1

ID, Kull 99, Vår 2001Frank Skorpen IKM, DMF

Regulering av DNA Transkripsjon i

Eukaryote Organismer

2

Regulering av gen-uttrykk på mange nivåer

• Klargjøring av DNA• Transkripsjon

• Initiering

• Stopp

• hnRNA prosessering• mRNA

• Transport

• Translasjon

• Stabilitet

• Protein• Kjemisk modifisering

• Prosessering

• Lokalisering

• Stabilitet

3

Gen-uttrykk reguleres primært ved regulering av transkripsjons-initiering

• Klargjøring av DNA• Transkripsjon

• Initiering

• Stopp

• hnRNA prosessering• mRNA

• Transport

• Translasjon

• Stabilitet

• Protein• Kjemisk modifisering

• Prosessering

• Lokalisering

• Stabilitet

4

Nukleære RNA polymeraser

• RNA pol I– transkriberer rRNA gener

• RNA pol II– transkriberer protein-kodende gener (klasse II gener)

• RNA pol III– transkriberer tRNA gener

5

Geners regulatoriske områder

Start

TRANSKRIPSJONSENHET

+1

TATA Inr

-25-50

CORE PROMOTER

-200

3’5’

TATAAT

konsensus:

ProximalDistal

ENHANCER ELEMENTER

Exon

Intron

6

E2F

Mulige transkripsjonsfaktor-bindende elementer kan identifiseres ut i fra DNA sekvens

7

Forskjellige sett av aktivatorer aktiverer forskjellige gener

A B C

A D E

Gen 1

Gen 2

8

Forskjellige typer celler uttrykker forskjellige gener fordi de inneholder forskjellige sett av transkripsjons-aktivatorer

A

B D EB

C

C

A

DE

A

A

Celletype I Celletype II

9

Transkripsjons-aktivatorer rekrutterer transkripsjonsmaskineriet til promoteren

TATA Inr

+1-25

CORE PROMOTER

DNA-bindings-domene

Aktiverings-domene

Transkripsjons-maskineri

10

Mange aktivatorer binder som homo- eller heterodimérer

TATA Inr

+1-25

CORE PROMOTER

Dimériserings-domene

-50-200 ProximalDistal

ENHANCER ELEMENTER

11

Transkripsjons-aktivatorer: familier

• Helix-turn-helix

• Leucine zipper

• Helix-loop-helix

• Zinc finger

• andre

NH2

COOH1

2

3

Helix-turn-helix

Helix-turn-helix motivet finnes i en rekkeprokaryote regulatoriske proteiner og i homeodomain proteiner i eukaryoter. Helix 3 er “recognition helix” som kontakter majorgroove i DNA helixen. Helix 1 and 2 ligger over helix 3 og kankontakte andre proteiner.

L

L

L

L

L

L

L

L

++

++

+

++

++

+NH2

NH2

COOHHOOC

Leucine zipper

Leucine zipper proteiner fungerer somdimérer av to subenheter, hver delt i tohelix-regioner. Leucine (L) residier i C-terminalen danner en hydrofob overflatefor interaksjon mellom de to protein sub-enhetene. Positive aminosyrer N-terminaltfor leucinene danner kontaktflaten med DNA.

Helix-loop-helix

++

+NH2

HOOC

++

+NH2

COOH

Helix

Helix

Loop

Helix-loop-helix proteiner har to helixerbundet sammen med en loop av ukjent struktur. Disse helixene danner overflatenfor dannelsen av dimérer. En tredje helixrik på positive aminosyrer er ansvarligfor DNA-binding.

Diagram av en zinc finger bestående av to cysteine (C) og to histidine (H) residier koordinert rundt et sink atom. Andre høytkonserverte aminosyrer i denne klassen avzinc fingre er også vist. Zinc fingre kan også bruke fire cysteiner til å koordinere zincatomet, slik som i steroid hormon receptorer.

P

C

L

H

C H

Zn

YCOOH

C2H2 zinc fingerNH2

14

15

Transkripsjons-aktivatorer kan slås på og av

P

PROTEIN-SYNTESE

LIGAND-BINDING

FOSFORYLERING BINDING TILANNEN SUBENHET

AK

TIV

INA

KT

IV

DNA-bindendesubenhet

Aktiverendesubenhet

16

Signal-aktivering av gener

Steroid hormonSteroid hormonreseptor

TRANSKRIPSJON

Insulin

Signal-kaskade

PP

Insulinreseptor

17

Aktivatorer rekrutterer RNA pol II og et sett av

5 generelle transkripsjonsfaktorer

-50

Aktivator

+1

TATA Inr

RNApol II

IIFIIH

IIE

IIB

IID

18

TBP binder til TATA-element og danner en plattform for binding av de andre faktorene

