabb víruskoncentráció esetén is alkalmasak a vírusok kimutatására. A Chenopodium quinoa a fonál alakú vírusok, a C. amaranticolor a poliéder alakú vírusok meghatározó tesztnövényei. Mindkét növény jól használható a rutinteszteléseknél és a dísznövényvírusok diagnosztizálásánál. A Chenopodium murale és a C. album fontos gazdanövénye a paradicsom bronzfoltosság vírusnak (tomato spotted wilt tospovirus). Thomas (1983) 47 dísznövényvírust tesztelt, amelyek közül 19-nek volt a Chenopodium quinoa a gazdája és 12-nek a C. amaranticolor. Megemlítjük, hogy az utóbbi években a Nicotiana benthamiana a legjelentősebb vírusdiagnosztikai tesztnövényként vált ismertté. Horváth (1993d) adatai szerint a nevezett növény 24 víruscsoportba (-nemzetségbe) tartozó 203 vírussal szemben fogékony.

8. A fás szárú növények virológiai ellenőrzéseA fás szárú növények (szőlő, gyümölcs) gazdasági jelentősége igen nagy. A vírus és fitoplazma eredetű betegségek a gyümölcstermesztést és szőlőtermesztést súlyosan veszélyeztetik (Németh, 1979, 1986; Lehoczky, 1992). Az ellenük való védekezés egyetlen módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása, ill. használata (Kiss, 1998).

A fás szárú növények virológiai tesztelése és vírusmentesítése eltér a lágy szárú növények vizsgálatától, ezért ezzel külön fejezetben foglalkozunk (Lehoczky és Beczner, 1980; Lehoczky, 1981; Németh és Kölber, 1998; Lázár, 1998; Voigt és Kállay, 1998).

8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszereA vírusok és más oltással átvihető fertőző kórokozók (viroidok, fitoplazmák) a szőlő termesztett fajtáinak jelentős mértékű – az egyes vírusoktól és a fertőzöttség mértékétől függően évenként 10–80%-os – leromlását okozzák (Lehoczky, 1992; Lázár, 1998). A termesztés számos területén jelentkezhetnek a vírusbetegségek gazdasági következményei, amelyek a fokozatos tőkeleromlásban és -elhalásban, a hozam csökkenésében, a minőség gyengülésében, a tőkék produktív időszakának megrövidülésében, az oltványkészítés eredményességének csökkenésében, a szaporítóanyag gyökeresedőképességének romlásában, a beteg tőkék környezeti tényezőkkel szembeni ellenálló képességének csökkenésében nyilvánulnak meg.

A szőlőtermesztő államok, így hazánk is, kidolgozta a szőlő növény-egészségügyi vizsgálatának programját, amely tartalmazza a szőlő virológiai szűrését (ellenőrzését) is (51. ábra).



51. ábra - A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán]

8.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése

A tesztelésre kijelölt tőkék előszűrését mechanikai vírusátvitellel lágy szárú tesztnövényeken kell elvégezni (Lázár, 1996). Ez a tevékenység egész évben végezhető, amennyiben a nyári időszakban az üvegház hőmérséklete nem haladja meg a 25 °C-ot. A téli időszakban vizsgálatba vont fajta, ill. klón ellenőrzése hajtatott dugványainak leveleiből történik. Az április–május hónapban (virágzásig) a szabadban fakadó tőkék hajtáscsúcsi (vitorla alatti 3–4. levél), ill. később a hónalj levelei a legalkalmasabbak a vizsgálatokra.

A tesztelés menete

a. A levélminta felületi fertőtlenítése 2%-os NaOH-val és folyóvizes öblítéssel.

b. A minta homogenizálása grammonként 3 ml 0,067 M-os foszfát-puffer (pH 7,2) és 3%-os polietilén-glikol (PEG 6000) hozzáadásával.

c. A lágy szárú tesztnövények (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Cucumis sativus cv. Delicatess, Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. glutinosa, N. tabacum cv. Samsun, Phaseolus vulgaris cv. Beautiful) inokulálása, majd leöblítése vízzel.

d. A tünetek folyamatos értékelése.



Megjegyzés: a fás szárú növényekben előforduló inhibítorok (gátlóanyagok, amelyek megnehezítik vagy megakadályozzák a vírusátvitelt) semlegesítésére ajánlott a koffein (1–3% w/v), a tojásalbumin (0,3–1,0% w/v), a nikotin (1–2% w/v) és a 0,01 M, foszfát-puffer pH 7,0 (Dijkstra és De Jager, 1998).

8.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése

A szőlő fás szárú növényeken történő tesztelése lehetőséget ad a fertőzöttség vagy a vírusmentesség megállapítására. E tesztelési módszer alapja az egyes szőlőfajták (indikátorok) fokozott érzékenysége, ami jól látható elváltozásokban (levéldeformáció, mozaik, törpe növés) nyilvánul meg. A szőlőfajták virológiai ellenőrzéséhez a tesztelésre kerülő fajták tőkéit a törzsültetvények vizuális szelekciójával jelölik ki. A szelekciót két alkalommal, június elején-közepén (virágzás) és szeptember közepén-végén (érés) kell végezni.

A szőlő vírusbetegségeinek kimutatásához 9 indikátorfajtát (17. táblázat) használnak 5 ismétlésben. A vizsgálatba vont tőke vesszőiből az összehasonlító ellenőrzéshez 5 db kontrollnövény beállítása is szükséges.

17. táblázat - A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal kimutatható szőlőpatogén vírusok1

Fás szárú indikátorok Vírusok

Siegfriedrebe (FS 4 201-39) Szőlő fertőző leromlás vírus

Arabis mozaik vírus

Paradicsom fekete gyűrűs

Szőlő bulgáriai látens vírus

Vitis rupestris cv. St. George Paradicsom fekete gyűrűs vírus

Szőlő fertőző leromlás vírus

Szőlő foltosság vírus



Vitis vinifera cv. Pinot noir

(és egyéb vörös fajták)

Szőlő levélsodródás vírus

Szőlő króm mozaik vírus


Paradicsom fekete gyűrűs vírus Lucerna mozaik vírus

Vitis vinifera cv. Chardonnay Szőlő fertőző leromlás vírus

Lucerna mozaik vírus


Vitis riparia cv. Glorie de Monpellier

Szőlő érmenti mozaik vírus

Szőlő bulgáriai látens vírus

Vitis vinifera cv. Jubileum 75 Szőlő króm mozaik vírus



Szőlő vonalas mintázottság vírus

Kober 5BB (V. berlandieri x V. riparia)


LN 33 (Couderc 1613 x V. berlandieri)

Szőlő parakérgűség vírus

Szőlő enációs vírus


110 R (V. rupestris x V. berlandieri)

Szőlő érnekrózis víru

1 A szőlővírusokkal kapcsolatos hazai információk Martelli és Lehoczky (1968), Lehoczky és Beczner (1980), Beczner és Lehoczky (1981), Lehoczky et al. (1984), Lehoczky és Burgyán (1986) és Lehoczky (1992) munkáiban találhatók meg. Köszönettel tartozom néhány adat rendelkezésre bocsátásáért dr. Kobza Sándornak (Budapest).

A tesztelés menete

a. A tesztelésre kerülő tőkék és az indikátorfajták beérett vesszőinek begyűjtése.

b. A vesszők előkészítése 24 órás, vízben történő áztatással, majd 5 órán keresztül 0,5%-os Solvochin Extra-kezeléssel.

c. Téli tárolás hűtőtárolóban, 1–2 °C-on.

d. Tavasszal az indikátorfajták vesszőinek előkészítése: 2 rügyes dugványok vágása, alsó rügy „kivakítása”. Az alsó rügy alatt 0,5–1 cm-rel kell „megtalpalni” a vesszőt, a felső rügy felett 2–3 cm-es csonkot kell hagyni.

e. A kétrügyes (indikátor) dugványvessző felső, ép rügye alatt 0,5–1 cm-re egy 12–15 mm hosszú metszlapot kell készíteni.

f. A vizsgálandó tőke vesszőjéről az indikátorfajtával megegyező pozícióból történő, az arról leválasztott metszlappal azonos méretű szövetpajzs készítése.

g. A szövetpajzs rugalmas fóliával történő rögzítése az indikátor dugványvesszőhöz.

h. A dugványok gyökereztető közegbe (fóliakonténerbe) helyezése.

i. A dugványok hajtatása üvegházban, növényasztalon, talpmeleg biztosításával.

j. A 4–6 lombleveles, begyökeresedett dugványok kiültetése szabadföldi iskolába.

k. A kísérlet értékelése két éven keresztül, évente két alkalommal.

8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszereA vírusmentes szaporítóanyag az alapja a versenyképes, jó minőségű termés előállításának. A fejlett gyümölcstermesztő országokban – köztük hazánkban is – már több évtizede kialakítottak olyan központosított, zárt vírusmentesítési rendszereket, ahol teljes koordinációban történik a fajtaminősítés, a törzskönyvezés, a növény-egészségügyi ellenőrzés, amelyekhez szervesen kapcsolódik az előállított vírusmentes faiskolai termék igazolvánnyal való ellátása.

8.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése

A vizsgálatokhoz lágy szárú indikátornövényeket használnak. A vírusátvitel során a mechanikai módszert



alkalmazzák.

Az almatermésűek lágy szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996)

a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus (mozaik és NEPO vírusok), Chenopodium quinoa [alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus); alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus) és NEPO vírusok] és a Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus).

b. A vizsgálatokat március–április hónapokban kell elvégezni.

c. A tesztelésnél használt növényi rész a virágszirom, amelyhez 1 : 5 arányban stabilizáló puffer szükséges. Az almástermésűek esetében kétféle puffert használnak: 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO 4 + 1% koffein; 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 + 0,1% Na2SO3 + 0,1% aszkorbinsav + 1% ni-kotin.

d. A virágszirmokat porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében kell szétdörzsölni, és a kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.

e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6-6 ismétlés beállítása szükséges.

f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os, vektormentes üvegházban kell elhelyezni.

A csonthéjasok lágy szárú biológiai tesztelése

a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus [Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus); szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a NEPO vírusok), Chenopodium quinoa (Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus, alma klorotikus levélfoltosság vírus és a NEPO vírusok), és Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus)].

b. A vizsgálatokat február végétől április végéig kell elvégezni.

c. A tesztelés során használt növényi részhez (meghajtatott rügyek levelei) 1: 3 arányban stabilizáló puffert kell adni. A csonthéjasok esetében használt puffer a következő: 1/5 M foszfát-puffer (pH 7,5) és 0,005 M DIECA + 0,001 M N,N-difeniltiokarbamid + 0,03 M koffein 1:1:1 arányban.

d. A meghajtatott rügyek leveleit porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében szét kell dörzsölni és a kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.

e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6–6 ismétlés beállítása szükséges.

f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os vektormentes növényházba kell elhelyezni.

8.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése

Az oltás nyugalmi állapotban lévő, cserepes és jól meggyökeresedett alanyokra történik. A vírusátvitel történhet kettős oltással, amely akkor használatos, ha az alany, a vizsgált fa és az indikátor azonos fajhoz tartoznak. A kéregátültetést akkor kell használni, ha az alany és a vizsgált fa nem azonos fajhoz tartozik. A gyökéroltást a Golden Delicious indikátoron, az alma seprűsödés fitoplazma (apple proliferation phytoplasma) kimutatására használják. E módszer kivitelezése a következő: a vizsgálandó növényekből márciusban szedett gyökérdarabokat rá kell oltani almamagoncgyökerekre kézben oltással, nyelves párosítással, majd ezt követően az alanyokat be kell oltani a Golden Delicious indikátorral.

Az üvegházi fás szárú biológiai tesztelés során használt indikátorokat, a kimutatható kórokozókat és a kísérlet körülményeit a 18. táblázat tartalmazza.

18. táblázat - Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996 után)1



Indikátornövény Kimutatható kórokozók Ismétlés Hőmérséklet °C Időtartam

Alma

Malus pumila

R 12740-7A

Spy 227


(apple chlorotic leaf spot trichovirus)

Alma 227 epinasztia és pusztulás vírus

(apple spy 227 epinasty and decline virus)

Alma törzsgöndörödés vírus

(apple stem pitting virus)

3

3

18–20

22–26

4 hét

3 hónap

Virginia Crab Alma törzsgöndörödés vírus


Alma törzsbarázdáltság vírus

(apple stem grooving capillovirus)

3 22–26 4 hét

Golden Delicious

Pyronia veitchii

Alma seprűsödés fitoplazma

(apple proliferation phytoplasma)

Alma fapuhulás fitoplazma

(apple rubbery wood phytoplasma)


(apple chlorotic leaf spot capillovirus)

4

3

18–20

22

4 hónap

10 hét

Körte

Pyronia veitchii

Pyrus calleriana

Körte érsárgulás vírus

(pear vein yellows virus)

Alma 227 epinasztia és fapusztulás vírus

(apple 227 spy epinasty and decline virus)

Alma fapuhulás fitoplazma

(apple rubbery wood phytoplasma)

Körte érsárgulás vírus

(pear vein yellows virus)

3

3

23

22

10 hét

4 hét

Cseresznye és meggy Prunus persica

GF 305, vagy


(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)

Szilva törpülés vírus

5

3

20

22

3 hónap

3 hónap



Elberta magonc

Prunus tomentosa

IR 473/1, vagy

IR 474/1

(prune dwarf ilarvirus)


(strawberry latent ringspot nepovirus)

Alma szárgöndörödés vírus








Szilva, kajszi és őszibarack

Prunus persica

GF 305 vagy

Elberta

Prunus tomentosa

IR 473/1, vagy

IR 474/1








(strawberry latent ringspot nepovirus)

Alma szárgöndörödés vírus


Szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)







5

3

20

22

3 hónap

3 hónap

1 Köszönettel tartozom dr. V. Németh Máriának (Budapest) kritikai észrevételeiért.



8.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése

A gyümölcsfák virológiai tesztelésénél alkalmazott átviteli módszer megválasztását befolyásolja az indikátornövény típusa, az indikátor és az alany faja, a kimutatandó vírus és az, hogy a kórokozó a fa melyik részében helyezkedik el, valamint a környezeti körülmények.

Átviteli módszerek

a. Egyszerű szemzés abban az esetben alkalmazható, ha az indikátorként használt alany és a vizsgálandó fa azonos fajhoz tartoznak, vagy legalábbis szemzésnél kompatibilisek (pl. GF 305 – Myrobalan). A Shirofugen-tesztnél inkompatibilis partnerek esetében is használható az egyszerű szemzés, mert a vírusátvitelhez elegendő a Prunus serrulata var. Shirofugen-indikátor és a vizsgálandó fáról származó szem 3–4 napos öszszetapadása.

b. Kettős szemzést akkor alkalmazunk, ha az indikátor valamely nemes faj vagy vad faj. Ebben az esetben egymás fölé kell szemezni a vizsgált fáról és az indikátorról származó szemeket, majd a következő évben a kihajtás után a vizsgálandó fáról származó szemből kihajtó hajtást (az alsót) vissza kell csípni.

c. A kettős oltás ugyanazon az elven alapszik, mint a kettős szemzés. Az indikátort kézben kell oltani a megvizsgálandó fa oltóvessző darabjára, majd ez a kettős kombináció kerül egy vírusmentes alanyra. Ez a módszer szabadföldön csak módszertani kísérleteknél használatos, elterjedtebb az üvegházi fás szárú teszteléseknél.

d. Kéregátültetés akkor használandó, ha az alany és a vizsgált növény különböző fajhoz tartoznak. Legkevesebb 3-4 nyelv alakú, szem nélküli kéregpajzsot kell készíteni, és azt az alanyon megfelelően bevágott, lehetőleg spirálisan elhelyezett bemetszésekbe kell helyezni. Ha nem az alany az indikátor, akkor a kéregpajzsocskák fölé kell szemezni az indikátort.

e. Indikátorkombinációk alkalmazása esetén a fa teszteléséhez szükséges növényszámot csökkentik. E módszer használata esetén a kettős szemzéssel kapott egyéves indikátorsuhángokra augusztusban 60–70 cm magasságban újabb indikátorszem kerül.

Szabadföldi gyorstesztek (Shirofugen-teszt, GF 305-teszt, GF 31-teszt)

Ezek a módszerek a csonthéjas gyümölcsfajok gazdaságilag legsúlyosabb vírusbetegségeinek kimutatására alkalmasak, és aránylag rövidebb időt igénybevevő, nagy tömegben végezhető vizsgálatok.

Shirofugen-teszt

A Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) és a szilva törpülés vírus (Prune dwarf ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 6 hét. A terület kiválasztásánál izolációs távolságra nincs szükség, mert a Shirofugen-növények vektorokkal nem fertőződnek, a fák nem virágoznak, ezért pollenfertőzés sem lehetséges. A lúgos kémhatású talajok nem felelnek meg a neveléshez.

Az alanyok közül a Mazzard F 12/1 a legmegfelelőbb. A növények térállása lehetőleg 1,5 × 1 m legyen. Az alanyok szemzése júliusban–augusztusban történik, a gyökérnyakba. Az egyéves suháng korig a növények faiskolai nevelése a szokásos körülmények között történik. Az 1 éves Shirofugen-suhángot tavasszal 80 cm magasságban vissza kell vágni, majd a legfelső 3–4 rügy kivételével a törzset fel kell tisztítani. A vizsgálandó fákról 5–5 szem kerül egymás fölé 2–3 cm távolságra a lelevelezett hajtásokra. Egy hajtás 1–3 fa vizsgálatára elegendő. A szemzés ideje július vége, augusztus eleje. A kiértékelést a szemzés után 6 héttel kell elvégezni, a szem körüli mézgásodás, majd a szemzés felvágása után a szem körüli szövetnekrózis alapján (Németh, 1979).

GF 305-teszt

A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus), a szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület kiválasztásánál fontos az 500 m-es izolációs távolság betartása (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítéshez vírusmentes mag vagy magoncalany szükséges. Kívánatos térállás: 0,8 × 0,5 m. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A GF 305 magoncokra az átvitel augusztus hónapban egyszerű szemzéssel vagy kéregátültetéssel történik. Egy fa vizsgálatához 5 növényt kell felhasználni. A tüneteket az alanyon fejlődött hajtások mutatják, amelyek kiértékelését 15–20 cm-es és 30–40 cm-es hajtáshosszúságnál kell elvégezni.



GF 31-teszt

A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület kiválasztásánál 500 m-es izolációs távolság betartása fontos (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítés fás dugványból előállított vírusmentes GF 31 alanyokkal, 0,8 × 0,5 m-es térállásban történik. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A magoncokra az átvitel egyszerű szemzéssel, augusztus hónapban történik. A beszemezett növényeket a következő év tavaszán a szemzés felett 15–20 cm-re vissza kell vágni. Kihajtás után a szemzés alatti részt le kell „vadalni”, a szemzést vissza kell csípni, a szemzés felett két, ellenkező oldalon elhelyezkedő hajtást meg kell hagyni, a többi hajtást pedig el kell távolítani. Augusztus közepén a meghagyott két hajtást le kell levelezni. A bonitálás augusztus végén, szeptember elején történik addig, amíg a hajtások kérge még zöld színű. Vírusfertőzés esetén a hajtások alsó részén, a kérgen rozsdabarna parásodás, repedezettség látható.

Szabadföldi főteszt

Jelenlegi ismereteink szerint ez a gyümölcstermő növények legmegbízhatóbb biotesztelési módszere. A központi törzsültetvények kontrollvizsgálatainál alkalmazzák, mert idő-, munka- és területigényes. A tesztelés időtartama, a telepítés és szemzés évét is beleszámítva, 4 év. A bonitálások az almástermésűeknél júniustól szeptember közepéig tartanak. A csonthéjas indikátornövényeknél, a tünetek értékelése május eleje és június vége között 3 alkalommal történik.

9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzéseA szántóföldi növények vírusfertőzöttsége az utóbbi években jelentősen megnövekedett. Ennek következtében az egyes növényeken fellépő mennyiségi és minőségi veszteségek igen jelentősekké váltak (Pennazio et al., 1996). Ez indokolja azt, hogy a fás szárú növényeken kívül a szántóföldi növények vírusmentesítése is képezze a növényvédelem szerves részét. Ezt támasztják alá azok a szántóföldi növényfajták állami elismerését, fenntartását, vetőmag-előállítását és -forgalmazását, virológiai ellenőrzését és vírusmentességi igazolási rendszerét szabályozó rendeletek [FM 88/1997. (XI. 28.)], a növényvédelemről szóló 1988. évi 2. törvényerejű rendelet, valamint ennek végrehajtásáról szóló rendelet [FM, 89/1997. (XI. 28.)], amelyek egyértelműen megszabják azokat a feladatokat, amelyek az egészséges, vírusmentes növények termesztését segítik elő.

A szántóföldi növények közötti jelentős biológiai és termesztési eltérések miatt az ellenőrzési rendszerek is kisebb-nagyobb mértékben eltérnek egymástól. Több növény esetében az ellenőrzési rendszerek még nincsenek kidolgozva, vagy csak részben valósultak meg. Az egyes növényekkel (gabonafélék, burgonya, kukorica, hüvelyes növények, szálas takarmánynövények) kapcsolatos vírusmentesítési rendszerekről Pocsai (1998) közleménye adott áttekintő tájékoztatást. Az alábbiakban – e munkát felhasználva – áttekintést adunk a modellnövényként szereplő burgonyára vonatkozó vírusmentesítési rendszer lényeges szempontjairól.

9.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjaiA burgonya azok közé a növények közé tartozik, amelynek affinitása a különböző vírusokkal szemben igen nagy (Horváth, 1988, 1990, 1995; Horváth és Kazinczi, 1999). A vegetatív szaporítószervekkel és levéltetvekkel terjedő vírusok elleni védekezés legfontosabb módja az egészséges (vírusmentes) vetőburgonya előállítása és használata. A burgonya egészségi állapotának fenntartására az alábbi rendszabályokat kell betartani:

a. Burgonya-vetőgumó csak olyan területen szaporítható, amelyen a szaporítást megelőző négy évben burgonyát nem termeltek.

b. Az elővetemények között dohány (Nicotiana tabacum), paprika (Capsicum annuum), paradicsom (Lycopersicon esculentum), tojásgyümölcs (Solanum melongena), cukorrépa (Beta vulgaris), kukorica (Zea mays) és lucerna (Medicago sativa) nem szerepelhet.

c. A szaporítótáblán belül elhelyezett, különböző fajtájú és szaporítási fokozatú, valamint különböző helyekről (vetőgumó-előállító hely) származó, fémzárolt vetőgumótáblák (parcellák) között 1,5 m izolációs távolságot kell hagyni.

d. A vetőgumótábla széleitől 200 m távolságon belül Solanaceae családba tartozó növényeket (pl. burgonya, paradicsom, dohány, paprika) nem lehet termelni.



e. A vetőgumót előállító szaporítótáblában a levéltetűvektorok megjelenését ellenőrizni kell, és veszélyes populációszám elérése esetén inszekticidekkel szükséges ellenük védekezni.

f. Szártalanításos módszerrel történő vetőgumó-szaporítás esetén – amelyet általában vetőgumó-előhajtatás és korai ültetés előz meg – a burgonya fejlődését agrotechnikai módszerekkel és megfelelő tápanyag-utánpótlással elő kell segíteni, hogy a levéltetű-vektorok tömeges rajzásának idejére a szártalanítás elvégezhető legyen.

9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere

A burgonya vírusfertőződésének ellenőrzésénél az alábbiakra kell tekintettel lenni:

a. A vetőgumó szaporítótábláinak szimptomatológiai (tünettani) ellenőrzését a tünetek megjelenésekor (virágzáskor) és a burgonyagumók fiziológiai beérésekor kell elvégezni.

b. A mintavételi terek száma a vetőburgonya-tábla nagyságától függ; 20 ha-ig 4 mintateret, és ezt követően további 10 ha-onként 2 mintaterületet kell kijelölni.

c. Az egyes mintaterek nagyságát 200 burgonyanövény tenyészterülete adja meg.

d. A vizsgált (ellenőrzött) mintatereken fel kell jegyezni a tüneteket (tünettani csoportonként), és meg kell határozni a beteg növények előfordulását %-ban. Ezt jegyzőkönyvben rögzíteni kell.

e. A tünettani vizsgálatokat laboratóriumi vizsgálatokkal kell kiegészíteni; ehhez a szabadföldről vizsgálati mintákat kell begyűjteni.

f. Az ELISA-féle szerológiai, laboratóriumi vizsgálatot ki kell terjeszteni a következő vírusokra: burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus). Ezekhez a vizsgálatokhoz 30 ha-onként 250 növény- (levél- vagy gumó-) mintát kell megvizsgálni.

g. A vírusfertőzöttség mértéke a szuperelit szaporítási fokozatnál a 0,2%-ot, az elit szaporítási fokozatnál a 0,5%-ot, az utántermesztésnél a 2,0%-ot nem haladhatja meg. Ha ezek a határértékek nagyobbak, akkor a burgonyatáblát a továbbszaporításból ki kell zárni.

h. A vírusfertőzöttség mértéke alapján alkalmasnak minősített vetőgumó-szaporító területek termését gumó-vírusvizsgálattal is ellenőrizni kell.

Nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a burgonya és általában a növények vírusellenőrzési és vírusmentesítési módszere alapvetően a) diagnosztikai és biotechnológiai technikák, valamint b) vírusmentesítési technikák együttes alkalmazásából áll. A vírusdiagnosztikai technikák (pl. szimptomatológia, biotesztek, szerológiai és elektronmikroszkópiai vizsgálatok, molekuláris technikák, nukleinsav-hibridizáció, elektroforezis, PCR-technika stb.) a vírusfertőzöttség pontos meghatározását, a vírusmentesítési technikák (hőterápia, kemoterápia, merisztématenyésztés stb.) pedig a vírusok eltávolítását eredményezik. Ezeket a módszereket a könyv egyes fejezeteiben részletesen ismertetjük.


9. fejezet - Elektronmikroszkópos módszerekA növényvírusok a gazdanövényben olyan szöveti elváltozásokat idézhetnek elő, amelyeket elektronmikroszkóp segítségével megfigyelhetünk. Egy új vírus leírása ma már elképzelhetetlen elektronmikroszkópos vizsgálatok nélkül. A növényvírusok rendszerét összefoglaló tanulmányok, kézikönyvek is tartalmaznak elektronmikroszkópos felvételeket minden csoport egy-egy fontosabb, jellegzetes képviselőjéről (Schmidt, 1980a; Milne, 1984, 1993; Francki et al., 1985). A vírusfertőzés hatására bekövetkezett kóros változások a növény élettani működésében mindig valamilyen szerkezeti eltéréshez kapcsolhatók. A beteg növény anyagcsere-folyamataira vonatkozó mérések és az ultrastrukturális vizsgálatok eredményeinek együttes elemzése teljesebb képet adhat a fertőzés hatásmechanizmusáról. Ezért az elektronmikroszkópos kutatómunkán alapuló adatok nem önállóan, hanem többnyire összetett vizsgálatok részeredményeként értékelhetők. A növényvírusok osztályozása alakjuk, méretük, felépítésük, szerológiai jellemzőik, genetikai szerkezetük és újabban replikációs stratégiájuk szerint történik. Ezért a növényvirológia számára új, még le nem írt vírusok rendszerbe sorolása részben elektronmikroszkópiai technikákon alapul. Ahhoz, hogy ilyen jellegű vizsgálatokat végezzünk, tisztában kell lennünk a növényvírusok morfológiájával, amelyet csak elektronmikroszkóppal tudunk megállapítani. A virionok nukleinsavból (vírusgenom) és az azt körülvevő fehérjeburokból állnak. A fehérjeburok (kapszid) köpenyfehérje-alegységekből (kapszomer) épül fel. Ezek elrendeződése szabja meg a virion szimmetriáját, illetve alakját, amely lehet izometrikus, ikozaéder (más szóval szférikus, mivel kisebb felbontású felvételeken gömbölyűnek tűnnek) és anizometrikus szimmetriájú – ezen belül megkülönböztetünk merev pálcika, hajlékony fonál formát és bacilus alakot (52. ábra). A legkisebb, izometrikus virion átmérője 12 nm körüli, míg a leghosszabb, fonál alakú vírusok hoszszúsága körülbelül 2000 nm.

52. ábra - Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán]

1. Negatív festéses módszerAz eljárás lényege, hogy a fertőzött növényből származó, virionokat tartalmazó nedvet vagy tisztított víruspreparátumot nagy molekulatömegű nehézfémsókkal „megfestjük”. Az erősen elektronszóró nehézfémionok a hátteret alkotó hártyához kötődnek aspecifikusan, azokat a virionok nem adszorbeálják. Így az elektronmikroszkóp képernyőjén a virionok a sötét háttérből világosan rajzolódnak ki (mivel önmagukban nem elég elektronszóróak). A módszer neve is innen származik, ugyanis az így előállított kép hasonlít egy fénykép negatívjára (Hitchborn és Hills, 1965).

A festés menete

A vizsgálathoz legjobb olyan 400 mesh mintahordozó fémrácsot (gridet) használni, amelyet előzőleg szénréteggel vagy műanyag hártyával (Formvar) vonunk be, és ezt követően szenezünk. A víruspreparátum és a nehézfémsó-oldat egyesítése és feljuttatása a rácsra kétféle módon történhet: 1. a preparátumot felcseppentjük a


Elektronmikroszkópos módszerek

gridre, és a hártyához kötődés után adjuk hozzá a festéket; 2. a mintát a festékkel már a rácsra történő felvitel előtt egyenlő arányban összekeverjük. Ha a minta és a festékoldat a rácson van, a felesleg eltávolítása után hagyjuk rászáradni. A virionok egyenletesebb eloszlása érdekében a minta felvihető spray vagy sűrített levegővel működő szórópisztoly segítségével, apró cseppek formájában is. Ennek a módszernek az az előnye, hogy mennyiségi meghatározásra is alkalmas lehet. A virionok ugyanis többnyire a cseppek szélén gyűlnek össze, és a cseppek elég kicsik ahhoz, hogy a teljes kerületük áttekinthető legyen.

A festéshez használt oldatok

a. Nátrium- vagy kálium-foszfo-volframát 2%-os vizes oldata, melynek kémhatását pH 7,0-re állítjuk be Na-, illetve KOH-dal. Bizonyos vírusok szerkezetét károsítja ez az oldat [pl. a Cucumo, a Gemini, Ilarvirus nemzetség tagjait: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)]. Feltehetően a kapszidot stabilizáló nukleinsav-fehérje között létrejött kölcsönhatások lazításával vagy felbontásával, illetve a Tospovirus nemzetség és Rhabdoviridae család tagjainál a külső burok sérülésével, ezért ilyen esetben a víruspreparátumot tartalmazó gridet a festés előtt szobahőmérsékleten, öt percig, 1%-os glutáraldehid-oldattal kell kezelni.

b. Uranil-acetát 2,0 vagy 0,1%-os vizes oldata, a pH-t nem állítjuk be. (Az uranil-acetát gyengén radioaktív, kezelése fokozott elővigyázatosságot igényel. Fényérzékenysége miatt sötét üvegben tárolandó.) A volframáthoz képest kontrasztosabb, részletgazdagabb kép nyerhető a finomszerkezet jobb megtartásának köszönhetően, azonban 5,5 pH-érték felett kicsapódik. Gondot okozhat, ha a növényi nedv vagy a foszfát-ionok koncentrációja nem megfelelő. A kristályképződés elkerülése érdekében ügyelni kell arra, hogy a mintát hordozó rácson ne legyen semmiféle szennyeződés.

c. Uranil-formiát vizes oldata az uranil-acetátnál leírt hígításban; elsősorban helikális szerkezetű vírusok negatív festésére használják.

d. Ammónium-molibdát 2%-os vizes oldata, a közeg pH-ját 4–9 közé kell beállítani ammóniával vagy sósavval. Bár a kontraszt szegényes, előnye, hogy az oldat közvetlenül összekeverhető a víruskészítménnyel, és a labilis vírusok szerkezetét is jól megtartja.

A felsoroltakon kívül még számtalan nehézfémsó választható vírusok negatív festésére; a fentiekben a teljesség igénye nélkül a legelterjedtebb, legszélesebb körben használt anyagokat soroltuk fel.

Általános tudnivalók

Mint minden in vitro vizsgálati módszer alkalmazása esetén, így az elektronmikroszkópos munka során is keletkezhetnek műtermékek, ezért külön figyelmet kell fordítanunk ezek kiküszöbölésére, vagy ha nem lehetséges, számolnunk kell velük az eredmények értékelésekor. Például a közeg összetételétől és fizikai-kémiai tulajdonságaitól függően változik a pálcika alakú vírusok virionjainak hossza, mint ahogyan ez a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) esetében jól ismert. Zavaró lehet, ha szennyezés kerül a gridre; ilyenkor vízzel vagy semleges 0,01–0,05 M-os foszfát-pufferral mossuk le a nemkívánatos anyagokat (a mosást 0,1 M CaCl2 oldattal is végezhetjük, akár a festés előtt). Uranil-acetát használatakor előfordul, hogy a nehézfémsó nem a hártyához kötődik, nem jön létre elektronszóró háttérréteg. Ez olyan, mintha pozitív képet kapnánk, és ezért a virionok átmérője is kisebb, közel fele a normális módon kapott értéknek. Ilyenkor a hártyázott rács elektrosztatikus feltöltődését kell megszüntetnünk (például nagyfeszültségű kisülést hozunk létre levegőn, 0,1 torr nyomáson). Ha másképp nem sikerül, akkor 0,01–0,1% marha- (bovin-) szérumalbumin hozzáadásával a festéket rögzíteni tudjuk a hártyához. Gyakran találkozunk olyan növényi mintával, amelyben kevert fertőzés van, tehát a mintánk két, három, vagy akár több vírus virionjait is tartalmazza.

A virionok között versengés lép fel a tartóhártya szabad kötőhelyeiért, és mivel a vírus szerkezetétől, fizikai-kémiai sajátságaitól függően a kialakuló kötőerők nem azonos erősségűek, nem feltétlenül a koncentrációjuknak megfelelő eloszlás alakul ki a rácson; sőt, el is veszíthetjük egy részüket úgy, hogy végül csak egyetlen vírus marad a preparátumon. Ha olyan vírussal akarunk dolgozni, melynek negatív festésére vonatkozóan nincs saját tapasztalatunk, sem irodalmi adatok nem állnak rendelkezésünkre, akkor problémát okozhat a megfelelő nehézfémsó-oldat megválasztása. Különböző festékek és eljárások kipróbálásával, az oldatok pH-jának vagy koncentrációjának megváltoztatásával találhatjuk meg az adott vírus esetében legmegfelelőbb vagy az elfogadható módszert.

Brandes-féle „levél-bemártásos” (leaf-dip) módszer



Ezt az eljárást a vírus(ok) gyors kimutatására dolgozták ki, mert közvetlenül az élő növényből, mindennemű tisztítási folyamat nélkül, igen egyszerűen megállapítható, hogy milyen típusú virionok vannak a gazdaszervezet sejtjeiben (Brandes, 1964; Ball, 1971; Schmidt, 1980b). A frissen elvágott levelet vagy epidermisznyúzatot keresztülhúzzuk egy tárgylemezre cseppentett vízcseppen, így a sérült sejtek tartalma részben a csepp belsejébe, részben annak felületére kerül. Egy hártyázott rácsot a víz felületébe érintünk, hogy a sejtnedv rátapadjon, majd negatív festést alkalmazunk. A minta felvételét úgy is végezhetjük, hogy a levél metszett felszínét közvetlenül a griden lévő festékcseppen húzzuk keresztül, majd szárítjuk.

A vírusok méretének meghatározása

Szférikus (izometrikus) vírusok átlagos átmérőjének számítása általában nem okoz gondot, az átlagtól való eltérések nem jelentősek. Hitchborn és Hills (1965) például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) átmérőjének átlagértékét 27,0 nm-nek állapította meg úgy, hogy a negatívan festett mintában 50 viriont vizsgáltak 400 000 szeres nagyítás mellett.

A pálcika és a fonál alakú vírusok hosszúságában ezzel szemben nagy különbségek lehetnek, bár a virionok többségének mérete szűk határok közé esik. Azt az átlagértéket, amely ebben az intervallumban található, Bode és Köhler (1952) elnevezte a vírus normál hosszának. Később a normál hossz meghatározását módosították (Brandes és Wetter, 1959; Brandes, 1964; Schmidt, 1980b), és javasolták a fő maximum átlagát. A mérések eredményét hisztogramokon lehet ábrázolni: a vízszintes tengelyen a virionok hosszát veszik fel (nm-ben), a függőleges tengelyen a megfelelő hosszhoz tartozó virionok számát, vagyis az eloszlási gyakoriságot (53. ábra). Gibbs et al. (1963) úgy pontosították a számításokat, hogy az egyes hosszúságkategóriákat megjelenítő oszlopokat a két szomszédos oszloppal összegezték (folyamatos összegzés, „running sums of three groups”). Így az egymás mellett lévő oszlopok magasságában (vagyis az egyes csoportokba tartozó virionok számában) kapott nagy eltérésekben rejlő hiba lehetőségét csökkenteni tudták. A mérést, illetve számolást végezhetjük a mintáról készült fényképen, vonalzót használva. A negatívokon szereplő nagyításértékeket pontosan kell kalibrálni, a mikroszkóp nagyítását időről időre ellenőrizni kell.

53. ábra - BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. : normál⇓ hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]

A virionok hosszúságát (a hajlékony, fonál alakú vírusokat kivéve) a negatívokon is meg lehet mérni sztereomikroszkóp segítségével, átvilágító fénnyel, 0,6 vagy 1,0 × objektívvel. Az okulárlencsébe épített mikrométerskálát szintén kalibrálni kell. A mérést addig folytatjuk, amíg legalább 100 viriont találunk, amelyek hosszúsága a főmaximumsávba esik.

2. Immuno-elektronmikroszkópos módszerAz elektronmikroszkópos vizsgálatok kombinálása szerológiai meghatározással lehetővé teszi a vírusok pontos azonosítását, illetve rendszertani helyük megállapítását, rokonsági körük felderítését. Az immunosorbent electron microscopy (ISEM) technikát akkor alkalmazzuk, ha a víruskészítményben olyan alacsony a virionok koncentrációja, hogy hagyományos negatív festéssel nem detektálhatóak (Milne és Lesemann, 1984; Dijkstra és De Jager, 1998). A módszer előnye a fajlagosság és az érzékenység növelése. A rácson lévő szenezett hártyára



antitesteket kötünk, majd inkubáljuk a vírustartalmú szuszpenzióban. Az antitestek megkötik az antigenikusan közelálló rokon vírusokat. A rácsterületre számított részecskeszám-növekedés a szerológiai reakció nélküli mintákhoz képest 2000–10 000-szeres is lehet.

Az antitest és az antiszérum hígítása

A negatív festéshez hasonlóan 400 mesh, Formvar vagy Parlodion hártyával bevont, szenezett rácsot használunk. Az antiszérum-, vagy antitest-készítmény hígítása általában 1:1000, illetve 1:5000 arányban ajánlott. Kisebb hígítás (pl. 1:100) esetében az antigén (vagyis a virionok) kötődése gátolt az IgG és az egyéb szérumfehérjék között kialakuló, a kötőhelyekért folyó versengés miatt. Az antiszérum és egyben a víruskészítmény hígítására többféle puffer alkalmas. Sok esetben jó a 0,1 M-os, semleges foszfát-puffer, de a 6,0–8,0 közé eső pH-optimumot be kell állítanunk. 0,05 M-os Tris-HCl-oldat (pH 7,2–7,5), vagy az ELISA-tesztben is használt 9,6 pH-jú nátrium-karbonát-puffer szintén megfelelő lehet. Az antiszérummal történő inkubációhoz öt perc elegendő. Erősebb kötődést érünk el, ha az inkubációt nem szobahőmérsékleten, hanem 37 °C-on végezzük; ez a negatív festék jobb eloszlását is elősegíti. A vírusok kivonásához, a gazda–vírus kapcsolat típusától függően, különböző puffereket használhatunk. Bizonyos növényeknél nyers kivonat készítésekor szükség lehet különböző védőanyagok hozzáadására. Ezzel részben elkerüljük a növény gátló, vagy roncsoló komponenseinek károsító hatását. Kínai kelből (Brassica pekinensis) tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) kinyerésekor a szövetnedvhez 0,1 M EDTA-t, szilvából vagy kajszibarackból történő szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kivonása esetében 2,5%-ban nikotint kell tennünk. Egyéb vírusoknál még 2%-os polivinil-pirrolidon (PVP) vagy 1%-os polietilén-glikol (PEG) hozzáadása is lehetséges.

A kontrasztosítás

A kontrasztosításnak három alapvető módja van: 1. árnyékolás platina/palládiummal; 2. pozitív festés etanolos uranil-acetáttal és 3. negatív festés, amely az előbbi kettővel szemben olyan előnyös tulajdonságokkal rendelkezik, hogy a növényi vírusdiagnosztikában már szinte kizárólag a negatív festést alkalmazzák. Az aspecifikus reakciók kizárása és a tiszta háttér biztosítása érdekében a befejező fázist kivéve (kontrasztosítás) minden egyes lépés után mossuk át a rácsot a hígításnál használt pufferral vagy desztillált vízzel. Ez úgy történhet, hogy valamilyen tiszta felületre (például parafilmdarabka, Petri-csésze) kevés folyadékot (puffer vagy desztillált víz) cseppentünk, majd óvatosan belemerítjük vagy ráúsztatjuk a gridet. Végül a negatív festéket felvisszük a rácsra, rászárítjuk, és ezzel hozzáfoghatunk a minta elektronmikroszkópos vizsgálatához.

3. Dekorációs módszerAz eljárás megegyezik az ISEM-technikával, azzal a különbséggel, hogy a negatív festés előtt az antitestekkel a hártyához adszorbeált virionokat antitest-készítménnyel inkubáljuk. Ez a másodlagos jelölés (dekoráció, „díszítés”) tovább növeli a kimutatás érzékenységét (az ELISA-hoz hasonló mértékben). A virionok élesebben rajzolódnak ki, mivel méretük is növekszik a hozzájuk kötődő antitestek által. Az ELISA-teszttel ellentétben nem kell konjugált antitestet használni, az eredmény közvetlenül értékelhető. Kis mennyiségű hígított antiszérum (5–10 µl) és víruskészítmény (1 µl) elegendő. A szenynyező növényi anyagok és a nem specifikus reakciók nem zavaróak, mivel a virionoktól morfológiailag jól megkülönböztethetőek. Az ELISA-teszttel történő összehasonlításból azonban nem szabad azt a következtetést levonni, hogy ez a módszer teljes mértékben felválthatja az ELISA-módszert, mert például magas költségigénye miatt a dekoráció és általában az elektronmikroszkópos eljárások nem alkalmasak nagyszámú minta feldolgozására. A vírus azonosításán kívül ez az eljárás módot ad az antiszérum titerének megállapítására, a vírusok közötti szerológiai rokonság meghatározására is (Dijkstra és De Jager, 1998).

A dekorációs módszer lépései

a. Az antiszérum, ill. antitest hígítása, a mindenkori antiszérum titerértékétől függően 1:1000 vagy 1:5000-szeresére, 0,1 M pH 7,0 foszfát-pufferrel.

b. Hártyázott rács inkubálása az antiszérumot tartalmazó oldatban 5 percig, 37 °C-on.

c. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.

d. Inkubáció a víruspreparátummal 15 percig szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on.

e. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.



f. Az antiszérumot 1:10 vagy 1:100 hígításban használjuk. Inkubáció 15 percig szobahőmérsékleten.

g. A grid mosása desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.

h. Negatív festés.

4. Kicsapásos (precipitációs) módszerA víruskészítményt összekeverjük az antiszérummal és inkubáljuk. Az immunreakció lejátszódása után az összecsapódott anyagot felvesszük a gridre és negatív festékkel kontrasztosítjuk.

5. Finomszerkezeti vizsgálatok módszereiA növényi szövet tartósításával, megtartásával a virionokat sejten belüli környezetükben tanulmányozhatjuk (Kay, 1961). Az elektronmikroszkóp felbontóképességének köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet kapunk a fertőzés okozta tünetekről. A gyantába ágyazott mintából bármikor készíthetünk metszeteket (Martelli és Russo, 1984), amelyeket szintén tárolhatunk és később újra vizsgálhatunk. Citokémiai módszerek alkalmazásával nyomon követhetjük egyes anyagcseretermékek sejten belüli elhelyezkedését, vagy megállapíthatjuk adott képletek (például zárványok) kémiai természetét.

A növényi szövetminta megválasztása

A vizsgálati anyag megválasztásánál tekintetbe kell vennünk, hogy szisztemikusan vagy lokálisan fertőzött növénnyel dolgozunk-e, meg kell különböztetnünk a tünetes és a (látszólag) tünetmentes, illetve a különböző szintről vett leveleket. Figyelnünk kell arra, hogy a minták a lehetőségekhez mérten eléggé homogének legyenek, tehát például sötétzöld-világoszöld mozaik esetén egy mintába vagy csak a sötét, vagy csak a világos területből kerüljön a szövet. Érdemes a növényt mintavétel előtt sötétben tartani, hogy a kloroplasztiszok keményítőtartalmát csökkentsük (ilyenkor az egészséges kontrollnövényt is sötétben kell tartani).

Fixálás

Célja, hogy a szöveten, sejten belüli alkotóelemeket a mintavételkor fennálló állapotukban rögzítsük és a sejt szerkezetét a legkevésbé drasztikus beavatkozással megőrizzük. A fixáló oldat és a fixálás körülményeinek meghatározásakor több tényezőt kell számításba venni. Problémát okozhat a kristályos aggregátumok, zárványok jelenléte, ilyen esetben speciális fixálást kell alkalmazni.

A fixálók úgy működnek, hogy bizonyos molekulák között keresztkötéseket hoznak létre. Ehhez először be kell jutniuk a sejt belsejébe, ami kémiai természetüktől függően gyorsan vagy lassabban történhet. Minél később alakulnak ki a kereszthidak, annál nagyobb a valószínűsége a műtermék keletkezésének. Ezért először előfixálást kell végezni egy aldehid típusú anyaggal, amely aránylag gyorsan bejut a sejtbe, és a fehérjemolekulák között, illetve a molekulákon belül képez keresztkötéseket.

A következő aldehideket használják általánosan fixálóként: glutáraldehid, formaldehid, akrolein, glutáraldehid és formaldehid keveréke (Karnovsky-féle fixáló). A glutáraldehid előnye, hogy gyorsan létrehozza a keresztkötéseket, jól megőrzi a citoplazma és a sejtalkotók szerkezetét, viszont lassabban hatol be a szövetekbe. A fixálást szobahőmérsékleten, 3–6%-os glutáraldehid koncentrációjú, 0,05–0,1 M foszfát- vagy kakodilát-pufferben, semleges pH-n végezzük. A nagy tisztaságú oldatot felhasználás előtt tartsuk hidegen és sötétben. A formaldehid reverzíbilis metilén-hidakat alakít ki. Önmagában kizárólag enzimatikus vizsgálatokra használják, glutáraldehiddel keverve kitűnő fixálószer.

A következő lépés az utófixálás, amihez leggyakrabban ozmium-tetroxidot használnak. Ez az oldat lassabban jut be a sejtekbe, és ott a telítetlen lipidmolekulák között alkot keresztkötéseket, így a membránok láthatóvá tételéhez feltétlenül szükséges. 0,02–0,1 M (pH 7) kakodilát-, foszfát-, Veronal- vagy PIPES-NaOH-pufferban oldjuk, 1–2%-ban. Az ozmium-tetroxidot – mivel gőzei erősen roncsolóak mind belélegezve, mind bőrön keresztül – tartsuk elszívófülke alatt. Bizonyos esetekben kálium-permanganáttal végzik az utófixálást (2–5%-os vizes oldatban), ez azonban erélyes oxidálószer, ezért a citoplazmában található virionokat és riboszómákat is tönkreteszi.

A legáltalánosabban használt pufferek a következők: 0,1 M kakodilát-HCl, 0,2 M Na-foszfát, Millonig-féle Na-dihidrogén-foszfát. Ozmium-tetroxid oldásához használhatunk Veronal-acetátot és 0,05 vagy 0,1 M kakodilát-



vagy foszfát-puffert.

A fixálás úgy történik, hogy a levéllemezből (vagy az adott növényi szervből) borotvapengével 0,5–1 cm2-es darabokat vágunk, majd egy csepp fixálóoldatban még kisebb, 1 × 1 × 1,5 mm-es mintákat készítünk. Fiolába tesszük őket, és annyi fixáló oldatot öntünk hozzá, hogy a szövetdarabkák belemerüljenek. Ha nem süllyednek le a minták, a szövetek közötti térben lévő levegőt vízlégszivattyú segítségével távolíthatjuk el. Az aldehides előfixálás 1–3 óráig tart szobahőmérsékleten. Ezután az aldehidmaradványokat pufferral mossuk ki a mintákból Pasteur-pipettával. Ozmium-tetroxiddal utófixálás következik 1–3 óra hosszat szobahőmérsékleten, vagy 4 °C-on egy éjszakán át. Desztillált vizes mosással (2–3-szor 1 órán keresztül) eltávolítjuk a maradék OsO4-ot.

Dehidratálás

A gyantába ágyazás előtt a szövetekből ki kell vonnunk a víztartalmat és az oldatot szerves oldószerre kell cserélni, mert a gyanták általában vízben nem oldódnak. A víztelenítés fokozatosan növekvő koncentrációjú aceton- (epoxi gyanták) vagy etanol- és propilén-oxid-oldat sorozattal történhet. Minden oldatban 10, de maximum 30 percig állhat a minta (máskülönben a lipidek kioldódnának). Etanolos dehidratálás során a koncentrációsorozat: 1 × 30 perc 20, 40, 60, 95%-os és 2 × 30 perc abszolút alkoholban.

Gyantába ágyazás

Metszet készítésére a puha növényi szövetek kevésbé alkalmasak, különösen, ha ultravékony metszeteket akarunk nyerni. A gyanták jobb tartást adnak az anyagnak és meghosszabbítják a minta eltarthatóságát. Kémiai természetüket tekintve a gyanták polimer vegyületek, beágyazásra is különböző típusúak alkalmasak. Három fő csoportjuk az epoxi-, a poliészter- és az akril-gyanták. Szobahőmérsékleten folyékonyak, magasabb hőmérsékleten polimerizálódnak. A folyékony gyantakomponensek összemérésekor, illetve formába öntésekor vigyázzunk, hogy az a bőrünkre ne kerüljön, mert ezek általában rákkeltő anyagok. Az epoxi típusú gyanták közé tartoznak az Epon, az Araldit és a kettő keveréke. Ebben az esetben etanolos víztelenítés után 2x30 percre propilén-oxidba tesszük a mintákat, majd propilén-oxid:gyanta 3:1 arányú keverékébe helyezzük. Végül friss, tiszta gyantát öntünk a formákba, amelyekbe megfelelő orientációval beletesszük a szövetdarabkákat. Kemencében az előírt hőfokon és ideig (30–40 °C-on, egy éjszakán át) hagyjuk megkeményedni (polimerizálódni) az anyagunkat. Manapság sok laboratóriumban szívesebben használnak ún. Spurr gyantát (vinil-ciklohexén-dioxid), mert egyszerűbb vele dolgozni, víztelenítésre pedig egyaránt alkalmazhatunk etanolt vagy acetont. Magasabb hőmérsékleten polimerizálódik (kb. 70 °C-on, minimum 8 órán át). Akril-gyanta például a glikol-metakrilát, amely vízben oldódó vegyület, ezért a víztelenítést nem szerves oldószerrel végezzük, hanem közvetlenül víz és gyanta keverékének sorozatával.

A minta metszése

Ahhoz, hogy a gyantába ágyazott mintáinkból (amelyet blokknak neveznek) megfelelő méretű és vastagságú metszeteket tudjunk készíteni, mikroszkóp alatt egy csonkagúla vagy piramis alakot kell kifaragnunk. Ennek célja részben az, hogy eltávolítsuk a fölösleges gyantát a minta fölött (és körül), másrészt ez az alakzat biztosítja, hogy jól metsződjön a minta és ne törjön le. A piramis oldalait határozott mozdulattal alakítsuk ki, hogy a sík felületek simák legyenek. A piramis csúcsát metsszük le úgy, hogy felülnézetből négyszög alakú lapot kapjunk. Ez a sík felület merőlegesen essen a mintánk síkjára vagy a levéldarabka lemezére, ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni. Ezzel a felülettel párhuzamosan fogjuk metszeni a blokkot. Ezt a műveletet érdemes gondosan elvégeznünk, mert nagyon sok múlik azon, hogy hogyan képeztük ki a vágási felületet, amely nem lehet nagyobb 0,5 × 0,5 mm-nél.

A következő lépés a minta metszése ultramikrotómmal. A készülékbe gyémánt- vagy üvegkést fogunk be, adott szögbe állítjuk. Ha nem áll rendelkezésünkre gyémántkés, vagy nem rendelkezünk elég gyakorlattal, üvegkést magunk is készíthetünk késtörő műszerrel. A késhez ún. „csónakot” kell készíteni, amelyet a késhez ragasztunk és vízzel töltünk fel. A kész metszetek a csónakban lévő víz felületére úsznak rá. Jó esetben a metszetek sorban egymás után, szalagszerűen összekapcsolódva jönnek le a késről. A metszeteket összetereljük egy fogpiszkálóból vagy gyufaszálból és néhány szál ecsetszőrből készített eszközzel, majd felszedjük a gridre (egyszerűen belemerítjük a rácsot a vízfelületbe). Választhatunk 300–400 mesh hártyázatlan rácsot, vagy nagyobb rácsméretű, 200 mesh hártyázott (és szenezett) gridet. Ha sikerült a metszeteket a rácsra juttatni, szűrőpapírral finoman leitatjuk a vizet.

Festés (kontrasztosítás)

A biológiai anyagok jellemzője, hogy nem eléggé szórják az elektronokat, ezért az elektronmikroszkópban



kapott kép kontrasztszegény lesz. Különböző eljárásokkal megnövelhetjük az elektronszóródást, s ezáltal a kontrasztot. Nehézfémionokat tartalmazó oldattal megfestve a mintánkat nagyon jó eredményt érhetünk el. Kontrasztosítást végezhetünk a fixálás során, víztelenítés előtt vagy alatt, illetve a beágyazás és metszés után, magukon a metszeteken uranil-acetát, uranil-nitrát vagy egyéb urániumsók oldatával. Víztelenítés előtt 15 percre 0,5–2,0%-os vizes oldatba tesszük a mintákat. Víztelenítés alatt a 70%-os etanol- vagy acetonoldathoz 1%-ban uranil-acetátot adunk, vagy uranil-acetátra nézve telített oldatot készítünk, és 15 percig tartjuk benne a mintákat. A metszeteket úgy festjük, hogy vízben, vagy 50%-os etanolban telített uranil-acetát-oldatot készítünk, és 1 órát hagyjuk benne a mintákat. Metszetek esetében használhatunk ólomsókat is (ólom-citrát, -tartarát), de ezek oldatban hajlamosak a levegő CO2-tartalmával karbonátos csapadékot képezni. Leginkább bevált festési mód az uranil-acetát és ólom-citrát együttes alkalmazása, amit kettősfestésnek nevezünk.

A kettősfestés menete

a. 50%-os etanollal 2%-os uranil-acetát-oldatot készítünk.

b. A grideket a metszeteket hordozó felületükkel fölfelé 10 percre vagy 1 órára az oldatba helyezzük.

c. 20–30 csepp 50%-os etanollal mossuk, majd száraz szűrőpapírra tesszük.

d. Néhány darab szilárd NaOH-pasztillát Petri-csészébe rakunk, lefedjük hidrofób anyaggal.

e. A hidrofób anyagra ólom-citrátot csepegtetünk.

f. A cseppekre 2 percre ráúsztatjuk a grideket.

g. CO2-mentes desztillált vízzel mossuk.

h. A grideket szűrőpapíron szárítjuk.

6. Citokémiai vizsgálatokA fertőzött sejtek bizonyos alkotóelemeinek kémiai természetét vagy a sejten belüli elhelyezkedését enzimatikus emésztés vagy kelátok alkalmazása révén határozhatjuk meg. Enzimes kezelést a vizsgálat céljától függően vagy a gyantába ágyazás előtt, vagy azt követően végezhetünk. Az első esetben az aldehides fixálás után történik az enzim hozzáadása, ezután OsO4-os utófixálás, víztelenítés és beágyazás következik. A második esetben a beágyazást követi az enzim alkalmazása.

7. Immunokémiai vizsgálatokKonjugált immunoglobulinok használatával szerológiai reakción alapuló kimutatásokat elektronmikroszkópos vizsgálathoz előkészített ultravékony metszeteken is végezhetünk. Az immunoglobulinokhoz ferritin- vagy kolloidális aranyszemcséket kötnek (immunogold jelölés), amelyek eloszlása jelzi, hogy a kérdéses anyag hol fordul elő a sejtben.

Immunokémiai és citokémiai vizsgálatok végzésekor a gyantába ágyazáshoz jobb olyan gyantát használni, amely alacsony hőmérsékleten polimerizálódik (pl. LR Gold), mert így a sejtalkotók, az enzimek és a fehérjék működőképesek maradnak (Van Lent et al., 1990; Dijkstra és De Jager, 1998).


10. fejezet - A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezeteHa a fertőzés során a gazdanövény és a vírus között kölcsönhatás alakul ki, akkor a vírus bejut a növény sejtjeibe, és ott közvetlen vagy közvetett úton kóros elváltozásokat okoz. A vírusok – mint közismert – önálló szaporodásra képtelenek, a gazdaszervezet anyagait, illetve replikációs-transzlációs egységét parazitálják, s ezzel fölborítják a növény anyagcsere-folyamatainak egyensúlyát. A sejt működésében bekövetkező eltérések gyakran együttjárnak a szerkezet változásával, amit elektronmikroszkópos metszeteken tanulmányozhatunk. Ez azért is fontos, mert a fertőzés folyamatának megértéséhez tudnunk kell, hogy a vírusreplikáció a növény mely sejtalkotóiban történik (de Zoeten, 1976). A növényi szövetek, sejtek vizsgálata módot nyújt arra, hogy a vírus sejtbe jutásától a virionok összeépüléséig végbemenő változásokat lépésről lépésre nyomon kövessük. Másrészt e készítményeken vizsgálhatjuk a virionokat vagy a vírus eredetű képleteket, illetve ezek sejten belüli elhelyezkedését.

1. Sejtek és sejtalkotókVírusfertőzött növényeknél gyakori jelenség a sejtfal megvastagodása. Ennek oka a sejt fenil-propanoid anyagcsere-folyamatainak kóros megváltozása. A növény a mérgező vegyületek felhalmozódását úgy akadályozza meg, hogy a sejtfalban megkötött enzimjei segítségével átalakítja azokat ligninné vagy egyéb polimerekké, és ilyen formában a sejt anyagforgalmából kivonja azokat. Ezek az anyagok a sejtfalra rakódnak, ezáltal sejtfalvastagodást idéznek elő (Mc Mullen et al., 1977). A plazmodezmák szerkezete is módosulhat a fertőzés következtében. Például a plazmodezma-átmérő jelentős növekedése szerepet játszhat a virionok sejtről sejtre történő terjedésében (Davison, 1969). Dália mozaik vírussal (dahlia mosaic caulimovirus) fertőzött dálialevélben a virionokat tartalmazó plazmodezmák átmérője közel kétszerese volt az egészséges növény plazmodezmáinak (Kitajima és Lauritis, 1969). A mitokondriumok megnagyobbodását és a sejt egyes területein történő tömörülését, a kriszták fellazulását is észlelték (Matthews, 1980, 1981).

Számos gazda–vírus kapcsolatban kialakuló mikroszkopikus tünet a kloroplasztiszok rendellenessége: külső alakjuk eltérése, belső membránrendszerük felbomlása vagy a tilakoidok és gránumok számbeli változása (Mc Mullen et al., 1978). Ezek az eltérések attól függetlenül kiakulhatnak, hogy a vírus szaporodása a kloroplasztiszban megy végbe vagy sem. Nem zárult le a vita arról, hogy a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzéskor tapasztalt fotoszintetikus aktivitáscsökkenés közvetlen vagy közvetett gátlás következménye-e. Esau (1968) elektronmikroszkópos felvételein dohány mozaik vírussal fertőzött Nicotiana tabacum növények kloroplasztiszaiban vírusfelhalmozódás látható (54. ábra). Reinero és Beachy (1986, 1989) vírus-köpenyfehérjét mutattak ki a tilakoidokhoz kapcsolódva, és feltételezték, hogy ez a PSII (photosystem II) fehérjéihez kötődve közvetlenül gátolja azok működését. Így valószínűnek tűnt, hogy a vírusreplikáció vagy a virionok összeépülése itt történik. Ezzel szemben olyan mutáns vírusok, amelyek köpenyfehérjéje nem képes bejutni a kloroplasztiszba, ugyanolyan tüneteket okoztak, mint a vad típusú vírus (Lindbeck et al., 1991).

54. ábra - Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó szétnyomja a gránumokat, a felső halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR = gránum, V = vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968 után]


A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete

Nem ilyen ellentmondásos a helyzet a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzése esetében. A kloroplasztiszok szélén apró hólyagok lefűződését írták le. A hólyagocskák a két kloroplasztisz-borítómembrán betűrődésével keletkeznek, nyaki részük nyitott a citoplazma felé, tehát a tartalmuk kapcsolatban marad a citoplazmával. Részletes vizsgálatok alapján (Matthews, 1981) megállapították, hogy a sejtben lejátszódó események a következő sorrendben követik egymást: először megjelennek az említett apró hólyagocskák a kloroplasztisz borítómembránjainak belső felületén. Ezután a kloroplasztisz duzzadni kezd, keresztmetszetben kör alakot mutat. Egyre több hólyagocska fejlődik, ezek csoportokba tömörülnek, közelükben endoplazmatikus retikulummembránok képződnek a kloroplasztisz felőli oldalon, sima felszínnel; a citoplazma felé eső oldalukhoz riboszómák kapcsolódnak. Ezek a membránok egymással is összeköttetésben vannak, így egy hálózatot hoznak létre a kloroplasztisz körül. A következő szakaszban az endoplazmatikus retikulum hártyái eltűnnek; ezek a területek elektromikroszkópban elektronáteresztővé válnak. A kloroplasztiszok összecsapódnak, majd a közöttük lévő elektronáteresztő zónában virionok halmozódnak föl (55. ábra). Végül a levelek öregedésével (szeneszcencia) a citoplazma és a kloroplasztiszok vakuolizálódnak, szétesnek. Megállapították, hogy a vezikulumok a vírus-RNS szintézisével hozhatók összefüggésbe, vagyis a vírusreplikáció helye ebben a nemzetségben (Tymovirus) a kloroplasztisz. Árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) szisztemikus fertőzés esetében Lin és Langenberg (1985) igazolták a plasztiszok vírus-RNS-tartalmát. Egy olyan vírus–gazda kapcsolatban, mint a paradicsom bonzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) és Nicotiana benthamiana – amelyben a vírus nem a kloroplasztiszban replikálódik –, a fertőzési folyamat végére a plasztiszok szerkezete teljesen fölbomlik (Almási et al., 1996). Ezek az organellumok a fertőzés kezdeti szakaszában csak enyhe változást mutatnak, később duzzadttá válnak, tilakoid membránjaik fellazulnak, eltávolodnak egymástól, nagy keményítőszemcsék és lipidcseppek (ozmiofil globulusok) halmozódnak föl, végül szétesnek (56. ábra). Mohamed (1973) hólyagok (vezikulumok) keletkezését is megfigyelte, amelyeknek azonban nem a vírusreplikációban, hanem a kloroplasztisz fölbomlásában van szerepük (Matthews, 1980). Ezekkel a tünetekkel párhuzamosan a klorofillkoncentráció is csökken, sok más vírusfertőzéshez hasonlóan (Mohamed, 1973; Brakke et al., 1988).

55. ábra - A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött kínai kel (Brassica pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes széli vezikulumok (V) a kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két



kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli vezikulumok kinagyított képe. Nyilak jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét, amely a citoplazmába nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után]

56. ábra - A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus) fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott keményítőszemcsék (nyíllal jelölve) szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja megváltozott, a belső membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt kloroplasztiszban plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó szakaszában a külső burokkal rendelkező virionok az egész citoplazmában megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók egy közös membránban



Az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék és egyéb membránok vesznek részt a paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) virionjainak „érési” folyamatában. Ez a vírus, akár a Bunyaviridae család többi tagja, azért különleges a növényvírusok között, mert a vírusgenomot a köpenyfehérjén kívül még egy glükoprotein burok borítja. A virionok összeépülése bonyolult (Dubois-Dalcq et al., 1984); a külső burkot a különböző sejtalkotókon történő áthaladás során nyerik (Ie, 1971; Kitajima et al., 1992).

2. ZárványokA fertőzés során létrejött zárványokat (inclusions) elhelyezkedésük, felépítésük, illetve eredetük alapján csoportosíthatjuk. Vannak a citoplazmában található zárványok, és vannak olyanok, amelyek különböző sejtalkotókban (sejtmag, mitokondrium stb.) helyezkednek el. Szerkezetük és származásuk szerint virionokból vagy vírus eredetű képletekből és növényi eredetű összetevőkből állhatnak. Szabályos kristályos elrendeződést, kristályszerű vagy lazább amorf halmazt alkothatnak. A különböző vírusok létrehozhatnak hasonló belső vagy mikrotüneteket, ennek ellenére egyes zárványtípusok annyira egyedi jellegűek, hogy diagnosztikai célra is felhasználhatók. A zárványok finomszerkezete elektronmikroszkóppal vizsgálható, a szöveten belüli elhelyezkedésüket, gyakoriságukat fénymikroszkóppal lehet megfigyelni (Christie és Edwardson, 1977, 1986; Martelli és Russo, 1977; Edwardson et al., 1993; Dijkstra és De Jager, 1998).

2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványokA dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) által szisztemikusan fertőzött növények sejtjeinek citoplazmájában a virionok gyakran nagy területre kiterjedő aggregátumokat hoznak létre (Esau, 1968). A



szabályos kristályszerkezet úgy alakul ki, hogy a virionok szorosan egymás mellé és fölé rendeződnek, több rétegben hexagonális síkot alkotnak. Ezért ezeket a zárványokat sokszor hexagonális lemezekként említik (57. ábra). A kristályok metszete hatszögletű, négyzet vagy téglalap alakú lehet. A dohány mozaik vírus egyes törzsei és a Tobamovirus nemzetség egyéb tagjai esetében a zárványok nem egyenes síkokkal határoltak, hanem kör, ovális vagy szabálytalan alakúak. Ezeknél több lemez kerül egymás fölé, amelyekben a lemez síkjára merőlegesen, hexagonális rendszerben találhatók a virionok, egy vagy több rétegben. A lemezek behajolhatnak, keresztmetszetben koncentrikus köröket alkotnak. A vírus „aucuba” törzse olyan virionfelhalmozódást okoz, amelyben az egyes rétegek egy síkban fekszenek és a virionok rétegenként körülbelül 60°-os szöget zárnak be egymással. Ezek hosszú nyaláboknak vagy tű alakú képleteknek látszanak. A fertőzés előrehaladtával a szabályos kristályos szerkezet fellazulhat, ekkor a virionok kristályszerű zárványt képeznek.

57. ábra - Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika alakú virionok egymással párhuzamosan, sorokba rendeződve, számos réteget képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA = központi vakuólum, W = sejtfal [Esau, 1968 után]

2.2. Amorf citoplazmatikus zárványokA virionok (elsősorban a fertőzés korai szakaszában) amorf zárványokat is létrehozhatnak. A dohány mozaik vírussal szisztemikusan fertőzött dohánynövényben Esau (1968) X-testnek nevezte el ezeket a formákat, amelyek mátrixba ágyazott érett virionokat tartalmaznak (58. ábra). A mátrix, amely riboszómákat is tartalmaz, szemcsékből (granulumok), csövecskékből (tubulusok) és membránokból áll. Az érett virionok jelenléte a



citoplazmában a vírusösszeépülés folyamatára utal. Az X-testeket ezért viroplazma néven is említik.

58. ábra - Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a nyalábok egymással szöget bezárva rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA = üregek, V = virionok [Esau, 1968 után]

A karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) fertőzött tarlórépa sejtjeiben az amorf zárványokban az izometrikus virionokon kívül a vírus nem-szerkezeti géntermékét is kimutatták (Espinoza et al., 1991). A vírusgenomban kódolt fehérje a zárványok egy részében a levéltetű-átvitelért felelős. A zárványok másik részében más fehérje-összetevőket találtak, melyek valószínűleg a vírusreplikációban és az összeépülési folyamatban vesznek részt.

2.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványokA Potyviridae család tagjai egy egészen különleges zárvány képződését idézik elő a fertőzött növényekben. A zárványnak több típusa van, amely vírusra jellemző, és nem függ a gazda–parazita között kialakuló kölcsönhatás jellegétől. Ezért ez az elektronmikroszkópos tünet diagnosztikai jelentőségű. A zárvány típusa szerint négy alcsoportot különböztetünk meg. Az I. alcsoportba tartoznak azok a vírusok, amelyek csak lemezes zárványt, a II. alcsoportba, amelyek csak tekercseket hoznak létre, a III. alcsoport tagjai a tekercsek mellett rövid, lemezes aggregátumokat is képeznek, míg a IV. alcsoportban a tekercsek hosszú lemezekkel együtt fordulnak elő (Christie és Edwardson, 1977). Felépítésükben egy egyszerű, a vírusgenom által kódolt, nem-glükozilált protein vesz részt. Egy központi tubulusból és abból kiinduló öt–tizenöt visszahajló lemezből állnak. Keresztmetszetben forgókerékszerű (pinwheel) alakzatot mutatnak, hosszmetszetben a lemezek nyalábként tűnnek föl (59. ábra). A lemezek kiterítve négyszög vagy háromszög alakúak; az előbbiek hengeres, az utóbbiak kúpos zárványt alkotnak. Ha a lemezek egyenesek maradnak, akkor lemezes aggregátumról beszélünk, ha feltekerednek, akkor tekercsről.

59. ábra - Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes aggregátumok, P = plasztid (kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel) zárvány [Horváth József szívessége folytán]



A zárványoknak a fertőzési folyamatban betöltött szerepét sokan tanulmányozták és tanulmányozzák napjainkban is (Shukla et al., 1994). A hengeres zárványok a fertőzés első szakaszában a plazmalemma közelében képződnek és központi tubulusuk a plazmodezmán áthúzódik; később eltávolodnak a plazmalemmától, a sejt belseje felé kerülnek és a citoplazmában gyűlnek össze. Ezért valószínű, hogy a virionok sejtről sejtre történő terjedését segítik elő. Másrészt viszont a lemezek általában a durva felszínű endoplazmatikus retikulummal is szorosan kapcsolódnak (Huth et al., 1984). A zárványfehérje egyes aminosavszakaszai nukleotidkötő képességgel rendelkeznek, és az N-végi régiója helikáz-aktivitást mutat. Ezek a tulajdonságok, és az a tény, hogy a zárványokhoz virionok is kapcsolódnak, azt a feltételezést támasztják alá, hogy részt vesznek a vírusreplikációban és a virionok összeépülésében is (Ammar et al., 1994).

2.4. Kristályos sejtmagzárványA Potyviridae család egyes tagjai (elsősorban a II. alcsoportba tartozók) a gazdanövény sejtmagjában kristályos zárványok keletkezését váltják ki (60. ábra). Ezek eltérő alakúak: négyoldalú csonka piramis, bipiramidális rombusz, csonkagúla, kocka vagy tű alakúak (Shukla et al., 1994; Edwardson és Christie, 1991). Kimutatták bennük azt a vírus eredetű proteázt, amely a vírusgenomban kódolt poliprotein poszt-transzlációs feldarabolását végzi, és egy másik fehérjét is, az RNS-függő RNS-polimeráz enzimet is.

60. ábra - Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) fertőzött dohánylevél (Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a zárvány síkjára; B: a metszet egy bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska) [Francki et al., 1985 után]


11. fejezet - Fénymikroszkópos festéses módszerekFénymikroszkópos vizsgálatokat a növényvirológiában elsősorban akkor végzünk, ha valamely tünet, illetve a fertőzés hatására létrejött képlet jelenlétére vagy pontos elhelyezkedésére vagyunk kíváncsiak (Esau, 1968; de Zoeten, 1976; Christie és Edwardson, 1977, 1986; Schmidt, 1980; Matthews, 1981). Megfigyelhetjük például a kristályos zárványok durva morfológiáját, vagy azt, hogy mely növényi szövetekben találhatók (61. ábra). Módunk van arra is, hogy a festődés alapján megkülönböztessük a fehérjetermészetű zárványokat a nukleotid tartalmúaktól (19. táblázat). A trifán-kék, a narancs-zöld (O–G) pl. a fehérjetermészetű, a metilzöld-pironin a nukleinsavak megfestésére alkalmas (Dijkstra és De Jager, 1998). Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményének kiegészítésére is lehetőségünk nyílik, ha ugyanabból az anyagból készítünk mintát a fénymikroszkópos analízishez is. A festési technika előnye, hogy olcsó, gyors és egyszerű munkára ad lehetőséget, ezenkívül a növényi szövet nagy területéből vehetünk mintát.

19. táblázat - A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után)

Festék Sejtmag Sejtmagvacska Plasztidák Citoplazm

a Zárványok

Trifán-kék világoskék kékesfekete színmentes

(a kloroplasztiszok zöldek)

színmentes kékesfekete

Floxin-metil-kék

rózsaszín rózsaszín-

viola

rózsaszín színmentes rózsaszín-viola

Metilzöld-pironin

kék világosvörös

világosvörös

színmentes rózsaszíntől

sötétvörösig

Azúr-A kék vörös-viola színmentes színmentes rózsaszíntől és

vörös-violától

színmentesig

(proteinszerű

zárvány esetén)

Narancs-zöld (O-G)

narancs zöld sárgászöld sárgászöld zöldesbarna

61. ábra - A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N =


Fénymikroszkópos festéses módszerek

sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége folytán]

A növényi minta előkészítése

Ennél az eljárásnál általában friss növényi szövetekből készítünk mintát, de bizonyos esetekben lehet formalinnal vagy glutáraldehiddel fixált szövetet használni. Friss anyagból nehezebb metszeni, fixálás során viszont sérülhetnek a zárványok. Készíthetünk epidermisznyúzatot finom, egyenes szárú csipesz segítségével. Ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni, bodzabélben rögzíteni tudjuk a levelet és borotvapengével vághatunk vékony szeletet. Ilyenkor a levél epidermiszét az egyik oldalról előzőleg el kell távolítani, hogy a festék be tudjon diffundálni a sejtekbe (a kutikula akadályozza a festék bejutását).

1. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés)Protein tartalmú zárványok festésére alkalmas (ilyenek a potyvirus fertőzések következtében kialakuló zárványok) (Dijkstra és De Jager, 1998).

A festés menete

A háromféle festékből (calcomine orange 2RS vagy direct orange 102, ill. 26 és Luxol brilliant green BL) külön-külön törzsoldatot készítünk. A törzsoldatokat szobahőmérsékleten korlátlan ideig tárolhatjuk.

a. 1 g festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban oldunk, összekeverjük, majd leszűrjük.

b. A törzsoldatokból és vízből egy kisméretű óraüvegen keveréket készítünk a következő arányban: 1 rész narancs festékhez 1 rész vizet és 8 rész zöld festéket adunk. A narancs és a zöld festék egymáshoz viszonyított aránya ettől eltérhet, de a víz a teljes térfogat 10%-a legyen.

c. A mintát a festékben 5–10 percig inkubáljuk.

d. A festékoldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk, majd 95%-os etanollal többször mossuk (egy-egy mosás 15–20 másodpercig tartson). Ezután kevés 2-metoxi-etilacetátot adunk hozzá.

e. 5 perc elteltével csipesz segítségével felvesszük a mintát, tárgylemezre helyezzük, egy csepp rögzítőt (Euparal) teszünk rá, és óvatosan rányomjuk a fedőlemezt (hogy a szövet kisimuljon).

f. A mintát olaj-immerziós tárgylencsével, kb. 1000-szeres nagyítással tanulmányozhatjuk.

Amennyiben zöld Luxol festékhez nem tudunk hozzájutni, magunk is előállíthatjuk, a következő módon: 2 g 1,3-di-orto-tolylguanidint (DOTG) oldunk 50 ml 0,7 M HCl-oldatban (3 ml 37%-os HCl-at vízzel 50 ml-re hígítunk), keverjük, majd átszűrjük szűrőpapíron. 3 g Guinea-zöld B (savas zöld 3-CI42085) festéket 50 ml vízben feloldunk. Az így kapott két törzsoldatot összeöntjük, keverés után szűrjük, és a csapadékot többször átmossuk vízzel. Végül a szűrőpapíron összegyűlt csapadékot (kb. 2,7 g) vákuum alatt 1–2 percig szárítjuk.

2. Nukleoproteidek azúrkék festése


Fénymikroszkópos festéses módszerek

A festéket mindig frissen kell készíteni. A tiazin típusú festékek közül elterjedt az azúr-A, de helyette az azúr-B, toluidin kék is megfelel. A mintát a növényi szövetből ugyanúgy nyerjük, mint az előző festésnél.

a. 0,1 g azúr-A festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban feloldunk. Ebből 18 részt (cseppet) veszünk, ehhez hozzáadunk 2 rész (csepp) 0,2 M Na2HPO4-ot, és összekeverjük.

b. Ezt követően az előzőekben leírt Calcomine orange–Luxol brilliant green BL (O–G festés) festésnél leírtak szerint járunk el, ha epidermisznyúzattal dolgozunk.

2.1.2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. Vastagabb szövetdarabok festése

a. Eltávolítjuk az epidermiszt, és levéldarabkákat vágunk.

b. A szövetet 30 percre 100%-os 2-metoxi-etanolba helyezzük, hogy kivonjuk a mintánkból a klorofillt.

c. Megfestjük azúr-A-val (10–15 perc).

d. 95%-os etanolban mossuk (10–15 perc).

e. 15–30 percen át egy lefedett edényben 2-metoxi-etilacetátban áztatjuk, hogy a festékfeleslegtől megszabaduljunk.

f. A mintát tárgylemezre rögzítjük, majd megvizsgáljuk.

Megjegyzés: Ha ezen a módon nem sikerül a festés (mint a tobamovirusok esetében), akkor az eljárás végén, amikor a szövetdarab már a tárgylemezen van és fedőlemezzel lefedtük, 1–2 percig melegítsük 60 °C-on.


12. fejezet - A vírusok izolálása és tisztításaA vírusokról szerzett ismereteink lényegesen gazdagodtak, amióta lehetővé vált a virionok tisztítása, és ezáltal fizikai és kémiai szerkezetük feltárása. A tisztítási és elválasztási módszerek tökéletesedésével magas tisztaságfokú és jelentékeny mennyiségű anyagot lehetett a biofizikai és biokémiai vizsgálatok számára előállítani és a vírusszerológia számára alkalmassá tenni. Az izolálásra és tisztításra általános módszer nincsen, hiszen az alkalmazott eljárás minden esetben a vírusbeteg növénytől, a víruskoncentrációtól és elsődlegesen a kórokozó fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Mindezek ellenére vannak olyan alapvető eljárások és módszerek, amelyeket részleteiben ugyan módosítva, de minden vírus tisztításánál alkalmazhatunk (Dijkstra és De Jager, 1998; Foster és Taylor, 1998).

1. A virionok tisztítása fertőzött növényekbőlA vírusok tisztítása elsősorban a virionok elkülönítését jelenti a növény más anyagaitól, míg más értelemben, pl. az osztott genomú (multikomponens) vagy a szatellit vírusok esetén az egyes viriontípusok elválasztását is jelenti. Nyilvánvaló, hogy első lépésként a tiszta, azaz a más vírusokat nem tartalmazó izolátumot a megfelelő körülmények megválasztásával fel kell szaporítani a számára legkedvezőbb (azaz a legnagyobb víruskoncentrációt biztosító) gazdanövényben. Ezt követi a növény sejtjeinek feltárása, a virionok kivonása, extrahálása. A feltárt vírusszuszpenziót több lépésben meg kell tisztítani a durva és a finomabb sejtalkotórészektől, és tömény állapotba kell hozni, azaz koncentrálni kell. Az így kapott vírusoldat további tisztítása elsősorban a virionok és a hozzájuk molekulatömegben és alakban hasonló anyagok különválasztását, vagy az egyes víruskomponensek elválasztását jelenti. A tisztítási folyamat végén a virionok tisztaságát és töménységét kell ellenőrizni és tárolásra alkalmassá tenni.

1.1. A vírusok biológiai tisztaságaA fertőzött növények az esetek nagy részében más vírusokkal vagy ugyanazon vírus eltérő törzseivel is fertőzöttek lehetnek. Alapvető követelmény, hogy a tisztításra váró anyag idegen kórokozót ne tartalmazzon. A biológiai tisztaságot a gazdanövénykör ismeretében olyan differenciáló vagy szeparáló (elválasztó) növényekkel biztosíthatjuk, amelyek csak a számunkra kiválasztott vírus gazdanövényei. A víruselválasztás egyes esetekben akár bonyolult rendszert is jelent, amelynek eredményeképp egy komplex fertőzés összetevői biztosan elkülöníthetők (lásd A vírusok differenciálása tesztnövényekkel c. fejezetet). A biológiai tisztaság legfontosabb követelménye a genetikai azonosság. A növényekből izolált vírusok általában genetikailag nem teljesen azonos populációt képviselnek, bennük eltérő törzsek, szerotípusok vagy mutánsok is előfordulhatnak. Megközelítő tisztaságú izolátumhoz úgy juthatunk, ha egy lokális gazdanövényt mechanikai módszerrel úgy inokulálunk, hogy csak kevés lézió fejlődjön ki. Egyetlen léziót (ami nagy valószínűséggel homogén populációt képvisel) kiválasztunk, és abból kiindulva új lokális gazdanövényt fertőzünk, majd ennek egyetlen léziójából kezdjük el az izolátum felszaporítását egy fogékony gazdanövényben. Egyléziós kultúra kialakítására nem minden esetben nyílik lehetőség. Egyes esetekben a fajlagos vektorátvitel nyújt lehetőséget a más kórokozóktól való elkülönítésre. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) például könnyen tisztítható más, mechanikailag átvihető vírusoktól, ha az izoláláshoz tripsz vektort használunk. Hasonló lehetőség kínálkozik a levéltetvekkel terjedő vírusok elválasztására is olyan komplexekből, amelyek többi tagjai levéltetvekkel nem vihetők át, vagy eltérő levéltetű-átviteli módszerrel (cirkulatív vagy nem-perzisztens módszer) terjednek.

1.2. A vírusok felszaporítása fogékony növénybenA vírusokat tisztításra elegendő mennyiségben kell előállítani. E célra olyan fogékony gazdanövény a legalkalmasabb, amelyben a lehető legnagyobb víruskoncentráció érhető el, gátló anyagokat (nyálkát, inhibitorfehérjéket) vagy nagymennyiségű fenolt nem tartalmaz, ami a feltárás során oxidálódva a labilisabb vírusokat inaktiválja. A növény levelei lehetőség szerint laza szerkezetűek, vízben gazdagok legyenek. Ellenkező esetben a kivonó oldattal többszöri feltárást kell végezni. Az esetek többségében a legnagyobb víruskoncentrációt a növények fiatal csúcsi levelei biztosítják. Ha csak lokális gazdanövények állnak rendelkezésre [például a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) esetében], akkor a tisztításhoz


A vírusok izolálása és tisztítása

lényegesen nagyobb mennyiségű növényi anyagra van szükség (62. ábra).

62. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán]

Lényeges szempont a vírusfelszaporítás körülményeinek jó megválasztása. A felszaporítás céljaira használt növény folyamatos növekedésű, harmonikus tápanyag-ellátottságú legyen. A magasabb szintű nitrogénellátás többnyire kedvez a nagyobb víruskoncentráció elérésének. Az alacsony hőmérséklet általában nem segíti a vírusok replikációját, s hasonlóképpen kerülni kell az igen magas üvegházi hőmérsékleteket is; mindkettő megváltoztathatja a gazdanövény reakciótípusát vagy mutációkhoz vezethet. Az árnyékolás, különösen nyáron, kedvező hatású, a víruskoncentráció nagyobb lesz, a lazább levélszerkezet pedig a feltárást segíti.

A felszaporításhoz legmegfelelőbb a 20–25 °C hőmérséklet, amelyet ellenőrzött körülmények között legjobban klímakamrákban biztosíthatunk. A felszaporított növényi anyag vírustisztításra akkor a legalkalmasabb, ha a víruskoncentráció a legnagyobb értéket éri el. Ennek ideje a gazda–vírus kapcsolattól függ, de általában a tünetek teljes kifejlődésével esik egybe. Tisztításra legalkalmasabbak a levelek, de egyedi esetekben a gyökerekből is történhet. A floémben lokalizálódó sárgaság típusú vírusok (luteovirusok) tisztításához elsősorban a levélereket használják.

A frissen összegyűjtött növények a legmegfelelőbbek a tisztításra. A hűtőszekrényben vagy fagyasztóládában történő tárolás lényegesen rontja a hatékonyságot, különösen labilis szerkezetű vírusoknál. A szisztemikus gazdanövény víruskoncentrációját vagy a tisztítás egyes lépéseinek hatékonyságát lokális gazdanövények inokulációival folyamatosan ellenőrizhetjük.

1.3. A feltárás és kivonás körülményeiA tisztításhoz olyan kíméletes eljárással kell a gazdanövény sejtjeit elroncsolni, hogy a virionok ne inaktiválódjanak, vagy ne denaturálódjanak. A feltárás történhet kis mennyiség esetén porcelán dörzsmozsárban, míg nagyobb tömegű anyag esetén általában késes homogenizálást alkalmazunk. A feltáráshoz feleslegben adott kivonó puffert használunk, amelynek összetétele a tisztítandó vírustól függ. Az oxidációs és más enzimfolyamatok visszaszorítása érdekében a feltárást alacsony (0–4 °C) hőmérsékleten kell végezni, amit jeges fürdővel, hűtött eszközökkel, illetve hideg szobában történő munkával érhetünk el. Egyes esetekben ajánlott a folyékony nitrogénben történő feltárás is.

