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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM AGRONOMIA TROPICAL

Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites

Vanessa Maciel dos Reis

Manaus 2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM AGRONOMIA TROPICAL


Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de

pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites

Orientador: Dr. José Odair Pereira Co-Orientadora: Dra. Doriane Picanço Rodrigues

Manaus 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical, Universidade Federal do Amazonas, como requisito para obtenção de título de Mestre em Agronomia Tropical, área de concentração em Melhoramento de plantas.


Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de

pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites

ApApApAprovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009

BANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORA Dr. José Odair Pereira

Universidade Federal do Amazonas - UFAM

Dr. Fábio Medeiros Pereira Universidade Federal do Amazonas – UFAM

Dra. Nelcimar Reis Sousa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical, Universidade Federal do Amazonas, como requisito para obtenção de título de Mestre em Agronomia Tropical, área de concentração em Melhoramento de plantas.

Ficha Catalográfica

(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)

R375r

Reis, Vanessa Maciel dos

Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear

de pupunha (Bactris gasipaes kunt) avaliadas com microssatélites /

Vanessa Maciel dos Reis. - Manaus: UFAM, 2009.

87 f.; il. color.

Dissertação (Mestrado em Agronomia Tropical) –– Universidade

Federal do Amazonas, 2009.

Orientador: Prof. Dr. José Odair Pereira

Co-orientadora: Doriane Picanço Rodrigues

1. Bactris gasipaes 2. Diversidade genética 3. Germoplasma

vegetal I. Pereira, José Odair II. Rodrigues, Doriane Picanço III.

Universidade Federal do Amazonas IV. Título

CDU 634.61(043.3)

AGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇO À Deus e a Maria Santíssima. Meu Tudo. Minha Mãe.

DEDICODEDICODEDICODEDICO À minha família e ao meu noivo.

Meus amados. Minha base.

OFEREÇOOFEREÇOOFEREÇOOFEREÇO À Ciência e Pesquisa.

AGRADECIMENTOS

À Deus. Meu Pai. Meu Senhor e Salvador. Meu Guia e Consolador.

À Maria Santíssima. Minha Mãe. Meu colo. Minha maior intercessora.

À Dra. Doriane Picanço Rodrigues, em quem eu encontrei mais que uma orientadora. Por seu acolhimento, generosidade, disponibilidade, ensinamentos, confiança, conselhos e pelo grande incentivo no meu desempenho e crescimento profissional, muito obrigada!

Ao Dr. Charles Roland Clement, por toda a colaboração nas discussões deste trabalho. Sempre disponível, prestativo, atencioso, generoso em transmitir seus ensinamentos e por ter contribuído em meu crescimento profissional, muito obrigada!

Ao Dr. José Odair Pereira, por disponibilizar o Laboratório de Bioativos e reagentes para realização de algumas etapas laboratoriais no primeiro projeto de pesquisa.

À Dra. Rosana Medeiros Galvão, pela compreensão, acolhimento e auxílio com reagentes no primeiro projeto de pesquisa.

Ao Dr. Pedro de Queiroz Costa Neto, por seu acolhimento e generosidade em ensinar a técnica AFLP. Obrigada pela amizade.

Ao Dr. José Ferreira da Silva, coordenador da Pós-Graduação, por sua compreensão, me possibilitando a alteração de projeto para conclusão deste curso.

À Dra. Maria Teresa Gomes Lopes pelo convite para entrar neste curso de Mestrado e pelo amadurecimento ganho em minha vida pessoal e profissional.

À Universidade Federal do Amazonas, incluindo professores e funcionários, pelo espaço cedido e todo o necessário para a concretização deste trabalho.

Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, pela disponibilidade de transporte nas coletas e material de trabalho.

Aos funcionários do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha. Ao Bosco, seu João, Paulo e Damião, pela colaboração na coleta do material no campo.

Ao Laboratório de Tecnologia de DNA, principalmente a Dina e ao Jonson, pelo auxílio nas genotipagens.

Ao Dr. Fábio Medeiros e ao mestrando Alessandro Alves pelo auxílio, disponibilidade e paciência em algumas análises estatísticas. Obrigada!

À Michelly Cristo Araújo, pela disponibilidade e auxílio nas primeiras coletas do material no campo. Pelos arquivos e informações que contribuíram neste estudo.

Aos colegas do Laboratório de Evolução Aplicada: Aldecinei, Alessandro, Andrea, Chelsea, Ederly, Francisca, Laura, Marcicleide e Michelly, pela convivência e momentos de descontração. Principalmente a Andrea Amancio (Dedéa), pela “fácil” amizade, confiança, conversas divertidas e construtoras.