TATA Inr

-50

Activator TBP

+1

TAFIIs

19

Rekruttering skjer vanligvis i to trinn: først TFIID,

deretter resten av komplekset

-50

Aktivator

+1

TATA Inr

RNApol II

IIFIIH

IIE

IIB

IID

20

Generelle transkripsjonsfaktorer og RNA pol II responderer ikke til aktivatorer in vitro

-50

Aktivator

+1

TATA Inr

RNApol II

IIFIIH

IIE

IIB

IID

21

Srb9

-50

Activator

+1

TATA Inr

RNApol II

IIFIIH

IIE

IIB

TBP

The Core Srb/Mediator Complex

Srb2, -4, -5, -6, and -7; (pos)Med1, -2, -4, -6, -7, and -8; (pos)

Gal11, Sin4, Rgr1, Rox3, and Pgd1 (neg)

Srb10 CDKSrb10 CDK

Srb11

Srb4

Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-DNA-bundne ko-aktivatorer

(neg)

H2BH2A

H3

H4H2AH2B

H4H3

H1

DNA helix

H2BH2A

H3

H4H2A H2B

H4H3

H2BH2A

H3

H4H2AH2B

H4 H3

H1

H2BH2A

H3

H4H2A H2B

H4H3

H1In vivo foreligger DNA i form av kromatin.Kromatin virker hemmende påDNA transkripsjon.

Nukleosom:180-200 bp DNAtvunnet rundt en oktamer av histoner

Histon acetyltransferaser (HATs) og histon deacetylaser (HDACs)

HAT

HDAC H2BH2A

H3

H4H2AH2B

H4H3

+

+ +

H2BH2A

H3

H4H2AH2B

H4H3

+

+++

++++ ++

++

++

+

+

H20CH3

C=O

OH

S

CH3

C=O

Coenzyme A Coenzyme A

SH

HAT enzymer kan dirigeres til promotere ved å binde til aktivatorer

CREBc-Jun Fos

P/CAF

p300/CBP p300/CBP

P/CAF:“p300/CBP-Associating Factor”

p300/CBP, “CBP: CREB-binding protein”

E2F-1

p53Nukleosom

25

TAFII250 har intern HAT aktivitet

TAFII250

TFIID

TATA

HATaktivitet

Aktivator

26

Mange repressorer fungerer ved å rekruttere HDAC aktiviteter

E2F/DP

Rb

HDAC1

Deacetyleringog represjon Mad Max

HDAC1

SIN3

YY1

HDAC2

27

InrTATA

+1Aktivator

Swi - Snf ComplexSwi - Snf Complex

ATP

ADP + Pi

Swi2Swi2

SWI/SNF bruker ATP til å remodellere nukleosomstrukturer

28

InrTATA

+1Aktivator

Swi - Snf ComplexSwi - Snf Complex

ATP

ADP + Pi

Swi2Swi2

SWI/SNF kan rekrutteres som del av RNA pol II holoenzym

RNA pol II holoenzym

Inr

+1Aktivator

TAFII250TBP

RNApol II

IIFIIH

IIE

IIB

Srb/Mediator

Swi - Snf Swi - Snf

ATP

ADP + Pi

HATs

DNA-bøyende ko-aktivator

Rekruttering ved synergi

TATA

30

Modell av pre-initieringskompleks

Aktivatorer

Generelle (basale)transkripsjonsfaktorer

Ko-aktivatorer/TBP-assosierte faktorer

RNA pol II

5’ 3’

5’ 3’

Kopiering til pre-mRNA

AAAAAAA-3’

Fjerning av introns,påsetting av m7G(5’)pp cap,3’-ende-kløyving og polyadenylering

5’-m7GppmRNAmRNA

ExonIntron

Produksjon av mRNA

elongatingRNA pol II(Pol IIo)

premRNA

AAUAAA

Kløyvings- /polyadenylerings-faktorer

Elongerings-faktorer

Spleise-faktorer

CTD((YSPTSPS)n

RNA pol II holoensym er involvert i både RNA-kjede forlengelse, RNA prosessering, og terminering av transkripsjon

Fjerning avintron

33

Oppsummering:

• Transkripsjonsaktiviteten av et gen bestemmes av hvor effektivt RNA pol II holoenzym rekrutteres til promoteren

• Dette bestemmes av den synergistiske effekten av de til enhver tid bundne aktivatorer

• Gener reguleres forskjellig fordi de binder forskjellige sett av aktivatorer

• Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-DNA-bundne ko-aktivatorer

34

• In vivo foreligger DNA i form av kromatin. Kromatin hemmer transkripsjons-initiering

• Assosiert med RNA pol II finnes enzymaktiviteter som re-modellerer kromatin, slik som SWI/SNF og HATs/HDACs

• SWI/SNF og HATs/HDACs kan også rekrutteres via interaksjon med sekvens-spesifikke aktivatorer

• Forskjellige promotere har forskjellige krav til sammensetningen av RNA pol II holoenzym