A kivonó puffer kiválasztása a legfontosabb, hiszen ennek kémhatása a vírus stabilitása szempontjából döntő.



Leggyakrabban 7,0 pH körüli, enyhén lúgos kémhatású puffereket használunk, de egyes virionok [például a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] csak savas közegben tárhatók fel. A túlságosan lúgos közegben ugyanis a nukleinsavak és a fehérjék közötti kötés fellazul, a virionok felduzzadnak, szétesnek. Az ionerősség megválasztása is a tisztítandó vírustól függ, általában ez 0,1–0,2 M közötti érték.

Adalékanyagokat használhatunk a virionok stabilitásának növelésére (Ca++), a fenoloxidáció elkerülésére (koffein, nikotin szulfát, polivinil-pirrolidon), más oxidatív folyamatok ellensúlyozására (aszkorbinsav, cisztein, tioglikolsav, dietil-ditiokarbamát), és a fehérje- vagy a nukleinsavbontó enzimek gátlására (proteináz-inhibítorok, bentonit). A szállítószövetekben felhalmozódott, nehezen feltárható vírusok esetében sejtfalbontó enzimekkel (maceráz, pektináz) növelhetjük a kitermelés hatékonyságát.

1.4. A vírusoldat szűréseA vírusokat tartalmazó nyers növényi szövetnedv tisztításában az első lépés a szűrés. Géz, tüllháló (cheesecloth) igen alkalmas a legdurvább sejtmaradványok, rostok eltávolítására, bár a felületük sok viriont is megköthet. Alacsony koncentráció esetén a szűréskor visszamaradt rostokat még egyszer feltárhatjuk a kivonó pufferrel.

1.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektőlA tisztítás lényege, hogy a szövetkivonatot lehetőség szerint minden, vírustól idegen szennyeződéstől, a lehető legkevesebb veszteséggel megtisztítsuk. A sötétzöld, zavaros szűrt nyers présnedv sok alakos elemet (kloroplasztiszt, sejtmagvakat, sejtfaldarabokat, a vakuólum zárványait, keményítőt stb.) tartalmaz. Alacsony fordulatú centrifugálással (5–6000 ford/perc) viszonylag rövid idő alatt a durvább és a nehezebb alakos elemek eltávolíthatók. Szerves oldószereket (kloroform, kloroform és butanol keveréke, széntetraklorid) tanácsos a centrifugálás előtt a présnedvhez adni, azzal jól összerázni, majd hűtés mellett állandóan keverni. Az apoláros szerves oldószerek a lipoproteideket és a klorofill nagy részét összegyűjtik. Ezeket az oldószereket néha már a feltárásnál is használjuk. A centrifugálás az emulziót elválasztja vizes és oldószeres fázisra, ez utóbbit eltávolítva a virionokat tartalmazó felülúszó tisztább, enyhén opálos, halványzöld lesz. (A barna szín oxidált fenolok jelenlétét jelzi, ajánlott ilyenkor redukáló szerek alkalmazása.) A szerves oldószeres tisztítást természetesen azoknál a vírusoknál nem lehet alkalmazni, amelyeknek külső lipoproteid vagy glükoproteid burkuk van (tospovirusok, rhabdovirusok). A szerves oldószerek alkalmazása esetenként tetemes veszteségeket okozhat.

1.6. A növényi fehérjék elkülönítéseA nyers, egyszer centrifugált szövetnedv sok növényi fehérjét tartalmaz. Hőkezeléssel ezek közül sok denaturálódik, kicsapódik, és így az oldatból alacsony fordulatszámú centrifugálással eltávolítható. Csak igen stabil vírusok [például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztításánál alkalmazható a virionok károsodása nélkül. A hőkezeléshez hasonlóan a fagyasztás is alkalmas lehet a növényi fehérjék koagulálására. A fagyasztás és újrafeloldás e célból célravezetőbb, mint az egyszeri fagyasztás, de alkalmazása azzal a veszéllyel jár, hogy a tisztítandó vírus is inaktiválódik. A fehérjék kicsapása az oldat kémhatásának csökkentésével is történhet. Alacsony (pH 5,0 körüli) értéknél sok fehérje kiválik. Izometrikus vírusoknál ez bevált módszer, helikális vírusoknál [például a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] nem.

Régebben a fehérjék kisózását gyakran használták tisztítási célra. Legelterjedtebb a 0,4%-os ammóniumszulfátos kisózás, de a citoplazma és kloroplasztisz riboszómáinak elválasztására Ca++ és Mg++ sókat is alkalmaznak. Derítéssel a tisztítandó oldatból számos olyan anyag (fenolok, inhibitorok, ribonukleázok, zöld sejttörmelékek stb.) eltávolítható, ami a tisztítás folyamatát zavarja. E célra felületaktív anyagokat, leggyakrabban faszénport, bentonitot, Celit-et (tisztított kovaföld), Ca-foszfát gélt, vagy DEAE cellulózt használhatunk. Tekintettel arra, hogy az adszorpció a pH és az ionerősség függvénye, a derítés körülményeit úgy kell megválasztani, hogy a virionok ne kötődjenek meg a felületen. A derítéshez használt anyagot szűréssel vagy centrifugálással különíthetjük el. Derítésnek tekinthetjük azt az eljárást is, amikor az egészséges növény fehérjéivel szemben termelt antiszérumot keverjük a tisztítandó oldathoz. Ez esetben a gazdanövény fehérjéi specifikusan kicsapódnak a vírusoldatból.

1.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítéseA szennyezőanyagoktól mentesített növényi szövetnedv nagy hígításban tartalmazza a virionokat, amelyeket az



oldattól el kell választani (izolálni), illetve a vírusoldatot be kell töményíteni. E célra leggyakrabban a vírusok kémiai kicsapását vagy fizikai ülepítését (ultracentrifugálását) alkalmazzák.

A kémiai kicsapás lényege azonos a növényi fehérjéknél alkalmazott módszerrel. Izoelektromos pontjuk közelében a virionok (nukleoproteidek) kicsaphatók, pl. a pH megváltoztatásával, extrém (3–5 pH) értékeken. A kicsapódott virionok centrifugálással gyűjthetők össze. A módszer hátránya, hogy csak a vírus fizikai tulajdonságainak teljes ismeretében biztonságos, az irreverzíbilis hatások miatt. A kicsapásra ezért inkább nagyobb koncentrációjú sóoldatokat – leggyakrabban ammóniumszulfátot – használnak. Az első kisózásnál (20%) a növényi fehérjék nagy része kicsapódik a virionok viszont nem. A centrifugálás után a felülúszó sókoncentrációját növelve (40%) már a vírusok nagy része kicsapódik a virion inaktiválódása nélkül. A kicsapást lassan, fokozatosan, kevergetés közben, hidegen kell végezni. A művelethez kristályos sót vagy tömény oldatot egyaránt használhatunk. A virionok kíméletes kicsapását az igen elterjedt (szintén több lépcsős) polietilén-glikolos (Mt 6000) kezeléssel érhetjük el. Ez esetben a virionok hidrátburkukat vesztve ülepíthetők ki az oldatból, ami a kémiai kicsapáshoz hasonló folyamat.

A fizikai elválasztási módszerek közül az ultraszűrésnek, a mozgó határfelületű elektroforézisnek vagy ioncserélő és adszorbciós oszlopon történő elválasztásának alárendelt jelentősége van. A leggyakoribb és legeredményesebb a virionok ultracentrifugással történő ülepítése. A nagy (40 000 ford/perc feletti) fordulatszámú szögfejes ultracentrifugákban a virionok mintegy két óra alatt a cső aljára ülepíthetők. Az ülepítést feloldás (szuszpendálás) követi, általában 1/10, vagy 1/5-rész pufferben. Az oldásra használt puffer gyakran azonos a kivonó pufferrel, ionerőssége azonban lényegesen kisebb, gyakran tartalmaz virionokat stabilizáló Ca- vagy Mg-ionokat. Lényeges, hogy a csapadék oldása lassan (akár egy éjszakán keresztül) történjen, a teljes oldódásig. Az oldhatatlan maradékot kis fordulatszámú centrifugálással különíthetjük el. Gyakran az ultracentrifugálás és a kis fordulatszámú centrifugálás lépéseit megismételve magas tisztaságfokú (opálos) vírusoldatot (szuszpenziót) kapunk. Az ultracentrifugálás többórás ideje alatt a fehérje- és nukleinsavbontó enzimek károsítanak, ezért az alacsony hőmérsékletet tartósan biztosítani kell, a feloldásra használt puffert célszerű sterilezni.

A hosszabb, helikális vírusok (potyvirusok) virionjai sérülékenyek, az ultracentrifugálás alatt eltörhetnek. Kíméletes ülepítési mód, ha a centrifugacsövek aljára pufferben oldott, töményebb „cukorpárna”-réteget teszünk, ami lassítja a virionok ülepedését.

A vírusok tisztításában döntő fordulatot jelentett a kilendülőfejes centrifugák és a lineáris cukorsűrűség-gradiensek alkalmazása. Ezekben a centrifugákban a gravitációs erő hatására a virionok a centrifugacső azonos magasságaiban koncentráltan, ülepedési állandójuknak megfelelően, egy zónában helyezkednek el. Ha az ülepítéshez cukorsűrűség-gradiens oldatot használunk, a virionok egyre töményebb oldattal találják szembe magukat, ülepedésük lelassul, leáll. A centrifugálás befejezése után a vírusokat tartalmazó zónák egymástól elválnak. Kellő töménység esetén az egyes frakciók felső megvilágítással, sötét háttérben jól láthatók.

A nukleoproteid tartalmú frakciók a centrifugacső injekcióstűvel történő megcsapolásával, vagy UV-detektorral ellátott frakciószedő géppel összegyűjthetők. Az ülepedési állandók különbözősége alapján a multikomponens-vírusok azonos nagyságú, de eltérő tömegű virionjai egymástól elkülöníthetők, frakcionálhatók.

A cukorsűrűséggradiens-centrifugálás terméke a virionokat tartalmazó sűrű cukoroldat. Az oldatot újból szögfejes ultracentrifugában ülepíthetjük. Híg pufferoldattal szemben dializálva a cukor eltávolítható, polietilén-glikollal (Mt 20000) szemben végzett fordított dialízissel töményíthető. Az egyes frakciók pontosabb elkülönítését teszi lehetővé a cézium-kloridos (CsCl2-os), borkősavas vagy nátrium-bromidos gradiens-centrifugálás.

1.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartásaA vírusok fizikai jellemzői közül a vírustisztítás szempontjából a legfontosabb az ülepítési állandó (szedimentációs koefficiens), amely a részecskék adott gravitációs térben történő ülepedési idejét jelzi. Egysége a Svedberg (1S = 1 × 10–13 cm s–1 dyn–1 = 0,1 ps, picosecundum), amit analitikai ultracentrifugában kísérletesen határoztak meg. Mértékét befolyásolja a virionok nagysága, alakja és sűrűsége, a közeg viszkozitása. Értéke 50S [szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus)] és 1000 S (rhabdovirusok) között van. Az ülepedési állandó ismeretében lehet megszabni az ultracentrifugálás idejét és az alkalmazott fordulatszámot.

A tisztított vírusoldat elvileg csak nukleoproteinből áll. A víruskoncentrációt UV-fényben állapítják meg, az oldat 220 és 300 nm közötti fényelnyelése (optikai denzitása, extinkció) alapján. Az extinkciós együttható (extinkciós koefficiens) egységnyi töménységű vírusoldatban mért, a vírusra jellemző (általában 2 és 10 közötti)



érték (1 mg/ml vírusoldat 1 cm fényútnál mért extinkciója 260 nm hullámhosszon). A vírusok UV-abszorpciós spektruma nem vírusspecifikus, de jelzi a készítmény tisztaságát (63. ábra). A virionoldatok általában 260 nm közelében mutatnak abszorpciós maximumot, míg a minimumérték 240 nm-nél észlelhető.

63. ábra - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után]

A fehérjék adszorpciós maximuma 280 nm-nél van (A280), a nukleinsavaknál a legnagyobb érték 260 nm-nél mérhető (A260). A két érték hányadosa (A280/A260) alapján következtethetünk a nukleinsav-tartalomra.

Csak stabil vírusok tarthatók hűtőszekrényben hosszabb ideig. Tartósítószerként mertiolátot vagy nátriumazidot is alkalmaznak, utóbbi azonban a szerológiai reakciókat zavarhatja. A tisztított vírus tartósítására használt puffert az adott helyzetnek megfelelően kell kiválasztani. Jó tárolást biztosít a fagyasztás és –20 °C-on való tárolás is, azonban a többszörös felengedés és fagyasztás tönkreteszi a virionokat. Egyes vírusok 50% glicerin hozzáadásával tartósíthatók. A tisztított vírusok legjobban folyékony nitrogénben vagy liofilezve tárolhatók.

Megjegyzés: A könyvben csak néhány víruscsoportra jellemző vírus tisztítása szerepel példaként. A virológiai irodalom azonban tisztítási módszerekben gazdag, célszerű az adott vírus tisztítása előtt ezekről tájékozódni. A legtöbb ismert vírus tisztítására útmutatást találunk Murrant és Harrison (1970–1988) C.M.I./A.A.B. Descriptions of Plant Viruses című sorozatában, továbbá Dijkstra és De Jager (1998), valamint Foster és Taylor (1998) vírusdiagnosztikai könyvében. Magyarul először a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) tisztításáról jelent meg közlemény (Horváth, 1972), majd ezt követően Balázs és Vassányi (1984) számolt be mintegy harminc vírus tisztítási módszereiről.

Stabil, egykomponensű RNS-vírus egyszerű tisztítása (Gooding és Hebert, 1967)



A stabil, egykomponensű vírusok közül a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a legismertebb növénypatogén kórokozó. A fogékony dohánynövényekben nagy koncentrációban, parakristályos formában van jelen. A tisztításra legalkalmasabbak a fiatal, mozaikos felső levelek. Merev, pálcika alakú virionjai 300 nm hosszúak és 18 nm vastagok. 95% fehérje és 5% (egyszálú, pozitív) ribonukleinsav alkotja. Tisztítás során a virionok gyakran aggregálódnak. A vírus tisztításának egyes lépései a következők:

a. A frissen leszedett vagy fagyasztott leveleket késes homogenálóban (Waring blendor) feltárjuk. A feltáráshoz 125 g levelet és vele azonos mennyiségű (125 ml) kivonó (extrakciós) puffert (0,25 M Na 2HPO4 és 5 mM Na2EDTA), 1 g aszkorbinsavat és 1 ml 2-merkaptoetanolt adunk.

b. A kivonatot 25 ml kloroformmal emulgeáljuk, jól összekeverjük, majd az elegyet durva szűrőpapíron, tüll- vagy nejlonszöveten átszűrjük.

c. A szűrletet centrifugálással (10 perc, 10 000 g) tisztítjuk, a felülúszót durva szűrőpapíron szűrjük át.

d. 80 ml szűrlethez 10 ml 5 M NaCl-t és 10 ml 30%-os PEG-et (0,02 g Na-azidot tartalmazó 30%-os polietilén-glikol 6000) adunk kis adagokban, majd az oldatot 20 percig lassan kevertetjük.

e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (10 000 g) ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 10 ml oldó pufferben (hígított NaOH-val pH 7,6-ra állított 2 mM Na2EDTA) feloldjuk. Az oldathoz 3 ml kloroformot adunk.

f. Centrifugálással (3 perc, 10 000 g) a fázisokat elválasztjuk, a felső, vizes fázist Pasteur-pipettával összegyűjtjük, a kloroformos fázist elöntjük.

g. A tisztított vírusoldatot 1 órán át 150 000 g-vel ultracentrifugáljuk. A felülúszót elöntjük.

h. A csapadékot az oldó pufferrel (e pont) feloldjuk, majd alacsony fordulatszám mellett centrifugáljuk (10 perc, 15 000 g).

i. A tisztított vírusoldatot ultracentrifugában (1 óra, 150 000 g) újra ülepítjük.

j. Az üledéket az oldó pufferben feloldjuk, mintegy 20 mg/ml töménységben.

Megjegyzés: A tisztított vírusoldat (1 mg/cm3) fajlagos fényelnyelése (abszorpciója) E260 = 3,0. Tároláskor a hűtőszekrényben lassan aggregálódik, ami a biológiai (RNS) vagy a szerológiai tulajdonságokra (fehérje) nincs hatással. 5% etilén-glikol jelenlétében –70 °C-on jól eltartható.

Bomlékony, egykomponensű RNS-vírus tisztítása (López-Moya, 1993)

A bomlékony egykomponensű RNS-vírusok közül a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) az egyik gazdasági szempontból legfontosabb kórokozó. Helikális, hajlékony, fonál alakú virionjai mintegy 700 nm hosszúak, törékenyek. A feltárás során elsősorban a szerológiai tulajdonságokat meghatározó köpenyfehérje (CP) N-végi szakaszai károsodnak, amelyek a virion külső részein helyezkednek el. A kíméletes feltárás érdekében proteinázkeveréket (cocktail) alkalmazva a CP különlegesen labilis része nem károsodik, megőrzi eredeti szerológiai tulajdonságait. A vírustisztítás lépései a következők:

a. Mintegy 100 g fertőzött, fiatal levelet (Nicotiana benthamiana vagy N. clevelandii) kétszeres mennyiségű proteáz inhibitor „coctail”-t [(1 mM fenolmetil-szulfonil-urea (MSF), 2 mM EDTA és 20 mM Na-jódacetát)] tartalmazó pufferben, késes homogenálóban hidegen feltárjuk. A 0,18 M McIlvain-puffer (pH 7) 0,25% tioglikolsavat, 0,01 M Na-DIECA-t és 0,5 M ureát tartalmaz. A feltáráshoz egyharmad térfogat (30 ml) kloroformot adunk.

b. Szűrés után a növényi nedvet alacsony fordulatszámú centrifugában (Sorvall GSA) 10 percig (6000 ford/perc) ülepítjük.

c. A felülúszót T 30 rotorban (Beckman) 90 percig ultracentrifugáljuk (25 000 ford/perc) 4 °C-on.

d. A kiülepedett vírusokat (0,2% 2-merkapto etanolt és 1,0 M ureát tartalmazó) 0,01 M citrát-foszfát-pufferrel (pH 7,0) hidegen, minimum két órán keresztül szuszpendáljuk, a kiindulási súly negyedének megfelelő (25 ml) mennyiségű pufferben.



e. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (6000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

f. A felülúszót Ti 50 rotorban (Beckman) 90 percig (25 000 ford/perc) hidegen ultracentrifugálva a virionokat kiülepítjük.

g. A csapadékot egy éjszakán keresztül tized térfogat (10 ml) (0,01 M Na 2EDTA-t tartalmazó) 0,1 M borát-pufferrel (pH 7,0) oldjuk.

h. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

i. A virionokat ultracentrifugálással ülepítjük (Beckman Ti 50 rotor, 25 000 ford/perc, 3 óra).

j. Az összegyűjtött virionokat 1 ml 50 mM-os borát-pufferben (pH 8,2) oldjuk. A spektrofotometriás méréshez mintegy 50-szeres hígítást használunk. E260 = 2,4.

Többkomponensű, ill. multikomponens-vírusok tisztítása (Lane, 1986)

A többkomponensű rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) fogékony gazdanövényeiben (árpa, búza) nagy koncentrációban fordul elő. A víruskoncentráció a fertőzés után egy-két héttel a legnagyobb. A 30 nm átmérőjű izometrikus virionok 20% nukleinsavat tartalmaznak. A tisztított vírus osztott genomú, négy komponense van. Az azonos nagyságú, de eltérő nukleinsav-tartalmú virionok a tisztítás után cukorgradiens-centrifugálással elkülöníthetők. A vírustisztítás lépései a következők:

a. A fertőzött szöveteket azonos mennyiségű kivonó pufferrel (0,5 M Na-acetát, 0,8 M ecetsav) késes homogenálóban (Waring blendor) homogenáljuk.

b. A kivonattal és kloroformmal (0,2 ml/g szövet) emulziót készítünk, az oldatot összerázzuk.

c. Alacsony fordulaton centrifugáljuk (10 perc, 5 000 g).

d. A felülúszót durva szűrőpapíron átszűrjük, majd állandó kevergetés közben (harminc percig) 1/4 rész 30%-os PEG-et (30% polietilén-glikol 6 000 és 0,02% NaN2) adunk hozzá. Erős kicsapódás látható.

e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (5 000 g) összegyűjtjük. A felülúszót kiöntjük.

f. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelő 0,2 ml mennyiségű desztillált vízzel oldjuk, és a folyadék térfogatának megfelelő 0,4 rész kloroformmal emulgeáljuk.

g. Öt perces centrifugálás után (5 000 g) a felülúszóhoz újra 1/4 térfogatnyi, 30%-os polietilén-glikolt (PEG) és 1/20 térfogatnyi 5 M NaCl-t adunk, állandó keverés (30 perc) közben.

h. Centrifugálás (10 perc, 5 000 g) után a felülúszót elöntjük.

i. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelően grammonként 0,2 ml acetát-pufferben (0,05 M Na-acetát, 0,01 M ecetsav, 1 mM Na2EDTA, 1 mM MgCl2) oldjuk.

Megjegyzés: A rozsnok mozaik vírus fajlagos abszorpciója E260 = 5 mg. A kitermelés kb. 1 mg/g szövet. Az oldat –70 °C-on fagyasztva (5% etilén-glikol hozzáadásával) tartható el a legjobban. A módszer alkalmas más izometrikus vírusok [lóbab foltosság vírus (broad bean mottle bromovirus), tehénborsó klorotikus tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus), tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztítására is.

DNS-vírus tisztítása (Guilfoyle, 1986)

A DNS-genomú vírusok legismertebb képviselője a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Az izometrikus virionok 50 nm átmérőjűek. A köpenyfehérje 42 kD, a kétszálú, kör alakú DNS mintegy 8 kilobázis (kb) nagyságú. A gazdanövényköre szűk. A felszaporításra leggyakrabban a tarlórépát (Brassica rapa cv. Just Right) használják. Az inokulációt követő 1-2 hét a legalkalmasabb a vírustisztításra. A víruskoncentráció a fiatal, tüneteket mutató levelek sejtjeiben (citoplazmában) a legnagyobb, ahol zárványtestekben (inklúziók formájában) fordul elő. A tisztítás sikere rendszerint a zárványtestek feltárásától függ. A tisztítás 2–4 °C-on történik.

a. A fertőzött szöveteket folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban vagy acélköpenyes Waring blendorban



elporítjuk. Kioldás után a szöveteket a nyers súlynak megfelelő térfogatú, 0,75% nátriumszulfitot tartalmazó, 0,5 M foszfát-pufferrel (pH 7,2) feltárjuk, majd magas fordulaton tovább homogenáljuk még egy percig.

b. A homogenátumot nyolc réteg tüllhálón és egy réteg nejlonszűrőn (Miracloth, Calbiochem) átszűrjük.

c. A szűrlethez Triton X-100-at (2,5% koncentrációig) és 1 M ureát adunk, majd a szövetnedvet 10–16 órán keresztül keverjük. Az oldathoz az enzimfolyamatok gátlására proteáz inhibitor PMSF-et (fenilmetil-szulfonilurea) adhatunk.

d. A kivonatot centrifugálással (7 000 g, 10 perc) tisztítjuk meg a durva szennyeződésektől. Az üledéket eltávolítjuk.

e. A felülúszó ultracentrifugálásával (40 000 rpm, 1 óra, 45-Ti Beckman-rotorban) a virionok kiülepíthetők.

f. A vírusokat is tartalmazó üledéket 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1mM EDTA és 2,5% Triton X-100 pufferrel feloldjuk.

g. A szuszpenziót a durva szennyezésektől centrifugálással (7000 g, 10 perc) tisztítjuk meg, a virionok a felülúszóban maradnak.

h. Újabb ultracentrifugálással (lásd e pont) a virionok újra kiülepíthetők.

i. A csapadékot ionmentesített vízben oldjuk, 36% céziumklorid hozzáadása után 16–24 óráig 35 000 fordulaton 75-Ti Beckman-rotorban centrifugáljuk.

j. A centrifugálás után a virionok határozott opaleszkáló réteget mutatnak a gradiens közepe táján, amit frakciószedővel vagy a centrifugacső lékelésével összegyűjtünk.

k. A tisztított vírusoldatot dialízissel sómentesítjük 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA és 150 mM NaCl ellenében 24 órán keresztül, a dializáló oldat többszöri cseréjével. A cézium-klorid-gradiens helyett cukorgradiens is használható.

Megjegyzés: A kitermelés 1–10 mg vírus/kg levél.

Glükoproteid burkú vírus tisztítása (Tas et al., 1977)

A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) az állatpatogén vírusokkal rokon. A növénypatogén vírusok nagy részétől egyrészt a glükoproteid burok megléte, másrészt a multikomponens RNS-genom kettős, részben pozitív, és részben negatív jellege (ambiszenz polaritás) különbözteti meg. A 70–100 nm átmérőjű, változékony, majdnem szférikus virionok nagyon bomlékonyak, a membránburok lipofil jellege kizárja a poláros oldószerek használatát, a tisztítást állandóan alacsony hőmérsékleten (3 °C-on) kell végezni.

a. 60–100 g fertőzött (Nicotiana rustica, vagy N. benthamiana) levelet vákuumban infiltrálunk 0,01 M Tris, 0,01 M nátrium-szulfit és 0,1% cisztein-hidroklorid (pH 8,0) extrakciós pufferrel. A leveleket Waring Blendorban homogenáljuk alacsony fordulaton 30 másodpercig.

b. A szövetnedvet gézen átszűrjük, centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk. Az üledék is sok vírust tartalmaz, ezért nem dobjuk el, hanem újra feltárjuk.

c. A centrifugálás üledékét 200 ml szuszpenziós pufferrel (0,01M glicin, 0,1% cisztein-hidroklorid és 0,1 Na-szulfit, pH 7,9) oldjuk, és 1–2 órán keresztül állni hagyjuk.

d. A harmadik kivonatot újra centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.

e. Az első (b pont) és a második centrifugálás (d pont) felülúszóit elkülönítve ultracentrifugáljuk (30 perc, 25 000 ford/perc, Spinco R30 rotorban), a virionokat kiülepítjük.

f. Az üledéket 20 ml szuszpendáló pufferben (c pont) oldjuk, majd a tisztított szövetnedvhez 0,2–0,4 ml egészséges növény (N. rustica vagy N. benthamiana) fehérjéivel szemben készített antiszérumot adunk, a szövetnedvet állni hagyjuk egy órára.

g. A fehérjeprecipitátumot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) eltávolítjuk, a felülúszót megtartjuk.



h. A felülúszót 6 ml-es adagokban szuszpenziós pufferben készített 3–30%-os cukorsűrűség-gradiens tetejére rétegezzük, majd kilendülőfejes centrifugában (23 000 ford/perc, 45 perc, SW 25 Spinco rotor) ülepítjük.

i. A vírustartalmú zónát összegyűjtjük, majd 25–50% cukorsűrűség-gradiensben újra 5–16 órán keresztül ultracentrifugáljuk (23 000 ford/perc).

j. A virionokat szuszpenziós pufferrel hígítjuk, majd az oldatot 30 000 ford/perc fordulaton 1 órán keresztül ultracentrifugálva koncentráljuk.

Megjegyzés: A kitermelés 1 mg/100 g szövet. A tospovirusokhoz tartozó vírusok [Impatiens nekrotikus foltosság vírus (Impatiens necrotic spot tospovirus), földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus (groundnut ringspot tospovirus), paradicsom klorotikus foltosság vírus (tomato chlorotic spot tospovirus)] tisztítására Feldhoff et al. (1996) dolgoztak ki új módszert. Az extrakciós puffer 0,1 M Na2SO3-at tartalmazó 0,1 M foszfát-puffer (pH 6), a szuszpenziós puffer tizedannyi töménységű. Az ultracentrifugálás 30 000 fordulatszámon történik harminc percig, a cukorgradiens-centrifugálás 27 000 fordulatszámon, 2 órán át, 20–50%-os cukoroldatban. A végső koncentrálás 1 órán keresztül tart, 50 000 ford/perc mellett.

2. A vírusfehérjék izolálása és tisztításaKorábban a vírus-köpenyfehérje aminosavsorrendjének megismerése állt a vizsgálatok homlokterében, ma azonban inkább a vírusgenom által kódolt összes fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének megismerésén van a fő hangsúly, amelyek célja a virionok felépítésének és működésének tanulmányozása, az antigénszerkezet megismerése. A továbbiakban csak a köpenyfehérje vizsgálatának főbb módszereit tárgyaljuk.

A vírusfehérjéket tisztított vírusokból izoláljuk. Általában a kivonásnak olyan módszereit kell alkalmazni, amely megvédi a fehérjék természetes (natív) jellegét és nem vezet a térbeli szerkezet módosulásához. Az alkalmazott módszer természetesen a vizsgálat céljától, és nem utolsósorban az adott vírus tulajdonságaitól függ. Az izolálás első lépése a fehérjék és más alkotórészek (nukleinsav) közötti kötések megbontása, majd a nemkívánatos szennyezőanyagok denaturálása és eltávolítása.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg ecetsavas módszerrel (Fraenkel-Conrat, 1957)

a. A vírus vizes oldatához (10–30 mg/ml) fokozatosan két térfogat hideg jégecetet adunk, az oldatot 30–60 percig állni hagyjuk, időszakonként felkeverjük.

b. Az oldatot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) tisztítjuk meg a kicsapódott nukleinsavtól.

c. A felülúszót 2–3 napig dializáljuk desztillált vízzel, a víz többszöri cserélésével. A dialízis során a fehérje kicsapódik, ahogy az oldat pH-ja az izoelektromos ponthoz közelít.

d. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, majd a fehérjét desztillált vízzel szuszpendáljuk. A pH-értéket híg lúggal (NaOH) fokozatosan 8,0-ra emeljük, majd az oldatot egy éjszakára állni hagyjuk, hogy a fehérje feloldódjék.

e. Az oldhatatlan anyagokat (emésztetlen virionok, denaturálódott fehérjék) ultra-centrifugálással (10 0000 g, 1 óra) eltávolítjuk.

Megjegyzés: A kitermelés a vírus összetételének megfelelően mintegy 95%-os. A módszer alkalmas más tobamovirusok, valamint a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) és a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) köpenyfehérjéjének tisztítására is.

A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg kalcium-kloridos módszerrel (Yamazaki és Kaesberg, 1963)

Ismert, hogy a virionok magas sókoncentrációjú oldatban disszociálnak. A módszer alapja, hogy a kétértékű Ca-ionok a virionban a fehérjék és nukleinsavak közötti kötést megbontják.

a. Dializáljuk a tisztított vírusoldatot 1 M CaCl2-oldatban (pH 6,3) 12 órán keresztül, 4 °C-on. Az oldat opaleszkálóvá válik.



b. A precipitátumot (RNS) centrifugálással (2 500 g, 20 perc) eltávolítjuk és a tiszta, fehérjéket tartalmazó felülúszót pufferrel szemben dializáljuk.

Megjegyzés: A módszer kis módosítással alkalmas egyéb vírusok [lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) (64. ábra)] köpenyfehérjéjének tisztítására is. Más vírusok [(tehénborsó klorotikus foltosság vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus), vad uborka mozaik vírus (wild cucumber mosaic tymovirus)] alkalikus közegben disszociálnak (Tsugita és Hirashima, 1972).

64. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán]

3. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióbólA vírusnukleinsavak (RNS vagy DNS) kivonása a vírus struktúrájának megbontása, roncsolása nélkül nem lehetséges, ezért a nukleinsav-kivonás mindig bizonyos mértékű veszteséggel vagy a nukleinsavak károsodásával jár. Az alkalmazott módszerek e veszteségek csökkentésére, illetve a nukleinsavak károsodásának megakadályozására irányulnak. A virion szerkezetének megbontása természetesen nagymértékben függ az adott vírus stabilitásától. A feltárás során a vírusnukleinsavak kémiai és biológiai épségét meg kell őrizni, óva egyrészt a denaturáló hatásoktól (alacsony vagy magas pH), másrészt a nukleinsavbontó enzimektől. A legtöbb nukleinsav-tisztítási módszer alapja a kétfázisú fenolos módszer, amely során detergenseket, nukleázinhibitorokat, fémkelátképző anyagokat használnak. Az alkalmazott módszerek lényege, hogy a feltárás minél rövidebb ideig tartson, és a fehérjéktől kétfázisú rendszerben a nukleinsavak elkülöníthetők legyenek. A nukleinsav-tisztítás centrifugálással, alkoholos kicsapással vagy szilárd fázison történő megkötéssel történik (Bruening, 1972).

3.1.1.

3.1.1.1. Feltárás fenolos extrakcióval

A nukleinsavak feltárására leggyakrabban vízzel telített fenolt használnak, ami további víz (puffer) hozzáadásakor kétfázisú rendszert képez. A nukleinsavak nagy része a vizes fázisban marad, míg az opálos, fenolos fázis többnyire a kicsapódott fehérjéket tartalmazza. A két rendszer alapos összerázása után a frakciók egymástól centrifugálással elválaszthatók. Néha interfázis is kialakul, ami a fenolban nem oldott fehérjéket tartalmazza. Alacsony sótartalom mellett, 60–65 °C-on, interfázis nem alakul ki. Ha a kirázáskor kloroformot (kloroform és fenol 1:1 arányú keverékét) is használnak – ami javítja a tisztaságot –, akkor interfázis alakulhat ki. Ez 1% izoamil-alkohollal javítható.

A fenolos módszer gyakran akár 50% RNS-kinyerési veszteséget okoz, amit javítani lehet azzal, ha a fenolhoz krezolt keverünk. A vizes fázisból a nukleinsavak ultracentrifugálással kiülepíthetők. Ez az üledék azonban vírusfehérjéket is tartalmaz. Az üledék oldása és detergenssel történő kezelése után magas tisztaságfokú nukleinsavat nyerhetünk óvatos cukor- vagy céziumklorid-gradiens-centrifugálással. Ha a centrifugacsövek 1/4



részébe 25%-os cukoroldatot rétegezünk, a gyorsabban ülepedő nukleinsavak a sűrűbb cukorpárnába ülepednek, míg a kisebb ülepedési sebességű fehérjék a felső részben maradnak.

A nukleinsavak kicsapásának ismert módszere a savas közegben (0,05–0,1 M kálium-acetát, pH 5) kétszeres mennyiségű 95%-os alkohollal történő kicsapás 0 °C-on vagy 0 °C alatt. A kicsapott nukleinsav centrifugálással (10 000 g, 15 perc) összegyűjthető. A tisztított nukleinsav biológiai állapotát a fertőzőképesség megmaradásával ellenőrizhetjük (pl. lokális léziós gazdanövényeken).

Megjegyzés: A fenol maró hatású, a bőrön nehezen gyógyuló égési sebeket okoz. Az eljárás során védőszemüveg, gumikesztyű, köpeny használata kötelező. Fenolos extrakcióhoz üvegeszközöket használjunk.

Dohány mozaik vírus- (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-kivonás fertőzött levelekből, fenolos módszerrel (Schlegel, 1960)

a. A növényi anyagot súlyának megfelelő 4-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenol és 1% nátrium-pirofoszfát (Na4P2O4) 1:1 arányú keverékével homogenáljuk 5 percig, hűtött eszközökkel. (Az egész kivonást ajánlott hideg szobában, 5 °C alatt végezni).

b. A kapott emulziót 5 percig 6 000 fordulaton centrifugáljuk.

c. A nukleinsavat tartalmazó vizes fázist 2-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenollal újra átrázzuk.

d. A vizes fázisból a fenolmaradékot éterrel távolítjuk el, háromszor ismételve a kirázást.

e. A nukleinsavakat 2 térfogatnyi hideg, 95%-os etanollal kicsapjuk.

f. Az alkoholos oldatot 5 percig centrifugáljuk (6 500 ford/perc).

g. A nukleinsavat tartalmazó csapadékot hideg, 1%-os K2HPO4-oldattal feloldjuk. (A fertőzőképesség ellenőrzésére kontrollként az 1%-os K2HPO4-ban homogenált levélszöveteket használhatunk.)

Megjegyzés: A fenti módszer egyéb vírusok [lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) (65. ábra), dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus)] esetében is fertőzőképes nukleinsavat eredményezett.

65. ábra - Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán]



Javított (kloroform-fenol) módszer nukleinsavak (RNS és DNS) kivonására tisztított oldatból

a. Egy rész konyhasóval telített fenolt fél térfogat vizes oldattal és egy térfogat kloroformmal Vortexben 10 percig keverünk, fél térfogatmintával (vírusszuszpenzió).

b. A két fázist 2 perces centrifugálással mikrocentrifugában elválasztjuk. A szerves fázis a 8-hidroxikinolintól sárga színű, általában alul helyezkedik el. Ha a sókoncentráció magas, akkor a fázisok fordítva helyezkednek el.

c. A vizes fázist összegyűjtjük és új csőbe tesszük. Ügyeljünk, hogy a vizes fázis interfázist és szerves oldószert ne tartalmazzon.

d. A vizes fázist egy térfogat kloroformmal összerázzuk, majd az elegyet 2 perces centrifugálással szétválasztjuk. A tiszta kloroformos fázis alul marad.

e. A vizes fázist tiszta kémcsőbe gyűjtjük.

f. A vizes fázishoz 1/10 térfogat 3 M Na-acetátot (pH 7) és 2,5 tf 95%-os etanolt adunk. Vortex-szel keverjük, majd 10 percig jeges fürdőn állni hagyjuk. Kis mennyiségeknél a kicsapás egy éjszakán át tart, vagy –20 °C-on rövidebb ideig.

g. A csapadékot mikrocentrifugával ülepítjük (min. 10 perc, 14 000 ford/perc). Tíz mikrogrammnál több nukleinsav már látható üledéket ad.

h. Mikropipettával a felülúszót eltávolítjuk.

i. Az üledékhez 500 mikroliter 80%-os etanolt adunk. Összerázás után 5 percig (14 000 ford/perc) centrifugáljuk, majd az alkoholt óvatosan elöntjük.

j. Az üledéket vákuummal szárítjuk, míg az alkohol el nem párolog.

k. A nukleinsavat steril vízben vagy pufferben oldjuk.

3.2. Vírus-DNS kivonásaA növénypatogén vírusok kisebb részében a genom DNS, és leginkább kétszálú. E vírusok jelentősége elsősorban abban van, hogy a magasabb rendű élőlények genetikai anyagával megegyező felépítésűek, így



különösen alkalmas objektumai a molekuláris virológiai és a biotechnológiai kutatásoknak.

DNS-kivonás fenolos módszerrel (Shepherd et al., 1968)

A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) különösen stabil kapszidjait csak fenolos, vagy csak nátrium-dodecil-szulfátos (SDS, 2,5 mg/ml), vagy pronázos (50 µg/mg vírus) inkubálással bonthatjuk meg 37 °C-on (Shepherd et al., 1970).

a. A tisztításhoz tisztított vírusoldatot használunk, amit 37 °C-on inkubálunk 6 órán keresztül 50 mM Tris-HCl-pufferben (pH 7,2) 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl és 500 µg/ml proteináz K jelenlétében.

b. A proteázos emésztés után az oldathoz CsCl2-t teszünk, 0,78 g/ml végkoncentrációig, majd 300 µg/ml etidium-bromidot keverünk hozzá.

c. A DNS-t ultracentrifugálással tisztítjuk (24 óra, 52 000 ford/perc 20 °C-on, Ti-75 Beckman rotorban). A DNS-zóna helyzetét UV-fényben láthatjuk, ezt a frakciót összegyűjtjük.

d. Az etidium-bromidot 3 M CsCl2-dal telített izopropanollal ismételt kirázással távolítjuk el.

e. A DNS-oldatot 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) és 1 mM EDTA-val szemben dializáljuk, az oldat többszöri cseréjével.

Megjegyzés: Ha az enzimes kezelés után a DNS-t fenol-kloroformos módszerrel választjuk el, a Sarkosyl helyett SDS-t használunk. Fenolos kivonásnál az enzimes feltárás után a kivonó pufferhez 1 mM etanolamint (pH 10,5) keverve a kitermelés javítható.

3.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekbőlAz egészséges növény szövetei a DNS és RNS mellett – ha kis mennyiségben is, de – kettős szálú ribonukleinsavakat (dsRNS) is tartalmaznak; néhány vírus genomja maga is dsRNS. A növénypatogén vírusok nagy része azonban egyszálú RNS (ssRNS), ami a replikáció során kétszálú formában fordul elő. Ez egy replikatív forma (RF), amely a pozitív genomi RNS-ből és annak negatív tükörképéből (template) áll. Az RF mellett azonban a fertőzött sejtekben olyan kettős szálú formák, a replikációs intermedierek (RI) is előfordulnak, amelyeken már egyszálú RNS-részek is vannak – ezek kisebbek, mint a RF. E szálakat azonban a tisztítás során az RNázok többnyire elemésztik.

A dsRNS-kivonás több módszerrel is lehetséges (cf. Jones, 1992): (1) a szövetek DNáz- és RNáz-kezelésével, (2) sóoldatban (pl. LiCl), eltérő oldékonyság alapján, (3) cukorsűrűség-gradiens centrifugálással, (4) cellulózról eltérő etanololdékonyság alapján. Morris és Dodds (1979) módszere egyesíti a fenti lehetőségeket. E módszer lényege, hogy az általában folyékony nitrogénben elporított szövetet olyan pufferrel tárják fel, ami az RNáz-aktivitást alacsony szinten tartja (magas pH, nagy sókoncentráció, detergensek, antioxidánsok és kelátképző anyagok). A nukleinsavak és fehérjék elválasztása általában kloroform és fenol keverékében történik, majd a nukleinsavakat cellulózporon választják el. A maradék, szennyező DNS-t és RNS-t enzimes emésztéssel távolítják el. Az így kinyert dsRNS-eket agaróz- vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel lehet elválasztani. Részletesebb leírást és gyakorlati kimutatásra alkalmas módszereket Dodds (1986) tanulmánya tartalmaz.

Egyszerűsített módszer dsRNS kivonására (Morris et al., 1983)

a. 10 g szövetet folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban elporítunk és 10 ml (vagy több) kétszeres töménységű, 1% SDS-t és 0,1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó STE-pufferrel (1 × STE = 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8) extraháljuk.

b. 10 ml vízzel telített fenol és 5 ml kloroform-pentanol (25:1) keverékével keverjük.

c. A kivonatot 10 percig centrifugáljuk (10 000 g), majd a vizes felülúszót összegyűjtjük.

d. A vizes fázishoz annyi etanolt adunk, hogy annak végső koncentrációja 16–18% legyen.

e. Az oldatot lassan, kis mennyiségekben 18% etanolt tartalmazó, STE-pufferben szuszpendált cellulózporral (Whatman CF11) töltött oszlopra (injekciós fecskendő) öntjük.

f. A cellulózoszlopot 18% etanolt tartalmazó STE-pufferrel néhányszor átmossuk, ami az egyszálú RNS-t és a



DNS-t lemossa az oszlopról.

g. A dsRNS-t kis mennyiségű (1–3 ml), alkoholt nem tartalmazó STE-pufferrel leoldjuk (eluáljuk) az oszlopról.

h. 2,5 térfogat etanol hozzáadásával a dsRNS-eket kicsapjuk. Az alkoholos oldatot éjszakára –15 °C-ra vagy néhány órára –70 °C-ra helyezzük.

i. A kicsapódott dsRNS-eket centrifugálással (10 perc, 10 000 g) gyűjtjük össze, majd a csapadékot kiszárítjuk. Feloldjuk 100 µl (10% RNáz-mentes szaharóz és egy kevés brómfenol-kéket tartalmazó) TPE-pufferrel (35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, l mM EDTA, pH 7,6).

j. Az oldatot 5 percig (5 000 g) centrifugálva tisztítjuk, majd a felülúszó nukleinsavmintát az előző példában leírtak szerint elektroforézissel elválasztjuk. Jelzőanyagként uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) vagy dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) dsRNS-t használhatunk.

Fás szárú növények esetében alkalmazható módszer (Watkins et al., 1990)

a. 10 g friss vagy fagyasztott szövetet folyékony nitrogénnel mozsárban elporítunk és 20 ml 2% polivinil-pirrolidont (PVP) (Mt. 44000), 1% SDS-t, 1% bentonitot, 0,2% DIECA-t és 0,1% thioglicerolt tartalmazó TMS-pufferrel (100 mM TRIS, 10 mM magnézium-acetát, 500 mM NaCl, pH 8,5) extrahálunk.

b. 20 ml (10% m-krezolt, 0,3 % 8-hidroxikinolint és 20 ml kloroform és pentanol 25:1 arányú keverékét tartalmazó) vízzel telített fenollal keverjük.

c. Az elegyet 60 °C-on 15 percig állni hagyjuk.

d. Az oldatot centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), a vizes felülúszót összegyűjtjük.

e. A vizes fázishoz ml-enként 0,02 g cellulózport (Cellex N-1 vagy Whatman CF-11) és 0,22 ml etanolt (95%) adunk.

f. A szuszpenziót 30 percig keverjük szobahőmérsékleten.

g. Tízperces centrifugálást követően (10 000 g) a felülúszót elöntjük.

h. A cellulózüledéket feloldjuk 1–2 ml 18% etanolt tartalmazó STE-pufferben (200 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7).

i. 10 perces (10 000 g) centrifugálást követőn a felülúszót elöntjük.

j. A cellulózüledéket kétszer mossuk 18%-os alkoholt tartalmazó STE-pufferben, a cellulózt centrifugálással gyűjtsük össze.

k. Az utolsó mosáskor a cellulózt 18%-os etanollal szuszpendáljuk, és üvegoszlopra vagy eldobható injekciós fecskendőre öntjük, majd száradni hagyjuk.

l. Az oszlopról a dsRNS-t és a maradék szennyező DNS-t etanolt már nem tartalmazó STE-pufferrel eluáljuk (leoldjuk).

m. A leoldott dsRNS-t 2,5 térfogat etanollal (95%) kicsapjuk, és egy éjszakán keresztül állni hagyjuk –15 °C-on, vagy néhány órán keresztül –70 °C-on.

n. A kicsapott nukleinsavakat centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), elöntjük a felülúszót, a csapadékot 1 ml (30 mM MgCl2-t tartalmazó) STE-ben oldjuk.

o. 10 µg/ml DNázzal kezeljük és 60 percig inkubáljuk 30 °C-on.

p. Hozzáadunk 1 ml (1 mM EDTA-t és 4% SDS-t tartalmazó) 20 mM-os Tris-puffert, majd 60 °C-on további 15 percig inkubáljuk.

q. Azonos mennyiségű vízzel telített fenollal emulgeáljuk.

r. Centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), majd összegyűjtjük a vizes felülúszót és hozzáadunk 2,5 térfogatnyi



etanolt. Ezt követően egy éjszakán –15 °C-on vagy –70 °C-on néhány órát állni hagyjuk, míg a dsRNS-ek kicsapódnak.

s. Centrifugálás után (10 perc, 10 000 g) a felülúszót elöntjük, a kicsapódott dsRNS-t kiszárítjuk. A csapadékot 100 µl RNáz-mentes, 10%-os szaharózoldatban készített, kevés brómfenol-kéket is tartalmazó TPE-pufferrel (35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7,6) szuszpendáljuk.

t. A szuszpenziót 5 percig centrifugáljuk (5 000 g), majd 20–40 µl mintát 7% TPE-pufferben készített poliakrilamid- vagy 1% agarózgélre felviszünk.

u. A mintákat 50 V feszültség mellett 16–20 órán keresztül poliakrilamid-gélben, vagy 3–5 órán át agarózgélben futtatjuk.

v. A géleket etidium-bromiddal vagy ezüstnitráttal festjük.


13. fejezet - A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációjaA vírusok – bár az élettelen és az élő anyag szerveződésének határterületén állnak – felfoghatók olyan obligát parazita (biotróf), azaz feltétlen élősködő szervezetekként is, amelyek önálló anyagcserével nem rendelkeznek, hanem a gazdanövény nukleinsav- és fehérjeszintetizáló rendszerét parazitálva annak anyagcseretermékeit (energiaforrásait, nukleinsavbázisait és aminosavait) használják fel saját bioszintézisükhöz. A vírusoknak önálló szaporodásuk nincs; ehhez az életjelenséghez ugyanis olyan szaporítószervekre vagy szaporító képletekre és önálló anyagcserére lenne szükségük, amivel nem rendelkeznek.

A vírusokat (és a viroidokat is) fertőző genetikai információként is felfoghatjuk, ami ebben a megfogalmazásban azt jelenti, hogy olyan fertőző (és betegségeket okozó) nukleinsavak, amelyek a gazdanövény nukleinsav-anyagcseréjébe kapcsolódva saját genetikai anyaguk újratermelését (bioszintézisét) biztosítják.

A vírusnukleinsavnak kettős szerepe van. Egyrészt meg kell sokszoroznia saját genetikai anyagát (ez maga a nukleinsav-replikáció); másrészt irányítania és kódolnia kell a gének kifejeződését, azaz a vírusfehérjék szintézisét (génexpresszió). A vírusfertőzött sejtben ez a két folyamat időben és térben szigorúan meghatározott sorrendben és elválasztva, rendezetten megy végbe, amelynek végső eredménye az új virionok szintézise.

A nyugalomban levő, meghatározott alakkal rendelkező (tehát elektronmikroszkóppal látható), inaktív vírusrészecskéket virionoknak nevezzük. A fertőzés után azonban a virionok „felbomlanak” (dissembly), és megkezdődik az új virionok szintézise. Ebben az állapotában „vegetatív vírus”-ként tartjuk számon a kórokozót. A szintetizált vírusnukleinsavak és a köpenyfehérje in vitro összeépülése (assembly) zárja a vírusbioszintézis folyamatát, amelynek végén újra virionok mutathatók ki, legtöbbször a vakuolumokban vagy a citoplazmában felhalmozottan. A vírusfertőzés következtében új genetikai információ kerül a sejtekbe, amelyek már a továbbiakban új, nehezen megbontható biológiai egységet jelentenek.

A replikáció vizsgálata során három alapvető kérdésre keressük a választ: 1. Hogyan szerveződik a vírusgenom (milyen géneket, milyen sorrendben tartalmaznak)? 2. E gének milyen módon nyilvánulnak meg (mi a génkifejeződés stratégiája)? 3. A szintézis milyen fehérjetermékeket eredményez (mi ezek feladata, működése)?

1. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszereiA vírusreplikációval kapcsolatos ismereteink az elmúlt két évtizedben ugrásszerűen szaporodtak. Ezt az időszakot – amelyet a molekuláris virológia és a biotechnológia kez-deti korszakának is tekinthetünk – több új, alapvető vizsgálati módszer bevezetése jellemezte.

1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálataA restrikciós endonukleázok (mikrogombákból vagy baktériumokból izolált, a kettős szálú nukleinsavszálakat nem a végeiken, hanem a lánc belsejében fajlagosan bontó enzimek) és a nukleinsavsorrendet meghatározó módszerek segítségével elsőként a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) mintegy nyolcezer bázispárból álló teljes nukleinsavsorrendje vált ismertté (Franck et al., 1980; Rezelman et al., 1980; Ahlquist et al., 1981; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982).

1.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-bőlA fordított átírást (RNS-től függő DNS-polimeráz) szabályozó reverz transzkriptáz enzim retrovirusokból történt izolálása és azok növényvirológiai alkalmazása lehetővé tette az egyszálú RNS-vírusok kettős szálú DNS-kópiává (cDNS) történő átírását. E cDNS-szakaszok restrikciós enzimekkel bonthatók, szekvenciájuk meghatározható. Először a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) és viszonylagos egyszerűségük


A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja

miatt az osztott genomú vírusok [tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] teljes szekvenciáit határozták meg (Goelet et al., 1982; Lomonossoff és Shanks, 1983). Napjainkra a legfontosabb típusvírusok e szempontból már ismertté váltak, és több esetben megismerhettük az egyes vírustörzsek közötti biológiai eltérések molekuláris hátterét is.

1.3. A protoplasztok virológiai alkalmazásaA genomban foglalt információk kifejeződéséről szerzett ismereteinket részben az izolált protoplasztok virológiai alkalmazásának köszönhetjük. A vírusfertőzés során a nukleinsav-replikáció és a vírusfertőzés többi lépése (sejtről sejtre terjedés, majd az egész növény fertőződése) során szükséges funkcionáló gének és fehérjék szerepe nem különíthető el pontosan. A sejtfaluktól enzimes (macerozim, celluláz, pektináz) úton megfosztott protoplasztok cm3-enként több millió sejtből álló szuszpenziója (66. ábra) azonnal fertőzhető, azaz a replikáció szempontjából szinkron-, in vivo rendszernek tekinthető. A génekben kódolt fehérjék szintézise viszonylag azonos időben történik meg, jól nyomon követhető. Az 1970-es évek végén és az 1980-as évek elején végzett kísérletek úttörő munkák voltak a molekuláris virológia kialakulásában (Takebe, 1975; Howell és Hull, 1978; Gonda és Symons, 1979; Jarvis és Murakishi, 1980; Nassuth et al. 1983).

66. ábra - Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok

1.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerekE transzlációs rendszerek (retikulocita-lizátum, búzacsíra-kivonat, Xenopus oocyta) virológiai alkalmazhatósága azon alapszik, hogy ezekben az alakos sejtalkotórészeket nem, de riboszómákat tartalmazó szuszpenziókban – ha minden más feltétel (nukleozidok, energiaforrás, transzfer RNS-ek, stb.) adott – a kívülről bejuttatott pozitív értelmű ribonukleinsavak, így a vírusnukleinsavak is (mint messenger RNS-ek) az információjuknak megfelelő fehérjék szintézisét megindítják. Ez az folyamat is gyakorlatilag azonos időben megy végbe. A szinkron tenyészetek adták az első alkalmat a vírusok proteinszintézisének megismerésére (Efron és Marcus, 1973; Davies és Kaesberg, 1974; Dougherty és Hiebert, 1980). A két utóbbi módszer (protoplaszt- és sejtmentes fehérjeszintézis) eredményei együttesen adnak útmutatást a fehérjetermékekre, azok képzési mechanizmusaira.

2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusaiA vírusok teljes génállománya a genom. Mint ismert, ezek formái: egyszálú DNS (pl. geminivirusok); kettős szálú RNS (pl. reovirusok), kettős szálú DNS (pl. caulimovirusok); valamint a növénypatogén vírusok túlnyomó többsége egyszálú (+) RNS. A növény- és az állatpatogén vírusok határán – mintegy a rokonságot bizonyítandó – foglalnak helyet a rhabdovirusok és a tospovirusok, amelyek genomja negatív (antiszensz), illetve részben kettős (+ és –), azaz ambiszenz. A nukleinsavlánc lehet fonalas (lineáris) vagy kör alakú (cirkuláris). Bár a nukleinsavak térbeli szerkezete sem közömbös, a főbb tulajdonságokat a nukleotidsorrend (nukleinsav-



szekvencia) határozza meg. Egy nukleotid eltérés – különösen, ha az a fehérjében aminosavcserét eredményez – már a biológiai tulajdonságok megváltozását (pl. tünettípus, átvitel, hőérzékenység stb.) okozhatja. A vírusok és vírustörzsek rokonságát a nukleinsav-homológia foka határozza meg.

A genom lehet egykomponensű, azaz osztatlan, de lehet osztott, azaz multikomponensű is. Ez utóbbi esetben az egyes komponensek csak együtt fertőzőképesek, hiszen a megosztottság a feladatok megosztását is eredményezi.

2.1. A nukleinsavak jellemző végeiA vírus-RNS 5’ és 3’ végei sajátos szerveződésűek. Egyes RNS-ek 5’ végén 7metil-guanozin (m7Gppp) sapka (cap) van (Tobamovirus, Potexvirus, Bromovirus nemzetségek), míg másokra (Comovirus, Nepovirus, Potyvirus, Sobemovirus) a genomhoz kötött kis molekulatömegű fehérje (VPg) a jellemző (Davies és Hull, 1982). A sapka jelenléte a fertőzés eredményességét, az RNS stabilitását és a transzlációt befolyásolja; szerepe a proteinszintézis megindításában van. A VPg-regulátor szerepe az RNS-szintézis megindításában nem minden vírus esetén bizonyított, de feltételezhető, hiszen ez az egyetlen fehérjemolekula, amely a replikáció teljes idején a nukleinsavhoz kötődik (Matthews, 1991).

Az RNS 3’ végén egyes nemzetségeknél (Tymovirus, Tobamovirus, Bromovirus, Potyvirus, Cucumovirus) tRNS-re emlékeztető szerveződésű és szerepű szakasz található, másoknál (Comovirus) ezt egy poliadenilsav-láncból [poly (A)] álló hosszú farok (tail) helyettesíti. A tRNS-szerű vég feltehetően a replikáz enzim felismerési helye, ahol a negatív szálak szintézise elkezdődhet. Szerepe egy olyan aminosav megkötésében van, ami elősegíti a replikációban szereplő enzimek felismerését és a transzlációt. A poly (A) farok a replikációnál nélkülözhetetlen, az RNS-t stabillá teszi. A láncvégi szerveződés nem követi a virion morfológiáját, de jellemzője lehet a vírusok új, nukleinsav-szerveződésen alapuló rendszerének. Az osztott genomú (multikomponens) vírusok nukleinsavvégei típus szerint megegyeznek.

Az RNS kezdeti szakaszain hosszabb, fehérjéket nem kódoló, de a működés szempontjából fontos szakaszok is lehetnek. Az 5’ vég fehérjét nem kódoló szakaszai például a riboszómákhoz történő kötődést biztosíthatják. Az egyes gének között néha csak egy-két, máskor több száz nem kódoló nukleotid van. A növénypatogén vírusok (a geminivirusok kivételével) intronokat nem tartalmaznak.

2.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékekA vírusgenom, hosszúságától függően, 1–12 gént tartalmazhat. Egy gént tartalmaz például a szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) virionja, míg a potyvirusokban a gének száma 10, a reovirusokban 12. Minden nyílt leolvasási szakasz (open reading frame, ORF) elején egy kezdő szignál, a végén pedig egy stop kondon (termination signal) foglal helyet. Ez a szakasz egy peptid vagy polipeptid leolvasására ad lehetőséget, amelynek nagysága a leolvasási szakasz hosszától függ. Ha a stop kodon gyenge, akkor ezt a riboszómák átolvashatják, és egy, a korábbinál hosszabb polipeptid szál is keletkezik (read-through protein). Ritkán átfedő (overlapping) gének is vannak egy nukleinsavszakaszon, ami azt eredményezi, hogy azon a szakaszon akár két fehérjetermék is képződhet. Gének lehetnek a negatív szálon is (pl. tospovirusok), de ez esetben ezek megnyilvánulása egy mRNS szintézisétől függ.

A fehérjetermékek feladatuknak megfelelően az alábbiak szerint csoportosíthatók: 1. strukturális fehérjék (pl. köpenyfehérje); 2. replikációban szereplő enzimek (proteázok, polimerázok, helikázok); 3. transzport-fehérjék, amelyek a vírus növényen belüli elterjedését, a fertőzés szisztemizálódását biztosítják; vagy 4. ún. segítő (helper) fehérjék, amelyek a vektortevékenységet fajlagosan segítik.

2.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános meneteA fertőzés után a pozitív (+) szálú RNS-vírusok (67. ábra) replikációjuk első lépésében fehérjeburkukat veszítik el, deproteinizálódnak. A folyamat az 5’ végen kezdődik el, és lehetővé teszi a nukleinsav (80S) riboszómákhoz történő kapcsolódását és az első géntermék, legtöbbször egy polimeráz enzim szintézisét. Ennek az RNS-től függő RNS polimeráz enzimnek (replikáz) segítségével a pozitív szálról egy negatív szálú (–) minta- (templát) RNS íródik át. A negatív szál bázissorrendjében a kiegészítő nukleotidokat tartalmazza, tehát tükörképe a pozitív szálnak. A két szál együtt egy kettős szálú RNS-nek felel meg, amit replikatív formának (RF) nevezünk. Ennek az átmeneti formának a jelenlétét több gazda–vírus kapcsolat [pl. árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus)] esetében sikerült bizonyítani. A továbbiakban a negatív szálról indul meg több ponton is a pozitív szálak szintézise. Ezt a csak részben kétszálú, de már több (+) egyszálú RNS-t tartalmazó formát



replikatív intermediernek (RI) nevezzük. A replikáció helye víruscsoportonként eltérő is lehet, történhet a sejtmagban, a citoplazmában a kloroplasztiszok határán vagy a citoplazma elkülönült helyein (viroplazma).

67. ábra - A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a növényi sejtben. A: fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D: vírusreplikáz (vagy egy része), E: a replikatív forma keletkezése, F: replikatív intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H: összeépülés, I: kész virionok, RF: replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi) RNS [Érsek és Gáborjányi, 1998 után]

A templát RNS a 3’-végtől íródik át. A VPg és köpenyfehérje (5’-végen vannak) a fehérjeszintézis elkezdésében játszik szerepet. Az egyes genomnál kisebb, azaz szubgenomi RNS-ek szintézisét szintén a replikáz enzim komplex szabályozza. Néha [pl. tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] az RNS szintézisében (pontosabban az RNS-től függő RNS polimeráz komplex képzésében) a gazdanövény fehérjéi (host coded proteins) is részt vesznek. A vírusfertőzés eredményessége (a gazdanövénykör kialakulása) attól is függ, hogy mennyire képes a kórokozó a gazdanövény fehérjéit saját nukleinsav-szintéziséhez felhasználni.

Az egyszálú, de negatív értelmű RNS-ek replikációja (tospovirusok) pozitív templát RNS segítségével valósul meg. A kettős szálú DNS-vírusok (caulimovirusok) replikációja szintén mRNS szintézisét igényli, erről a mRNS-ről fordított transzkripcióval képződik a pozitív szálak szintézise. E speciális eseteket a következő fejezetben tárgyaljuk.

2.4. A génkifejeződés általános módjaiA vírus-nukleinsav második funkciója hírvivő (messenger) RNS jellegű, feladata a génkifejeződés biztosítása. A



transzlációkor a genomnak csak az 5’ végi, első nyílt leolvasási szakasza fejeződik ki polipeptid formájában, a többi „néma” marad. A vírusoknak a teljes génkifejeződéshez többféle stratégiát, egyszerre esetleg több módszert kell választani ahhoz, hogy minden génje expresszálódjék. Erre több lehetőség is van. Az első esetben a) a genom osztatlan (bennük belső stop szignál nincs), egyetlen poliprotein képződik, ami később, a transzláció után hasad funkcióképes alegységekre; b) a genom osztottságából adódik, a multikomponens-vírusok minden virionja (általában) csak egy-egy RNS-darabot foglal magában, ezek az RNS-ek csak egy (vagy két) gént hordoznak; c) a genomban több gén is van, a belső szakaszok leolvasását egy vagy több, a genomnál kisebb, azaz szubgenomi RNS szintézise előzi meg. Ezek a szubgenomi RNS-ek már csak egy (vagy két) rövidebb gént tartalmaznak. Egy vírus génkifejeződéséhez egyszerre több szubgenomi RNS-t is felhasználhat; d) ha a 3’ vég zárószekvenciái gyengék, lehetővé válik a stop kodon átolvasása és egy hosszabb szál szintézise is. Az így képződött átolvasott fehérje (read-trough protein) hosszabb szekvenciái tehát részben azonosak a rövid száléval. Hasonló a mechanizmusa a különböző leolvasási fázisokban keletkezett (transframe) fehérjéknek is. Ez esetben e) egy fehérje szintézise még nem ér véget, de a másik fehérje szintézise már megkezdődhet.

3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekbenA növénypatogén vírusok a génexpresszióhoz az alapvető lehetőségeket vírusnemzetségenként jellemző módon, egy formában, vagy különböző kombinációkban valósítják meg (Foster és Taylor, 1998). Ez a forma egyes nagyobb csoportok esetében hasonlóságokat mutat, ami alkalmas új vírusrendszer alapjainak felvázolásához is. Az alábbiakban csak néhány jól ismert stratégiát mutatunk be.

3.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékekA potyvirusok [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic potyvirus), szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) stb.] virionjai helikálisak, kb. 700 nm hosszúak. Az egyszálú (+) RNS genom mintegy 10 000 nukleotidot tartalmaz. 5’ végén VPg van, 3’ vége poliadenilált. Az első, mintegy 85–205 nukleotid nem kódoló régiót egy hosszú leolvasási szakasz követi, amiről egyetlen (350–360 kD) hosszú poliprotein-prekurzor íródik át, amit a vírus által kódolt proteázok vágnak el a transzláció után funkcióképes fehérjékké. A potyvirusok génkifejeződésének szabályozását valószínűleg e különböző fehérjék időben eltérő megjelenése teszi lehetővé (Riechmann et al., 1992).

A potyvirusok génkifejeződését a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) példáján mutatjuk be (Riechmann et al., 1992) (68. ábra). Az első géntermék (P1 fehérje) biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott, de ismert, hogy proteolitikus aktivitású és transzport-fehérje funkciót is betölthet. A fertőzött levelek epidermiszsejtjeiben zárványok formájában halmozódik fel. A második végtermék a levéltetűvel történő átvitelt segítő fehérje (helper komponens, HC-Pro) szintén többfunkciós jellegű, nemcsak a vektorátvitelben van szerepe, de a floemben történő transzportban is. A fehérje C terminális része proteáz jellegű. A sejtekben amorf zárványokat alkot. A harmadik polipeptid (P3 protein) szerepe jórészt ismeretlen. Részt vehet a proteolitikus hasítás szabályozásában. A 6K1 és 6K2 fehérjéknek – szekvenciájuk alapján – a replikációban, a VPg mebránhoz kötésében van jelentőségük. A henger vagy forgó kerék (szélkerék) alakú citoplazmikus zárványfehérje (CI) a potyvirusok legjellemzőbb terméke. Helikáz-aktivitású. A kis sejtmagi zárványfehérje (NIa) proteáz-aktivitású, és felelős a poliprotein nagyobbik részének hasításában. A genomhoz kötött protein (VPg) az RNS pozitív szálak szintézisének megindításához szükségesek. A nagy sejtmagi zárványfehérje (NIb) anyagáról feltehető, hogy ez az RNS-től függő RNS-polimeráz, ami a CI, a VPg(NIa), valamint a 6K 1 és 6K2 fehérjékkel együtt a replikációs komplex egyik tagja. A hosszú polipeptidlánc utolsó származéka a kapszid- vagy köpenyfehérje (CP). Szerepe – a nukleinsavat védő funkcióján kívül – a gazdaspecifitásban és a levéltetűvel történő átvitelben van. A potyvirusok taxonómiája elsősorban a köpenyfehérje eltérésein alapul. A CP N terminális része igen változékony, vírus- és törzsspecifikus eltéréseket tartalmaz. A középső régió erősen konzervatív, ez felelős a sejtről sejtre terjedésért és a vírus összeépüléséért. A C és az N végek a virionok felületén helyezkednek el.

68. ábra - A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al.,



1991 után]

A potyvirusok jellegzetes replikációjában az egyes fehérjetermékek azonos, tehát ekvimoláris mennyiségben termelődnek. Ahhoz, hogy egyetlen köpenyfehérje-molekula kialakuljon, az egész nukleinsavnak újra transzlálódnia kell. Ennek a „gazdaságtalan” termelésnek egyrészt az a következménye, hogy kevés a növényben felhalmozott burok- (kapszid-) fehérje és virion mennyisége, másrészt a bioszintézis más „felesleges” termékei zárványok formájában halmozódnak fel.

3.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinekA tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) a Comovirus nemzetség típus tagja. A vírusnemzetség hazai képviselője a vöröshere tarkulás vírus (red clover mottle comovirus). A genom két (+) RNS szálra osztott (M és B); ezek külön-külön, azonos méretű (30 nm) izometrikus virionokban enkapszidálódnak. A rövidebb M szál 3481 nukleotidból (nt) áll. A hosszabb B szál 5889 nt nagyságú. Mindkét szál 5’ végén kovalens kötésű VPg található, a 3’ végén poliadenilált. Mindkét szál első 44 kezdeti szekvenciáiban, illetve a szálak adenilált része előtti szakaszaiban nagy a hasonlóság. Ez utóbbinak valószínűleg a köpenyfehérje-felismerésében van szerepe (69. ábra).

69. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után]

Az egyes szálak külön replikálódnak. Mindkét szál replikatív formáját a fertőzött levelekben azonosították, és csak egy-egy leolvasási szakaszt tartalmaznak. A replikáció során így mindkét szálról csak egy poliprotein (105 és 202 kD) szintézise valósul meg, amelyek a transzláció után proteolitikusan alegységekre hasadnak. A protoplasztok fertőzésekor kimutatható első hosszú polipeptid (202 kD) többlépcsős hasadási termékei közül egy (32 kD) proteáz-aktivitású, míg az 58 kD-os fehérje a replikáz enzim része, de ugyanennek a poliproteinnek a terméke a 4 kD nagyságú VPg is. A 110 kD nagyságú replikáz enzim is a B komponensben kódolt. Ha a protoplasztokat csak a B komponenssel fertőzték, akkor virionok nem képződtek. Eredménytelen volt a protoplasztok fertőzése akkor, ha azokat csak a rövidebb komponenssel fertőzték. Az eredménytelenség oka – ma már nyilvánvalóan – arra vezethető vissza, hogy a replikáz enzim kódja a B RNS-hez kötött. Ha a két komponens a fertőzéskor együtt volt, akkor a fertőzés eredményes volt, és komplett virionok is képződtek. A virionokhoz szükséges két köpenyfehérje (37 és 23 kD) ugyanis az M szálon kódolt, hasonlóan az 58 és 48 kD nagyságú fehérjékkel, amelyek a sejtről sejtre terjedés feltételeit biztosítják. A 48 kD nagyságú fehérjét a membránokból izolálták. Mindezek a peptidek egyetlen polipeptid (105, illetve 95 kD) hasadási termékei, ezt az elsődleges terméket azonban – valószínűleg gyors bomlása miatt – a fertőzött protoplasztokból nem lehetett



kimutatni. Mindkét elsődleges poliproteinszál hasítását a B komponensben kódolt (24 kD) fehérje végzi (Goldbach és van Kammen, 1985; Rezelman et al., 1989).

A vírusszintézisben a B komponensben kódolt 60 és 58 kD, illetve 110 kD fehérjék mellett részt vesznek a gazdanövény polimeráz emzimei is, amelyek jelenlétét sikerült a fertőzött növényekből kimutatni (Dorssers et al., 1984). A replikáció helye a citoplazma, a virionok a sejtfal mellett tubuláris szerkezetű formákból, a viroplazmából mutathatók ki, majd a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel.

A comovirusokhoz hasonló replikációs stratégiát követnek a nepovirusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) és a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)] is.

3.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNSA rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) a gabonaféléket hazánkban is gyakran fertőző, jól ismert kórokozó. Három részre osztott genomja 8243 nukleotidot tartalmaz (Ahlquist et al., 1984; Ahlquist, 1987). Az egyes nukleinsavszálak mellett az izometrikus (30 nm) virionokba még egy kis szubgenomi RNS is enkapszidálódik úgy, hogy cukorgradiens-centrifugálással csak három nukleinsavat tartalmazó [nehéz (B), közepes (M) és könnyű (L) frakció különíthető el] (70. ábra). A nehéz, B szálban egy hosszú nukleinsavszál (RNS1) van, a középsőben két kisebb (RNS3 és a szubgenomi RNS), míg a harmadik frakcióban ugyancsak egy szál (RNS2) foglal helyet. A fertőzött növényből azonban egy negyedik, nukleinsavat nem tartalmazó üres köpenyfehérje-kagylókból álló (T), ún. felső frakció is elválasztható.

70. ábra - A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után]

Az RNS1 3234, az RNS2 2865 és a RNS3 2144 nukleotidot tartalmaznak. Minden szál 5’ végén metil-guanozin „sapkát”, 3’ végén tirozin megkötésére alkalmas traszfer-RNS-hez hasonló másodlagos szerkezetet hordoz. Elvileg minden nukleinsavszálon egy gén foglal helyet, azaz egy leolvasási szakaszt tartalmaz. Ez alól kivétel az RNS3, amelyen két, fehérjének megfelelő leolvasási szakasz is helyet foglal. A két gén között rövid, mintegy 250 nukleotid hosszúságú nem kódoló szakasz is van, amiből mintegy 20 adenilált.

A replikációs stratégia lényege a genom osztottságából ered. Az RNS-eken csak egy leolvasási szakasz van, ami egy-egy fehérje szintézisét teszi lehetővé. A harmadik RNS-szál azonban két cisztront is tartalmaz, a 3’ vég felé eső részen foglal helyet a köpenyfehérje-gén. Ez egy új, genomnál kisebb, 0,9 kilobázis nagyságú szubgenomi RNS szintézisén keresztül olvasódik le. A szubgenomi RNS maga is hasonló a genomi RNS-ekhez, amennyiben ez is 5’ végén „sapkát” hordoz, 3’ vége pedig szintén tRNS-jellegű. A szubgenomi RNS maga is enkapszidálódik



az RNS3-al, együtt alkotva a középső (M) frakciót.

Az RNS1 terméke (109 kD) részt vesz az RNS-replikációban, metil-transzferáz- és helikáz-aktivitása van. Az RNS2 által kódolt fehérje (94 kD) szintén részt vesz a replikációban (valószínűleg ez az RNS-függő RNS-polimeráz enzim). Az RNS3 olyan fehérje (32 kD) szintézisét irányítja, ami a vírus növényen belüli elterjedését segíti (transzport-fehérje). A negyedik termék – amelynek szintézise a rövid szubgenomi RNS-től függ – a köpenyfehérje (20 kD).

A replikáció – feltehetően a genom osztottsága miatt – igen gyors és nagyon hatékony. Mind a négy kettős szálú RNS (dsRNS) kimutatható a fertőzött protoplasztokból. Először a hosszabb RNS-ek termékei jelennek meg, majd az idő haladtával túlnyomóvá válik a köpenyfehérje szintézise. A különböző bromovirusok egyes komponensei (például az RNS3) annyira hasonlóak, hogy azok egymással kicserélhetők [tehénborsó klorotikus tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus)] (pszeudo-rekombináció). A vírustörzsek, esetleg vírusfajok közötti rekombináció a faj számára nagy evolúciós előnyt jelenthet, az új kombinációk a természetes szelekció révén vagy állandósulhatnak, vagy eltűnhetnek.

A bromovirusok a sejtmagban [pl. lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus)] replikálódnak, de az új virionok a citoplazmában (esetenként viroplazmában) halmozódnak fel. A bromovirusokhoz hasonló replikációs utat követnek a cucumovirusok [pl. uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], a hordeivirusok [pl. árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus)] és az ilarvirusok [pl. alma mozaik vírus (apple mosaic ilarvirus)], valamint a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Utóbbi kórokozó e szempontból azért érdekes, mert a nukleinsav-replikáció kezdeményezésében a köpenyfehérjének különleges szerepe van.

3.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ekA dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a tobamovirus nemzetség típustagja. A legrégebben és legrészletesebben tanulmányozott víruskórokozó. A genom egy pozitív szálú, 6395 nukleotidból álló RNS. Teljes szekvenciája 1982 óta ismert (Goelet et al., 1982). Az 5’ végen 7-metil guanozin sapka (m7Gppp), a 3’ vég tRNS-szerű (hisztidint kötő) másodlagos szerkezetű. Az RNS 3’ végétől kb. 1000 nukleotid távolságra a köpenyfehérjét specifikusan felismerő és megkötő szekvenciák helyezkednek el. Az RNS első 70 nukleotidja és a 3’ vég utolsó szekvenciái fehérjét nem kódoló szakaszok.

Az első leolvasási szakasz egy 126 kD nagyságú fehérje szintézisét teszi lehetővé. Ezt egy gyenge stop kodon (UAG) követi, ami lehetővé teszi annak „átolvasását” és ezen keresztül a második leolvasási szakasznak megfelelő, az előbbinél hosszabb fehérjeszakasz (183 kD) szintézisét eredményezi (71. ábra). E fehérje 5’ vég felőli része szekvenciájában teljesen azonos a 126 kD fehérjével. Az átírt szakasz, ami a harmadik leolvasási szakasznak felelne (ORF3) meg, elvileg egy önálló (54 kD) fehérje lehetne, ezt a fehérjét azonban a fertőzött növényekben nem találták meg. Mind a 126, mind a 183 kD fehérje RNS-től függő RNS-polimeráz, tehát maga a replikáz enzim.

A belső gének további kifejeződése szubgenomi RNS-ekhez kötött. Az I 2 szubgenomi RNS két leolvasási szakaszt (ORF4 és ORF5) is tartalmaz, amelyek közül csak az első (ORF4) nyilvánulhat meg. Ennek terméke a 30 kD nagyságú peptid, transzport-fehérje, tehát a sejtről sejtre történő terjedésben van szerepe. A belső leolvasási szakasz (ORF5) transzlációja csak egy újabb, egycisztronos, kis szubgenomi RNS (sRNS) révén valósul meg. Az ORF5 a köpenyfehérje (17,6 kD) kódját foglalja magában. Mindkét szubgenomi RNS-t (I 2 és sRNS) a fertőzött növényekből izolálták. Érdekes, hogy a két szubgenomi RNS közül csak az sRNS metilált. A rövid sRNS gyors és nagy tömegű köpenyfehérje szintézisét teszi lehetővé. A köpenyfehérje szerepe többoldalú, egyrészt védi a nukleinsavat a káros külső hatásoktól, másrészt részt vesz a kompatibilitási viszonyok kialakításában is.

A vírusreplikáció általános menete a A vírusnukleinsav replikációjának általános menete című fejezetrészben ismertettek szerint történik. A sejtbe került virionokról – valószínűleg több pontból kiindulva – a köpenyfehérje elemésztődik, szabaddá válik az RNS 5’ vége, ahonnan a 80S riboszómákon megindul az első két ORF-termék szintézise. Mindkét fehérje részt vesz annak a replikációs komplexnek a kialakításában, amiben a gazdanövény által kódolt fehérjéknek is meghatározó szerepük van. A vírusspecifikus RNS-től függő RNS-polimeráz a membránhoz kötött poliriboszómákhoz (30 000 g frakció) kötődik. Ez katalizálja mind a pozitív, mind a negatív szál szintézisét. E frakcióból mind a replikatív forma (RF), mind a replikatív intermedier (RI) jelenléte kimutatható.



A szubgenomi RNS-ek szintézisének szabályozási mechanizmusa kevésbé ismert. A replikáció végén felszaporodó köpenyfehérje felismeri az RNS 3’ véghez közeli (5290–5527 nukleotid közötti), speciális bázispárosodású szakaszait (felismerési régió), és megkezdődik mindkét irányban a köpenyfehérje-korongok nukleinsavval történő összeépülése (assembly) és az új virionok kialakítása. A reakció in vitro körülmények között is végbemegy, egyes esetekben a kötőhelyek a rokon vírusok fehérjéit is felismerik.

A vírusszintézis helye a citoplazma, az endoplazmatikus retikulum speciális része (viroplazma). Felmerült annak a lehetősége is, hogy a kloroplasztiszok is a vírusbioszintézis helyei. Valószínűbb azonban, hogy a vírus-köpenyfehérje és a virionok csak később épülnek be a színtestekbe. A képződött új virionok a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel igen nagy mennyiségben, s gyakran hexagonális parakristályos formába rendeződnek.

A tobamovirusokhoz hasonló expressziót követnek az egyéb tulajdonságaikban távol álló luteovirusok is.

3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripcióA caulimovirusok a kettős szálú DNS-vírusok egyedüli képviselői. Típustagjuk a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Gazdasági kárt nem okoz, tudománytörténeti szempontból mégis jelentős. Kezdetben a magasabbrendű szervezetekre jellemző génállománya miatt került a molekuláris biológiai, majd a biotechnológiai, génsebészeti kutatások homlokterébe. Később a replikációs stratégia különlegessége keltette fel iránta azt a tudományos érdeklődést, amely mind a mai napig tart. Nukleinsav-újratermelése ugyanis egy RNS-től függő DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz enzim működésén alapul. E replikációs mód az állat- és humánpatogén retrovirusokra jellemző, ezért is használják a caulimovirusokra a pararetrovirus elnevezést.

A karfiol mozaik vírus több törzsének a teljes nukleinsavsorrendje már viszonylag korán ismertté vált (Franck et al., 1980; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982). A genom két, bázispárosodással pontosan illeszkedő, kör alakú DNS-szálból áll (72. ábra). A bázispárok száma kb. 8000. A külső (alfa) szál egy helyen szakad meg (gap 1 = kapu), míg a belső (béta) szálon két kapu is van (gap 2 és 3). A genom hat gént, de nyolc elvi lehetőséget tartalmaz.

Az első nyitott leolvasási szakasz (ORF I) terméke a 37 kD nagyságú fehérje, amit a fertőzött levelek sejtfalfrakcióiból lehet kimutatni. Szerepe a plazmodezmák átjárhatóságának biztosítása, tehát transzlokációs fehérjének tekinthető. A második és harmadik gén (ORF II és ORF III) termékei hasonló (18, ill. 15 kD) nagyságúak. Az első (18 kD) a levéltetűvel történő vírusátvitelt segíti (helper protein), az utóbbi (15 kD) strukturális fehérje a virion belsejében van. A negyedik fehérje (57 kD) az ORF IV terméke, a köpenyfehérje előanyaga, belőle származik proteolízissel a köpenyfehérje (42 kD). Az ORF V a leghosszabb leolvasási szakasz, egy RNS-től függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzimet kódol. A hatodik, az ORF VI génterméke a viroplazma-fehérje, szerepe a betegség indukciójában és a tünetek kifejlődésében van. Az utolsó két kis molekulatömegű fehérje (ORF VII és OFRF VIII) szerepe nem kellően ismert.

A caulimovirusok nukleinsav-szintézise különleges módon történik (73. ábra). A sejtbe jutott virionok köpenyfehérje-burkukat elveszítve jutnak el a sejtmagba. Itt a két DNS-szálról a kapukat átfedő RNS-végek leoldódnak és a genom teljes (megszakítás nélküli) kettős kört formál, ún. minikromoszómát alkot. A továbbiakban a szálak közötti kötés fellazul. Az egyik (alfa) szálról mRNS-ek szintézise (19 S és 35 S RNS) indul meg. Közülük a 35S RNS a genom teljes információit hiánytalanul tartalmazza. A replikáció második szakaszában mindkét RNS-szál elhagyja a sejtmagvat és a citoplazmába jut. Itt a 19S RNS a viroplazma fehérjeszintézisét irányítja.

A 35S RNS a viroplazmában kezdi meg egy új DNS- (–) szál szintézisét, tehát egy fordított transzkripciót, azaz RNS-től függő DNS-szintézist (Guilley et al., 1983; Hull és Covey, 1983). A reakciót katalizáló enzimet reverz transzkriptáznak nevezzük. Ehhez hasonló különleges enzim csak az állatpatogén retrovirusokban fordul elő. Így, ha rövid időre is, de egy RNS-templát és a neki megfelelő DNS- (–) szál együtt fordul elő. A későbbiekben a mRNS-t RNázok elemésztik (egy rövid rész megmarad a gap-ek borítására), és a (–) DNS-szálról mint primerről másik (+) DNS-szál képződik (Hull et al., 1987).

Az új DNS-szálak szintézisével lépést tartva történik a köpenyfehérje-szintézis. Az új DNS-szálak a köpenyfehérjével komplett virionokat alkotnak, amelyek elsősorban a viroplazmában vagy azok közvetlen közelében halmozódnak fel.

3.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia



A geminivirusok különlegessége, hogy a genom az amúgy is jellegzetes (18 × 30 nm nagyságú) ikerpartikulumokban egyszálú, kör alakú DNS. Ez lehet egyetlen szál [pl. búza törpülés vírus (wheat dwarf monogeminivirus)], vagy két szál [pl. bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)]. A bigeminivirusok két DNS-szála különböző. A harmadik csoport (hybrigeminivirus) nukleinsava mindkét alaptípusra hasonlít; a két szál hasonló, de nem azonos. Típus képviselőjük pl. a répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top hybrigeminivirus, újabban: beet curly top curtovirus). A geminivirusok replikációs stratégiája több hasonlóságot mutat. Minden geminivirusban megtalálható egy arginin–timin gazdag hurok, és egy rövid, kb. 200 nukleotid nagyságú, fehérjét nem kódoló, közös szakasz.

A replikáció módját legismertebb képviselőjük, a kukorica csíkosság vírus (maize streak monogeminivirus, újabban: maize streak mastrevirus) példáján (Stanley, 1985; Stanley és Davies, 1989) mutatjuk be. Az egyszálú, cirkuláris genom 2687 nukleotidból áll (Mullineaux et al., 1984). A nukleinsavszálon négy nyílt leolvasási szakasz van, kettő a pozitív polaritású, ún. „virionszálon” (V1 és V2), kettő pedig a negatív, ún. „komplementer szálon” (C1 és C2). E két szálrészt egy rövid intergenikus szakasz választja el egymástól. Az első (V1) fehérjetermék (10,9 kD) szerepe ismeretlen, a második (V2) a köpenyfehérje (27 kD). A másik leolvasási szakaszon is két fehérje kódolt (C1 és C2), ezek a replikációhoz szükségesek (74. ábra). A transzláció egyszerre, két irányban megy végbe. Maga a nukleinsav-replikáció kétszálú formák (dsDNS) képzésével, ún. „forgó kerék” (rolling circle) formában valósul meg, amely folyamatban a gazdanövény fehérjéi is szerepet kapnak. A fehérjeszintézis ún. naszcens RNS-primerek segítségével történik (Dhar és Singh, 1995).

74. ábra - A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et al., 1984 után]

A replikáció a sejtmagban történik, ugyanitt halmozódnak fel a kész virionok is, gyakran kristályos elrendeződésben. A citoplazmában granuláris zárványok figyelhetők meg. Számos geminivirus a floem parenchima szöveteiben található nagyobb mennyiségben (Harrison, 1985).