Aos alunos e funcionários do Laboratório de Cultura de Tecidos, pelo espaço cedido e pela compreensão. Ao seu Valdemir, pelo auxílio no preparo de soluções. À Sônia, meu socorro nas soluções e materiais autoclavados.

Aos alunos e funcionários do Laboratório de Genética Animal, pela estrutura física para realização de alguns procedimentos laboratoriais.

Aos meus colegas de curso de Mestrado, por todos os momentos de estudo e descontração.

À Raquel Alencar e Liene Picanço, pela amizade, companheirismo e os muitos momentos divertidos. Conseguimos ultrapassar as dificuldades com coragem e determinação.

Ao meu Grupo de Oração, Maria Auxiliadora, pela compreensão da minha ausência. Pela amizade, torcida e oração de todos.

À minha madrinha Margarida Pereira, por suas orações que ajudaram a sustentar a minha espiritualidade nos muitos momentos de correria deste mestrado.

À Maria de Fátima Leonel pela amizade, carinho e preocupação. Por todos os e-mails atenciosos, que mesmo na “distância” parecíamos tão próximas.

À minha família. À minha Mãe por toda a sua garra, coragem e determinação em fazer de mim a pessoa que sou hoje. Ao meu Pai, por seu carinho, atenção, presença e disponibilidade. Ao meu irmão, pelo exemplo de busca, disponibilidade e pelas gracinhas do dia a dia. AMO VOCÊS.

Ao meu noivo Leandro Magno. Meu grande amigo neste momento. Obrigada pela ajuda na plotagem dos dados, pela companhia, apoio, colo, paciência, atenção, carinho e amor. TE AMO.

A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

Obrigada!

“Tudo o que existe é obra de Tuas mãos. Todas as coisas revelam o Teu poder.

Nós também somos parte da Tua criação. O que nós resta é Te agradecer.”

SUMÁRIO

Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract 1. Introdução.........................................................................................................................18

2. Referencial Teórico...........................................................................................................20

2.1 Características da Espécie..........................................................................................20

2.2 Utilidades da Pupunheira..........................................................................................21

2.3 Taxonomia................................................................................................................23

2.4 Origem e Distribuição Geográfica............................................................................24

2.5 Domesticação............................................................................................................26

2.6 Raças primitivas e populações híbridas.....................................................................28

2.7 Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha (INPA)...............................................31

Coleção Nuclear........................................................................................................33

2.8 Marcadores Moleculares...........................................................................................35

Marcadores Microssatélites.......................................................................................38

2.9 Diversidade e Estrutura Genética de Populações....................................................39

3. Material e Métodos............................................................................................................46

3.1 Material vegetal e Extração de DNA.........................................................................46

3.2 Amplificação dos loci microssatélites........................................................................48

3.3 Análise genética dos dados........................................................................................49

4. Resultados e Discussão......................................................................................................51

4.1 Avaliação das raças primitivas e outras

populações.................................................................................................................51

4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites.........................................................56

4.3 Parâmetros genéticos das populações.......................................................................58

4.4 Relações entre raças e outras populações.................................................................69

5. Conclusões.........................................................................................................................72

6. Referencias Bibliográficas..................................................................................................73

Apêndice – Identificação dos acessos de pupunha utilizados nas análises genéticas.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Figura 1. Figura 1. Figura 1. Variedades de frutos de uma população de pupunha de Benjamim Constant, Amazonas, Brasil (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).........................................21

Figura 2.Figura 2.Figura 2.Figura 2. Distribuição aproximada dos três tipos de B. gasipaes var. chichagui (HENDERSON, 2000) baseadas em informações organizadas por C. R. Clement e E. Ferreira (CLEMENT et al., 2009a).......................................................................................25

FiguraFiguraFiguraFigura 3.3.3.3. Distribuição geográfica das raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes var. gasipaes) nos Neotrópicos. MICROCARPA: 6. Tembé, 7. Juruá, 8. Pará; MESOCARPA: 1. Rama, 2. Guatuso, 3. Utilis, 4. Tuíra, 5. Cauca, 9. Solimões, 10. Pampa Hermosa, 11. Tigre, 12. Pastaza, 13. Inirida; MACROCARPA: 14. Putumayo, 15. Vaupés (RODRIGUES et al., 2004a; CRISTO-ARAÚJO, 2008).....................................................30

Figura 4.Figura 4.Figura 4.Figura 4. Representatividade do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha, INPA, Manaus, AM, Brasil, em termos de número de acessos por raça e população...................32

Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. Representatividade da Coleção Nuclear de Pupunha, dentro do BAG, em termos de números de acessos por raça e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008)..........................34

Figura 6.Figura 6.Figura 6.Figura 6. Provável validade de grupos populacionais identificados pelo programa STRUCTURE baseada em 17 loci microssatélites de pupunha. (∆K com K de 1 a 15, com 15 simulações para todos os 179 indivíduos analisados).......................................................51