A kétszálú geminivirusok [pl. a bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic bigeminivirus, újabban: bean golden mosaic begomovirus)] szekvenciái – a közös régiótól eltekintve – eltérőek. Elnevezésük szerint a két szál: DNS-A és DNS-B. Ezek felépítése is elkülönül virion részre és komplementer szálra, tehát a transzkripció itt is egyszerre két irányban valósulhat meg. A DNS-A szálon átfedésben a replikációs fehérjék (AC1, AC2, AC3) olvasódnak le. Ezek közül az AC1 elég a replikációhoz, a többi termék csak a hatásfokot növeli. A DNS-A komplementer szál két fehérjét (AV1 és AV2) kódol. Az első szerepe nem ismert, a második a köpenyfehérje. A DNS-B szál virion része és komplementer régiója is egy-egy transzlokációs fehérjét (movement protein) kódol (BV1, BC1). A geminivirusok replikációja a sejtmagban megy végbe, itt jellegzetes fibrilláris citopatológiai elváltozásokat is okoznak. A virionok parakristályok formájában itt halmozódnak fel.

Újabban olyan egyszálú DNS-vírusokat fedeztek fel, amelyek a geminivirusokhoz hasonló felépítésűek, virionjaik izometrikusak, de nem ikervirionokból állnak. Növénypatogén képviselőik pl. a levéltetvekkel terjedő banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top nanavirus) vagy a kabócák útján fertőző kókusz hajtás



leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus). E víruscsalád (Circoviridae) genomja a geminivirusnak mintegy fele (kb. 1 kilobázis). A genom szerveződése távoli hasonlóságot mutat a geminivirusokkal. A hurokképződés itt is megfigyelhető egy fehérjét nem kódoló szakaszon, és feltehetően hasonlóság van a génkifejeződésben is (Chu et al., 1995).

3.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációjaA paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kb. 80–100 nm, változó nagyságú, nem teljesen gömb alakú (teleomorf) virionjait – a többi növénypatogén vírusoktól eltérően – kettős glükoproteid burok veszi körül. A virionban három nukleinsavszál foglal helyet. A leghosszabb (L-RNS) szál (8,9 kb) negatív polaritású. A középső (M-RNS 4,8 kb) és a rövid (S-RNS 2,9 kb) szál kezdeti (5’ végi) szakasza pozitív, végső (3’ felőli) negatív, azaz kettős (ambiszensz) jellegű (75. ábra). A negatív RNS-szál információja csak úgy nyilvánulhat meg, ha róla egy pozitív, azaz messenger aktivitású komplementer szál képződik. E mRNS terméke egy nyitott leolvasási szakasznak megfelelő (331 kD nagyságú) protein. A másik két vírus RNS (M és S) ambiszensz jellege azzal az előnnyel jár, hogy a rajtuk levő gének egyszerre olvasódhatnak le. A pozitív részen ez közvetlenül megy végbe, míg a negatív részről ugyanúgy mRNS segítségével, mint az L (–) szál esetében is történik. A leghosszabb RNS-szál (L) fehérjeterméke 331 kD, ami a nukleinsav-szekvencia alapján feltehetően a polimeráz enzim. Az S-RNS két fehérjét (N 28,8 kD és NS s 54,2 kD) kódol, az M-RNS pedig az NSm-fehérje (33,6 kD) és a két glükoproteid (G1/G2 127,4 kD) szintézisét irányítja (de Haan, 1994).

75. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után]

A replikáció helye a viroplazmában van. A glükoproteid-membrán vagy az endoplazmatikus retikulumból, vagy a Golgi-készülékről szakad le és burkolja be a virionokat. Ennek megfelelően a glükoproteid-burok egy része gazdanövény eredetű, hasonlóan a gerinceseket fertőző bunyavirusokhoz, amelyeknél a glükoproteid-burkokat a gazdaszervezet szolgáltatja.



A tospovirusok különös érdekessége a defektív részecskék képződése. Sorozatos mechanikai átvitelek után glükoproteid-burok nem képződik, ami azzal jár, hogy a burok nélküli vírusrészecskék elvesztik tripsz vektorokkal (Thrips spp., Frankliniella spp. Scirtothrips ssp.) történő átvihetőségüket.

3.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációjaSzatellit vírusok

Már az 1920-as években felfigyeltek arra, hogy egyes, a dohány nekrózis vírussal (tobacco necrosis necrovirus) fertőzött növényekben nemcsak a dohány nekrózis vírusra jellemző 30 nm átmérőjű izometrikus virionokat lehetett kimutatni, hanem azoknál lényegesen kisebb, 18 nm átmérőjű, ugyancsak izometrikus virionokat is. Ezek a szatellit vírus elnevezést kapták, hasonlóan a nagyobb égitestek mellett előforduló kis bolygókhoz (szatellitek). Ezek a csak részben vagy egyáltalán nem önálló virionok egymagukban nem fertőzik a növényeket, csak az őket segítő (helper) vírussal együtt. A satellivirusok jellegzetes képviselője, a szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) replikációjában az őt segítő helper vírustól specifikusan függ. E sajátos függés alapja, hogy a szatellit vírus genomja replikációra képtelen, e folyamathoz a segítő vírus replikáz enzimét használja fel, mintegy a helper vírust parazitálva. A szatellit dohány mozaik vírus mintegy 1200 bázis nagyságú genomja csak egy gént kódol, a saját köpenyfehérje-szintéziséhez szükséges információt tartalmazza. A helper és szatellit virionok köpenyfehérjéje teljesen eltér egymástól. A hosszú, fehérjét nem kódoló szakasz szerepe szinte ismeretlen, feltételezhetően a virion stabilitásában van szerepe.

A szatellit vírusok jelenléte egyes esetekben lényegesen befolyásolja a tünetek megjelenését, azok erősségét. Ennek oka az, hogy a szatellit jelenlétében – feltehetően versengés következtében – visszaszorul a helper vírus replikációja. Hasonló működésű szatellit vírusokat [pl. szatellit köles mozaik vírus (panicum mosaic satellivirus)] is leírtak, de ezek nincsenek egymással rokonságban.

Szatellit RNS-ek

Az 1970-es években Elszász tartományban figyeltek fel a paradicsom járványos pusztulására. A fertőzött növényekből az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) izolálták. A tisztított vírus nukleinsav-vizsgálata azonban azt mutatta, hogy az uborka mozaik vírus három genomi és egy szubgenomi RNS-e mellett még egy ötödik, rövid nukleinsav is előfordult a virionokban enkapszidált formában (Kaper és Waterworth, 1977, 1981). Ez az ötödik, az uborka mozaik vírushoz kapcsolt nukleinsavszál (cucumber mosaic virus associated RNA5, CARNA5) okozta a tünetek súlyosságát, a beteg növények teljes pusztulását. A CARNA5 jelenléte a virionokban nem befolyásolta a levéltetű-átvitelt.

A CARNA5 genom 330–390 bázis nagyságú. A helper vírusához hasonlóan a szatellit RNS 5’ vége metilált (m7Gppp), 3’ végén hidroxilcsoport van. A genomon egytől három nyílt leolvasási szakasz is van, ezek azonban in vivo fehérjét nem kódolnak. A szatellit vírusokhoz hasonlóan a szatellit RNS-ek jelenléte az inokulumban jelentősen csökkenti a fertőzőképességet. A helper vírus RNS1 és RNS2 egyes szakaszai komplementerek a szatellit RNS-sel, illetve maguk is képesek megkötni a helper vírus köpenyfehérjéjét. Ez a térszerkezet teszi lehetővé a szatellit RNS-ek beépülését a helper vírus virionjaiba.

A helper vírusokhoz hasonló felépítésű szatellit RNS-ek replikációja a helper vírustól függ. Abban az esetben, ha a szatellit RNS nem hasonlít a helper vírusra, akkor egy negatív templáton alapuló, autokatalitikusan bomló kétszálú RNS-ről képződnek az új RNS-szálak (forgó kerék mechanizmus). Ez a viroidokra jellemző replikációs formához hasonló.

Számos vírusnál [pl. földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)] is megfigyelték a szatellit RNS-ek jelenlétét, a nepovirusok körében pedig általánosan előfordulnak (Murant és Mayo, 1982; Francki, 1985). Azt is megfigyelték, hogy a szatellit vírusok jelenléte – a helper vírus replikációjának visszaszorítása révén – csökkentheti is a tüneteket. Harrison et al. (1987) kimutatták, hogy az uborka mozaik vírus szatellit RNS-sel transzformált dohánynövényekben az uborka mozaik vírus tünetei mérséklődtek és replikációja is gátlást szenvedett, a rendszer biológiai védekezésre alkal-mas volt.

A szatellit vírusok annyiban hasonlók a szatellit RNS-ekhez, hogy a) mindkettő genomja rövid, egyszálú RNS; b) a replikációjuk a helper vírustól függ; c) a replikációjuk visszaszorítja a helper vírus replikációját; d) saját RNS-templátjukat használják fel; e) jelenlétük a tüneteket befolyásolja (gyengíti vagy erősíti). Különbség, hogy a szatellit vírusok önálló virionokat alkotnak, míg a szatellit RNS-ek a helper vírussal közösen



enkapszidálódnak.

Szatellit DNS-ek

Újabban a paradicsom levélgöndörödés vírussal (tomato leaf curl bigeminivirus = begomovirus) kapcsolatban szatellit DNS-t mutattak ki (Dry et al., 1998). Ez az első adat arra vonatkozóan, hogy nemcsak szatellit RNS-molekulák, hanem szatellit DNS-molekulák is vannak.

3.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékeiA paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus) esetén kimutatták, hogy a fertőzött növényekben a vírusreplikáció során néha olyan „hibás” virionok is keletkeztek, amelyek nem a teljes genomot, hanem annak töredékeit tartalmazzák (Hillmann et al., 1987). Ennek megfelelően ezek a nukleinsavak homológ szekvenciákat mutatnak az eredeti vírus RNS-sel, deléciós mutánsként is felfoghatók. Általában defektív interferáló RNS-eknek (DI) nevezzük, mert felszaporodásuk a fertőzött növényekben jelentősen gátolja a teljes genomú vírus replikációját és a betegség tüneteit. A defektív RNS-ek replikációja és enkapszidációja teljesen a „helper” vírustól függ. Kialakulásával kapcsolatban kétféle feltevés is van: (1) a replikáció során meghatározott helyeken autokatalitikus vagy enzimatikus hasítással jöttek létre; vagy (2) az RNS-polimeráz a replikáció során ugyanannak az RNS-nek más pontjára „átugrott”. Ez utóbbi feltételezést több kísérleti érv is támogatja (Roux et al., 1991).

Defektív interferáló RNS-ek gyakran fordulnak elő a tombusvirus nemzetségben [pl. cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (cymbidium ringspot tombusvirus)] (Burgyán et al., 1989), de az állatpatogén vagy a gombákat fertőző vírusok között is.

4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődéseEgyes vírusok teljes nukleinsav-szekvenciájának megismerése azzal a meglepő eredménnyel járt, hogy egymástól morfológiailag távol eső (pl. izometrikus és helikális) vírusok virionokat nem alkotó fehérjéinek (tehát nem a köpenyfehérjéknek) a kódjai nagymértékű szekvenciahomológiát mutattak egymással, illetve egyes állatpatogén RNS-vírusok azonos típusú génjeivel. Az nem volt meglepő, hogy egyes taxonómiai egységekben (pl. víruscsaládok) a génkifejeződés hasonló utakat követ, az azonban igen, hogy rendszertanilag igencsak távoli taxonok replikációs stratégiája is azonos megoldásokon alapszik (Matthews, 1985).

Felvetődött, hogy maga a növény- és állatpatogén vírusok merev elkülönítése is mesterséges, és valójában e két fő – eddig mereven elkülönített – víruscsoport evolúciós rokonságban van egymással. Azoknak a víruscsaládoknak a megismerése, amelyek egyes tagjai állat-, mások növénypatogének (Reoviridae, Rhabdoviridae és Bunyaviridae), megerősítették ezt a feltételezést.

4.1. Vírus-„szupercsaládok”Picornavirusokhoz hasonló növényvírusok

A comovirusok [pl. tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a nepovirusok [pl. paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)], és bizonyos mértékig a potyvirusok [pl. burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus)] közös tulajdonságokat mutatnak a Picornaviridae családba tartozó poliovirusokkal. Közös tulajdonságaik a következők: 1. az egyszálú (+) RNS genom VPg-t hordoz az 5’ végen, a 3’ vég pedig poliadenilált; 2. a géntermékek egy hosszú poliproteidből transzláció után hasadnak egy vírus által kódolt proteáz segítségével; 3. a genom több hasonló szerepű, nem-szerkezeti fehérjét kódol, amelyek aminosav-szekvenciája meglehetősen hasonló (g 20%); 4. az ún. konzervált szekvenciák a genomban hasonló elrendezésűek (76. ábra).

76. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok fehérjegénjeinek hasonló elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus). VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat jelölik [Matthews, 1985 után]



Bár az említett vírusok köpenyfehérjegénjei igen különbözőek, mégis mind a comovirusok, mind a poliovirusok izometrikus virionjai kétféle köpenyfehérjéből hasonló módon épülnek fel (Goldbach, 1986). A potyvirusok némileg elkülönülő csoportot alkotnak, ezek köpenyfehérje-génje ugyanis az RNS-szál 3’ végén helyezkedik el.

Sindbisvirusokhoz hasonló növényvírusok

Az elmondottakhoz hasonlóan nagy meglepetést okozott az a felfedezés is, hogy egyes, felépítésükben ugyancsak eltérő (izometrikus és helikális, osztatlan és osztott genomú) növénypatogén vírusok (Alfamovirus, Bromovirus, Tobamovirus) hasonló transzlációs stratégiát követnek. Közös jellemzőik az alábbiak: 1. az egyszálú (+) RNS genom 5’ végén sapka van, ugyanakkor a 3’ vég eltérő lehet; 2. a lucerna mozaik vírus és a rozsnok mozaik vírus RNS1 és RNS2 által kódolt fehérjék három szakaszban (mintegy 250–300 aminosav) nagy szekvencia-homológiát mutattak egymással, valamint a dohány mozaik vírus 126 és 183 kD fehérjéivel; 3. e fehérjék szerepe a vírus-RNS-szintézisben van, polimeráz-aktivitásúak; 4. hasonlóság mutatkozik mindhárom esetben a kb. 30 kD fehérjék és a köpenyfehérjék szintézisében is, ami szubgenomi RNS-ek segítségével valósul meg (77. ábra). A dohány mozaik vírus átírt fehérje (183 kD) és a rozsnok mozaik vírus RNS2 terméke aminosav-szekvenciájában, valamint a gének elrendeződésében hasonló a Togaviridae család gerincteleneket és gerinceseket egyaránt fertőző sindbisvirusokhoz.

77. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) genomszerveződésének hasonlósága a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV = lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus, TMV = dohány mozaik vírus, CP = köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok [Matthews, 1985 után]

A luteovirusok szupercsaládja átmeneti típus-e?

Újabban egyre több bizonyíték szolgál annak erősítésére, hogy a luteovirusok is egy önálló szuperfamília alkotói lehetnek. E csoportba a tombusvirusok, a dianthovirusok, a hordeivirusok és a luteovirusok, esetlegesen a sobemovirusok tartoznak, részben a szekvencia-homológia, részben a gének működése és elrendezése alapján. A csoportnak közös vonásai vannak a Sindbis és a Picornavirus szupercsaláddal, lehetséges, hogy összekötő kapocsként szerepelnek e két taxonómiai csoport között. Mindezek a lehetőségek már a jelenlegi vírustaxonómiában is tükröződnek.



Pararetrovirusok: a retrovirusokhoz hasonló növényvírusok

Korábban azt gondolták, hogy csak a gerinceseket fertőző, tumort okozó RNS-vírusok replikációja történik fordított transzkripcióval, azaz a reverz transzkriptáz segítségével. Később igazolták, hogy egyes DNS-vírusok, mint pl. a hepatitisz B-vírus vagy a növénypatogén karfiol mozaik vírus hasonlóan replikálódnak. A retrovirusok reverz transzkriptáz enzime hasonló szekvenciákat mutat, mint a hepatítisz B-vírus vagy a karfiol mozaik vírus reverz traszkriptáz enzim, utalva e vírusok rokonságára. Hasonlóságot fedeztek fel a proteázok és endonukleázok megfelelő szakaszain is.

4.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődésérőlAz állat- és a növénypatogén vírusok aminosav-szekvenciáiban talált hasonlóságok felvetették a vírusok evolúciós rokonságának kérdését. Hogyan lehetséges, hogy az állat- és a növényvilág már 1,2 × 10 9 évvel ezelőtt olyan elvált, genetikai parazitákkal rendelkezik, amelyek génjei hasonló elrendeződésűek és hasonló fehérjéket kódolnak?

A vírusok törzsfejlődésére vonatkozólag több hipotézis is van: 1. a vírusok közös eredetűek (monofiletikus származás), azaz közös őstől erednek, és ökológiai tényezők miatt különültek el az eltérő gazdaszervezetek alapján; 2. az eredetileg különböző eredetű vírusok párhuzamos evolúció során váltak hasonlókká (polifiletikus származás), vagyis az azonos feladatot betöltő fehérjék hasonló szerkezetűekké váltak. A 3. feltételezés szerint a vírusok egymástól függetlenül fejlődtek ki, úgy, hogy a gazdaszervezettől transzdukcióval hasonló, a replikációhoz szükséges, önálló, konzervált géneket vettek át (Goldbach, 1986).

A lehetséges változatok közül az első feltevés a legvalószínűbb, tehát az, hogy a vírusok közös eredetűek, és a különböző irányú evolúció következményeként eltérő vírusok fejlődtek ki, amelyek azonban magukon viselték a rokonság konzervatív bélyegeit. E felosztásnak megfelelően a növénypatogén RNS-vírusok eddig két szupercsoportba (Picornavirus és Sindbisvirus) sorolhatók, más állatpatogén vírusokkal együtt. Ennek jó példáját mutatja a comovirusok és a poliovirusok hasonlósága. Ugyanebbe a Picornavirushoz hasonló csoportba oszthatók az egykomponensű potyvirusok és a kétkomponensű nepovirusok is. A másik szupercsoportot a Sindbisvirusokhoz hasonló növényi vírusok alkotnák, amelyhez a bromovirusok, cucumovirusok és tobamovirusok tartoznak. Az említett szupercsoportok bár nagy morfológiai eltéréseket mutatnak, ezek azonban éppen a belső extracelluláris lehetőségekhez való alkalmazkodást tükrözik. Ennek eredménye lehet az, hogy különösen a védő szerepet betöltő köpenyfehérje mutatja a legváltozatosabb formákat, a legnagyobb eltéréseket. Ugyancsak nem meglepő, hogy a vírustörzsek (pl. a potyvirusok esetében) általában a köpenyfehérje-szekvenciákban térnek el leginkább egymástól.

Hasonlóan szuperfamíliaként lehet kezelni azokat a vírusokat is, amelyek sajátos replikációjuk folytán reverz transzkripciót követnek. A caulimovirusok e tekintetben a retrovirusokhoz hasonlóak, a pararetrovirusok csoportját alkotják.

A vírusok újszerű csoportosításában eltűnik a megszokott különbség a genom osztottsága és osztatlansága között. E tekintetben az evolúciós előny mindenképpen a multikomponens-vírusoké. A genom osztottságából adódó előnyök a következők: a) az RNS-ek gyors rekombinációs újrarendeződésére adnak lehetőséget; b) megnövelhető a genom mérete (nincsenek enkapszidációs problémák); c) csökken a mutagén és károsító hatások lehetősége, javul az RNS-replikáció megbízhatósága; d) könnyebbé válik a transzláció önellenőrzése, a termékek arányainak önszabályozása; e) a kis virionok vektorokkal történő átvitele könnyebbé válik, egyszerűbb lesz a virionok mozgása a növényen belül (Goldbach, 1986).

Mindezek az előnyök azonban egy esetben, a mechanikai átvitelben bizonyos mértékig eltűnnek. Míg az egykomponensű vírusok fertőzéséhez elvben egyetlen virion is elegendő, az osztott genomú vírusoknál ez többszörös, hiszen a fertőzés helyén, ugyanabban a sejtben egyszerre minden komponensből legalább egynek jelen kell lennie ahhoz, hogy a fertőzés eredményes legyen. A rovarokkal vagy a maggal történő vírusátvitel esetén ez biztosított is, ezért lehetséges az, hogy a növénypatogén vírusok körében gyakori a genom osztottsága. Evolúciós szemszögből tekintve az osztott genom fejlettebb formát jelent (Goldbach, 1986).

Az állat- és növénypatogén vírusok közös eredetének több bizonyítéka van. Több rovarpatogén RNS-vírus is növényi betegségeket okozhat. Feltehetően ez a csoport a legújabb idők evolúciós terméke. A növénypatogén vírusok egy részét ugyanis rovarok terjesztik, közülük több (rhabdovirusok, luteovirusok, reovirusok, marafivirusok, tenuivirusok, tospovirusok) a rovar testében is replikálódik. Ugyanakkor ismertek olyan RNS-rovarvírusok is, amelyek emlősöket is fertőznek. A rovarpatogén vírusok között több az RNS jellegű. Feltételezések szerint a növénypatogén comovirusok és a gerincespatogén picornavirusok ilyen közös



rovarvírusoktól származnak. A rovarpatogén RNS-vírusok között osztott genomú is van (nodamuravirusok). Ez a forma a növénypatogén vírusok esetében gyakori, az állatpatogéneknél azonban nem fordul elő. A rovarpatogén RNS-vírusok e tekintetben is összekötő láncszemet, evolúciós átmenetet jelentenek a növényvírusok származására.

Az evolúció mechanizmusa

A vírusok gyors változásokra képesek, hamar alkalmazkodnak a megváltozott körülményekhez. E változások hosszú evolúció eredményei, és ebben szerepet játszott a gazdaszervezettel való tartós együttélés, alkalmazkodás, együttes fejlődés, a koevolúció is. Ismert, hogy egyes víruscsoportok melyik földrészen fordulnak csak elő, vagy az, hogy pl. a tymovirusok Európában vagy Amerikában stb. eltérőek. Egyes vírusok földrajzi eredete is jól meghatározható (pl. burgonyapatogén vírusok). A vírusevolúció ma is tartó folyamat, amelynek mozgatórugói a genomot érő külső hatások.

Általában a legnagyobb evolúciós erőt a mutációk, a rekombinációk, a gének újrarendeződése (gene reassortment), esetenként a gének megkettőződése vagy kiesése jelenti, de lehetséges egyes növényi gének átvétele is (Roossinck, 1997). A génekben történt kis szekvenciaváltozások összegeződve a vírusok mikroevolúcióját eredményezik, míg a nagyobb szakaszokat érintő génkicserélődések következménye a biológiai funkciók erőteljes változásával járó makroevolúció.

A géneket károsító erők minden élő szervezetre egyaránt hatnak. A növényvírusfajok nukleotid szekvenciái azonban – összevetve más fajokkal – igen nagy eltéréseket mutatnak, bizonyítva, hogy ezek a hatások a vírusok esetében kifejezettebben érvényesülnek. Ennek okai a növényvírusok jellegéből fakadnak.

A növénypatogén vírusok túlnyomó többségét jelentő (+) RNS-vírusok replikációja az RNS-től függő RNS-polimeráz enzimhez kötött. Az átírás hibaszázaléka magas, 10–4, ami 10 kilobázisonként átlagosan egy tévedést jelent. Ennek oka az, hogy az RNS-polimeráz működéséhez nem igényli a bázispárosodást, tehát kevéssé függ a primer jelenlététől. Káros oxidációs hatások gyakran okoznak a genomban mutációkat. Egy sejtet átlagosan egyetlen nap mintegy 10 000 „ütés” ér, amit a szervezet reparáló hatásai legtöbbször hatástalanítanak.

Míg a kettős szálú DNS bázispárosodása miatt a DNS-genom jobban védett a mutagén hatásoktól, addig az RNS-genom ezekkel szemben sokkal érzékenyebb, ami újabb és újabb vírustörzsek kialakulását eredményezheti. E módosulások az egyes vírustörzseknél a gazdanövénykör szűkülését vagy tágulását egyaránt eredményezhetik (Roossinck, 1997).

A rekombináció lehetősége mind az RNS-, mind a DNS-vírusoknál egyaránt előfordul. E hatást leginkább a defektív interferáló (DI) RNS-ek, illetve a vírusok deléciós változatai esetén tanulmányozták, amelyeknél a homológ rekombináció révén a hiányos szekvenciák regenerálódhatnak. Azonos vírusok törzsei vagy hasonló vírusfajok kevert fertőzései is gyakran eredményezhetnek rekombinációt, ami fontos eredő pontja lehet új vírusok, vírustörzsek kialakulásának. A egyes növénypatogén vírusok (luteovirusok, nepovirusok, bromovirusok és cucumovirusok) változékonyságában bizonyított a rekombináció nagy jelentősége (Nagy és Bujarski, 1995; Roossinck, 1997). Az új vírus (törzs) életképességét a természetes szelekció dönti el.

Néhány növényvírusnál bizonyítható a génkicserélődés is, mint a génexpresszió ellenőrző mechanizmusa. A hybrigeminivirusoknál például egyes mesterségesen előállított pszeudo-rekombináns esetén bizonyították egyes génszakaszok újrarendeződését. Hasonló jelenséget figyeltek meg természetes körülmények között az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus) nukleinsavai között is, ahol az RNS3-szál cseréje történt meg. Bár a génkicserélődés nem túl gyakori jelenség, egy új vírus kialakulásában drámai jelentőségű lehet. A vírusok közötti tartós kapcsolat meglepő eredményre vezethet. Ennek példája a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) esete, amelynek RNS1 frakciója a luteovirusokkal mutat rokonságot, míg az RNS2 – amely a replikáz enzim kódját tartalmazza – a carmovirusokhoz és a tombusvirusokhoz hasonló.

Egyes vírusok esetén a komplex fertőzések az RNS-rekombináció vagy a hetero-enkapszidáció révén új konstrukciók kialakulását eredményezik, azaz egy vírusfaj a másik vírusfaj köpenyfehérjéjével burkolódik be. Ez a vektorátvitel megváltozását is jelentheti. E lehetőség kísérletileg bizonyított, így környezetvédelmi szempontból néha joggal vetődik fel az a félelem, hogy a vírusgének felhasználásával előállított transzgenikus növények révén új, patogénebb vírustörzsek is keletkeznek. Napjaink génsebészeti törekvései ezért inkább arra irányulnak, hogy a patogén eredetű rezisztencia kialakítása helyett inkább a növények természetes rezisztenciagénjeit kutassák fel, és ezeket használják fel a genetikailag módosított szervezetek előállítására.



Az evolúciós vizsgálatok felvetik a vírusok eredetére vonatkozó kérdéseket is. Felmerült az az elképzelés is, hogy a vírusok egy sejt előtti, precelluláris világ fosszíliái, amelyek a földi élet kialakulásában és a gének horizontális mobilitásában fontos szerepet játszanak (Roossinck, 1997). Matthews (1991) összefoglaló véleménye szerint a növénypatogén vírusokon belül négy evolúciós csoport körvonalai bontakoznak ki: 1. egyszálú pozitív RNS-vírusok; 2. a növénypatogén reovirusok, rhabdovirusok és bunyavirusok; 3. caulimovirusok és 4. geminivirusok, amelyek feltehetően a prokariotikus szervezetek vírusaiból származnak.


14. fejezet - Szerológiai vizsgálati módszerek1. Immunológiai alapfogalmakA növényvírusok többféle (1–10) proteint kódolnak, amelyekből a zárványfehérjék és a köpenyfehérjék fordulnak elő a legnagyobb koncentrációban a fertőzött növényben. E kettő közül a köpenyfehérjék azok, amelyeket antigénként a leggyakrabban felhasználnak a vírusfertőzés kimutatására (Matthews, 1957; Siitari et al., 1986; Brakke, 1990). A szerológiai reakciók alapelve az a felismerés, hogy ha melegvérű állat vérébe nagy molekulatömegű fajidegen anyag (pl. fehérje) kerül, akkor ez az állat vérsavójában ellenanyag (antitest, immunoglobulinok) képződését indukálja. Az antitestképzés fajlagos, azaz egy antigén hatására csak a neki megfelelő antitest képződik. Az antitestek a nekik megfelelő antigéneket felismerik, így létrejön az immunválasz-reakció, ami lehetővé teszi a kórokozó pontos azonosítását.

1.1. Az immunválaszAz antigén hatására bekövetkező immunválasz molekuláris magyarázata Harlow és Lane (1988), Long és Kindt (1988), Ezquerra és Coligan (1988), továbbá Fox (1988) kutatók nevéhez fűződik.

Az antigén-specifikus antitestképződéshez az állatban háromféle, egymással kölcsönhatásban álló sejt (az ún. antigénhez kapcsolódó sejt, továbbá a T sejt és a B limfocita sejt) összehangolt működése szükséges. Ha az antigén bekerül az állat testébe, az antigénhez kapcsolódó ún. APC sejtek (APC: antigen-presenting cell) a makrofágokhoz hasonlóan bekebelezik és átformálják azt (78A ábra). Ezután a „megemésztett” antigén az APC sejt felszínére kerül, ahol egy speciális, kompatibilis, ún. MHC (MHC: major histocompatibility molecule) molekulához kapcsolódik. A következő lépésben a T sejt – amely mind az átformált antigén, mind pedig az MHC molekula kapcsolódásához alkalmas receptorhelyekkel rendelkezik – összekapcsolódik az APC sejttel (78B ábra). Ekkor az APC sejt felületén létrejön egy három molekulából álló komplex, a T sejt antigénreceptora, az átformált antigén és az MHC molekula között (78C ábra). Ez a komplex az APC és a T sejteket oldékony anyagok, ún. interleukinok (IL-1, IL-2) kiválasztására serkenti, amelyek a T sejteket aktiválják (78D és 78E ábra). Az aktivált T sejtek ezután az antigénhez kapcsolódó B sejtekhez kötődnek. Ekkor a T sejtek elkezdik az IL-4 és IL-5 anyagok termelését, amelyek a B (limfocita) sejtek osztódását és differenciálódását stimulálják (78F ábra). Megfelelő serkentés esetén a B sejt immunoglobulin-genomja közvetlenül antitest képződését indukálja. Ha az állat immunrendszere később ugyanazzal az antigénnel találkozik, az immunoglobulin genom azon része, amely az antigénmegkötő sajátságért felelős, szomatikus mutációk sorozatán megy át. Ezek a mutációk pedig antitestek képződését indukálják, melyek többé-kevésbé affinisak az adott antigénre.

78. ábra - Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után]

Azok a B sejtek, amelyek az antigénnel szemben nagymértékű affinitással rendelkező antitestet képeznek, több és több antigént vonzanak, gyorsan növekednek, osztódnak és még több magas affinitású antitestet képeznek. A


Szerológiai vizsgálati módszerek

T sejtek által kiválasztott IL-5 anyag – más szignálokkal együtt – arra serkenti a B sejteket, hogy vagy rövid (3–4 napos) élettartamú, nagy mennyiségű antitestet kiválasztó plazmasejtekké, vagy pedig hosszú élettartamú, ún. memory (emlékező) sejtekké differenciálódjanak. Az ún. memory B sejtek elsőrendű feladata, hogy reagáljanak egy újabb antigénstimulusra, és nem az antitestek kiválasztása, hanem inkább azok megjelenítése történik meg a felületükön (78F ábra).

Egy anyag akkor antigén, ha egy melegvérű állat sejtjeiben, ill. testnedvében immunválaszt indukál. Antigén sajátságokkal a nagy molekulatömegű anyagok rendelkeznek. Bár az alacsony molekulatömegű anyagok is (pl. a 10–15 aminosavból álló szintetikus fehérjék) megemésztődnek és kifejezésre jutnak az APC sejt MHC molekuláján, túl kis méretűek ahhoz, hogy az APC sejt MHC molekulája és a T sejt receptora egyidejűleg felismerje őket. Egyes esetekben a kis molekulatömegű anyag antigén sajátosságát növelni lehet, ha azt kémiai úton nagyobb molekulatömegű molekulához rögzítjük (Harlow és Lane, 1988).

1.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságaiAz epitóp fogalma és típusai

A vírus-köpenyfehérjének azt a (minimum 5–7 aminosavból álló) szakaszát, amely az antitesttel kapcsolatba lép, epitópnak nevezzük. Egy fehérjén egy vagy több ilyen ún. antigén tulajdonsággal rendelkező szakasz lehet. Az epitópok lépnek kölcsönhatásba az állatok által produkált antitestekkel. Az epitópok különböző típusainak a meghatározására olyan szintetikus peptideket alkalmaznak, amelyek a természetes fehérjék fragmentumai (Jerne, 1974; van Regenmortel, 1988). Az epitópoknak többféle típusa van. A véletlenszerűen összecsavarodott szerkezetű fehérjeszakasz az ún. szekvenciális epitóp. A specifikus szerkezetű fehérjeszakaszt konformációs epitópnak nevezzük, amelyen belül folyamatos (két vagy több aminosavcsoportba tartozó aminosavak kapcsolódnak egymáshoz) és megszakított (két különálló peptidlánc kapcsolódásából, vagy egyetlen összecsavarodott peptidláncból álló fehérjeszakasz) epitópokat különböztetünk meg. A kriptotópok olyan, ún. „rejtett” epitópok, melyek csak az antigén disszociációja, fragmentációja vagy denaturációja után válnak immunogénné. Ha az antitest enzimmel kapcsolt szubsztráton lép az epitóppal kölcsönhatásba, akkor neotópnak hívjuk az epitópot. A metatópok olyan epitópok, melyek a köpenyfehérjének a disszociált és a polimerizált formáján is jelen vannak. A semleges vagy neutralizációs epitópok olyan antitestek felimerésére képesek, melyek a vírus fertőzőképességét semlegesítik.

A fehérjealegységek antigén sajátosságának erőssége attól függ, hogy a molekulán hol helyezkednek el. A hidrofil aminosav-maradványok, amelyek a folyamatos epitópoknak felelnek meg, általában az antigén külső részén vannak. A hidrofób maradványok kevéssé hozzáférhetőek az immunrendszer számára, hacsak a molekula nem denaturálódik. A flexibilis (10–20 nm) mozgással rendelkező epitópok szorosabb kölcsönhatásba lépnek az antitesttel, mint a merev molekulák. Egy molekula hidrofil régiója, mely a szegmentális mobilitásért felelős, a folyamatos epitópnak felel meg. Egy molekula karboxil- és aminocsoport-végei nagyfokú mobilitást tesznek lehetővé. Ezek a terminális részek a molekula felületén elhelyezkedve tipikus folyamatos epitópokat alkotnak. A rövid aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjeszakaszok egyedülálló epitópot képviselnek a diagnosztikai elkülönítésben. Valószínűleg ezek a régiók tolerálják a DNS-mutációkat, mert feltehetőleg nem szerepelnek abban a kölcsönhatási kapcsolatban, amely a molekula összecsavarodásáért felelős (van Regenmortel, 1988).

1.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusaiAz antitestek immunoglobulin-molekulák, amelyek antigén hatására az állat B limfocitáiban (nyiroksejtjeiben) termelődnek. Minden molekulán minimum kettő vagy attól több, ún. paratóp helyezkedik el, amely az antigén epitópját felismerő sajátsággal rendelkezik (Jerne, 1974). Az antitesteket két csoportba soroljuk: 1. a poliklón antitestek több mint egy epitóppal szemben reaktívak, 2. a monoklón antitestek ezzel szemben csak egy epitóppal reagálnak. A szakirodalom az antitest-molekulákat öt immunoglobulin (Ig) osztályba (IgG, IgM, IgA, IgD és IgE), illetve nyolc alosztályba (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 és IgA2) sorolja. Az IgA, IgD és IgE típusú antitestek nem olyan jelentősek, mint az IgG és az IgM antitestek, ezért ezeket a szerológiában csak ritkán alkalmazzák (Harlow és Lane, 1988).

Az IgG, IgD, IgE és az IgA antitest-molekulák mindegyike egy pár nehéz és egy pár könnyű polipeptidláncot tartalmaz (79A ábra). A láncokat diszulfid hidak vagy pl. az IgA2 esetében nem kovalens kötések tartják össze. Az IgM antitestek öt-öt pár könnyű és nehéz láncot tartalmaznak (pentamer szerkezet), míg az IgA két vagy három ilyen párból áll (Barrett, 1988; 79B és C ábra). Az IgG papainnal történő emésztése során a molekula három fragmentumra esik szét. Ezek közül két fragmentum egyforma méretű, nehéz és könnyű láncot egyaránt tartalmaz, és antigénkötő hellyel rendelkezik (Fab fragmentumok). A harmadik fragmentumnak, amely csak a



nehéz láncot tartalmazza, antigénkötő helye nincs (Fc fragmentum) (79E ábra). A Fab és Fc fragmentumok közti régiót ún. „hinge” régiónak nevezzük, amely a molekula flexibilitását biztosítja, ami ahhoz szükséges, hogy a Fab szegmensek egymástól függetlenül is tudjanak működni (79D ábra). Az IgG molekula pepszinnel történő emésztése két Fab fragmentumot eredményez (amelyek egymással diszulfid híddal vannak összekötve), ezenkívül (F(ab’)2) és egy Fc’ fragmentum is keletkezik (79F ábra). A könnyű és a nehéz lánc aminoterminális részén 3–3, híd vagy keret (Fw: framework) által összekapcsolt determináns régió helyezkedik el. Ezek a CDR rövidítéssel illetett helyek (CDR: complementary determining region), és bizonyos mértékig a Fw-k is, a paratópon belül felelősek az antigénhez való kapcsolódásért. A CDR régiók aminosavsorrendje az antigéntől függően változik, ezért ezeket hipervariábilis résznek is hívjuk (79D ábra). A CDR és a Fw régiókon kívül eső rész kevéssé változik egy osztályon, ill. alosztályon belül, ezért ezeket konstans régióknak is nevezzük.

79. ábra - Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990 után]

Az immunizált állatokban elsődleges immunválaszként IgM antitestek képződnek, amelynek koncentrációja a szérumban az immunizálás után 10 nap múlva éri el a maximumát, aztán csökken. Ha az antigén sikeresen indukálja a T sejtek válaszreakcióját, akkor ezután kb. két hét múlva IgG antitestek képződnek, a maximális koncentrációban. Ha ugyanazt az állatot másodszorra is immunizáljuk, akkor az IgM- és az IgG-képződéshez szükséges idő ugyanannyi lesz, mint az első immunválasz során, bár az IgG koncentrációja magasabb lesz (Barrett, 1988). Ha az MHC molekulák inkompatibilisek egy antigénnel szemben, akkor csak IgM antitestek fognak képződni.

1.4. Antigén–antitest kölcsönhatásokAz antigén és az antitestek között hidrogénhidak, ionos kötések, elektrosztatikus vonzóerők, Coulomb-, hidrofób és van der Waal’s erők által létesül kapcsolat (Harlow és Lane, 1988; Sheriff et al., 1987; van Regenmortel, 1988).

A kapcsolódás reverzíbilis, és az affinitás erőssége a hőmérséklettől, a pH-tól és az oldhatósági viszonyoktól függ. Ha ezek a körülmények változnak, az ugyanazon antigénnel és antitesttel végzett vizsgálatok (pl. ELISA) eltérő eredményeket adnak. A stabil, ill. fél-reverzíbilis immunkomplexek az antigén és az antitest közötti többszörös kölcsönhatás eredményeként jönnek létre. A stabil immunkomplexek kialakításának képességét aviditásnak nevezzük. Az IgM típusú antitestek a 10 paratópjukkal többszörös kapcsolat kialakítását teszik lehetővé, és nagyobb antigén-aviditással rendelkeznek, mint az IgG antitestek a maguk két paratópjával (79A és C ábra). Az antitest egy paratópja alacsony affinitású egy antigénnel szemben. Ha ez a gyenge kölcsönhatás megszűnik, akkor az antitest megmaradó paratópjai a közeli epitópokhoz kötődnek és stabilizálják az antitest–antigén komplexet. Az alacsony affinitású IgM antitestnek még marad 9 paratópja, míg az alacsony affinitású IgG antitestnek csak egy paratópja marad az antitest–antigén komplexek stabilizálásához. Ebből következik, hogy az IgM antitestek, amelyek gyenge kapcsolatba lépnek több antigénnel, kevésbé specifikusak, mint az IgG antitestek, mivel az IgM antitesteknek nagyobb kapacitásuk van ahhoz, hogy az antigén–antitest kapcsolatot stabilizálják. Ezért egy ugyanolyan antigén-specifitással és gyenge affinitással rendelkező IgG nem marad kötődve az antigénhez, és ezért nem mutatható ki úgy, mint az IgM antitest. Az antitest paratópját felépítő nehéz és könnyű lánc hipervariábilis régiójához az antigén úgy kapcsolódik, mint ahogyan a kulcs (antigén) illik a zárba (antitest) (Harlow és Lane, 1988). A röntgenkristálytan módszerével az antitest–antigén komplex háromdimenziós szerkezetét már feltárták (Amitt et al., 1986; Colman et al., 1987; Sheriff et al., 1987).



2. Poliklón antitestek előállításaA szerológiai diagnosztikában a monoklón és a poliklón antitestek közül választhatunk. A poliklón antitestek előállítása egyszerűbb és a fajlagosságot növelni lehet, ha az antigén tisztaságát fokozzuk. Mind a poliklón, mind pedig a monoklón antitestek keresztreakcióba léphetnek heterológ antigénekkel, vagy pedig annyira specifikusak, hogy az ugyanazon vírus eltérő törzseiből származó heterológ antigéneket sem ismerik fel. Azt, hogy poliklón, ill. monoklón antitesteket használjunk, a vizsgálatok típusa és célja dönti el. A poliklón antiszérumok az antitestek változatos fajlagosságú vegyes populációját tartalmazzák, és ezért az antitest-populációk különböző részei lehetnek reaktívak a különböző szerológiai tesztek során. Ezzel szemben a monoklón antitestek csak egyféle típusú és specifitású homogén populációt tartalmaznak, így a tesztekben csak egyféleképpen reagálnak. Meg kell azonban jegyezni, hogy a túlzott érzékenység hátrányos is lehet, pl. ha a vírusban kis változás történik, és ez a változás éppen azt az antigén-determinánst érinti, amely ellen a hibridómasejt az antitestet termeli. Ekkor a vírus felismerése elmarad, holott az a növényi mintában jelen van.

2.1. A kísérleti állat kiválasztásaBármely melegvérű állatban (patkány, egér, tengerimalac, nyúl, csirke) immunszérum képződhet. A patkánynak, az egérnek és a tengerimalacnak kevés a széruma. A csirkék testhőmérséklete magas, és az a vélemény, hogy a csirkeszérum esetében az antigén–antitest-reakcióhoz magas ozmolaritás szükséges, és ilyen körülmények között az antigén károsodhat. A nagyobb testű állatok (pl. birka, kecske, ló) véréből nagyobb mennyiségű szérum nyerhető, de az immunizáláshoz több antigénre van szükség. Immunizálásra a leggyakrabban nyulakat alkalmaznak, mert kis mennyiségű antigénre is magas titerértékű, megfelelő mennyiségű szérumot lehet nyerni belőlük. Ha az antigéneket kicsapatjuk (pl. az agargél diffúziós módszer esetében), akkor a csirkék, a nyulak és a lovak a legjobb szérumforrások, míg a tengerimalac, a patkány és az egér nem megfelelő. A csirke és a nyúl antiszéruma sokféle koncentrációban ad precipitációs reakciót, míg a juh és a kecske antiszéruma csak szűkebb koncentrációjú tartományban. Egy szérum előállításakor legalább ugyanazon faj két egyedét szükséges ugyanazzal az antigénnel immunizálni.

2.2. Az immunizálásAz immunizálásra használt antigén mennyisége függ az antigén sajátságaitól, az antigén előkészítésétől és a beoltás módszereitől. A hosszú ideig tartó immunizálási folyamatnál, ahol nagy mennyiségű antigénre van szükség, többféle és nagyobb mennyiségű antitestek képződnek, mint a rövidebb ideig tartó immunizálásnál, de az antitestek alacsonyabb specifitásúak. Az immunizálásra gyakran kombinált injektálási módszereket alkalmaznak. Általában az intravénás és az intramuszkuláris befecskendezés kombinációját alkalmazzák egy 5–7 hétig tartó immunizálási folyamat során. Az intravénás injektálás után az antitest ugyan gyorsabban szétterjed, de a szervezet védekező mechanizmusa folytán a véráramban gyorsan hatástalanná válik. Ezért több mint 8 intravénás injekció kell ahhoz, hogy a szérum a megfelelő koncentrációban tartalmazza az antitesteket.

Célszerű a pufferben lévő antigént ún. Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányban emulgeálni intramuszkuláris injektálás céljából. Az adjuváns paraffinolajat és emulgeálószert (mannid monooleát) is tartalmaz. A komplett Freund-adjuváns hő által elölt baktériumokat is tartalmaz (Mycobacterium tuberculosis, M. butyricum, ill. egyéb, savnak ellenálló fajokat), míg az inkomplett adjuvánsban nincsenek baktériumok. Az adjuváns feladata, hogy stabilizálja és raktározza az antigént az izomszövetben, ezért nagyobb mennyiségű antitest képződésével számolhatunk, mint ha ugyanolyan mennyiségű antigént vizes fázisban fecskendeztünk volna be az állatba. A leggyakrabban alkalmazott Freund-adjuvánson kívül egyéb adjuvánsok használata is lehetséges, és újabban jelentős eredmények születtek az adjuvánskutatás terén (Hampton et al., 1990).

2.3. Injektálási módszerekAlapvetően hatféle befecskendezési módszert különböztetünk meg:

a. Intravénás (nyúlnál a fülén lévő marginális érbe, csirkénél a szárnyba, egérnél a farok-főérbe).

b. Intramuszkuláris (nyúlnál a lábikra vagy a comb izomzatába, csirkénél a lábba, ill. a mellizomzatba).

c. Hasnyálmirigybe (egérnél ez a módszer a legjobb).

d. Bőr alá (nyúl).



e. Bőrbe (nyúl).

f. Talpba (nyúl).

A vírussal történő immunizálás során a megfelelő mennyiségű antitestképzéshez csirkében és nyúlban általában 2 intramuszkuláris és egy intravénás injekció szükséges, hetente 1–2 mg antigén mennyiségben. Az antiszérum maximális titerértéke az első injektálás után vírustól függően változik, de legtöbbször 5–7 hét múlva várható. A titerérték az antiszérum azon jellemző sajátossága, amely megmutatja azt, hogy az antiszérumot meddig hígíthatjuk folyamatosan a kétszeresére, hogy még látható precipitációt kapjunk az antigénnel történő reakció során.

A befecskendezni kívánt antigén mennyiségét csak akkor célszerű növelni, ha a titerérték hirtelen csökken. Túlzott mennyiségű antigén használata a titerértéket nem növeli meg jelentősen. E célból előnyösebb az injektálásának, illetve az antigén stabilizálásának a módján változtatni.

2.4. Vérvétel és szérumnyerésVérvétel előtt 12–18 órával az állatokat éheztetni kell, hogy a lipidakkumulációt a vérben megakadályozzuk. Immunizálásra többnyire nyulakat használnak. A vérvétel a szívből, az artériákból és a vénákból történhet. A leggyakoribb és a legkevésbé kockázatos a fülben lévő érből kéthetente 20–20 ml vért venni. A kinyert vért egy óráig szobahőmérsékleten alvadni hagyjuk, majd 30 percig 37 °C-ra tesszük; ekkor a szérum mennyisége megnő. Egy éjszakára hűtőbe rakjuk, majd a szérumot leöntjük, ill. leszívjuk. A sejtes elemek elkülönítése céljából centrifugálás, majd szűrés következik. Ezt követi a Na-aziddal és glicerollal történő keverés, majd utána a –20 °C-on történő liofilezés.

2.5. Az IgG tisztítása az antiszérumbólAz antitestek (IgG) tisztításának többféle módja ismeretes, amelyek egymással kombinálhatók (Hampton et al., 1990). Az alkalmazott eljárások röviden a következők:

a. Részleges tisztítás ammónium-szulfátos kicsapatással.

b. Ioncserés kromatográfia.

c. Protein A affinitású kromatográfia.

d. Homológ antigén–antitest komplexekből történő disszociáció.

e. Cukorgrádiens-centrifugálás.

f. F(ab’)2 fragmentumok kinyerése.

g. Magasnyomású folyadékkromatográfia (HPLC).

h. Méretspecifikus membránon történő ultraszűrés.

i. Gélszűrés (IgM osztályba tartozó, nagy molekulatömegű antitestek esetében).

3. Monoklón antitestek előállításaA növénykórtanban a monoklón antitestek (monoclonal antibodies, Mabs) alkalmazása nem régi keletű (Stern és Gamble, 1984; Campbell, 1984; Halk és Boer, 1985). Előnyei a következők:

a. Csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak.

b. A kívánt fajlagosság a hibridóma-sejtvonalak sorozatvizsgálatával elérhető.

c. A hibridóma-sejtvonalak stabilak a tenyésztés, illetve a fagyasztott tárolás során.

Kohler és Milstein (1975) vezette be azt az eljárást, amelynek lényege, hogy a lép antitestképző nyiroksejtjeit rákos myelomasejtekkel fuzionáltatva ún. hibridómákat kapunk, amelyben biztosított a specifikus antitest



kiválasztása és a folyamatos növekedés. Immunizálásra egereket vagy patkányokat használnak fel. Ezen állatok vére kevés, azonban érzékenyek egy olyan tumorra, ami olyan ascites testfolyadékot produkál, amelyben annyi az antitest, mint a vérszérumban. Az ascites testfolyadék használatának előnyei a következők:

a. Az immunizáláshoz kevés antigén szükséges.

b. A testfolyadék mennyisége (ideális körülmények között) 20 ml.

c. Az antitesteket ugyanúgy lehet tisztítani és tárolni, mint a szérumból kivont IgG-t.

d. Hatékonyan alkalmazhatók egyes diagnosztikai eljárásokban, ahol a kimutatáshoz két, genetikailag különböző szérumforrásból származó antigénrendszer szükséges.

A hibridómakultúrák klónozása és további szelekciója monoklón antitesteket (Mabs) eredményez, amelyek az antigénnek csak egyetlen epitópjával szemben mutatnak aktivitást. A monoklón antitestek előállításának technikai lépései több szerző munkájában megtalálhatóak. A monoklón antitestek előállításának folyamata a 80. ábrán látható. A módszer fontosabb lépései az alábbiakban foglalhatók össze:

a. Az egerek vagy patkányok immunizálása. Azokból az egerekből, amelyekben az antiszérum titerértéke a legmagasabb, a lépet eltávolítják, és fúzióra előkészítik.

b. Az egér myeloma-sejtvonalainak tenyésztése. A fagyasztott myeloma-kultúrából a fúzió előtt legalább tíz nappal életképes, aktív növekedési állapotban (log fázisban) lévő sejtkultúrát kell készíteni.

c. A lépsejtek fuzionáltatása a myelomasejtekkel.

d. A fuzionált sejtek (hibridómák) tenyésztése szelektív táptalajon, amely a nem fuzionált sejtek növekedését gátolja.

e. A hibridóma-kultúrák szűrése a monoklón antitestek kiválasztása céljából.

f. A hibridómák klónozása a monoklón sejtvonalak biztosítása céljából.

g. Ascites testfolyadék termelése.

80. ábra - A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]



3.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségeiA monoklón antitestek (Mabs) felhasználhatók a különböző növénypatogének (vírusok, baktériumok, spiroplazmák, fitoplazmák) és törzseik meghatározására és jellemzésére, a patogének és az általuk kódolt termékek lokalizációjának és felhalmozódásának, valamint a kórokozók és génproduktumaik szerkezetének a jellemzésére (Goding, 1983; Adam et al., 1991; Herscheid, 1992). Jelenleg 19 víruscsoportba tartozó, több mint 60 növényvírusra készítettek monoklón antitesteket (20. táblázat).

20. táblázat - Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva)

Angol név Magyar név Akroním

Alfalfa mosaic alfamovirus Lucerna mozaik vírus AMV

Apple chlorotic leaf spot trichovirus


ACLSV

Apple mosaic ilarvirus Alma mozaik vírus ApMV

Arabis mosaic nepovirus Arabis mozaik vírus ArMV

Banana bunchy top nanavirus Banán csúcscsokrosodás vírus BBTV

Barley yellow dwarf luteovirus Árpa sárga törpülés vírus BYDV

Bean common mosaic potyvirus Bab közönséges mozaik vírus BCMV

Bean pod mottle comovirus Babhüvely foltosság vírus BPMV

Bean southern mosaic sobemovirus Bab déli mozaik vírus SBMV



Bean yellow mosaic potyvirus Bab sárga mozaik vírus BYMV

Beet necrotic yellow vein benyvirus Répa nekrotikus sárgaerűség vírus

BNYVV

Beet western yellows luteovirus Répa nyugati sárgaság vírus BWYV

Carnation etched ring caulimovirus Szegfű karcolatos gyűrűs vírus CERV

Carnation latent carlavirus Szegfű látens vírus CLV

Carnation mottle carmovirus Szegfű foltosság vírus CarMV

Carnation necrotic fleck closterovirus

Szegfű nekrotikus foltosság vírus

CNFV

Cassava African mosaic bigeminivirus

Manióka afrikai mozaik vírus CAMV

Citrus tristeza closterovirus Citrus tristeza vírus CTV

Citrus variegation ilarvirus Citrus tarkaság vírus CVV

Clover yellow vein potyvirus Here sárga erűség vírus ClYVV

Cowpea mosaic comovirus Tehénborsó mozaik vírus CPMV

Cowpea severe mosaic comovirus Tehénborsó súlyos mozaik vírus CPSMV

Cucumber green mottle mosaic tobamovirus

Uborka zöldfoltosság mozaik vírus

CGMMV

Cucumber mosaic cucumovirus Uborka mozaik vírus CMV

Grapevine fanleaf nepovirus Szőlő páfránylevelűség vírus GFLV

Lettuce mosaic potyvirus Saláta mozaik vírus LMV

Maize dwarf mosaic potyvirus Kukorica törpülés mozaik vírus MDMV

Maize streak mastrevirus Kukorica csíkosság vírus MSV

Odontoglossum ringspot tobamovirus

Odontoglossum gyűrűsfoltosság vírus

ORSV

Papaya ringspot potyvirus Papaya gyűrűsfoltosság vírus PRSV

Pea severe mosaic potyvirus Borsó súlyos mozaik vírus PeSMV

Peanut clump pecluvirus Földimogyoró bokrosodás vírus PCV

Peanut mottle potyvirus Földimogyoró foltosság vírus PeMoV



Plum pox potyvirus Szilva himlő vírus PPV

Potato leaf roll polerovirus Burgonya levélsodródás vírus PLRV

Potato A potyvirus Burgonya A-vírus PVA

Potato M carlavirus Burgonya M-vírus PVM

Potato X potexvirus Burgonya X-vírus PVX

Potato Y potyvirus Burgonya Y-vírus PVY

Prune dwarf ilarvirus Szilva törpülés vírus PDV

Prunus necrotic ringspot ilarvirus Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus

PNRSV

Raspberry bushy dwarf idaeovirus Málna bokros törpülés vírus RBDV

Rice dwarf phytoreovirus Rizs törpülés vírus RDV

Rice ragged stunt oryzavirus Rizs érdes törpülés vírus RRSV

Rice stripe tenuivirus Rizs csíkosság vírus RSV

Satsuma dwarf nepovirus Satsuma törpülés vírus SDV

Soybean dwarf luteovirus Szójabab törpülés vírus SbDV

Soybean mosaic potyvirus Szójabab mozaik vírus SMV

Sweet clover necrotic mosaic dianthovirus

Here nekrotikus mozaik vírus SCNMV

Tobacco etch potyvirus Dohány karcolatos vírus TEV

Tobacco mosaic tobamovirus Dohány mozaik vírus TMV

Tobacco necrotic dwarf luteovirus Dohány nekrotikus törpülés vírus

TNDV

Tobacco streak ilarvirus Dohány csíkosság vírus TSV

Tomato mosaic tobamovirus Paradicsom mozaik vírus ToMV

Tomato ringspot nepovirus Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus

ToRSV

Tomato spotted wilt tospovirus Paradicsom bronzfoltosság vírus TSWV

Tulip breaking potyvirus Tulipán színtörés vírus TBV



Watermelon mosaic 2 potyvirus Görögdinnye mozaik 2-vírus WMV-2

Wheat soil-borne mosaic furovirus Búza talajlakó mozaik vírus SBWMV

Zucchini yellow mosaic potyvirus Cukkini sárga mozaik vírus ZYMV

A Mabs-ok alkalmazhatók a vírusok mennyiségi és minőségi meghatározására, a vírusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására csakúgy, mint a strukturális és nem strukturális génproduktomok szerkezeti és funkcionális tanulmányozására. Alkalmazhatók vírusok, vírustörzsek és szerotípusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges törzse ellen készült Mab segítségével további tíz, a tobamovirusokhoz tartozó vírust sikerült elkülöníteni (Briand et al., 1982). Tekintettel arra, hogy a monoklón antitestek csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak, kitűnően alkalmazhatók az antigénszerkezet molekuláris szintű tanulmányozására (Altschuh et al., 1985). A Mab segítségével lehetővé válik az epitópok azonosítása, szerkezetük feltérképezése. Mab-ot használtak pl. a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), valamint a dohány mozaik vírus szerkezetének a tanulmányozására, valamint a potyvirusok, az ilarvirusok és a tobamovirusok specifikus epitópjainak a meghatározására. Jelenleg már nemcsak a vírus-köpenyfehérjével szemben készülnek monoklón antitestek, hanem pl. nukleáris zárványokkal, henger alakú zárványfehérjékkel, amorf zárványokkal, és potyvirusok esetében a levéltetű-átvitelért felelős, ún. helper komponensekkel szemben is.

4. A szerológiai reakciók alaptípusai4.1. PrecipitációAz elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén (azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék összetömörülését jelenti.

Folyékony közegben történő precipitációs teszt

a. Az antiszérumból megfelelő pufferrel hígítási sorozatot készítünk.

b. 0,5 ml antiszérumot ugyanannyi mennyiségű növényi szövetnedvvel kémcsőben összekeverünk és vízfürdőben 25–40 °C-on inkubálunk.

c. Az a legmagasabb hígítási érték, amelynél az antiszérum a neki megfelelő, ismert koncentrációjú antigénnel reagálva még látható precipitációt mutat, az antiszérum titerértékeként ismert és az inkubálás után egy, ill. két órával meghatározható. A precipitációt láthatóbbá lehet tenni, ha a kémcsövet fekete hátterű fényforrás elé helyezzük.

A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10–3, ill. 10–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10–2.

Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965; Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő



lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.

A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.

A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai differenciálindex (SDI).

4.2. AgglutinációAz agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl. latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok kimutatásában.

4.3. Immunodiffúziós tesztekAz immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.

Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla) géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.

Egyszerű géldiffúzió

A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal (Oudin, 1952).

Radiál géldiffúzió

Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.

Kettős géldiffúzió

Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a



vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban. Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.

Precipitációs minták

Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10 –7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés (spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is tartalmaz (81. ábra).

81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990 után]

Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében

A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel, hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.

A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében (Purcifull és Batchelor, 1977)

a. Az agar előkészítése: A közeg 0,8% agart, 1% NaN3-t és 0,5% SDS-t tartalmaz. 4 g agarhoz 300 ml desztillált vizet adunk és 5 perc alatt 100 °C-on felolvasztjuk. A felolvasztott agarhoz 5 g nátrium-azidot (NaN 3) adunk és jól összekeverjük. 2,5 g SDS-t 100 ml forró desztillált vízben feloldunk, ezt hozzáadjuk az agaroldathoz. A keveréket 500 ml-ig forró desztillált vízzel kiegészítjük és összekeverjük. 11 cm átmérőjű Petri-csészébe 12–12 ml oldatot öntünk. Miután az agar megszilárdult, a Petri-csészéket 4 °C-on nedves kamrában tároljuk.

b. Az antigén előkészítése: A fertőzött és az egészséges növény levelét desztillált vízzel 1:1 arányban



homogenáljuk, majd minden gramm levélszövethez 1 ml 3%-os SDS-t adunk. A mintát gézen átszűrjük.

c. Az antiszérum előkészítése: A potyvirusok esetében az SDS-sel nem kezelt vírussal történő immunizálás is jó eredményt ad. Az antiszérumot általában nem hígítjuk, de ha mégis szükséges, akkor vagy a PBS-pufferrel, vagy 0,05 M Tris-HCl-lel (pH:7,2), amely 0,85% NaCl-ot és 5% bovin-szérumalbumint is tartalmaz.

d. Az agarba lyukvágóval 7 mm átmérőjű lyukakat vágunk. Egy centrális lyuk körül 6 db perifériális lyuk legyen egymástól 4–5 mm-re. A középső lyukba az antiszérum, a szélsőkbe pedig a növényi minták kerülnek.

e. Az inkubálás 24 °C-on történik, és az eredményeket 24–48 óra múlva feljegyezzük. A nem specifikus, nem antigén–antitest reakció következtében létrejövő precipitációs ívek kialakulása elkerülhető, ha a gélközeghez bovin-szérumalbumint is adunk.

4.4. ImmunoelektroforézisAz immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel (Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)

a. Az agarózoldat elkészítése. (Egy 9x12 cm-es nagyságú lemez 15 ml 0,75%-os agarózt tartalmazzon 0,02 M-os veronál-pufferben (pH 8,6) és 0,1%-os Na azidban.)

b. Ha az agaróz 50–55 °C-ra lehűlt, akkor 2 cm2 agarózhoz 1 µl antiszérumot adunk.

c. Az agarózlemezre lyukakat vágunk, a növényi mintát ezekbe csepegtetjük.

d. A lemezt 24 óráig 4 °C-on, vagy szobahőmérsékleten, vízhűtés mellett, 50 V feszültség alá helyezzük (2 V/cm).

e. A lemezt – általában szűrőpapíros felitatással – megszárítjuk.

f. A megszárított lemezhez annyi foszfát-puffert adunk (pH: 7,0), hogy azt befedje, majd két óráig a pufferben, egy óráig pedig desztillált vízben áztatjuk.

g. A lemezt „Comassie Brilliant Blue G-250” nevű festékkel színezzük. Fél óráig történő rázatás után a festéket eltávolítjuk, majd 10 percig újraszínezünk. Ezt követően desztillált vizes áztatás, majd a lemez szárítása következik.

h. Kalibrációs görbék segítségével a precipitációs csúcsok magasságából következtetni lehet a vírus koncentrációjára.

4.5. ELISA-módszerekAz „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először növényvírusok kimutatására.

Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt



eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását, ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus, pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal szemben.

82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum [Hampton et al., 1990 után]

Direkt ELISA

• Kettősellenanyag-szendvics (DAS ELISA) (Clark és Adams, 1977)

A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk,



amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely) rendelkeznek.

Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek, ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat, amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van. A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az eredményeket (82A ábra).

• Direkt eljárás

Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.

• Direkt biotin-avidin ELISA

A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé. Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:

a. A cella falát először IgG-vel érzékenyítjük.

b. Mosás után a mintát hozzáadjuk.

c. Ezután biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk.

d. Mosás után avidin (sztreptavidin)–enzim konjugátum hozzáadása következik.

e. Végül az enzim szubsztrátjának a bevitele történik.

• A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kimutatása DAS ELISA módszerrel

Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi kontrollmintákat.

a. A lemez IgG-vel történő érzékenyítése: Az antiszérumot fedőpufferrel 500-szorosára hígítjuk. Az oldatból 200-200 μl-t pipettázunk a cellákba, és négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő eltelte után mosópufferrel kétszer kimossuk a cellákat, majd ismételten kétszer, de ekkor a puffert 3-3 percig a cellákban hagyjuk.

b. A növényi minták felvitele: 0,4 g friss súlyú növényi mintát 2 ml homogenálópufferben eldörzsölünk, majd a felülúszót leöntjük és Eppendorf-csőben 12 000 fordulatszámon (rpm) kb. 5 percig centrifugáljuk. Nagyszámú minta esetén növényi homogenizálóberendezések is alkalmazhatók. Nemcsak a vizsgálandó növényi mintákat, hanem pozitív és negatív kontrollmintákat is fel kell vinni a cellákba. A cellákba



pipettázott növényi mintákat egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután kétszer mosópufferrel mossuk a cellákat, majd ismételten háromszor, a mosópuffer három percig cellákban történő inkubálásával.

c. Az IgG-enzim (alkalikus foszfatáz) konjugátumot konjugátumpufferben 500-szorosára hígítjuk, majd a cellákba pipettázzuk. A konjugátumot 4 órán át 35 °C-on inkubáljuk a cellákban, majd elvégezzük a mosást a b pont szerint.

d. A szubsztrát (4-nitrofenil-foszfát) hozzáadása. A szubsztrát elkészítése: Folyamatos keverés mellett 4-nitrofenil-foszfátot szubsztrátpufferben 1:1 arányban feloldunk. 150–150 μl-t a cellákba pipettázunk. 35 °C-on kb. 30 percig inkubálunk.

e. A reakciót 50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk (nem szükségszerű).

f. A színváltozás mértékét ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük. Ha a minták abszorbciós értékei a negatív kontroll abszorbciós értékének a kétszeresét meghaladják, akkor tekinthető a vizsgált minta az adott vírusra nézve pozitívnak.

• A szükséges pufferek összetétele:

g. Fedő (coating) puffer: 1,59 g Na2CO3; 2,93 g NaHCO3; 0,2 g NaN3 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,6).

h. PBS–Tween mosópuffer: 0,5 ml Tween-20 feloldása 1 liter-PBS oldatban, keverés mellett.

i. 10 × PBS-oldat (phosphate-buffer saline) (10-szeres töménységben, ezért közvetle-nül a felhasználás előtt 10-szeres hígítást kell készíteni): 72 g NaCl; 4,3 g KH2PO4; 14,4 g Na2HPO4 × 2 H2O (vagy: 29 g Na2HPO2 × 12 H2O); 1g Merthiolát (Thimerosal) 1liter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 7,4).

j. Kivonó (homogenáló) puffer: IgG puffer + 2% polivinil-pirrolidon (PVP).

k. IgG puffer: 1% BSA-t (marhabovin-szérumalbumin) vagy sovány tejport tartalmazó PBS–Tween-oldat, melyet a tejpor szuszpendáltatása után több réteg szűrőpapíron át kell szűrni.

l. Konjugátumpuffer: ugyanaz, mint a kivonó puffer.

m. Alkalikus foszfatáz szubsztrátpuffer: 97 ml diethanol-amin; 0,2 g MgCl2 × 6 H2O; 0,2 g NaN3 1 1iter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,8; 1 N HCl-lel beállítva).

Indirekt ELISA

• Indirekt F(ab’)2 ELISA (Barbara és Clark, 1982)

Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab’)2 fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c) régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab’)2 fragmentumokhoz nem. Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B ábra).

• Indirekt DAS ELISA (van Regenmortel és Burckard, 1980)

E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat) ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).

• Indirekt ELISA (Lommel et al., 1982)



Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).

• Módosított F(ab’)2 vagy protein A ELISA

Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).

• A protein A ELISA-eljárás

a. Általában 1 µg protein A-t 1 ml fedőpufferben feloldva 200 µl protein A-oldattal érzékenyítjük a lemezt, majd kb. négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő letelte után kétszer desztillált vízzel, majd egyszer PBS–Tween mosópufferrel történő mosás szükséges.

b. 200–200 μl specifikus IgG antiszérum felvitele az antiszérum titerértékétől függő, de általában 500–1000-szeres hígításban történik. Négy óráig 35 °C-on történő inkubáció, majd mosás az a lépés szerint.

c. Növényi minták felvitele: 0,4 g friss levél 2 ml kivonópufferben történő homogenálása, majd a felülúszó Eppendorf-csőben történő centrifugálása 5 percig, vagy a homogenátum vattán történő átszűrése. Inkubálás 4 °C-on egy éjszakán át, majd háromszori desztillált vízzel történő mosás, és kétszeri PBS–Tween mosópufferrel történő mosás következik. Kiöntés előtt a puffert 3 percig hagyjuk a cellákban.

d. A második IgG réteg felvitele [lásd b lépés].

e. Protein A-enzim konjugátum felvitele. Előtte a konjugátumot ún. konjugátumpufferrel – a konjugátum minőségétől függően – hígítjuk (pl. 20 ml pufferben 5 µl konjugátumot oldunk). Ezután a lépés után az inkubáció 4 órán keresztül 35 °C-on történik, majd a c lépés szerinti mosás következik.

f. A szubsztrátum felvitele. Ha az enzim alkalikus foszfatáz, akkor a szubsztrát 4-nitrofenil-foszfát. Ha az enzim peroxidáz, akkor a szubsztrát o-fenilén-diamin lesz.

g. A szubsztrát felvitele után a reakcióelegyet 35 °C-on inkubáljuk. A pozitív minták esetében rövid idő alatt kialakul a narancssárga színreakció.

h. Ha az enzim alkalikus foszfatáz volt, a reakciót cellánként 50-50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk.

i. A lemezt ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük.

O-fenilén-diamin (OPD) készítése:

a. 1 kapszula OPD-t 50 ml citromsavas foszfátpufferben feloldunk. Az OPD erősen rákkeltő hatású, ezért gumikesztyű használata kötelező. Az OPD fényérzékeny, ezért feloldásakor a főzőpoharat alufóliába kell csomagolni és a bemérés után a lemezt is takarni kell.

b. 50 ml bidesztillált vízben 1 tabletta Hyperolt oldunk fel. H2O2 keletkezik.

c. A hidrogén-peroxid (H2O2) oldatból 500 μl-t adunk az 50 ml OPD-oldathoz, és kevertetjük. Az így nyert elegyből 150 l mennyiséget pipettázunk a lemez celláiba.

Citromsavas foszfátpuffer készítése:

5,6 g citromsav; 11,2 g Na2HPO4 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).

A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer, kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben található.

4.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA)



A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).

4.7. ImmunoblottingEzen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA) és a szöveti (tissue) blotting.

A Western blot technika

Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún. elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.

Dot-blot immunteszt

Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.

A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito, 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.

• A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatása dot-blot technikával (Moya et al., 1997)

a. Növényi minta előkészítése. Egy gramm levelet 40 ml Tris-HCl-ben homogenálunk (pH 6,8), amely 30 mM aszkorbinsavat és 0,2% 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A keveréket öt percig 100 °C-on történő felmelegítéssel denaturáljuk.

b. A nitrocellulóz membránt óvatosan a TBS-puffer felszínére helyezve megnedvesítjük.

c. A membránt öt percig szűrőpapíron szárítjuk (ma már olyan membránok is léteznek, melyek használatánál a b és a c művelet elvégzése nem szükséges).

d. 1 μl növényi mintát csepegtetünk a membránra, majd azt 5 percig szűrőpapíron szárítjuk.

e. A filtert blokkoló oldatban (5% sovány tejport tartalmazó PBS-oldat) egy órán keresztül rázatjuk, majd egy pillanatra desztillált vízbe mártjuk.

f. Monoklón antitesttel kezeljük a szűrőt (0,1 g/ml PBS-oldatban).

g. Ezután desztillált vízbe történő bemártás, 2 × 10 percig TTBS-oldatban történő mosás, majd ismételten egy pillanatra desztillált vízbe történő bemártás következik.

h. A szűrőt peroxidázzal jelzett „antiegér“ antiszérumban inkubáljuk.



i. Desztillált vizes bemártás, majd 10 percig TTBS-ben, és 10 percig TBS-ben történő gyenge rázatás következik.

j. A membránt öt percig az előhívó oldatban előhívjuk.

k. Desztillált vizes öblítés után az értékelés következik.

TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).

TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.

Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os

nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!

Szöveti (tissue) blotting

Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).

5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikábanTöbb mint két évtizede az ELISA-módszer a legszélesebb körben alkalmazott eljárás a vírusdiagnosztikában. A monoklón antitesteket is használó ELISA-eljárás nagymértékben hozzájárult a burgonya vírusmentesítési programjához és a gyümölcsfaiskolák vírusmentesítéséhez (Halk és De Boer, 1985). Az egyes monoklón antitestek egy-egy vírus csak korlátozott számú szerotípusára alkalmazhatók. Ez a hátrány kiküszöbölhető a különböző Mabs keverékének használatával. Bár az ELISA-módszer nem annyira érzékeny, mint pl. a vírusok nukleinsav-tartalmának meghatározásán alapuló ún. nukleinsav-hibridizációs módszerek, nagyszámú minta tömegteszteléshez jobban alkalmazható. A bioteszt- vagy tesztnövénymódszer szintén érzékenyebb, mint az ELISA, de a tesztnövények felnevelése sokáig tart és csak kisszámú minta tesztelését teszi lehetővé (Horváth, 1993).

Az ELISA-eljárások mellett a kettős géldiffúzió, a dot-blot és a Western blot módszerek a legnépszerűbbek (Banttari és Goodwin, 1985; Barnett, 1986; Salazar, 1996).


15. fejezet - A nukleinsavak jellemzésének módszereiA vírusok genetikai információját hordozó nukleinsav típusa lehet ribonukleinsav (RNS) vagy dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek egyszálúak (ssRNS, ssDNS) vagy kétszálúak (dsRNS, dsDNS) lehetnek, de a virionképzésben csak egyféle nukleinsav vehet részt. A vírus-RNS-szál lehet pozitív vagy negatív. Pozitívnak nevezzük akkor, ha róla közvetlenül transzláció valósul meg, azaz messenger RNS-ként (mRNS) funkcionál. A növénypatogén vírusok túlnyomó többsége egyszálú pozitív RNS-genomot tartalmaz, az egy-, ill. kettős szálú DNS vírusok száma csekély. A növényvírusok kisebb része negatív szálú RNS-vírus; ebben az esetben szükség van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A vírusokban a nukleinsavbázisok sorrendje meghatározó, hiszen a nukleinsavakban foglalt információk felelősek a fertőzőképességért, a vírusreplikációért, a fehérjék szintéziséért, beleértve a köpenyfehérje termelését is. A vírusgenom lehet egykomponensű, azaz osztatlan és lehet többkomponensű, azaz osztott. A vírusgenom minősége, a nukleinsav-molekulák száma, a genom szerveződése és kifejeződése alapvető jelentőségű a vírusok rendszerezésében (Matthews, 1991, 1992).

A nukleinsav jellemzésére alkalmas első technikák kifejlesztését a viroidok felfedezése és későbbi vizsgálatai motiválták, hiszen a viroidok esetében nincsen lehetőség fehérjék vizsgálatára. Mint ismert, a viroidok csupasz (naked) RNS-ből állnak. A molekuláris biológia és a biotechnológia területén elért eredmények szintén nagymértékben hozzájárultak ahhoz, hogy lehetővé vált a vírusnukleinsav mind diagnosztikai, mind rendszertani célú jellemzése, a genomban kódolt fehérjék szerepének megértése és a genom génsebészeti célokra történő felhasználása.

A nukleinsavak jellemzésének egyik legáltalánosabban használt technikája a gél-elektroforézis, amely lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását, méretének meghatározását. A nukleinsav jellemzésére használt, ún. hibridizációs módszerek különösen olyan növényvírusok vizsgálatában terjedtek el, ahol a szerológia nem ad megbízható eredményt [pl. dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) esetében]. A nukleinsav-hibridizáció gyors eljárása a dot-blot hibridizáció, amely azonban nem teszi lehetővé a nukleinsav méretének meghatározását, ehhez DNS esetében Southern-, RNS esetében pedig Northern-hibridizációra van szükség.

A nukleinsav jellemzésének legfontosabb és legalaposabb módszere a teljes genom bázissorendjének, azaz szekvenciájának meghatározása. A növényvírusok esetében erre azért van lehetőség, mert a genom kis méretű, általában kisebb, mint 10 000 bázispár. A genom teljes szekvenciájának megismerése új szempontokat adott a vírusok rendszerezéséhez, hiszen lehetővé tette a rendszerezésben az evolúciós összefüggések figyelembevételét is. A molekuláris biológiában széles körben alkalmazott polimeráz-láncreakció (polimerase chain reaction, PCR) használata a növényvírus-diagnosztikában és a molekuláris virológiában egyaránt ismert. A továbbiakban a nukleinsav jellemzésére alkalmas technikák részletes ismertetésével foglalkozunk. Megemlítjük, hogy e témával kapcsolatban a könyv kéziratának leadása után jelent meg Dijkstra és De Jager (1998) kitűnő könyve a vírus-RNS vizsgálati módszereiről.

1. Gél-elektroforézisA gél-elektroforézis lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását és méretének meghatározását. A technika lényege az, hogy az elektromos térbe helyezett gélben a molekulák a gél pórusain keresztül az ellenkező töltés irányába vándorolnak.

A negatív töltésű nukleinsavak gélben történő mozgását sok tényező befolyásolja, de megfelelően standardizált körülmények között a vándorlás gyorsaságát a legnagyobb mértékben a molekula mérete határozza meg. Minél kisebb a molekula, annál könnyebben, gyorsabban mozog. Megfelelő méretű ismert anyag (marker) alkalmazásával a molekula pontos mérete is megállapítható. A technika egyszerű, gyors és olyan fragmentumok elválasztására is alkalmas, amelyre más úton, pl. sűrűséggradiens-centrifugálással nincs mód.

A vizsgált molekulák a gélen könnyen láthatóvá tehetők egy alacsony koncentrációban használatos fluoreszcens festék, az ehídium-bromid alkalmazásával. Ennek segítségével ultraibolya fényben már 1–10 ng DNS is kimutathatóvá válik. A gél agarózból vagy poliakril-amidból készülhet, a feladatnak megfelelő alakban, sűrűségben és méretben. Az agarózgéleket általában a magasabb mérettartományban alkalmazzák, mintegy 200


A nukleinsavak jellemzésének módszerei

bázispártól (bp) egészen 50 kilobázisig (kb). A poliakril-amid gélek kiválóan alkalmasak kisebb méretű molekulák (5–500 bp) elválasztására. Felbontóképességük olyan nagy, hogy különböző DNS-fragmentumok összehasonlításakor már 1 bp-nyi különbség is észlelhető (Sambrook et al., 1989).

A gél-elektroforézisnek a növényvirológiában elsősorban a vírusgenom (RNS vagy DNS) méretének, illetve a genom bázissorendjének meghatározásában van szerepe. A 83. ábra az agarózgél-elektroforézis vázlatát mutatja.

83. ábra - A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után]

2. Nukleinsav-hibridizációA hibridizáció egyszálú nukleinsavláncok specifikus bázispárosodását jelenti, a purin és pirimidin bázisok egymásnak megfelelősége, a komplementaritás szabálya szerint. A kétszálú DNS két szálát hevítéssel vagy lúgos kezeléssel eltávolítva egymástól (denaturálás) egy egyszálú DNS-molekulákat tartalmazó oldat keletkezik, és az így kapott DNS-oldat lehűlésekor a kétszálú szerkezet újra kialakul (renaturálódás). Azt a hőmérsékletet, amelyen a molekulák 50%-a denaturálódik, olvadási hőmérsékletnek (Tm) nevezzük. Az olvadási hőmérsékletet alapvetően a következő faktorok befolyásolják: 1. a nukleinsav bázisösszetétele, azaz a magas G+C-tartalomnál magasabb a Tm értéke; 2. a sókoncentráció, ugyanis a magas sókoncentráció növeli az olvadási hőmérsékletet; 3. a hidrogénkötést befolyásoló kémiai anyagok (pl. formamid) jelenléte csökkenti a Tm-et. A hibridizációs tesztekhez olyan hőmérsékleti körülményeket kell választani, amelyek maximalizálják az asszociáció fokát a komplementer szálak között. Ez általában 22–27 °C-kal kevesebb a Tm-nél, azaz kb. 65 °C (Matthews, 1991).

A már oldatban levő molekulákhoz komplementer RNS-t vagy DNS-t adva olyan molekulák is képződnek, amelyeknek egyik szálát a hozzáadott komplementer RNS vagy DNS alkotja. Ha ezeket a molekulákat a felismerhetőség érdekében radioaktív vagy más módon jelölik, akkor a kapott hibrid molekulák is kimutathatóvá válnak. A jelölt RNS-t vagy DNS-t próbának nevezik, amely olyan molekulákhoz kapcsolódik (hibridizál), amelynek vele azonos (homológ) a szekvenciája (Hames és Higgins, 1985).

A hibridizáció megvalósítható úgy is, hogy mindkét nukleinsav oldatban van (folyadék-hibridizáció), de jobban elterjedt az a gyakorlat, amikor az egyik molekulát egy szilárd mátrixon, filteren immobilizálják (filter-hibridizáció). A növényvirológiában általánosan alkalmazott dot-blot, Southern- és Northern-hibridizáció mellett



érdemes említést tenni az ún. szendvics-hibridizációról is. A nukleinsav-hibridizációs eljárásokról nemrég Hull (1993) írt összefoglaló tanulmányt.

2.1. Dot-blot hibridizációA dot-blot hibridizáció a legáltalánosabban használt módszer nagyszámú minták elemzésére (Dijkstra és De Jager, 1998). A hibridizáláshoz el nem választott nukleinsavmintát rögzítenek egy megfelelő hordozón (nitrocellulóz vagy pozitív töltésű nejlonmembránon), és erre radioaktív próbát hibridizálnak. Fő lépései a következők: 1. a vizsgálandó növényekből kis mennyiségű szövetnedv- vagy össznukleinsav-kivonás; 2. a nukleinsav denaturálása hevítéssel; 3. a szövetnedvből, ill. a nukleinsavoldatból egy cseppnek a membránra történő felvitele; 4. a nukleinsav membránhoz kötése; 5. a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása a prehibridizáció során; 6. hibridizálás radioaktívan jelölt nukleinsavpróbával; 7. a filter mosása a nem-, illetve aspecifikusan hibridizált próba eltávolítására; 8. a filter szárítása, majd kazettában röntgenfilm fölé helyezése; 9. a film előhívása.

A nukleinsav dot-blot hibridizáció (Hames és Higgins, 1985 után)

• Összes nukleinsav-kivonás

a. A vizsgálandó növényekből egy Eppendorf-tető nagyságú levélkorongot 400 µl kivonó-pufferrel [50 mM Tris-HCl (pH 7,6); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% SDS; 0,3% merkapto-etanol] dörzsmozsárban homogenálunk.

b. A homogenátumot visszapipettázzuk egy Eppendorf-csőbe, hozzáadunk 400 µl fenolt és 30 mp-ig Vortexben keverjük.

c. Vortexelés után a homogenátumot 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).

d. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 150 µl fenolt és 150 µl kloroformot, majd 30 percig vortexeljük.

e. A fenolos oldatot 5 percig centrifugáljuk (14000 rpm, 4 °C).

f. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 300 µl kloroformot, összerázzuk, majd 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).

g. A felülúszót leszívjuk és a nukleinsavakat 200 µl ammónium-acetát jelenlétében 1 ml absz. etanollal kicsapjuk, az oldatot 20 percig –70 °C-on tartjuk.

h. Az alkoholos oldatot 20 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C), majd óvatosan leöntjük a felülúszót.

i. A csapadékban lévő nukleinsavakat 1,5 ml 70%-os etanollal mossuk (nem szuszpendáljuk).

j. Centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C). A felülúszót leöntjük, és a csapadékot beszárítjuk.

k. A csapadékot 30–40 µl steril vízben szuszpendáljuk.

Megjegyzés: Az összes nukleinsav-kivonás során biztosítani kell, hogy az RNS ne degradálódjon, ezért gondoskodni kell az oldatok és eszközök RNáz-mentességéről. A kivonás folyamán végig kesztyűt kell viselni. A kivonópuffert, a fenolt és a kloroformot hűtőben (4 °C) tároljuk, a sterilezett Eppendorf-csöveket az egyes lépések között jégen tartjuk. A kivont nukleinsav minőségét és mennyiségét agarózgélen futtatva ellenőrizhetjük, illetve a mennyiségét spektrofotométerrel mérhetjük.

• A minták előkészítése és membránra vitele

a. A nukleinsavoldatból 3 µl-t kiveszünk, hozzáadunk 3 µl felvivőpuffert [50% (w/v) deionizált formamid; 6% (w/v) formaldehid; 4,2% (w/v) glicerin; 0,035% brómfenolkék; 0,035% xiléncianol; 20mM HEPES pH 7,8; 1 mM EDTA pH 8,0].

b. A nukleinsavakat 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, majd jég közé tesszük.

c. Az oldatból 4 µl-t pipettázunk a Hybond-N membránra, ügyelve arra, hogy a minták pontszerűen, egymástól kellő távolságban (kb. 1 cm) helyezkedjenek el.



d. A membránt 2 percre UV-transzparensre helyezzük, hogy a nukleinsavakat irreverzibilisen a membránhoz kössük.

• Előhibridizáció, hibridizáció, autoradiográfia

e. A filtert egy, az egyik oldaláról nyitott műanyag tasakba tesszük, és hozzáadunk 5 ml előhibridizációs oldatot (5 × SSPE; 5 × Denhard oldat; 1,5% SDS; 50% formamid; 19% H2O; 1 mg élesztő-RNS).

f. A tasakot lezárjuk, és 42 °C-os vízfürdőben rázatva 30 percig előhibridizálunk.

g. A tasak egyik oldalát felnyitva, hozzáadjuk az elkészített próbát (80 µl), és egy éjszakán át 42 °C-os termosztátban hibridizálunk.

h. A filtert mosófolyadékkal (1 × SSC; 0,1% SDS) 3 × 20 percig mossuk.

i. A filtert megszárítjuk, kazettába helyezzük, tetejére pedig röntgen-filmet teszünk.

j. A filmet 24–48 óra elteltével előhívjuk.

• Próbakészítés (T7 QuickPrime Kit, Pharmacia Biotech)

k. Mérjük össze a következő reakcióelegyet: 17 µl hődenaturált DNS (25–50 ng); 5 µl reagenskeverék (reagent mix); 0,5 µl T7 polimeráz (Pharmacia, 10 u/µl); 2,5 µl [32P]dCTP (1 MBq).

l. A reakciót 5–15 percig 37 °C-on inkubáljuk.

m. A mintához hozzáadunk 75 µl 1,5%-os SDS-t, és az így kapott 100 µl próbából 25 µl-t használunk egy hibridizációban, a többit –20 °C-on 2–3 hétig tárolhatjuk.

n. A felhasználandó 25 µl próbát 25 µl 0,5%-os SDS és 10 µl 1 n NaOH hozzáadásával 5 percig szobahőmérsékleten denaturáljuk, majd 5 percre jégbe tesszük, és hozzáadunk 10 µl 1 n HCl-t és 10 µl 1 n Tris-HCl-t (pH 7,6).

o. Az így elkészült próbát a prehibridizáló folyadékhoz adjuk.

2.2. Southern-hibridizációA Southern-hibridizáció lényege (84. ábra), hogy az agarózgél-elektroforézissel elválasztott DNS-fragmentumokat változatlan mintázatban egy membránra viszik át. A szokásos módon készített gélt lúgban áztatva a DNS-t denaturálják, majd savval semlegesítik. Az így előkezelt gélt egy megfelelő oldattal átitatott szűrőpapírra fektetik, a gél felületére pedig ráhelyezik a membránt. Az egészet lefedik egy vaskos köteg szűrőpapírral, amely szívni kezdi a nedvességet (blottolás, 85. ábra). Miközben a papír a gélen és a membránon átszívja a folyadékot, a DNS is az oldattal együtt mozog, amikor azonban eléri a membránt, ott megkötődik, rögzül. A membránhoz kötött DNS-molekulákhoz radioaktívan jelölt próbát hibridizálnak. A próbával homológ DNS-molekulák autoradiográfiával kimutathatók (Sambrook et al., 1989). A Southern-hibridizáció a növényvirológiában általánosan elterjedt a vírusok polimeráz láncreakciós vizsgálatával kapott, ún. PCR-termékek végső azonosításában. A Southern-hibridizáció (PCR termékek azonosítására) lépései a következők: polimeráz láncreakció (lásd a Polimeráz láncreakció (PCR) c. fejezetet), elektroforézis, blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia.

84. ábra - A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után]



85. ábra - A blottolás [Sambrook et al., 1989 után]

• Elektroforézis

a. A vizsgálandó PCR termékeket 1–1,5%-os agarózgélben elektroforézissel elválasztjuk.

b. A gélt denaturáló oldatot (0,6 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl; pH 7,0) tartalmazó kádba helyezzük és 30 percig inkubáljuk.

c. A denaturáló oldat helyére neutralizáló oldatot (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0) teszünk, majd 30 perces inkubáció következik.

d. A gélt a 85. ábrán látható módon, egy éjszakán át blottoljuk, a blottoláshoz 20 x SSC-puffert kell használni.

e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig az UV-transzparensre helyezve fixáljuk.

Az elektroforézis után a blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia történik, a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint.

2.3. Northern-hibridizációA Northern-hibridizáció elve megegyezik a Southern-hibridizációval, de a vizsgálandó anyag itt nem DNS, hanem RNS. Az RNS-sel való munka sokkal nagyobb elővigyázatosságot igényel, mint a DNS-sel történő eljárások, mert az RNS nagyon bomlékony. Ezért gondoskodni kell arról, hogy a teszthez használt minden eszköz és oldat RNáz-mentes legyen. A vizsgálatban az RNS-t olyan, ún. denaturáló agarózgélben választják el, amely biztosítja az RNS másodlagos szerkezetének bontását. A leggyakrabban használt denaturáló ágensek a formaldehid és a glioxál. A gélen történő szeparálás után ugyanazon lépések következnek, mint a Southern-hibridizációban, azzal a különbséggel, hogy itt nincs szükség a gél futtatás utáni denaturálására és neutralizálására.

A Northern-analízis alkalmazása különösen elterjedt a vírusgenom bizonyos részeivel transzformált növényekben (transzgénikus növények) a transzgén expressziós szintjének meghatározására.



A Northern-hibridizáció (Sambrook et al., 1989 után)

a. Az összes nukleinsav kivonásával nyert oldatból 8 µl-t használunk kiindulási anyagként.

b. Az RNS-mintához hozzáadunk 8 µl mintapuffert, majd a kapott oldatot 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, ezután pedig 2 percre jégbe tesszük.

c. A mintákat (mindig szerepeljen pozitív és negatív kontroll) denaturáló gélen, denaturáló futtató pufferben elektroforetizáljuk.

d. Futtatás után a gélt 30 percig 10 x SSC-ben áztatjuk, majd a 85. ábra szerint blottoljuk.

e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig UV-transzparensre helyezve az RNS-t rögzítjük.

Ezt követően a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint következik a prehibridizáció, a hibridizáció és az autoradiográfia.

2.4. Szendvics-hibridizációA szendvics-hibridizáció (86. ábra) során a vizsgálni kívánt vírus genomjából két egymással nem átfedő szakaszt kiválasztanak, ezeket klónozzák, majd az egyik szakaszt csapdaként használják és egy, az ELISA-módszernél használatos mikrotiterlemez falához kötik. Ha ilyen mintahelyekbe az adott vírust tartalmazó szuszpenziót pipettáznak, akkor a csapda megköti a hibridizáló vírusrészecskéket. A nem kötődött anyagot mosással eltávolítják. Ezután a másik klónt, a másik genomdarabot viszik a lyukakba, de ez a klón már jelölve van (pl. alkalikus foszfatázzal), így a vírus-RNS koncentrációjával arányos hibridizációs szignál (színreakció) megfelelő műszer segítségével mennyiségileg is értékelhető.

86. ábra - A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán]

2.5. PróbakészítésA hibridizáció során alkalmazott próba egy olyan RNS- vagy DNS-fragmentum, amely homológ a vizsgálandó molekulával. Az RNS-sel való bánásmód sok körültekintést igényel, ezért sokkal gyakoribb a DNS-próbák használata. A virológiában a vírus egy részéről készült komplementer DNS-klón (cDNS) használatos próbakészítéshez. A cDNS-klón készítésekor (87. ábra) vírus-RNS-ről reverz transzkripció segítségével „elsőszál” cDNS készül. A keletkező elsőszál-cDNS RNS részét RNáz H segítségével részlegesen bontják, és a megmaradó RNS-fragmentumok szolgálnak primerként a DNS-polimeráz I működéséhez, amely szintetizálja a cDNS második szálát. A cDNS-t restrikciós enzimekkel vágva, az ugyanolyan restrikciós enzimmel hasított vektorba (plazmidba) illesztik, majd a rekombináns plazmidot egy adott baktériumsejtbe transzformálják, és abban felszaporítják. A plazmid a baktériumból bármikor tisztítható, és a kinyert DNS tetszőlegesen használható próbakészítéshez, illetve bármely génsebészeti eljáráshoz. Az egyes DNS-fragmentumok in vitro körülmények között is szaporíthatók polimeráz láncreakció segítségével. Azért, hogy a hibridizáció során keletkező hibridek detektálhatók legyenek, a próbákat jelölni kell. A jelölés történhet radioaktív és nem radioaktív eljárással (Brown, 1990).

87. ábra - A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után]



A radioaktív jelölési módszerek közül a leggyakoribb a „nick”-transzláció és a primer meghosszabbítás. A nick-transzláció (88. ábra) során a DNáz I-enzimmel kezelt DNS-szálakon nick-ek (nukleinsav-folytonossági hiányok) jönnek létre, amelyeket az Escherichia coli DNS-polimeráz a komplementaritás elve szerint „befoltoz” a négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát felhasználásával, amelyek közül az egyik alfa helyzetben 32P izotópot tartalmaz. A polimerizáció mellett az enzimnek 5’–3’exonukleáz-aktivitása is van, így az eredeti nick tovább bővíthető, a polimeráz halad tovább a láncon, és közben beépíti a jelölt dezoxiribonukleozidokat is.

88. ábra - Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, : Végső nick⇓ pozíció, →→→→ : Jelölt szál [Brown, 1990 után]

Az ún. véletlen (random) priming módszerénél a DNS-polimeráz I nagyobb egységét, a Klenow-fragmentumot



vagy a T7 DNS-polimeráz enzimet használják. A reakció során a jelölendő DNS-t denaturálják, majd random hexanukleotidokat, polimeráz enzimet, alfa-32P dezoxiribonukleozid-trifoszfátokat adnak a reakcióelegyhez. A hexanukleotidok a denaturált DNS-hez hibridizálnak, és primerként szolgálnak. A polimeráz enzim a primerekhez kapcsolódik, és a jelölt bázisokat beépítve meghosszabbítja azokat. E módszerrel a nick-transzlációhoz képest 2–5-szörös specifikus aktivitás érhető el. Napjainkban a PCR-technikával történő próbakészítés is egyre gyakoribbá válik.

A nem radioaktív jelölési módok közül a legelterjedtebb a biotinálás (89. ábra). Ezekben a reakciókban a biotint, mint haptént (biotin-II-dUTP) pl. nick-transzlációval beépítik a próbába, majd a szignált Southern-hibridizáció után két lépésben előhívják. A filtert először a biotinhoz specifikusan kötődő olyan streptavidinnel reagáltatják, amelyhez jelző (reporter) molekulaként alkalikus foszfatáz enzimet kötöttek. Így egy DNS-enzim komplex jön létre. Ha az enzim szubsztrátjával inkubálják a nitrocellulóz filtert, színes csíkok mutatják a hibridek helyét.

89. ábra - A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után]

3. Nukleinsav-szekvencia meghatározásaA nukleinsavak bázissorrendjének meghatározására a Maxam és Gilbert (1977)-féle kémiai degradáló és a Sänger és Coulson (1975)-féle láncterminációs módszer ismert, amelyek közül jelenleg a láncterminációs módszert használják. Ahhoz, hogy egy vírus teljes genomjának szekvenciáját meghatározzák, először cDNS-klónokat kell készíteni, mégpedig úgy, hogy ezek a klónok a teljes vírusgenomot átfedjék. A vírusok esetében a kisméretű genom megkönnyíti a szekvencia meghatározását. Nagyobb genomok bázissorrendjének meghatározása már komolyabb feladat, de az automatizált (gépi) szekvenálás terjedésével egyre inkább megvalósítható.

A láncterminációs módszer során a vizsgálandó DNS-t először egyszálúvá teszik. A folyamat kulcsenzime, a DNS-polimeráz I alkalmas arra, hogy az egyszálú DNS kiegészítő szálát elkészítse, de ehhez szükség van egy rövid kétszálas szakaszra is, amely az indító szerepét játssza. Az egyszálú DNS-hez tehát egy rövid oligonukleotid primert hibridizálnak, amelytől kezdődően elindulhat a második szál szintézise. A



szekvenáláshoz négy reakció készül, ezek mindegyike tartalmazza a mintául szolgáló egyszálú DNS-t és a hozzá hibridizált primert, valamint tartalmazzák a négyféle nukleozid-trifoszfátot (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) is. A nukleozid-trifoszfátok közül az egyiket radioaktívan jelölik, hogy a termék később kimutatható legyen.Tartalmaznak az elegyek továbbá didezoxi-NTP-t (ddNTP), de mindegyik elegy csak egyfélét. A DNS-lánc felépülését katalizáló polimeráz enzim jelenlétében megindul a mintának megfelelő komplementer szál szintézise. Azok a mesterségesen felépülő szálak azonban, amelyekbe nem dezoxi-nukleozid-trifoszfát (dNTP), hanem ddNTP épül be, nem tudnak tovább gyarapodni, mert a „rossz” nukleozid-trifoszfát ribóz részének 3’-helyzetű szénatomján nincs hidroxilcsoport, így ehhez nem tud kapcsolódni a következő nukleotid. Ha a ddNTP és a dNTP aránya megfelelő, akkor a ddNTP beépülésekor létrejövő lánctermináció statisztikusan úgy oszlik el, hogy az összes lehetséges vég képviselve lesz. A négyféle reakciót párhuzamosan végzik, és az elegyeket poliakril-amid gélre viszik, ahol elektroforézist végeznek. A gél felbontóképessége maximális, azaz már egy nukleotid különbséget is ki tud mutatni. A négy elegynek megfelelően négy oszlop fut párhuzamosan, s a kapott csíkok magasságából megállapítható, hogy melyik szakasz zárult adeninnel, melyik guaninnal, melyik timinnel és melyik citozinnal; ebből pedig összeállítható a vizsgált DNS bázissorendje. A szekvencia-adatokat nemzetközi számítóközpontokban, ún. génbankokban helyezik el. A saját szekvencia gyors komputeres programok segítségével összehasonlítható a génbankban levő ismert szekvenciákkal (Sain és Erdei, 1985).

A Maxam és Gilbert (1977)-féle szekvenálás során a radioaktív végjelölésű egyszálú DNS-mintát négyfelé osztják, és négy roncsolási reakciót végeznek. Ezek során elbomlik a G-, az A- és a G-, a T- és a C-, illetve a C-bázis. A roncsolási reakciót úgy végzik, hogy a reakció részleges, azaz minden lehetséges köztes termék egyidejűleg jelen legyen. A keletkezett fragmentumokat elektroforézissel választják el, és a jelölt részeket autoradiográfiával azonosítják (Sain és Erdei, 1985).

A nukleinsav-szekvencia meghatározásának módszertanát Sambrook et al. (1989) részletesen tárgyalja.

4. Polimeráz láncreakció (pcr)A vizsgálandó nukleinsavmintát a polimeráz láncreakció segítségével in vitro körülmények között szaporíthatjuk fel (amplifikálhatjuk). Ez azért alapvető jelentőségű, mert a vizsgálatokhoz sok esetben nem áll rendelkezésre megfelelő mennyiségű kiindulási anyag, RNS vagy DNS. A szekvencia-specifikus amplifikáció lehetőséget ad arra, hogy igen kis mennyiségben jelenlevő (vírus-)nukleinsavat is kimutathassunk (Saiki et al., 1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A PCR-reakció lényege (90. ábra) az, hogy a denaturált DNS két láncához két ismert szekvenciájú, kb. 20 bázispár hosszúságú primert hibridizálunk, melyek a felszaporítandó szakasz két végét jelölik ki, majd DNS-polimeráz segítségével megtörténik a primerek meghosszabbítása. Ez a reakciósor ciklikusan ismétlődik, újabb és újabb minta-DNS-szekvenciák keletkeznek. A reakció tehát exponenciális lesz, azaz 20–30 ciklus után a célszekvencia 106-szoros mennyiségi növekedése érhető el. Ezért az amplifikációhoz pikogramm (10–12 g) mennyiségű vizsgálati anyag is elegendő lehet. A PCR fő lépései: 1. denaturáció általában 94 °C-on; 2. anel-lálás a primerek olvadási hőmérsékletétől kb. 5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten (45–60 °C-on); 3. polimerizáció 68 vagy 72 °C-on (Sambrook et al., 1989).

90. ábra - A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után]



A reakció kulcsa a rendkívül hőstabil Taq-polimeráz enzim, amely lehetővé teszi a reakciósor automatizálását. Az amplifikációra gyárilag előállított készüléket használnak, amelyekben a ciklus egyes lépéseinek paraméterei előre programozhatók.

A felszaporított DNS-t általában agarózgélben, etídium-bromidos festés után teszik láthatóvá és hasonlítják össze megfelelő méretmarkerrel, illetve a PCR-termék specifikus azonosítására a Southern-hibridizáció is alkalmazható.

A PCR során keletkező termék kívánság szerint klónozható, illetve közvetlenül szekvenálható is.

Megjegyzés: A PCR-technika nagy előnyei az érzékenység, a fajlagosság és a gyorsaság. Magas fokú érzékenysége miatt speciális laboratóriumi körülmények biztosítását igényli azért, hogy az idegen, nemkívánatos szekvenciák felszaporítása elkerülhető legyen (egyszer használatos eszközök, reagensek ellenőrzése, jól ismert pozitív és negatív kontrollok alkalmazása stb.). A vírusdiagnosztikában azért előnyös a PCR használata, mert rendkívül specifikus, és a mintavételtől számított 4–6 órán belül eredményt ad. A növényvírusok jelentős része RNS-genomot tartalmaz, ezért a polimeráz láncreakciót itt megelőzi egy reverz transzkripciós lépés, amelynek terméke az az első szál komplementer DNS-e lesz, amely az ezt követő PCR templátjául szolgál (91. ábra). A polimeráz láncreakció alkalmazását korlátozó tényező azonban az, hogy az oligonukleotid primerek megtervezéséhez pontos szekvencia-adatokra van szükség.

91. ábra - Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS



(cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után]

A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR)

A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR) a dot-blot hibridizációnál említett összes nukleinsav-kivonással kezdődik. Ezt követi a reverz transzkripció (elsőszál-cDNS-készítés) és a polimeráz láncreakció.

• Reverz transzkripció

a. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként, majd helyezzük a mintákat 1 órán át 42 °C-os vízfürdőbe: 2,0 µl nukleinsavoldat (össznukleinsav-kivonásból); 4,4 µl H2O; 2,0 µl 5 × M-MuLV-puffer; 0,1 µl 0,1 M DTT; 0,1 µl RNáz-inhibitor; 1,0 µl 5mM dNTPk; 0,2 µl oligo dT (20 pmol) vagy 3’-vég primer (20 pmol); 0,2 µl M-MuLV Promega (200 u/µl) reverz transzkriptáz.

b. Egy óra elteltével helyezzük a mintákat jégre, vagy tárolás esetén –20 °C-ra.

• Polimeráz láncreakció

c. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként egy-egy 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe: 38,7 µl H2O; 2 µl cDNS; 5µl 10 × Taq-puffer; 2µl 5mM dNTPk; 1 µl Primer 1 (100 ng); 1 µl Primer 2 (100 ng); 0,3 µl Taq polimeráz Promega (5 u/µl); 30 µl paraffinolaj. Az olajat csak a végén kell rácseppenteni.

d. A reakciót egy előre programozott PCR-készülékbe helyezzük, amikor az már a 94 °C-ot elérte.

e. A reakció befejezése után az olaj alól óvatosan kipipettázzuk az oldatot, és az olajat kloroformos extrakcióval



eltávolítjuk.

f. A mintákból 6–6 µl-t 1%-os agarózgélen elektroforetizálunk.

Ajánlott program egy kb. 1000 bp hosszúságú DNS szakasz kiemelésére, ha a primerek olvadási hőmérséklete kb. 60 °C:

Program Kezelés Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám

a) denaturálás 94 °C 4 perc 1

b)

denaturálás

annelálás

polimerizálás

94 °C

55 °C

72 °C

1 perc

1 perc

1 perc

35

c) polimerizálás 72 °C 10 perc 1

d) tárolás 4 °C állandó


16. fejezet - Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok1. A növényi hormonok jellemzéseA növények növekedését szabályozó anyagok, más néven a fitohormonok élettani szerepük alapján két csoportra oszthatók: juvenil- és szeneszcenciahormonokra. A növények élettani állapotát a növekedésszabályzó anyagok közösen, egymásra is kölcsönhatást gyakorolva alakítják ki.

1.1. JuvenilhormonokHatásukra általában az jellemző, hogy a növény anyagcsere-folyamatait, sejtosztódását és a tápanyagok felhalmozódását serkentik, a generatív fázisba történő átmenetet viszont késleltetik, tehát juvenilis (fiatal) állapotban őrzik meg a növényt.

Auxinnak tekinthetünk minden olyan növekedésszabályozó anyagot, amelyek biológiai hatása az indol-3-ecetsavéval megegyezik (pl. fenil-ecetsav, naftil-ecetsav, indol-vajsav). A felsorolásból kitűnik, hogy nem csak indolszármazékok lehetnek auxinok, de a növényi szervezetben az indol-3-ecetsav (92. ábra) bizonyosan a legáltalánosabb auxin hatású növekedésszabályozó. Ez a fejezet az auxin hatású vegyületek széles köréből csupán az indol-3-ecetsav meghatározásának módszertani kérdéseivel foglalkozik.

92. ábra - Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete

Az indol-3-ecetsav szintézise a fiatal levelekben és hajtáscsúcsokban történik triptofánból, bazipetális transzportja a floemben zajlik. Érdemes megjegyezni, hogy a növény szöveteiben található nagyszámú indolvegyület egy részéről közismert, hogy az indol-3-ecetsav bioszintézisének köztes termékei (triptamin, indol-3-piroszőlősav, indol-3-acetaldehid stb.), míg másoknak az indol-3-ecetsav raktározásában és szállításában lehet szerepe. Így az indol-3-etanolnak, továbbá sok indol-3-ecetsav konjugátumnak (glükóz, mio-inozit, cellulóz-glükán, glükoprotein és polipeptid észtereknek) hasonló szerepe van.

Az auxinok legnyilvánvalóbb hatása a megnyúlásos növekedés serkentése. A sejtek szintjén ez úgy valósul meg, hogy a növényi sejtfal a hormon hatására fellazul, rugalmassá válik, majd a sejtekbe víz diffundál, ezáltal a sejtek kiterjedése megnő.

A gibberellinek csoportjához sok hasonló szerkezetű (tetraciklikus diterpenoidsav) vegyület tartozik (93. ábra). Az ismert gibberellinek száma meghaladja a 110-et (Kende és Zeevaart, 1997). Elsősorban az érett kloroplasztiszokban képződnek. A gibberellinek két nagy csoportra oszthatók: a C19 és a C20 típusú


Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok

gibberellinekre (molekulavázuk 19, ill. 20 szénatomot tartalmaz). A C19 típusú gibberellinek biológiailag aktívak, a C20 típusúak pedig – ismereteink szerint – a C19 gibberellinek metabolikus prekurzorai. A gibberellinek bioszintézisének kiinduló vegyülete a mevalonsav.

93. ábra - A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete

Hatásukat a merisztematikus szövetekre fejtik ki, egyrészt a sejtosztódás fokozásával, másrészt a már nem osztódó, de még nem differenciálódott sejtek megnagyobbodásának indukálásával. Aktivitásuk eredménye sok tekintetben az indol-3-ecetsavhoz hasonló, ami arra utal, hogy részben az auxinszintézis serkentésén keresztül fejtik ki hatásukat.

A citokininek a sejtosztódás szabályozásáért elsősorban felelős növényi hormonok. A szabad citokininbázisok többsége izopentenil oldalláncot viselő adeninszármazék. Két alaptípusuk a zeatin (Z) és az izopentenil-adenin (iP) (94. ábra). A purinváz 9. nitrogénatomjához gyakran kapcsolódik ribóz vagy glükóz gyűrű, ilyen például a 9-zeatin-ribozid ([9R]Z), vagy a 9-izopentenil-adenin-ribozid ([9R]iP), amelyeket citokinin-nukleozidoknak neveznek. A cukor-molekulához foszfátcsoport is kapcsolódhat, ezek a citokinin nukleotidok.

94. ábra - A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti képlete



Szintézisük a gyökerek osztódó szöveteiben, csúcsirányú szállításuk a xylemben történik. A citokininek sejtosztódást fokozó hatásuk mellett a sejtek differenciálódását is serkentik, továbbá indukálják a növényi szövetben a tápanyagok felhalmozódását, viszszatartását.

1.2. SzeneszcenciahormonokJellemző élettani hatásuk a növény szintézisfolyamatának gátlása, a légzés fokozódása és a generatív fázisba (virág- és termésképzésbe) történő átmenet serkentése, amelyek a növények szeneszcenciája (öregedése) irányában hatnak. A növényt ért stresszek következtében aktivitásuk megnő.

Az etilén (95. ábra) a növekedést serkentő hormonok antagonistája, a megnyúlásos növekedés fékezője. Szintézise a metioninciklusból vezethető le, de telítetlen zsírsavak peroxidációja során is képződik. További élettani hatásai: a légzés fokozódása, a virágképzés indukciója, a termésérés serkentése és a levelek leválása. A növényre ható biotikus és abiotikus stresszek szintén megnövekedett etiléntermelést okoznak.

95. ábra - Az etilén szerkezeti képlete

Az abszcisszinsav a növényi szintetikus folyamatok széles körének gátló hormonja, mely a gibberellinekhez hasonlóan diterpenoid vegyület (96. ábra). A plasztidokban szintetizálódik, hatását az intenzív anyagcserét folytató szövetekre fejti ki. A növekedés gátlása mellett szabályozza a levelek leválását, valamint a rügyek



nyugalmi állapotát. Szárazság- és hidegstressz hatására a növények abszcisszinsav-tartalma fokozódik, és így emelkedik ezekkel a stresszekkel szembeni ellenálló képességük.

96. ábra - Az abszcisszinsav szerkezeti képlete

2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásaiVírusfertőzött növények auxinszintjét vizsgálva ellentétes eredmények születtek: bizonyos esetekben csökkent az auxinszint, más esetekben viszont nőtt. További nehézséget jelent a vírusok által okozott auxinkoncentráció-változás hatásának értékelésében az, hogy az auxin kis mennyiségű jelenléte serkenti a növekedést, nagyobb töménységben pedig gátolja azt, sőt az egyes növényi szervek növekedése számára optimális auxinkoncentrációk között is nagyságrendi különbségek vannak. Smith et al. (1968) szerint cukorrépa, bab és paradicsom levélszöveteiben a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) szisztemikus fertőzése után az auxintartalom csökkent ugyan, de ez nem volt arányos a tünetek mértékével, mert a rezisztens növényekben, ahol a vírus szaporodása korlátozott mértékű volt és a tünetek is csak minimálisan fejlődtek ki, az auxin mennyisége ugyanúgy csökkent, mint a fogékony növényekben, ahol a tünetek súlyosak voltak. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzésére hiperszenzitíven reagáló dohánynövényekben Van Loon (1979) vizsgálatai során az inokulált levelek auxinszintjének nagymérvű növekedését tapasztalta a léziók kifejlődése alatt. A vírusfertőzés iránt szisztemikusan fogékony gazdanövény beteg leveleiben viszont a hormon koncentrációjának csökkenését észlelték (Rajagopal, 1977).

Olyan esetekben, amikor a vírusfertőzést törpüléses tünet kíséri, a fertőzött növényekben a gibberellinek tartalma gyakran csökkent. Ezt tapasztalták uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzött uborkában (Bailiss, 1977). Ez a folyamat külsőleg adott gibberellinekkel visszafordítható (Fernandez és Gáborjányi, 1976), bár számításba kell venni azt, hogy a gibberellines kezelés mindenképpen serkenti a szár megnyúlását, akár fertőzött volt a növény, akár nem. Meg kell továbbá azt a tényt is említeni, hogy a törpüléssel járó vírusbetegségek, így a paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) fertőzése paradicsomon (Bailiss, 1968) vagy az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) árpán (Russel és Kimmins, 1971) sejtszámcsökkenést (mitózisgátlást) indukálnak. A gibberellinek viszont inkább a sejtek kiterjedését fokozzák (Russel és Kimmins, 1971), jóllehet egészséges növényekben a sejtosztódásra is hatásuk van (Bailiss, 1968). Feltételezhető tehát, hogy a gibberellin-aktivitás gátlása nem az elsődleges oka a vírusok által előidézett törpülésnek. A gibberellinek törpülést enyhítő hatása a peroxidáz jellegű auxin-oxidáz gátlásával magyarázható (Gáborjányi et al., 1973).

A vírusfertőzött növények citokinin-tartalmára vonatkozó vizsgálatok eredményei az auxinokhoz hasonlóan ellentmondásosak. A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) fertőzése csökkentőleg hat a citokinin-tartalomra tehénborsó gyökérszöveteiben (Kuriger és Agrios, 1977) és Nicotiana glutinosa inokulált leveleiben (Tavantzis et al., 1979). Ezzel ellentétben Balázs et al. (1977) dohány mozaik vírussal fertőzött ‘Xanthi-nc’ hiperszenzitív dohány félleveleiben az összcitokinin szintjének emelkedését mérték. Ugyanezt tapasztalták olyan ‘Xanthi-nc’ növények nem fertőzött felső leveleiben is, ahol az alsó leveleket előzőleg dohány mozaik vírussal inokulálták. Ez a megfigyelés felveti azt a lehetőséget, hogy a megemelkedett citokinin-aktivitás öszszefügg a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásával. A citokininszint a dohány mozaik



vírussal szisztemikusan fertőzött ’Samsun’ dohánylevelekben is megemelkedett (Sziráki és Balázs, 1977).

Vírusfertőzés esetén a hiperszenzitív dohányok fokozott etiléntermelését mutatták ki (Balázs et al., 1969). A nekrózisok száma, nagysága és az etilénprodukció között egyenes összefüggés figyelhető meg (Nakagaki et al., 1970). Tekintettel arra, hogy az etiléntermelés emelkedése csak néhány órával előzi meg a nekrózisok megjelenését, ráadásul az eredetileg fertőzött sejtek elhalása már kissé előbb bekövetkezik, mint ahogy a látható léziók kialakulnának, valószínűnek látszik, hogy az etilén nem kiváltó oka a lézióképződésnek. Ezt támasztja alá az is, hogy a lokális klorózist okozó vírusfertőzés szintén megemelkedett etiléntermeléssel jár együtt (Gáborjányi et al., 1971). A dohány mozaik vírussal szisztemikusan fertőzött dohánylevelekben az etilén termelése nem növekszik (Balázs et al., 1969).

Az abszcisszinsav növekedést gátló tulajdonsága jól ismert, mégis viszonylag kevés vizsgálatot végeztek vírusfertőzött növények abszcisszinsav-tartalmára vonatkozóan (Balázs et al., 1973). A legtöbb kísérletet dohánynövényeken végezték, és azt tapasztalták, hogy vírusfertőzés hatására a hormon képződése fokozódik. Whenham és Fraser (1981) a dohány mozaik vírus közönséges törzsével szisztemikusan fertőzött ‘White Burley’ dohányok szöveteiben hatszoros abszcisszinsav-koncentrációt mértek a kontrollnövényekhez képest. Lokális léziót adó dohány–dohány mozaik vírus kapcsolatában a hormon koncentrációja szintén megnőtt. Az abszcisszinsavszint az inokulált növények nem fertőződött leveleiben is megemelkedett, és a levelek növekedése gátlást szenvedett. Tekintve, hogy mind az abszcisszinsav, mind a vírusfertőzés gátolja a sejtosztódást, a tanulmány készítői arra a következtetésre jutottak, hogy a fertőzött levelek csökkent növekedését a hormonaktivitás serkentése okozta.

3. A növényi hormonok meghatározásaA növényi hormonok meghatározása azért bonyolult feladat, mert 1. a szövetekben nagyon alacsony (ng) koncentrációkban fordulnak elő, 2. a növények nagy változatossággal termelnek hasonló kémiai szerkezetű molekulákat, amelyek nem rendelkeznek hormonaktivitással, 3. kis molekulatömegűek, kémiai szerkezetük nem nagyon specifikus, 4. az extrakciós és a tisztítási lépések során könnyen bomlanak, 5. a hormonok több csoportja nem egységes (pl. az izopentenil-adenin és a zeatin típusú citokininek két fajtája vagy a C 19 és a C20

szénvázú gibberellinek nagy száma ismert), a meghatározásukra használt analitikai módszerek ezért többnyire egy-egy adott kémiai szerkezettel bíró vegyületre irányulnak és nem az azonos biológiai aktivitással rendelkező vegyületcsoport összes tagjára, továbbá 6. a növényen belül az egyes szervek hormontartalma igen eltérő.

A növényi hormonok kvantitatív meghatározásának alapjai

A növényi növekedésszabályozó anyagok meghatározása a biológiai aktivitáson alapuló biotesztekkel, fizikokémiai módszerekkel vagy immunanalitikai módszerekkel történik (Brenner, 1981; Hedden, 1993). A biotesztekre csak az etilén esetében térünk ki. A fizikai-kémiai módszerek lépései a következők: mintavétel, kivonatkészítés v. extrakció, minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás) és mennyiségi analízis.

• Mintavétel

Vírusfertőzött és egészséges növények összehasonlító vizsgálatakor a mintákat azonos körülmények között nevelt, ugyanolyan élettani állapotú növények megfelelő szervéből és szövetéből kell venni.

• Kivonatkészítés vagy extrakció

A metanol 80%-os vizes oldata a legelterjedtebb extrahálószer. Lényeges, hogy a kivonás során a vizsgálni kívánt hormonvegyületek ne hidrolizáljanak, más kémiai reakciókban vagy enzimes úton ne károsodjanak. Célszerű nagy tisztaságú kivonószerrel dolgozni, érdemes továbbá egy olyan mintát is készíteni és a többivel azonos módon tisztítani és mérni, amelybe növényi anyagot nem teszünk, csak extrahálószert.

• Minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás)

Lehetséges lépései a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás, a szilárd fázisú extrakció, a hagyományos oszlopkromatográfiás, a vékonyréteg-kromatográfiás, a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás és a gázkromatográfiás elválasztás.

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás a különböző polaritású oldószerekben való eltérő megoszláson alapul. Az oldószer kioldóképességének a megadott körülmények (pH stb.) mellett optimálisnak kell lennie a megfelelő hormonra nézve. A két fázis elválását gátló anyagok (pl. foszfolipidek) rontják a



hormonok kioldásának hatékonyságát. A hormonokat kioldó szerves fázis (pl. 1-butanol, etilacetát) tartalmazhat kismértékben vizes puffert, ami az oldószer elpárologtatása során töményebbé válik, és ez szélsőséges pH-viszonyokat eredményezhet. Ezért érdemes a szerves fázist a bepárlás előtt vízzel extrahálni, vagy a pH-ját semlegesíteni.

A szilárd fázisú extrakció lényege, hogy a nyers növényi kivonatot egy kisméretű, eldobható oszlopon tisztítják, aminek töltetén a vizsgálni kívánt anyag, egyéb mintakomponensekkel együtt, megkötődik. A szennyezőkomponenseket azután különféle oldószerekkel eltávolítják az oszlopról, majd egy alkalmas oldószerrel a vizsgálandó mintaalkotót is kinyerik. A módszer előnyei a gyors és egyszerű kivitelezhetőség, a kérdéses mintaösszetevő kedvezően magas kinyerhetősége (kicsi az elválasztási veszteség) és az alacsony oldószerigény. Az oszlop töltete a leggyakrabban szilikagélhez kémiailag kötött oktadecil-szilán (= ODS vagy C18), de kation- és anioncserélő töltetek, valamint egyszerű szilikagél-adszorpciós töltetek használata is elterjedt.

A hagyományos oszlopkromatográfiás elválasztás főként fenolszármazékok és pigmentek eltávolítására alkalmas. Az oszlopok töltete lehet oldhatatlan polivinil-pirrolidon (PVP), Sephadex LH-20, DEAE-cellulóz, továbbá Dowex-50, Duolit és cellulóz-foszfát ioncserélő töltetek, aktív szén, Cellit vagy szilikagél-adszorpciós töltetek.

A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás mind hatékonyságában, gyorsaságában, mind mintakapacitásában elmarad a nagyhatékonyságú folyadékkromatográf teljesítményétől, alkalmazását gazdasági megfontolások tehetik indokolttá. Növényi hormonok elválasztására cellulóz- és szilikarétegek használatosak.

A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztás (HPLC) az előzetes tisztítási lépéseken átesett növényi minta összetevőit nagy hatékonysággal elválasztó, gyors módszer. Az oszlop töltete fordított fázisú HPLC esetén – aminek alkalmazása igen elterjedt – a legtöbbször oktadecil-szilán (ODS).

A gázkromatográfiás elválasztás (GC) hatékony, gyors kromatográfiás módszer. Korlátozott mintakapacitása miatt többlépéses minta-előkészítési folyamat esetén általában az utolsó kromatográfiás művelet. A hagyományos, töltött gázkromatográfiás kolonnákat a kapilláris oszlopok váltják fel. A növényi hormonok (az etilén kivételével) nem eléggé illékonyak, ezért származékképzéssel alakítják át szerkezetüket, hogy gázkromatográffal elválaszthatóak legyenek. Ilyen származékképző eljárás a metilezés vagy a trimetil-szililezés.

• Mennyiségi meghatározás

A növényi hormonok kvantitatív meghatározása hatékony elválasztást biztosító kromatográfhoz (HPLC, GC) kapcsolt, megfelelő szelektivitású detektorokkal vagy immunanalitikai módszerekkel (RIA, ELISA) történhet. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográf detektorok két típusa terjedt el növényi hormonok mérésére: a fluoreszcens detektorok és az elektrokémiai detektorok. A fluoreszcens detektorokat elsősorban in-dol-3-ecetsav mérésére használják, mert az indolvegyületek mérésére minden kémiai származékká történő átalakítás nélkül alkalmasak. Az elektrokémiai detektorok oxidatív üzemmódban használva szintén indol-3-ecetsav mérésére alkalmasak, ha az aminocsoport nitrogénmolekulája nem kötött.

A növényi hormonok gázkromatográfiás meghatározása a következő detektorokkal történhet: elektronbefogásos detektor, nitrogén–foszfor detektor és tömegspektrométer. Az első kettő alkalmazása szórványos, a tömegspektrométer használata azonban széles körben elterjedt.

Az elektronbefogásos detektor erősen elektronegatív vegyületekre, tehát halogénezett származékokra és bizonyos aromás molekulákra szelektív detektor. Az abszcisszinsav metil-észterének, illetve más növényi hormonok halogénezett csoportot tartalmazó mesterséges származékainak meghatározására alkalmas. A nitrogén–foszfor detektort nitrogén- vagy foszfortartalmú molekulák szelektív detektálására használják, tehát indol-3-ecetsav- és citokinin-származékok mérésére. A tömegspektrométer a gázkromatográfhoz kapcsolható legnagyobb szelektivitással rendelkező detektortípus. A minta elválasztott komponensei egy ionforrásban ionizált töredékekre hasadnak. Minden vegyület egyedi szerkezetéből adódóan azonos ionizáló energia hatására következetesen ugyanazokra az ionizált töredékekre hasad, és az egyes töredékek képződésének aránya is állandó marad. A berendezés analizátora a töredékeket tömeg/töltés arányuk alapján elválasztja, a detektor pedig érzékeli mennyiségüket, amelyet az ún. tömegspektrumban különböző magasságú függőleges vonalak formájában láthatunk. A töredékek képződése (azonos ionizáló energia mellett) állandó, ezért egy bizonyos komponens tömegspektrum-mintázata (a töredékek egymáshoz viszonyított intenzitása, azaz mennyiségük) is azonos.

• Immunanalitikai vagy szerológiai módszerek



Kiváló szelektivitásuk mellett megfelelő érzékenységet biztosító módszerek, melyek alacsony tisztaságú növényi minták esetében is alkalmazhatóak. A növényi növekedésszabályozók kis molekulatömegük miatt nem immunogének, ezért nagyméretű fehérjékhez (marha-szérumalbumin vagy tojásfehérje) kötik őket, alkalmassá téve melegvérű állatok (többnyire nyulak) immunizálására. A termelt antiszérum érzékenysége és egyéb vegyületekkel szemben adott keresztreakciója nagymértékben függ az immunizálás során használt hormonfehérje komplex kötésétől. Lényeges feltétel, hogy a fehérjemolekula ne a vizsgálni kívánt hormon valamelyik fő funkcionális csoportjához kötődjék, ami az antitestképződés során epitópként szerepelne. Több vizsgálati módszer ismert.

A radioaktív immunanalitikai módszerek (RIA) közös elve a radioaktív izotóppal jelzett hormonvegyületek és a növényi mintában jelen lévő, azonos típusú hormonmolekulák versengése a specifikus antiszérum-kötőhelyekért. Az elegyben mérhető radioaktív izotóp koncentrációja fordított arányban áll a minta hormontartalmával.

Az enzimhez kötött immunanalitikai módszerek (ELISA) alapja az, hogy a vizsgálatok során a növényi mintában lévő hormonmolekulák peroxidáz vagy alkalikus-foszfatáz enzimhez kötött hormonvegyületekkel versengenek az antiszérum-kötőhelyekért. Az egyensúlyi állapot kialakulását követően az enzim szubsztrátját az elegyhez adva színreakciót kapunk, amelynek intenzitása fordítottan arányos a minta hormontartalmával.

• Belső standardok használata

A növényi hormonok meghatározását többlépéses minta-előkészítési művelet előzi meg, ami a vizsgálni kívánt vegyületre nézve veszteséggel jár. A folyadék–folyadék megoszlás tökéletlensége, a foszfolipidek vagy a fehérjék általi megkötés, a kémiai átalakulás és az üvegeszközök felületén való megkötődés egyaránt rontja a kinyerhetőség hatékonyságát. A kivonatkészítés során a mintához adott – ismert mennyiségű – standard vegyület koncentrációja azonban az utolsó (analitikai) lépésnél visszamérhető, aminek ismeretében következtethetünk a tisztítási-elválasztási lépcsők együttes kinyerési hatékonyságára és a növényi minta eredeti hormontartalmára. A belső standardot célszerű úgy megválasztani, hogy kémiai szerkezete nagyon közel álljon ahhoz a mintaalkotó vegyülethez (növényi hormonhoz), amit vizsgálni szeretnénk. A hozzáadott belső standard mennyiségének megválasztásakor törekedni kell arra, hogy a mintaelegyben lévő koncentrációja a minta várható hormontartalmával megközelítőleg egyezzen. A leggyakrabban használt belső standardok a 14C vagy 3H radioaktív izotóppal jelzett abszcisszinsav, az indol-3-ecetsav, a G3-gibberellin vagy a zeatin, valamint tömegspektroszkópiás detektálás esetén a 2H és 15N nem radioaktív nehéz izotópokkal egyszeresen vagy többszörösen jelzett hormonvegyületek.

3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározásaAz indol-3-ecetsav kivonása növényi mintákból

Az indol-3-ecetsav (IES) kivonása történhet hagyományos módon, metanol 80%-os vizes oldatával, vagy egyéb IES kivonására alkalmas módszerekkel. Ilyen a növényi minta 65% i-propanolt tartalmazó 0,2 M-os imidazol-pufferben (pH 7,0) történő homogenálása (4 ml kivonószer/g minta arányban). A belső standard hozzáadása után a homogén növényi macerátumot 1 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 10 000 g fordulatszámon 5 percig centrifugáljuk, a továbbiakban pedig a felülúszóval dolgozunk (Chen et al., 1988).

Az indol-3-ecetsav elválasztása

• Folyadék–folyadék megoszláson alapuló elválasztás

Az IES oldékonysága, megoszlása a szerves és vizes fázis között a pH függvényében változik. Semleges vagy lúgos kémhatású közegben a karboxilcsoport protonja disszociál, a molekula negatív töltést hordoz, oldékonysága poláros oldószerekben (pl. desztillált vízben) sokkal jobb. Savas kémhatású közegben azonban a hidrogénion nem disszo-ciál, a molekula töltés nélküli állapotban van, ezért ilyenkor apoláros oldószerekben jobban oldódik. A kivonás során kapott minta IES-tartalmát tehát gyengén lúgos (pH 8,0), 0,1 M-os foszfát-pufferben oldva, etilacetáttal szemben el lehet választani a semleges indolvegyületektől (pl. indol-3-etanol, indol-3-metanol, indol-3-aldehid). Az oldat pH-ját csökkentve (pH 3,0) az IES oldékonysága megváltozik, etilacetáttal kivonható a vizes fázisból. Az IES mellett a szerves oldószer tartalmazza majd az 5-hidroxil-indol-ecetsavat, a 4-klór-indol-ecetsavat, az indol-piroszőlősavat, a fenil-ecetsavat és más savas karakterű indolvegyületeket, míg a konjugált indolvegyületek és az amfoter összetevők (pl. triptofán) a vizes fázisban maradnak. Az etil-acetát helyett dietil-éter is használható, mely még kevésbé poláros oldószer.



• Hagyományos PVP-oszlopkromatográfia

Oldhatatlan polivinil-pirrolidonnal (PVP) töltött oszlopokat széles körben alkalmaznak IES tisztítására. Az oszlop mérete a minta térfogatától függően igen változatos lehet. Hatásukat alacsony pH mellett a fenolvegyületek visszatartása által fejtik ki, H-kötéseken keresztül. A pH csökkentésével fokozódik az oszlop IES-megkötő képessége, az elválasztás időtartama azonban ezáltal nagyon kitolódik. Kompromisszumként célszerű 4–5 közötti pH-tartományban, citromsav/0,1 M-os Na-foszfát-puffer mozgó fázissal végezni az elválasztást.

• Az indol-3-ecetsav ioncsere-kromatográfiás elválasztása

A savas karakterű indolvegyületek anioncserélő oszlopokon megköthetőek. A DEAE cellulóz (OH –) anioncserélő töltet előkészítése 30 percnyi vízzel való duzzasztással, azután 0,5 M-os H 2SO4 oldatos mosással kezdődik. Ezután vízzel mossák, majd 0,5 M-os NaOH-oldatban 10 percig inkubálják. A töltetet ezt követően desztillált vízzel alaposan átmossák, míg a pH-ja tartósan 7,5 alatt nem marad. A nedves DEAE cellulóz ioncserélő anyagot az ismertetett lépések után megfelelő méretű oszlopba töltik (30 g mintából származó növényi kivonat elválasztására egy 100 mm × 20 mm-es oszlop alkalmas), majd rátöltik az IES-t tartalmazó vizes oldatot, és 300 ml vízzel eluálják. Az IES a töltet kationos csoportjain megkötődik, a minta semleges és bázikus összetevői az oszlopról az eluenssel eltávoznak. Az IES és egyéb savas indolszármazékok 200 ml 50 mM-os Na2SO4-oldattal átmosva választhatók le az oszlopról.

DEAE Sephadex A-25 (acetát–) anioncserélő oszlopot is használnak IES tisztítására. A gél típusú töltetet vízben duzzasztva készítik elő; 0,5 M-os sósavoldattal, majd 0,5 M-os NaOH-oldattal mossák, azután 1 M-os nátrium-acetát-oldatban inkubálják több órán keresztül. Ezt követően desztillált vízzel mossák mindaddig, amíg pH-ja már nem változik. A töltetet ezután 2-propanol/víz (1:1 térfogatarányú) elegyébe áztatják, és nedvesen oszlopba töltik. Az 50%-os propanolban oldott növényi kivonatot az oszlopra töltik, mozgó fázisként szintén 50%-os propanolt használnak. Az elválasztás után a savas karakterű indolszármazékok oszlopról való leválasztása a 2-propanol/víz mozgó fázishoz adott ecetsavoldattal történhet. Az ecetsav koncentrációja a mozgó fázisban növekedhet lépcsőzetesen, vagy 0 és 10% között gradiens módon. Ez a preparatív célú elválasztás viszonylag rövid, 100–200 mm-es oszlopokon elvégezhető. A szükséges oldószertérfogatok és az egyes indolvegyületek retenciós ideje tapasztalati úton állapítható meg (Momonoki et al., 1983; Nonhebel és Bandurski, 1984).

• Az indol-3-ecetsav elválasztása szilárd fázisú extrakcióval

A különféle gyári kiszerelésű, egyszer használatos, eldobható oszlopok széles skálája szerezhető be poláros szilikagél- vagy apoláros oktadecil-szilán- (ODS-) töltettel. HPLC- vagy GC-analízis előtt használják őket. Jó hatékonyságuk alapvető feltétele, hogy a következő analitikai lépés elválasztási mechanizmusa eltérjen az itt használt oszlopétól.

Az ODS-oszlopon történő mintatisztítás egyik lehetősége az oszlop aktiválása 2 ml 1%-os ecetsavval, majd a növényi mintát 1% ecetsavat tartalmazó, 5-10%-os metanololdatban viszik az oszlopra. A mintában lévő szennyezőanyagokat a minta oldószerének további részleteivel távolítják el az oszlopról. Az állófázison megkötődött indolvegyületeket azután 1% ecetsavat tartalmazó, lépcsőzetesen növekvő koncentrációjú (max. 70%-os) metanololdat 2–2 ml-es részleteivel eluálják. Szilikagéltöltet esetében 5 ml 0,5 M-os ecetsavval, azután 5 ml 1% ecetsavat tartalmazó, n-hexán/etilacetát (99:1 térfogatarányú) elegyével kezelve tehetik aktívvá az oszlopot. A minta felvitele után az indolszármazékok 1% ecetsavat tartalmazó, hexánban oldott növekvő koncentrációjú (max. 60%-os) etilacetát-oldat 2–2 ml-es részleteivel nyerhetők vissza az oszlopról. Ezek az oszlopok kevesebb mint 1 g töltetet tartalmaznak, ezért mintabefogadó képességük erősen korlátozott.

• Az indol-3-ecetsav elválasztása HPLC-vel

Fordított fázisú HPLC-rendszerekben az állófázis 5 mm átmérőjű gömb vagy szabálytalan alakú szilikagél hordozószemcsékhez kémiailag kötött szénhidrogénlánc; alkil- (C2, C6, C8, C18) vagy fenilcsoport. Ezek közül az oktadecil-szilán (ODS, ill. C18) terjedt el leginkább a gyakorlatban. Az elválasztás során a mozgó fázis lehet izokratikus (állandó összetételű) és gradiens (az elúció alatt egyre töményebb). Ez utóbbi a csúcselhúzódás kialakulását gátolja. Az eluens valamilyen szerves oldószer, többnyire metanol, etanol vagy acetonitril vízben, illetve vizes pufferben oldva.

Az IES állófázishoz való kötődését a mozgó fázis pH-ja nagymértékben befolyásolja. Mivel savas pH-jú közegben (pH 3,5) az IES karboxilcsoportján lévő hidrogénion nincs disszociált állapotban, tehát a molekula nem hordoz töltést, jobban kötődik az apoláros állófázishoz és lassabban halad át az oszlopon. Az



indolvegyületeket ezért rendszerint savas pH-jú mozgó fázissal eluálják. Ezt a módszert ion-visszaszorításnak nevezik. Ha a mozgó fázis pH-ja nem eléggé alacsony, az IES mennyiségének jelentős része ionos állapotba kerül. Ilyenkor a nem-disszociált és disszociált molekulák retenciós ideje nem egyforma, ami csúcselhúzódást okoz.

Az IES meghatározását fordított fázisú HPLC-ionpár változatával is végezhetik. Ennél a módszernél a mozgó fázis pH-ját pufferrel kb. 6,5-re állítják, és hozzáadnak egy lipofil elleniont, pl. tetrabutil-ammonium-ot (TBA+), amelynek töltése ellentétes az elválasztani kívánt molekula töltésével. Semleges pH mellett az IES disszociált állapotban van és a poláros mozgó fázishoz kötődik. A TBA+ ellenion jelenlétében azonban IES––TBA+ ionpárok alakulnak ki, amelyek eltérő polaritásuk miatt inkább az apoláros ODS állófázishoz kötődnek, ezáltal az oszlop IES-visszatartó képessége nagymértékben megnő.

• Az indol-3-ecetsav gázkromatográfiás elválasztása

A gázkromatográfiás elválasztást megelőző lépés a származékképzés. Az IES éterben diazometánnal metilezhető. A diazometán sárga, erősen mérgező, robbanékony gáz! Éteres oldata N-metilén-N-nitrozo-p-toluénszulfonamidból Schlenk és Gellerman (1960) módszerével, a Cohen (1984) által kifejlesztett egyszerű berendezéssel állítható elő. A mintát teljesen megszárítják, azután metanolban feloldják, majd az éteres diazometánból annyit adnak hozzá, amennyi az oldatot tartósan sárgára színezi. A származékképzés ideje alatt az éter mennyisége legalább ötszöröse kell, hogy legyen a metanol mennyiségének. A reakció igen rövid idő alatt végbemegy, tehát 5 perc múlva a reagenst nitrogéngáz átáramoltatása közben eltávolítják.

Az indolvegyületek másik gyakori származékképzési típusa a trimetil-szililezés (TMS), ami többféleképpen végezhető, ezek közül Badenoch-Jones et al. (1982) módszerét ismertetjük. A száraz mintát kevés metanolban feloldották, majd üvegfiolába töltötték, amelyben szárazra párolták. Ezután diklór-metánt adva a mintához azeotropos bepárlással szárították tovább. A származékképző lépésben az előkészített száraz anyagot 30 μl acetonitril/BSTFA (bisz-trimetilszilil-trifluoracetamid) (1:1 térfogatarányú) elegyében feloldották, a fiolát lezárták, és 70 °C-on tartották 10 percig. A mintát ezután közvetlenül vizsgálhatták gázkromatográffal, vagy nitrogén átáramoltatása mellett megszárították és apoláros oldószerben (hexán, etilacetát) feloldották. A TMS-származékképzés legfőbb nehézségét a mintában nyomnyi mennyiségben jelenlévő víz okozza. Ez gátolja a származék képződését, valamint elősegíti a szililezett termék bomlását. A TMS-származékokat ezért nem lehet HPLC-vel tovább tisztítani.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Az indolvegyületek gázkromatográfiás elválasztása két különböző típusú megosztó fázison történhet; a gyakorlatilag apoláros dimetil-szilikon alapú SE-30, OV-101 és DB-1 nedvesítő folyadékokon, valamint a kissé polárosabb OV-7, OV-17, DC-550 és SP-2250 folyadékfázisokon, amelyek fenil-metil-szilikon és dimetil-szilikon keverékén alapulnak. Mindkét nedvesítőfolyadék-típus alkalmas szinte az összes indolszármazék vizsgálatára. Nagy csúcskapacitásuk (a kromatográfia során elválasztható komponensek nagyobb száma) és nagy érzékenységük miatt a kapilláris kolonnák egyre inkább tért hódítanak az indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározása terén.

Az IES gázkromatográfiás elválasztására példaként egy Dunlap és Binzel (1996) által közölt módszert ismertetünk. A megtisztított növényi mintából 2 μl mennyiséget automatikus, megosztás nélküli (splitless) módszerrel egy 10 m-es, 0,18 mm belső átmérőjű kapilláris oszlopba injektáltak. Az oszlop belső felületét 0,4 μm vastagságú DB-1701 nedvesítőfolyadék-film borította. Az elválasztást 1 ml/perc hélium vivőgáz térfogati sebesség mellett, 70 kPa oszlopnyomással végezték. Az elválasztás alatt az oszlop hőmérsékleti programja a következő volt: 0,5 percig 65 °C, majd 15 °C/perc ütemben az értékét 225 °C-ra emelték, amit 3 percig tartottak, azután 250 °C-ra emelve a hőmérsékletet 5 percig tartották ezt az értéket. Az elválasztás összesen mintegy 20 percet vett igénybe, az IES retenciós ideje ilyen körülmények mellett 11 perc volt.

Az indol-3-ecetsav kvantitatív meghatározása

• Az indol-3-ecetsav meghatározása HPLC-vel

Az IES meghatározása HPLC-vel különböző detektorok (fluoreszcens és elektrokémiai detektorok) segítségével történhet. A két detektortípus közül a fluoriméterek IES-sel szemben mutatott érzékenysége a jobb (Sandberg et al., 1987).

A különféle növényi szövetekben az egyes indolvegyületek mennyisége nagymértékben eltérhet. Nagy különbségek lehetnek az egyéb összetevők koncentrációjában is, amelyektől az elválasztás során meg kell tisztítani a mintát. Egy új növényi szövet IES-tartalmának meghatározásakor ezért célszerű a tisztítási lépések



több kombinációjának kipróbálása, majd egy HPLC-vel való elválasztás és detektálás után a kérdéses csúcsokhoz tartozó komponensek felfogása és más független HPLC-módszerrel történő újraelválasztása és mérése.

Az előkészített növényi minta IES-tartalmát a HPLC-vel történő elválasztás után határozzuk meg, ún. belső standard hígulási módszerrel. A belső standard radioaktív izotóp atomot tartalmaz, amely vagy az indolváz ötödik szénatomján lévő trícium (3H) izotóp, vagy a karboxi-metil csoport első vagy második szénatomját helyettesítő 14C radioaktív izotóp lehet. Először ismert mennyiségű tiszta belső standardot analizálunk HPLC-vel. A detektor által képzett csúcsot kalibrációs görbéhez hasonlítjuk, a csúcshoz tartozó belső standard IES-t összegyűjtjük, és folyadékszcintillációs számlálóval megmérjük az oldat radioaktív sugárzásának mértékét. A következő lépésben az extrahált növényi mintához ismert mennyiségű belső standardot adunk. Az előző fejezetekben leírt módszereket alkalmazva a mintát tisztítjuk, HPLC-vel elválasztjuk, az IES-t detektáljuk, végül ennek is mérjük a radioaktív sugárzását, mely kisebb lesz, mint a tiszta belső standardban mért érték. Azért lesz ez az érték kisebb, mert a minta természetes IES-tartalma és a sugárzó belső standardként hozzáadott indol-3-ecetsav a HPLC-oszlopon nem válik el egymástól, közös csúcsot képez, mely összegyűjtve, a nem sugárzó, természetes IES-tartalom miatt, alacsonyabb egységnyi IES-re jutó radioaktív tevékenységet mutat. A növényi kivonat eredeti, endogén IES-tartalma a következő képlettel számítható ki (Sandberg et al., 1987):

Y = [(Ci /Cf) – 1]X

amelyben

Y: a növényi kivonat IES-tartalma (ng),

X: a mintához adott belső standard mennyisége (ng),

Ci: a tiszta belső standardban mért radioaktív sugárzás (dpm/ng); dpm: percenkénti hasadások száma (= disintegrations per minute),

Cf: a minta természetes IES-tartalmával hígított belső standard radioaktív sugárzása (dpm/ng).

• Az indol-3-ecetsav meghatározása gázkromatográfhoz kapcsolt tömegspektrométerrel (GC-MS)

A GC-MS hatékony és elterjedten használt eszköz indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározására. A kapilláris GC-kolonnák közvetlenül kapcsolhatók tömegspektrométerhez, a töltött kolonnákból kiáramló gázt azonban előzőleg egy gázelválasztón kell keresztülvezetni, ami a vivőgázt (rendszerint héliumot) eltávolítja a mintából. Az IES-t és származékait leggyakrabban elektronütköztetéssel ionizálják, 70 eV ionizációs potenciál energiaszinten. Ilyen ionizáló energia hatására a bázision következetesen a 130 m/z értékkel rendelkező kvinolínium-ion lesz, mely az oldallánc lehasadásával képződik. A legtöbb szerves molekula ionizálásához szükséges energiamennyiség mindössze 10 eV (kb. 1000 kJ/mol). Ezen az energiaszinten pozitív molekulaionok keletkeznek. Ennél nagyobb ionizáló energia következtében a molekula különféle hasadásokat szenved. A gyakorlatban elterjedt 70 eV hatására a különböző indolvegyületekből a töredékek széles skálája képződik, amely jellemző az eredeti molekula szerkezetére. Maga az eredeti molekula azonban ilyen magas ionizációs energiaszinten a töredékképződés miatt gyakran nem is jelenik meg a tömegspektrumban. Ezért olyan tömegspektroszkópiás vizsgálatokban, amelyekben a molekulaion detektálása is szükséges (pl. egy ismeretlen vegyület molekulatömegének meghatározása), kíméletesebb ionizációs módszert kell alkalmaznunk. Ez lehet pozitív vagy negatív kémiai ionizáció, mely érzékenyebb az elektronütköztetéses ionizációs eljárásnál. Indolszármazékok kémiai ionizálása pozitív töltésű metánionokkal vagy negatív töltést hordozó ammóniaionokkal 5–10-szer erősebb ionintenzitást eredményez, mint az elektronütköztetéses módszer (Rivier és Saugy, 1986). A 21. táblázat az IES és származékai tömegspektrumában megjelenő molekula- és bázisionokat, valamint jellemző töredékeiket tartalmazza.

21. táblázat - Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában előforduló jellegzetes ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil, Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision.

Elektronütköztetéses ionizáció (70 eV)



IES és származékai

A tömegspektrum jellegzetes ioncsúcsai Irodalom

IES Mi+ 175 (36), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (11), 77 (13).

Vebrel et al. (1983)

IES Mi+ 175 (33), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (12), 77 (17).

Wurst et al. (1984)

IES Mi+ 175 (63), 131 (25), Bi+ 130 (100), 103 (19), 77 (26).

Feung et al. (1975)

Me IES Mi+ 189 (30), 131 (12), Bi+ 130 (100), 103 (9), 77 (13).

Vebrel et al. (1983)

Me-TMS IES Mi+ 261 (28), Bi+ 202 (100), 200 (5), 170 (2), 145 (3), 130 (4).

Sandberg et al. (1987)

di-TMS IES Mi+ 319 (47), Bi+ 202 (100), 130 (9), 129 (6), 75 (12), 73 (38).

McDougall és Hillman (1980)

Pozitív kémiai ionizáció

IES származékai

Reagens gáz


Me IES amónia 208 (7), 207 (61), 191 (13), Mi+(Bi+) 190 (100), 130 (10).

Rivier és Saugy (1986)

Me IES metán 218 (11), Mi+ 190 (84), 189 (20), 158 (18), Bi+130 (100).


Me IES i-bután 228 (3), 191 (12), Mi+

(Bi+) 190 (100), 189 (8), 130 (5).


di-TMS IES ammónia 393 (4), 392 (16), 323 (7), 322 (25), Mi+(Bi+) 321 (100)


di-TMS IES metán 348 (17), Mi+(Bi+) 320 (100), 304 (15), 230 (1), 202 (3).

Badenoch-Jones et al. (1984)

Negatív kémiai ionizáció

IES származékai

Reagens gáz


Me IES ammónia 189 (15), Mi–(Bi–) 188 (100), 175 (3), 174 (1), 161 (29).




Me IES metán Mi–(Bi–) 188 (100). Rivier és Saugy (1986)

Me IES i-bután 194 (60), Mi–(Bi–) 188 (100), 178 (48), 162 (50), 150 (67).


di-TMS IES ammónia 389 (12), Mi–(Bi–) 319 (100), 299 (11), 289 (9), 213 (8).


3.2. A gibberellinek meghatározásaA gibberellinek meghatározásakor a fő nehézséget az jelenti, hogy a növényekben nagyon sok gibbánvázas vegyület fordul elő, amelyek egymástól csak kis szerkezeti eltéréseket mutatnak, a szövetekben lévő összes koncentrációjuk mégis igen alacsony. A gibberellinek többségének molekulaszerkezetére az erősen oxidált funkcionális csoportok nagy száma jellemző, ami stabilitásukat lényegesen csökkenti. Ezért tisztításuk és elválasztásuk során célszerű a 2,5–8,5 pH tartományon belül maradni és vizes oldatban 40 °C alatti hőmérsékleten dolgozni. A gibberellintartalmú növényi kivonatok és a különböző tisztítási lépéseken átesett minták mélyhűtőben lefagyasztva, –20 °C-on tárolhatók.

A gibberellinek kivonása növényi mintákból

A különböző növényi szervek és szövetek gibberellintartalma nagy különbségeket mutathat. A termésekben lévő magok gibberellintartalma például 1000-szerese is lehet a vegetatív részek hormontartalmának, amit a gibberellinek tisztítása során figyelembe kell venni.

A gibberellinek kivonását leggyakrabban tiszta hideg metanollal vagy metanol 80%-os vizes oldatával végzik. Egységnyi tömegű növényi mintát 4–5-szörös térfogatú kivonószerrel homogenálnak, majd 4 °C-on több órán át állni hagynak. A folyadék és szilárd fázist ezután szűréssel szétválasztják és a szilárd növényi maradékot újra extrahálják. A két extrahálószer-részletet egyesítik, a metanolt azután vákuumban 40 °C alatti hőmérsékleten bepárolják.

A gibberellinek tisztítása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló tisztítás

Az extrakciót követő bepárlás maradékát, a gibberellint tartalmazó vizes fázist 0,1 M-os foszfátpufferben oldják. A pH értékét 2,5-re kell beállítani. Az első oldószeres kirázási lépésben a vizes fázissal megegyező térfogatú etil-acetáttal háromszor kirázzák a gibberellintartalmú oldatot, ami a legtöbb gibberellin típusú molekulát átoldja a szerves fázisba ezen a pH értéken. A következő lépésben gyengén lúgos (pH 8,5) foszfátpuffer egyenlő térfogatú egységeivel ismét háromszor rázzák ki a szerves gibberellintartalmú oldatot, ez a lúgos pH miatt disszociációra készteti a gibberellineket, ami poláros jelleget kölcsönöz a molekuláknak, tehát poláros-vizes fázisba viszi a gibberellinsavakat. A vizes gibberellinoldat pH-ját ezután ismét 2,5-re állítják, és etil-acetát egyenlő térfogatú mennyiségeivel újra szerves fázisba viszik a gibberellineket. Végül a szerves fázisban nyomokban előforduló foszforsav eltávolítása érdekében 2,5-ös pH-érték mellett, négyszer 5 térfogat% vízzel mossák a gibberellint tartalmazó etilacetát-fázist, mert az elkövetkező bepárlás során az oldatban maradt foszforsav betöményedik és szélsőséges pH-viszonyokat eredményez.

• Fenolok eltávolítása polivinil-pirrolidonnal

A folyadék–folyadék-megoszlásos módszerrel nyert gibberellintartalmú oldatot leggyakrabban szennyező vegyületek a zsírsavak, a fenolok és a cukrok. A fenolok (főleg pigmentek) stabil komplexet képeznek a gibberellinekkel. A polivinil-pirrolidon (PVP) azonban jó hatékonysággal köti meg a fenolokat, ezért hormonok tisztítása során gyakran használják. Az etil-acetátban oldott, majd bepárolt frakciót 0,1 M-os foszfátpufferben (pH 8,5) feloldják, azután egy 0,5–1,0 g PVP-vel töltött rövid oszlopra töltik. Az elúciót az oszloptérfogat kétszeresének megfelelő mennyiségű oldószerrel (foszfát-pufferrel) végzik. A fenolok kötődése fokozható a töltet savanyú (pH 3,0) pufferrel való előmosásával.



• A gibberellinek tisztítása szilárd fázisú extrakcióval

A gibberellintartalmú növényi kivonatok kis mennyiségeinek gyors és jó minőségű elválasztása valósítható meg egyszer használatos, eldobható oktadecil-szilán (fordított fázisú) oszlopokon. Az oszlop előkészítését 5 ml metanollal, majd 5 ml 5%-os ecetsavval mosva (fecskendővel injektálva) végzik. A növényi kivonatot 0,1 M-os foszfát-pufferben (pH 2,5) juttatják az oszlopra, ezt is injektálva. A rendszert ezután 5 ml 5%-os ecetsavval, majd 5 ml desztillált vízzel mossák. A gibberellineket végül 80%-os metanollal viszik ismét oldatba és távolítják el az oszlopról.

• A gibberellinek tisztítása anioncsere-kromatográfiával

Anioncserélő oszlopon (DEAE-Sephadex A-25, Dowex 1X1-100) a gibberellinek csoportja hasonló saverősségük miatt egyöntetűen elválasztható. Az egyik lehetőség a 0,2 M-os ecetsav-metanol 1:1 térfogatarányú elegyében feloldott növényi mintát acetát típusú Sephadex anioncserélő oszlopra vinni, az oszlopot az oldószer azonos térfogatú mennyiségeivel négyszer mosni, majd a gibberellineket 2 térfogategységnyi 2 M-os ecetsav/metanol 1:1 arányú elegyével eluálni (Crozier és Durley, 1983). A másik bevált módszer a Dowex 1X1-100 anioncserélő gyantával töltött oszlopon való elválasztás (Browning és Saunders, 1977). A vizes növényi kivonatot (pH 8,0) az oszlopra viszik, amit azután vízzel mosnak, végül etanol/1M-os hangyasav (4:1 térfogatarányú) elegyével eluálják a gibberellineket. Az anioncsere-kromatográfiát követő szilárd fázisú extrakció (ODS-oszlopon) két lépésben jobb megoldás, mint a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló kirázás.

A gibberellinek elválasztása

A gibberellineket tisztításuk során hasonló szerkezetük miatt egy csoportként kezeltük, elválasztásukkor azonban az egyes gibberellinvegyületeket különválasztjuk egymástól.

• Vékonyréteg-kromatográfia

A kereskedelmi forgalomban kapható kész szilikagélrétegek, pontosan beállított oldószerek használata mellett, megfelelnek a gibberellinek elválasztására (MacMillen és Suter, 1963). Felbontóképességükben és a szétválasztott gibberellinek visszanyerhetősége tekintetében azonban elmaradnak a HPLC-től. A szilikagélrétegen való elválasztás rendszerint savas kémhatású oldószerben (ecetsav- vagy hangyasavoldatban) történik, ami biztosítja a gibberellineken lévő karboxilcsoport protonált állapotát. Ezáltal javul a gibberellinek mobilitása és a komponensek élesebb sávban válnak el egymástól. A gibberellinek etil-acetát telített vizes oldatával vagy acetonnal eluálhatók a rétegről.

• A gibberellinek elválasztása HPLC-vel

A HPLC a mintaösszetevők elválasztásának igen jó hatékonysága mellett, a retenciós értékek pontos megismételhetőségében és az elválasztás kis időigényében is felülmúlja az egyéb kromatográfiás módszereket. Az oszlop töltete rendszerint 5–10 μm nagyságú szabálytalan vagy gömb alakú szilikagél hordozószemcsékből áll, amelyhez valamilyen funkciós csoportot kötnek állófázisként. A funkciós csoport lehet poláros karakterű (normál fázisú HPLC), vagy egy hosszabb, apoláros szénhidrogénlánc (fordított fázisú HPLC). A minta a mozgó fázisban feloldva jut az oszlopra, 40 MPa körüli magas nyomáson, amit egy pumpa biztosít. A preparatív célra használt HPLC-oszlopok általában 5–10 mm belső átmérőjűek, de nagy mennyiségű mintákhoz nagyobb méretű kolonnák is szóba jöhetnek.

A mozgó fázis rendszerint metanol vagy etanol vizes oldata, amely kis mennyiségben (kb. 50 μl/l) tartalmaz valamilyen savat (foszforsavat, ecetsavat vagy hangyasavat), biztosítva a gibberellinek protonált állapotát. Jensen et al. (1986) a gibberellinek széles skáláját választották el, és mérték a retenciós idejüket egy 250 x 4,6 mm belső átmérőjű 5 μm szemcseméretű Supercosil LC18 fordított fázisú HPLC-oszlopon. A mozgó fázis 1 ml/perc folyadékáramlási sebességű izokratikus metanololdat volt, kémhatását foszforsavval állították be (pH 3,0).

• A gibberellinek gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: A gibbánvázon lévő karboxilcsoport(ok) diazometánnal metil-észterré alakítható(k). A diazometánnal veszélyessége miatt csak elszívófülke alatt lehet dolgozni. A metilezésre szánt mintát metanolban oldják, majd az éteres diazometán-oldatot cseppenként adagolva végbemegy a metileződés folyamata. A reagenscseppek hozzáadását akkor hagyják abba, amikor az elegyből nem szabadul már fel további nitrogén, és az oldat megtartja sárga színét. A felesleges diazometán néhány perc elteltével eltávolítható az oldat szárazra



párlásával nitrogén alatt. Nagy mintamennyiség esetén a felesleges diazometán ecetsavval elbontható és az oldat szárazra párolható. A metil-észterré alakított gibberellinek kevésbé polárosak, mint a szabad gibberellinsavak, ezért a nem metileződött frakció eltávolítható, ha a kivonatot valamilyen viszonylag apoláros oldószerben (pl. diklórmetánban) feloldjuk, majd egy tiszta üvegcsébe töltjük. A minta ebben a formában is használható gázkromatográfiás elválasztásra, de a gyakorlatban többnyire még egy származékképző lépést beillesztenek, trimetil-szilil-éterré alakítva a hidroxilcsoportot tartalmazó gibberellineket. Ez a lépés a gibberellin-metil-észterek polaritását tovább csökkenti, valamint a tömegspektrométer által képzett spektrumban javítja a molekulacsúcsok intenzitását. A trimetil-szililezésre használt két leggyakoribb reagens a BSTFA (bisz-trimetil-szilil-trifluoracetamid) és az MSTFA (N-metil-O-trimetil-szilil-trifluoracetamid). A növényi mintakivonat kis mennyiségeit üvegcsébe töltik és nitrogén alatt vagy deszikkátorban alaposan szárazra párolják. Ez azért elengedhetetlenül szükséges, mivel mind a reagensek, mind a kész trimetil-szilil-származékok nedvesség hatására bomlanak. Az üvegcsék lezárása után a reakcióelegyek hőmérsékletét 90 °C-ra emelik, és ezen tartják 30 percig. A BSTFA és az MSTFA egyaránt illékony vegyületek, ezért a GC-kolonnán jól elválnak a meghatározni kívánt gibberellinektől, de vákuum alatt deszikkátorban is elpárologtathatók és más illékony, nedvességnyomoktól mentes oldószerrel helyettesíthetők.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A gibberellinek elválasztására leginkább a kvarc kapilláris oszlopok felelnek meg. Hedden (1987) metil-TMS gibberellinszármazékokat analizált kapilláris kolonnán (25 m × 0,2 mm i.d.), ami kb. 0,3 μm vastagságú BP-1 – kémiailag kötött – apoláros megosztó fázissal volt bevonva. A kolonna az injektálást követő 1 percig 60 °C-os volt, majd 240 °C-ig 20 °C/perc, 300 °C-ig 4 °C/perc intenzitással emelték a hőmérsékletet. A hélium-vivőgáz nyomása 90 kPa volt. Az ilyen típusú oszlop mintakapacitása erősen korlátozott (kb. 0,1 μg). A gibberellinek gázkromatográfiás analízisére a hagyományos GC-detektorok nem alkalmasak, tömegspektroszkópiás detektálásuk terjedt el.

A gibberellinek mennyiségi meghatározása

• A gibberellinek GC-MS analízise

A gibberellinek GC-MS mennyiségi vizsgálatát többszörös ionmegfigyeléssel (multiple ion monitoring; MIM) végzik, amelyben a tömegspektrométer a teljes spektrum felvétele helyett csak néhány, az adott vegyületre nagyon jellemző töredékion intenzitását méri. Két mintában lévő azonos gibberellinvegyület relatív mennyisége a molekulacsúcsok abszolút értékeinek összehasonlításával kapható meg, ha azonban a molekulacsúcs intenzitása nagyon kicsi, az összehasonlítás valamelyik jellegzetes töredékion értéke alapján is elvégezhető. A gibberellinek extrakciós, tisztítási és elválasztási veszteségeit belső standardok felhasználásával lehet korrigálni, amit rögtön a szövet eldörzsölése után kell a mintához adni. Célszerű olyan standard vegyületet választani, ami kémiailag nagyon hasonló a vizsgált gibberellinmolekulához. A tömegspektrométer a részecskéket tömegük alapján választja szét, ezért GC-MS vizsgálathoz használhatunk (nem radioaktív) nehéz izotóppal jelzett gibberellin-analógokat, amik a növényben lévő gibberellin molekuláktól mindössze annyiban különböznek, hogy vázukban egy, illetve néhány H-, C- vagy O-atomot 2H-, 13C- vagy 18O-izotóp helyettesít. Megbízható eredményt kalibrációs görbe segítségével kaphatunk. Ennek lényege az, hogy a belső standardként használt szintetikus gibberellin-analóg vegyületből és magából a vizsgált gibberellinhormonból olyan oldatsorozatot készítenek, amelynek tagjai a két komponenst különböző arányban tartalmazzák. (Például 0,0; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 mól gibberellin/mól belső standard gibberellin-analóg sorrendben.) Az oldatsor tagjait ezután tömegspektrométerrel analizálják, megkapva így az egyes mólarányokhoz tartozó csúcsintenzitás-arányokat, majd az értéksorhoz görbét illesztenek. A belső standardot tartalmazó minták mérése során kapott csúcsintenzitás-arány alapján a kalibrációs görbe segítségével meghatározható a minta gibberellin/belső standard gibberellin-analóg mólaránya, amiből a kérdéses gibberellin fiziológiás mennyisége kiszámítható, mert a hozzáadott belső standard mennyisége általunk választott, ismert érték.

• A gibberellinek kvantitatív szerológiai meghatározása

A növényekben található gibberellinek széles skálája miatt szerológiai meghatározásuk nagy körültekintést igényel. A vizsgálathoz használt antiszérum szelektivitása alapvető fontosságú. Atzorn és Weiler (1983) a gibberellinek (G3, G4 és G7) rendkívül érzékeny mennyiségi meghatározására alkalmas (0,2–0,5 pg küszöbértékű!) kompetitív ELISA-módszert fejlesztettek ki. A liofilezett antiszérumokat 50 mM NaHCO 3-t tartalmazó oldatba (pH 9,3) vitték, a G3-ra specifikus IgG-antiszérumot 10 mg/l hígításban, a G4 és G7-re specifikus IgG-t pedig 25 mg/l hígításban alkalmazták. A mikrotálca üregeibe 0,2 ml antiszérumoldatot mértek, majd 3 napon keresztül, 4 °C-on inkubálták. Az IgG-oldatot ezután leöntötték, az üreg falához nem kötődött IgG-molekulák maradékát háromszori desztillált vizes mosással távolították el, az így érzékenyített mikrotálcákat legalább két hétig lehetett tárolni 4 °C-on. Az érzékenyített üregekbe a következőkben bemérték a kompetíciós elegyet, ami 50 μl TBS- (Tris-buffered saline) puffert [50 mM 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-



propándiol (=Tris), 1 mM MgCl2, 0,01 M NaCl, pH 7,5], 100 μl standard gibberellinoldatot vagy megfelelően hígított növényi extraktumot és 50 μl TBS-pufferben oldott gibberellin-alkalikus-foszfatáz konjugátumot tartalmazott. A kompetíciós elegyben vetélkedés folyt az alkalikus-foszfatáz jelzőenzimhez kötött gibberellinmolekulák és a mintában, ill. a standard oldatban található gibberellinek között az IgG-kötőhelyekért. Amennyivel magasabb volt a növényi mintában a kérdéses gibberellinvegyületek (G 3, valamint G4 és G7) szintje, annyival több kötődött belőlük az üreg falán található specifikus helyekre, visszaszorítva az alkalikus-foszfatázzal jelölt gibberellinmolekulák megtapadását. Az ELISA-tálcákat ezután 16 órán át 4 °C-on inkubálták, majd a folyadékot leöntötték és a lapokat desztillált vízzel ismét háromszor mosták. Az utolsó lépésben a jelzőenzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot – üregenként 0,2 ml oldatot – mértek az egyes reakcióterekbe (1 mg/ml szubsztrát 50 mM-os NaHCO3 oldatban, pH 9,6). A mikrotálcákat ezt követően 6 órán át 37 °C-on tartották, míg az enzim által katalizált színreakció – ami sárga színt eredményez – ki nem fejlődött. Az üregekben lévő folyadék színintenzitása arányos a reakcióterek falához kötött alkalikus-foszfatáz-gibberellin konjugátum mennyiségével és fordítottan arányos a növényi minta, ill. standard oldat gibberellintartalmával. A reakciót 50 μl 5 M-os KOH-oldattal állították le, abszorbanciáját (A: 405 nm) ELISA-mikrotálcák mérésére használt spektrofotométerrel állapították meg. A gibberellin standard hígítási sorának abszorbanciaértékei alapján kalibrációs görbe szerkeszthető, ami lehetővé teszi a növényi minták gibberellintartalmának meghatározását.

3.3. A citokininek meghatározásaA citokininek kivonása növényi mintákból

A citokininek extrakciójának hagyományos módszere szerint a növényi mintát 80%-os hideg metanolban homogenálják, majd a citokinineket tartalmazó oldószert bepárolják. Ez a kivonási módszer azonban magas foszfatáz-aktivitással jár együtt, ezért a citokinin-nukleotidok nagy része elbomlik. Bieleski (1964) extrakciós módszerével a növényi foszfatázok aktivitása gátolható: a mintát folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, majd metanol/kloroform/90%-os hangyasav/desztillált víz (12:5:1:2 térfogatarányú) elegyében 18 órán keresztül –15 °C-on tartjuk. A kivonószert többrétegű gézen leszűrjük, és a növényi szövetet hideg metanol/90%-os hangyasav/desztillált víz (6:1:4) elegyében homogenáljuk, azután –15 °C-on, 4 órán át tároljuk. A felülúszót többrétegű gézen, majd szűrőpapíron leszűrjük és egyesítjük az előző extrakciós lépés kivonószer-elegyével. A minta kezdeti folyékony nitrogénben való megfagyasztása fontos része a kivonási módszernek.

A citokininek elválasztása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

A bázikus citokininek (szabad bázisok, ribozidok és glükozidok) 1-butanollal kirázva a szerves fázisba oldódnak át, miközben a citokinin-nukleotidok a vizes fázisban maradnak. A pH-t 7,0 és 8,2 közötti értékre kell beállítani, hogy a bázisok a kevésbé poláris protonált állapotban legyenek. Lehetséges, hogy 1-butanol esetében az első kirázás alkalmával a két fázis nem válik el rögtön, akár egy éjszakát is igénybe vehet a szerves és vizes fázis kialakulása.

• A citokininek ioncsere-kromatográfiás elválasztása

Kationcserélő oszlopon a bázikus citokininek eredményesen tisztíthatók. A vizes növényi kivonatok pH-ját ecetsavval beállítjuk (pH 3,0), majd azonos pH-jú NH4

+ típusú cellulóz-foszfát-oszlopon tisztítjuk. Az oszlopot pH 3,0-ra beállított ecetsavoldattal mossuk, amely a citokinin-nukleotidokat eltávolítja az oszlopról. A következő lépésben a pozitív töltésű molekulákat (így a bázikus citokinineket is) 2 M-os ammónium-hidroxid-oldattal választjuk le az oszlopról.

• A citokininek elválasztása HPLC-vel

Számos kvantitatív vizsgálati módszer előtt (tömegspektrometria, immunanalitikai mérések stb.) jó hatékonysággal alkalmazható, nagy mintakapacitással rendelkező citokinintisztítási eljárás. Az oktadecil-szilán- (ODS) töltetek elterjedése nagymértékben hozzájárult a HPLC-citokininek elválasztása terén elért sikeréhez. A citokininek preparatív célú elválasztására egy 150 × 10 mm i.d., fordított fázisú HPLC-oszlop, 1 ml injektálható mintakapacitással jól megfelel. Mozgó fázisként 5 ml/perc áramlási sebességű acetonitril (7–11%-os) egyenletesen növekvő koncentrációjú, gradiens oldata vált be, előzetesen TEAB-bal (trietil-ammónium-hidrogénkarbonát) a pH-ját semlegesre állítva.

• A citokininek gázkromatográfiás elválasztása



Származékképzés: A bisz-(trimetil-szilil)acetamid (BTMSA) kétszeres mennyiségű acetonitrilben feloldva 60 °C-on, 5 perc alatt trimetil-szilil (TMS)-származékká alakítja a vizsgált citokinineket (izopentenil-adenin, zeatin, izopentenil-adenin-ribozid, zeatin-ribozid). Elterjedtebb azonban a bisz-(trimetil-szilil)trifluoracetamid (BSTFA) származékképző reagens alkalmazása. Számos oldószerben (piridin, dimetil-formamid, acetonitril) feloldva használják, szobahőmérséklettől 120 °C-ig, 30 perc reakcióidő-tartamtól több óráig, a reakciókörülmények széles skáláját alkalmazva. A TMS-származékképzés legfőbb hátránya, hogy az egyes citokininek gyakran többféle származékot is képeznek a reakció során – pl. a zeatin kétszeresen és háromszorosan, a zeatin-ribozid négyszeresen és ötszörösen szubsztituált származékok képzésére is hajlamos –, a reakció körülményeitől függően. Úgy tűnik, hogy a szobahőmérsékleten (néhány órán keresztül) végzett TMS-származékképzés és a minta gondos kiszárítása (hogy vizet még nyomokban se tartalmazzon) következetesen a legkevésbé szubsztituált származék képződését eredményezi.

A permetil-citokinin-származékok képzése jóllehet bonyolultabb, mint a TMS-származékoké, mégis számos előnyük van azokkal szemben: nem bomlékonyak, ezért HPLC-vel vagy más elválasztási módszerrel tovább tisztíthatók, és nem képeznek többféle szubsztituált származékot. A permetilezés folyamata során a citokinineket egy erős bázissal, azután metil-jodiddal reagáltatjuk. A bázisok közül a metil-szulfinil anion vált be, melyet kálium-t-butoxid és száraz dimetil-szulfoxid reakciójával állítunk elő. A kálium-t-butoxid hozzáadása után az elegyet nitrogén alatt 10 percig kevertetjük, majd centrifugálással tisztítjuk. A szulfinil-anion-koncentrációt sósavval titrálva – fenolftalein indikátor jelenlétében – határozzuk meg. A gyakorlatban leginkább bevált aniontartalom kb. 0,1 M, amihez 20 mg kálium-t-butoxid szükséges 1ml dimetil-szulfoxidban feloldva. A néhány μg tisztított és szárazra bepárolt mintát 50 μl metil-szulfinil aniont tartalmazó reagenssel visszük ismét oldatba. Ezután 10 μl metil-jodidot adunk az oldathoz, szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd 50 μl desztillált vízzel hígítjuk, végül a permetilezett citokinineket átoldjuk 100 μl kloroformba. A mintát nitrogéngáz átáramoltatása mellett szárazra pároljuk, szükség esetén vákuumdeszikkátor alatt tovább szárítjuk.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A citokinin-származékok gázkromatográfiás elválasztására apoláros, magas hőmérsékleten is stabil megosztó fázissal rendelkező oszlopokkal dolgoznak (pl. SE-30, SE-52, OV-1, OV-17). A tapasztalatok szerint egy 1,5 m × 4 mm i.d., 100–120 mesh szemcseméretű, 3%-os OV-1 nedvesítőfolyadék-filmmel bevont Gas Chrom Q hagyományos töltött kolonna jól bevált. Az elválasztás hatékonysága tovább fokozható, ha kapilláris kolonnát használunk (pl. SGE 25QC2/BP 10–0,25), amelynek mérete 25 m × 0,2 mm i.d.. Ez az oszloptípus kiválóan bontja fel a TMS és a permetilezett citokinin-származékokat. Használatakor az ajánlott felső hőmérsékleti határ: 270 °C. A citokinin-származékok elválasztásának mindennapi gyakorlatához jól megfelel egy rövidebb, szélesebb kapilláris kolonna is (12 m × 0,3 mm i.d.), nagyobb hőstabilitású nedvesítő folyadékkal párosítva (SGE BP-1 vagy BP-5). Ez a kolonna a citokininek gyorsabb elválasztását teszi lehetővé, és felbontóképessége is még elég jó. Az oszlop 80 kPa héliumvivőgáz-nyomás mellett működtethető, de nagy molekulasúlyú anyagok gyorsabb elválasztására a nyomást, legfeljebb 200 kPa-ig, emelni lehet (Horgan és Scott, 1987).

A citokininek mennyiségi meghatározása

• A citokininek GC-MS analízise

A gázkromatográffal elválasztott különféle citokininek (citokinin-származékok) a tömegspektrométer ionizációs kamrájában töredékekké (fragmentumokká) alakulnak. A különböző citokininek azonos körülmények között végzett ionizáció hatására, egyedi molekulaszerkezetüknek megfelelően, következetesen ugyanazokra az ionizált töredékek-re hasadnak, az egyes töredékek képződésének arányát is megőrizve. Tehát egy adott szerkezetű citokinin-molekula azonos ionizáló energia hatására megismételhető módon ugyanazt a tömegspektrumot adja.

Az elválasztott vegyületek ionizálását többnyire gáz halmazállapotban, elektronok-kal ütköztetve végzik. Változtatva az ütköző elektronok energiáját, különböző energiamennyiséget közölhetünk a vizsgálandó molekulákkal, aminek következtében azok hasadásokat szenvednek (különféle töredékeket képezve). Az ionizálás további lehetősége a kémiai ionizáció, ami kíméletesebb az elektronütköztetésnél. Citokininek kémiai ionizálására leginkább megfelelő reagens ion az NH4

+, amely csak fokozatosan veszít energiájából a minta molekuláival való sokszoros ütközés során. Így nem a minta egyetlen molekulája veszi fel a teljes energiamennyiséget, ezért a vizsgált molekulák kevésbé töredeznek.

A tömegspektrumot koordináta-rendszerben ábrázolva a vízszintes tengelyen szerepel az ionizált molekula, illetve a molekulatöredékek tömegének és töltésének hányadosa (m/z érték). Rendszerint egyszeres töltéssel rendelkező ionok keletkeznek, ezért a különböző molekula- és molekulatöredék-ionok m/z értékét csak a tömegük befolyásolja. A függőleges tengelyen az ionizált részecskék előfordulásának egymáshoz viszonyított



relatív gyakoriságát, intenzitását ábrázoljuk (0 és 100% között). Így egy citokinin-vegyület tömegspektrumát tekintve (97. ábra) az egymást követő függőleges vonalak az egyes töredékekre vonatkoznak – növekvő részecsketömegüknek megfelelő sorrendben elhelyezkedve –, a vonalak magassága pedig az ionizált töredékek egymáshoz viszonyított relatív mennyiségét jelöli. A vízszintes tengelyen az origótól legtávolabbra eső vonal az eredeti molekula ionizációjával képződő (tehát hasadást nem szenvedő) molekulaiont ábrázolja, amelynek tömege egyenlő a minta nem ionizált molekulájának tömegével. Azt az iont (töredéket), amely a fragmentumok között a legnagyobb mennyiségben van jelen, tehát amely a legintenzívebb (legmagasabb) spektrumvonalat mutatja, bázisionnak nevezzük, és a függőleges tengelyen feltüntetett skála alapján ezt jelöljük 100%-kal. Az összes többi fragmentum mennyiségét ehhez viszonyítjuk.

97. ábra - A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány

Egy adott citokinin (pl. zeatin) különböző mintákban vizsgálva azonos ionizáló energia hatására ugyanazt a spektrumot hozza létre. Két minta zeatinkoncentráció különbségét a bázision vagy más megfelelő töredékion abszolút intenzitásának összehasonlításával kaphatjuk meg. Mivel elvileg minden ion abszolút intenzitása arányos a mintában jelen lévő vegyület mennyiségével, ezért az ismert m/z érték alapján akár mindössze egy töredékion (vagy a molekulaion) mérésével is meghatározhatjuk a vizsgálni kívánt hormonvegyület koncentrációját (tehát nincs szükség teljes tömegspektrumra). Ezt a módszert szelektív ionmegfigyelésnek (selective ion monitoring; SIM) nevezzük. Különösen kisebb tömegű töredékek esetében előfordulhat azonban, hogy egyéb – szennyező anyagból származó – azonos tömegű töredékion jelenléte torzítja (látszólagosan növeli) a kiválasztott ion intenzitását, és ez egyéb fragmentumok vizsgálata hiányában rejtve marad. Ezért SIM-vizsgálatkor igyekeznek minél nagyobb tömegű és minél egyedibb (csak az adott citokininre jellemző) töredéket kiválasztani. Ez a hibaforrás kiküszöbölhető úgy, hogy egyszerre több jellemző töredékion intenzitását mérik (multiple ion monitoring; MIM), így a normális hasadási aránytól esetleg eltérő, relatív töredékion-intenzitásra rögtön fény derül.

Akár teljes tömegspektrumot vizsgálunk, akár SIM- vagy MIM-módszerrel dolgozunk, a mintában egy adott citokinin tényleges koncentrációját kalibrációs görbe segítségével állapíthatjuk meg. Célravezetőbb azonban, ha a tisztítási műveletek megkezdése előtt ismert mennyiségű hormon-analóg vegyületet, belső standardot mérünk a mintához. Erre a célra 2H vagy 15N izotóppal egyszeresen vagy többszörösen jelzett citokinin-vegyületeket használnak. A meghatározás utolsó lépésében – a tömegspektroszkópiás detektálás során – a tömegspektrométer analizátora, az izotópatomok nagyobb tömege miatt, elválasztja egymástól a mintában természetesen jelenlévő citokinin-vegyületből származó töredékeket és az izotóppal jelzett belső standard töredékeit. A tömegspektrumban így számos fragmentumnak megtalálható lesz az izotóppal jelzett párja. Egy töredéknek és izotóppal jelzett párjának a relatív intenzitáskülönbsége alapján – a bemért belső standard ismert koncentrációja miatt – kiszámíthatjuk a minta fiziológiás hormontartalmát, kiküszöbölve a minta-előkészítés során bekövetkező veszteségeket is! A leggyakrabban használt belső standardok az N6 oldallánc első szénatomján két 2H-atomot vagy a két terminális szénatomon öt 2H-atomot hordozó deutériummal jelzett, illetve a purin váz négy



nitrogénatomját 15N izotóppal helyettesítve kapott szintetikus citokininek. A SIM-módszer nyilvánvalóan nem alkalmas arra, hogy egyszerre vizsgáljuk egy természetes citokinin-vegyület töredékének és izotóppal jelzett analógjának mint belső standardnak az intenzitását.

A trimetil-szilil- és permetilszármazékok képzése nem befolyásolja a belső standardok alkalmazását. Az izotópos belső standardok használata során két tényezővel számolnunk kell, amelyek zavarhatják a tömegspektrométerrel való mennyiségi meghatározást. Egyrészt a növényi minta természetes citokinin-vegyületei is tartalmazhatnak izotópatomokat, amelyek a tömegspektrumban látszólagos növekedést okozhatnak a belső standard intenzitásában. Célszerű ezért minél több izotópatomot tartalmazó hormon-analógot választani, tehát például két 2H helyett inkább öt 2H-t tartalmazó szintetikus citokinineket használni, mert ezek tömege több egységgel haladja meg a nehéz izotópot nem tartalmazó, illetve egy-két nehézizotóp-atomot tartalmazó természetes citokininek tömegét, tehát a spektrumban jobban elkülöníthetőek.

Hasonló problémát okoz az is, ha a belső standardként használt, jelzett vegyületünk számottevő mennyiségben tartalmaz izotóppal nem jelzett hormonmolekulákat, amelyek a tömegspektrometriás vizsgálat során nem választhatók el a mintában jelen lévő (meghatározni kívánt) citokininektől. A belső standard kiváló minősége tehát alapvető feltétele a megbízható kvantitatív vizsgálati eredményeknek.

A citokininek és származékaik elektronütköztetéssel nyert fontosabb töredékeit a 22. táblázat tartalmazza (Horgan és Scott, 1987).

22. táblázat - Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses tömegspektrumát alkotó fontosabb ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-adenin, [9R]iP = izopentenil-adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil, perMe = permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision.

Citokinin vagy citokinin-

származék típusaA tömegspektrumban megjelenő jellegzetes ioncsúcsok

iP Mi+ 203 (54), 188 (65), 161 (13), 160 (96), 148 (17), 136 (15),

Bi+ 135 (100), 119 (22), 108 (33), 93 (10), 84 (18).

[9R]iP Mi+ 335 (22), 203 (60), 202 (22), 188 (51), 161 (12), 160 (80), 148 (23),

136 (27), Bi+ 135 (100), 119 (21), 108 (27).

Z Mi+ 219 (20), Bi+ 202 (100), 201 (41), 188 (75), 186 (28), 160 (50),

136 (53), 135 (37), 120 (25), 119 (39), 108 (32).

[9R]Z Mi+ 351 (8), 201 (95), 200 (61), 199 (86), 198 (50), 188 (53), 160 (60),

148 (40), 136 (60), Bi+ 135 (100), 119 (46).

di-TMS iP Mi+ 347 (24), 332 (38), 305 (22), 304 (83), 274 (20), 264 (30), 247 (22),

207 (30), 192 (15), 160 (14), 135 (15).

tri-TMS [9R]iP Mi+ 551 (13), 245 (21), 232 (51), 230 (25), 217 (24),



204 (10), 203 (27),

202 (25), 188 (10), 160 (15), 147 (15), 103 (30).

di-TMS Z Mi+ 363 (6), 348 (15), 274 (39), 273 (51), 272 (26), 260 (70), 258 (17),

232 (28), 192 (21), 188 (17), 156 (36).

tri-TMS Z Mi+ 435 (6), 420 (14), 347 (20), 346 (72), 332 (27), 306 (11), 305 (16),

304 (61), 272 (15), 264 (19), 156 (11).

tetra-TMS [9R]Z Mi+ 639 (3), 536 (17), 320 (16), 245 (14), 230 (16), 217 (18), 201 (30),

188 (24), 156 (32), 147 (13), 103 (29).

di-perMe iP Mi+ 231 (70), 216 (57), Bi+ 188 (100), 176 (16), 163 (18), 162 (34),

135 (21), 134 (38), 133 (30), 107 (25), 98 (26).

tetra-perMe [9R]iP

Mi+(Bi+) 391 (100), 348 (20), 218 (28), 217 (76), 216 (83), 202 (80),

175(32), 174 (95), 148 (30), 101 (29), 98 (25).

tri-perMe Z Mi+ 261 (7), Bi+ 230 (100), 216 (6), 188 (22), 176 (4), 162 (7), 134 (8),

107 (7), 67 (7), 42 (11), 41 (10).

penta-perMe [9R]Z

Mi+ 421 (6), 390 (71), 348 (6), Bi+ 216 (100), 174 (17), 148 (6), 101 (11),

71 (10), 67 (8), 45 (45), 41 (17).

• A citokininek kvantitatív szerológiai meghatározása

Vonk et al. (1986) nőszirom szöveteiben mérték kompetitív, indirekt ELISA-módszerrel a Z, a [9R]Z, az iP és a [9R]iP koncentrációját. A növényi kivonatot anioncsere-kromatográfiával, majd szilárd fázisú extrakcióval (oktadecil-szilán oszlopon) tisztították. A szabad citokinin-bázisokat (Z, iP) HPLC-vel választották el a ribozidszármazékoktól ([9R]Z, [9R]iP). Az elválasztást követően a frakciókat bepárolták, majd PBS-Tween-pufferrel ismét oldatba vitték a komponenseket, ezt használva az ELISA-vizsgálatokhoz [PBS-Tween-puffer (Phosphate-buffered saline + Tween): 0,01 M-os foszfát puffer, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20; pH 7,4]. A 96-lyukú ELISA-mikrotálca érzékenyítését üregenként 200 μl [9R]Z- és [9R]iP- KHLH-konjugátumoldattal végezték [KHLH (keyhole limpet hemocyanin) = egy tengeri kagylóból származó fehérje], aminek töménysége 20 μg/ml coating puffer volt. (Coating puffer: 0,05 M Na 2CO3/NaHCO3; pH 9,6). Az érzékenyített lemezeket hűtőszekrényben, 4 °C-on, egy éjszakán keresztül inkubálták. Felhasználás előtt a lapokat egyszer desztillált vízzel, ötször PBS-Tween-pufferrel mosták. A különböző hígításban elkészített mintákat és a citokinin-standardokat PBS-Tween-ben oldva mérték az üregekbe (100 μl). Azután a [9R]Z-vel és a [9R]iP-vel szemben termelt antiszérumot PBS-Tween-ben megfelelően hígítva hozzáadták az üregekhez (100 μl). Az így elkészített kompetíciós elegyben a növényi anyagból származó citokininek és az érzékenyítéssel az üregek falához kötött citokinin-konjugátumok vetélkednek egymással az elegyhez adott antiszérum-kötőhelyekért. Az immunkomplexek kialakulása egy éjszakát igényel, 4 °C-on inkubálva az ELISA-tálcákat. Ezután a lemezeket PBS-Tween-nel ötször mosták, amivel eltávolították a lemez falához nem kötődött antigén-antitest komplexeket.



Az ELISA-rendszer antitestkötő kapacitásának felső határát (B0) olyan üregek beállításával vizsgálták, amelyek nem tartalmaztak mintát, csak antiszérumot és PBS-Tween-t, tehát nem jött létre kompetíció. Az antitestkötő képesség alsó határát (Bu) olyan kompetíciós elegyben határozták meg, ami a nem kötött antigént (Z, iP, stb.) nagy túlsúlyban tartalmazta, gyakorlatilag megakadályozva ezzel, hogy az antitestek az üreg falához kötődjenek. A következő lépésben alkalikus-foszfatáz jelzőenzimmel konjugáltatott, nyúl-IgG-re specifikus antiszérumot adtak az üregekhez PBS-Tween-ben oldva (200 μl; 1500 ×-os hígításban), amely hozzákötődött az üregekben maradt, citokininekre specifikus nyúl-IgG- (antitest-) molekulákhoz. A tálcákat 3 órán át, 35 °C-on inkubálták, PBS-Tween-nel ötször mosták, végül szubsztrát-pufferben oldva (coating puffer + 0,5 mM MgCl2) az üregekhez mérték az enzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot (200 μl; 1 mg/ml). A tálcákat 35 °C-on inkubálva a szubsztrátból színes termék képződött az alkalikus-foszfatáz katalitikus hatására. A színintenzitást 405 nm-en mérték ELISA-lapok leolvasására kifejlesztett spektrofotométerrel. A kalibrációs görbét a következő képlet segítségével szerkesztették meg:

amelyben

B: az üreg falához kötődött antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

B0: a bemért antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,

AB: a standardot (ill. mintát) tartalmazó üregben mért extinkció-érték,

ABu: a minimális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték,

AB0: a maximális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték.

A B/B0 értékeket egy koordináta-rendszer y-tengelyén vették fel (0–100%), aminek x-tengelyén az egyes B/B 0

értékekhez tartozó Z, iP, [9R]Z és [9R]iP értékeket ábrázolták (pmol, pg). Az ismeretlen citokinintartalmú minta extinkcióját ismerve a B/B0-t kiszámították, és a szigmoid kalibrációs görbével egybevetve leolvasták a minta hormontartalmát.

3.4. Az etilén meghatározásaAz etilén biológiai aktivitását ismereteink szerint 0,1–10 nl/ml koncentrációtartományban fejti ki, ezért analitikai meghatározása során legalább 0,01 nl/ml érzékenységű módszerrel célszerű dolgoznunk. Az etilén gáz halmazállapotú, ezért növényi szövetből történő kivonása lényegesen egyszerűbb, mint a többi növényi növekedésszabályzóé: a szövetekből vett gázminta vagy a szövetek által kibocsátott gáz felfogva közvetlenül vizsgálható. A vizsgálati eredmények értékelésekor azonban figyelembe kell vennünk azt, hogy a növényi szövetek különböző mértékben megkötik a termelődő etilén egy részét. Ez a pufferhatás főként a gyors etilénkoncentráció-változások mérését zavarja.

Etilén-mintavételi módszerek

• Mintavétel növényi szövetekből

Olyan növényi mintákból, melyek belső üregeket, gáztereket tartalmaznak (pl. almatermések, paprikabogyó), fecskendőre illesztett injekciós tűvel közvetlenül vehetünk gázmintát. A mintavétel ideje alatt a vizsgálni kívánt növényi részt tarthatjuk folyadék alatt, vagy a mintavevő tűt bevonhatjuk zsírral, nehogy a minta külső légköri gázokkal szennyeződjön. A gázmintát óvatosan vegyük a fecskendővel, mert a hirtelen nyomáscsökkenés szintén külső gázok bejutását okozhatja a mintavételi térbe. Ez a módszer ismételt mintavételre nem alkalmas.

A különböző termések és gumók által termelt etilént vákuummal is kivonhatjuk. Olaj- vagy vízlégszivattyúra köthető deszikkátort 2/3-ig feltöltünk vízzel vagy telített sóoldattal (amely gátolja a minta által kibocsátott,



valamint egyéb, levegőből származó gázok oldódását). Egy felfordított tölcsért vagy a tetején nyitott harangot a folyadékba süllyesztünk, ügyelve arra, hogy a tölcsér csúcsa is a folyadékréteg színe alatt legyen, de alul ne tapadjon a deszikkátor fenekéhez (esetleg súlyokkal rögzíthetjük). A harang, illetve tölcsér belső felülete buborékmentes kell, hogy legyen. A tölcsér nyakába belül vízszintesen egy rácsot erősítünk, amely a folyadék felhajtóerejével szemben leszorítja a mintát, megakadályozva, hogy az, alulról nekinyomódva a tölcsér szárának, elzárja a gázok útját. Végül a mintát behelyezzük a harang alá, amelynek tetejét, illetve tölcsér esetében a tölcsér szárának végét gumimembránnal lezárjuk, és vákuumot hozunk létre az edényben. A szövetekből kiszabaduló gázok a tölcsér szárának csúcsában gyűlnek össze. Rövid idő múlva a szivattyút leállítjuk, az edényt felnyitjuk, és a gumimembránon keresztül fecskendővel gázmintát veszünk. A minta a kivonás során folyadékba merül, ezért légzése, etiléntermelése fokozódik, tehát a kibocsátott gázok összetétele változik. A felsoroltak miatt a lehető legrövidebb ideig és a legkisebb vákuummal dolgozzunk. Tekintettel kell arra is lennünk, hogy túl erős vákuum esetén a folyadékban oldott gázok felszabadulnak, keveredve a minta által termelt gázeleggyel, ami teljesen eltorzíthatja a mintavétel eredményét.

• Mintavétel a növény által kibocsátott gázokból

Ezek a módszerek alkalmasak a teljes növény etiléntermelésének a mérésére is. A mintavétel típusa és az általa nyert adat információtartalma alapján a módszerek két fajtáját különböztetjük meg: a statikus és a dinamikus módszereket. A statikus módszerek esetében a meghatározás egy adott időtartam alatt kibocsátott gázok összes mennyiségéből történik. A folyamatos módszerek esetében a növényi mintát tartalmazó gáztéren folyamatosan ismert összetételű gázkeverék vagy levegő áramlik át. Mind a bemenő, mind a kimenő gázkeverékből mintát veszünk, és etiléntartalmukat összehasonlítjuk.

Statikus módszerek: Előnyük, hogy felépítésük és működtetésük egyszerű, rövid időtartamú mérésekre, alacsony mintaszám mellett, jól alkalmazhatóak. A teljes növényt vagy a növény egy eltávolított részét légmentesen lezárható tárolóedénybe helyezzük. Az edény tartalmazhat akár levegőt, akár egy általunk beállított, ismert gázkeveréket. Az edény lezárása után mintát veszünk a gáztérből, ezt az időpontot tekintjük a vizsgálat kezdetének. A vizsgálat végén ismét mintát veszünk a gáztérből. A termelt etilén menynyiségét a következő képlettel számítjuk ki:

amelyben

A: a gáztér kezdeti és végső etilénkoncentrációjának a különbsége (nl),

B: a bemért növényi anyag (g),

C: a vizsgálat ideje (h).

A növényi anyag által termelt etilén mennyiségének kiszámításához ismernünk kell a méréshez használt edény térfogatát. Kisméretű edényeket vízzel megtöltve mérhetjük tömegnövekedésüket. Nagyobb tartályok esetében ismert térfogatú gázt befecskendezve és koncentrációját visszamérve, a hígulás mértéke alapján meghatározhatjuk térfogatukat. A gáztér valódi térfogatát jobban közelíthetjük azonban, ha figyelembe vesszük a minta által kitöltött teret, számolva azzal is, hogy a növényi szövetek szintén tartalmaznak gáztereket. A legtöbb friss növényminta 1 g-ja mintegy 1 ml szilárd-folyékony fázist tartalmaz (a többi gáz) (Saltveit és Yang, 1987). Pontosabb eredményt kapunk tehát, ha 1 g növényi mintát 1 ml térfogattal számítunk, és az így kapott térfogatértéket levonjuk az edény térfogatából.

Dinamikus (átáramló rendszerű) módszerek: Felépítésük és működtetésük bonyolultabb a statikus módszereknél, de hosszú távú vizsgálatok esetében, sorozatos mintavétel mellett szükséges az alkalmazásuk. A dinamikus berendezésekre általában jellemző, hogy az etilénvizsgálatra szánt növényt vagy növényrészt



tartalmazó zárt edényen ismert összetételű gázkeverék áramlik át, ismert mennyiségben. A berendezés alapvető része a gázkeverő cső, amelynek bevezető csonkjaihoz kapcsolódnak a különböző gáztartályok (levegő, N2, O2, CO2, C2H2). Minden csonkba beépítenek két szelepet, az egyik a beáramló gázok mennyiségének pontos beállítására, a másik az adott gáz áramlásának gyors megszakítására való, a beállított értékek megőrzése mellett. A beállított gázkeverék teljes átáramló mennyiségét is mérik. A vizsgálati eredményeket befolyásoló szennyező gázok (etilén, széndioxid) eltávolítására gáztisztítókat építenek be a rendszerbe. A levágott növényrészek vagy szövetdarabok kiszáradását a rendszerbe iktatott gáznedvesítő küszöböli ki. Dinamikus módszerek esetében a termelt etilén mennyiségét a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:

amelyben

A: az átáramló gáz mennyisége (ml/h),

B: a bemenő és kimenő gázkeverék etilénkoncentrációjának különbsége (nl/ml),

C: a bemért növényi anyag mennyisége (g).

A fenti egyenlet azonban csak akkor érvényes, ha a növényminta etiléntermelése egyenletesen állandó és a rendszerünk egyensúlyi állapotban van. Az egyensúlyi állapot kialakulásának időigénye a tárolóedény térfogatától és a gázáram sebességétől függ. A rendszer állapotát (egyenletes etiléntermelés mellett) akkor tekinthetjük egyensúlyinak, ha az edény össztérfogatának a háromszorosát kitevő gázmennyiség áramlott már át rajta (ilyenkor a bemenő gázkeverék és a növény által kibocsátott gáz keveredése tökéletes). Amennyiben a növényminta etiléntermelése gyorsan változik, értékének kiszámítása nem egyensúlyi rendszerekre kidolgozott matematikai módszerekkel történhet (Marynick és Marynick, 1975).

Az etilén mennyiségi meghatározása

• Biotesztek

Bizonyos növényfajok igen érzékenyek a levegő etiléntartalmára: adott etilénkoncentráció hatására jellegzetes tüneteket mutatnak. Sötétben nevelt borsó-csíranövények (7 napos korban) 0,1–1,0 nl/ml levegő-etiléntartalom mellett szárrövidülést, szárvastagodást, a szár meggörbülését és vízszintes növekedést mutatnak (Knight et al., 1910). A tünetek magasabb etilénkoncentráció mellett kifejezettebbé válnak. Fiatal (5–6) leveles paradicsomnövények 0,1 nl/ml etilénkoncentráció hatására levélhervadást és levélhullást mutatnak.

Ismeretlen összetételű gázminta etiléntartalmát biotesztek segítségével úgy becsülhetjük meg, ha a gázmintába helyezett tesztnövények reakcióját összehasonlítjuk olyan növények tüneteivel, amelyeket előzetesen standard etiléntartalmú gázsorozatban tartottunk.

• Az etilén gázkromatográfiás meghatározása

A gázkromatográfia messze a legelterjedtebb módszer az etilén mérésére. Az oszlop töltete lehet egyszerű, szilárd Al-oxid vagy Porapak, illetve gáz-folyadék kromatográfia esetében szinte bármilyen nedvesítő folyadék – Chromosorb, Porapak vagy egyéb szilárd hordozószemcse-felületen. Az etilén elválasztására megfelel egy 0,5 m × 3,0 mm i.d. rézkolonna, 40–60 mesh szemcseméretű Al-oxid töltettel. Az oszlop 30–80 °C hőmérsékleten, 20 ml/perc nitrogén vivőgáz térfogati sebesség mellett működtethető. Gyakran szükséges lehet az oszlop egy éjszakán keresztül történő hevítése 150–180 °C körüli hőmérsékleten, alacsony intenzitású vivőgáz-átáramoltatás mellett, így fokozva az oszlop hatékonyságát. Ez a lépés megismételhető, ha az oszlop szennyezetté válik, és az etilén már nem megfelelően válik el más gázoktól (például az etántól). Kvarc kapilláris oszlop (15 m × 0,2 mm i.d.), apoláros szilikonolaj típusú nedvesítő folyadékkal (pl. SE-30) párosítva szintén jól használható etilén meghatározására. Ezen az oszlopon az etilén retenciós ideje 0–10 °C között mintegy 4,5 perc; ilyen körülmények között más gázoktól jól elválasztható csúcsot ad. A kolonnán elválasztott etilén detektálására



három detektortípus terjedt el: a lángionizációs, a fényionizációs és a félvezető detektor.

3.5. Az abszcisszinsav meghatározásaAz abszcisszinsav kivonása növényi mintákból

Az abszcisszinsav (ABS) kivonása friss növényi anyagból vagy folyékony nitrogénben mélyhűtött, majd –20 °C-on tárolt növényi mintából egyaránt elvégezhető. Egy vizsgálathoz kb. 5–10 g anyagra van szükség. Legelterjedtebb extrahálószerei a 80%-os metanol, vagy a 80% acetont és 20% 0,1 M-os ecetsavat tartalmazó oldószerelegy, de más szerves oldószerek, így etanol, etil-acetát, kloroform, hangyasav, illetve ezek különböző arányú keverékei is használhatók (egységnyi tömegű növényi anyaghoz 5–10 térfogategységnyi oldószert adva). Antioxidáns vegyület jelenléte javítja a kivonatkészítés hatékonyságát. A növényi szövet oldószeres extrakcióját porcelánmozsárban eldörzsölve vagy géppel homogenálva végzik, majd a felülúszót centrifugálással választják el a szilárd szövetmaradványoktól. A kivonatot a következő tisztítási lépés előtt (folyadék–folyadék-megoszlásos, ill. kromatográfiás elválasztás) a vizes fázis térfogatára vagy teljesen szárazra párolják.

Az abszcisszinsav elválasztása

• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás

Az ABS gyenge sav. Savas közegben, pH 3,0 alatt disszociálatlan állapotban van, és apoláros oldószerekben (pl. éter) nagyságrendekkel jobban oldódik, mint vízben. Lúgos kémhatású közegben (pH 9,0) viszont disszociációja csaknem teljes, vízben való oldékonysága ekkor sokkal jobb, mint szerves oldószerekben. Ezek ismeretében tehát lúgos közegben (pH 8,0) éterrel rázatva a vizes növényi extraktumot, megtisztíthatjuk a mintát a bázikus és semleges – éterben oldódó – komponensektől, miközben az ABS a vizes fázisban marad. Ha az oldat kémhatását ezután megváltoztatjuk (pH 3,0), éterrel szerves fázisba vihetjük az ABS-t, egyéb éterben oldódó szerves savakkal együtt (ilyenkor az erősen poláros komponensek a vizes fázisban maradnak).

• Hagyományos oszlopkromatográfia és szilárd fázisú extrakció

A legelterjedtebb – ABS elválasztására használt – oszlopkromatográfiás töltet a polivinil-pirrolidon (PVP), amely jó hatékonysággal köti meg a mintában lévő fenolvegyületeket, és az ABS kevés veszteséggel nyerhető vissza az elúció végén. A mintát legtöbbször közel semleges (pH 6,0) foszfát-pufferrel nyerik vissza az oszlopról.

Az ABS-tartalmú növényi kivonat szilárd fázisú extrakciója különféle gyári kiszerelésű (Sep-Pak, Waters Associates stb.) előre töltött, egyszer használatos oszlopokkal végezhető. Leggyakoribb a fordított fázisú, oktadecil-szilán töltet alkalmazása. Az elúció metanol és ecetsav, vagy metanol és foszforsav keverékével történhet.

• Az abszcisszinsav vékonyréteg-kromatográfiás elválasztása

A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztási lépés eredményeként az ABS az éteres fázisba kerül, amelyet szárazra párolva egy, még viszonylag heterogén kivonatot nyernek, amit vékonyrétegen, vagy HPLC-vel tisztíthatnak tovább. Vékonyréteg esetében a száraz extraktumot kb. 100 μl metanolban feloldják, és ezt viszik fel a rétegre. Az ABS vékonyréteg-kromatográfiás elválasztására fluoreszcens indikátort tartalmazó, 0,5 mm vastag szilikagélrétegek terjedtek el. Az ABS foltja a vékonyrétegen elnyeli az UV-sugárzást, így UV-fény alatt kimutatható. A vékonyréteget használat előtt célszerű metanol/ecetsav (98:2 térfogatarányú) elegyével mosni a szennyeződések eltávolítása érdekében. A rétegre a minták mellett tiszta abszcisszinsav markert is el kell helyezni, gondosan ügyelve arra, nehogy a minták valamelyikével érintkezzen. Mintafelvitel előtt érdemes az egyes sávokat tűvel megkarcolva elválasztani. A futtatáshoz több oldószerkombináció használható: toluol/etil-acetát/ecetsav (különböző arányú elegyei), kloroform/ecetsav (98:2) vagy kloroform/metanol/víz (75:22:3). Kifejlesztés után az abszcisszinsav markerrel egy magasságban futó foltokat 1–2 ml etil-acetát telített vizes oldatával, vagy aceton/metanol (1:1) elegyével eluálják a rétegről. Az eluátumból a szilikagélszemcséket centrifugálással vagy szűréssel távolítják el.

• Az abszcisszinsav elválasztása HPLC-vel

A folyadék–folyadék-megoszlásos elválasztással, illetve a szilárd fázisú extrakcióval nyert, félig tisztított növényi mintát szárazra párolják, majd 1 ml 20% metanol/80% 0,1 M-os ecetsav elegyében feloldják, ezt injektálják a HPLC-oszlopra. A HPLC-oszlopok közül a fordított fázisú oktadecil-szilán (ODS) töltetű oszlopok



használata gyakori eleme az ABS-elválasztásnak. Nagyméretű (150 x 10 mm i.d.), tipikus szemipreparatív ODS-oszlopra 100 mg éteres kivonat (Horgan, 1981), illetve 5 g friss növényi anyagból készített tisztítatlan extraktum injektálható (Neill és Horgan, 1987). Kisebb, analitikai célra használt oszlopok (150 × 4,5 mm i.d.) mintakapacitása jóval kevesebb, de felhasználási területük is alapvetően más: részben már megtisztított növényi minták további szétválasztására alkalmasak. Ez utóbbi oszloptípusra vonatkoznak a következő konkrét elválasztási paraméterek (Neill és Horgan, 1987): a gradiens-elúciót 0,1 M-os ecetsavban oldott metanollal végezték (0–100% között, lineárisan növekvő koncentrációban), 30 percen keresztül, 2 ml/perc eluensáramlási sebesség mellett. Ebben az esetben az abszcisszinsav retenciós ideje 10–13 perc között változott.

• Az abszcisszinsav gázkromatográfiás elválasztása

Származékképzés: Az ABS metil-észterének előállításához szükséges diazometánt Schlenk és Gellerman (1960) módszerével állítják elő. A diazometán nemcsak robbanékony, de rákkeltő is, előállítását és a metilezés folyamatát elszívófülke alatt kell végezni! A diazometánból kis mennyiséget (max. 20 ml-t) fejlesztve, felfogják éter/metanol (4:1 térfogatarányú) elegyében, és így, oldott állapotban tárolják –20 °C-on tárolják. A metilezésre szánt száraz mintához kevés, (kb. 1 ml) diazometán-oldatot adnak, amelyben a mintát mintegy 10 percig hagyják állni. Ha a diazometán sárga színe hamar eltűnik, akkor további reagens hozzáadása szükséges.

GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Apoláros és poláros megosztó fázisú oszloptöltetek egyaránt elterjedtek metilezett ABS GC-analízisére. Apoláros nedvesítő folyadékok például a metil-szilikon OV-1, SE-30, DC-200 vagy SP-2100. Poláros megosztó fázisként az Epon-1001, az XE-60, az Ultrabond-PEGS és a Carbowaxok használata javasolható. Neill és Horgan (1987) az abszcisszinsav és két metabolitjának gázkromatográfiás elválasztását egy 1 m × 4 mm i.d. töltött kolonnán végezték, 3% OV-1 megosztó fázissal, 210 °C oszlophőmérsékleten. A nitrogén vivőgáz térfogati sebessége 40 ml/perc volt. Az oszlopból távozó komponensek mennyiségét elektronbefogásos detektorral mérték. A hagyományos töltött kolonnák mellett kvarc kapilláris kolonnák alkalmazása is gyakori (pl. BP-1 kémiailag kötött megosztó fázissal). Mintakapacitásuk azonban lényegesen kisebb, mint a töltött kolonnáké. Rosher et al. (1985) az abszcisszinsav metilezett származékát mérték GC-MS-sel, kapilláris GC-kolonnán választva el az egyes mintaösszetevőket. A metilezett mintákat metanolban oldva injektálták (1 μl mennyiségben) a 40 °C-os oszlopba, (50:1 arányú) megosztásos módszerrel. Az oszlop hőmérsékletét az injektálás után 1 perccel kezdték el növelni, 200 °C-ig ballisztikus görbét követve, majd 5 °C/perc intenzitással 250 °C-ig. Az injektor hőmérséklete 250 °C, a hélium vivőgáz nyomása 0,2 MPa volt. Az elválasztott, oszlopból kiáramló komponenseket tömegspektrométer ionforrásába vezették.

Az abszcisszinsav mennyiségi meghatározása

• Az abszcisszinsav GC-MS analízise

A tömegspektrométer gázkromatográfhoz kapcsolva rendkívül érzékeny és sokoldalú mérési lehetőséget nyújt. Teljes tömegspektrum felvétele helyett – más növényi növekedésszabályzók méréséhez hasonlóan – az ABS esetében is csak egy vagy néhány, adott m/z értékű töredékion intenzitását követik nyomon (SIM- és MIM-módszer). Szelektív ion megfigyeléskor (SIM) a készülék csak azt az intenzitást méri, amit az ABS metilészterének egy bizonyos töredékionja ad. Erre leginkább a 190 m/z értékű részecske alkalmas. A Me-abszcisszinsav – elektronütköztetéssel ionizálva – a következő m/z értékeken ad jellemző fragmentumokat (70 eV ionizációs potenciál hatására): 190, 162, 146, 134, 125, 112, 91. Az ionok által adott jel intenzitása arányos a beinjektált ABS mennyiségével, ezért kalibrációs görbe készíthető, ami lehetővé teszi ismeretlen abszcisszinsav-tartalmú minták mennyiségi vizsgálatát.

• Az abszcisszinsav kvantitatív szerológiai meghatározása

Rosher et al. (1985) gyenge vízellátással stresszelt almafacsemeték és csemegepaprikatövek leveleiben radioaktív szerológiai módszerrel (RIA) határozták meg az ABS menynyiségét. A növényi extraktumokat először folyadék–folyadék-megoszlással (éterrel), azután PVP-oszlopon, majd szilárd fázisú extrakcióval (ODS-oszlopon) tisztították, végül a mintákban lévő komponenseket HPLC-vel választották szét. A RIA-vizsgálatokat 5 ml-es polietilén szcintillációs csövekben végezték. A csövekbe 400 μl 0,2 M-os Na-acetát/ecetsav-puffert (pH 4,0) pipettáztak. Hozzáadtak 100 μl tríciummal jelölt ABS-t (kb. 670 Bq; 0,635 TBq/mmol), továbbá 100 μl ABS standard oldatot, megfelelő hígításban (0,19–100 pmol tartományban; 2-szeres hígítási lépésekben), vagy 100 μl mintát, továbbá 100 μl 1,5%-os PVP-oldatot, vagy ugyanennyi desztillált vizet. Az elegyet Vortex-szel kevertették, végül hozzámérték a 100 μl ABS-antiszérumot (250-szeres hígításban). Az említett kompetíciós elegyek mellett olyan csövet is beállítottak, amellyel a maximális izotóppal jelölt ABS-kötődést (Bmax-ot) mérhették (nem adtak hozzá sem mintát, sem ABS-standardot). A nem specifikus kötődés mértékét olyan



elegyben határozták meg, ami nem tartalmazott antiszérumot, ezt az értéket minden mérési eredményből levonták. Az így elkészített csöveket 4 °C-on 90–120 percig tartották. Az antitestekhez (immunglobulinokhoz) specifikusan kötődött ABS-molekulákat az IgG-fehérjék kicsapásával választották el a nem kötődött frakciótól. Ezt telített ammónium-szulfát 90%-os oldatával (1 ml) végezték, majd 30 perc inkubációs idő után a kicsapódott szilárd fázist centrifugálták (10 percig, 2500 g-vel) és a felülúszót leöntötték. A precipitátumot telített ammónium-szulfát 50%-os oldatával (1 ml) ismét elegyítették, centrifugálták és a kicsapott fehérjefrakciót 150 μl vízbe visszaoldották. Az oldathoz ezek után hozzáadták a szcintillációs koktélt (ezt kereskedelmi forgalomban árusítják), ami segít elkerülni azt, hogy az oldat fázisokra váljon szét. Ez alapvető feltétele a megbízható szcintillációs számlálásnak. A szcintillációs számlálóval végül megállapították az oldat által kibocsátott radioaktív sugárzás mértékét, amely minél kisebb volt, annál kevesebb tríciummal jelölt ABS kötődött, tehát a minta (ill. a standard) annál több ABS-t tartalmazott. Az ABS-standardsor alapján kalibrációs görbét szerkesztettek, ami lehetővé tette ismeretlen ABS-tartalmú növényminták kvantitatív vizsgálatát. A számítást a következő (logit transzformációs) képlettel végezték:

amelyben

B: az egyes minták vagy standardok esetében mért radioaktivitás,

Bmax: kompetíciómentes – mintát, ill. standard oldatot nem tartalmazó – elegy radioaktivitása.

Az adatokat koordináta-rendszerben ábrázolva az x-tengelyre került az ABS mennyisége (pmol), az y-tengely mutatta a logit(B/Bmax) értéket.


17. fejezet - Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerekA növények, mint ahogyan minden élőlény, életük során számos környezeti hatásra (szárazság, hőmérséklet-változás, légszennyeződés, kórokozókkal történő fertőződés stb.) reagálnak. E környezeti hatások gyakran az optimális életkörülmények megváltozását okozzák, ezzel alkalmazkodásra kényszerítik a növényeket. A hatás erősségétől függően látható vagy mérhető stressz-szimptómák jelennek meg a növényen. A „stressz” a Selye János által megfogalmazott definíció szerint nem más, mint a szervezet nem fajlagos válasza különböző stresszorok károsító hatása ellen. A stresszor hatására jelentkező tünetegyüttes pedig a generális adaptációs szindróma, amely magában foglalja a vészreakciót, a rezisztencia és a kimerülés szakaszát (Selye, 1975). Ezt a definíciót azonban manapság nem követik a kutatók, ma a stressz a stresszor fogalmával azonos fogalom. A stressz tehát a károsító tényező, a növény nem fajlagos válaszreakciója pedig a stressz-szimptóma. A növényekben fellépő stressz pontos meghatározása azonban igen nehéz. A különböző genetikai arculattal rendelkező organizmusok más-más módon reagálnak a környezet változásaira. Nehéz meghatározni az egyes környezeti tényezők (98. ábra) hatásának a stressz kiváltásához elegendő szintjét, ahol az anyagcsere-folyamatok stressz-anyagcsere-folyamatokba váltanak át (Elstner és Osswald, 1994).

98. ábra - A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után]

A számos stressz közül a kórokozók (gomba, baktérium, vírus) fertőzése a legváltozatosabb és legbonyolultabb hatású. A behatoló mikroorganizmus érzékelésén és azonosításán túl a növény képes koordinált rendszerben egy vagy több védekező mechanizmust felmutatni, amelyek segítségével megpróbálja megakadályozni a kórokozó behatolását, szaporodását, és végül annak elpusztítására törekszik.

A védekezés lehetőségei egyrészt adottak, másrészt indukálhatók. Az indukálható védekező reakciók két típusát különböztetjük meg: a) specifikusan, valamint b) nem specifikusan indukálható védekező reakciók. Ez utóbbiak előidézésére számos biotikus és abiotikus stresszor (stressz) képes. A többnyire összetett védekezés során a növény egyrészt kémiai „fegyverzettel” (fitoalexinek, aktív oxigénformák és antimikrobiális fehérjék termelése) rendelkezik, másrészt szerkezeti gátak kialakítására (sejtfal megszilárdítása, ligninképződés és a sejtfalfehérjék immobilizációja) képes (Dixon et al., 1994).

A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét jelentősen befolyásolja a specifikus felismerés, amely specifikus elicitor–receptor kölcsönhatáson keresztül történhet. A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét azonban gyakran nem specifikus, hanem általánosan aktiválható reakciók döntik el.

A védekezési folyamatok egy része a növényi sejt felületén játszódik le, de itt történik egyéb folyamatok


Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek

indukálása is, amelyek tagjai annak a folyamatláncolatnak, amely mint jelátadó rendszer működik. A válaszreakciók egy része rezisztenciát idéz elő, míg többségük inkább a kórokozó sikeres fertőzésének a kísérőjelensége, esetleg az abiotikus stresszhatás által kiváltott stressz-anyagcserefolyamat része [aktív oxigénformák (AOF) termelődése, az exocelluláris és intracelluláris pH-változás, a membránpotenciál megváltozása, az ion-kiáramlás, a fehérjék foszforiláltsági mintázatának a változása stb].

A fent említett AOF termelődése a gazda–parazita kapcsolatok, valamint számos abiotikus stressz által előidézett folyamat során fokozódik. Ez a reakció az állatvilágban és a humán patológiában több mint 30 éve ismert. A növényekben később fedezték fel. Az azóta született biokémiai és genetikai kutatási eredmények alátámasztják az AOF-nak a sejthalálban betöltött kulcsszerepét, bár a mai napig vitatott, hogy vajon az AOF közvetlen hatása mennyire irányul a növény és mennyire a kórokozó ellen. Az is kérdés, hogy jelmolekulaként szerepet játszanak-e az egyes védelmi szerepet kódoló gének transzkripciójának indukálásában (Dangl et al., 1996).

1. Az aktív oxigénformákA legtöbb látható vagy mérhető stressztünet kapcsolatos az oxigénanyagcsere-folyamatok megváltozásával, melynek során a heterolitikus (két elektron átvitelével járó) folyamatok helyett megnövekszik a homolitikus (egy elektron átvitelével járó) folyamatok mennyisége, és emiatt ún. szabad gyökök keletkeznek. Az AOF részben szabad gyökök, mint a szuperoxid (•O2

–) és a hidroxil gyök (•OH), amelyek párosítatlan (extra) elektronnal rendelkeznek, részben olyan molekulák, amelyek reakcióik során szabad gyök képzésére képesek, mint pl. a hidrogén-peroxid (H2O2) és a szinglet oxigén (1O2).

Ezek a gyökök és molekulák a molekuláris oxigénből sorozatos redukcióval keletkeznek.

Képzésükre így minden aerob sejt képes, kis mennyiségű termelődésük az egészséges növényi szövetek sejtjeiben természetes folyamat. AOF keletkeznek kloroplasztiszokban a fotoszintetikus elektrontranszport során, mitokondriumokban, ahol az oxigén 4%-a alakul át szuperoxiddá, továbbá a citoplazmában lejátszódó enzimreakciók során. Az így keletkező AOF semlegesítésére a sejt antioxidáns-kapacitással rendelkezik, amelyet antioxidáns enzimek és nem enzimatikus antioxidánsok képviselnek.

A molekuláris oxigén önmaga nem nagyon reakcióképes, a fent említett redukciók során elektronszerkezete azonban megváltozik, s ezáltal rendkívül reakcióképessé válik. Számos, élettani szempontból jelentős makromolekulát képes károsítani (membránokat, fehérjéket, aminosavakat, nukleinsavakat stb.). Ha a sejt antioxidáns-kapacitását felülmúlja az AOF gyors, nagy mennyiségű átmeneti képződése, ún. „oxidatív robbanás” (oxidative burst) következik be. Ez utóbbi jelentős károsításokat okozhat, és bekapcsolódhat a sejt jelátviteli rendszerébe, ezáltal szerves részévé válik számos folyamatnak.

1.1. Szuperoxid gyök (•O2–)

Molekuláris oxigénből egyelektronos redukcióval szuperoxid (•O2–) anion keletkezik. Ennek a reakciónak a

végbemeneteléhez csekély energiabevitelre van szükség. Ezt az energiát az élő rendszerekben legtöbbször a redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) szolgáltatja. A további redukciókhoz már nincs szükség extra energiára, a megfelelő reakciópartner jelenlétében spontán módon is lejátszódnak. Az élő sejtekben a szuperoxid (•O2

–) sav–bázis egyensúlyt alkot protonált formájával, a hidroperoxil gyökkel (•O2H),



ez utóbbi forma lipofil, könnyebben behatol a membránok lipid kettősrétegébe, és így képes a káros lipid-peroxidáció előidézésére.

A szuperoxid (•O2–) jelenléte a növényi szövetekben pH-függő (fiziológiás pH esetén a szuperoxid nem nagyon

reaktív). Az 1,0 × 10–6 M-os szuperoxid (•O2–) oldatban a molekula felezési ideje (t1/2) 6,5 pH esetén 0,5

másodperc, míg 8,5 pH esetében 50 másodperc. Vizes oldatban annak kissé savas és semleges pH-ja esetén a szuperoxid (•O2

–) és protonált formája

hidrogén-peroxiddá (H2O2) és oxigénné (O2) alakul át (Sutherland, 1991). Ez a reakció lejátszódhat spontán dizmutáció útján, vagy szuperoxid-dizmutáz enzim katalizációja segítségével. Az enzim gyorsan katalizálja a reakciót, jelenlétében 1010-szer gyorsabb a reakció. Megjegyzendő, hogy a spontán dizmutáció is nagyon gyors, mégis csaknem minden szervezet rendelkezik olyan speciális enzimmel vagy rendszerrel, amely a dizmutációért felelős. Az enzim megtalálható a citoplazmában, a kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, sőt a plazmamembránon kívül is. A szuperoxid (•O2

–) keletkezését jelentős mennyiségű hidrogén-peroxid (H2O2) keletkezése kíséri:

1.2. Hidrogén-peroxid (H2O2)A hidrogén-peroxid (H2O2) aránylag stabil AOF. Elektromosan semleges és kevésbé reaktív, képes tehát áthatolni a membránokon, így a keletkezési helyéről más sejtekbe vándorolhat. A sejtekben keletkezett hidrogén-peroxid (H2O2) spontán módon vagy kataláz segítségével

átalakulhat vízzé (H2O) és molekuláris oxigénné (O2), vagy szubsztrátja lehet különböző peroxidázoknak, amelyek segítségével a ligninszintézis alapjául szolgáló fenoxil gyökök keletkeznek,



de átalakulhat a Halliwell-Asada-cikluson (lásd az Aszkorbát c. alfejezetet) keresztül is. A hidrogén-peroxid (H2O2) közvetlen oxidálására képes néhány átmeneti fém, ilyen a Fe2+ és a Cu2+ is.

1.3. Hidroxil gyök (•OH)A legaktívabb az itt tárgyalt formák közül a hidroxil gyök ( •OH), amely hidrogén-peroxid (H2O2) és a szuperoxid (•O2

–) direkt reakciójával (Haber-Weiss-reakció) keletkezhet:

A növényi sejtben, a sejt természetes állapota mellett ez a reakció lassan játszódik le, és nem termelődik általa jelentős mennyiségű hidroxil gyök (•OH), 4,8-as pH-optimuma miatt gyakorisága elhanyagolható.

Jelentős mennyiségű hidroxil gyök keletkezik átmeneti fémek – Fe2+ és Cu2+ – oxidációja

során (Fenton-reakció). Ez olyan ciklusreakció, ahol az oxidált ionok redukáló formájukat szuperoxiddal (O 2-)

való reakció útján visszanyerik.

A hidroxil gyökök (•OH) sejten belüli keletkezését elsősorban az átmeneti fémek hozzáférhetősége határozza meg (Gutteridge és Halliwell, 1994). A hidroxil gyök ( •OH) az egyik legerősebb redukáló ágensként irreverzíbilis változásokat idéz elő a sejt makromolekuláiban és megtámadja az organellumokat. Felezési ideje 10–9 másodperces tartományba esik, így meghatározása és szerepének vizsgálata nem sok sikerrel járt ez idáig. A hidroxil gyök (OH) jelenléte a növény–kórokozó kapcsolatokban feltételezhető.

1.4. Egyéb aktív oxigénformákA biológiai membránokhoz kapcsolt elektrontranszport-láncok és a szolubilis fázis kémiai reakciói révén számos más, az előző fejezetekben nem említett AOF keletkezik. Ezek részben gyökök, mint pl. a szerves ligandumot (R) tartalmazó fenoxil gyökök (RO2

•), alkoxil gyökök (RO•), nitrogén-monoxid gyökök (NO•), nitrogén-dioxid gyökök (NO2

•), részben pedig molekulák, pl. szinglett oxigén (1O2), ózon (O3), hipoklórossav (HOCl), szerves peroxidok (ROOH), salétromossav (HNO2) stb. Az utóbbi évek kutatási eredményei a nitrogén-monoxid gyök (NO•) kiemelkedő szerepét bizonyítják. A nitrogén-monoxid szintáz által termelt nitrogén-monoxid gyök (NO•)



szuperoxid gyökkel reagálva további AOF-at hoz létre (Millar és Day, 1997):

Delledonne et al. (1998) és Durner et. al. (1998) munkáikban a nitrogén-monoxid gyök (NO •) hiperszenzitív reakcióban, valamint az egyes védelmi szerepet betöltő gének transzkripciójának aktiválásában betöltött szerepét bizonyítják.

2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsokAz egészséges növény szöveti sejtjeiben aktív oxigénformák keletkeznek, amelyek akkumuláció folytán toxikussá válhatnak a sejt számára. A sejtek azonban több antioxidáns tulajdonságú molekulával és jellegű folyamattal rendelkeznek. Ide tartoznak a kismolekulájú, nem enzimatikus antioxidánsok (aszkorbát, glutation, E-vitamin stb.), az egyes enzimek (aszkorbát-peroxidáz, dehidroaszkorbát-reduktáz, glutation-S-transzferáz, glutation-reduktáz, szuperoxid-dizmutáz, kataláz, peroxidáz stb.), valamint több összetett enzimrendszer, amely képes hatékonyan védelmezni azokat a sejtalkotókat, amelyekben lokalizáltak.

2.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD)A szuperoxid-dizmutáz fémtartalmú enzim. A növényvilágban három alapvető formáját azonosították. Attól függően, hogy milyen fémet tartalmaz és hol fordul elő, megkülönböztetünk Cu/Zn-SOD-t, Mn-SOD-t, Fe-SOD-t. A Cu/Zn-SOD elsősorban az eukarióta szervezetek citoplazmájában és/vagy a kloroplasztisz sztrómájában található. A Mn-SOD a prokarióta szervezetekre jellemző, de megtalálható az eukarióta szervezetek mitokondriális mátrixában is. A Fe-SOD a prokariótákon kívül néhány eukarióta család kloroplasztiszában is megtalálható.

Az enzim a szuperoxid (•O2–) dizmutációját katalizálja. Az így keletkezett hidrogén-peroxid (H2O2) az előbb leírt

módokon, pl. kataláz segítségével alakul át vízzé (H2O) és oxigénné (O2). A szuperoxid dizmutázt jelentős antioxidánsnak tekintik. Azonban állati és baktérium-sejtekben, ahol megemelkedett aktivitását észlelték, a sejtek halálát okozta, ha a kataláz nem volt képes semlegesíteni a keletkezett hidrogén-peroxidot (H 2O2). Egyes feltételezések szerint a SOD képes a hidrogén-peroxidból (H2O2) hidroxil gyök (•OH) keletkezését is katalizálni; feltehetően ez a mechanizmus magyarázza a hidroxil gyöknek a membránkötött átmeneti fémektől távol eső károsítását (Yim et al., 1990).

2.2. AszkorbátJelentős antioxidáns, az egész sejten belül megtalálható. Képes közvetlenül reakcióba lépni a szuperoxiddal (•O2

–) és a hidroxil gyökkel (•OH), valamint képes a hidrogén-peroxidot (H2O2) aszkorbát-peroxidáz segítségével



– Halliwell-Asada-ciklus – átalakítani.

Az oxidált aszkorbát dehidroaszkorbát-reduktáz segítségével, glutation terhére regenerálódik; ez utóbbi regenerálódását a glutation-reduktáz és a NADPH biztosítja.

2.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidokA glutation redukált (GSH) és oxidált (GSSG) formája, valamint a glutation-reduktáz (GR) jelentős szerepet játszik a hidrogén-peroxid (H2O2) lebontásában a citoszolban és a kloroplasztiszban szerveződött összetett rendszerben, a Halliwell-Asada-ciklusban. A glutation-S-transzferáz a xenobiotikumok méregtelenítésében vesz részt. Hasonlóan az aszkorbáthoz, a glutation is képes közvetlen reakciókra.

Fontos még megemlíteni mint nem enzimatikus antioxidánst, az E-vitamint (α-tokoferol), amely a membránok kettős lipidrétegében található, és védelmet nyújt a lipid-peroxidáció ellen. Az oxidált vitamin az aszkorbát-glutation ciklusban nyeri vissza redukáló képességét.

Az alábbi antioxidáns-rendszereken kívül számos flavonoid komplex képes antioxidánsként működni, gátolva a lipid-peroxidációt.

2.4. KatalázA hidrogén-peroxidot (H2O2) vízzé (H2O) és oxigénné (O2) katalizáló vasporfirin prosztetikus csoportot tartalmazó enzim megtalálható a legtöbb aerob élő szervezetben. Jelentős szerepet játszik a peroxiszómák és a glioxiszómák hidrogén-peroxid- (H2O2) szintjének csökkentésében. Szerepe a növény–kórokozó kölcsönhatásokban is jelentős. A kataláz disszociációs állandója magas, így kis mennyiségű hidrogén-peroxid (H2O2) átalakításának katalizálásánál nem túl hatékony, pl.: ha 1 mg katalázt elegyítünk 10 mM-os hidrogén-peroxid- (H2O2) oldattal, akkor 4000 mol H2O2/perc teljesítménnyel katalizálja a reakciót, míg ugyanennyi kataláz 10 μM-os hidrogén-peroxid- (H2O2) oldatban csak 2 μmol/perc. Ebben az esetben az előzőleg leírt rendszer jóval hatékonyabb, mint a kataláz. Az is lehetséges, hogy bizonyos stresszhelyzetekben, amikor a NADPH-igény nagy, a kataláz szerepe megnövekedik.

3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módjaMiután számos tudományos dolgozat született az AOF kémiájáról, keletkezésükről és a sejt antioxidáns-folyamatairól, kézenfekvővé vált a kérdés, hogy hol és hogyan keletkezik nagy mennyiségben az AOF.

A legvitatottabb dolgozatok a mai napig az AOF eredetének tanulmányozása során születnek. A részben bizonyított és részben feltételezéseken alapuló modellek közül a részleteiben legjobban ismert „NADPH-oxidáz” rendszer számos analógiát mutat az állati fagocita sejtekben található rendszerrel. Egy másik, részben hipotetikus modell, a pH-függő „sejtfal-peroxidáz” rendszer. AOF-termelő képességet tulajdonítanak a „csíra/oxalát oxidáz” rendszernek, amely hidrogén-peroxidot termel a behatoló kórokozó ellen, de nem történik oxidatív robbanás, valamint a xantin-oxidáznak, amely enzim oxigént használ fel a xantin oxidálására, szuperoxid és húgysav keletkezése közben. A „lipoxigenázt” szintén lehetséges AOF-forrásnak tekintették, azonban kiderült, hogy az AOF termelődése megelőzi a lipoxigenáz aktiválódását.



Az oxidatív robbanás során keletkező aktív oxigénformákat képző NADPH-oxidáz rendszer a plazmamembránban található (99. ábra), aktiválódását számos egyéb folyamat előzi meg. Ezek a folyamatok részei a jelátadási rendszernek, amelyen keresztül a NADPH-oxidáz is aktiválódik. Az így keletkező aktív oxigénformák egyéb anyagcsere-folyamatokat aktiválnak, amelyek bizonyos rezisztenciagének transzkripciójának aktiválásához és sejthalálhoz is vezethetnek. A modell hipotetikus, leegyszerűsített működési elve a következő: a plazmamembránban található receptormolekula (Rp) egy elicitor- molekulát ismer fel, ezt a guanozin-trifoszfát (GTP)-kötött ún. „G-fehérje” aktiválása, az ioncsatornák megnyitása (a Ca 2+ és a H+

beáramlása, valamint a K+ kiáramlása és ezáltal a citoplazma savasodása) követi. A protein-kinázok és protein-foszfatázok, valamint a foszfolipázok is valószínűsíthetően részt vesznek az aktív oxigénformákat létrehozó NADPH-oxidáz rendszer aktiválásában.

99. ábra - Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok aktiválásában. RP = receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA • = szalicilát gyök, BA2H = benzoesav-2-hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-Kosack és Jones, 1996 után módosítva]

A hidrogén-peroxid (H2O2) keletkezésének egy másik lehetősége, a pH-függő sejtfal peroxidáz-modellje, bár ellentmond az előbbinek, ugyanúgy nem zárja ki a jelátadási ösvényen keresztüli aktiválódást, hangsúlyozva a plazmamembrán és a sejtfal közötti felület komponenseinek fontosságát. Összegezve megállapítható, hogy az elicitormolekulát itt is ugyanúgy egy receptor molekula érzékeli, ezt követi az ionoknak az ioncsatornákon keresztüli áramlása (Ca2+, K+, H+, Cl–), ami a plazmamembrán külső felületének átmeneti alkalizációját eredményezi, ezt pedig már a sejtfal kötött peroxidáz-aktiválódása követi.

Az AOF termelődéséről szóló első növénybiológiai tanulmány 1983-ban látott napvilágot, ahol egy burgonyagumó szövetében végbemenő hiperszenzitív reakció (HR) során észlelték a szuperoxid ( •O2

–) termelődését. Továbbá megállapították, hogy az ilyen reakció csak az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatra jellemző (Doke, 1983).

Az AOF keletkezésének módját növény–baktérium sejtszuszpenzióban sikerült vázolni, egy inkompatibilis és egy kompatibilis gazda–parazita kapcsolat összehasonlításával. Megállapították, hogy az AOF keletkezésének két fázisát, hullámát lehet megkülönböztetni. Az első fázis egy aránylag rövid, nem specifikus reakció következtében jön létre, mind a kompatibilis, mind az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatban, míg a második fázis hosszabb és specifikusan jellemző az inkompatibilis kapcsolatra (100. és 101. ábra). Az inokulum baktériumszámának növelése (107 ⇒ 108 cfu/ml) maga után vonta az AOF mennyiségének növekedését az első fázisban, ugyanakkor a második fázisban azok csökkenése következett be (Baker et al., 1991). Ez a ellentmondás az első fázisban megnövekedő antioxidáns-kapacitás következménye.

100. ábra - Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény kapcsolatban [Baker és Orlandi, 1995 után]



101. ábra - Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas syringae pv. tabaci) és P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os rasszával fertőzött dohány- és szója-sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok) és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita kapcsolatok [Baker és Orlandi, 1995 után]



4. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe4.1. Antimikrobiális aktivitásAz AOF antimikrobiális aktivitása régóta ismert (lásd fagocitózis). A növényi sejtek képtelenek mozgást végezni, körülvenni és beburkolni a kórokozót, ellenben AOF termelésére képesek. A szuperoxid és a hidrogén-peroxid baktériumok és gombák elleni antimikrobiális aktivitása in vitro kísérletekben igazolt, in vivo betöltött szerepük azonban nem bizonyított (Király et al., 1997).

A stacionáris fázisban lévő baktériumok több katalázt termelnek, mint a log fázisban lévő baktériumok, ezáltal ellenállóbbak a hidrogén-peroxid magas koncentrációjával szemben. Baker és Orlandi (1995) munkájából kitűnik, hogy magas hidrogénperoxid-koncentráció mellett (1,0–50 mM) a baktériumpopuláció túlélését a baktériumsejtek koncentrációja határozza meg, nem pedig az egyes baktériumsejtek antioxidáns-aktivitása.

4.2. Fitoalexinek termelődéseAz AOF és a fitoalexinek termelődése között számos összefüggést találtak az elmúlt évtizedben. A szójanövények hipokotiljában a hidrogén-peroxid hatására keletkező zsírsav-hidroperoxidok gliceollin-akkumulációt váltottak ki (Apostol et al., 1989). Ezek az adatok közvetlen ok-okozati összefüggésre utaltak, ám ugyanezen laboratóriumban később arra a következtetésre jutottak, hogy a növényben két különböző elicitormolekula van jelen, amelyek képesek mindkét reakció párhuzamos és független indukciójára. Más dolgozatok is megkérdőjelezik az összefüggést. Pl. dohánysejteket tisztított fehérje-elicitorral kezelve fitoalexin-termelődést észleltek, azonban AOF termelődését nem. Az utóbbi évek eredményei azt valószínűsítik, hogy ez a két jelenség párhuzamosan indukálható, feltehetőleg különböző felismerő és jelátadó rendszer által.

4.3. Hiperszenzitív reakcióA hiperszenzitív reakció (HR), mint a növényi rezisztenciával kapcsolatos válaszreakció, régóta vizsgált növény-kórélettani jelenség (Klement, 1982). Levine et al. (1994) tanulmányában az AOF termelődését mind a virulens, mind az avirulens baktériumtörzsek előidézték. A gazdasejtek halála azonban csak az avirulens törzsnél észlelhető. A HR előidézésében a hidrogén-peroxidnak tulajdonították a kulcsszerepet. Glazener et al. (1996) mutáns baktérium alkalmazásával bizonyították, hogy bár a baktérium képtelen HR-t előidézni a növényi sejtekben, az AOF kétfázisú termelődése mégis megtörténik. A hozzáadott (exogén) hidrogén-peroxid, bár valóban képes sejthalál előidézésére, csak jóval nagyobb mennyiség esetén (2–10 mM) hatásos, mint amennyi in vivo a növényben az AOF keletkezésekor termelődik. Egyes mutánsokkal végzett kísérletek a hidrogén-peroxid helyett a szuperoxidnak tulajdonítanak iniciáló szerepet a sejthalál indukálásában.

4.4. Szisztemikus szerzett rezisztenciaA szisztemikus szerzett rezisztencia és az AOF termelődésének összefüggését több dolgozat részleteiben vizsgálja. Léon et al. (1995) megállapították, hogy a hidrogén-peroxid növeli a benzoesav-2-hidroxiláz enzim aktivitását, amely enzim benzoesavból szalicilsav (SA) képződését katalizálja, mindez SA-akkumulációhoz vezet. Bizonyított tény, hogy a SA elengedhetetlen a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához. Fodor et al. (1997) vizsgálatai szerint a SA különböző antioxidánsokat aktivál és ezzel alapvetően hozzájárul a nekrotikus tünetek visszaszorításához, vagyis a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához.

A hidrogén-peroxid mennyisége jelentősen megnő a fertőzési helyeken, feltételezhető a SA mellett egy másodlagos hírvivő szerepe a jelátadási rendszerben, amely során szisztemikus szerzett rezisztencia alakul ki, valamint kórfolyamat-függő fehérjék génjei aktiválódnak. Ez utóbbi szerepét számos szerző megkérdőjelezi (Klessig és Malamy, 1994).

4.5. Indukált sejtfal-megszilárdításRégóta ismert és bizonyított jelenség a kórfolyamat kezdetén bekövetkező sejtfal-megszilárdítás, amely során a sejtfalfehérjék peroxidáz által katalizált keresztkötődéssel megszilárdítják a sejtfalat, és lassíthatják a kórokozó behatolását. Ez az oxidatív robbanás során keletkező hidrogén-peroxid által befolyásolt folyamat. A sejtfal megszilárdításában részt vevő egyéb folyamatok létezésére utal az is, hogy indukálására képes pl. a glutation is,



ami köztudottan antioxidáns.

5. Mérési módszerek és értékelésükAz aktív oxigénformák instabil természetűek, spontán és enzim katalizálta reakcióik nagyon gyorsak, felezési idejük a másodperces időintervallumba esik. Mindez megnehezíti közvetlen mérésüket a növényben. Ugyan a leegyszerűsített gazda–parazita kapcsolatok, pl. a növényi sejtkultúra-szuszpenzió és baktérium-szuszpenzió, esetleg a kórokozóból izolált elicitor-molekula és a növényből izolált organellumok áthidalják a módszertani nehézségeket, de vajon mennyire tükrözik a növényben lejátszódó eseményeket?

Az AOF kórélettani szerepéről eddig felgyülemlett ismeretanyag többsége, pl. a védekezési folyamatok, bizonyos gének expressziójának, valamint a sejtfal megszilárdításának indukálása, a hiperszenzitív reakcióban betöltött szerepük stb. főleg a fent említett modell-kapcsolatokból származik. Az AOF meghatározására szolgáló mérési módszereket és indikátorokat, valamint előnyeiket és bizonyos hátrányaikat a 23. táblázat foglalja össze (Schroeder et al., 1996).

23. táblázat - Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után módosítva)

Jelzőanyag Alkalmazott módszer

Kimutatott anyag

Kimutatási határ

Módszerek előnyei (+), hátrányai (–)

Keményítő/KI agarlemezek

szövetlenyomat

H2O2 500 µM + lokalizácó

– szükséges a mért anyag

kiválasztódása a növényből

– a háttér elszíneződése a levegő okozta

oxidáció miatt

– nehéz alkalmazhatóság az ún.

„száraz” szövetrészeknél,

mint pl. a levelek

CeCl3 elektronmikrosz-

kópos vizsgálat

H2O2 + sejtszintű és szubcelluláris lokalizáció

– anyag- és eszközigény

(IV)Cl4 növényi kivonattal

végzett kolori-

metriás mérés

H2O2 50 µM + mennyiségi meghatározás

+ növényi pigmentek zavarják a

meghatározást; aktív szénnel vagy

erős anioncserélővel színteleníteni

kell a mérést megelőzően

4-nitro-tetrazó- infiltráció •O2– + lokalizáció



lium-kék (NBT) + •O2–-ra specifikus

Diamino-benzidin

(DAB)

infiltráció

lumineszcencia

H2O2 + lokalizáció

Luminol növényi

kivonatokban

H2O2 l 1 µM + mennyiségi meghatározás

5.1. KJ / keményítő módszerA H2O2 termelődésének megállapítására szolgáló legkönnyebb módszerek közé tartozik. A módszer a jodidionok H2O2 általi oxidációjára épül, a keletkezett jód komplexképződés közben reagál a keményítővel és színes, kékeslila elszíneződést okoz. Ez az egyszerű reakció több módszer alapja. A módszerek előnye, hogy anyag- és műszerigénye kicsi, valamint lehetővé teszik a H2O2 lokalizációját. Hátrányaik: a degradálódási folyamatok, a háttér elszíneződése, amely a jódnak a levegő általi oxidációjából fakad, valamint a kiválasztási folyamatok fizikai akadályai, így a kis víztartalmú szöveteknél, mint pl. a levelek, nehezen alkalmazható, másrészt érzékenysége csak az 500 μM-os érték körül mozog.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (agarlemezes módszer)

A növényi szövet H2O2-tartalmának meghatározása Olson és Varner (1993) módszere alapján történik. A fiatal növények gyökereit vagy a levelekből kivágott korongokat (esetleg burgonyagumó-szeleteket) 1%-os agarózlemezre helyezzük, amely 50 mM KI-ot és 2–5% keményítőt tartalmaz. A mintákat az elszíneződés megjelenéséig (függ a H2O2 mennyiségétől) szobahőmérsékleten tároljuk (102. ábra).

102. ábra - A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után]



A H2O2 meghatározása növényi szövetben (szövetlenyomat-készítéssel)

a. A „H2O2-nyomtató papír” elkészítése nitrocellulózmembrán- (0,2 μm) darabkák áztatásával történik.

b. Az áztató oldatot desztillált vízből 100 g/l oldható keményítő és 0,5 mol/l KI hozzáadásával készítjük. A keményítő oldása forralással történik, a KI-ot csak kihűlés után adjuk az oldathoz.

c. A nitrocellulóz-darabkákat 30 °C-on megszárítjuk, használat előtt sötétben tároljuk, ezzel is megelőzve az esetleges oxidációt. Az áztató oldat tárolhatósága 5 óra, a lenyomatkészítő papíré pedig 2 óra.

d. A szövetlenyomatok készítése szobahőmérsékleten történik (18–20 °C) Cassab és Varner leírása alapján (1989).

e. A H2O2-nyomtató papír darabkáit öt réteg vastagságú kromatográfiás papírra helyezzük.

f. A szövetmetszeteket steril borotvapengével, kézzel metsszük (vastagságuk 0,5–1,0 mm) és azonnal a lenyomatkészítő papírra helyezzük. A műveletet 15 másodpercen belül végezzük, egy papírra 3–6 szövetmetszetet helyezünk.

g. Ezt követően a metszeteket 16-rétegű steril gézzel betakarjuk, és finoman 60 másodpercig ujjal nyomjuk (a leghatásosabb terhelés 200–300 g között van).

h. A szeleteket óvatosan (csipesszel) eltávolítjuk, a lenyomatokat 5–10 perces szárítást követően (103. ábra) sztereomikroszkóppal vizsgáljuk (16-szoros nagyítás). A lenyomatok megjelenése a papírokon 5–10 percet igényel, ez elsősorban a H2O2 mennyiségétől függ. Mivel a lenyomatok idővel erősödnek, összehasonlíthatóságuk érdekében az értékelést azonos időközönként végezzük. A lenyomatok 2 óráig tárolhatók sötétben (bár így is látható kevés háttérelszíneződés).



i. A hozzávetőleges mennyiségi meghatározáshoz kalibrációs sort készítünk. A H2O2-oldat 2,5 μl-es cseppjeit 0–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8 mmol/l-es koncentrációban helyezzük a papírra. Minden értékeléshez friss kalibrációt készítünk (ügyeljünk az azonos időközökre).

j. Az eredményeket mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel rögzítjük.

103. ábra - H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után]

5.2. CeCl3 módszerA CeCl3 elektronsűrű nehézfém, vizes közegben oldott állapotú, a H2O2 cérium-peroxiddá oxidálja. Amíg más módszerek segítségével az AOF jelenlétének meghatározása csak szöveti és sejtszinten lehetséges, addig ezen módszer lehetővé teszi az egyes sejtorganellumokban történő meghatározást. A módszer hátránya, hogy műszer- és költségigényes.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (transzmissziós elektronmikroszkóppal)

A minták előkészítése hagyományos módon történik: fixálás, beágyazás, metszés és festés (Bestwick et al., 1995) alapján. A H2O2 lokalizálására szolgáló módszer a cérium-peroxid keletkezésén alapul.

a. Az inokulált szövetből 1–2 mm2-es darabokat vágunk, ezeket 1 órán keresztül a frissen készített 5 mM-os CeCl3-oldatban (pH-ja 7,2) inkubáljuk.

b. A CeCl3-ot 50 mM-os 3-(-morfolino) propán-szulfonsavban (MOPS) oldjuk.

c. Ezt követően a szöveteket 50 mM-os nátrium-kakodilát- (CAB) pufferben 1 órán keresztül fixáljuk, a puffer 1,25% (v/v) glutár-aldehidet és 1,25% (v/v) p-formaldehidet is tartalmaz (pH-ja 7,2).

d. A fixáció után a szöveteket 2 × 10 percen át mossuk CAB-pufferben, és 45 percen keresztül utófixálást végzünk 1% (v/v) ozmium-tetroxidot tartalmazó CAB-pufferben.

e. A szöveteket újra 2 × 10 percig CAB-pufferben mossuk.

f. Növekvő töménységű etanol-sorozatban dehidratálást végzünk 30, 50, 70, 80, 90% (v/v). A mintákat minden etanololdatban 15 percig tartjuk, majd 3 × 20 percre 100%-os etanolba helyezzük (a dehidratálást esetleg acetonnal is végezhetjük, ebben az esetben aceton–gyanta keverékbe ágyazzuk a mintákat).

g. A további eljárás során a mintákat 2 × 20 percre propilén-oxidba helyezzük, majd folyamatosan beágyazzuk Eponaralditba.



h. A szövet 12 órára tiszta gyantába, majd újabb 4 órára friss gyantába helyezzük.

i. Ezt követően 48 órára a 60 °C-os polimerizáló blokkokba kerül.

j. A mikrotómos metszést gyémántkéssel végezzük (70–90 nm).

k. A metszeteket bevonatlan rézrácsra (Cu-grid, 300 mesh) helyezzük és transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáljuk (75 kV-os gyorsító áram).

5.3. Ti(IV)Cl4 módszerA módszer perhidroxid komplex képződésén alapul. Bár a növény levélszövetének számos pigmentje ugyanazon a hullámhosszon abszorbeál, mint a titániumkomplex, a módszer mégis alkalmazható, de csak aktív szenes derítés, esetleg anioncserélő gyanta alkalmazása mellett. A levelek folyékony nitrogénben való fagyasztása, az 5%-os triklór-ecetsav, az aktív szén alkalmazása és az ammónium-hidroxiddal való semlegesítés megfelelő elszíntelenítést eredményeznek. A módszer hátránya a pigmentek interferenciáján kívül az, hogy bár kvantitatív meghatározásra nyújt lehetőséget, érzékenysége csak 50 μM-os határ körül mozog, ennél ugyanis jóval érzékenyebb módszerek is léteznek.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (spektrofotometriásan)

Az itt részletezett két mérési módszer kolorimetrián alapuló spektrofotometriás mérés. Az A-módszer Patterson et al. (1984), míg a B-módszer Okuda et al. (1991) nevéhez fűződik.

A-módszer

Az első módszer a semlegesített TCA-s kivonáson és a Ti(IV)-PAR komplexképződésen alapul.

a. A leveleket (2 g) folyékony nitrogénben fagyasztjuk, majd 1 ml 5%-os triklór-ecetsavval és 0,7 g aktív szénnel együtt eldörzsöljük.

b. Az extraktumot centrifugáljuk (18 000 g, 10 perc, 0 °C-on) és egyben szűrjük (0,45 μm). Mindaddig ismételjük a szűrést, amíg az összes aktív szenet és kicsapott fehérjét el nem távolítottuk.

c. A szűrlethez a 8,4-es pH eléréséig 7 M-os NH4OH-oldatot adunk.

d. Újabb szűrést végzünk, és az így kapott szűrletet 1 ml-es egyenlő részekre osztjuk, a minták felébe 1 μg katalázt teszünk.

e. Az összes mintát 20 °C-on 10 percig inkubáljuk, majd kolorimetriás reagenst adunk hozzá.

f. A mintákhoz ismert mennyiségben és egyenlő arányban 4-(2-piridilazo)-rezorcinol (PAR) és kálium-titánium-oxalát komplexét adjuk hozzá.

g. Mindkét oldatot 6 × 10–4 töménységben készítjük, és úgy elegyítjük, hogy pH-ja 8-as legyen.

h. A szín 45 °C-on egy óra múlva jelenik meg. A spektrofotometriás méréseket 508 nm-en végezzük.

B-módszer

a. A leveleket (0,2 g) előhűtött (0 °C) dörzsmozsárban 2 ml 0,2 N-os HClO 4-ban 0,1 g kvarchomokkal eldörzsöljük.

b. A mintákat 5 percig 20 000 g-n centrifugáljuk, majd a felülúszót 4 N-os KOH-dal 7,5-ös pH eléréséig lúgosítjuk.

c. Az így kapott oldatot 1 percig 1000 g-n centrifugáljuk.

d. A felülúszó 200 μl-ét 1 ml-es anioncserélő oszlopra (0,8 × 2 cm, AG-1) visszük fel.

e. Az oszlopot 800 μl desztillált vízzel mossuk, és az így nyert oldatot alkalmazzuk a H2O2 meghatározására.

f. A reakcióelegy 1,5 ml végtérfogatában 1 ml felülúszót, 400 μl 12,5 mM-os 3-N,N-dimetil-amino-



benzoesavat (0,375 M-os foszfát-pufferben oldva, pH-ja 6,5), 80 μl 3-metil-2-benzotiazolin-hidrazont és 20 μl peroxidázt (0,25 egység) tartalmaz.

g. A peroxidáz hozzáadása után az abszorbancia változását 25 °C-on, 590 nm-en (két fényutas) spektrofotométerben követjük nyomon.

h. A mért értékeket korrigáljuk 15 percig 20 °C-on inkubált 10 egység kataláz hozzáadásával készült minta abszorbanciájával.

5.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszerAmíg az indikátorok egy része a H2O2-ra specifikus, addig az NBT a •O2

–-ra szelektív. A redukción kívül a sárga NBT lilás-barnás formazánná csapódik ki. A növényi szövetekbe történő bejuttatásának több lehetősége van. A szukkulens szövetekbe felszívással juttatható be, de vákuminfiltrálni is lehetséges. A felszívás során a xilém és a floém azonban jelentős mennyiségű festéket emészt, valamint az ott felhalmozódott csapadék elzárhatja a transpiráció útját. Ez a bejuttatási módszer amellett, hogy anyagigényes, a csapadék feltorlódása miatt sem tökéletes. Ezért a vákuminfiltrálással történő bejuttatás jobban ajánlható. A módszer előnye, hogy sejtszintű lokalizációt tesz lehetővé.

A •O2– meghatározása növényi szövetekben (specifikus indikátor alkalmazásával)

A •O2– szöveti festése tehát az NBT-vel való speciális reakción alapszik (Doke és Ohashi, 1988).

a. 10 mM-os kálium-foszfát-pufferben (pH 7,8) 0,5% (w/v) NBT-t, 10 M NADPH-t és 10 M EDTA-t oldunk. Az oldat fényérzékeny, készítésekor a lombikot fóliával takarjuk, oldás után szűrjük.

b. A növényi részt (pl. levélkorongokat) az oldattal vákuminfiltráljuk.

c. Ezt követően 25 °C-on inkubáljuk, 15 perc múlva a szövet azon részeiben, ahol •O2- termelődés észlelhető,

megjelenik a formazán lilás-barnás elszíneződése.

d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, bár a reakció szabad szemmel is jól látható. Mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel felvételeket készítünk (104. ábra).

104. ábra - Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után]

5.5. Diaminobenzidin (DAB) módszerA H2O2-ra specifikus reakció elsősorban keletkezési helyének meghatározására alkalmas. Bár az irodalomban elsősorban gomba–gazda kapcsolatoknál alkalmazták ezt a módszert (Thordal-Christensen et al., 1997), egyszerű és nem túl műszerigényes volta révén vírus–gazda kapcsolatra is átdolgozható.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (specifikus indikátorral)

a. A levágott inokulált leveleket 8 órán át 3,3’-diaminobezidin-HCl 1 mg/ml-es 3,8-as pH-jú oldatában inkubáljuk (az alacsony pH a DAB oldódásához szükséges). A DAB-oldatot készíthetjük aszkorbinsav (10mM) hozzáadásával is.



b. A H2O2 keletkezésének helyén vörösesbarna elszíneződés jelenik meg. A minták vizsgálata különböző időpontban történik.

c. A reakció megjelenését követően a vizsgált epidermisznyúzatokat fixáljuk, ami történhet 30%-os glicerin és 30%-os tejsav oldatával vagy 96%-os forró etanol-oldatban (10 perc).

d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, majd fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

5.6. Kemilumineszcenciás módszerA módszer H2O2 növényiszövet-kivonatokban történő meghatározására alkalmas. Amellett, hogy specifikus, igen érzékeny. Összehasonlítva a Ti(IV)Cl4-os módszerrel, érzékenysége legalább 50-szeres (l 1 μM). Ugyanazon kísérleti beállítás során a két módszert összehasonlítva ez utóbbival, szignifikáns eltérések mutathatók ki, míg Ti(IV)Cl4-dal nem. A H2O2 mennyisége luminométerrel mérhető és a kibocsátott fény intenzitásával arányos. A növényi kivonat készíthető HClO4-val is (Chen et al., 1993). A lumineszcenciás módszerek (peroxidáz katalizálta lumineszcencia) jól alkalmazhatók sejtszuszpenzióban is, mind az AOF képződésének, mind a H 2O2-elbontó aktivitás meghatározására (Glazener et al., 1991). Az itt részletezett módszer Warm és Laties (1982) munkájából származik.

A H2O2 meghatározása növényi szövetben (luminol segítségével)

a. A H2O2 meghatározásához vett növényi mintákat (egyenként 5 g-ot) folyékony nitrogénben fagyasztjuk.

b. 20 ml 5%-os, 4 °C-os triklór-ecetsavban (TCA) előhűtött dörzsmozsárban homogenáljuk.

c. A növényi kivonatot tartalmazó minták mellett belső standardot és vakmintát is készítünk. A belső standardhoz és a vakmintához 3 μmol H2O2-ot (1–5 μmol H2O2) adunk a homogenálást megelőzően. A vakminta 25 ml 5%-os TCA, amely nem tartalmaz növényi kivonatot.

d. A mintákat 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk.

e. A felülúszók 1 ml-ét, a növényi kivontaban lévő színes vegyületek kiszűrése érdekében, anioncserélő oszlopon engedjük át, mintánként kétszer (0,7 × 4 cm, 100 mg Dowex AG 1-X8).

f. A vak- és standard mintákkal ugyanígy járunk el.

g. Az így kapott kivonatok 50 μl-ének H2O2-tartalmát 50 μl 0,5 mM-os luminol (3-aminoftálsav-hidrazid) segítségével mérjük. A luminolt 0,2 M-os NH4OH-ban oldjuk (pH 9,5).

h. A kemilumineszcenciát 100 μl 0,5 mM-os K3Fe(CN)6 (0,2 M-os NH4OH-ban oldva) injektálásával indukáljuk.

i. Az emittált fotonokat 5 másodpercig pulzusintegrátorral számláljuk.

j. A H2O2-specifikus kemilumineszcencia megállapítására az elszíntelenített növényi kivonat 1 ml-éhez (Tris-HCl-pufferben, pH-ja 7) 500 egység katalázt adunk, ezt 10 percig 30 °C-on inkubáljuk, majd ismételten mérést végzünk. A két mérés különbsége (ΔCL) a H2O2-specifikus kemilumineszcencia.

k. A H2O2 egyéb lebomlásának, esetleg más komponensek interferenciájának kiszűrésére szolgál a belső standard és a vakminta, a levonásuk után kapott kemilumineszcencia, a nettó kemilumineszcencia (net CL) arányos a minta H2O2 mennyiségével, amit kalibrációs görbe segítségével határozunk meg.

5.7. Egyéb mérési módszerekAz aktív oxigénformákat fluoreszcenciás és elektronspínrezonanciás módszerekkel is mérhetjük; ezek igen gyakori mérésformák. A fluoreszcenciás módszerek kitűnően alkalmazhatók sejtkultúrákban az AOF keletkezésének detektálására, elsősorban a H2O2 meghatározására. A H2O2 keletkezése szkopoletin fogyásával határozható meg, spektrofluoriméter (460/350 nm) segítségével (Levine et al., 1994). Fluoreszcenciás módszer alkalmazható a membrán-lipidfázisok változásának meghatározására. A fluoreszcein-diacetát apoláros molekula, amely könnyen áthatol a membránok lipidfázisán, ott elveszíti acetát részét, és poláros fluoreszcein keletkezik, amely már nem tud a membránokon áthatolni. Így a plazmamembránok permeabilitásának változása jól nyomon



követhető a fluoreszcein-diacetát akkumulációjával, a sejtek észterázaktivitásával, valamint a fluoreszcein kiáramlásával (Keppler et al., 1988).

Fluoreszcens mikroszkópia is alkalmazható a sejthalál detektálására, ahol az élő sejteket fluoreszcens festékkel, neutrálvörössel festjük (Koga et al., 1988). Ez utóbbi két módszer az egyéb közvetett mérési lehetőségek közé tartozik.

Az elektonspínrezonancia-spektroszkópia (ESR) paramágneses tulajdonságú anyagok tanulmányozására alkalmas spektroszkópiás módszer. Ilyenek a párosítatlan elektronú atomok, szabad gyökök, néhány molekula, mint pl. NO, O2

– , olyan féminok, amelyek d és f elektronhéja csak részlegesen betöltött stb. A módszer többek között alkalmas paramágneses anyagok koncentrációjának meghatározására, 10–9–10–10 mol/l határokig. Ez az intervallum lehetőséget nyújt az AOF mennyiségének pontos megállapítására. A módszer az AOF-nak izolált membránban és mikroszómafrakcióban történő meghatározására alkalmas.

Egyéb (közvetett) mérési lehetőségek

A fertőzött növényi szövetekben az AOF mérésén kívül számos más mérési lehetőség is van, amely mérések eredményei közvetve utalnak az AOF megnövekedett mennyiségű, a természetestől eltérő jelenlétére. Ide tartoznak az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok meghatározásai. Az enzimaktivitások és a nem enzimatikus antioxidánsok változásának mérésére több módszer is lehetőséget nyújt. Mérhetők spektrofotometriásan, gélelektroforézis segítségével és kemilumineszcenciásan.

Az AOF által okozott és befolyásolt kórélettani folyamatok szintén számos alternatívát nyújtanak. A nekrotikus foltok megjelenésével járó gazda–parazita kapcsolatok esetében egyszerű indikátoros festéssel meghatározhatók az elhalt sejtek, akár az egysejt-nekrózisok is. A nekrózisok során bekövetkező sejthalál egyik jellemző folyamata a sejtmembránok szétesése, amely a membránpotenciál változásával, valamint elektrolit- (ion-) kiáramlással jár. Az ilyenkor lejátszódó lipidperoxidáció az egyik legjellemzőbb folyamat. Mérése mind spektrofotometriásan, mind termolumineszcenciásan elvégezhető.

Enzimaktivitások mérése spektrofotometriás módszerrel

A Halliwell-Asada-ciklus antioxidáns enzimeinek mérése spektrofotometriásan történik.

• Mintavétel

A mintavétel során ügyelni kell arra, hogy a fertőzött növény folyamataira jellemző mintát vegyünk. Az egyes folyamatok erőssége levélszintenként különbözhet, mint ahogy a vírussal való fertőzhetőség is változó levélszintenként. A különböző vírus–gazda kapcsolatok tüneti megnyilvánulása befolyásolja a mintavétel időpontját és helyét. Az enzimaktivitások a lokális nekrotikus és klorotikus tünetek esetében a fertőzési helyekhez közel eső szövetrészekben változnak jelentősebben, így a foltokat közvetlenül körülvevő, még zöld szövetrészekből vegyük a mintát. Az egészséges növény példányai között is lehetnek jelentős eltérések az élettani folyamatokban, ezért a nagyszámú mintavétel ajánlott.

• Nyers enzimkivonatok készítése

a. A levélszövetet, mintánként 0,5 g-ot, 3 ml hideg homogenáló pufferben, előhűtött dörzsmozsárban eldörzsöljük. A homogenáló puffer 0,05 M-os TRIS-HCl-puffer (7,8 pH), amely 7,5% (w/v) polivinil-pirrolidont (vízoldható) és 1 mM EDTA-Na2-t tartalmaz.

b. A homogenizátumot centrifugáljuk (5000 g, 20 perc, 4 °C), és a felülúszót alkalmazzuk az aktivitások méréséhez.

• Aktivitások meghatározása

A spektrofotometriás méréseket ellenőrzött hőmérsékletű küvettaházban, 25 °C-on végezzük (Shimadzu-CPS240A spektrofotométer).

• Aszkorbát-peroxidáz (AP) aktivitásának mérése

Az AP aktivitásának mérése Nakano és Asada (1981) módszere alapján történik.

a. Az aktivitásmérő elegy 2,25 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 5,625



mM-os aszkorbinsav-oldatot, 50 μl nyers növényi enzimkivonatot és 100 μl 11,25 mM-os hidrogén-peroxid-oldatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást kvarc küvettában 290 nm-en 3 percig mérjük.

c. Ezt követően újabb aktivitásmérő elegyet készítünk, amely nem tartalmaz hidrogén-peroxidot, és újabb 3 percig követjük az aszkorbinsav fogyását. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 290 nm-en 2,8 mM–1 cm–1. Az aktivitás kiszámolásánál a két mérés különbségét alkalmazzuk:

• Dehidroaszkorbinsav-reduktáz (DHAR) aktivitásának mérése

A DHAR aktivitásának mérése Asada (1984) módszere alapján történik.

a. Az aktivitásmérő elegy 2,3 ml végtérfogatában 2 ml 0,05 M-os nátrium-foszfát-puffert (a puffer tartalmaz 0,1mM EDTA-Na2-t, pH 6,5), 100 μl 0,5 mM-os dehidroaszkorbinsav-oldatot (a dehidroaszkorbinsavat és a glutationt pufferben oldjuk), 100 μl 1 mM-os redukált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 265 nm-en kvarc küvettában mérjük, majd újabb aktivitásmérő elegyet készítünk növényi enzimkivonat nélkül, és újabb mérést végzünk. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 14 mM–1cm–1. Az aktivitás számításánál a két mérés különbségét alkalmazzuk.

• Glutation-reduktáz (GR) aktivitásának mérése

A GR aktivitásának mérését Halliwell és Foyer (1978) módszere alapján végezzük, figyelembe véve Klapheck et al. (1990) módosításait.

a. Az aktivitásmérő elegy 2,5 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 2,4 mM-os NADPH-t, 300 μl 5 mM-os oxidált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.

b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 340 nm-en mérjük, majd új reakcióelegyet készítünk, melyhez nem adunk glutationt, és ismételjük a mérést. A glutation moláris extinkciós koefficiense 6,2 mM –1cm–1. Az aktivitást itt is a két mérés különbségéből számoljuk.

Elhalt sejtek festése Evans-kék indikátorral



A fertőzött növény leveleiből levélkorongokat vágunk, amelyeket Evans-kék biológiai indikátor 1%-os desztillált vizes oldatával infiltrálunk, és 15 percig inkubáljuk. Az infiltrálást a gazda-parazita kapcsolattól függően különböző időközönként végezzük. Az Evans-kék csak az elhalt sejteket festi meg. A szöveteket fénymikroszkóppal vizsgáljuk, fényképezőgéppel felvételeket készítünk.

Az ionkiáramlás mérése levélkorongokból

A sejthalál jól jellemezhető az ionkiáramlás mérésével. A módszer az oldatok vezetőképességének változásán alapul. A fertőzött növény leveleiből az egyes mérésekhez 5–5 levélkorongot vágunk ( = 9 mm). A∅ levélkorongokat fonákjukkal felfelé, 5 ml desztillált vízben úsztatva, szobahőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk. Ezt követően konduktivitásmérővel mérjük az úsztatóoldat vezetőképességét (Mittler et al., 1996).

A lipidperoxidáció mérése

A lipidperoxidáció mérését spektofotometriásan végezzük Heath és Packer (1968) módszere alapján, figyelembe véve Dhindsa et al. (1981) módosításait. A módszer elve a malondialdehid (MDA) mérésén alapul, amely a lipidperoxidáció során keletkező korai termék.

a. Mintánként 0,5 g levelet folyékony nitrogénben fagyasztunk, majd dörzscsészében elporítunk.

b. Az így előkészített mintákat 2 ml 0,2 M-os citrát-foszfát-pufferben (6,5 pH) – ami tartalmaz 0,5% Triton-X 100 detergenst is – szuszpendáljuk, majd a homogenátumot centrifugáljuk (20 000 g, 15 perc).

c. A felülúszó 1 ml-ét 2 ml, hűtött, 0,5%-os (v/v) 2-tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) triklór-ecetsavval elegyítjük, és 95 °C-os vízfürdőn 45 percig inkubáljuk, végül 15 percig olvadó jégben hűtjük.

d. Centrifugáljuk, s az így kapott felülúszó abszorbanciáját 532 nm-en mérjük.

e. A nem specifikus abszorbanciát 600 nm-en mérjük, és a kapott adatot kivonjuk az előző mérésből. Az így kapott adatot használjuk az MDA extinkciójának számításánál. Az MDA moláris extinkciós koefficiense 155 mM–1cm–1.


18. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszereiA nemesítés évezredes tudatos emberi tevékenység, amelynek során valamely kedvező tulajdonságot homogén populációkban alakítanak ki. Erre a tradicionális nemesítésben két lehetőség van: (1) keresztezés, amely a mendeli öröklődés ismeretében a megfelelő szülőpárok kiválasztásán alapuló szexuális hibridizálás és (2) kiválogatás, amely megadott szempontok szerinti elkülönítést jelent. A nemesítés fő célja a piacképes, jó minőségű, kórokozókkal és kártevőkkel szemben ellenálló, jó termőképességű fajták előállítása. A növényi kórokozók terméscsökkentő és minőségrontó hatásának felismerésével a betegség-ellenállóság kialakítása egyre fokozottabb elvárás lett. A vírusbetegségek elleni kémiai védekezés eredménytelensége miatt a vírus-ellenállóságra nemesítés különösen nagy jelentőségű (Kappert és Rudorf, 1958; Wiersema, 1972; Horváth, 1983, 1984, 1988; Spaar és Kleinhempel, 1985; Burton, 1989; Ross, 1986; Huisman et al., 1992; Foxe, 1992; Kegler és Friedt, 1993; Kyle, 1993; Bradshaw and MacKay, 1994).

1. A rezisztenciára nemesítés fő irányaiA rezisztencia formáit a növényben meglévő természetes ellenálló képesség szerint csoportosíthatjuk aszerint, hogy a rezisztencia a kórokozó megtelepedése vagy a betegség kialakulása ellen hat (Gáborjányi és Tóbiás, 1984). Az így kialakított ellenálló képesség lehet nem specifikus (horizontális), ami egy adott kórokozó minden törzse ellen védettséget ad, és lehet törzsspecifikus (vertikális), ahol az ellenálló képesség a kórokozó egy-egy törzsével szemben eredményes. A genetikailag ellenőrzött vírusrezisztencia két csoportba osztható: 1. a monogének vagy poligének által szabályozott kvalitatív lokalizált rezisztencia, és 2. a többnyire poligének által szabályozott kvantitatív, nem lokalizálódó rezisztencia (Fraser, 1986; Spaar et al., 1992).

1.1.1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Fertőzéssel szembeni ellenálló képesség

A fertőzéssel szembeni ellenállóság kialakításának célja a kórokozó távol tartása az egyébként fogékony növénytől. A növény fertőzés előtti tulajdonságán (axenia) alapul: vastag kutikula, szőrözöttség stb. (ezek meggátolják a fertőzést és a vektorok tevékenységét). Ez a képesség ugyan nem nyújt tartós védelmet, de gyakran az ún. „szabadföldi ellenállóságot” eredményezi. Többnyire vad fajokkal való keresztezés útján alakítható ki. Jelentősége alárendelt.

1.1.1.1.2. Túlérzékenységre (hiperszenzitivitásra) irányuló nemesítés

Mint ismert, a növények egy része a fertőzéssel szemben túlérzékeny, azaz hiperszenzitív. A fertőzést követő túlérzékenységi reakció (HR) nyomán gyors lokális nekrózis fejlődik ki, ami az esetek nagyobb részében a biotróf kórokozó lokalizálását is eredményezi. A HR-t a fertőzött levelek szeneszcenciája követheti, és a leválasztó szövetréteggel rendelkező növényfajoknál a levelek lehullanak (amputációs rezisztencia). Mindez azt jelenti, hogy a HR-rel rendelkező növények nem fertőzött részei egészségesek maradnak (sőt, bizonyos mértékben egy újabb fertőzés elleni indukált szisztemikus rezisztenciára tesznek szert). A hiperszenzitivitásra irányuló nemesítés igen elterjedt, általában egy gén által szabályozott. Eredményessége nagyrészt a környezeti tényezőktől befolyásolt, és új, a rezisztenciát áttörő patotípusok, vírustörzsek kialakulását eredményezi. Ismert a szisztemikus nekrózisképzés is (Foxe, 1992). Ebben az esetben a fertőzött növény elpusztul.

1.1.1.1.3. A betegséggel szembeni ellenálló képesség kialakítása

Szintén örökletes tulajdonságon alapul. Kialakítása szempontjából a vírus replikációja és növényen belüli elterjedése, azaz transzlokációja a döntő tényező, ezekre összpontosul a nemesítés fő iránya. Célja a teljes és tartós ellenálló képesség (extrém rezisztencia vagy immunitás) kialakítása minden ismert törzs fertőzésével szemben. Az öröklődés általában egy (vagy kevés) gén jelenlétén alapul.


A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei

1.1.1.1.4. Toleranciára nemesítés

A legtöbbször, kultúrnövényekhez közel álló vad fajokból származó rezisztenciát biztosító gének hiányában, meg kell elégedni a toleranciával. A toleráns fajok ugyanarra a fertőzésre gyengébb tünetekkel vagy kisebb termésveszteséggel válaszolnak, tehát hasznos tulajdonságok hordozói. Ugyanakkor a kórokozó a toleráns növényben is replikálódik, ezért másodlagos fertőzési forrást jelent.

2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokbanJelenlegi ismereteink szerint 101 vírusrezisztencia-gén ismert a potyvirusokkal és 24 gén a cucumovirusokkal szemben. A legtöbb ismert gén a Solanum fajokban (25) és a Nicotiana fajokban (22) található (Kegler és Spaar, 1993).

A dohány N-gén működése és a hiperszenzitivitás

A vírusfertőzéssel kapcsolatos hiperszenzitivitás felfedezése Holmes (1929) nevéhez fűződik. Amikor az enyves dohányt (Nicotiana glutinosa) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges (U1) törzsével fertőzte, akkor az inokulált leveleken lokális léziók képződését (HR) figyelte meg. A helyi nekrózisok a fertőzést teljesen lokalizálták, a rezisztencia minőségi jellegű, azaz teljes volt. A N. glutinosa és a kultúr dohányfajták (N. tabacum) keresztezésével olyan hibrideket állított elő, amelyek szintén hiperszenzitivitáson alapuló rezisztenciát mutattak a vírus fertőzésével szemben. A hiperszenzitív rezisztenciát biztosító „nekrotikus” N-gén dominánsan öröklődik. Az N-gén hőmérsékletfüggő, 32 °C felett nem működik, és a korábban lokalizált fertőzés szisztemikussá válik. A hiperszenzitív rezisztenciagén nemcsak dohány–dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) kapcsolatban hőmérsékletfüggő, hanem ismert az is, hogy pl. 32 °C felett a Gomphrena globosa vagy a Capsicum chinense (PI 152225) hiperszenzitív reakciója (nekrotikus lokális léziók) a paradicsom bokros törpülés vírussal (tomato bushy stunt tombusvirus), ill. a paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus) szemben szisztemikussá válik, tehát a magas hőmérséklet képes a hiperszenzitív rezisztencia áttörésére (Redolfi et al., 1977; Roggero et al., 1996). Az N-gén rezisztenciáját a virulensebb tobamovirusok (pl. paprikáról izolált Ob törzs) áttörik (Csilléry et al., 1983). A legtöbb információval az N-gén működésével kapcsolatosan rendelkezünk. Számos dohányfaj és vad Nicotiana faj (közöttük legjelentősebb a N. sylvestris, N. suaveolens) tartalmazza az N’-gént (105A ábra). Két dohány mozaik vírus törzsből készített hibrid nukleinsavak fertőzésével izolálni lehetett a vírus azon nukleotid szekvenciáit, amelyek a nekrózis kialakulását szabályozzák, és a dohány genomjában is sikerült már azonosítani HR-felelős géneket.

105. ábra - Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött, jobbról egészséges, kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív rezisztenciája a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben. Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum annuum cv. Bogyiszlói szisztemikus tünetei (D)



Az N-gén eredményessége a sejtfaltól függ. Az N-gént tartalmazó dohányok protoplasztjai ugyanúgy fertőzhetők vírussal, mint a fogékony fajták protoplasztjai, bennük a vírusreplikáció azonos mértékű, bár a rezisztens növény protoplaszt-kultúrszűrletéből vírusreplikációt gátló anyagot (IVR) izoláltak (Loebenstein és Gera, 1981). Ma már számos vírusrezisztencia-hordozó dohányfajta, ill. -törzs ismert (24. táblázat).

24. táblázat - Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája

Rezisztenciahordozó növények

Vírusok1

TMV PVY CMV TSWV TEV TNV TVM

V

CV + +

Zlatolist + + +

Bulgáriai törzs + +

Kentucky-hibrid (71698) + +

Ky 15 + +



T1 245 + + +

Trapezond + +

TI1 406 + +

1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TSWV, tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos vírus); TNV, tobacco necrosis necrovirus (dohány nekrózis vírus); TVMV, tobacco vein mottling potyvirus (dohány érfoltosság vírus).

A paradicsom Tm-gén és a kvantitatív rezisztencia

A paradicsom mintegy negyven vírussal szemben fogékony. A paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) tüneteit paradicsomon a Tm-gének szabályozzák. A Tm-O típusú izolátumokkal szemben a Tm-1 gén nyújt bizonyos fokú ellenálló képességet. A rezisztencia nem a fertőzés blokkolásán (HR), hanem a replikáció visszaszorításán és ezáltal a szisztemikus tünetek kifejlődésének gátlásán alapul. Ilyen szempontból tehát toleranciagén, mennyiségi jellegű. Ilyen esetben a kórokozó – csökkent mértékben – a rezisztens fajtákban is szaporodhat. A Tm-1 gén az O típusú izolátumok replikációját homozigóta fajtákban 95%-ban gátolta, míg a heterozigótáknál ez az érték csak 70% volt (Fraser és Loughlin, 1980, 1982). Ez a körülmény kedvez az új vírustörzsek kialakulásának, annál is inkább, mert a magas hőmérséklet a rezisztenciát megszünteti.

Magasabb fokú, extrém rezisztenciát adnak a Lycopersicon peruvianum növényből származó Tm-2 és a Tm-22

gének. A rezisztens növények normális hőmérsékleten tünetmentesek, vagy alig látható nekrózissal reagálnak a fertőzésre. Jelenlegi ismereteink szerint hatvan olyan paradicsomfajta, ill. hibrid ismert, amely tartalmazza a Tm-1 és Tm-22 rezisztenciagéneket. A Tm-22 gént eddig még egyetlen vírustörzs sem volt képes áttörni. Vírusokkal szemben az alábbi rezisztenciahordozók ismertek (25. táblázat).

25. táblázat - A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után módosítva)

Vírusok1 Lycopersicon spp. rezisztenciahordozók

CMV2 L. cheesmanni, L. hirsutum, L. penelli

TMV Craigella-vonalak

TMV + CMV L. esculentum, L. peruvianum

PVY L. esculentum cv. Angela, L. pimpinellifolium, L. peruvianum var. dentatum,

L. peruvianum var. humifusum

TMV L. peruvianum

PVX Lycopersicon-vonalak

PVY P.I. 13782-46-I-I-m, L. chilense

TSWV3 L. pimpinellifolium, L. peruvianum, L. esculentum cvs Rey de los Tempranos,

Pearl Harbour, Manzana

1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka



mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); PVX, potato X potexvirus (burgonya X-vírus); TSWV, tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus).

2 A CMV [cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus)] rezisztenciahordozóinak meddőségi problémái miatt a rezisztencia öröklődése biztonságosan nehezen tanulmányozható.

3 A TSWV [tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus)] L. peruvianum növény esetében módosító gének jelenlétében fő domináns génnel öröklődik (Watterson, 1993).

A paprika inkomplett rezisztenciáját biztosító L1-gének

A paprikát fertőző vírusok száma 40 felett van, és eddig több mint 20 vírus spontán előfordulását állapították meg (Horváth, 1986a). A paprika vírusokkal szembeni affinitására jellemző, hogy a virológiai irodalomban a 8 új Capsicum faj számos vírusra fogékony (Horváth, 1986b) (105D ábra). A paprikapatogén vírusok közül az egyik legveszélyesebb vírus a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus). A dohány mozaik vírus ellenállóságát a Li-gének (inkomplett) szabályozzák (Lippert et al., 1965). Ezek a gének a vírusfertőzést elvileg hiperszenzitív reakcióval lokalizálják, de ez nem nyújt teljes körű védelmet minden tobamovirus fertőzés ellen. A vírus U1 törzsével szemben a L1 rezisztenciagént hordozó fajták (L1/L1) lokális rezisztenciát nyújtanak, amit más tobamovirusok [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus), paprika enyhe foltosság vírus (paprika mild mottle tobamovirus)] áttörnek. A Capsicum frutescens növényből származó L2 gén a paradicsom mozaik vírussal szemben nyújt ellenálló képességet, míg a teljesebb védelmet a Capsicum chinense L3 génje jelenti (Csilléry et al., 1983; Gáborjányi és Tóbiás, 1984; Moór és Zatykó, 1995; Zatykó és Moór, 1995). A Capsicum chacoense L4 rezisztenciagén átvitele paprikafajtákba is eredményesnek ígérkezik. Már van olyan paprikafajta (Himes), amely a legnagyobb rezisztenciával tűnik ki (Csilléry, 1995; Sági és Salamon, 1998). A 26. táblázat a Capsicum genotípusok és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolatot mutatja be.

26. táblázat - A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolat (Boukema, 1984 után)

Capsicum fajták és származékok

Rezisztencia genotípus

Tobamovirus patotípusok1

P0 P1 P1, 2 P1, 2, 3

C. annuum cv. Early Calwonder L+ L+ + + + +

C. annuum cv. Bruinsma Wonder L1 L1 – + + +

C. frutescens cv. Tabasco L2 L2 – – + +

C. chinense PI 159236 L3 L3 – – – +

C. chacoense PI 260429, SA 185 L4 L4 – – – –

1 + = Fogékony (szisztemikus mozaik), – = lokális léziók (nem szisztemikus), rezisztens.

Újabb kutatások során megállapítást nyert, hogy a Capsicum annuum (C. annuum cvs Avelar, Criollos de Morelos, Jupiter, RNaky), C. annuum var. minimum, C. annuum var. piramidale, a Capsicum chinense (PI 152225, PI 159234, PI 159236), a C. frutescens (BG2814-6) fajtákban, ill. fajokban és származékaiban rezisztenciát állapítottak meg néhány potyvirussal, a paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus), az uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) és a dohány nekrózis vírussal (tobacco necrosis necrovirus) szemben (Horváth, 1986c; Valkonen et al., 1996; Grube et al., 1998). Hiperszenzitív rezisztenciát állapítottak meg néhány fajban: Capsicum annuum var. longum [uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], C. barbatum var. pendulum [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)], C. praetermissum [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus)], C. pubescens [uborka mozaik vírus, burgonya Y-vírus, paradicsom mozaik vírus, dohány mozaik



vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] (Horváth, 1986c).

Figyelemre méltó a Capsicum annuum növényekben kimutatott komplex vírusrezisztencia (27. táblázat).

27. táblázat - A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után)

Vírusok1 Rezisztenciahordozók

CMV + TMV C. annuum – K 2002 törzsek 97, 157, 187

PVY + TEV C. annuum – P 11, S.C. 46252, C. chinense

PVY + TMV Agronomico 9, 10, 11, 12

CMV + TMV + PVY C. annuum – Yolo Y, Agronomico 8, Quadrato d’ Asti,

Corno di Bue

PVY + TMV + TEV C. annuum – Florida VR-2, S.C. 46252,

C. frutescens – Tabasco

PVY + TEV + PepMoV C. annuum – Avelar 234, Delray Bell

TRSV + PVBV + PVMV C. annuum – DH 2-4, DH II-5

PVY + TEV + TMV + PepMoV

C. annuum – Tam mild Jalapeno I

PVY + PVBV + PepMoV + TRSV

C. annuum – Byadgi × Puri Orange

1 CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TMV tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos vírus); PepMoV, pepper mottle potyvirus (paprika foltosság vírus); TRSV, tobacco ringspot nepovirus (dohány gyűrűsfoltosság vírus), PVBV, pepper vein banding virus (paprika érszalagosodás vírus); PVMV, pepper veinal mottle potyvirus (paprika érfoltosság vírus).

A Capsicum annuum cv. CM 334 (mexikói paprika vonal) növény genetikai szegregációs analízise során megállapították, hogy a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a paprika foltosság vírussal (pepper mottle potyvirus) szembeni rezisztenciájáért két gén felelős. A pr4 gén a domináns, és mindkét vírus eddig ismert patotípusaival szemben aktív. A pr5 gén recesszív, és csak a burgonya Y-vírussal szemben érvényes (Dogimont et al., 1996). Legújabban uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) szembeni rezisztenciát mutattak ki a Capsicum annuum cv. French Perennial és a C. frutescens BG 2814-6 fajtában (Grube et al., 1996, 1998).

Az ellenőrzés módszere

• Paprikafajták tobamovirus-ellenállóságának vizsgálata mechanikai inokulációval

a. Kifejlett szikleveles paprikanövények szikleveleit mechanikai módszerrel különböző patotípusú tobamovirusokkal (28. táblázat) inokuláljuk. Az inokulumforrás leveleit 1:5 arányban (g/cm3), 0,1 M Sörensen-féle foszfát-pufferrel (pH 7,0) hígítjuk, a leveleket celittel vagy karborundumporral finoman beszórjuk. A levelek inokulációját üvegspatulával végezzük. Az inokulációt követő két hétig a növényeket ellenőrzött hőmérsékleten (25 °C), termosztátszobában tartjuk (Anonymous, 1994).



28. táblázat - Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága

Fajták

Vírusok1

Rezisztencia jellege

TMV-U1

P0

ToMV-Ob P1, 2

PMMV-SL P1, 2, 3

Tünetek2

Fecske –/SMo –/SMo –/SMo L+

Keszthelyi rezisztens

NLL/– –/SMo –/SMo L1

Greygo NLL/– –/SMo –/SMo L2

Novares NLL/– NLL/– –/SMo L3

Himes NLL/– NLL/– NLL/– L4

1 TMV-U1, dohány mozaik vírus U1 törzse (U1 strain of tobacco mosaic tobamovirus); ToMV-Ob, paradicsom mozaik vírus Ob törzse (Ob strain of tomato mosaic tobamovirus); PMMV-SL, paprika enyhe foltosság vírus SL törzse (SL strain of pepper mild mottle tobamovirus).

2 A tünetek rövidítései és magyarázata A biotesztek virológiai alkalmazása c. fejezetben található

b. A fertőzött növényeket rovarmentes üvegházban neveljük legalább két hétig. A lokális tüneteket az első héten naponta, majd a szisztemikus tüneteket hetenként egyszer értékeljük.

Megjegyzés: A legalacsonyabb, P0 patotípusú dohány mozaik vírus U1 törzs (tobacco mosaic tobamovirus U1 strain = TMV-U1) (Siegel és Wildman, 1954) fertőzésére fogékony (L+ genotípusú) Fecske fajta inokulált levelein nincsenek tünetek, de a fertőzést követő két hét múlva szisztemikus mozaikfoltosság alakul ki a csúcsi leveleken. Ez a fajta minden paprikapatogén tobamovirus fertőzésére fogékony. A Rezisztens Keszthelyi fajta már a P0 patotípusú TMV-U1 törzs fertőzésével szemben rezisztens, az inokulált leveleken a lokális nekrózisok gátat szabnak a kórokozó szisztemizálódásának, ugyanakkor fogékony a magasabb patogenitású vírustörzsekkel (P1, P1, 2, P1, 2, 3) szemben (L1 rezisztenciatípus). A Greygo fajta már magasabb rezisztenciaszintet mutat (L 2), de rezisztenciáját elveszti egy magasabb patogenitású törzs (P1) fertőzésével szemben. A Novares már az L3

rezisztenciagént is hordozza, tehát reziszens a P1, 2 patotípusú paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) Ob törzs (Csilléri et al., 1983) fertőzésére, de fogékony a P1, 2, 3 patotípusú paprika enyhe foltosság vírus (paprika mild mottle tobamovirus) SL-törzs (McKinney, 1952; Wetter et al., 1984) fertőzésével szemben. Az L4 gén védettséget ad az eddig ismert valamennyi patotípus fertőzésére. Eltérő patogenitású törzsek inokulációjával elvileg minden paprikafajta tobamovirus-rezisztenciaszintje megállapítható.

2.1.2.1.1.

2.1.1.1.

2.1.1.1.1. A burgonya rezisztenciagénjeinek szerepe a vírusellenállóságban

A burgonya biológiai leromlása – amelyet a kedvezőtlen környezeti feltételek is elősegítenek – az egyre inkább fokozódó vírusfertőzésekre vezethető vissza. A leromlásban mintegy 30 vírus vesz részt, de ismert, hogy a burgonyát mintegy 266 kórokozó és kártevő károsítja (Mendoza, 1986). A fontosabb vírusok a következők: burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus). E kórokozókkal szemben



a különböző vad Solanum fajok eltérő magatartást mutatnak. Jelenlegi ismereteink szerint ma már több mint 150 vad gumós Solanum faj ismert, és mintegy 5 ezerre becsülhető a primitív burgonyaklónok száma (Huaman, 1986; Ochoa, 1990). Igen jelentős azoknak a fajoknak a szerepe, amelyek vírusrezisztencia-tulajdonságaiknál fogva az európai burgonyafajtákban mint keresztezési partnerek vesznek részt. A Solanum demissum 335, a S. tuberosum ssp. andigena 298, a S. stoloniferum és a S. vernei 41–41, a S. acaule 39, a S. phureja 27, a S. spegazzini 11, a S. chacoense 10 fajtában található meg (Hermsen, 1989). A legfontosabb genetikai anyagok (vad Solanum fajok) rezisztenciatulajdonságát a 29. táblázatban foglaltuk össze.

29. táblázat - A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988 után) 1, 2, 3

Solanum fajok/fajtákFertőzéssel szembeni

rezisztencia

Túlérzékenységi

rezisztencia

(HR-rezi sztencia)

Immunitás

Solanum acaule PLRV PVX, PVY PVX

S. cardiophyllum PVM

S. demíssum PLRV, PVY PVA, PVX, PVY

S. megístacrolobum, EBS 1787 PVM, PVS

S. microdontum PVM, PVS

S. phureja PVY

S. stoloniferum PVY, PVA PVY, PVA

S. tuberosum ssp. andigena PVS PVX, PVY

S. tuberosum ssp. tuberosum PVX

S. vernéi PVY PVY, PVA

S. tuberosum cv. Arran Pilot TRV

1 PLRV, potato \safro\\polerovirus (burgonya levélsodródás vírus); PVA, potato Apotyvirus (burgonya

A-vírus); PVM, potato M carlavirus (burgonya M-vírus); PVS, potato S carlavirus (burgonya S-vírus); PVX, potato X potexvirus (burgonya X-vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus);TRV, tobacco rattle tobravirus (dohány rattle vírus).

2 A Solanum phureja rezisztens a Pseudomonas solanacearum baktériummal szemben is.

3 Barker (1996) újabban a Solanum stoloniferum vad fajból származó dr. Macintosh és Maris Piper burgonyafajtákban - amelyek immunitást (Ry-gén) mutattak a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) törzseivel (PVY°, PVYN, PVYNTN) szemben - egy korábban nem ismert Ra-gént is kimutatott; ez a gén a burgonya A-vírus



(potato Apotyvirus) rezisztenciájáért felelős.

A burgonya vírusrezisztenciáját szabályozó fő géneket a 30. táblázat tartalmazza.

30. táblázat - Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után)

Vírus1 A rezisztencia típusa Gén

PLRV intolerancia NI

PVY lokális hiperszenzitivitás extrém rezisztencia

Ny

Rysto

Ryadg

PVX lokális hiperszenzitivitás extrém rezisztencia

Nx,

Nb

Rx

PVS lokális hiperszenzitivitás Ns

PVM lokális hiperszenzitivitás extrém rezisztencia

Na

Rysto

TRV intolerancia Nt

1 PLRV, burgonya levélsodródás vírus (potato \eafro\\polerovirus); PVY, burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus); PVX, burgonya X-vírus (potato X potexvirus); PVS, burgonya S-vírus (potato S carlavirus); PVM, burgonya M-vírus (potato M carlavirus); TRV, dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus).

• A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni ellenálló képesség kialakítása

A vírusnak négy törzstípusa ismert: PVYN = PVYO, PVYR = PVYN, PVYC = PVYC és PVYAn = PVYAn (Horváth, 1966a,b, 1967a,b). A leggyakoribb a közönséges PVYO vagy normál törzs, amely mozaikfoltossággal, a levelek elszáradásával vagy lehullásával jellemezhető. A nekrotikus PVYN törzs fertőzése ugyan enyhébb tünetekkel jár, de dohányon érnekrózist okoz. A vírus legújabb törzse (PVYNTN) pedig a burgonyán gumónekrózist vált ki (Beczner et al., 1984). A PVYC törzs levéltetű-átviteli képességét elveszítette. Ez utóbbi fertőzését az Nc gén jelenlétében a hiperszenzitív reakció legyőzi. A rezisztenciára nemesítés iránya egyrészt az N és az R fő gének bevitelén, másrészt a Solanum chacoense, S. demissum, S. microdontum, S. stoloniferum vad burgonyafajok hibridizálásán alapul. Az Ny gén expressziója változó, és a domináló vírustörzstől függő, míg az Ry gén stabil és nem vírustörzs-specifikus. Az extrém rezisztenciát adó gént a Solanum stoloniferum és a S. tuberosum spp. andigena vadburgonyában találták meg. A rezisztenciát egyetlen domináns gén biztosítja az összes törzs fertőzésével szemben. Ma már a legtöbb burgonyafajtában jelen van az Ry gén, amely egyéb vírusellenálló képességgel kombinálódik (Horváth és Wolf, 1991; Barker, 1996). A kvantitatív, nem lokalizálódó és extrém rezisztenciáért (immunitás), valamint a HR-reakcióért, ill. a kvalitatív lokalizált rezisztenciáért felelős gének a Solanum alandiae (BGRC 27326), Solanum stoloniferum (Ryston2, Rystorna, Rystona) növényben találhatók meg a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben (106A ábra). A burgonya Y-vírussal szemben további rezisztenciagének vannak a Solanum andigenum (Ryadg), S. chacoense (Nychc), S. hougashi (Ryhou), S. pinnatisectum, S. polytrichon, S. simplicifolium, S. vernei, S. tuberosum (N tbr) növényekben.

106. ábra - A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív reakció (az inokulált leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237) vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a



burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben

• A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) rezisztenciára nemesítés eredményei

A vírusrezisztenciát nyújtó fő gének a következők: Nb, Nx, Rx, Rxacl és Rxadg. A vírustörzsek csoportosítása annak megfelelően történik, hogy mely rezisztenciagéneket képesek áttörni (31. táblázat).

31. táblázat - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe, 1992 után)

GénTörzstípus1

1 2 3 4

nxnb + + + +

Nxnb – + – +

nxNb – – – +

NxNb – – – +

Rx – – - –

1 + = Fogékony; – = Rezisztens.

A leggyakoribbak a 3. csoportba tartozó törzsek, a legritkábbak a 4. típusúak. Az Rx gén minden vírustörzs ellen hatásos, kivéve a HB bolíviai törzset. Ezeket a géneket már több fajtába sikeresen beépítették. A vírustörzscsoportok eltérő földrajzi elhelyezkedésének nagy jelentősége van (Valkonen et al., 1994).

• A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni ellenállóság kialakítása

Némely fajta esetében a vírusrezisztenciát adó NI fő gén jelenlétében (amit kisebb gének módosíthatnak) a növények szisztemikus hiperszenzitivitás miatt elpusztulnak. Emiatt a nemesítési programok jó részében ez a fő gén nem szerepel. A betegség-ellenállóság kialakítása poligénikus úton történik, amelynek kifejeződése mennyiségi jellegű, nehezen, csak évekig tartó, magas infekciós nyomásnak kitett szabadföldi kísérletekkel ellenőrizhető. Az ellenálló képesség kialakítása részben a fertőzés elleni védelemre, részben a vírusszintézis csökkentésére, részben a transzlokáció megakadályozására irányul. A vírusszintézis gátlásáról több diploid burgonyafaj (Solanum etuberosum és S. brevidens) esetén beszámoltak. Ez utóbbi fajokat a biotechnológiai védekezés során fel is használták protoplasztfúziókra, tekintettel arra, hogy szexuális úton nem keresztezhetők a kultúr burgonyafajtákkal. Ezek a fajok burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus) és burgonya X-vírus (potato X potexvirus) ellenállósággal is rendelkeznek (Fehér et al., 1990; Valkonen et al., 1991, 1992; Horváth et al., 1993b, 1996).

• Egyéb burgonyapatogén vírusok



A burgonya A-vírus (potato A potyvirus), a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) és a burgonya S-vírus (potato S carlavirus) gazdaságilag kevésbé jelentősek, ennek ellenére a nemesítési programokban szerepel a rezisztencia kialakítása. Ismert, hogy a burgonya A-vírussal szemben hiperszenzitív az Na gén, míg az Ry gén extrém ellenálló képességet nyújt (Barker, 1996). A burgonya M-vírus fertőzését a Gm domináns gén szabályozza, amelynek működését kisebb gének kontrollálják. A burgonya S-vírus ellen az Ns gén nyújt védelmet. A dohány rattle vírus (syn.: burgonya szártarkulás vírus; tobacco rattle tobravirus) elleni védelmet egyetlen fő gén (Nt) adja (Foxe, 1992; Swiezynski, 1994).

3. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszereiA burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni extrém rezisztencia

• A szülőpartnerek kiválasztása és vizsgálata

A nemesítési cél meghatározását követően ki kell választani azokat a keresztezési partnereket, amelyekkel a kitűzött cél várhatóan a leghatékonyabban és a leggyorsabban érhető el (Horváth, 1968; Ross, 1986; Foxe, 1992). Rendszerint meglévő fajtába vagy értékes nemesítési vonalba próbálják bevinni a kiválasztott rezisztenciagént. A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szemben extrém rezisztenciát nyújtó, dominánsan öröklődő Ry gént Solanum stoloniferum (Rysto) és S. tuberosum ssp. andigenum (Ryadg) növényekben azonosították. Az Rysto extrém rezisztenciát ad a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben is, míg az Ryadg nem. A S. stoloniferum növénnyel történő keresztezés eredményeként citoplazmatikus hímsterilitás (CMS) lép fel az utódokban, ami a S. tuberosum sejtmagi és a S. stoloniferum citoplazmai genetikai állománya összeférhetetlenségének a következménye. Ennek eredményeként az extrém rezisztenciát hordozó utódok csak anyaként használhatók fel, ami a visszakeresztezési programok hatékonyságát csökkenti. A vad, illetve primitív fajokkal történő keresztezés esetén számítani kell arra, hogy a felhasznált genotípusok kedvezőtlen tulajdonságai (egyes morfológiai bélyegek, a kívánatosnál több gumókötés, sérülésérzékenység, rossz íz, magas alkaloidtartalom stb.) megjelenhetnek az utódokban, ezért ha mód van rá, kultúr genotípusokat kell használni. Ma már számos, kiváló kultúrtulajdonsággal rendelkező burgonyafajta tartalmazza az Ry gént. A nemesítési programot a CMS figyelembevételével célszerű megtervezni. Meg kell azonban jegyezni, hogy a fajtaszabadalom bevezetése óta a szabadalmaztatott fajták genetikai állományának felhasználásához a nemesítő, illetve fajtatulajdonos hozzájárulása szükséges. Amennyiben valamilyen fontos ok miatt a nemesítési programban vad fajokat használunk fel, azok különböző nemzetközi génbankokban hozzáférhetők (Horváth, 1988). Itt azonban figyelembe kell venni, hogy a vad Solanum fajok különböző származékainak rezisztenciája eltérő lehet, ezért pontosan azonosítható vonalakat kell használni, vagy a nemesítő csoport virológusának kell megvizsgálnia a rezisztenciaszintet (Horváth és Hoekstra, 1989; Bősze et al., 1996). A nemesítési alapanyag külföldről, különösen más kontinensről történő beszerzése komoly veszélyeket rejt magában (Howell, 1981; Horváth et al., 1993a). Éppen a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) dohány érnekrózis törzsének (PVYN) nemesítési alapanyaggal Dél-Amerikából Európába kerülése igazolja ezt a veszélyt. Ezért alapvető követelmény, hogy a beérkezett genotípusok kórokozó-mentességét karantén körülmények között – e könyv más fejezeteiben ismertetett – in vitro és in vivo módszerekkel igazoljuk. Mielőtt egy kiterjedt nemesítési programban szülőpartnerként felhasználnánk valamely fajt vagy fajtát, célszerű vele megfelelő számú tesztkeresztezést végezni, a kombinálni kívánt tulajdonságok öröklődése, valamint a fertilitási viszonyok megállapítása céljából. Az apai vonalak pollenjének fertilitása kárminecetsavas festéssel egyszerűen megállapítható.

• Kárminecetsavas festés

a. 5 g kármint horzsakő jelenlétében, 100 ml 45%-os ecetsavban 30 percig forralunk.

b. A festékoldatot kihűlés után leszűrjük.

c. A vizsgálandó pollenből vett mintát (min. 200 pollen) tárgylemezre helyezzük, és 2 perces kárminecetsavas festést követően megvizsgáljuk a megfestődött pollenszemek arányát.

d. Ha a mintában 10%-nál kevesebb pollen festődik meg, akkor a vizsgált fajt (fajtát) apai szülőpartnerként alkalmatlannak kell tekinteni.

Megjegyzés: A módszer gyors és egyszerű, megbízhatósága azonban nem minden esetben kielégítő.

• Fluoreszcein-diacetátos (FDA) festés



a. 0,5 ml szacharózoldathoz 1 ml acetonban feloldott 2 mg FDA-t kell adni.

b. A pollenmintát 30 percig inkubálni kell az oldatban, majd vízzel kimosni.

c. Az enzim hatására keletkezett fluoreszcinmennyiséget UV-lámpa alatt lehet vizsgálni.

Megjegyzés: Ez a módszer a legbiztonságosabb.

A partner-előállító (genetikai) vagy a közvetlen fajta-előállító program céljainak megfelelő szülőpartnerek kiválasztása során figyelembe kell venni, hogy a keresztezés során előállított magoncokat és azok utódait mintegy 50 tulajdonságra kell vizsgálni. Ehhez megfelelő számú magonc előállítása és megfelelő számú keresztezési kombináció alkalmazása szükséges. A jelenleg elfogadott álláspont szerint a keresztezési kombinációk számának növelése hatékonyabb megoldás, mint egy keresztezési kombináción belül a magoncok számának növelése. Az egy nemesítési program (nemesítő intézet) számára évenként javasolt keresztezési kombinációk száma 150–300, az egy kombinációban előállított magoncok száma pedig 400–500.

3.1.3.1.1.

3.1.1.1.

3.1.1.1.1. Keresztezési technikák

A nemesítési tervnek megfelelő számú magonc előállításához mindenekelőtt a szülőpárok felneveléséről kell gondoskodni. A szülőpartnerek mind üvegházban, mind szabadföldön felnevelhetők. A virágzás szempontjából a környezeti tényezők közül a fénynek és a hőmérsékletnek van jelentős szerepe. A burgonya (S. tuberosum ssp. tuberosum) a virágfejlődés szempontjából hosszúnappalos növény. A fajták között a megvilágítás időtartama iránti érzékenység szempontjából különbségek vannak, azonban általánosan elfogadott, hogy az optimális virágfejlődéshez legalább 16 órás megvilágítás szükséges. A túl magas és túl alacsony hőmérséklet szintén gátolja a virágzást. Az optimális hőmérséklet 16–22 °C között van. A virágzás jelentős csökkenéséhez vezet, ha az elültetett gumó fiziológiailag öreg (a nyugalmi időszak letelte és az ültetés között túl hosszú idő telik el). Vannak olyan fajok és fajták, amelyek megfelelő környezeti feltételek biztosítása mellett is csak gyenge virágzási hajlamot mutatnak. Ilyen esetben alkalmazhatók a különböző, virágzást indukáló módszerek.

A vegyszeres kezelések kivételével – amelyek hatékonyságáról eltérőek a vélemé-nyek – a módszerek többsége a képződő fiatal gumók eltávolításán vagy a gumóképződés megakadályozásán alapul. A „téglára ültetés” módszere esetén a téglára helyezett gumóból fejlődő növény gyökereit a mélyebb talajrétegbe vezetik. A növény gumó feletti részéről a talajréteget lemosva a képződő fiatal gumók folyamatosan eltávolíthatók. Az asszimiláták gumóképződéshez történő felhasználását azzal is akadályozhatjuk, ha a burgonya hajtását paradicsom alanyra oltjuk. A keresztezések végrehajtására alkalmazott egyszerű módszer az, amikor a szántóföldön begyűjtött, még ki nem nyílt virágzatot a kasztrálást és beporzást követően antibiotikumot tartalmazó vízzel töltött edényekbe helyezik és üvegházi körülmények között nyerik a bogyótermést.

A szülőpartnerként kiválasztott anyai és apai vonalak virágzásának szinkronizálása nehéz feladat. Célszerű az apai vonalak pollenjét előre begyűjteni és a keresztezésig tárolni.

• A pollen begyűjtése és tárolása

a. Az érett, de még fel nem nyílt portokokat tartalmazó virágokat szitára helyezzük és 24–48 óráig szárítjuk szobahőmérsékleten.

b. A pollenszemek a szita rázogatásával a portokokból kinyerhetők.

c. A pollenszemek a portokokból vibrátorral frissen is kinyerhetők.

d. A pollen hűtőszekrényben, 4 °C-on 10 napig tárolható. Hosszabb tárolás estén a pollenszemeket 24–48 óráig 30 °C-on szárítjuk, majd fiolákban légmentesen lezárva –20 °C-on tároljuk. Az így tárolt pollenszemek csírázóképességüket hosszú ideig megőrzik (a vizsgálatok szerint 19 hónap után a pollenszemek 87%-a még csírázóképes).

A nemesítők véleménye megoszlik abban a kérdésben, hogy szükséges-e a kiválasztott anyai szülőpartner



éretlen portokjainak eltávolítása (kasztrálás) a keresztezés előtt. Egyesek véleménye szerint az önmegporzás, valamint a rovar- és szélmegporzás valószínűsége olyan kicsi, hogy a kasztrálás elhagyható, míg mások a biztos keresztezési kombináció létrejötte érdekében javasolják elvégezni. A kasztrálás akkor végezhető el káros következmények nélkül, amikor a még ki nem nyílt bimbóból a bibe kibújik.

A keresztezéseket a biztosabb megtermékenyülés érdekében célszerű a délelőtti órákban elvégezni, mert a környezeti feltételek ebben az időszakban a legkedvezőbbek.

• Keresztezés

a. A pollen felvitelének egyszerű módja egy olyan cső alkalmazása, amelybe a bibe belefér (pl. szívószál). A csövet a végétől néhány mm-re lezárjuk.

b. A csövet a pollenbe mártva a pollenszemek berakódnak és a bibére húzva azon megtapadnak.

c. A keresztezéskor a nem megtermékenyített (éretlen vagy elöregedett) virágokat lecsípjük, és a virágzatot a keresztezési kombináció azonosítására alkalmas jelöléssel látjuk el.

d. A bogyók érés után gyorsan leválhatnak a kocsányról, ezért időben kell begyűjteni őket, vagy hálóból készült, megfelelő szellőzést biztosító zacskót kell kötni köréjük.

e. A magokat keresztezési kombinációként a bogyóból kiszedjük, és mosással a bogyóhús-maradványokat eltávolítjuk (a bogyóhús csírázásgátló anyagokat tartalmazhat). A magok a mosás és szárítás után gyakorlatilag csírázóképesek.

f. A magokat jó nedvességtartó képességű szaporítóközegbe vetjük, 1–2 cm mélyen. A talajt folyamatosan nedves állapotban kell tartani, esetleg a csíranövények megjelenéséig a kiszáradás ellen le lehet takarni. Ha az elsődleges nemesítési célok között a burgonya Y-vírus elleni rezisztencia szerepel ebben a fázisban, a magoncok 4–6 leveles fejlettségénél a tömeges inokulációt szórópisztollyal elvégezhetjük.

g. A magoncokat ezt követően olyan térállásba ültetjük ki, hogy a gumótermés tövenként elkülöníthető legyen. Minden magonc alól 1 gumót gyűjtünk be anyatő céljára.

h. Az anyatövek, valamint a további nemzedékek (A, B és C klónok) között erős szelekciót végzünk a kívánatos tulajdonságokra (32. táblázat).

32. táblázat - Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva)

Év1Klónok száma

Gumószám

klónonként

Feladatok2

1 400–500 keresztezési kombináció előállítása, legalább az egyik szülőpartner Ro-1- és PVY-rezisztens

2 140 000 Tömeges magvetés és korlátozott negatív szelekció

3 100 000 1 Erős szelekció a növények között vírusfertőzésre, a gumók között termésre, alakra, rügymélységre, hússzínre. Téli vizsgálat Ro-1- és vírusrezisztenciára. A késői érésű genotípusok kiszűrése érdekében kémiai szártalanítás csak augusztus elején végezhető

4 7000 7 A klónok számozása. A növekedési típus, az



érésidő és a betegségek felvételezése. Téli vizsgálat ízre, főzési típusra, keményítőtartalomra, elszíneződésre és feldolgozási alkalmasságra. Ismételt vizsgálat fonálféreg-rezisztenciára

5 1400 50 Ugyanaz, mint a negyedik évben

6

7

7

500

(100)

10

250

250

1250

Kisparcellás kísérletek. Rezisztenciavizsgálat

varasodásra, rákra, vírusokra és mindkét nematóda faj patotípusaira. A hetedik év végén döntés a megfelelő hivatalos intézményeknél történő bejelentésekről

8 4 5000 Hivatalos vizsgálatok

9 4 0,75 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-termelés indítása

10 1 5 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-termesztés

1 A 6. évtől kezdve a kétséges klónok ismételt vizsgálata.

2 Ro-1, Globodera rostochiensis rassza; PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus).

• Extrém rezisztencia ellenőrzése burgonyafajtákon (Wiersena, 1972)

Az extrém rezisztencia megléte mesterséges körülmények között is lehetővé teszi a fajták vizsgálatát már palántakorban.

a. Magról nevelt fiatal burgonyapalántákat burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) vagy burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) – esetleg mindkettővel – inokulálunk, felső festéktartályos magasnyomású festékszóró pisztoly segítségével. A távolság 2–5 cm, a nyomás 1,5–2 kg/cm3.

b. A fertőzött növényeket 20–22 °C-os fóliaházban tartjuk legalább három hétig. A tünetes növényeket eltávolítjuk, a tünetmenteseket kiválogatjuk, átültetjük. A módszer a hiperszenzitivitás ellenőrzésére kevésbé alkalmas. A túlélő, tünetmentes növényeket szerológiailag ellenőrizzük.

c. Ha a kiválasztott növényanyag rezisztenciájáról két- vagy több év után is meg akarunk győződni, a burgonyanövényekről hajtást szedünk, és azt burgonya X-vírussal vagy burgonya Y-vírussal (vagy mindkettővel) fertőzött paradicsomnövényekre oltjuk kertészeti oltással. Az ellenőrzést ELISA-vizsgálatokkal egészítjük ki.

Megjegyzés: A vírusfertőzésekhez célszerű a nekrózist okozó törzseket használni, ami a fiatal, fogékony növényeket egy hét múlva elpusztítja, illetve azokon három héten belül tüneteket okoz. Az inokulumot használat előtt nejlonszűrőn átszűrjük, vagy centrifugáljuk. Az inokulumhoz karborundumport keverünk, de az abrazívum ülepedését a szórópisztoly tartályának enyhe kevergetésével meg kell akadályozni.

Multiplex rezisztenciával rendelkező genotípusok kiválasztása és tesztelése

A multiplex tulajdonságot tesztkeresztezésekkel lehet megállapítani. Ennek során a vizsgálandó genotípust ismerten fogékony (nulliplex) partnerrel keresztezik. Az utódokat mesterségesen fertőzik, és a fertőződött egyedek számából következtetni lehet arra, hogy a rezisztenciagént a genotípus hány lokuszon hordozza.

Számos burgonya-kórokozó, különösen a Phytophthora infestans esetében a rezisztenciát áttörő rasszok megjelenésének nagyobb a jelentősége, mint a vírusoknál. Ilyen törzsek megjelenésének lehetősége, mint számos példa mutatja, a vírusoknál sem zárható ki (Jones, 1985; Van den Heuvel et al., 1994; Feigelstock et al.,



1995). Ezért inkább a nemesítési program hatékonyságának növelése szempontjából van jelentősége olyan szülőpartnerek előállításának és felhasználásának, amelyek a rezisztenciagéneket több lokuszon hordozzák. A tetraploid burgonya esetében az érzékeny genotípusokat (rrrr) nulliplexnek, a rezisztenciagént egy lokuszon hordozót (Rrrr) simplexnek, a két lokuszon hordozót (RRrr) duplexnek, a három lokuszon hordozót (RRRr) triplexnek, míg a négy lokuszon hordozót (RRRR) quadriplexnek nevezik. Szülőpartnerrel történő keresztezés esetén az utódok között az ellenálló:fogékony genotípusok aránya simplex esetén 1:1, duplex esetén 5:1. Triplex és quadriplex szülőpartner esetén a mendeli szabályok szerint valamennyi utód rezisztens, de ennél kisebb mértékű eltérés is lehetséges. A multiplex szülőpartnerek felhasználása lehetővé teszi, hogy az előállított genotípusok szelekcióját más, lényeges tulajdonságra végezzük el, így a nemesítési program gyorsítható, hatékonysága növelhető.


19. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszereiA vírusbetegségek elleni védekezés leghatékonyabb módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása és a rezisztenciára történő nemesítés. A korszerű biotechnológiai módszerek alkalmazása mindkét területen igen sikeres és kifizetődő. Ide szűkebb értelemben azokat az eljárásokat sorolják, amelyekben a növényi sejt genetikai programját az ember megváltoztatja az így kialakított tulajdonságok technológiai felhasználása érdekében. Tágabb értelemben azonban ide tartoznak a különböző szövettenyésztési módszerek is.

A laboratóriumokból kikerülő növényfajtajelölteknek természetesen a szabadföldi kísérletekben is sikeresen kell szerepelniük, hogy azokból engedélyezett növényfajta lehessen. 1987 és 1994 között az Amerikai Egyesült Államokban 1700 helyen végeztek szabadföldi kísérleteket genetikailag módosított, transzgénikus növényekkel. Ezek 31%-a herbicidrezisztens (toleráns), 21%-a rovarrezisztens, 14%-a vírusrezisztens, 3%-a gombarezisztens volt (Schiemann és Casper, 1995). Európában az ilyen szabadföldi kísérletek száma lényegesen kisebb. 1992–1994 között Franciaországban 95, Belgiumban 59, Angliában 58, Hollandiában 51, Olaszországban 23, Németországban 22, Spanyolországban 13, Dániában 11 és Portugáliában 4 szabadföldi kísérletet végeztek transzgénikus növényekkel (Landsmann és Shah, 1995).

Napjainkra már több génsebészeti úton előállított, engedélyezett növényfajtát hoztak forgalomba. Az európai piacon hímsteril (kukorica, olajrepce), herbicid- és rovarrezisztens (dohány, szója, kukorica), valamint vírusrezisztens (burgonya, cukorrépa, dohány, paradicsom) fajták vannak. Hazánkban magyar nemesítésű transzgénikus fajta, ill. fajtajelölt nincs (Heszky et al., 1999).

Általában elmondható, hogy a biotechnológiai módszerekkel olcsóbban és rövidebb idő alatt lehet előállítani egy adott betegséggel szemben toleráns vagy rezisztens fajtát, mint a hagyományos, „klasszikus”, növénynemesítési eljárásokkal (Tepfer és Balázs, 1997; Foster és Taylor, 1998). Fontos azonban megállapítani, hogy a rezisztenciára nemesítés a modern és látványos eredményeket jelentő módszerek bevonásával is csupán versenyfutás marad a növénynemesítő és a kórokozók újonnan megjelenő törzsei, biotípusai vagy rasszai között.

1. Szomatikus hibridizációTermesztett növényeink vad rokonai és ezek különböző származékai számos, jelentős gazdasági károkat okozó vírussal szemben rezisztenciát mutatnak. Ezek a növényfajok és származékaik értékes alapanyagot jelentenek a növénynemesítők számára. Ilyen értékes nemesítési alapanyag pl. a Solanum stoloniferum dél-amerikai vad faj több származéka (PI. 255548, 275245, 275247, 545800 stb.), amelyek extrém rezisztenciát (immunitást) mutatnak a rezisztenciaáttörő képességgel (resistance breaking) rendelkező burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) NTN törzsével szemben (Horváth és Wolf, 1995; Bősze et al., 1996). A hagyományos nemesítési eljárás során a kultúrnövényeket ivaros úton keresztezik a vad fajokkal (származékokkal), hogy a betegség-ellenállóságot a kultúrfajba (fajtába) bevigyék. Az ivaros keresztezés azonban számos faj között nem lehetséges. A protoplasztfúzió új utat nyitott a rezisztenciára nemesítésben, mert lehetővé tette, hogy a szexuális szaporodás megkerülésével olyan fajok egyedeit is keresztezzük, amelyek ivaros módon nem hibridizálódnak és nem hibridizálhatók egymással (Puite et al., 1988; Filippone et al., 1992; Marchant et al., 1993). A módszer azokban az esetekben alkalmazható, melyekben protoplasztokból növényegyedeket tudnak regenerálni. A protoplaszt a növényi sejtfal kíméletes eltávolítása után megmaradó „csupasz” – sejtfal nélküli – sejt. A protoplasztfúzió a (szomatikus eredetű) protoplasztsejtek egyesítését jelenti. Ennek során – ellentétben a szexuális rekombinálódással – a szülői sejtek citoplazmája is egyesül. Mivel a kórokozókkal szembeni rezisztenciát néhány esetben a plasztidok genomja kódolja, a fúziós technikák utat nyitottak olyan egyedek létrehozására, amelyek a citoplazmás genetikai determinánsok új kombinálódásai (cibridek) (Wenzel, 1985). A szomatikus hibridizáció előnye, hogy a többgénes öröklődésű reziszten-ciák is átvihetők a vad fajból a termesztett fajtába. A módszer hátránya azonban szintén abból adódik, hogy egyszerre nagy mennyiségű örökítő anyag kerül át, így azokkal nem kívánt tulajdonságok jelenhetnek meg a nemesített fajtában. A szomatikus hibridek előállítása három lépésben történik: 1. a protoplasztok izolálása, 2. a sejtek egyesítése (fúzió), 3. regeneráció és szelekció.

1.1.1.1.1.


A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. A protoplasztok izolálása

A növények szomatikus sejtjeiről eltávolítják a sejtfalat. Ez úgy történik, hogy egy növényi szervdarabot egy sejtfalbontó enzimeket (pektináz, celluláz, hemicelluláz – Trichoderma, ill. Rhizopus gombákból) tartalmazó folyékony ozmotikum (általában mannitol- vagy szorbitololdat) felszínére helyeznek, és steril körülmények között inkubálják. A sejtfaluktól megfosztott sejteket, a protoplasztokat elválasztják a törmeléktől, és tápanyagokat tartalmazó tápoldatba helyezik.

A sejtek egyesítése (fúzió)

Jelenleg erre kétféle módszert alkalmaznak: a protoplaszt-szuszpenziókat összekeverik, és ehhez polietilén-glikolt (PEG) adnak, vagy pedig elektromos impulzussal kezelik a sejteket. Ezekre a lépésekre azért van szükség, hogy a negatív töltéssel rendelkező plazmalemma töltésviszonyait megváltoztassák, és így létrejöhessen a protoplasztok összetapadása, illetve egyesülése.

A PEG-gel történő kezelés úgy történik, hogy Petri-csésze aljára csöppentett protoplaszt-szuszpenzióhoz lassan, 2–3 lépésben adják hozzá a PEG-oldatot. A végső PEG-koncentráció 15–20%, de ez növényfajoktól függ. A PEG-es inkubálás időtartama általában 20–30 perc. Ezután a Petri-csésze felületére ülepedett protoplasztokról óvatosan leszívják a PEG-oldatot, és a tenyészetet többször átmossák a táptalajjal. Végül ebben a táptalajban veszik fel a sejteket.

Az elektrofúzióhoz a kis vezetőképességű mannitol- vagy glükóz-ozmotikumban szuszpendált protoplasztokat elektromos küvettába helyezik. Ebben a technikában váltóáramnak és egyenáramnak egyaránt szerepe van. Váltóáram hatására a sejtek – összetapadva – láncot alkotnak az elektródok közötti elektromos erővonalak mentén, egyenáramú impulzus hatására pedig szakadások jönnek létre az érintkező membránokon. A protoplasztok fúziója a membránok újrarendeződésekor jön létre.

1.1.1.1.2. Regeneráció és szelekció

A sejtfúziót követően a hibrid sejteket kiemelik a vad típusú protoplasztok közül. Ez mikroszkópos technikák segítségével, illetve antibiotikumok alkalmazásával történhet. A hibrid sejtvonalakból azután hormonkezeléssel növényeket regenerálnak. In vitro szövetkultúrákban a növényi sejtekből – a totipotenciának köszönhetően – teljes növények regenerálódnak. A regenerált növények között nagyok lehetnek a különbségek (szomaklonális variabilitás). Az öntermékenyülő homozigóta kultúrfajoknál a transzgénikus növények szaporítása önbeporzással vagy az eredeti fajtával történő visszakeresztezéssel lehetséges. Az ilyen keresztezések eredményeképpen a szomaklonális variabilitás előfordulási esélye csökken. A vegetatív úton szaporított növényfajoknál – amelyek általában idegentermékenyülők és heterozigóták – a szomaklonális variabilitás előfordulását a minimálisra csökkenthetjük, ha az elsődleges transzgén növények közül szelektáljuk a fajtaazonos transzgén növényeket. A burgonya a szövettenyésztés során magas szomaklonális variabilitásra képes. Ezért e faj esetében azokat a transzformánsokat kell szelektálni, amelyekben a szomaklonális variabilitás nem fordul elő (Huisman et al., 1992).

A protoplasztfúzióval előállított szomatikus hibridek sokszor a további ivaros szaporításra alkalmatlannak bizonyulnak, illetve nemkívánatos tulajdonságok is átkerülhetnek a vad fajokból. A szomatikus sejtgenetika számos biztató eredménye ellenére is a rezisztenciára nemesítés legígéretesebb útja jelenleg mégis a transzgénikus növények előállítása.

Protoplasztok izolálása és növények regenerálása dohányból [Nagy (1992) által módosítva]

a. Dohány (Nicotiana tabacum) hajtáskultúráit hormonmentes MS táptalajon, 26 °C-on, 2000 lux fényintenzitás mellett, 16 órai megvilágítási idő után 8 óráig sötétben tartjuk.

b. Steril Petri-csészébe 8 ml sejtfalbontó enzimoldatot (lásd Táptalajok és oldatok) teszünk.

c. A 4–6 hetes növényekről kifejlett leveleket szedünk.

d. A leveleket fonákukkal fölfelé steril Petri-csészébe helyezzük.

e. A levelekre kevés Cellitet szórunk, és ecsettel óvatosan kenegetve megsértjük az epidermiszréteget.



f. A levelet sértett felületével lefelé az enzimoldat felszínére helyezzük.

g. A Petri-csészét lezárjuk, és egy éjszakán át 26 °C-on, sötétben inkubáljuk.

h. A protoplasztokat enyhe, keverő mozdulatokkal szuszpendáljuk, majd 80 μm-es nejlon szűrőn átszűrjük. A szűrőre a sejtszuszpenziót széles szájú pipettával átvisszük.

i. A szuszpenziót 10 ml-es centrifugacsőbe helyezzük.

j. A 10 percig történő centrifugálás (60 g) után az intakt protoplasztok a folyadékoszlop felszínén sötétzöld gyűrűt képeznek.

k. A protoplasztokat Pasteur-pipettával 8 ml-es W5 ozmotikumot tartalmazó centrifugacsőbe visszük át úgy, hogy a táptalajból minél kevesebbet szívjunk fel, majd két percig centrifugáljuk.

l. A leülepedett protoplasztokról leszívjuk az ozmotikumot és a sejteket 1 ml K3-as táptalajban reszuszpendáljuk.

m. Egy csepp szuszpenziót Fuchs-Rosenthal- vagy Bürker-kamrába teszünk, és mikroszkóp alatt megszámoljuk a protoplasztokat. Ha a szuszpenzióban túl sok a sejttörmelék, a W5-tel történő mosási lépést meg kell ismételni. Optimális esetben a protoplasztkinyerés 2–3 millió sejt/g friss növényanyag. A protoplasztfúzió vagy a transzformálás PEG-es kezelés, illetve elektromos impulzus hatására következik be.

n. A protoplasztokat a táptalajjal 105 sejt/ml koncentrációra higítjuk. Ebből a keverékből 4 cm-es átmérőjű Petri-csészékbe 2,5–2,5 ml-t mérünk, majd a Petri-csészéket lezárjuk és 26 °C-ra, sötétbe helyezzük.

o. A protoplaszttenyésztés, illetve a növényregenerálás a 33. táblázatban leírtak szerint történik.

33. táblázat - Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei

Idő

(nap)Táptalaj Ozmotik

umNövekedésszab

ályzó Kezelés Fejlődési állapot

0–5 K3 0,4 M 2 mg/1 NAA,

1 mg/1 BAP

tenyésztés sötétben protoplasztok,

sejtfal-regenerálódás,

első sejtosztódás

6–14 K3 0,4 M 1 mg/1 BAP,

0,1 mg/1 NAA

átoltás új táptalajba 10-szeres hígítással (fény)

fejlődő kolóniák

(50–70 sejtesek)

15–28 K3 0,2 M 0,5 mg/1 BAB,

0,05 mg/1 NAA

átoltás 5-szörös hígítással (fény)

1–2 mm-es, zöldes kolóniák

28–50 B5

0,8% agár

3% szaharóz

– 0,5 mg/1 BAP,

0,01 mg/1 NAA

kolóniák átoltása agár táptalajra (fény)

hajtásprimordia

40–60 MS

0,8% agár

– 0,1 mg/1 BAP, vagy

fejlődő hajtások

áthelyezése

zöld hajtások, gyökérkezdeménye



2% szaharóz

hormonmentes új táptalajra k

60-tól MS

0,8% agár

2% szaharóz

hormonmentes fejlődő hajtások áthelyezése új táptalajra

10-15 naponként

gyökeres növénykék

1.1.1.1.3. Táptalajok és oldatok

a. Sejtfalbontó enzimoldat: 0,7% celluláz és 0,25% macerozim (Sigma) 0,4 M szaharóz-tartalmú K3 táptalajban.

b. K3-as táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3; 250 mg/l NH4NO3; 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O; 300 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 150 mg/l NaH2PO4 × H2O; 134 mg/l (NH4)2SO4; 50 mg/l CaHPO4; 27,8 mg/l FeSO4 × H2O; 37,3 mg/l Na2EDTA. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × 4 H2O; 3 mg/l H3BO3; 0,75 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4

× 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O. Vitaminok: 10 mg/l tiamin-HCl; 1 mg/l piridoxin-HCl; 1 mg/l nikotinsav; 100 mg/l inozit. Cukrok: 250 mg/l xilóz; 0,4 M szaharóz (protoplaszt-izoláláshoz); 0,4 M glükóz (sejtkultúrához). Hormonok: lásd 33. táblázat.

c. B5 táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3, 150 mg/l CaCl2 × 2 H2O, 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O, 134 mg/l (NH4)2SO4, 150 mg/l NaH2PO4 × H2O. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × H2O, 3 mg/l H3BO3, 0,75 mg/l KI, 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O, 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O, 13,2 mg/l MnSO4 × H2O, 27,8 mg/l FeSO4 × 7 H2O, 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O. Vitaminok:1 mg/l nikotinsav, 1 mg/l piridoxin HCl, 10 mg/l tiamin HCl, 100 mg/l mio-inozit. Hormonok: lásd 33. táblázat.

d. W5 ozmotikum: 9000 mg/l NaCl, 18 400 mg/l CaCl2 × H2O, 400 mg/l KCl, 1000 mg/l glükóz (pH 5,8).

1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságaiA Solanum brevidens, nem gumóképző vad burgonyafaj egyes származékai ellenállóak a különböző burgonyavírusokkal [burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll luteovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus)] szemben (Jones, 1979; Austin et al., 1985; Horváth et al., 1987; Gibson et al., 1988, 1990; Pehu et al., 1990; Fehér et al., 1990; Valkonen et al., 1991, 1992, 1995; Horváth et al., 1993, 1996). A S. brevidens ivaros úton nem keresztezhető a Solanum tuberosum kultúrnövény fajtáival. A két faj protoplasztfúzióval előállított vegetatív sejthibridjeiből életképes, gumóval rendelkező fajhibridek nevelhetők fel (Austin et al., 1985; Gibson et al., 1988; Fehér et al., 1990; Pehu et al., 1990). A vegetatív hibridek még természetesen nem rendelkeznek a kultúrburgonya-fajták összes jó tulajdonságával, de már alkalmasak arra, hogy további keresztezési partnerek legyenek és új, vírusnak ellenálló burgonyafajtákat lehessen belőlük előállítani (Dudits és Heszky, 1990).

Austin et al. (1985) után Helgeson (1992) szintén a S. brevidens (PI 218228) és a S. tuberosum (PI 203900) származékaival állított elő sejthibrideket. A S. brevidens fenti származéka fertilis diploid, és rezisztens a burgonya levélsodródás vírussal szemben, viszont rendkívül fogékony a Phytophthora infestans 0 és 4-es rasszára. A S. tuberosum fenti származéka tetraploid, és fogékony a burgonya levélsodródás vírusra, valamint a P. infestans 4-es rasszára, viszont rezisztens a gomba 0 rasszával szemben. A szomatikus hibridizáció olyan fertilis hibrideket eredményezett, amelyek mindkét szülő rezisztenciáját magukban foglalták. A rezisztencia a szexuális úton létrejövő utódokban is megnyilvánult, és a gumók minőségében is javulás következett be.

2. Molekuláris genetikai módszerekMolekuláris genetikai módszerek segítségével olyan tulajdonságok vihetők be a növényekbe, amelyekért egyetlen gén vagy géncsoport a felelős. E beavatkozás attól függetlenül végezhető, hogy mi az eredete



(származási helye) a beültetni kívánt gén(ek)nek. Ily módon egészen új típusú rezisztenciák alakíthatók ki, mégpedig irányítottan, azaz anélkül, hogy számunkra kedvezőtlen tulajdonságok jelennének meg a fajtában. A védettséget kialakító gén vagy gének örökíthető módon történő bejuttatása egy növénybe – mind a szomatikus hibridizáció, mind pedig az itt tárgyalandó növénytranszformálások esetében – akkor lehetséges, ha annak sejtjeiből egész egyedeket tudunk regenerálni.

A transzgénikus növények előállításával történő vírusok elleni védekezést a bevitt gének forrása alapján csoportosítjuk: 1. növényi eredetű, természetes vírusellenállóság-gének, 2. vírus eredetű gének, 3. egyéb vírusellenállóság-gének.

2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésévelMivel egy betegségre nézve számos fajta ellenálló, az e tulajdonságért felelős gének legkézenfekvőbb forrását maguk a növények jelentik. E gének megtalálása és izolálása a 102–104 Mbp (megabázispár) méretű növényi genomból nem könnyű feladat. A molekuláris genetikai módszerek (PCR alapú technikák, genomtérképezés) rohamos fejlődése azt eredményezte, hogy napjainkban mind több rezisztenciagén azonosításáról és klónozásáról számolnak be a szakirodalomban. Ez, elsősorban a korábbi években, a transzpozon „tagging” módszer (transzpozon nyomon követés) (Osborne és Baker, 1995), míg újabban a molekuláris térképezési eljárások (Tanksley et al., 1995; Paterson, 1996) sikeres alkalmazásának köszönhető. Az azonosított rezisztenciagén-családok növekvő számának, valamint azok konzervatív régióinak köszönhetően (Ronald, 1998) legújabban ún. degenerált oligonukleotidok felhasználásával, PCR technika segítségével emelik ki a rezisztenciagéneket a különböző növényfajokból.

2.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás

A prokarióta és az állati sejtekhez hasonlóan a növényekben is találhatók ugráló genetikai elemek, úgynevezett transzpozonok (Shepherd, 1988). Ezeknek az a tulajdonságuk, hogy bizonyos gyakorisággal megváltoztatják a genomon belüli helyüket. Az integrálódott transzpozon „knock out” mutációt okoz az adott lókuszon, azaz a gén, amelybe az elem épült, elveszti funkcióját. Az egyes növényfajokban fölfedezett transzpozonrendszerek jelentős része két elemből áll: egy autonóm és egy nem-autonóm elemből. (Ilyen például a kukoricában fölfedezett Ac/Ds rendszer.) A nem-autonóm elem csupán akkor képes a helyváltoztatásra, ha az autonóm elem is egyidejűleg jelen van a genomban. A transzlokáció további feltétele, hogy a sejtben a genom replikációja végbemenjen (S fázis). Ez csak az osztódó – merisztematikus, illetve embrionális – sejtekre jellemző. Az ugráló genetikai elemek széleskörű felhasználását az tette lehetővé, hogy azok más növényfajokba átvihetők anélkül, hogy tulajdonságaikat elvesztenék.

A transzpozon „tagging” módszerrel olyan gének izolálása lehetséges, amelyek fenotípusos hatása egyértelműen nyomon követhető. Ez a rezisztenciagének esetében általában lehetséges, mivel e tulajdonságok sokszor egygénes, domináns öröklődésűek. Ilyenek a Tm-1 és Tm-2 gének a paradicsomban, a Rx és Ry gének a burgonyában, az N és N’ gének a dohányban. A módszer előnye, hogy nem szükséges a keresett gén fehérjetermékének az előzetes ismerete, illetve a magas szintű génexpresszió. Az eljárás során a transzpozonok segítségével mutánsokat állítanak elő, majd a betegséggel szemben érzékennyé vált növényeket szelektálják.

A mutagenezis kétféle genotípusú növény keresztezésével történik (107. ábra). Az egyik a rezisztenciagénre nézve homozigóta-domináns és nem-autonóm transzpozont tartalmaz, a másik homozigóta-recesszív és a transzpozon autonóm párját hordozza. A két növény keresztezése után minden utódnövény heterozigóta lesz a rezisztenciagénre nézve. Mivel azonban az utódok embrionális fejlődése során megtörténik a transzpozonok áthelyeződése, azok a növények, melyekben az ugráló genetikai elem a keresett gén domináns alléljába integrálódott, fogékony fenotípust mutatnak. Mivel a transzpozont molekuláris térképezés segítségével, DNS-hibridizációs és PCR alapú módszerekkel meg tudják keresni az ilyen növények genomjában, az általuk mutált gén velük együtt kiemelhető. Ez a DNS-fragmentum baktériumvektor-plazmidba klónozva már „kézben van”, azaz felhasználható a legkülönfélébb molekuláris biológiai alkalmazásokra. Ilyen például a génnek, illetve a betegséggel szembeni ellenállóképességnek más növénybe történő átvitele (növénytranszformálás). Transzpozon nyomon követéses módszerrel izolálták a Nicotiana glutinosa növényből származó N gént, mely a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szembeni rezisztenciagén (Dinesh-Kumar et al., 1995).

107. ábra - A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns rezisztenciagént (R gén) homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont hordozó növényt olyan növénnyel keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját



tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént hordozza annak érdekében, hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm elem transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további keresztezésekkel eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó kromoszómarészt, illetve szelektálják a mutáns, vírusfogékony növényeket. P = promóter régió

2.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás

A növényi genomtérképezés szédítő fejlődése lehetővé tette, hogy ma már ún. pozicionális vagy genomtérkép alapú klónozással keressék a rezisztenciagéneket. Ez az eljárás gyorsabb és kevésbé fáradtságos a transzpozon „tagging” módszernél. Az ugráló elemek ugyanis véletlenszerűen integrálódnak a genomba, így annak valószínűsége igen csekély, hogy éppen az általunk keresett rezisztenciagént inaktiválják.

A pozicionális klónozás ezt a nehézséget küszöböli ki. Az eljárás a növényfajták egyre részletesebb genomi térképeit használja fel. E térképeken molekuláris markereknek (jellemző DNS-szekvenciarészleteknek) a kromoszómákon elfoglalt helyét tüntetik fel. A pozicionális klónozás során a keresett vírusellenállóság-génnek az azonos kromoszómán lévő markerekhez viszonyított helyét állapítják meg. Ennek érdekében sokszoros keresztezéseken keresztül nyomon követik és összevetik az utódok betegség-ellenállóságát, valamint a molekuláris markerek pozícióit (108. ábra). Az utóbbit elsősorban olyan nagy hatékonyságú (nagyszámú polimorf jelet előállító) „marker-technológiák” alkalmazásával végzik, mint a „random amplified polymorphic DNAs” (RAPD) vagy az „amplified fragment length polymorphisms” (AFLP). A rezisztenciagéneket azután molekuláris „környezetük” ismeretében genomi könyvtárakból izolálják. E módszer segítségével azonosították Arabidopsis thaliana növényből a tarlórépa göndörödés vírussal (turnip crinkle carmovirus), illetve a dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) szembeni rezisztenciáért felelős géneket (Dempsey et al., 1997; Mahajan et al., 1998).



108. ábra - Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem izogén vonalak analízise (Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént hordozó, vírusellenálló növényt (P1) keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel visszakeresztezik. Az utódnövények közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd azokat újból a homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik nemzedékben szinte a teljes genom – a rezisztenciagént tartalmazó szűk régió kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát majdnem tökéletesen izogén vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A domináns (rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1 hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján két csoportra osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a rezisztenciagénnel azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek átrendeződnek. C: a molekuláris markereket (polimorfizmusokat) összehasonlítják a hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával együtt hasadó markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó szekvenciarészletek, amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a rezisztenciagének



2.2. A kórokozótól származtatott rezisztenciaA patogéntől származtatott rezisztencia (pathogen derived resistance, PDR) felfedezését a keresztvédettség jelenségének a felismerése tette lehetővé. Viszonylag régóta ismeretes a növényvirológiában, hogy ha egy növényt megfertőznek egy vírussal, majd később ugyanannak a vírusnak egy súlyosabb tüneteket okozó törzsével inokulálják a leveleket, akkor a súlyosabb tünetek már nem alakulnak ki; a második vírussal a növény már nem fertőzhető meg. Ez a jelenség a keresztvédettség (cross protection) (McKinney, 1929; Horváth, 1969; Matthews, 1992; Fraser, 1998). Feltételezték, hogy a második vírustörzszsel szembeni rezisztencia annak köszönhető, hogy a sejtekben már jelen van az első vírustörzs köpenyfehérjéje. Az 1980-as évekre lehetővé vált, hogy ez utóbbit ne vírusfertőzéssel biztosítsák, hanem a növények transzformálásával. Olyan transzgénikus növényeket állítottak elő, amelyek a vírus köpenyfehérjét kódoló génjét megfelelő promóter mögött hordozták. Ezek a növények saját maguk „termelték” a vírus köpenyfehérjéjét. A keresztvédettséggel kapcsolatos kísérleti feltételezés 1986-ban beigazolódott. Powell et al. (1986) beszámoltak arról, hogy a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegénjét hordozó transzgénikus dohánynövények a vírussal szemben rezisztensekké váltak. Az ilyen típusú ellenállóságot patogéntől származtatott rezisztenciának nevezik, mivel a jelenséget kiváltó gén a kórokozóból származik. Az RNS-genommal rendelkező vírusok esetén (a legtöbb növénypatogén vírus ilyen) ahhoz, hogy a kívánt gén a növénybe építhető legyen, a vírus cDNS klónjait készítik el. A dohány mozaik vírussal kapcsolatos fenti kísérlet vezette be azokat a vizsgálatokat, melyek eredménye ma már számos betegség-ellenálló növényfajtához vezetett.

2.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia



A vírusoktól származtatott ellenállóság legelterjedtebb és legsikeresebben alkalmazott formája a vírus köpenyfehérjéje által közvetített rezisztencia (coat protein mediated resistance) (Fauquet és Beachy, 1992; Stiekema et al., 1993; Wassenegger, 1998). Ez olyan típusú rezisztencia, amelyet a növényi genomba épített köpenyfehérjegén vált ki. Ezek a növények ellenállóak az adott vírussal és – bizonyos mértékig – a rokon vírusokkal szemben is (Stark és Beachy, 1989; Ling et al., 1991). A Powell és munkatársai által 1986-ban közölt kísérlet (loc. cit.) óta külföldi és hazai kutatók hasonló sikereket értek el a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X potexvirus), a dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) és a különböző potyvirusok köpenyfehérjegénjével. Ma már több mint 20 vírussal szemben állítottak elő köpenyfehérje-transzgénikus, rezisztens növényeket (Fauquet és Beachy, 1992; Stiekema et al., 1993; Tepfer és Balázs, 1997; Miller és Hemenway, 1998). Ezek mindegyike valamilyen pozitív vagy negatív RNS-genommal rendelkező vírus köpenyfehérjéjét termelte (34. táblázat).

34. táblázat - A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus növényekben (Miller és Hemenway, 1998)

Vírus-köpenyfehérjegén1 Transzgénikus növény

Arabis mozaik vírus (Arabis mosaic nepovirus) Nicotiana tabacum

Borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus)

Pisum sativum

Burgonya levélsodródás vírus (potato \eafro\\polerovirus)

Solanum tuberosum

Burgonya aukuba mozaik vírus (potato aucuba mosaic potexvirus)

Nicotiana tabacum

Burgonya M-vírus (potato M carlavirus) Solanum tuberosum

Burgonya S-vírus (potato S carlavirus) Solanum tuberosum

Burgonya X- vírus (potato X potexvirus) Solanum tuberosum,

Nicotiana tabacum

Burgonya Y- vírus (potato Y potyvirus) Solanum tuberosum,

Nicotiana tabacum

Cukkini sárga mozaik vírus (zucchini yellow mosaic potyvirus)

Nicotiana tabacum,

Cucurbita pepo

Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus)

Nicotiana tabacum

Dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus) Nicotiana tabacum

Dohány karcolata s vírus (tobacco etch potyvirus) Nicotiana tabacum

Dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) Nicotiana tabacum,

Lycopersicon esculentum



Dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) Nicotiana tabacum

Görögdinnye mozak vírus (watermelon mosaic potyvirus)

Nicotiana tabacum,

Cucurbita pepo

Kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic potyvirus)

Zea mays

Lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) Nicotiana tabacum,

Medicago sativa,


Papaya gyűrűsfoltosság vírus (papaya ringspot potyvirus)

Nicotiana tabacum,

Carica papaya

Paprika enyhe foltosság vírus (paprika mild mottle tobamovirus)

Nicotiana tabacum

Paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)

Nicotiana tabacum

Paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) Lycopersicon esculentum

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus (béét necrotic yellow vein benyvirus)

Beta vulgáris

Rizs csíkosság vírus (rice tripe tenuivirus) Oryza sativa

Saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus)1 Lactuca sativa

Szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) Nicotiana tabacum

Szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) Nicotiana tabacum

Szőlő króm mozaik vírus (grapevine chrome mosaic nepovirus)

Nicotiana tabacum

Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) Nicotiana tabacum,

Cucurbita pepo,

Capsicum annuum,


1 Lásd Dinant et al. (1997)

2.2.1.1.

2.2.1.1.1. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia megjelenési formája

A betegséggel szembeni rezisztenciát a vírusfertőzés után az infekciós helyek számának és/vagy a betegségszimptómák kialakulásának összehasonlításával értékeljük a köpenyfehérjegént tartalmazó (CP+) és a



köpenyfehérjegént nem tartalmazó (CP–) növényekben. Az elsődlegesen transzformált növényeket és az F1

utódnemzedék rezisztenciáját is értékelik. A rezisztenciára történő tesztelés szempontjából előnyösebb a növényi populációk vizsgálata, mert a populációkban az egyes egyedek korban, növekedési ütemben és méretben is egységesek, ezért általában az F1 utódnemzedékben és a következő generációkban értékelik a rezisztenciát.

A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia vizuálisan is megnyilvánul. A rezisztencia első megnyilvánulási formája az, hogy az inokulált leveleken kevesebb lesz a fertőzési helyek száma. A dohány mozaik vírus fertőzése következtében a köpenyfehérjegént tartalmazó Nicotiana tabacum cv. Xanthi levelein a lokális nekrotikus léziók száma 95–98%-kal csökkent a köpenyfehérjegént nem tartalmazó növényekhez képest (Nelson et al., 1987).

A köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a rezisztencia másik megnyilvánulási formája a szisztemikus szimptómák kialakulásának akadályozása. Az ilyen típusú növényekben jóval kisebb a valószínűsége annak, hogy a lokális szimptómák kialakulása után a fertőzés szisztemizálódik.

A rezisztencia harmadik megnyilvánulási formája az, hogy a köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a vírus jóval kisebb mennyiségben akkumulálódik a fertőzés után, mint a köpenyfehérjegént nem tartalmazó növényekben. Azok a transzgénikus növények, amelyek a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjéjét termelték, a fertőzés után igen alacsony koncentrációban, vagy pedig egyáltalán nem akkumulálták a vírusokat (Lawson et al., 1987; Nelson et al., 1987; Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988). A makroszimptómák megjelenésének hiánya és a vírusakkumuláció elmaradása között szoros pozitív korreláció áll fenn.

Az inokulum koncentrációjának növelése megszüntetheti a rezisztenciát. A dohány mozaik vírus inokulumkoncentrációjának a növelésével csökkent a transzgénikus növények közül a rezisztens egyedek száma (Powell et al., 1986). Ezzel ellentétben azonban a burgonya X-vírus, a burgonya Y-vírus és a dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények a rendkívül magas (50 μ/ml) inokulumkoncentrációval szemben is immunisnak bizonyultak (Hemenway et al., 1988; Stark és Beachy, 1989; Lawson et al., 1990).

A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia

A burgonya X-vírus a Potexvirus nemzetség típustagja. Hemenway et al. (1988) és Lawson et al. (1990) létrehozták a burgonya X-vírus köpenyfehérjegén komplementer DNS-ét (cDNS). A létrehozott génkimérákat agrobaktériumos transzformálással a Bintje és az Escort (Hoekema et al., 1989), valamint a Russet Burbank (Lawson et al., 1990) burgonyafajtákba építették be. A regenerálódott burgonyanövényekben az összes növényi protein 0,05–0,3%-a a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérje volt. A burgonya X-vírus köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények vírussal szembeni rezisztenciáját gyökeres dugványokon tanulmányozták. A vírussal történő fertőzés után a transzgénikus Bintje és Escort fajták 20–50-szer kevesebb vírust tartalmaztak, mint a nem transzgénikus növények, és a transzgénikus növényekben a betegség szimptómái is később jelentek meg (Hoekema et al., 1989). Szoros pozitív korrelációt állapítottak meg az akkumulálódott köpenyfehérje mennyisége és a rezisztencia erőssége között.

A burgonya vírusrezisztenciára történő nemesítése csak akkor eredményes, ha a fajta rezisztenciatulajdonságai stabilan kifejeződnek, és a fajta egyéb hasznos tulajdonságai is megmaradnak a szabadföldi termesztés során. Ezért a kérdést úgy kell feltenni, hogy a transzgénikus, burgonya X-vírussal szemben ellenálló burgonyák hordozzák-e az eredeti fajták, a Bintje és az Escort fontos, egyéb értékmérő tulajdonságait. Ezen kérdés megválaszolására a transzgénikus klónok szabadföldi viselkedését tanulmányozták 52 fontos, értékmérő tulajdonság tekintetében. Azt találták, hogy a Bintje fajta transzgén klónjainak mindössze 17,9%-a, míg az Escort fajta transzgén klónjainak 81,8%-a volt fajtaazonos.

A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia

A burgonya Y-vírus a Potyvirus nemzetség típustagja. Lawson et al. (1990) elkészítették a burgonya Y-vírus köpenyfehérjéjét kódoló gén cDNS-ét, majd azt Russet Burbank burgonyafajtába építették olyan formában, hogy a gén a növényben kifejeződhessen. Azok a növényi vonalak, melyek a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a burgonya Y-vírus köpenyfehérjegénjét egyaránt tartalmazták, egyidejűleg mindkét vírus fertőzésével szemben rezisztensek voltak. 20 μg/ml burgonya Y-vírus inokulumkoncentráció esetében a transzgénikus növények rezisztenciát mutattak, míg ez az inokulumkoncentráció a nem transzgénikus növények 80%-át megfertőzte.



Stark és Beachy (1989) a szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) N törzsének köpenyfehérjét kódoló génjét építették be a „Xanthi” dohányfajtába. Azok a dohányvonalak, melyek a szójabab mozaik vírus köpenyfehérjegénjét tartalmazták, az összes kivonható protein 0,001–0,23%-ában akkumulálták a vírus-köpenyfehérjét. Mivel a szójabab mozaik vírus nem patogén a dohányra, a vonalakat a dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) és a burgonya Y-vírussal inokulálták; ezek a vírusok sem egymással, sem a szójabab mozaik vírussal nem mutattak szerológiai rokonságot. Mégis számos vonal a burgonya Y- és a dohány karcolatos vírusokkal szemben is bizonyos mértékű rezisztenciát mutatott, néhány vonal esetében azonban még rendkívül magas (50 g/ml) inokulumkoncentráció esetén is erős rezisztenciát figyeltek meg.

A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia

A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) a Polerovirus nemzetség gazdasági szempontból igen veszélyes tagja. Kawchuk et al. (1991) e vírus köpenyfehérjegénjét építették Russet Burbank burgonyafajtába. Bár több rezisztens vonalat is találtak a regeneránsok között, egyetlen transzgénikus klónban sem tudták a köpenyfehérje jelenlétét kimutatni. Ugyanakkor a köpenyfehérjét kódoló messenger RNS (mRNS) szintje igen magas volt. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a rezisztenciát a mRNS, és nem a köpenyfehérje közvetíti.

2.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia

A replikázoktól származtatott vírusellenállóság Golemboski et al. (1990) nevéhez fűződik. Amikor a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) 54 kD méretű replikáz fehérjéjét transzgénikus növényben expresszálták, a növények ellenállóak lettek a vírusfertőzéssel szemben. Azóta számos esetben alakítottak ki betegség-ellenállóságot vírusok replikáz génjeinek növényekbe építésével (Baulcombe, 1994; Palukaitis és Zaitlin, 1997). A paprika enyhe foltosság vírus (pepper mild mottle tobamovirus) 54 kD-os protein génjének a növényi genomba történő beépítésével ellenállóságot sikerült kialakítani. Az ellenállóság a paprika enyhe foltosság vírus magas inokulumkoncentrációja esetén sem szűnt meg, más tobamovirusok (pl. dohány mozaik vírus) azonban áttörték azt. Az 54 kD-os fehérje megcsonkított változata is ellenállóságot indukált a paprika enyhe foltosság vírus fertőzéssel szemben, amiből azt a következtetést lehet levonni, hogy az ellenállóság létrejöttéhez nem szükséges a teljes fehérje jelenléte.

A Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) elleni, replikáz által közvetített rezisztencia akkor volt erősebb, amikor a fehérje kisebb mennyiségben termelődött. Az ellenállóság a rokon vírusok fertőzésével szemben nem nyilvánult meg. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) elleni, replikáz által kiváltott ellenállóság tekintetében csupán az enzimet kódoló RNS megjelenése is elegendőnek bizonyult. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) nem transzlálódó kettős RNS-szála magas szintű rezisztenciát indukált. A fenti esetekben tehát az ellenállóságot minden bizonnyal nem a fehérje, hanem az RNS közvetítette. A lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) szembeni rezisztencia esetében azonban az a transzlációs termékhez volt köthető.

A replikáz génekkel kialakított rezisztenciák mechanizmusairól keveset tudunk. A legtöbb esetben nincs közvetlen kapcsolat a protein kifejeződése és a rezisztencia mértéke között. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) RNS-polimeráz gén-jét expresszáló dohánynövényekben a vírus sejtről sejtre történő mozgása, valamint a floémbe lépése is gátolva volt. A legújabb megfigyelések szerint pedig az uborka mozaik vírus helikáz génjét hordozó dohánynövény egyszerre volt képes gátolni a vírus szisztemikus terjedését, valamint az inokulált levélben komplementálni a helikáz gént nem tartalmazó mutáns vírust. A replikáz gének által közvetített rezisztenciákra általánosan elmondható, hogy szűk védettséget eredményeznek, azaz csupán a legközelebbi rokon vírustörzsek ellen hatékonyak.

2.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia

A vírusok mozgásfehérjéje azok sejtről sejtre történő terjedését teszi lehetővé a fertőzött növényben. A mozgásfehérje mutált változatainak beépítésével számos esetben vírussal szemben ellenálló növényvonalakat állítottak elő. Az ilyen transzgéneket hordozó növények mutatták a legszélesebb, patogéntől származtatott rezisztenciát; azok számos vírustörzzsel, sőt fajjal szemben ellenállónak bizonyultak.

A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) mozgásfehérjegénjének mutált szekvenciájával sikeresen váltottak ki ellenállóságot transzformált dohánynövényekben.

A fehérhere mozaik vírus (white clover mosaic potexvirus) mutáns 13 kD méretű fehérjéjének beépítésével



olyan dohánynövényeket állítottak elő, melyek nem csupán az eredeti vírusra nézve voltak ellenállóak, hanem két további, a Potexvirus nemzetségbe tartozó, valamint egy Carlavirus nemzetségbe tartozó vírussal szemben is. Szintén több génusz képviselőire terjedt ki a védettség azokban az esetekben, amelyekben burgonyanövényeket transzformáltak burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), illetve burgonya X-vírus (potato X potexvirus) módosított mozgásfehérjéivel. Az előbbi esetben a védettség burgonya X-vírusra, valamint burgonya Y-vírusra, míg az utóbbiban egy Potexvirus és két Carlavirus nemzetségbe tartozó vírusra is kiterjedt.

A mozgásfehérjét kódoló vírusgénnel transzformált növényekben ez a fehérje (vagy ennek mutációs változata) elfoglalhatja a plazmodezmákon található kötődési helyeket, ezáltal kompetitív módon gátolhatja a vírus eredetű, funkcióképes mozgásfehérje kötődését, amivel megakadályozza a kórokozó sejtről sejtre történő terjedését. Hordozhat a növénybe épített mozgásfehérjét kódoló gén olyan mutációt is, ami azzal jár, hogy ez a fehérje verseng a normális mozgásfehérjével, ami szintén gátolja a kórokozó terjedését.

2.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia

A szatellit RNS-ek olyan kisméretű molekulák, melyek egyes vírustörzsekkel együtt fertőznek. Jellemző rájuk, hogy csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak. Maga az RNS nem mutat homológiát a segítő vírus genomjával (rövid szakaszoktól eltekintve), és fehérjét nem kódol. A szatellit RNS-ek néhány gazdanövényen módosítják (erősítik vagy gyengítik) a segítő vírus tüneteit. Ebből ered a szatellit RNS-ek felhasználásának lehetősége, de kockázata is.

A szatellit RNS jelenléte sok esetben enyhíti az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzés tüneteit. A szatellit RNS-szekvenciákat kifejező transzgénikus dohánynövények rezisztensek az uborka mozaik vírus, valamint a vele rokonságban álló paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) fertőzéssel szemben (Harrison et al., 1987). A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) szatellit RNS-szekvenciáit kifejező dohányok ellenállónak bizonyultak a vírusfertőzéssel szemben (Gerlach et al., 1987). Ennek a módszernek a kockázata részben abból ered, hogy előfordulhatnak a szatellit RNS és a segítő vírus olyan kombinációi is, amelyek a tünetek súlyosságát fokozzák. Másrészt a gyenge, illetve a súlyos tüneteket okozó kombinációk gyakran csak néhány nukleotidban különböznek egymástól. Mivel a szatellit RNS gyakran szenved mutációt, fennáll a veszélye annak, hogy a transzgénikus növényben esetleg új, virulensebb törzs keletkezik (Harrison, 1992).

2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia

A defektív interferáló (DI) RNS-ek a vírusgenom deléciós származékai. A szatellit RNS-ekhez hasonlóan a DI-RNS-ek is csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak, nukleotidsorrendjük azonban szinte teljes egészében megegyezik a vírusgenom egyes szakaszaival. A DI-RNS-ek jelenléte gyakran gyengített betegségtüneteket okoz az adott gazdanövényen.

Kollár et al. (1993) új típusú vírusellenállóságot értek el Nicotiana benthamiana növényekben a Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) DI RNS-ének beépítésével. A transzgénikus növények genomjába integrálódott vírusszekvenciáról DI-RNS transzkriptumok íródtak át, ami azt eredményezte, hogy a vírussal történt felülfertőzés után teljesen elmaradtak a betegségre egyébként jellemző súlyos tünetek, a csúcsi nekrózis és az azt követő teljes növénypusztulás.

2.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa

Ha a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) köpenyfehérjéből néhány aminosavat lehasítottak, akkor az így „megcsonkított” fehérje alkalmatlan volt a rezisztencia indukálására a transzgénikus növényekben (van Dun et al., 1988). A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegén az AUG transzlációs start kodon nélkül szintén nem közvetített vírusellenállóságot (Powell et al., 1990). Ezekből a megfigyelésekből azt a következtetést vonták le, hogy nem a messenger RNS (mRNS), hanem annak transzlációs terméke, a fehérje felelős a rezisztencia kialakításáért. A köpenyfehérjegén magasabb szintű kifejeződése a rezisztencia magasabb szintű állapotához vezetett (Hemenway et al., 1988; Powell et al., 1990). Újabban azonban egyre több bizo-nyíték utal arra is, hogy a köpenyfehérjegén által transzformált növényekben a rezisztenciát nem mindig a fehérje közvetíti. A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni rezisztencia a transzgénikus burgonyavonalakban úgy nyilvánult meg, hogy a fehérjét a növényekben nem sikerült kimutatni. Néhány esetben a köpenyfehérjegén antiszensz orientációban beültetve is védelmet nyújtott (Kawchuk et al., 1991; van der Wilk et al., 1991). Ezek a tanulmányok azt igazolják, hogy a vírus köpenyfehérjegénjei különböző típusú rezisztenciát indukálhatnak a transzgénikus növényekben.



Számos vizsgálat utal arra, hogy a köpenyfehérjegén megnyilvánulása gátolja a fertőzés korai eseményeit. A rezisztencia a dohány mozaik, a lucerna mozaik és a dohány csíkosság (tobacco streak ilarvirus) vírusok esetében megszűnt akkor, ha a fertőzéseket a vírus nukleinsavával és nem a komplett virionokkal végezték (Loesch-Fries et al., 1987; Nelson et al., 1987; van Dun et al., 1988). Ezen megfigyelésekre alapozva azt a következtetést lehetett levonni, hogy a köpenyfehérje által közvetített rezisztencia esetében a fertőzött sejtekben a virionok szétválása (dekapszidáció) gátlódik. A csak nukleinsavat tartalmazó inokulum azért törte át a rezisztenciát, mert ezekben az esetekben a fertőzéshez nem volt szükség a dekapszidációra (Register és Beachy, 1988). Ezzel ellentétben a burgonya X-vírus RNS-ével történő inokulálás nem szüntette meg a transzgénikus növények rezisztenciáját (Hemenway et al., 1988). A fertőzés korai eseményeinek gátlása három módon lehetséges: 1. a vírus nem tudja „levetni” a fehérjeburokját, ezért nem indulhat el a vírusgének transzlációja. Az is elképzelhető, hogy a transzgén által kódolt köpenyfehérje blokkolja azokat a növényi sejtben meglévő receptorokat, amelyekhez a vírus a fertőzés során kötődik; 2. a köpenyfehérjétől megszabadult nukleinsav a transzgénikus növényben termelődött köpenyfehérjével újra beburkolódik (enkapszidálódik), ezáltal nem tud fertőzni; 3. a köpenyfehérje a vírus RNS-replikációját befolyásolja (Baulcombe, 1996).

A legtöbb köpenyfehérjegén által közvetített rezisztencia esetén a fertőzés után a szisztemikus tünetek később jelennek meg, vagy egyáltalán ki sem alakulnak. Ez a vírus sejtről sejtre történő terjedésének, a vírussal inokulált levélből a szállítószövet-rendszerbe történő áramlásának, a nem inokulált levelekbe történő behatolásának vagy ezekben a levelekben a fertőzés kezdetének a gátlásából adódhat (Beachy et al., 1990). Wisniewski et al. (1990) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-ével történő fertőzés után összehasonlította a vírus terjedését a transzgénikus és a nem transzgénikus növényekben. A vírus terjedése a fertőzési hely szűk környezetében (1–3 mm) mindkét típusú növény esetében hasonló volt, míg azoktól nagyobb (5–10 mm) távolságokra, illetve más levelekbe a vírus csak a nem transzgénikus növények esetében jutott el. A nem transzgénikus növényben a dohány mozaik vírus részecskék a szállítószövet-rendszerben és a csúcsi szövetekben hét nappal korábban jelentek meg, mint a transzgénikus növényekben. Egyes megfigyelések szerint a köpenyfehérjegénnel transzformált növényekben a víruspartikulumok nem léptek be a szállítószövet-rendszerbe (Cassab és Varner, 1987).

2.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa

A vírusszekvenciákkal transzformált növényekben fellépő ellenállóság lehet fehérjék vagy RNS által közvetített rezisztencia; az előbbi általában széles spektrumú, több vírus ellen érvényesül, de gyengébb hatékonyságú, az utóbbi a vírusok szűkebb körére terjed ki, ám nagy inokulumtömeg ellen is hatékony (Király és Hornok, 1996a, b). Az RNS közvetítette ellenállóság annak köszönhető, hogy specifikus, a megcélzott vírus RNS-ét érintő degradációs mechanizmus működik a transzgénikus növények sejtjeiben (Baulcombe 1996). Ezt a specificitást áltatában a transzgén nukleinsavsorrendje biztosítja. Újabban azonban olyan eseteket is leírtak, melyekben caulimo- és nepovirusok elleni rezisztencia homológ nukleáris gén (transzgén) hiányában alakult ki.

Feltételezik, hogy az említett citoplazmatikus RNS-degradáló folyamatot rövid, a célszekvenciával komplementer RNS-ek de novo szintézise és anellálása (hibridizációja) váltja ki (Goodwin et al., 1996). Az RNS által közvetített rezisztencia tanulmányozása nagymértékben hozzájárult a transzkripciót követő gén-lecsendesítés (posttranscriptional gene silencing) felfedezéséhez. Ez az adaptív mechanizmus nem csupán az inokulált levélben indukálódik, hanem az egész növényben elterjed, ami valamilyen jelátvivő rendszert feltételez (Voinnet and Baulcombe, 1997). Bár a növényeknek ez az – úgy tűnik – általános, adaptív védekező rendszere mind jobban jellemzett, az abban részt vevő biokémiai folyamatokról ma még keveset tudunk. Azt, hogy a gén-lecsendesítésnek valóban fontos szerepe lehet a vírusok elleni védelemben, az is megerősíti, hogy azok különböző mechanizmusokat fejlesztettek ki a növényi válaszreakció elkerülésé-re. A potyvirusok segítő komponens fehérjéjéről (HCPro), valamint a cucumovirusok 2b fehérjéjéről kimutatták, hogy azok aktívan visszaszorítják a gén-lecsendesítést (Kasschau and Carrington, 1998; Brigneti et al., 1998). E jelenségek vizsgálata ma a növényi molekuláris biológia legintenzívebben kutatott területei közé tartozik.

Ma már nyilvánvaló, hogy nem csak a vírus köpenyfehérjéje közvetítheti a rezisztenciát. 1990 óta növekszik azon ellenálló vonalak száma, amelyek a vírusok nem strukturális génjeit (nem köpenyfehérje-gént) hordozzák és expresszálják. Ilyen sikeresen alkalmazott gének a replikáz enzim és a mozgásfehérje (movement protein) génjei. Ezen túlmenően a vírusgenom számos, fehérjét nem kódoló részével (DI-RNS-ek, szatellit RNS-ek, mutáns, nem transzlálható genomi szekvenciák) sikerült betegség-ellenállóságot kiváltani. Ebből az az általános következtetés vonható le, hogy elméletileg bármely vírus eredetű szekvencia alkalmas arra, hogy valamilyen szintű ellenállóságot váltson ki a transzgénikus növényben (Lomonossoff, 1995).

2.3. Egyéb rezisztenciagének



A rezisztenciagének termékei valamilyen módon blokkolják a vírus szaporodását, növényen belüli mozgását, vagy csökkentik patológiai hatásait. Korlátozott eredményekkel járó kísérleteket végeztek abból a célból, hogy ezeket a hatásokat megtervezett módon, mesterségesen (nem természetes rezisztenciagénekkel, ill. vírusgénekkel) váltsák ki (Wilson, 1993). Ezeket a kísérleteket a növényi genomba ültetett gének alapján a következők szerint csoportosítjuk:

a. Ribozimokat kódoló gének. A ribozimok olyan RNS-molekulák, melyek endonukleáz enzimekhez hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek. Képesek egy másik RNS-molekulát specifikusan felismerni, és azt adott helyen elhasítani. Több esetben olyan előre megtervezett ribozimokat ültettek a növényekbe, amelyek egy adott vírus fertőzése esetén, annak RNS-genomját elhasították, gátolva így a vírus replikációját. A módszer hátránya, hogy a ribozim és a vírus nukleinsavsorrendjének szinte tökéletesen egymást kiegészítőnek (komplementernek) kell lennie, így ez a hatás csak a vírusok szűk körére vonatkozhat. A védettség ugyanakkor csak kismértékű, mivel a sejtben gyorsan replikálódó vírus-RNS-ek invázióját a ribozimok csak korláto-zott mértékben tudják közömbösíteni. A tünetek kialakulásának enyhe késését figyelték meg dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben terve-zett ribozimot kifejező dohánynövényeken, amikor azokat híg koncentrációban fertőzték.

b. Antitesteket kódoló gének. Az antitestek az állati immunrendszer elemei, olyan proteinek, melyek egy másik makromolekulát, annak jellemző részeit (epitópjait) specifikusan felismerik és megkötik. Ha egy növénykórokozó vírus ellen előállított antitestet a növényi sejtbe juttatnak (a növényben expresszáltatják), az nagy valószínűséggel ott is képes lesz az adott vírus megkötésére. Ez a kapcsolódás pedig gátolhatja a kórokozó szaporodását vagy elterjedését. Tavladoraki et al. (1993) ezzel a megoldással alakított ki rezisztenciát a Nicotiana benthamiana növényekben az articsóka tarka fodrosodás vírus (artichoke mottled crinkle tombusvirus) ellen. Mindazonáltal az e területen folyó kutatások még kezdeti stádiumban vannak. A módszer gyakorlati értékét egyelőre megkérdőjelezi az antitestek összeépülésének bizonytalansága és alacsony koncentrációja a növényi citoplazmában.

c. Antiszensz vírusszekvenciák. Ebben az eljárásban, akárcsak az antitestek növényben történő felhasználása esetében, úgy kívánják gátolni a kórfolyamatot, hogy a vírus makromolekuláit megkötik. Ha egy RNS-genomú vírus cDNS klónjai rendelkezésre állnak, azokat promóter mögé építve, negatív orientációban is integrálni lehet a növény genomjába. Az ilyen, úgynevezett „antiszenz” transzgénekről keletkező transzkriptumok, szekvencia-komplementaritásuk következtében, hibridizálnak a citoplazmában a vírus RNS-kel, ami – valószínűleg többirányú mechanizmusokon keresztül – blokkolja az RNS működését. Azok a kísérletek, amelyeket az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) valamely genomrészletének antiszensz RNS-ével végeztek, csekély eredménnyel jártak. Néhány esetben azonban gyenge védelmet sikerült elérni a vírusfertőzéssel szemben.

d. „Öngyilkos gének”. Az ebben az eljárásban használt gének rendkívül erős fitotoxinokat kódolnak (például ricin vagy diftéria toxin). Az „öngyilkos” elnevezés onnan ered, hogy e gének mindaddig működésképtelenek, míg egy adott vírus meg nem jelenik a sejtben. Ezeket a toxin géneket ugyanis negatív (antiszensz) orientációban építik be a növénybe, így a róluk átírt RNS-transzkriptum „értelmetlen”. E transzkriptumok azonban tartalmazzák egy adott vírus RNS-polimeráz enzimje promóter régióját is. Vírusfertőzés esetén ez az enzim átírja a toxin-RNS „értelmes” szálát, amelyről azonnal megindul a fehérjeszintézis. A keletkező, erősen toxikus fehérjék pedig az egész sejtet – gyakran a környező szöveti régiókkal együtt – elpusztítják, mielőtt a kórokozó továbbterjedne a növényben. Diftéria toxint és burgonya X-vírus szubgenomi promóter régiót tartalmazó konstrukcióval transzformált növényekben a vírus koncentrációja 1/20-a volt a negatív kontrollnövényekben lévőhöz képest.

2.3.1.

2.3.1.1.

2.3.1.1.1. Nem növénykórokozó mikroorganizmusok génjeivel indukált rezisztencia

Sok olyan mikroszkopikus gombafaj ismert, amelynek egyedeiben több-kevesebb gyakorisággal találhatunk vírusszerű partikulumokat (virus-like particles, VLP), kettős szálú RNS- (double stranded, dsRNS) genommal. A legtöbb gomba látszólag alkalmazkodott ehhez az állapothoz, mások viszont védekeztek a VLP-k ellen. A Schizosaccharomyces pombe fajból klónozták a pac1 gént, amely dsRNS molekulákat bontani képes RNázt kódol (Iino et al., 1991). Amikor ezt a gént átvitték dohányba, a transzformált növények fokozottan ellenállóvá váltak a paradicsom mozaik vírussal (tomato mosaic tobamovirus) szemben, de az uborka mozaik vírussal és a



burgonya Y-vírussal fertőzött növényeken is késleltetve jelentek meg a tünetek (Watanabe et al., 1995). A meglepő védettséget a szerzők azzal magyarázták, hogy az egyszálú növényvírusok szaporodása során kettős szálú replikációs intermedierek is keletkeznek, és az említett gomba eredetű RNáz ezeket támadja meg.

2.3.1.1.2. Riboszóma-inaktiváló fehérjék által indukált rezisztencia

Vírusok ellen biztosítanak védelmet a riboszóma-inaktiváló fehérjék (ribosome inactivating proteins, RIP). Közülük a Phytolacca americana fajból származó komponens, a PAP igen hatékony inhibítora számos növényi vírusnak. Az egyes RIP-ek specifitása nagyon eltérő. Amikor a P. americana PAP génjét dohányba vitték, sok növényegyed súlyosan károsodott, másokban viszont csekély mértékű volt a transzgén expressziója, így ezeken nem jelentkeztek látható tünetek. Ez utóbbiak ugyanakkor ellenállóaknak bizonyultak a burgonya X-vírus, a burgonya Y-vírus, valamint az uborka mozaik vírussal szemben (Lodge et al., 1993).

2.3.1.1.3. Magasabb rendű állatok génjeivel indukált rezisztencia

Egészen különleges lehetőséget kínálnak a magasabb rendű állatokból származó, növényvírusok ellen védelmet nyújtó gének. Truve et al. (1993) a patkány 2–5A szintetázát kódoló génjével transzformálták a burgonyát, és ezzel szabadföldi körülmények között is megnyilvánuló ellenállóságot értek el a burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben. Ismert, hogy a 2–5A szintetáz az emlőssejtek interferon által indukált antivirális védekezési reakciójában vesz részt oly módon, hogy aktiválja a vírus eredetű RNS-molekulák bontását végző RNázt.

3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genombaA rezisztenciagének forrásától (például természetes rezisztenciagének, vírusgének, „öngyilkos” gének) függetlenül szükség van azok bevitelére a növényi genomba. Ezt az eljárást növénytranszformációnak nevezzük, mivel általa örökíthető módon új tulajdonságot lehet bevinni a növénybe. A transzformációs módszerek két csoportba sorolhatók: 1. indirekt transzformáció és 2. direkt transzformáció. Amennyiben a génbevitel hordozó (vektor) organizmus alkalmazásával történik, indirekt transzformációról beszélünk. Direkt transzformáció során a DNS passzív módon (mechanikai, kémiai úton vagy elektroporációval) jut a sejtbe. E sejtekből azután egész növényeket regenerálnak, melyekben tehát a sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt DNS-szekvenciát. A növénytranszformálás előfeltétele a jól működő regenerációs rendszer, amelynek segítségével növényegyedek állíthatók elő.

3.1. Az agrobaktériumos transzformálásA kétszikűeknél a legáltalánosabb, de újabban az egyszikű növényeknél is megjelent az Agrobacterium tumefaciens (illetve az Agrobacterium rhizogenes) vektor felhasználásával történő génbevitel. Ezek a Gram-negatív talajbaktériumok a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik és tumorokat okoznak rajtuk. A baktériumok patogenitása öszszefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével. A Ti plazmid egy része (transzfer DNS = T-DNS) a kórfolyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába integrálódik (Süle, 1985; Filippone és Penza, 1992). A T-DNS régióban helyezkednek el a tumorok kialakulásáért felelős gének, míg a T-DNS átvitelét szabályozó gének mindvégig a baktériumsejtben lokalizáltak. Ha a tumorindukálók helyére más géneket építenek be, azok éppúgy integrálódnak a növényi genomba. E rendszer felhasználásával a növények gyakorlatilag bármely génnel transzformálhatók (109. ábra).

109. ábra - A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után]



A T-DNS szakaszt hordozó plazmidot, amelybe a kívánt gén egyszerűen beépíthető, klónozó plazmidnak nevezik. A növénytranszformálás gyakorlatában a T-DNS a következő régiókat tartalmazza (110. ábra):

a. Szelekciós marker gén (antibiotikum- vagy herbicid-rezisztenciagén) megfelelő promóter és terminációs régiók között, melyek a gén működését, expresszióját (kifejeződését) teszik lehetővé.

b. A hasznos gén (például rezisztenciagén, vírus-cDNS-szekvencia) szintén promóter- és terminációs régió között.

c. Határoló régiók. Ezek a T-DNS „jobb és bal oldali” végei, amelyek a szakasz integrálódásához nélkülözhetetlenek.

110. ábra - A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött

A marker gén (leggyakrabban a kanamicinrezisztenciát eredményező neomicin-foszfotranszferáz gén-nptII) bevitele azért szükséges, hogy segítségével a regenerálás során a transzformáns növények szelektálhatók legyenek. A növénytranszformálás folyamán alkalmazott lépések növényi rendszerenként eltérőek. Az általános lépések azonban a következők:

A klónozó plazmidot (rajta a beépíteni kívánt génnel) tartalmazó Agrobacterium sejteket egy éjszakán keresztül folyékony táptalajban fölszaporítják. A plazmidok hordoznak olyan antibiotikum-rezisztenciagéneket is, amelyek baktériumpromóter mögött vannak. Így, ha a folyékony táptalajhoz megfelelő antibiotikumot is adnak, akkor csak azok a sejtek szaporodnak föl, amelyek a kívánt plazmidot tartalmazzák. Ebbe a baktériumszuszpenzióba mártják néhány másodpercre a megsebzett levél- vagy szárrészt. Ekkor megy végbe az Agrobacterium fertőzés és a génátvitel. Ezt az explantumot aztán szilárd regeneráló táptalajra helyezik, ahol megindul a kalluszképződés, majd a hajtásregenerálás. A gyökérregeneráláshoz a fiatal hajtásokat általában gyökereztető táptalajra helyezik. Ez már kétféle antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalaj. Az egyik



antibiotikum az augmentin, vagy cefotaxim, mely a növénykék felületén esetleg átvitt Agrobacterium sejteket pusztítja el, a másik a T-DNS-en bevitt marker génnek megfelelő antibiotikum (általában kanamicin), melynek hatására csak a transzformáns (a marker gént, tehát a T-DNS-t hordozó és expresszáló) hajtások gyökereznek meg.

A fentiekben csupán nagy vonalakban ismertettük a rutinszerű dohánytranszformálás főbb lépéseit. Sok esetben például nem differenciálódott levélszöveteket, hanem kalluszt transzformálnak, és a kalluszsejteket órákig együtt tenyésztik az Agrobacterium sejtekkel. Többszöri átoltási lépések után organo- vagy embriogenezis útján regenerálják az utódnövényeket. Az agrobaktériumos transzformálásban egységes protokoll nincs, a tenyésztési lépések növényfajoktól és -fajtáktól, valamint laboratóriumoktól függően mások és mások.

A burgonyanövények (Solanum tuberosum) transzformálása (Dietze et al., 1995)

a. Transzformálásra alkalmas növények előállítása. Vírusmentes steril növények 15-15 mm-es hajtáscsúcsait 90 ml 2MS (0,7% Bitec agar, Difco) táptalajra oltjuk félliteres befőttesüvegekben. Négy héttel később 5–6 db, sötétzöld levelet gyűjtünk be.

b. Az Agrobacterium tumefaciens-t 5 ml (a vektorplazmidnak megfelelő antibiotikumot tartalmazó) YEB táptalajba oltjuk le 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban, és egy éjszakán át 28 °C-on rázatjuk (130 rpm).

c. A leveleket üres Petri-csészébe helyezzük, levágjuk a levélalapi részt és egy éles zsilettpengével két, 1–2 mm hosszúságú vágást végzünk egymástól 4–5 mm távolságra úgy, hogy a vágások keresztezzék a levél főerét.

d. Tíz ilyen levelet fonákával fölfelé 10 ml 2 MS (folyékony) táptalajt tartalmazó Petri-csészébe, a tápoldat felszínére helyezünk, anélkül hogy a leveleket alámerítenénk. Ehhez 50 μl késői, logaritmikus fázisban lévő Agrobacterium kultúrát adunk, és az elegyet óvatosan összekeverjük. A Petri-csészét két napra 22–24 °C-ra helyezzük.

e. A leveleket fonákukkal lefelé kallusz-indukáló táptalajra (CIM) tesszük úgy, hogy a teljes levélfelület érintkezzen a táptalajjal. A vágási helyeken először kisméretű kalluszok jelennek meg.

f. Hét nap elteltével a leveleket hajtás-indukáló táptalajra helyezzük (SIM), ahol megjelennek az első hajtások.

g. Amikor a hajtások elérték az 1–1,5 cm-es hosszúságot, azokat gyökereztető táptalajra (RIM) helyezzük át. Ehhez a lépéshez célszerű 250 ml-es, 70 ml táptalaj tartalmú üveget használni. Három vagy négy héttel később a gyökerekkel és levelekkel rendelkező növénykék tovább szaporíthatók, illetve üvegházba ültethetők.

Dietze et al. (1995) a szövettenyésztés során a 16 órai megvilágítást követően 22 óráig tartó sötét periódust és 3000 lux fényintenzitást alkalmaztak. A transzformáns növényekre a kallusz-indukáló (CIM) és a hajtás-indukáló (SIM) táptalajon a riporter génnek megfelelő antibiotikummal (kanamicin vagy higromicin stb.) szelektáltak. Az itt ismertetett eljárás segítségével levelenként két-három transzformáns regenerálható.

Táptalajok

a. YEB: 0,1% élesztőextraktum; 0,5% marhahúsextraktum; 0,5% pepton; 0,5% szaharóz; 0,49 g/l MgSO4 × H2O. A megfelelő antibiotikumot sterilezés után a már szobahőmérsékletre lehűlt táptalajhoz adjuk.

b. MS táptalaj: Makroelemek: 1650 mg/l NH4NO3; 1900 mg/l KNO3; 440 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 370 mg/l MgSO4

× 7 H2O; 170 mg/l KH2PO4. Mikroelemek: 6,2 mg/l H3BO3; 16,9 mg/l MnSO4 × H2O; 10,6 mg/l ZnSO4 × 7 H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O; 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O; 27,5 mg/l FeSO4 × 7 H2O. Vitaminok: 0,5 mg/l nikotinsav; 0,5 mg/l piridoxin HCl; 0,1 mg/l tiamin HCl; 2,0 mg/l glicin; 100 mg/l mio-inozit. Szilárd táptalaj esetén szükséges még 0,7% agar hozzáadása. A táptalaj pH-ját 5,7–5,8 értékre 1 M KOH-oldattal állítjuk be. A táptalaj sterilezése 121 °C-on 20 percig történik.

c. Kallusz-indukáló táptalaj (CIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 5 mg/l naftolecetsav (NAA); 0,1 mg/l benzilaminopurin (BAP); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy 1 mg/l higromicin.

d. Hajtás-indukáló táptalaj (SIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 2 mg/l zeatin; 0,02 mg/l naftilecetsav (NAA); 0,002 mg/l gibberellinsav (GA3); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kamicin vagy higromicin.



e. Gyökereztető táptalaj (RIM): MS táptalaj; 250 mg/l klaforán.

3.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussalAz Agrobacterium segítségével végzett növénytranszformálás az egyszikű növényeknél általában nem alkalmazható. Alternatív eljárás a protoplasztok transzformálása polietilén-glikol- (PEG) oldatban. A PEG képes megbontani a sejtmembrán folyamatosságát, és a keletkező pórusokon a DNS passzív módon bejuthat a sejtbe, ahol a genomba integrálódhat. Makropórusok ugyanakkor elektromos impulzussal is létrehozhatók. Ez utóbbi módszerrel nemcsak protoplasztokba, hanem intakt növényi sejtekbe is képesek DNS-t juttatni. Ma mindkét eljárást széleskörűen alkalmazzák.

3.3. Génátvitel biolisztikus módszerrelE módszer alkalmazható a legszélesebb körben intakt sejtek transzformációjára. A bejuttatni kívánt DNS-t 1–2 μm átmérőjű wolframrészecskékre rögzítik, majd ezeket nagy sebességre gyorsítják – általában nagynyomású He-, illetve N2 gázzal. A részecskék eltalálják a célszövetet, és behatolnak a részlegesen sérült sejtekbe. A részecskék felületén bevitt DNS azután integrálódhat a növény genomjába.

A „génpuskával” történő növénytranszformálás valójában óriási előrelépést jelentett a transzgénikus növények előállításában, mivel számos gazdaságilag jelentős fajta transzformációját tette lehetővé.

3.3.1.

3.3.1.1.

3.3.1.1.1. A biotechnológia mint új és hatékony eszköz

Az elmúlt évtized biológiai, biokémiai és molekuláris biológiai felfedezései egyre közelebb vitték az emberiséget ahhoz, hogy az egyes szervezetek működését ellenőrző géneket megismerjék és az adott keretek között szinte korlátlan módon megváltoztassák. A génsebészet, ill. a génátültetés módszereinek felhasználásával forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben is (Balázs és Gáborjányi, 1984; Monti, 1992a, b). 1998-ban a transzgénikus növényfajták termesztési területe csaknem elérte a 40 millió hektárt. Ewe (1998) szerint 1-2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a transzgénikus növény lesz. A tendenciára jellemző, hogy az Amerikai Egyesült Államokban 2154, Japánban 2055, Németországban 629 géntechnológiai úton előállított növényre jelentettek be szabadalmat (Janositz, 1998).

Új, transzgénikus fajták termesztésbe vétele azonban bizonyos kockázatokkal is jár. Vírusellenálló növények esetében ezek sokkal kevésbé egészségügyi, mint inkább ökológiai jellegű kockázatok (Bartsch et al., 1996a, b; Parker és Bartsch, 1996; Bartsch és Pohl-Orf, 1996; Tepfer és Balázs, 1997). Rendkívül fontos ezért az ilyen fajták kontrollált engedélyezése és termesztésbe vétele. E rendelkezéseket Magyarországon a géntechnológiai tevékenységről szóló 1998. Évi XXVII. Törvény tartalmazza. Úgyszintén fontos feladat a nyilvánosság pontos tájékoztatása a biotechnológia eredményeiről a megalapozatlan félelmek eloszlatása érdekében (Jones, 1994; Deshayes, 1994; Balázs, 1997).


20. fejezet - Függelék1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének) ellenőrzése és megakadályozásaA növényvírusok okozta igen jelentős gazdasági károk csökkentésére az elmúlt években szükség volt a külföldről behozott, az országon keresztülhurcolt és az országból kivitt vírusokkal kapcsolatos intézkedésekre. Ezeket a megnövekedett nemzetközi árucsere-forgalom, valamint az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának határozata is indokolta. A növényvédelmi intézkedések szigorú betartásában ezért alapvetően érdekeltek vagyunk (Kalmár et al., 1994).

1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatokAz Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi Határozatai részletesen megtalálhatók a Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás által szerkesztett kiadványban (Szemessy és Szőnyegi, 1993). A terjedelmes rendelkezések minden részletre kiterjedően intézkednek a növények vagy növényi termékek károsítóinak az Európai Közösségbe történő behurcolásával, valamint a Közösségen belüli elterjedésével kapcsolatban. A „Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek” c. egyetemi tankönyvben csak a vírusokra, ill. a vírusszerű kórokozókra vonatkozó ismereteket tárgyaljuk. A „Növény-egészségügyi határozat” olyan kifejezéseket tartalmaz (pl. növények; növényi termékek; ültetés (telepítés), vetés; ültetésre (telepítésre), vetésre szánt növények; károsítók; növényútlevél; hivatalos növényvédelmi szolgálat; bármely állami hatóság; védett zóna; nyilatkozat vagy intézkedés), amelyek jelentésének egyértelmű meghatározása feltétlen kívánatos.

1.1.1.

1.1.1.1.

1.1.1.1.1. Növények

Ide tartoznak az élő növények és azok élő részei, beleértve a vetőmagvakat is. Élő növényeknek és azok részeinek tekinthetők a termések (a fagyasztással tartósított gyümölcsök kivételével); a zöldségfélék (fagyasztottak kivételével); a gumó, hagyma, hagymagumó, rizóma; a vágott virágok; a leveles ágak; a leveleit megtartó vágott fa és a növényi szövettenyészet.

1.1.1.1.2. Növényi termékek

Ide tartoznak a fel nem dolgozott vagy csak egyszerű előkészítésnek alávetett növényi eredetű termékek.

1.1.1.1.3. Ültetés (telepítés)/vetés

A növények talajba (termesztő közegbe) helyezése, amellyel biztosítani lehet fejlődésüket, szaporodásukat.

1.1.1.1.4. Ültetésre (telepítésre)/vetésre szánt növények

Azok a növények, amelyeket már kiültettek vagy elvetettek, vagy az eredeti közegben maradtak, vagy hazahozataluk után újratelepítettek. Ide tartoznak azok a növények is, amelyeket behozatalukkor nem ültettek ki és nem vetettek el, hanem azt később kívánják megtenni.

1.1.1.1.5. Károsítók

A növények vagy növényi termények károsítói azok, amelyek az állat- vagy növényvilághoz tartoznak, vagy amelyek vírusok, fitoplazmák vagy egyéb kórokozók.

1.1.1.1.6. Növényútlevél


Függelék

Hivatalos címke, amely azt bizonyítja, hogy a jelen határozat növény-egészségügyi követelményekre és különleges előírásokra vonatkozó rendelkezéseit betartották, és amelyet az Európai Közösségi szinten a különböző növény- vagy növényi terméktípusokra egységesítettek, és amelyet bármely tagország hivatalos testülete készített elő, állított ki a növényútlevél kiállítási eljárásának részleteit szabályozó végrehajtási rendelkezések szerint.

1.1.1.1.7. Hivatalos, felelős testület

Növényvédelmi Szolgálat, vagy bármely más állami hatóság, amelyet országos vagy regionális szinten állítottak fel az országos hatóság felügyelete alatt, az érintett tagország alkotmányos keretein belül.

1.1.1.1.8. Védett zóna

Védett zónának az a terület tekintendő, amelyben a határozatban említett egy vagy több károsító még nem honos, vagy nem telepedett meg a kedvező körülmények ellenére sem, jóllehet az Európai Közösség egy vagy több részén már megtelepedett. Továbbá védett zónának tekintendő az a terület is, amelyen fennáll a veszélye annak, hogy bizonyos károsítók megtelepednek az adott növények számára kedvező ökológiai viszonyok mellett, annak ellenére, hogy ezek a károsítók nem honosak vagy nem telepedtek még meg az Európai Közösségben. Megjegyzés: egy károsító akkor tekinthető megtelepedettnek, ha az ott előfordul, és ha hivatalosan nem intézkedtek megsemmisítéséről, vagy az intézkedések legalább két egymást követő éven át hatástalannak bizonyultak.

1.1.1.1.9. Nyilatkozat vagy intézkedés

A nyilatkozat vagy intézkedés akkor tekinthető hivatalosnak, ha azt a tagország hivatalos növényvédelmi szervezetének a képviselője – vagy annak felelőssége mellett más köztisztviselő – hozza (teszi meg). Egyéb esetekben a már említett képviselő vagy köztisztviselő vagy a meghatározott hivatalos felelős testület egyike által alkalmazott „kvalifikált ügynök” (ha nincs személyes érdekeltsége az általa hozott intézkedések kimenetelében, és megfelel a képesítés minimális követelményeinek) nyilatkozik (intézkedik). E tekintetben a tagországoknak kell biztosítani, hogy köztisztviselőik és ügynökeik kvalifikáltak legyenek.

1.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok

Az e csoportba tartozó károsítókat a 35. táblázat tartalmazza. A károsítók (kórokozók) között vírusok (27), fitoplazmák (5), viroid (1) és rickettsia (1) kórokozók vannak. A karantén vírusok 14 nemzetségbe tartoznak: Begomovirus, Bigeminivirus, Bromovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Comovirus, Crinivirus, Ilarvirus, Luteovirus, Nepovirus, Potexvirus, Potyvirus, Rhabdovirus, Tymovirus. Két vírus [paradicsom Florida vírus (tomato Florida virus), őszibarack mozaik vírus (amerikai), peach (American) mosaic virus] rendszertani helye pontosan még nem ismert. A 35. táblázatban felsorolt burgonyapatogén vírusok (burgonya A-vírus, burgonya M-vírus, burgonya S-vírus, burgonya V-vírus, burgonya X-vírus, burgonya Y-vírus, burgonya levélsodródás vírus) és a burgonya orsósgumójúság viroid nem európai izolátumai tekintendők karantén kórokozóknak.

35. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1

A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve

Burgonyapatogén kórokozók

Burgonya andeszi látens vírus

Burgonya andeszi foltosság vírus

Arracacha B-vírus

Burgonya fekete gyűrűsfoltosság vírus

Burgonya A-vírus*

Potato Andean latent tymovirus

Potato Andean mottle comovirus

Arracacha B ? nepovirus

Potato black ringspot nepovirus

Potato A. potyvirus

Potato M carlavirus


Függelék

Burgonya M-vírus*

Burgonya S-vírus*

Burgonya V-vírus*

Burgonya X-vírus*

Burgonya Y-vírus*

Burgonya levélsodródás vírus*

Burgonya orsósgumójúság viroid*

Potato S carlavirus

Potato V potyvirus

Potato üpotexvirus

Potato Y potyvirus

Potato leafroll polerovirus

Potato spindle tuber viroid

Egyéb vírusok és fitoplazma

Szilfa floem nekrózis fitoplazma


Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus

Bab aranysárga mozaik vírus**

Lóbab enyhe foltosság vírus**

Saláta fertőző sárgaság vírus**

Paprika enyhe „tigré” vírus**

Tök levélgöndörödés vírus**

Euphorbia mozaik vírus**

Paradicsom Florida vírus**

Elm phloem necrosis phytoplasma

Tobacco ringspot nepovirus

Tomato ringspot nepovirus

Bean golden mosaic begomovirus

Broad bean mild mottle bromovirus

Lettuce infectious yellows crinivirus

Pepper mild tigré ? bigeminivirus

Squash leaf curl bigeminivirus

Euphorbia mosaic bigeminivirus

Tomato Florida virus

Cydonia, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Ribes, Rubus, Vitis spp. vírus, fitoplazma

és rickettsia kórokozói és minden nem Európában előforduló kórokozói

Áfonya levélfoltosság vírus

Cseresznye érdeslevelűség vírus (amerikai)

Őszibarack (amerikai) mozaik vírus

Őszibarack ál-rickettsia

Őszibarack rozettás fitoplazma

Őszibarack X-betegség

Blueberry leaf mottle nepovirus

Cherry rasp \eafnepovirus

Peach (American) mosaic virus

Peach phony rickettsia

Peach rosette phytoplasma

Peach X-disease phytoplasma

Peach yellows phytoplasma


Függelék

fitoplazma

Őszibarack sárgaság fitoplazma

Szilva amerikai vonalas mintázottság vírus

Málna levélgöndörödés vírus (amerikai) Földieper látens C-vírus

Földieper érszalagosodás vírus

Földieper boszorkányseprűsödés fitoplazma

Plum American line pattern ilarvirus

Raspbery leaf curl ? luteovirus

Strawberry latens C ? rhabdovirus Strawberry vein banding ? caulimovirus

Strawberry witches’broom phytoplasma

1 A *-gal megjelölt vírusok nem európai törzsei (izolátumai). A **-gal megjelölt vírusok Bemísia tabaci vektorral terjednek.

1.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma kórokozók

Az ide tartozó kórokozók a következők: alma sarjburjánzás fitoplazma (apple proliferation phytoplasma), kajszi klorotikus levélsodródás fitoplazma (apricot chlorotic leafroll phytoplasma), körte pusztulás fitoplazma (pear decline phytoplasma).

1.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett zónákban tilos

Két vírus behurcolása és terjedése tilos négy védett zónában (országban). Ezek a következők: a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) behurcolása tilos Dániába, az Egyesült Királyságba (Észak-Írország) és Portugáliába, valamint a paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) behurcolása tilos Dániába.

1.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak

Az ide tartozó vírus, fitoplazma és viroid kórokozókat a 36. táblázat tartalmazza.

36. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve fontos vírus, vírusszerű és viroid kórokozók

A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus (nem európai izolátumok)

Beet curly top curtovirus

Beta vulgaris

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus

Rubus spp.

Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang viroid

Pálmáé spp. (európai országokon kívüli növények) telepítése esetén (magvak kivételt képeznek)

Cseresznye levélsodródás vírus* Cherry leafroll Rubus spp.


Függelék

nepovirus

Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus

Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus spp. és hibridjeik (termés és magvak kivételt képeznek)

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza dosterovirus (nem európai izolátumok)


Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus


Cseresznye aprógyümölcsűség vírus (nem európai izolátumok)

Cherry little cherry virus Prunus cerasus, P. avium, P. insica,

P. sargentii, P. serrula, P. serrulata, P. speciosa, P. subhirtella, P. yedoensis hibridjei és fajtái (magvak kivételével)

Citrus psorozis vírus (természetes úton terjedő)

Citrus psorosis virus Citrus, Fortunella Swingle,

Poncirus növényfajok és hibridek (termés és magvak kivételével)

Pálma letális sárgaság fitoplazma Palm lethal yellowing phytoplasma

Pálma spp. (nem európai országból származó) telepítése esetén (magvak kivételt képeznek).

Barack nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus*

Prunus necrotic ringspot ilarvirus

Rubus spp.

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus

Citrus, Fortunella Swingle,

Poncirus növények és hibridjeik (termés, magvak kivételt képeznek)

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus



Citrus boszorkányseprűsödés fitoplazma

Citrus witches’broom phytoplasma



* A megnevezett vírusok az Európai Közösségben, Rubus-fajokon nem fordulnak elő.

1.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus, vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók

E csoportba 11 vírus, 1 viroid, 2 fitoplazma és 1 spiroplazma tartozik (37. táblázat).

37. táblázat - Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve fontos károsítók


Függelék

A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények


Répa levélgöndörödés vírus

Arabis mosaic nepovirus

Beet leaf curl ? rhabdovirus

Fragaria és Rubus spp.

Beta vulgáris

(vetőmag kivételével)

Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt viroid

Dendranthema spp.

(magvak kivételével)

Citrus tristeza vírus (európai törzsek)

Citrus tristeza closterovirus

Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus spp.

(termés és magvak kivételével)

Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus spp.


Szőlő aranyszínű sárgaság fitoplazma

Grapevine Flavescence dorée phytoplasma

Vitis spp.


Szilva himlő vírus Plum ponpotyvirus Prunus spp.


Burgonya sztolbur fitoplazma

Potato slolbw phytoplasma

Solanaceae családba tartozó növények

(vetőmagvak kivételével)

Málna gyűrűsfoltosság vírus

Raspberry ringspot nepovirus

Fragaria, Rubus spp. (magvak kivételével)

Spiroplasma citri Spiroplasma citri Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus spp.


Földieper göndörödés vírus

Strawberry crinkle cytorhabdovirus

Fragaria spp.



Strawberry latent ringspot nepovirus



Földieper enyhe sárga levélszélűség vírus

Strawberry mild yellow edge-associated ? potexvirus

Fragaria spp.



Tomato black ring nepovirus




Függelék

Paradicsom bronzfoltosság vírus

Tomato spotted wilt tospovirus

Apium graveolens, Capsicum annuum, Cucumis melo, Dentran-hema növények.

Az Impatiens New Quinea hibridek összes fajtája. Mindazok a Lactuca sativa, Lycopersicon esculentum és Nicotiana növények, amelyekről bizonyított, hogy a növénytermesztés számára értékesítik őket. Ültetésre szánt Solanum melongena és S. tuberosum

1.2. Egyéb határozatokA „Növény-egészségügyi Határozat” (lásd Szemessy és Szőnyegi, 1993) I. és II. Függelékében a vírusokon és vírusszerű kórokozókon kívül kitér azokra az ismeretekre is, amelyek a baktériumokkal, gombákkal, rovarokkal, atkákkal, fonálférgekkel kapcsolatosak.

A „Növény-egészségügyi Határozat” III. Függeléke (A. rész) azokkal a növényekkel és növényi termékekkel, valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a tagországokba tilos. A B. rész azokkal a növényekkel és növényi termékekkel, valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a védett zónákba tilos.

A IV. Függelék A. része a növények, növényi termékek és egyéb anyagok tagországokba történő behozatalakor és a tagországokon belüli szállításakor valamennyi tagország által kötelezően alkalmazandó előírásokat foglalja magában. Az I. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösségen kívüli területekről származó növények, növényi termékek és más anyagok is. A II. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösség országaiból származó növények és a velük kapcsolatos intézkedések. A IV. Függelék B. része azokat a különleges eljárásokat tárgyalja, amelyeket valamennyi tagország köteles elrendelni a növények, növényei termékek és más anyagok meghatározott védett zónákba történő bevitelével és a védett zónákon belüli szállításával kapcsolatban.

Az V. Függelék arról rendelkezik, hogy azokat a növényeket, növényi termékeket és más anyagokat, amelyeket növény-egészségügyi ellenőrzésnek kell alávetni, az Európai Közösségből származók esetében a termőhelyen, a Közösségen belüli szállítást megelőzően, az Európai Közösségen kívül eső országok esetében pedig a származási országban vagy a feladó országban, az Európai Közösségbe hozatal engedélyezése előtt kell ellenőrizni. A Függelék A. részének I. pontja azokkal az Európai Közösségből származó növényekkel, növényi termékekkel és más anyagokkal foglalkozik, amelyek az egész Közösségre nézve fontos károsítók potenciális hordozói, és amelyekhez növényútlevelet kell csatolni. Az A. rész II. pontja azokat a növényeket, növényi termékeket és más anyagokat sorolja fel, amelyek bizonyos védett zónákra nézve fontos károsítók potenciális hordozói, és amelyekhez az adott zónába történő behozatalkor vagy az adott zónán belüli szállításkor a megfelelő zónákra érvényes útlevelet kell csatolni. A Függelék B. része az A. részben felsoroltaktól eltérő területekről származó növényeket, növényi termékeket és más anyagokat sorolja fel.

2. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok EurópábanA „karantén károsító” a nemzetközileg elfogadott „Növényegészségügyi terminusok szótára” szerint olyan károsító, amelynek potenciális gazdasági jelentősége van azon a területen, ahol eddig még nem fordult elő, vagy ha elő is fordul, széles körben még nem terjedt el, és hivatalos ellenőrzés alatt van. A károsító magában foglalja a faj, törzs, biotípus fogalmát is. Az Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet (EPPO, European and Mediterranean Plant Protection Organization) a karantén károsítókat két csoportba sorolja: 1. azok a károsítók, amelyek nem fordulnak elő az EPPO-régióban; ezek az A1 csoportba tartoznak, és 2. azok a károsítók, amelyek az EPPO-régió néhány területén előfordulnak; ezek az A2 csoportba tartoznak. Az EPPO-régió tagállamai kötelesek minden intézkedést megtenni az A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben, míg az A2 csoportba tartozó károsítókkal szembeni eljárásokat szabadon megválaszthatja. A követelmények igen szigorúak az ún. „egzotikus”, A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben. Ez a specifikus és „károsítócentrikus” szemlélet az EPPO központi koncepciója.


Függelék

Az Európai Unió (EU) tizenöt tagállama mind aktív tagja az EPPO-nak. Az EU Növényegészségügyi Direktívái (EU Plant Health Directive) (lásd Függelék előző fejezete) igen kis mértékben eltérnek az EPPO követelményeitől, de alapvető kérdésekben megegyeznek. Az EPPO-tagállamok szoros kapcsolatban vannak az EPPO titkárságával az A1 és A2 károsítók adatlapjainak összeállításában. Ezek az információk a szervezet folyóiratában (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin) jelennek meg, amelyek többnyire az alábbi adatokat tartalmazzák: károsító neve, fő gazda, földrajzi elterjedés, biológia, gazdasági jelentőség, belépés módja, identifikálás, egészségügyi vizsgálat, irodalom. A tudományos publikációkat többnyire színes ábrák egészítik ki.

Az EU, az EPPO, a CABI, a Nemzetközi Entomológiai Intézet, a Nemzetközi Mikológiai Intézet és a Nemzetközi Parazitológiai Intézet nemrég összeállította és közzétette a „Quarantine Pests for Europe” (Európa Karantén Károsítói) c. könyvet (Smith et al., 1997), amely a legújabb adatokat tartalmazza a karantén rovarokra, atkákra, fonálférgekre, gombákra, baktériumokra, vírusokra, vírusszerű organizmusokra, viroidokra és parazita növényekre vonatkozóan. A jelen fejezetben a vírusokra, vírusszerű organizmusokra és viroidokra – mint karantén károsítókra – vonatkozóan közöljük az aktuális adatokat (38. táblázat).

38. táblázat - Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok) az EPPO-régióban (Smith et al., 1997 után)

A károsító neve Előfordulása a

régióban2Magyar név Angol név1

Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus* A2

Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus A2

Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus** A1

Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus A2

Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic begomovirus A1

Répa levélcsúcs fodrosodás vírus Beet curly top curtovirus A2

Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus A2

Répa nekrotikus sárgaerűség vírus Beet necrotic yellow vein benyvirus A2

Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus A2

Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus A2

Cseresznye levélsodródás vírus Cherry leafroll nepovirus* A2

Cseresznye aprógyümölcsűség vírus Cherry little cherry virus A1

Cseresznye nekrotikus rozsdaszínű foltosság betegség

Cherry necrotic rusty mottle disease A2

Cseresznye érdeslevelűség vírus Cherry rasp leaf nepovirus A1

Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt viroid A2


Függelék

Citrus sárgulás betegség Citrus blight disease A1

Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus A1

Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus A1

Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus A1

Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus A1

Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus A2

Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus A2

Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang viroid A1

Tehénborsó enyhe foltosság vírus Cowpea mild mottle carlavirus A1

Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus A1

Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows crinivirus A1

Őszibarack látens mozaik viroid Peach latent mosaic viroid*** A1

Őszibarack rozettás mozaik vírus Peach rosette mosaic nepovirus A1

Szilva (amerikai) vonalas mintázottság vírus

Plum (American) line pattern ilarvirus A1

Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus A2

Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus A1

Burgonya fekete gyűrűsfoltosság vírus Potato black ringspot nepovirus A1

Burgonya andeszi foltosság vírus Potato Andean mottle comovirus A1

Burgonya orsósgumójúság viroid Potato spindle tuber viroid A2

Burgonya T-vírus Potato T vitivirus A1

Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus A1

Burgonya sárgaerűség betegség Potato yellow vein disease A1

Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus A1

Málna levélgöndörödés vírus Raspberry leaf curl ? luteovirus A1

Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus A2


Függelék

Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus A1

Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus A1

Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle cytorhabdovirus A2

Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus A1

Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot nepovirus A2

Földieper enyhe sárga levélszélűség vírus Strawberry mild yellow edge disease

associated ? potexvirus

A2

Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ? caulimovirus

A2

Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco rinsgpot nepovirus A2

Paradicsom fekete gyűrűs vírus Tomato black ring nepovirus A2

Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus A1

Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus Tomato ringspot nepovirus A2

Paradicsom bronzfoltosság vírus Tomato spotted wilt tospovirus A2

Paradicsom sárga levélgöndörödés vírus Tomato yellow leaf curl bigeminivirus

A2

1 * = Rubus növényen; ** = Oca-törzs; *** = Az EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet) karanténlistára vett egy új károsítót [őszibarack látens mozaik viroid (peach latent mosaic viroid, PLMVd)], amely Olaszországban 20–50%-os előfordulást és súlyos károkat okoz őszibarackon, nektarinon, szilván, sárgabarackon és cseresznyén (Barba és Faccioli, 1998).

2 A1 = A károkozó (vírus) nem fordul elő az EPPO-régióban (European and Mediterranean Plant Protection Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet); A2 = A károkozó előfordul az EPPO-régió bizonyos területein.

3. Az ábrák eredeteAlmási Asztéria (Budapest): 56.

Baker, C.J. és Orlandi, E.W.: 100., 101. Academic Press, London (1995) engedélyével.

Brandes, J. (Braunschweig, Németország): 6., 13B, C., 14A szívessége folytán.

Brown, T.A.: 83., 87., 88. Stanley Thornes (Publ.) Ltd., Cheltenham (1990) engedélyével.

Brunt, A. et al.: 20. CAB International, Wallingford (1990) engedélyével.

Chiykowski, L.N. (Ottawa, Kanada): 28A, B, C, D szívessége folytán.


Függelék

De Bokx, J.A. (Wageningen, Hollandia): 23A szívessége folytán.

Doke, N. és Ohashi,Y.: 104. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1988) engedélyével.

Esau, K.: 54., 57., 58. The University of Wisconsin Press, London (1968) engedélyével.

Érsek Tibor és Gáborjányi Richard: 67. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest (1998) engedélyével.

Francki, R.I.B. és McLean, G.D.: 63. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1968) engedélyével.

Francki, R.I.B. et al.: 55., 60A, B. CRC Press, Boca Raton (1985) engedélyével.

Fritzsche, R. (Aschersleben, Németország): 43 szívessége folytán.

Gáborjányi Richard (Budapest): 66.

German, T.L. et al.: 75. Ann. Rev. Inc., Palo Alto (1992) engedélyével.

Gibbs, A.J.(Harpenden, Herts, Nagy-Britannia): 15D, 18B, 53 szívessége folytán.

Hammond-Kosack, K.E. és Jones, J.D.G.: 99. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1996) engedélyével.

Hampton, R. et al.: 78., 79., 80., 81., 82. The American Phytopath. Soc., St. Paul, Minnesota (1990) engedélyével.

Harrison, B.D. (Dundee, Skócia): 17A, B szívessége folytán.

Horváth József (Keszthely): 1A, B, C., 2A, B., 4A, B, C., 7A., 8A, B., 11A, B, C, D., 12A, B, C., 13A., 14B., 16A, B., 17C., 22A, B., 23B., 24A, B., 26A, B., 33., 34A, B, C, D, E, F., 44., 45A, B., 46A, B., 47A, B, C, D., 48A, D., 49A., 50A, B., 52A, B, C., 59A, B., 61A, B, C., 62A, B., 64A, B, C., 65A, B., 105A, B, C, D., 106A, B.

Hull, R. és Covey, S.: 72. Elsevier Trends Journals, Cambridge (1983) engedélyével.

Kado, C.I. (Berkeley, Amerikai Egyesült Államok): 15A, B, C szívessége folytán.

Kunkel, H.: 35., 36. Academic Press, London (1977) engedélyével.

Lázár János (Kecskemét): 51 szívessége folytán.

Mamula, D. (Zagreb, Horvátország): 18A szívessége folytán.

Matthews, R.E.F.: 69., 70., 71. Academic Press, Orlando (1985), (1991) engedélyével.

McInnes, J.L. és Symons, R.H.: 90., 91. CRC Press, Boca Raton, Florida (1991) engedélyével.

Miller, A. (Ames, Amerikai Egyesült Államok): 27 szívessége folytán.

Molnár János (Szeged): 86, 89 szívessége folytán.

Mullineaux, P.M. et al.: 91. Oxford University Press, Oxford (1984) engedélyével.

Murant, A.F. (Dundee, Skócia): 10 szívessége folytán.

Murphy, F.A. et al.: 3. Springer Verlag, Wien und New York (1995) engedélyével.

Nakasuyi, F. (Okayama, Japán): 7B, C szívessége folytán.

Noordam, D.: 37., 38., 39., 40A, B, C; 41. PUDOC, Wageningen (1973) engedélyével.

Paliwal, Y.C. és Slykhuis, J. (Ottawa, Kanada): 29A szívessége folytán.


Függelék

Peters, D. (Wageningen, Hollandia): 5., 9 szívessége folytán.

Pfeifer, P. és Hohn, T.: 73. Cell Press, Cambridge (1983) engedélyével.

Pintér Csaba (Keszthely): 48B, C., 49B szívessége folytán.

Pogány Miklós (Budapest): 92., 93., 94A, B, C., 95., 96., 97.

Proeseler, G. (Aschersleben, Németország): 31 szívessége folytán.

Riechmann, J.L. et al.: 68. Kluwer Academic Publ., Dordrecht (1993) engedélyével.

Sain, B. és Erdei, S.: 84. Gondolat Könyvkiadó Kft., Budapest (1985) engedélyével.

Salazar, L.F. (Lima, Peru): 19., 109 szívessége folytán és az International Potato Center, Lima, Peru (1996) engedélyével.

Sambrook, J. et al.: 85. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor (1989) engedélyével.

Schlee, D.: 98. Gustav Fischer Verlag, Jena (1992) engedélyével.

Schmelzer, K. (Aschersleben, Németország): 21. Akademie Verlag, Berlin (1980) engedélyével.

Schopfer, P.: 103. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1994) engedélyével.

Slykhuis, J.T. (Ottawa, Kanada): 29B szívessége folytán.

Smith, K.M. (Austin, Amerikai Egyesült Államok): 30 szívessége folytán.

Szalay-Marzsó László (Budapest): 32 szívessége folytán.

Szilassy Dénes (Gödöllő): 107., 108., 110.

Taylor, C.E. és Robertson, W.M.: 42. Plenum Publ. Company, London (1975) engedélyével.

Teakle, D.S. (Brisbane, Ausztrália): 25A, B, C szívessége folytán.

Washio, O. et al.: 37. [módosítva Kunkel, H.: Academic Press, London (1977) engedélyével].

Wu, G. et al.: 102. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1995) engedélyével.


IrodalomPrinciples of molecular organization, expression, and evolution of closteroviruses: over the barriers.

Agranovsky, A.A. Adv. Virus Res. 47 1996 119–157

Methods of virus classification. Andrewes, C.H. Academie Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (eds.), Methods in Virology. Vol. IV., , ppNew York and London 1968 593–613

Orvosi virológia. Bakács, T. és Farkas E. Medicina KönyvkiadóBudapest 1965 444 pp

A növényi RNS-vírusok bioszintézise. Balázs, E. Medicina Könyvkiadó In: Csaba Gy. (szerk.), A biológia aktuális problémái 23Budapest 1981 77–93

Potyvirus Taxonomy. Barnett, O.W. Springer Verlag Arch. Virol. Suppl. 5Wien and New York 1992

Plant Viruses and Virus Diseases. Bawden, F.C. Waltham Mass 3rd Edit. Chronica Botanica Co 1950

Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia. Belák S., Tuboly S. és Varga J. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1983 449 pp

Introduction to Plant Virology. Bos, L. PUDOCWageningen 1983 160 pp

Virus Identification Data Exchange. Boswell, K.F. and Gibbs, A.J. Viruses of Legumes. Austr. Nat. Univ., Canberra 1983 139 pp

The VIDE (Virus Identification Date Exchange) Boswell, K.F., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L. Project: A Date Bank for Plant Viruses. Rev. Plant Pathol. 65 1986 221–231

Some properties of a phloem-limited non–mechanically transmissible grapevine virus. Boulila, M., Boscia, D., Di Terlizzi,B., Castellano, M.A., Minafra, A., Savino, V. and Martelli, G.P. J. Phytopathol. 129 1990 151–158

Gross morphology and serology as a basis for classification of elongated plant viruses. Brandes, J. and Bercks, R. Adv. Virus Res. 11 1965 1–24

Klassifizierung und Nomenklatur pflanzenpathogener Viren. Brandes, J. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1967 237–243

Viruses of Tropical Plants. Brunt, A A., Crabtree, K. and Gibbs, A. CAB International Descriptions and Lists from the VIDE DatabaseWallingford 1990 707 pp

Viruses of Plants. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L. CAB International Description and Lists from the VIDE DatabaseWallingford 1996a 1484 pp

Plant Virus Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. Index to Viral Genera, Index to Virus Species and Index to Virus Acronyms. Version 20th August 1996b

Sinaloa tomato leaf curl virus, a newly described geminivirus of tomato and pepper in West Coastal Mexico. Brown, J.K., Idris, A.M. and Fletcher, D.C. Plant Dis. 77 1993 1262

Phylogenetic relationships reveal recombination among isolates of cauliflower mosaic virus. Chenault, K.D. and Melcher, U. J. Mol. Evol. 39 1994 496–505

Fully biologically active in vitro transcripts of the Eriophid mite–transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Choi, Il-R., French, R., Hein, G.L. and Stenger, D.C. Phyto. pathol. 89 1999 1182–1185

A new Bemisia tabaci (Gennadius) biotype in southwestern United States and its role in silverleaf of squash and transmission of lettuce infectious yellows virus. Cohen, S., Duffus, J.E. and Liu, H.-Y. Phytopathology 82 1992 86–90


Irodalom

Proposals for changes in luteovirus taxonomy and nomenclature. D’Arcy, C.J. and Mayo, M. Arch. Virol. 142/6 1997 1285–1287

Cassava vein mosaic virus (CsVMV), type species for a new genus of plant double stranded RNA viruses. de Kochko, Verdaguer, B., Taylor, N., Carcamo, R., Beachy, R.N. and Fauquet, C. Arch. Virol. 143 1988 945–962

Maize white line mosaic virus. de Zoeten, G.A. and Reddick, B.B. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses 283 1984 1–4

Molecular biology and evolution of closteroviruses: Sophisticated build-up of large RNA genomes. Dolja, V.V., Karasev, A.V. and Koonin, E.V. Ann. Rev. Phytopathol. 32 1994 261–285

Variation of rice tungro viruses: further evidence of two rice tungro bacilliform virus strains and possibly several rice tungro spherical virus variants. Druka, A. and Hull, R. J. Phytopathol. 146 1998 175–178

A novel subrival agent associated with a geminivirus. Dry, I. B., Krake, L. R., rigden, J. E. and Rezaian, M. A. The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093

Lettuce infectious yellows virus – A new type of whitefly-transmitted virus. Duffus, J.E., Larsen, R.C. and Liu, H.Y. Phytopathology 76 1986 97–100

Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton, Florida 1991a 504 pp

The Potyvirus Group. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Vol. I-IV. Florida Exp. Stat. Monograph. 16 1991b

Inclusion in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen, M.A. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed.), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton, Florida 1993 101–127

Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp

The nomenclature and classification of viruses the international committee on nomenclature of viruses. Fenner, F. Virology 46 1971 979–980

Classification and nomenclature of viruses. Fenner, F. Intervirol. 7 1976 1–115

Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985a 151–174

The Plant Viruses. Vol. 1. Francki, R.I.B. Plenum Press Polyhedral Virions with Tripartite GenomesNew York and London 1985b 309 pp

Classification and nomenclature of viruses. Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. and Brown, F. Springer VerlagWien and New York 1991 450 pp

Atlas of Plant Viruses. Vol. II. Francki, R.I.B., Milne, R.C. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton, Florida 1985 284 pp

Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp

A gabonafélék vírusbetegségei, gabonavírusok. Gáborjányi, R. Akad. Dokt. Ért 1990 Budapest

Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991 101 pp

A vírusfertőzés inhibitorai és vírusbioszintézist gátló anyagok. Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35 1986a 139–146

A növényi vírusok elleni kémiai védekezés lehetőségei. Indukált antivirális anyagok és kemoterápiás szerek. Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35 1986b 341–350

What’s in a virus name? Gibbs, A.J., Harrison, B.D., Watson,D.H. and Wildy, P. Nature 209 1966 450–454


Irodalom

Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976 1976 292 pp

Plant virus classification. Gibbs, A.J. Adv. Virus Res. 14 1969 263–328

Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24 1986 289–310

A History of Experimental Virology. Grafe, A. Spinger VerlagBerlin 1991 343 pp

Plant Virus Disease Control. Hadidi, A., Khetarpal, R.K. and Koganezawa, H. APS PressSt. Paul, Minnesota 1998 704 pp

Guidelines for the identification and characterization of plant viruses. Hamilton, R.I., Edwardson, J.R., Francki, R.I.B., Hsu, H.T., Hull, R., Koenig, R. and Milne, R.G. J. Gen. Virol. 54 1981 223–241

Chemotherapy of Plant Virus Infections. Hansen, A.J. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York 1988 285–299

Antiviral Chemicals for Plant Disease Control. Hansen, A.J. CRC Critical Rev.Pl. Sci. Vol. 8., Issue 1., Boca Raton 1989 45–86

Advances in Disease Vector Research. Vol. 9 and 10. Harris, K.F. Springer VerlagNew York 1992–1994 367 and 442 pp

Vectors of Plant Pathogens. Harris, K.F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp

Usefulness and limitations of the species concept for plant viruses. Harrison, B.D. Intervirol. 24 1985 71–78

Separation and properties of tobacco rattle virus with different lenghts. Harrison, B.D. and Nixon, H.L. J. Gen. Microbiol. 21 1959 569–581

Sixteen groups of plant viruses. Harrison, B.D., Finch, J.T., Hollings, M., Shepherd, R.J., Valenta, V. and Wetter, C. Virology 45 1971 356–363

Virus structure: high resolution perspectives. Harrison, S.C. Adv. Virus Res. 28 1983 175–240

Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 1984 67 pp

Handbook of Phytopathogenic Viruses. Holmes, F.O. BurgessMinneapolis 1939

Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 pp

A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. (szerk.) Mezőgazda KiadóBudapest 1995 328 pp

New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses. I. Horváth, J. Historical review. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 12 1977 177–214

Hosts and Non-Hosts of Plant Viruses. Horváth, J. Internat. Biosci. Monograph. No. 12. Today and Tomorrow’s Printers and Publishers, New Delhi 1982 77 pp

New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses. Horváth, J. XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161

Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (eds.), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47

A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 1993b 21–58

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 1993c 257–354

Növényvírusok. Horváth, J. Egyetemi jegyzet, PATE, Keszthely 1999 237 pp


Irodalom

Molecular characterization of peanut stunt virus (PSV) strain BV-15, a natural reassortant between subgroups I and II of PSV strains. Hu, C.C. and Ghabriel, S.A. Phytopathology 86, 17 (Abstr.) 1996

A list of proposed standard acronyms for plant viruses and viroids. Hull, R., Milne, R.G. and Van Regenmortel, M.H.V. Archs. Virol. 120 1991 151–164

Sinaloa tomato leaf curl geminivirus: biological and molecular evidence for a new subgroup III virus. Idris, A.M. and Brown, J.K. Phytopathology 88 1998 648–657

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 2–4Berlin 1977a 434 pp., 389 pp., 528 pp

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Registerband. Verzeichnisse und Übersichten zu den Virosen in EuropaBerlin 1977b 337 pp

Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemenBerlin 1980 658 pp

Studies on the use of antiphytoviral compounds in potato stem cutting cultures considering the quantitative virus resistance of cultivars. Kluge, S., Möschke, M. and Schulze, S. Arch. Phytopath. Pflanzenschutz. 26 1990 353–358

The Plant Viruses. Vol. 3. Koenig, R. Plenum Press Polyhedral Virions with Monopartite RNA GenomesNew York and London 1988 294 pp

Arthropodenviren. Krieg, A. Georg Thieme VerlagStuttgart 1972 328 pp

Handbook of Plant Virus Infections. Kurstak, E. Elsevier/North-Holland Biomedical Press Comparative DiagnosisAmsterdam 1981 943 pp

Applied Virus Research. Vol. 1 Kurstak, E., Marusyk, R.G. and Murphy, F.A. Plenum Publ. Corp New Vaccines and ChemotherapyNew York 1988

Nematode Vectors of Plant Viruses. Lamberti, F., Taylor, C.E. and Seinhorst, J.W. Plenum PressLondon and New York 1974 460 pp

Cytopathological effects induced by maize chlorotic mottle virus in infected maize. Lesemann, D.-E. VIIIth Conf. Virus Diseases of Graminaceae in Europe., Goslar 1998

Vírusok, fertőző gének. Lomniczi, B. Gondolat KiadóBudapest 1978 326 pp

Characterization, nucleotide sequence and genome organization of leek white stripe virus, a putative new species of the genus Necrovirus. Lot, H., Rubino, L., Delecolle, B., Jacquemond, M., Turturo, C. and Russo, M. Arch. Virol. 141 1996 2375–2386

The classification of viruses. Lwoff, A. and Tournier, P. Ann. Rev. Microbiol. 20 1966 45–74

A system of viruses. Lwoff, A., Horne, R. and Tournier, P. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 27 1962 51–55

Plant Viruses. Vol I. Mandahar, C.L. CRC Press Structure and ReplicationBoca Raton 1989 366 pp

Leafhopper Vectors and Plant Disease Agents. Maramorosch, K. and Harris, K.F. Academic PressNew York 1979 654 pp

Methods in Virology. Vol. I–VIII. Maramorosch, K. and Koprowski, H. Academic PressNew York and London 1967–1984

Trichovirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Candresse, T. and Namba, S. Arch. Virol. 134 1994 451–455

Oleavirus, a new genus in the family Bromoviridae. Martelli, G.P. and Grieco, F. Arch. Virology 142 1997 1933–1936

Foveavirus, a new plant virus genus. Martelli, G.P. and Jelkmann, W. Arch. Virology 143 1998 1245–1249


Irodalom

Vitivirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Minafra, A. and Saldarelli, P. Arch. Virology 142 1997 1929

Aureuvirus, a novel genus in the family Tombusviridae. Martelli, G.P., Russo, M., Rubino, L. and Sabanadzovic, S. Arch. Virology 143 1998 1847–1851

Plant Virology. 3rd ed. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991 835 pp

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

Diagnosis of Plant Virus Diseases. Matthews, R.E.F. CRC PressBoca Raton 1993 374 pp

Angewandte Pflanzenvirologie. Mayer-Kahsnitz, S. B. Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218 pp

Recent revision of the rules of virus classification and nomenclature. Mayo, M.A. Arch. Virol. 141 1996 2479–2484

Molecular biology of luteoviruses. Mayo, M.A. and Ziegler-Graf, V. Adv. Virus Res. 46 1996 413–460

Virus taxonomy – 1997. Mayo, M.A. and Pringle, C.R. J. Gen. Virology 79 1998 649–657

Family Luteoviridae: A reclassification of luteovirus. . Mayo, M.A. and D’Arcy, C. J. CAB International In: Smith, H. G. and Barker, H. (Eds.): The Luteoviridae CABI PublWallingford 1999 15–22

Taxonomy of viruses, 1975. Melnick, J.L. Progr. med. Virol., 20 1975 208–211

Alternatives to the species concept for virus taxonomy. Milne, R.G. Intervirol. 24 1985 94–98

The Plant Viruses. Vol. 4. Milne, R.G. Plenum Press The Filamentous Plant VirusesNew York and London 1988 423 pp

Ophioviruses, an emerging cluster of plant viruses. Milne, R.G., Accotto, G.P., Lisa, V. and Vaira, A.M. Xth International Congr. Virology. Jerusalem 1996 84

CMI/AAB (now AAB) Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Sets 1–22. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne 1970-1989

Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L., Ghabrial, S.A., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo, M.A. and Summers, M.D. Springer VerlagWien and New York 1995 586 pp

A vírusok biológiája. Nász, I. Medicina Kiadó In: Csaba, Gy. (szerk.): A biológia aktuális problémáiBudapest 1975 9–67

Vírusrendszertan. Nász, I. Biológia 27 1979 3–43

Álatalános virológia. Nász, I. Medicina Könyvkiadó In: Nász, I., Klinikai mikrobiológiaBudapest 1988 49–95

Az adenovírusok és kórokozó szerepük. Nász I., Béládi I. és Lengyel A. Akadémiai KiadóBudapest 1967

Vírus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 841 pp

Viren, Mykoplasmosen und Rickettsien. Nienhaus, F. UlmerStuttgart 1985 264 pp

Identification of Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. PUDOC.: Wageningen 1973 207 pp

Taxonomy of several tobamoviruses from China as determined by molecular hybridization analysis with complementary DNA. Palukaitis, P., Randles, J.W., Tian Ying-tuan, Kang, Liang-yi and Tien, Po Intervirology 16 1981 136–141

Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996 283–296


Irodalom

Virus nomenclature. Pereira, H.G. Nature 210 1966 149–150

Recent Progress in Tospovirus and Thrips Research. Peters, D. and Goldbach, R. 4th Internat. Symp. Tospoviruses and Thrips in Floral and Vegetable Crops. Wageningen 1998 110 pp

Strawberry vein banding virus – definitive member of the genus caulimovirus. Petrzik, K., Benes, V., Mráz, I., Honetlegrová-Fránová, J., Ansorge, W. and ¹pak, J. Virus Genes 16 303–305

The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Virus Taxonomy (ICTV), including new proposals ratified since publication of the Sixth ICTV Report in 1995. Pringle, C.R. Arch. Virol. 142/1 1998 203–208

The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere. Polston, J.A. and Anderson, P.A. Plant Dis. 81 1997 1358–1359

Nucleotide sequence and taxonomy of maize chlorotic dwarf virus within the familie Sesquiviridae. Reddick, B.B., and Habera, L.F. J. Gen. Virol. 78 1997 1165–1174

Mechanisms of plant virus evolution . Roossinck, M.J. Ann. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209

A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae. Rybicki, E.P. Arch. Virol. 139 1994 49–77

Virologisches Praktikum. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1, Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610

Synthetic Antiphytoviral Substances. Schuster, G. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York 1988 265–283

Isolation and characterization of a rodshaped, whitefly transmissible, DNA-containing plant virus. Sela, I., Assouline, I., Tanne, E., Cohen, S. and Marco, S. Phytopathology 70 1980 226–228

The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt, A.A. CAB InternationalWallingford 1993 516 pp

The Luteoviridae. Smith, H.G. and Baker, H. CABI Publ. CAB InternationalWallingford 1999 297

Insect Virology. Smith, K.M. Academic PressNew York and London 1997 256. pp

Phylogenetic relationships within the family Potyviridae: Wheat streak mosaic virus and brome streak mosaic virus are not members of the genus Rymovirus. Stenger, D.C., Hall, J.S., Choi, Il-R. and French, R. Phytopathology 88 1998 782–787

Az L333, az azadihidrouracil (DHT) és a cianoguanidin (CG) gátló hatása az árpa csíkos mozaik vírus (BSMV) ellen. Tallóczy, Zs. és Gáborjányi R. Növénytermelés 39 1990 245–253

Proposed re-classification of furoviruses. Torrance, L. and Mayo, M.A. Arch. Virol. 142/2 1997 435–439

Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. V., Németh M. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1979 629 pp

Applying the species concept to plant viruses. Van Regenmortel, M.H.V. Arch. Virol. 104 1989 1–17

Virus species, a much overlooked but essential concept in virus classification. Van Regenmortel, M.H.V. Intervirol. 31 1990 241–254

Viral species. Van Regenmortel, M.H.V. Chapman and Hall Ltd In: Claridge, M.F., Dawah, H.A. and Wilson, M.R. (Eds), Species: The Units of BiodiversityLondon 1997 17–24

The Plant Viruses. Van Regenmortel, M.H.V. and Fraenkel-Conrat, H. Plenum PressNew York and London 1986 424 pp

The concept of virus species. Van Regenmortel, M.H.V., Maniloff, J. and Calisher, C. Arch. Virol. 120 1991


Irodalom

313–314

Applied Plant Virology. Walkey, D.G.A. Heinemann LtdLondon 1986 329 pp

Interspecific reassortment in the evolution of a cucumovirus. White, P.S., Morales, F.J. and Roossinck, M.J. Virology 207 1995 334–337

Classifying viruses at higher levels: symmetry and structure of virus particles as criteria. Wildy, P. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 12 1962 145–163

Classification and Nomenclature of Viruses. Wildy, P. In: Melnick, J.L. (ed.), Monographs in Virology. Vol. 5. S. Karger, Basel, München, Paris, London, New York, Sydney 1971 450 pp

Ecology and epidemiology of whitefly-transmitted closteroviruses. Wisler, G.C., Duffus, J.E., Liu, H.-Y. and Li, R.H. Plant Disease 82 1998a 270–280

Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato. Wisler, G.C., Li, R.H., Liu, H.-Y., Lowry, D.S. and Duffus, J.E. Phytopathol. 88 1998b 402–409

Antiphytoviral activity of 1-morpholinomethyl-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DD13). Yordanova, A., Karparov, A., Stoimenova, E. and Starcheva, M. Plant Pathology 45 1996 547–551

Plant Pathology. Agrios, G. N. Academic PressNew York 1988

Kertészeti növények fonálféreg-kártevői. Andrássy, I. és Farkas K. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1988 419 pp

Plant regeneration from seedling derived callus of dodder (Cuscuta trifolii Bab. et Gibbs). Bakos, Á., Fári, M., Toldi, O. and Lados, M. Plant Science 109 1995 95–101

Basky, Zs. (1993) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 71–121 Identification key for alate aphids caught in yellow pan traps.

A szilvahimlő vírust terjesztő levéltetvek rajzása és a természetes fertőzés összefüggései. Basky, Zs. és Gáborjányi R. Növényvédelem 30 1994 201–206

Adsorption of tobacco mosaic virus (TMV) in five soils of Cuba. Blanco-Sanches, N., Crespo, J. and Gonzales, G. Ciencias de la Agr. 29 1986 9–14

Nematode transmission of plant viruses – a 30 year perspective. Brown, D.J.F. and Trudgill, D.L. Scottish Crop Research Institute. Ann. Rep. 1997/1998. Invergowrie 1998. pp 1988 121–125

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–Heidelberg 1998 458 pp

Methoden der Übertragung pflanzenpathogener Viren durch Nematoden. Fritzsche, R. Biol. Zbl. 86 1967 753–759

Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp

Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991

Adatok a sztolbur vírus magyarországi elterjedéséhez. Gáborjányi, R. és Lönhard M. Növényvédelem 3 1967 176–180

A paradicsom bronzfoltosság vírus (TSWV) járványtani kérdései. Gáborjányi R., Jenser G. és Nagy Gy. Növényvédelem 29 1993 543–547

Characterization and natural spread of tomato spotted wilt virus isolated in Hungarian tobacco plantations. Gáborjányi, R., Jenser, G. and Vasdinyei, R. Horticultural Science 26 1994 91–94

A paradicsomot, a paprikát és a dohányt fertőző paradicsom bronzfoltosság vírus hazai izolátumainak tünettani és szerológiai jellemzése. Gáborjányi R., Vasdinyei R., Almási A., Csilléry G. és Ekés M.


Irodalom

Növényvédelem 31 1995 533–540

Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976

Evidence that a component other than the virus particle is needed for aphid transmission of potato virus Y. Govier, D. A. and Kassanis, B. Virology 57 1974 285–286

Partial purification and characterization of the potato virus Y helper component. Govier, D. A., Kassanis, B. and Pirone, T. P. Virology 78 1977 306–314

Vectors of Plant Pathogens. Harris, K. F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp

Transmission of tobacco ratte virus isolate PpK20 by its nematode vector requires one of the two nonstructural genes in the viral RNA2. Hernández, C., Visser, P. B., Brown, D.J.F. and Bol, J.F. J. Gen. Virology 78 1997 465–467

Methods in Virology. Hill, S. A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp

The water-culture method for growing plants without soil. Hoagland, D.R. and Arnon, D.J. Coll. Agr. Univ. CalifBerkeley 1950

A levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) kimutatására alkalmazott Igel-Lange teszt megbízhatósága. Horváth, J. Növénytermelés 3 1962 257–266

A burgonya levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) átvitele indikátornövényekre. Horváth, J. Növénytermelés 1 1963 57–64

Green petal – a new disease of rape in Hungary. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4: 1969 363–367

A sárgaság típusú növénybetegségeket okozó mikoplazmák tulajdonságai és a növényi mikoplazmózisok. Horváth, J. Növénytermelés 19 1970 327–337

Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 p

Újabb adatok a mikoplazmák és mikoplazmózisok tulajdonságairól és előfordulásáról. Horváth, J. A Növényvéd. Korszerűsítése 8 1974 103–148

Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: R.E.F. Matthews (Eds), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 1993b 257–354

Isolation of cucumber mosaic virus from a water plant living in the Lake Balaton. Horváth, J. Malhotra Publ. House In: Rishi, N., Ahuja, K. L. and Singh, B. P. (Eds), Virology in the TropicsNew Delhi 1994 211–216

Növényvirológia. Horváth, J. Egyetemi jegyzet. Pannon Agrártudományi Egyetem, Keszthely 1999 237 pp

Solanum demissum-Hybride A6 als neue Testpflanze für den Nachweis des Gurkenmosaik-Virus (cucumber mosaic virus). Horváth, J. and Pocsai, E. Z. Pfl-Krankheiten 78 1971 695–699

Tobacco mosaic virus in Danube water in Hungary. Horváth, J., Juretiæ, N., Krajaæiæ M. and Mamula, D. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 337–340

Transmission of plant viruses by dodder. Hosford, R. M. Bot. Rev. 33 1967 387–406

Molecular biology of plant virus-vector interaction. Hull, R. Springer-Verlag In: Harris, K.F. (Ed), Advances in Disease Vector ResearchNew York 1994 361–383

Kis nematologia. Jávor, I. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1974 142 pp

A tripszek szerepe a paradicsom bronzfoltosság vírus terjedésében. Jenser, G. Növényvédelem 31 1995 541–545


Irodalom

Seed transmission of viruses: current perspectives. Johansen, E., Edwards, M.C. and Hampton, R.O. Ann. Rev. Phytopathol. 32 1994 363–386

Experimental transmission of viruses in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993a 49–72

Virus transmission through soil and by soil-inhabiting organisms in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993b 73–99

Some data on adsorption of two plant viruses to soil. Juretiæ, N. and Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 26 1991 423–426

Occuring of ribgrass mosaic virus in water of Hungarian river Zala. Juretiæ, N., Horváth, J. and Krajaèiæ, M. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 291–295

Pflanzliche Virologie. Band I. Klinkowski, M. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1958

Plant viruses in rivers and lakes. Koenig, R. Adv. Virus Res. 31 1986 321–333

Plant viruses in German rivers and lakes. I. Koenig, R. and Lesemann, D. E. Tombusviruses, a potexvirus and carnation mottle virus. Phytopath. Z. 112 1985 105–116

Isolation of carnation ringspot virus from a canal near a sewage plant: cDNA hybridization analysis, serology and cytopathology. Koenig, R., Lesemann, D. E. and Burgermeister, W. J. Phytopathology 121 1988 346–356

Membran feeding systems aphids research. Kunkel, H. Academic Press In: Harris, K. F. and Maramorosch, K. (Eds), Aphids as Virus VectorLondon 1977 311–339

Molecular biology of the tobravirus genome. MacFarlane, S., Brown, D.J.F., Vassilakos, N., Mooney, A., Schmitt, C., Mueller, A-M., Prior, D. and Oparka, K. Scottish Crop Research Institute. Ann. Rep. 1997/1998. Invergowrie, pp 1998 129–131

Angewandte Pflanzenvirologie. Meyer-Kahsnitz, S. Bernhard Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218. pp

Pollen- and seed-transmitted viruses and viroids. Mink, G.I. Ann. Rev. Phytopath. 31 1993 375–402

Aseptic cultivation of four virus transmitting species of leafhoppers (Cicadellidae). Mitsuhashi, J. and Maramorosch, K. Contrib. Boyce Thompson Inst. 22 1963 165–173

Notes on aphid transmission of potato leafroll virus. Miyamoto, S. and Miyamoto, Y. Scient. Rep. Hyogo Univ. Agric., Ser. Plant Protection 7 1966 51–66

The Vpg of tobacco etch virus RNA is the 49-Kda proteinase or the N-terminal 2,4-Kda part of the proteinase. Murphy, J.F., Rhoads, R.E., Hunt, A.G. and Shaw, J.G. Virology 178 1990 285–288

Übertragung der Gelbsuchtviren durch die Zwergzikade Euscelis plebejus (Fallén). Musil, M. Biol. Práce 1 1965 1–86

Identification of Plant Viruses. Methods and Experiments. Noordam, D. Centre for Agricultural Publishing and Documentation (Pudoc), Wageningen 1973

First report on the multiplication of tomato spotted wilt tospovirus in tobacco thrips, Frankliniella fusca. Pappu, H.R., Todd, J.W., Culbreath, A.K., Bandla, M. and Sherwood, J.L. Plant Disease 82 1998 1282

A Manual of Entomological Techniques. Peterson, A. 7th Ed. Edwards, Ann. Arbor, Michigen 1953

Efficiency and selectivity of the helper-component-mediated aphid transmission of purified potyvirus. Pirone, T.P. Phytopathology 71 1981 922–924

Viral genes and gene products that determine insect transmissibility. Pirone, T.P. Virology 2 1991 81–87


Irodalom

Nematode transmission. Raski, D. J. and Hewitt, W. B. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds): Methods in Virology. Vol. INew York 1967 309–345

Loss of aphid-transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. Phytopathology 70 1980 647–649

A helper factor essential for aphid transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. and Ogata, K. Ann. Phytopath. Soc. Japan 47 1981 68–70

Beiträge zur Kenntnis der Übertragbarkeit von Viren durch Cuscuta-Arten. Schmelzer, K. Phytopath. Z. 28 1956 1–56

Übertragungsmöglichkeiten. Schmelzer, K. Akademie Verlag Übertragung unter Ausschluss tierischer Vektoren. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band. 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 111–133

Virologisches Praktikum. Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610

Samenübertragbare Viren bei Gemüsekulturen. Schmidt, H.E. Vortr. Pflanzenzüchtung 29 1994 109–136

Immunological detection and mutational analysis of the RNA2-encoded nematode transmission proteins of pea early browing virus. Schmitt, C., Mueller, A-M., Mooney, A., Brown, D. and MacFarlane, S. Virology 79 1998 1281–1288

The quantitative extraction of nematodes from soil. Seinhorst, J. W. Nematologica 1 1956 249–267

Aphid transmission of cucumber mosaic virus affected by temperature and age of infection in diseased plants. Stimmann, M. W. and Swenson, K. G. Phytopathology 57 1967 1074–1076

Virus transmission by aphids. Sylvester, E. S. Interscience Publishers A viewpoint. In: Maramorosch, K. (Ed), Viruses, Vectors and VegetationNew York 1969 159–173

Aquisition, retention and transmission of viruses by nematodes. Taylor, C. E. and Robertson, W. M. Plenum Press In: Lamberti, F., Taylor, C. E., and Seinhorst, J. W. (Eds), Nematode Vectors of Plant VirusesLondon 1975 253–276

Fungus transmission of plant viruses. Teakle, D. S. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. INew York 1967 369–391

Purification and characterization of potyvirus helper component. Thornbury, D. W., Hellmann, G. M., Rhoads, R. E. and Pirone, T. P. Virology 144 1985 260–267

Criteria for host plant acceptance by aphids. Tjallingii, W. F. and Mayoral, A. Kluwer Academic Press In: Menken, S. B. J., Visser, J. H. and Harrewijn, P. (Eds). Proc. 8th Internat. Symp. Insect Plant RelationshipsDordrecht 1992 280–282

Virus diseases of cucumbers. Van Dorst, H. J. M. Ann. Rep. Glasshouse Grops Res. and Exp. Stat., Naaldwijk 1961 75

Exclusivity and complementarity in the association between nepo- and tobraviruses and their respective vector nematodes. Vassilakos, N., MacFarlane, S. A., Weischer, B. and Brown, D. J. F. 1997. Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent, 62/3a 1997 713–720

Loss of potyvirus transmissibility and helper component activity correlates with non-retention of virions in aphid stylet. Wang, R. Y., Ammar, E. D., Thornbury, D. W., Lopez-Moya, J. J. and Pirone, T. P. J. Gen. Virology 77 1996 861–867

Role of helper component in vector-specific transmission of potyviruses. Wang, R. Y., Powel, G., Hardie, J. and Pirone, T. P. J. Gen. Virology 79 1998 1519–1524

Testing methods for, genetics of and breeding for resistance to rice stripe disease. Washio, O., Ezuka, A.,


Irodalom

Toriyama, K. and Sakurai Y. Bull. Chugoku Agr. Exp. Stn. 16 1968 39–197

A szaporítóanyag certifikációs rendszere és követelményei. Bach, I. és Szőnyegi S. OMMI, BFNTÁBudapest 1996

Grapevine disease in Hungary caused by alfalfa mosaic virus infection. Beczner, L. and Lehoczky, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 16 1981 119–128

Symptoms of Virus Diseases in Plants. Bos, L. Centre Agr. Publ. DocWageningen 1970 1970 206 pp

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin–Heidelberg 1998 458 pp

The Potyvirus Group. Vol. 1–4. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Univ. of Florida, Gainesville 1991

Anatomy of plant virus infections. Esau, K. Ann. Rev. Phytopath. 5 1967 45–76

Effects of light and temperature on symptom development and virus content of tobacco leaves inoculated with potato mop-top virus. Harrison, B. D. and Jones, R.A.C. Ann. Appl. Biol. 67 1971 377–387

Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp

Inoculating methods in tobacco mosaic studies. Holmes, F. O. Bot Gaz. 87 1929 56–63

A comparison of the experimental host ranges of tobacco-etch and tobacco-mosaic viruses. Holmes, F. O. Phytopathology 36 1946 643–659

Studies on strains of potato virus Y. 1. Horváth, J. Strain C. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138

A burgonyát fertőző vírusok differenciálásának módszerei és a burgonya Y-vírustörzsek (Marmor upsilon Holmes) tulajdonságai. Horváth, J. Kandidátusi Ért. Rostock-Budapest 1966b 231 pp

Separation and determination of viruses pathogenic to potatoes with special regard to potato virus Y. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967 319–360

Die Anfälligkeit von Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn. gegenüber dem Kartoffel-Y-Virus im Hinblick auf die Blattsequenz. Horváth, J. Acta Bot. Acad. Sci. Hung. 15 1969a 71–77

Die Anfälligkeit und Symptomausprägung der Blätter von Nicotiana tabacum L. cv. Hicks Fixed A2-426 nach Infection mit dem tobacco mosaic virus in Abhängigkeit von ihrer Sequenz am Spross. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4 1969b 131–137

Trennung und Nachweis des Kartoffel-X- und Kartoffel-Y-Virus mittels Chenopodium murale Horváth, J. L. Z. PflKrankh. PflSchutz 76 1969c 9–11


A hőmérséklet és a fotoperiódus hatása a Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi-nc dohány-levélkorongok lokális érzékenységére a dohány mozaik vírussal szemben. Horváth, J. és Pocsai E. A Növényvéd. Korszerűsítése 6 1972 65–82

Vírus-gazdanövénykörök és vírusdifferenciálás. Horváth, J. Akadémiai Doktori Ért., Budapest-Keszthely 1976 607 pp

Preservation of some plant viruses by dehydration over anhydrous calcium chloride (CaCl2). Horváth, J. and Besada, W.H. Z. PflKrankheiten 87 1980 463–472

New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses. XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Horváth, J. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161

Újabb adatok a növények vírusfogékonyságáról. 5. Horváth, J. Chenopodiaceae (Chenopodium fajok). Bot. Közlem. 73 1986 229–242


Irodalom

Potato gene centres, wild Solanum species, viruses and aphid vectors. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 23 1988 423–448

A burgonyavírus-kutatás helyzete Magyarországon: Múlt, jelen, jövő. Horváth, J. Burgonyatermesztés 2 1990 36–66

Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomo 28 1993a 257–354

A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 28 1993b 21–58

Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993c 15–48

The role of Nicotiana species in plant virology with special regard to Nicotiana benthamiana Domin: A review. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 28 1993d 355–377

A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. Mezőgazda KiadóBudapest 1995 428 pp

Potato virus research in Hungary. Horváth, J. and Kazinczi, G. Global Conf. Potato, New Delhi, p 1999 267

Transmission of viruses from apperently healthy potatoes. Johnson, J. Wisc. Agr. Exp. Stat., Res. Bull. No. 63 1925

Szaporítóanyagok EU-minősítési rendszere és meghonosítása Magyarországon. Kiss, P. Agroinform Kiadó és Nyomda Kft FM EU-Integrációs Sorozat. 17Budapest 1998 1–34

Untersuchungen über die Viruskrankheiten der Kartoffel. 1. Köhler, E. Versuche mit Viren aus der Mosaikgruppe. Phytopath. Z. 5 1933 567–591

Szőlővírusokkal kapcsolatos újabb hazai kutatások eredményei. Lázár, J. Egyetemi Doktori Értekezés. Budapest 1996

A hazai szőlő-vírusmentesítési program történeti előzményei, jelene és megoldásra váró problémái. Lázár, J. Növényvédelem 35 1998 415–418

A szőlő virológiai szűrésének mai gyakorlata és a vírusmentes egészségi állapot megőrzésének kilátásai a termő üzemi szőlőültetvényekben. Lehoczky, J. Kertgazdaság 13 1981 59–77

Szőlőtőkék korai elhalásának etiológiája. Lehoczky, J. Doktori Ért., Budapest 1992

Szőlőbetegség a lucerna mozaik vírus fertőzésétől. Lehoczky, J. és Beczner L. Vírusátvitel fás szárú indikátorokra (indexelés). Kertgazdaság 12 1980 59–66

A paradicsom fekete gyűrűs vírus előfordulása szőlőben Magyarországon. Lehoczky, J. és Burgyán J. Kertgazdaság 18 1986 47–57

A szőlő krómmozaik vírusbetegségének elterjedése hazánkban és vírusának kimutatása ELISA technikával a szabadföldi tőkék leveléből. Lehoczky J., Kölber M., Beczner L. és Pácsa S. Kertgazdaság 16 1984 41–52

Isolation of Arabis mosaic virus from Hungarian grapevines. Martelli, G.P. and Lehoczky, J Phytopath. Medit. 7 1968 129–133

Über die Mosaikkrankheit des Tabaks. Mayer, A. Landwirtsch. Versuchsstat. 32 1886 451–467

CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A. F. and Harrison, B. D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne, Warvick 1970-1988

Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. Németh, M. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1979 629 pp


Irodalom

Vírus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 1986 841 pp

A vírusmentes gyümölcs szaporítóanyag-előállítás rendszerének hazai kialakulása, jelenlegi problémái és kutatási feladatai. Németh, M. és Kölber M. Növényvédelem 35 1998 409–414

Identification on Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. Centre for Agr. Publ. Doc., Wageningen 1973

Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996 283–296

Recovery of plants from viral diseases: historical and new perspectives. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Z. Pflanzenkrankh. Pflschutz 106 1999 128–139

A szántóföldi növények vírusmentesítési rendszere. Pocsai, E. Növényvédelem 35 1998 419–428

Comparative host ranges of six plant viruses. Price, W. C. Amer. J. Botany 17 1940 694–702

Äussere Symptome. Schmelzer, K. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 21–83

Virologisches Praktikum. a, Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H. E. und Wolf, P. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610

Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110

On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic group as revealed by the use of plant indicators and selective methods of transmission. Smith, K.M. Proc. Roy. Soc. B109 No. 251 1931

Arabis mosaic virus. Thomas, B. J. In: Hammond, J. and Lawson, R. H. (Eds), Diagnostic Methods for Viruses of Ornamental Crops. Florist and Nursery Crops Laboratory, USDA, BARC-West, Beltsville, USA 1983 3–4

A vírusmentes gyümölcsszaporító-anyag előállítás bázisültetvényeinek kialakítása, fenntartása az Érdi GyDKF Kft-nél. Voigt, E. és Kállay T. Növényvédelem 34 1998 688–692

Procedures to increase virus yield from infected plants. Yarwood, C.E. Academic Press, New York In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V 1971 451–479

Leaf-dip serology. In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V. Ball, E.M. Academic Press, New York 1971 445–450

Elektronmikroskopische Untersuchungen am Kartoffel-X- und Tabakmosaik-Virus. Bode, O. und Köhler, E. Z. Naturf. 7b 1952 598–600

Identifizierung von gestreckten pflanzenpathogenen Viren auf morphologischer Grundlage. Brandes, J. Mitt. biol. BundAnst. Ld-u. Forstw. 110 1964 1–130

Classification of elongated plant viruses on the basis of particle morphology. Brandes, J. and Wetter, C. Virology 8 1959 99–115

Atlas of Plant Viruses . Vol. I-II. Francki, R.I.B., Milne, R.G. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton 1985

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-Heidelberg 1998 458 pp

The relationship between barley stripe mosaic and lychnis ringspot viruses. Gibbs, A.J., Kassanis, B., Nixon, H.L. and Wood, R.D. Virology 20 1963 194–198

The use of negative staining in the electron microscopic examination of plant viruses in crude extracts.


Irodalom

Hitchborn, J.H. and Hills, G.J. Virology 27 1965 528–540

Techniques for Electron Microscopy. Kay, D. Blackwell Scientific Publications Oxford 1961 1961

Use of thin sectioning for visualization and identification of plant viruses. Martelli, G.P. and Russo, M. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIIIOrlando 1984 143–224

Immunosorbent electron microscopy in plant virus studies. Milne, R.G. and Lesemann, D.-E. In Academic Press: New YorkMaramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIII 1984 85–101

Electron microscopy for the identification of plant viruses in in vitro preparations. Milne, R.G. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIINew York 1984 87–112

Electron microscopy of in vitro preparations. Milne, R.G. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 215–251

Elektronenmikroskopie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980a 329–353

Die Darstellung des Virus im Elektronmikroskop. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1. Schmidt, H.B. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980b 599–610

Localization of the 34 kDa polyhedron envelope protein in Spodoptera frugiperda cells infected with Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Van Lent, J.W.M., Groenen, J.T.M., Klinge-Roede, E.C., Rohrmann, G.F., Zuidema, D. and Vlak, J.M. Arch. Virol. III 1990 103–114

Comparison of ultrastructural changes of Nicotiana benthamiana infected with three different viruses. Almási, A., Ekés, M. and Gáborjányi, R. Acta Phytopath. et Entomol. 31 1996 181–190

Association of virions and coat protein of tobacco vein mottling potyvirus with cylindrical inclusions in tobacco cells. Ammar, E.D., Rodríguez-Cerezo, E., Shaw, J.G. and Pirone, T.P. Phytopathology 84 1994 520–524

Chlorophyll, chloroplast ribosomal RNA, DNA are reduced by barley stripe mosaic virus systemic infection. Brakke, M.K., White, J.L., Samson, R.G. and Joshi, J. Phytopathology 78 1988 570–574

Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida Agricultural Experiment Stations. Monograph Ser. Nr. 9., Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville 1977

Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant Dis. 70 1986 271

Cell to cell movement of tobacco ringspot virus. Davison, E.M. Virology 37 1969 694

Practical Plant Virology. Protocols and Excercises. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer VerlagBerlin-Heidelberg 1998 458 pp

Assembly of Enveloped RNA Viruses. Dubois-Dalcq, M., Holmes, K.V. and Rentier, B. Springer-VerlagWien 1984

Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton 1991

Inclusions in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen, M.A. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 101–128

Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968

Cauliflower mosaic virus gene II product forms distinct inclusion bodies in infected plant cells. Espinoza, A.M., Medina, V., Hull, R. and Markham, P.G. Virology 185 1991 337–344


Irodalom

Barley yellow mosaic virus: purification, electron microscopy, serology, and other properties of two types of the virus. Huth, W., Lesemann, D.-E. and Paul H.-L. Phytopath. Z. 111 1984 37–54

Electron microscopy of developmental stages of tomato spotted wilt virus in plant cells. Ie, T.S. Virology 2 1971 468–479

Plant virions in plasmodesmata. Kitajima, E.W. and Lauritis, J.A. Virology 37 1969 681

Comparative cytological and immunogold labelling studies on different isolates of tomato spotted wilt virus. Kitajima, E.W., Ávila, de A.C., Resende, R. de O., Goldbach, R.W. and Peters, D. J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 24 1992 1–14

Peripheral vesicles of barley stripe mosaic virus-infected wheat cells contain double-stranded RNA. Lin, N.-S. and Langenberg, W.G. Virology 142 1985 291–298

Coat protein-related polypeptides from in vitro tobacco mosaic virus coat protein mutants do not accumulate in the chloroplasts of directly inoculated leaves. Lindbeck, A.G.C., Dawson, W.O. and Thomson, W.W. Molecular Plant-Microbe Interactions 4 1991 89–94

Plant virus inclusion bodies. Martelli, G.P. and Russo, M. ( Adv. Virus Res. 21 1977 175

Host plant responses to virus infection. In: Fraenkel-Konrat, H. and Wagner, R.R. (Eds), Comprehensive Virology. Vol. 16. Matthews, R.E.F. Plenum Press Virus-Host InteractionsNew York 1980 297–359

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981

Ultrastructure of cell-wall thickenings and paramural bodies induced by barley stripe mosaic virus. Mc Mullen, C.R., Garden, W.S. and Myers, G.A. Phytopathology 67 1977 462–467

Aberrant plastids in barley leaf tissue infected with barley stripe mosaic virus. Mc Mullen, C.R., Garden, W.S. and Myers, G.A. Phytopathology 68 1978 317–325

Some effects of systemic infection by tomato spotted wilt virus on chloroplasts of Nicotiana tabacum leaves. Mohamed, N.A. Physiological Plant Pathology 3 1973 509–516

Association of TMV coat protein with chloroplast membranes in virus-infected leaves. Reinero A. and Beachy, R. Plant Molecular Biology 6 1986 291–301

Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with tobacco mosaic virus. Reinero A. and Beachy, R. Plant Physiol. 89 1989 111–116

The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt A.A. CAB InternationalCambridge 1994

Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida Agricultural Experiment Stations. Monograph Series. Nr. 9. Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Gainesville 1977

Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant Dis. 70 1986 273

Cytology of virus infection and virus transport. de Zoeten, G.A. Springer-Verlag In: Heitefuss, R. and Williams, P.H. (Eds), Physiological Plant PathologyBerlin 1976 129–149

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-Heidelberg 1998 458 pp

Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981

Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110


Irodalom

Néhány fontosabb növényi vírus tisztítási módszere. Balázs, E. és Vassányi, R. Növényvédelmi Kutató IntézetBudapest 1984 34 pp

Virus degradation and nucleic acid isolation. Bruening, G.E. In: Kado, C.I. and Agrawal, H.O. (Eds), Principles and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold, Princeton 1972. pp 1972 444–465

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–Heidelberg 1998 458 pp

The potential for using double stranded RNAs as diagnostic probes for plant viruses. Dodds, J.A. In: R.A.C. Jones and L. Torrance. (Eds), Developments in Applied Biology 1. Developments and Applications in Virus Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK 1986 71–86

Serological comparison of tospoviruses with polyclonal antibodies against the main structural proteins of TSWV. Feldhoff, A., Kikkert, M., Kormelink, R., Krczal, G., Goldbach, R. and Peters, D. X. Intern. Congr. Virology, Jerusalem, p 1996 119

Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp

Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Fraenkel-Conrat, H. Virology 4 1957 1–4

Purification of potato virus X and preparation of infectious ribonucleic acid by degradation with lithium chloride. Francki, R.I.B. and McLean, G.D. Australian J. Biol. Sci. 21 1968 1311–1318

A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities. Gooding, G.W., Jr. and Hebert, T.T. Phytopathol. 57 1967 1285

Methods in Enzymology. Vol. 12A and 12 B. Grossman, L. and Moldave, L. Nucleic Acids. Academic PressNew York 1967-1968

Propagation of DNA viruses. Methods in Enzymology. Vol. 118. Guilfoyle, T.J. Academic PressNew York 1986 696–704


Application of double-stranded RNA analysis of plants to detect viruses, virus-like agents, virus satellites and subgenomic viral RNAs. Jones, A.T. In: J.M. Duncan and Torrance, L. (Eds), Techniques for the Rapid Detection of Plant Pathogens. Blackwell Scientific Publications, Oxford 1992 115–128

Propagation and Purification of RNA Viruses. Lane, L. Academic Press Methods in Enzymology. Vol. 118New York 1986 687–696

Estudio de la transmisión por áfidos del virus de la sharka, „plum pox virus” (PPV). López-Moya, J.J. Thesis Doctoral, Univ. Politécnica de Madrid 1993 32–34

The use of hot phenol in preparing DNA. Massie, H.R. and Zimm, B.H. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 54 1965 1641–1643

Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue. Morris, T.J. and Dodds, J.A. Phytopathology 69 1979 854–858

Viral specific dsRNA: diagnostic value for plant virus disease identification. Morris, T.J., Dodds, J.A., Hillman, B., Jordan, R.L., Lommel, S.A. and Tamaki, S.J. Plant Molecular Biology Rep. 1 1983 27–30

CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne, Warwick 1970-1988

Transmission of several plant viruses by phenol-water extracts of diseased tissues. Schlegel, D. Phytopathology 50 1960 156–158

DNA in cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Wakeman, R.J. and Romanko, R.R. Virology 36 1968 150–152


Irodalom

Double stranded DNA from cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Bruening, G.E. and Wakeman, R.J. Virology 41 1970 339–347

Purification and serological analysis of tomato spotted wilt virus. Tas, P.W. L., Boerjan, M.L. and Peters, D. Neth. J. Pl. Path. 83 1977 61–72

Isolation and properties of virus proteins. Tsugita, A. and Hirashima, A. In: Kado, C. I. and Agrawal, H. (Eds), Principles and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold Co. New York 1972 413–443

Double-stranded RNA analysis of strawberry plants affected by June yellows. Watkins, C.A., Jones, A.T. Mayo, M.A. and Mitchell M.J. Ann. Appl. Biol. 117 1990 73–83

Isolation and characterization of a protein subunit of broadbean mottle virus. Yamazuki, H. and Kaesberg, P. J. Mol. Biol. 6 1963 465–673

Molecular biology and molecular genetics of plant bromoviruses. Ahlquist, P. Plenum Press In: von Wettstein. D. and Chua, N.H (Eds), Plant Molecular BiologyNew York 1987 419–431

Nucleotide sequence of brome mosaic virus genome and its implications for virus replication. Ahlquist, P., Dasgupta, R. and Kaesberg, P. J. Mol. Biol. 172 1984 369–383

Complete nucleotide sequence of brome mosaic virus RNA3. Ahlquist, P., Luckow, V. and Kaesberg, P. J. Mol. Biol. 153 1981 23–38

Nucleotide sequence of DNA from an altered-virulence isolate D/H of the cauliflower mosaic virus. Balázs, E., Gulley, H., Jonard, G. and Richards, K. Gene 19 1982 239–249

A defective interfering RNA molecule in Cymbidium ringspot virus. Burgyán, J., Grieco, F. and Russo, M. J. Gen. Virol. 70 1989 235–239

Non-geminated single stranded DNA plant viruses. Chu, P. Boevink, P., Surin, B., Larkin, P., Keese, P. and Waterhouse, P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds), Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 311–341

Genom expression of plant positive-strand RNA viruses. Davies, J.W. and Hull, R. J.Gen. Virol. 61 1982 1–14

Translation of mRNA: Protein synthesis directed by several virus RNAs in a cell-free extract from wheat germ. Davies, J.W. and Kaesberg, P. J. Gen. Virol. 25 1974 11–20

Tospoviruses. de Haan, P. Academic Press In: Webster, R.W. and Granoff, A. (Eds), Encyclopedia of VirologyLondon, Vol. 3 1994 1459–1464

Geminiviruses. Dhar, A.K. and Singh, R.P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds), Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 289–309

The cowpea mosaic virus RNA replication complex and the host-encoded RNA-dependent RNA polymerase-template complex are functionally different. Dorssers, L., van der Meer, J., van Kammen, A. and Zabel, P. Virology 125 1984 155–174

Translation of potyvirus RNA in a rabbit reticulocyte lysate: Reaction conditions and identification of capsid protein as one of the products in vitro translation of tobacco etch and pepper mottle viral RNAs. Dougherty, W.G. and Hiebert, E. Virology 101 1980 466–474

A novel subviral agent associated with a geminivirus. Dry, I.B., Krake, L.R., Rigden, J.E. and Rezaian, M.A. The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093

Translation of TMV-RNA in a cell-free wheat embryo system. Efron, D. and Marcus, A. Virology 53 1973 343–348

Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi, R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp

Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp


Irodalom

Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA. Franck, A., Gullley, H., Jonard, I.G., Richards, K. and Hirth. L. Cell 21 1980 285–294

Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 151–174

The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing. Gardner, R.C., Howarth, A., Hahn, P., Brown-Leudi, M., Shepherd, R.J. and Messing, J. Nucleic Acid Res. 9 1981 2871–2888

Tospoviruses. Diagnosis, molecular biology, phylogeny and vector relationship. German, T.L., Ullman, D.E. and Mayer, J.W. Annu. Rev. Phytopathol. 30 1992 315–348

Goelet, P., Lomonosoff, G.P., Butler, P.J.G., Akam, M.E., Gait, M.J. and Karn, J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79 5818–5822 Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA.

Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24: 1986 289–310

Structure, replication, and expression of the bipartite genome of cowpea mosaic virus. Goldbach, R. and van Kammen, A. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed.). Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida 1985 83–120

Cucumber mosaic virus replication in cowpea protoplasts: Time course of virus, coat protein and RNA synthesis. Gonda, T.J. and Symons, R.H. J. Gen. Virol. 45 1979 723–736

Observations concerning the discontinuous DNAs of cauliflower mosaic virus. Gulilley, H., Richards, K.E. and Jonard, G. EMBO J. 2 1983 277–282

Advances in geminivirus research. Harrison, B.D. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 55–82

Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B.D., Mayo, M.A. and Baulcombe, D.C. Nature 328 1987 799–802

A defective interfering RNA that contains mosaic of a plant virus genome. Hillman, B.I., Carrington, J.C. and Morris, T.J. Cell 51 1987 427–433

Replication of cauliflower mosaic virus and transcription of its genome in turnip leaf protoplasts. Howell, S.H. and Hull, R. Virology 86 1978 468–481

Does the cauliflower mosaic replicate by reverse transcription? Hull, R. and Covey, S.N. Trends Biochem. Sci. 8 1983 119–121

Structure and replication of caulimovirus genomes. Hull, R., Covey, S.N. and Maule, A.J. J. Cell Sci., Suppl. 7 1987 213–229

Infection of protoplasts from soybean cell culture with southern bean mosaic and cowpea mosaic viruses. Jarvis, N.P. and Murakishi, H.H. J. Gen. Virol. 48 1980 365–376

Cucumber mosaic virus-associated RNA5. Kaper, J.M. and Waterworth H.E. Causal agent for tomato necrosis. Science 196 1977 429–431

Cucumoviruses. Kaper, J.M. and Waterworth, H.E. Elsevier-North Holland Biomedical Press In: Kurstak, E. (Ed), Handbook of Plant Infections and Comparative DiagnosisAmsterdam 1981 257–332

The nucleic acid sequence of cowpea mosaic virus B RNA. Lomonossoff, G.P. and Shanks, M. EMBO J. 2 1983 2253–2258

Viral taxonomy for the nonvirologist. Matthews, R.E.F. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 451–474

Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego, London 1991 835 pp

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

The nucleotide sequence of maize streak virus DNA. Mullineaux, P. M., Donson, J., Morris-Krsinich, B.A.M.,


Irodalom

Boulton, M.I. and Davies, J.W. EMBO J. 3 1984 3063–3069

Satellites of plant viruses Murant, A.F. and Mayo, M.A. Ann. Rev. Phytopathol. 20 1982 49–70

Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: sequence and structure requirement and accuracy of crossovers. Nagy, P.D. and Bujarski, J.J. J.Virol. 69 1995 131–140

Time course of alfalfa mosaic virus RNA and coat protein synthesis in cowpea protoplasts. Nassuth, A., Bruggencate, G. and Bol, J.F. Virology 125 1983 75–84

A szilvahimlő vírus molekuláris klónozása, új diagnosztikai módszer kifejlesztése és transzgénikus vírusrezisztens növények előállítása. Palkovics, L. Ph.D. értekezés, Gödöllő 1996 1–113

Comparative sequence analysis of four complete primary structures of plum pox virus strains. Palkovics, L., Burgyán, J. and Balázs, E. Virus Genes 7 1993 339–247

Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: A detailed model and test of some aspects. Pfeifer, P. and Hohn, T. Cell (Cambridge, Mass.) 33 1983 781–789

Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., Goldbach, R. and van Kammen, A. J. Virol. 36 1980 366–373

Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., van Kammen, A., and Wellink, J. J. Gen. Virol. 70 1989 3043–3050

Highlights and prospects of potyvirus molecular biology. Riechmann, J.L., Lain, S. and Garcia, J.A. J. Gen. Virol. 73 1992 1–16

Mechanisms of plant virus evolution. Roossinck, M. J. Annu. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209

Effects of defective interfering viruses on virus replication and pathogenesis in vitro and in vivo. Roux, L., Simon. A.E. and Holland J.J. Adv. Virus Res. 40 1991 181–211

The molecular biology of geminiviruses. Stanley, J, Adv. Virus Res. 30 1985 139–177

Structure and function of the DNA geminiviruses. Stanley, J. and Davies, J.W. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed), Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida 1989 191–218

The use of protoplasts in plant virology. Takebe, I. Annu. Rev. Phytopathol. 13 1975 105–125

Monoclonal antibodies against tomato spotted wilt virus: Characterization and application. Adam, G., Lesemann, D. E. and Vetten H. J. Ann. Appl. Biol. 118 1991 87–104

Immunochemical studies of tobacco mosaic virus. VI. Altschuh, D., Al Moudallal, Z., Briand, J. P. and Van Regenmortel, M. H. V. Attempts to localize viral epitopes with monoclonal antibodies. Mol. Immunol. 22 1985 329–337

Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution. Amitt, A. G., Marinzza, R. A., Phillips, S. E. V. and Poljak, R. J. Science 233 1986 747–753

Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Avrameas, S. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies. Immunochemistry 6 1969 43–52

Plant Dis. 69, 202–205. Banttari, E. E. and Goodwin, P. H. (1985) Detection of potato viruses S, X, and Y by enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (Dot-ELISA).

A simple indirect ELISA using F(ab’)2 fragments of immunoglobulin. Barbara, D. J. and Clark, M. F. J. Gen. Virol. 58 1982 315–322

Application of new test procedures to surveys: merging the new with the old. Barnett, O. W. In: Jones, R. A. C. and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, pp 1986 247–268


Irodalom

Textbook of Immunology. Barrett, J. T. C. V. Mosby CoSt. Louis, MO 1988 455 pp

Preparation of antigens, viruses. Brakke, M. K. APS Press In: Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. H. (Eds), Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant PathogensSt. Paul, Minnesota 1990 15–26

Serological differentiation of tobamoviruses by means of monoclonal antibodies. Briand, J. P., Al Moudallal, Z. and Van Regenmortel, M. H. V. J. Virol. Meth. 5 1982 293–300

Cross-protection and multiplication of mild and severe strains of TMV in tomato plants. Burgyán, J. and Gáborjányi, R. Phytopath. Z. 110 1984 156–167

Monoclonal Antibody Technology: The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas. Campbell, A. M. ElsevierNew York 1984 265 pp

Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Clark, M. F. and Adams, A. N. J. Gen. Virol. 34 1977 475–483

Enzyme immunosorbent assays in plant virology. Clark, M. F. and Bar-Joseph, M. Academic Press In: Maramorosh, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIIOrlando 1984 51–85

Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase. Colman, P. M., Laver, W. G., Varghese, J. N., Baker, A. T., Tulloch, P. A., Air, G. M. and Webster, R. G. Nature 326 1987 358–365

Practical Plant Virology. Dijksra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-Heidelberg 1998 458 pp

Plant virus detection using a new form of indirect ELISA. Edwards, M. L. and Cooper, J. I. J. Virol. Methods 11 1985 309–319

T cell receptors: Structure and genetics. Ezquerra, A. and Coligan, J. E. Current Opinion in Immunol. 1 1988 77–83

Interaction of major histocompatibility complex molecules with immunogenic peptides. Fox, B. S. Current Opinion in Immunol. 1 1988 103–106

Monoclonal antibodies: Principles and Practice. Goding, J. W. Academic Press Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and ImmunologyNew York 1983 276 pp

Serological identification of potato Y virus and tobacco etch virus using immunodiffusion plates containing sodium dodecyl sulfate. Gooding, G. V. and Bing, W. W. Phytopathology 60 1970 1293

Rocket immunelectrophoresis assay for cauliflower mosaic virus. Hagen, T. J., Taylor, D. B. and Meagher, R. B. Phytopathology 72 1982 239–242

Monoclonal antibodies in plant-disease research. Halk, E. L. and De Boer, S. H. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 321–350

APS Press: St. Paul, Minnesota Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. (Eds) (1990) 387 pp Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens.

Antibodies. A laboratory manual. Harlow, E. and Lane, D. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY 1988 726 pp

A quantitative theory of the precipitin reaction. II. Heidelberger, M. and Kendall, F. E. A study of an azoprotein – antibody system. J. Exp. Med 1935 62, 467

Herstellung und Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern gegen fünf Stämme des Wasserrübenmosaikvirus (Turnip mosaic virus, TuMV). Herscheid, R. Inaugural Dissertation zur Erlangung des Grades Dr. agr. Bonn 1992 122 pp

A dot immunobinding assay for the detection of tobacco mosaic virus in infected tissues. Hibi, T. and Saito, Y. J.


Irodalom

Gen. Virol. 66 1985 1191–1194

Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R. E: F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 15–48

Towards a network theory of the immune system. Jerne, N. K. Ann. Immunol. (Inst. Pasteur). 125C 1974 373–389

Serological properties of viruses and their fragments. Kleckowski, A. In: Beemster, A. B. R. and Dykstra, J. (Eds), Viruses of Plants. North-Holland, Amsterdam 1966 196 pp

Applications of immuno-blotting in plant virus diagnosis. Koenig, R. and Burgermeister, W. In: Jones, R. A. C. and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Developments in Applied Biology. Association of Applied Biologists. Wellesbourne, pp 1986 121–138

Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Kohler, G. és Milstein, C. Nature 256 1975 495–497

Electroimmunoassay. Laurell, C. B. and McKay, E J., Academic Press In: Langone, J. J. and van Vunakis, H. (Eds), Methods in Enzymology. Part B. Immunochemical Techniques. Vol. 73New York 1981 339–369

Immunological detection of plant viruses and a mycoplasmalike organism by direct tissue blotting on nitrocellulose membranes. Lin, N. S., Hsu, Y. H. and Hsu, H. T. Phytopathology 80 1990 824–828

Evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Lommel, S. A., McCain, A. H. and Morris, T. J. Phytopathology 72 1982 1018–1022

Antigen recognition overwiev. Long, E. O. and Kindt, T. J. Current Opinion in Immunol. 1 1988 71–72

Plant Virus Serology. Matthews, R. E. F. University PressCambridge 1957 128 pp

Serological characterization of Hungarian plum pox virus isolates. Moya, J. L., Abella, D. L., Rúiz, J. R., Garcia, B. M. and Gáborjányi, R. Z. Naturforsch. 52 1997 1–5

Identification of Plant Viruses: Methods and Experiments. Noordam, D. Center Agric. Publ. Document, Wageningen 1973 207 pp

Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis. Ouchterlony, O. Ann. Arbor Science Publishers, Inc. Ann Arbor 1968 215 pp

Specific precipitation in gels and its application to immunochemical analysis. Oudin, J. Year Book Publishers Inc In: Corcoran, A. (Ed), Methods in Medical Research. Vol. 5Chicago 1952 335–378

Immunodiffusion tests with sodium dodecyl sulfate (SDS)-treated plant viruses and plant viral inclusions. Purcifull, D. E. and Batchelor, D. L. Fla. Agric. Exp. Stn. Tech. Bull. 788 1977). 1–39

Improvements in the passive hemagglutination technique for serological detection of plant viruses. Rajeshwari, R., Reddy, D. V. R. and Izuka, N. Phytopathology, 71 1981 306–308

Development of a dot-immunobinding assay for detection of citrus tristeza virus. Rocha-Pena, M. A., Lee, R. F. and Niblett, C. L. J. Virol. Meth. 34 1991 297–309

Potato Viruses and Their Control. Salazar, L. F. IPC PessLima 1996 214 pp

Gel-Diffusion Methods for the Serological Detection of Potato Viruses X, S and M. Shepard, J. F. Montana State Univ. Bull. 662 1972 1–71

Immunochemical cross-reactivity between the dissociated capsid proteins of PVY group plant viruses. Shepard, J. F., Secor, G. A. and Purcifull, D. E. Virology 58 1974 464–475

Three dimensional structure of an antobody-antigen complex. Sheriff, S., Silverton, E. V., Padlam, E. A., Cohen, G. H., Smith-Gill, S. J., Finzel, B. C. and Davies, D. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 1987 8075–8079


Irodalom

Detection of viral antigens by direct one-incubation time-resolved fluoroimmunoassay. Siitari, H., Lovgren, T. and Halonen, P. In: Jones, R. A. C. and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, pp 1986 155–164

Hybridoma Technology in Agricultural and Veterinary Research. Stern, N. and Gamble, H. R. Rowman and AllenheldNew Yersey 1984 318 pp

The use of rocket immunoelectrophoresis to detect tobacco mosaic virus in infected pepper tissues. Tóbiás, I., Hornok, L. and Balázs, E. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung 14 1979 231-237

Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Tobwin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 1979 4350–4354

Use of protein A to improve sensitisation of latex particles with antibodies to plant viruses. Torrance, L. Ann. Appl. Biol. 96 1980 45–50

Single radial immunodiffusion. Vaerman, J. P. Methods Enzymol. 73 1981 291–305

Detection of a wide spectrum of tobacco mosaic virus strains by indirect enzyme immunoassay (ELISA). van Regenmortel, M. H. V. and Burckard, J. Virology 106 1980 327–334

Serology and Immunochemistry of Plant Viruses. van Regenmortel, M. H. V. Academic PressNew York 1982 302 pp

Molecular dissection of protein antigens and the prediction of epitopes. van Regenmortel, M. H. V. Elsevier Science Publ. Co. Inc In: Burdon, R.H. and van Kippenberg, P. H. (Eds), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyNew York 1988 1–40

Serological procedures. van Regenmortel, M. H. V. and Dubs, M. C. CRC Press In: Matthews, R. E. F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 159–214

Serology in virus disease diagnosis. Wetter, C. Ann. Rev. Phytopathol. 3 1965 19–42

Gene Cloning. Brown, T.A. An introduction. Chapman and Hall 1990

Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin-Heidelberg 1998 458 pp

Nucleic Acid Hybridisation. Hames, B.D. and Higgins, S.J. IRL Press A Practical ApproachOxford 1985

Nucleic acid hybridization procedures. Hull, R. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant VirusesBoca Raton 1993 254–271

Plant Virology. Third Edition. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 1992. 403 pp

A new methode of sequencing DNA. Maxam, A. and Gilbert, W. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 1977 560–564

Comparative stucture of viroids and their rapid detection using radioactive and nonradioactive nucleic acid probes. McInnes, J.L. and Symons, R.H. CRC Press In: Maramorosch, K. (Eds), Viroids and Satellites: Molecular Parasites at the Frontier of LifeBoca Raton 1991

Orvosi biológia. I. Genom, gének, sejtfunkciók. Molnár, J. Egyetemi jegyzet, SZOTE, Szeged 1991

Enzymatic amplification of α-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim, N. Science 230 1985 1350–1354

Génsebészet. Sain, B. és Erdei S. Gondolat KiadóBudapest 1985

A rapid method for determining sequences in DNA by primer synthesis with a DNA polimerase. Sänger, F. and Coulson, A.R. J. Molecular Biol. 94 1975 441


Irodalom

Molecular Cloning. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989

The immunoassay of gibberellins II. Quantitation of GA3, GA4 and GA7 by ultra-sensitive solid-phase enzyme immunoassay. Atzorn, R. and Weiler, E. W. Planta 159 1983 7–11

Mass spectrometric identification of indole compounds produced by Rhizobium strains. Biomed. Badenoch-Jones, J., Summons, R. E., Entsch, B., Rolfe, B. G., Parker, C. W. and Letham, D. S. Mass Spectrom. 9 1982 429–437

Phytohormones, Rhizobium mutants, and nodulation in legumes. Badenoch-Jones, J., Summons, R., Rolfe, B. G. and Letham, D. S. Auxin metabolites in pea root nodules. J. Plant Growth Regul. 3 1984 23–39

Gibberellins and the early disease syndrome of aspermy virus in tomato (Lycopersicon esculentum [Mill.]). Bailiss, K. W. Ann. Bot. 32 1968 543–551

Gibberellins, Abscisic Acid and Virusinduced Stunting. Bailiss, K. W. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.), Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977 361–373

Ethylene production in Xanthi tobacco after systemic and local virus infections. Balázs, E., Gáborjányi, R., Tóth, A. and Király, Z. Acta Phytopath. Hung. 4 1969 355–358

Leaf senescence and increased virus susceptibility in tobacco. Balázs, E., Gáborjányi, R. and Király, Z. The abscisic acid. Physiol. Plant. Path. 3 1973 341–346

The role of cytokinins in the systemic acquired resistance of tobacco hypersensitive to tobacco mosaic virus. Balázs, E., Sziráki, I. and Király, Z. Physiol. Plant Path. 11 1977 29–37

The problem of halting enzyme action when extracting plant tissues. Bieleski, W. J. Anal. Biochem. 9 1964 431–442

Modern methods for plant growth substance analysis. Brenner, M. L. Ann. Rev. Plant Physiol. 32 1981 511–538

Membrane localised gibberellins A9 and A4 in wheat chloroplasts. Browning, G. and Saunders, P. F. Nature 265 1977 375–377

A rapid and simple procedure for purification of indole-3-acetic acid prior to GC-SIM-MS analysis. Chen, K-H., Miller, A. N., Patterrson, G. W. and Cohen, J. D. Plant Physiol. 86 1988 822–825

Convenient apparatus for the generation of small amounts of diazomethane. Cohen, J. D. J. Chromatogr. 303 1984 193–196

Modern methods of analysis of gibberellins. Crozier, A. and Durley, R. C. Praeger In: Crozier, A. (Ed.), The Biochemistry and Physiology of the Gibberellins. Vol. INew York 1983 485–560

NaCl reduces indole-3-acetic acid levels in the roots of tomato plants independent of stress-induced abscisic acid. Dunlap, J. R. and Binzel, M. L. Plant Physiol. 112 1996 378–384

Reversion of dwarfing induced by virus infection; effect of polyacrylic gibberellic acids. Fernandez, T. F. and Gáborjányi, R. Acta Phytopath. Hung. 11 1976 271–275

Indole-3-acetic acid. Mass spectra and chromatographic properties of amino acid conjugates. Feung, C. S., Hamilton, R. H. and Mumma, R. O. J. Agric. Food Chem. 23 1975 1120–1124

Ethylene production, tissue senescence and local virus infections. Gáborjányi, R., Balázs, E. and Király, Z. Acta Phytopath. Hung. 6 1971 51–56

Growth inhibition of virus-infected plants: Alterations of peroxidase enzymes in compatible and incompatible host-parasite relations. Gáborjányi, R., Sági, F. and Balázs, E. Acta Phytopath. Hung. 8 1973 81–90

Gibberellins. Hedden, P. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 9–110


Irodalom

Modern methods for the quantitative analysis of plant hormones. Hedden, P. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44 1993 107–129

Modern methods for plant hormone analysis. Horgan, R. Pergamon In: Rheinhold, L., Harborne, J. B. and Swain, T. (Eds.), Progress in Phytochemistry. Vol. VIIOxford 1981 137–170

Cytokinins. In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. II. Horgan, R. and Scott, I. M. Academic PressLondon 1987 303–365

Analysis of gibberellins and gibberellin conjugates by ion-supression reversed-phase high-performance liquid chromatography. Jensen, E., Crozier, A. and Monteiro, A. M. J. Chromatogr. 367 1986 377–384

The five „classical” plant hormones. Kende, H. and Zeevart, J. A. D. Plant Cell 9 1997 1197–1210

New method of detecting traces of illuminating gas. Knight, L. I., Rose, R. C. and Crocker, W. Science 31 1910 635

Cytokinin levels and kinetin-virus interactions in tobacco ringspot virus-infected cowpea. Kuriger, W. E. and Agrios, G. N. Phytopathology 67 1977 604–609

Thin layer chromatography of gibberellins. MacMillen, J. and Suter, P. J. Nature 197 1963 790

A mathematical treatment for rate data obtained in biological flow systems under nonsteady state conditions. Marynick, D. S. and Marynick, M. C. Plant Physiol. 56 1975 680–683

Derivatives of indole-3-acetic acid for SIM GC-MS studies. McDougall, J. and Hillman, J. R. Z. Pflanzenphysiol. 98 1980 89–93

Effect of deseeding on the indole-3-acetic acid contents of shoots and roots of Zea mays seedlings. Momonoki, Y. S., Schulze, A. and Bandurski, R. S. Plant Physiol. 72 1983 526–529

Ethylene production by detached leaves infected with tobacco mosaic virus. Nakagaki, Y., Hirai, T. and Stahmann, M. A. Virology 40 1970 1–9

Abscisic acid and related compounds. Neill, S. J. and Horgan, R. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 111–167

Oxidation of indole-3-acetic acid and oxindole-3-acetic acid to 2,3-dyhidro-7-hydroxy-2-oxo 1 H indole-3-acetic acid-7’-O-b-D-glucopyranoside in Zea mays seedlings. Nonhebel, H. M. and Bandurski, R. S. Plant Physiol. 76 1984 979–983

Effect of tobacco mosaic virus infection on the endogenous levels of indoleacetic, phenylacetic and abscisic acids of tobacco leaves in various stages of development. Rajagopal, R. Z. Pflanzenphysiol. 83 1977 403–409

Chemical ionization mass spectrometry of IAA and ABA: evaluation of negative ion detection and quantification of ABA in growing maize roots. Rivier, L. and Saugy, M. J. Plant Growth Regul. 5 1986 1–16

Validation of a radioimmunoassay for (+)-abscisic acid in extracts of apple and sweet-pepper tissue using high-pressure liquid chromatography and combined gas chromatography-mass spectrometry. Rosher, P. H., Jones, H. G. and Hedden, P. Planta 165 1985 91–99

Growth regulators and the effect of barley yellow dwarf virus on barley (Hordeum vulgare L.). Russel, S. L. and Kimmins, W. C. Ann. Bot. 35 1971 1037–1043

Ethylene. Saltveit, M. E., Jr. and Yang, S. F. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon 1987 367–401

Indole-3-acetic acid and related compounds. Sandberg, G., Crozier, A. and Ernstsen, A. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon 1987 169–301

Esterification of fatty acids with diazomethane on a small scale. Schlenk, H. and Gellerman, J. Anal. Chem. 32


Irodalom

1960 1412–1414

Alterations in the auxin levels of resistant and susceptible hosts induced by the curly-top virus. Smith, S. H., McCall, S. R. and Harris, J. H. Phytopathology 58 1968 575–577

The effect of infection by TMV on cytokinin level of tobacco plants, and cytokinin in TMV-RNA. Sziráki, I. and Balázs, E. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.), Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977 345–352

The influence of kinetin on tobacco ringspot virus infectivity and the effect of virus infection on the cytokinin activity in intact leaves of Nicotiana glutinosa L. Tavantzis, S. M., Smith, S. H. and Witham, F. H. Physiol. Plant Path. 14 1979 227–233

Effects of auxin on the localization of tobacco mosaic virus in hypersensitively reacting tobacco. Van Loon, L. C. Physiol. Plant Path. 14 1979 213–226

Etude spectroscopique (IR, NMR1H, masse) comparée des acides indolyl-1 acétique (AIA-1), indolyl-2 acétique (AIA-2), et indolyl-3 acétique (AIA-3) et de leurs esters méthyliques (masse). Vebrel, J., Laude, B., Seguin, A. and Dubouchet, J. Spectrochim. Acta 39 1983 887–894

The role of cytokinins in relation to flower-bud blasting in Iris cv. Ideal: Cytokinin determination by an improved enzyme-linked immunosorbent assay. Vonk, C. R., Davelaar, E. and Ribot, S. A. Plant Growth Regul. 4 1986 65–74

Effect of systemic and local-lesion-forming strains of tobacco mosaic virus on abscisic acid concentration in tobacco leaves: Consequences for the control of leaf growth. Whenham, R. J. and Fraser, R. S. S. Physiol. Plant Pathol. 18 1981 267–278

High-performance liquid chromatography of plant hormones. II. Wurst, M., Pikryl, Z, and Vokoun, J. Determination of plant hormones of the indole type. J. Chromatograph. 286 1984 237–245

Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Apostol, I., Heinstein, P.F. and Low, P.S. Plant Physiol. 90 1989 109–116

Chloroplast: formation of active oxygen and its scavenging. Asada, K. Acad. Press In: Colowick, S.P. and Kaplan, N.O. (Eds), Methods in Enzymology. Vol. 105New York 1984 422–429

Early responses during plant-bacteria interactions in tobacco cell suspensions. Baker, C.J., O’Neill, N.R., Keppler, L.D. and Orlandi, E.W. Phytopathology 81 1991 1504–1507

Active oxigen in plant pathogenesis. Baker, C.J. and Orlandi, E.W. Annu. Rev. Phytopathol. 33 1995 299–321

Localization of hydrogen-peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bestwick, C.S., Brown, I.R., Benett, M.H.R. and Mansfield, J.W. Plant Cell 9 1995 209–221

Tissue printing on nitrocellulose paper: a new method for immunolocalization of proteins, localization of enzyme activities and anatomical analysis. Cassab, G.I. and Varner, J.E Cell Biol. Int. Rep. 13 1989 147–152

Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Chen, Z., Silva, H. and Klessig, D.F. Science 262 1993 1883–1886

Death don’t have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Dangl, J.L., Dietrich, R.A. and Richberg, M.H. Plant Cell 8 1996 1793–1807

Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Delledonne, M., Xia, Y., Dixon, R.A. and Lamb, C.J. Nature 394 1998 585–588

Leaf senescence: Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and decreased level of superoxide dismutase and catalase. Dhindsa, R.S., Plumb-Dindsa, P.and Thrope, T.A. J. Exp. Bot. 32 1981 93–101


Irodalom

Early events in the activation of plant defense responses. Dixon, R.A., Harrison, M.J. and Lamb, C.J. Annu. Rev. Phytopathol. 32 1994 479–501

Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissue to infection with an incompatibile race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Doke, N. Physiol. Plant Pathol. 23 1983 345–357

Involvement of an O2 generating system in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with tobacco mosaic virus. Doke, N. and Ohashi Y. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 163–175

Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Durner, J., Wendehenne, D. and Klessig, D.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 1998 10328–10333

Mechanisms of oxygen activation during plant stress. Elstner, E.F. and Osswald, W. In: Crawford, R.M.M., Hendry, G.A.F. and Goodman, B.A. (Eds) Oxygen and enviromental stress in plants. Royal Society of Edinburgh, Edinburgh, pp 1994 131–154

Local and systemic responses of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to salicylic acid in tobacco. Fodor, J., Gullner, G., Ádám, A.L., Barna, B., Kőmíves, T. and Király, Z. Role in systemic acquired resistance. Plant Physiol. 114 1997 1443–1451

An improved method for monitoring active oxygen in bacteria-treated suspension cells using luminol-dependent chemiluminescence. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. Harmon, G.L. and Baker, C.J. Physiol. Mol. Plant Pathol. 39 1991 123–133

The active oxygen response of cell suspensions to incompatible bacteria is not sufficient to cause hypersensitive cell death. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. and Baker, C.J. Plant Physiol. 110 1996 759–763

Antioxidants in nutrition, health, and disease. Gutteridge, J.M.C. and Halliwell, B. Oxford University PressNew York, pp 1994 10–13

Properties and physiological function of a glutathione reductase purified from spinach leaves by affinity chromatography. Halliwell, B. and Foyer, C.H. Planta 139 1978 9–7

Resistance gene-dependent plant defense responses. Hammond-Kosack, K.E. and Jones, J.D.G. Plant Cell 8 1996 1773–1791

Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Heath, R.L. and Packer, L. Kinetics and stochiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophys. 125 1968 189–198

Plasma membrane alteration during bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco suspension cells as monitored by intracellular accumulation of fluorescein. Keppler, L.D., Atkinson, M.M. and Baker, C.J. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 209–219

Role of extracellular polysaccharide (EPS) slime of plant pathogenic bacteria in protecting cells to reactive oxygen species. Király, Z., El-Zahaby, H.M. and. Klement, Z. J. Phytopathology 145 1997 59–68

Scavenging of hydrogen peroxide in the endosperm of Ricinus communis by ascorbate peroxidase. Klapheck, S., Zimmer, I. and Cosse, H. Plant Cell Physiol. 31 1990 1005–1013

Hypersensitivity. Klement, Z. Academic Press In: Mount, M.S. and Lacy, G.H. (Eds), Phytopathogenic ProcaryotesNew York 1982 149–177

The salicylic acid signal in plants. Klessig, D.F. and J. Malamy Plant Mol. Biol. 26 1994 1439–1458

Hypersensitive cell death, autofluorescence, and insoluble silicon accumulation in barley leaf epidermal cells under attack by Erysiphe graminis f. sp. hordei. Koga, H., Zeyen, R.J., Bushnell, W.R. and Ahlstrand, G.G. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 395–409

Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco. Léon, J., Lawton, M.A. and Raskin, I. Plant Physiol. 108 1995 1673–1678


Irodalom

H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. Cell 79 1994 583–593

Alternative solutions to radical problems. Millar, A.H. and Day, D.A. Trends in Plant Science 2 1997 289–290

Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during a pathogen-induced hypersensitive response at low oxygen pressure. Mittler, R., Shulaev, V., Seskar M. and Lam, E. Plant Cell 8 1996 1991–2001

Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Nakano, Y and Asada, K. Plant Cell Physiol. 22 1981 867–880

Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatment. Okuda, T., Matsuda, Y., Yamanaka, A. and Sagisaka, S. Plant Physiol. 97 1991 1265–1267

Hydrogen peroxide and lignification. Olson, P.D. and Varner, J.E. Plant J. 4 1993 887–892

Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using Titanium(IV). Patterson, B.D., MacRae, E.A. and Ferguson, I.B. Anal. Biochem. 139 1994 487–492

Bonckés alatt a kutatás. Selye, J. Kriterion könyvkiadóBukarest 1975

Ökologische Biochemie (2 Auflage). Schlee, D. Gustav Fischer VerlagJena 1992

Histochemical demonstration and localization of H2O2 in organs of higher plants by tissue printing on nitrocellulose paper. Schopfer, P. Plant Physiol. 104 1994 1269–1275

A comparison of methods for determination of the oxidative burst in whole plants. Schroeder, A.T., Martin, G. and Low, P.S. In: Stacey, G., Mullin, B. and Gresshoff, P.M. (Eds), Biology of Plant-Microbe Interactions, Proc. 8th International Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions St. Paul, pp 1996 15–20

The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection. Sutherland, M.W. Physiol. Mol. Plant Pathol. 39 1991 79–93

Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitve response during the barley-powdery mildew interaction. Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. and Collinge, D. B. Plant J. 11 1997 1187–1194

Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Warm, E. and Laties, G.G. Phytochemistry 21 1982 827–831

Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. Wu, G., Shortt, B.J., Lawrence, E.B., Levine, E.B. and Fitzsimmons, K.C. Plant Cell 7 1995 1357–1368

Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide. Yim, M.B., Chock, P.B. and Stadtman, E.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 5006–5010

Guidelines for the conduct of tests for distinctness uniformity and stability. Anonymous, Sweet pepper. UPOV Internat. Union for the Protection of New Varieties of Plants. TG6/7. Geneve 1994 22 pp

Inheritance of resistance to potato viruses Y and A in progeny obtained from potato cultivars containing gene Ry: evidence for a new gene for extreme resistance to PVA. Barker, H. Theor. Appl. Genet. 93 1996 710–716

Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato. Beczner, L., Horváth, J., Romhányi, I. and Förster, H. Potato Res. 27 1984 339–352

Resistance to TMV in Capsicum chacoense Hunz is governed by on allele of the L-locus. Boukema, I.W. Capsicum Newsl. 3 1984 47–48

Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the tuber necrosis strain of potato Y Potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta


Irodalom

Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174

Potato Genetics Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R. CAB InternationalWellesbourne 1994 552 pp

The Potato. (3rd ed.) Burton, W.G. Longman GroupUK 1989

A new pepper strain of tomato mosaic virus. Csilléry, G., Tóbiás, I. and Ruskó, J. Acta Phytopat. Acad. Sci. Hung. 18 1983 195–200

Szóbeli közlés. Csilléry, G. – 1995

Genetic analysis of broad spectrum resistance to potyviruses using doubled haploid lines of pepper (Capsicum annuum L.). Dogimont, C., Palloix, A., Daubze, A.M., Marchoux, G., Selassie, K.G. and Pochard, E. Euphytica 88 1996 231–239

Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th International Congr. Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209

Coat protein sequence of a resistance-breaking strain of potato virus X isolated in Argentina. Feigelstock, D.A., Tozzini, A.C. and Hopp, H.E. Virus Genes 10 1995 289–292

Breeding for resistance: conventional methods. Foxe, M.J. Neth. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2.) 1992 13–20

Genes for resistance to plant viruses. Fraser, R.S.S. CRV/Critical Rev. Plant Sci. 3 1986 257–294

Resistance to tobacco mosaic virus in tomato: Effects of the Tm-1 gene on virus multiplication. Fraser, R.S.S. and Loughlin, S.A.R. J. Gen. Virol. 48 1980 87–96

Effects of temperature on the Tm-1 gene for resistance to tobacco mosaic virus in tomato. Fraser, R.S.S. and Loughlin, S.A.R. Physiol. Plant Pathol. 20 1982 109–117

A növények vírus-ellenállóságának és fogékonyságának kórélettani kérdései. Gáborjányi, R. és Tóbiás, I. Kertgazdaság 4 1984 61–79

Breeding for cucumber mosaic virus resistance in pepper: Phenotypic and molecular marker-assisted approaches. Grube, R.C., Zhang, Y., Lackney, V., Prince, J., Murphy, J., Huang, B., Paran, I. and Kyle, M. Nat. Pepper Conf., Naples, FL 1996 1996

Molecular mapping, tagging and inheritance of virus resistance loci in Capsicum. Grube, R.C., Zhang,Y., Radwanski, E.R., Paran, I., Livingstone, D.,Blauth, J. and Kyle Jahn, M.M. 10th EUCARPIA Meeding on Genetics and Breeding of Capsicum and eggplant. Avignon, pp 1998 137–140

Current use of potato collections. Hermsen, J.G.Th. Cambridge Univ. Press In: Brown, A.H.D., Frankel, O.H., Marshall, D.R. and Williams, J.T. (Eds), The use of plant genetic resourcesCambridge 1989 68–75

Local lesions in tobacco mosaic. Holmes, F.O. Botan. Gaz. 87 1929 39–55

Studies on strains of potato virus Y. 1. Strain C. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138

Studies on strains of potato virus Y. 2. Normal strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966b 333–352

Studies on strains of potato virus Y. 3. Strain causing browning of midribs in tobacco. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967a 95–108

Studies on strains of potato virus Y. 4. Anomalous strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967b 195–210

A vírusrezisztenciára nemesítés eredményei és a dohánymozaik vírus rezisztenciára nemesítés lehetőségei burgonyánál. Horváth, J. Növénytermelés 17: 1968 225–238

The role of resistant plants in virology and plant breeding. Horváth, J. Tag.-Ber. Akad. Landwirtsch.-Wiss.


Irodalom

DDR, Berlin, 216 1983 201–216

Burgonyagéncentrumok: A rezisztenciagének és víruspatogének forrásai. Horváth, J. Medicina Könyvkiadó In: Csaba Gy.(szerk.). A biológia aktuális problémáiBudapest 1984 153–185

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. I. Review. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986a 35–49

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. II. Horváth, J. New compatible host-virus relations (susceptible plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986b 51–58

Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. III. Horváth, J. New incompatible host-virus relations (resistant and immune plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986c 59–62

Horváth, J. (1988) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 23 423–448 Potato gene centres, wild Solanum species, viruses and aphid vectors.

Reaction of some new Bolivian tuber-bearing Solanum species to different potato pathogenic viruses. Horváth, J. and Hoekstra, R. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 24 1989 351–362

Reaction of Solanum stoloniferum accessions to potato virus Y and henbane mosaic virus. Indian Horváth, J. and Wolf, I. J. Virology 7 1991 176–178

Detection of a tymovirus from Solanum hannemannii. Horváth, J., Lesemann, D.E., Koenig, R., Weidemann, H. L. and Hoekstra, R. Newsl. Eur. Community Potato Quarantine Stats. 1 1993a 2–3

Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll Luteovirus. Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR, Paris, France, pp 1993b 455–456

Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of potato Y Potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th Triennial Conf. EAPR, Veldhoven, The Netherlands 1996. pp 1996 166–167

The risks from exotic potato viruses. Howell, P.J. EPPO Bull. 11 1981 243–249

Conservation of potato genetic resources at CIP. Huaman, Z. Circular 14 1986 1–10

Molecular breeding for virus resistant potato plants. Neth. Huisman, M.J., Jongedijk, E., Posthumus-Lutke Willink, D., Van der Wilk, F. and Cornelissen, B.J.C. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2) 1992 29–36

Further studies on resistance-breaking strains of potato virus X. Jones, R.A.C. Plant Pathol. 34 1985 184–189

Handbuch der Pflanzensüchtung. 2. Aufl., III. Band. Kappert, H. und Rudorf, W. Verlag Paul PareyBerlin und Hamburg 1958

Resistenz von Kulturpflanzen gegen pflanzenpathogene Viren. Kegler, H. und Friedt, W. Gustav Fischer VerlagJena 1993 408 pp

Types of and genes for resistance to plant pathogenic viruses. Kegler, H. and Spaar, D. Arch. Phytopath. Pflanz. 28 1993 95–107

Resistance to Viral Diseases of Vegetables. Kyle, M.M. Timber PressPortland, Oregon 1993 278 pp

Gene list of pepper. Lippert, L.F., Bergh, B.O. and Smith, P.G. J. Heredity 56 1965 30–34

Inhibitor of virus replication released from tobacco mosaic virus-infected protoplasts of a local lesion-responding tobacco cultivar. Loebenstein, G. and Gera, A. Virology 114 1981 132–139

Two strains of tobacco mosaic virus, one of which is seed borne in an etch immune pungent pepper. McKinney, H.H. Plant Dis. Rep. 36 1952 184–187


Irodalom

Advances in population breeding and its potential impact on the efficiency of breeding potatoes for developing countries. Mendoza, H.A. Cambridge Univ. Press In: Jellis, G.J. and Richardson, D.E. (Eds), The Production of New Potato Varieties. Technological AdvancesCambridge 1986

Results of pepper breeding in Hungary. Moór, A. and Zatykó, L. Acta Horticulturae 412 1995 88–91

The Potatoes of South America. Ochoa, C.M. Cambridge Univ. PressCambridge 1990 512 pp

Systemic infection of tomato bushy stunt virus in Gomphrena globosa induced by high temperature and long photoperiod. Redolfi, P., Pennazio, S., Appiano, A. and Martin, C. Phytopath. Z. 90 1977 43–50

Continous high temperature can break the hypersensitivity of Capsicum chinense ’PI 152225’ to tomato spotted wilt tospovirus (TSWV). Roggero, P., Lisa, V., Nervo, G. and Pennazio, S. Phytopath. Medit. 35 1996 117–120

Potato Breeding. Ross, H. Verlag Paul Parey Problems and PerspectivesBerlin and Hamburg 1986 132 pp

Breeding white sweet pepper hybrids armed with the tobamovirus resistance allele L4. Sági, Zs. and Salamon, P. Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant. Avignon, p 1998 173

Some natural relationships among strains of tobacco mosaic virus. Siegel, A. and Wildman, S.G. Phytopathology 44 1954 277–282

Bekämpfung von Viruskrankheiten der Kulturpflanzen. Spaar, D. und Kleinhempel, H. VEB Deutscher LandwirtschaftsverlagBerlin 1985 440 pp

Typen genetisch kontrollierter Virusrezistenz der Pflanzen. Spaar, D., Kegler, H. and Schenk, G. Zbl. Mikrobiol. 147 1992 157–171

Inheritance of resistance to viruses. Swiezynski, K.M. CAB International In: Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R. (Eds), Potato GeneticsWallingford 1994 338–363

Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow-to-cell spread. Valkonen, J.P.T., Pehu, E., Jones, M.G.K. and Gibson, R.W. J.Gen. Virol. 72 1991 231–236

Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and viroid. Valkonen, J.P.T., Brigneti, G., Salazar, L.F., Pehu, E. and Gibson, R.W. Ann. Appl. Biol. 120 1992 301–313

Use of the virus strain group concept to characterize the resistance to PVX and PVYO in the potato cv. Valkonen, J.P.T., Slack, S.A. and Plaisted, R.L. Allegany. Amer. Potato J. 71 1994 507–516

Comparison of resistance to potyviruses within Solanaceae: infection of potatoes with tobacco etch potyvirus and peppers with potato A and Y potyviruses. Valkonen, J.P.T., Kyle, M.M. and Slack, S.A. Ann. Appl. Biol. 129 1996 025–038

Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease. Eur. Van den Heuvel, J.F.J.M., Van der Vlugt, R.A.A., Verbeek, M., De Haan, P.T. and Huttinga, H. J. Plant Pathol. 100 1994 347–356

Development and Breeding of Resistance to Pepper and Tomato Viruses. Watterson, J.C. Timber Press In: Kyle, M.M. (Ed.), Resistance to Viral Diseases of VegetablesPortland, Oregon 1993 80–101

Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Wetter, C., Conti, M., Altschuh, D., Tabillon, R. and Van Regenmortel, M.H.V. Phytopathology 74 1984 405–410

Breeding for resistance. Wiersema, H.T. In: de Bokx, J.A. (Ed.), Viruses of Potatoes and Seed-Potato Production. Puduc, Wageningen, pp 1972 174–187

New results of pepper breeding in Hungary. Zatykó, L. and Moór, A. IXth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant. Budapest, pp 1995 1–4

Tranfer of resistance to potato leaf roll virus from Solanum brevidens into Solanum tuberosum by somatic fusion. Austin, S., Baer, M. A. and Helgeson, J. P. Plant Sci. 39 1985 75–82


Irodalom

A növényvédelem új feladata a géntechnológiai úton módosított szervezetekről alkotott törvény végrehajtása. Balázs, E. Növényvédelem 33 1997 582–584

A génátültetés alkalmazása: A korszerű növényvédelem új lehetősége. Balázs, E. és Gáborjányi, R. Növényvédelem 20 1984 145–151

Ecological aspects of transgenic sugarbeet: transfer and expression of herbicide resistance in hybrids with wild beets. Bartsch, D. and Pohl-Orf, M. Euphytica 91 1996 55–58

Competitiveness of transgenic sugarbeet resistant to beet necrotic yellow vein virus and potential impact on wild beet populations. Bartsch, D., Schmidt, M., Pohl-Orf, M., Haag, C. and Schuphan, I. Molecular Ecol. 5 1996a 199–205

How will transgenic sugarbeets behave in natural plant communities? Bartsch, D., Edmonds, A., Gluth, H., Haag, C., Morak, C., Pohl-Orf, M. and Schmidt, M. Springer-Verlag In: Schmidt, E. R. and Hankeln, T. (Eds), Transgenic Organisms and BiosafetyBerlin and Heidelberg 1996b 319–329

Replicase-mediated resistance: a novel type of virus resistance in transgenic plants. Baulcombe, D. C. Trends Microbiol. 2 1994 60–63

Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. Baulcombe, D. C. The Plant Cell 8 1996 1833–1844

Coat protein mediated resistance against virus infection. Beachy, R. N., Loesch-Fries, S. and Tumer, N. E. Ann. Rev. Phytopathol. 28 1990 451–474

Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the tuber necrosis strain of potato Y potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174

Viral pathogenecity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. Brigneti, G., Voinnet, O., Li, W., Ji, L., Ding, S., and Baulcombe, D. The EMBO J. 17 1998 6739–6746

Immunocytolocalization of extensin in developing soybean seed coats by immunogold-silver staining and by tissue printing on nitrocellulose paper. Cassab, G. and Varner, J. E. J. Cell Biol. 105 1987 2581–2588

Bio/Technology 6, 549–557. Couzzo, M., O’Conell, K. M., Kaniewski, W., Fang, R. X., Chua, N. H. and Tumer, N. E. (1988) Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisense RNA.

Identification of an Arabidopsis locus required for resistance to turnip crinkle virus. Dempsey, D A., Pathirana, M. S., Wobbe, K. K. and Klessig, D. F. The Plant J. 11 1997 301–311

Deshayes, A. F. (1994) Environmental, and social impacts of GMO’s In 5–19Jones, D. D. (Ed), The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Univ. California, Oakland, pp What have we learned from the past few years?

Agrobacterium-mediated transformation of potato (Solanum tuberosum). Dietze, J., Blau, A. and Willmitzer, L. Springer Verlag, Berlin In: Spangenberg, G. (Ed.), Gene Transfer to Plants 1995 24–29

Coat protein gene-mediated protection in Lactuca sativa against lettuce mosaic potyvirus strains. Dinant, S., Maisonneuve, B., Albony, J., Chupeau, Y, M.C., Bellec, Y., Gaudefroy, F., Kusiak, C., Souche, S., Robaglia, C. and Lot, H. Molecular Breeding 3 1997 75–86

Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: Its possible role in the TMV-N- mediated signal transduction pathway. Dinesh-Kumar, S. P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 1995 4175–4180

Növénybiotechnológia. Dudits, D. és Heszky L. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1990 309 pp

Transgenes Saatgut und Biomedizin. Ewe, T. Deutschland 1 1998 28–30


Irodalom

Virus-engineered resistance: Concepts, efficacy, and stability. Fauquet, C. and Beachy, R. N. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992 273–286

Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th Internat. Congr. Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209

Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Filippone, E. and Penza, R. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 197–202

Isolation of protoplasts and genetic manipulation. Filippone, E., D’Ambrosio, F. and Cardi, T. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 127–134

Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic Resistance. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press, Totowa, New Jersey 1998 571 pp

Introduction to classical crossprotection. Fraser, R.S.S. Humana Press In: Foster, G.D. and Taylor, S.C. (Eds), Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 13–24

Construction of a plant disease resistance gene from the satellite RNA of tobacco ringspot virus. Gerlach, W. L., Lewellyn, D. and Haseloff, J. Nature 328 1987 802

Resistance to potato leaf roll virus and potato virus Y in somatic hybrids between dihaploid Solanum tuberosum and S. brevidens. Theor. Gibson, R. W., Jones, M. G. K. and Fisch, N. Appl. Genet. 76 1988 113–117

Gibson, R. W., Pehu, E., Woods, R. D. and Jones, M. G. K. (1990) Ann. Appl. Biol. 116 151–156 Resistance to potato virus Y and potato virus X in Solanum brevidens.

Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus. Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P. and Zaitlin, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 6311–6315

Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance. Goodwin, J., Chapman, K., Swaney, S., Parks, T.D., Wernsman, E.A., and Dougherty, W.G. Plant Cell 8 1996 95–105

Advances and prospects in potato virology with special reference to virus resistance. Harrison, B. D. Neth. J. Pl. Path. 98 1992 1–12

Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B. D., Mayo, M. A. and Baulcombe, D. C. Nature 328 1987 799–802

New genes for disease resistances through somatic hybridization. Helgeson, J. P. Neth. J. Pl. Path. 98 1992 223–229

Hemenway, C., Fang, R. X., Kaniewski, W. K., Chua, N. H. and Turner, N. E. (1988) EMBO J. 7 1273–1280 Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA.

A kultúrflóra biodiverzitása Magyarországon. Heszky L., Bódis L. és Kiss E. Növénytermelés 48 1999 435–443

The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Hoekema, A., Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. and Cornelissen, B. J. C. Bio/Technology 7 1989 273–278

Cross protection test with four strains of potato virus Y in Nicotiana tabacum L. cv. Samsun. Horváth, J. Zbl. Bakt. II. Abt. 123 1969 249–252

Extreme and complex resistance to infection by NTN strain of potato Y potyvirus and other viruses in genotypes of tuber bearing Solanum stoloniferum. Horváth, J. and Wolf, I. 9th EAPR Virology Section Meeting.


Irodalom

Bled, pp 1995 29–30

Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of potato Y potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th Triennial Conf. EAPR., Veldhoven, pp 1996 166–167

Resistance to potato leafroll luteovirus in four accessions of Solanum brevidens Phil. Horváth, J., Király, Z., Föglein, F. and Balogh, J. 10th Triennial Conf. EAPR, Aalborg, pp 1987 321–322

Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll luteovirus. Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR, Paris, pp 1993 455–456

Molecular breeding for virus resistant potato plants. Huisman, M. J., Jongedijk, E., Willink, D. P., van Der Wilk, F. and Cornelissen, B. Neth. J. Pl. Path. 98 1992 29–36

S. pmbe pacl+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III-like RNase. Iino, Y., Sugimoto, A. and Yamamoto, M. EMBO J. 10 1991 221–226

Die Bioregionen-Zellen des Wachtums. Janositz, P. Deutschland 1 1998 26–28

The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Jones, D.D. The Univ.Calif., Division of Agr. and Natural Resources, Oakland 1994 558 pp

Resistance to potato leaf roll virus in Solanum brevidens. Jones, R. A. C. Potato Res. 22 1979 149–152

A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing. Kasschau, K.D., and Carrington, C.J. Cell 95 1998 461–470

Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants. Kawchuk, L. M., Martin, R. R., and McPherson, J. Molecular Plant-Microbe Interact. 4 1991 254–261

A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a rezisztencianemesítésben. I. Király, Z. és Hornok, L. Mikroorganizmusokból klónozott gének. Növénytermelés 45 1996a 195–206

A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a rezisztencianemesítésben. II. Király, Z. és Hornok, L. Rezisztenciagének, transzgénikus növények. Növénytermelés 45 1996b 307–316

Defective interfering RNA-mediated resistance against cymbidium ringspot tombusvirus in transgenic plants. Kollár, Á., Dalmay, T. and Burgyán, J. Virology 193 1993 313–318

Biosearch: Gentechnik-Datenbank der BBA Landsmann, J. und Shah, A. 3. Mitteilung. Nachrittenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 47 1995 135

Engineering potato virus Y in transgenic Russet Burbank. Lawson, C., Kaniewski, W., Haley, L., Rozman, R., Newell, C., Sanders, P. and Tumer, N. E. Bio/Technology 8 1990 127–134

Expression of a soybean b-conglycinin gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35S and 19S promoters in transformed petunia tissues. Lawson, M. A., Tierney, M. A., Nakamura, I., Anderson, E. and Komeda, Y. Plant Mol. Biol. 9 1987 315–324

Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya ringspot virus coat protein gene. Ling, K., Namba, S., Gonsalves, C., Slightom, J. L. and Gonsalves, D. Bio/Technology 9 1991 752–758

Broad-spectrum virus resistance in transgenic plant expressing pokeweed antiviral protein. Lodge, J. K., Kaniewski, W. K. and Tumer, N. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 7089–7093

Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance. Loesch-Fries, L. S., Merlo, D., Zinnen, T., Burhop, L. and Hall, K. EMBO J. 6 1987 1845–1851


Irodalom

Pathogen-derived resistance to plant viruses. Lomonossoff, G. P. Ann. Rev. Phytopathol. 33 1995 323–343

Identification and characterization of a locus (RTM1) that restricts long-distance movement of tobacco etch virus in Arabidopsis thaliana. Mahajan, S. K., Chisholm, S. T., Whitham, S. A. and Carrington, J. C. The Plant J. 14 1998 177–186

Protoplast fusion. Marchant, R., Davey, M. R. and Power, J. B. Academic Press In: Dey, P. M. and Harborne, J. B. (Eds), Methods in Plant Biochemistry. Vol. 10. Molecular BiologyLondon 1993 187–205

Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R. E. F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp

Mosaic diseases in the Canary Islands McKinney, H. H. West Africa and Gibraltar. J. Agr. Res. 39 1929 557–558

History of coat protein-mediated protection. Miller, E.D. and Hemenway, C. Humana Press In: Foster, G.D. and Taylor, S.C. (Eds), Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 25–38

The use of wild species in crop improvement. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992a 55–62

The role of biotechnology in agricultural research. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992b 1–10

Isolation and culture of tobacco mesophyll protoplast. Nagy, I. Int. Symp. and Training Course in Plant Biotechnology. Gödöllő, pp 1992 15–29

Lesions and virus accumulation in inoculated transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of tobacco mosaic virus. Nelson, R. S., Powell, P. and Beachy, R. N. Virology 158 1987 126–132

Movers and shakers: Maize transposons as tools for analyzing other plant genomes. Osborne, B. I. and Baker, B. Curr. Opin. Cell Biol. 7 1995 406–413

Replicase-mediated resistance to plant virus disease. Palukaitis, P. and Zaitlin, M. Adv. Virus Res. 48 1997 349–377

Recent advances in ecological biosafety research on the risks of transgenic plants: A trans-continental perspectives. Parker, I. M. and Bartsch, D. Birkhuser Verlag In: Tomink, J., Wöhrmann, K. and Sentker, A. (Eds), Transgenic Organisms-Biological and Social ImplicationsBasel 1996 147–161

Genome Mapping in Plants. Paterson, A. H. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA, 1996 1996

Studies on the genetic basis of resistance to potato leaf roll virus, potato virus Y and potato virus X in Solanum brevidens using somatic hybrids of Solanum brevidens and Solanum tuberosum. Pehu, E., Gibson, R. W., Jones, M. G. K. and Karp, A. Plant Sci. 69 1990 95–101

Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Powell, P. A., Nelson, R. S., Hoffman, N. and Rogers, S. G. Science 232 1986 738–743

Protection against tobacco mosaic virus infection in transgenic plants requires accumulation of coat protein rather than coat protein RNA sequences. Powell, P. A., Sanders, P. R., Tumer, N., Fraley, R. T. and Beachy, R. N. Virology 175 1990 124–130

Progress in Plant Protoplast Research. Puite, K. J., Dons, J. J. M., Huizing, H. J., Kool, A. J., Koornnef, M. and Kreus, S. A. Kluwer Acad. PublBoston 1988

Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event in infection. Register, J. C. and Beachy, R. N. Virology 166 1988 524–532

Resistance gene evolution. Ronald, P.C. Curr. Opin. Plant Biol. 1 1998 294–298


Irodalom

Freilandversuche mit gentechnisch vernderten Pflanzen im Jahr 1994. Schiemann, J. und Casper, R. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 47 1995 100–101

Transposable elements and gene-tagging. Shepherd, N.S. IRL Press In: Shaw, C.H. (Ed), Plant Molecular Biology. A Practical ApproachOxford 1988

Protection against potyvirus infection in transgenic plants: evidence for broad spectrum resistance. Stark, D. M. and Beachy, R. N. Bio/Technology 7 1989 1257–1262

Is durable resistance against viruses and bacteria attainable via biotechnology? Stiekema, W. J., Visser, B. and Florack, D. E. A. Kluwer Acad. Publ In: Jacobs, Th. and Parlevliet, J. E. (Eds), Durability of Disease ResistanceDordrecht 1993 71–81

A növénykórokozó baktériumok plazmidjai, különös tekintettel az Agrobacterium tumefaciensre. Süle, S. Akadémiai Kiadó In: Érsek, T. és Hornok, L. (Szerk.), Kórokozók és a fertőzött növényBudapest 1985 34–46

Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley, S. D., Ganal, M. V. and Martin, G. B. Trends in Genetics 11 1995 63–68

Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack. Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., Martinis, D., Cattaneo, D. and Galeffi, P. Nature 366 1993 4649–472

Virusresistant Transgenic Plants: Potential Ecological Impact. Tepfer, M. and Balázs, E. Springer VerlagBerlin 1997 126 pp

Transgenic potato plants expressing mammalian 2’ - 5’ oligoadenylate synthase are protected from potato virus X infection under field conditions. Truve, E., Aaspollu, A., Honkanen, J., Puska, R., Mehto, M., Hassi, A., Teeri, T. H., Kelve, M., Seppnen, P. and Saarma, M. Bio/Technology 11 1993 1048–1052

Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and a viroid. Valkonen, J. P. T., Brigneti, G., Salazar, L. F., Pehu, E. and Gibson, R. W. Ann. Appl. Biol. 120 1992 301–313

Resistance to viruses in F1 hybrids produced by direct crossing between diploid Solanum series Tuberosa and diploid S. brevidens (series Etuberosa) using S. phureja for rescue pollination. Valkonen, J. P. T., Orillo, M., Slack, S. A., Plaisted, R. L. and Watanabe, K. N. Plant Breeding 114 1995 421–426

Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow cell-to-cell spread. Valkonen, J. P. T., Pehu, E., Jones, M. G. K. and Gibson, R. W. J. Gen. Virology 72 1991 231–236

Expression of the potato leafroll luteovirus coat protein gene in transgenic potato plants inhibits viral infection. van der Wilk, F., Willink, D., Huisman, M. J., Huttinga, H. and Goldbach, R. Plant Molecular Biol. 17 1991 431–439

Transgenic tobacco expressing tobacco streak virus or mutated alfalfa mosaic virus coat protein does not cross-protect against alfalfa mosaic virus infection. van Dun, C. M., Overduin, B., van Vloten-Doting, L. and Bol, J. F. Virology 164 1988 383–389

Systemic signalling in gene silencing. Voinnet, O., and Baulcombe, D.C. Nature 389 1997 553–555

Application of PCR to transgenic plants. Wassenegger, M. Humana Press In: Meltzer, S.J. (Ed), PCR in BioanalysisTotowa, New Jersey 1998 153–164

Resistance against multiple part viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease. Watanabe, Y., Ogawa, T., Takahashi, H., Ishida, I., Takeuchi, Y., Yamamoto, M. and Okada, Y. FEBS Letters 372 1995 165–168

Strategies in unconventional breeding for disease resistance. Wenzel, G. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 149–172


Irodalom

Strategies to protect crop plants against viruses: pathogen derived resistance blossoms. Wilson, A.M.T. Proc Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 3134–3141

Local and systemic movement of tobacco mosaic virus (TMV) in tobacco plants that express the TMV coat protein gene. Wisniewski, L. A., Powell, P. A., Nelson, R. S. and Beachy, R. N. Plant Cell 2 1990 559–567

Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180

Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96

Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180

Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96

Latent mosaic, an emerging disease of peach. Barba, M. and Faccioli, F. Inf. Agr. 54 1998 71–72

Quarantine Pests for Europe. Smith, I.M., McNamara, D.G., Scott, P.R. and Holderness, M. CAB InternatWallingford 1997 1997 1425 pp


Documents

regi.tankonyvtar.hu · Web viewa volt Jugoszlávia területén mintegy 16 millió szilvafát betegített meg és pusztított el. A növényvírusok által előidézett termésveszteségekre