Figura 7. Figura 7. Figura 7. Figura 7. Re-designação das raças e populações para consistência dos agrupamentos formados pelo programa STRUCTURE..............................................................................52

Figura 8.Figura 8.Figura 8.Figura 8. Agrupamentos populacionais identificados pelo programa STRUCTURE com base em 17 loci microssatélites de pupunha, incluindo a nova designação das raças e populações, e sem o acesso F-0209-83 da raça Vaupés. (∆K com K de 2 a 12, 15 simulações).............................................................................................................................53

Figura 9.Figura 9.Figura 9.Figura 9. Probabilidade de associação das 174 plantas em quatro grupos identificados pelo programa STRUCTURE (∆K = 4). As cores presentam os grupos e cada planta (linha vertical) é avaliada em termos da probabilidade de compor um determinado grupo, estimado pelo coeficiente de relacionamento (q) (PRITCHARD et al., 2007). O quinto grupo (lado direto) é composto por algumas plantas que o programa não conseguiu determinar um relacionamento firme....................................................................................54

Figura 10.Figura 10.Figura 10.Figura 10. Agrupamentos populacionais estimados pelo programa STRUCTURE, incluindo apenas populações e raças da Amazônia Ocidental até América Central. (com K de 1 a 9, com 15 simulações).................................................................................................55

Figura 11.Figura 11.Figura 11.Figura 11. Relação entre o número total de alelos e o número de alelos privativos amostrados em 17 loci microssatélites em raças e populações de pupunha silvestre e cultivada..................................................................................................................................57

Figura 12.Figura 12.Figura 12.Figura 12. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de alelos compartilhados (Das) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................64

Figura 13.Figura 13.Figura 13.Figura 13. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de Nei (1978) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................65

Figura 14. Figura 14. Figura 14. Figura 14. Dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978) mostrando as relações genéticas de 34 acessos de pupunha cultivada (var. gasipaes) e quatro acessos de pupunha silvestre (var. chichagui tipo 1 e 3) que compõe a Coleção Nuclear e mantidos no BAG de pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil. ................................................................................................................................................68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1. . . . Acessos de pupunha cultivada e silvestre proveniente do Banco de Germoplasma de Pupunha do INPA, Manaus, AM, Brasil que compõem a Coleção Nuclear. Classe de tamanho do fruto; designação raça ou população; localização geográfica dos acessos: Brasil (BR), Colômbia (CO), Costa Rica (CR), Equador (EC), Panamá (PA) e Peru (PE); número de passaporte dos acessos no banco de dados do INPA ;e número de amostras de cada acesso utilizadas neste estudo.................................................................................................47

Tabela 2. Tabela 2. Tabela 2. Tabela 2. Características dos 17 loci microssatélites selecionados entre 39 testados e seus respectivos autores.... Ta - temperatura de anelamento; pb - número de pares de base.........48

Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3. Classificação do número de alelos baseados em sua freqüência e distribuição entre as amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear, mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................57

Tabela 4. Tabela 4. Tabela 4. Tabela 4. Índices de diversidade genética, índices de fixação e diferenciação genética de 17 loci microssatélites em amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, e o conjunto de todas as populações. A – Número de alelos; P – Número de alelos privados; HO – Heterozigosidade observada; HE – Heterozigosidade esperada; HS – Diversidade genética na população; HT – Diversidade genética total; GST – Estimador da diferenciação genética de Nei; RST – Estimador de diferenciação genética (stepwise mutation model); Estimativas das estatística F de Wright: FIS – Coeficiente de endogamia intrapopulacional, FST – Coeficiente de endogamia entre populações e FIT – Coeficiente de endogamia para o conjunto das populações. *Ho - significativamente diferente de HE a p<0,05. *FIS – não diferente de zero a p<0,05.....................................................................................................................................60

Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Matriz de divergência (FST – diagonal abaixo) e fluxo gênico [M(número absoluto de migrantes) = 2Nm – diagonal acima] entre nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, com 17 loci microssatélites.........................................................................................................................67

RESUMO

A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) é a única palmeira domesticada dos Neotrópicos. Provavelmente foi domesticada inicialmente por sua madeira e posteriormente por seus frutos oleosos e amiláceos. Possui ampla variabilidade fenotípica em suas populações cultivadas, resultado do processo de domesticação ocorrido ao longo de 10.000 anos. As populações cultivadas (var. gasipaes) estão organizadas em raças primitivas que possuem características próprias. Algumas dessas raças já foram caracterizadas morfométrica, química e geneticamente. O INPA (Manaus, Amazonas, Brasil) mantém um Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha com uma parte deste complexo de raças primitivas e populações silvestres, que foram caracterizadas geneticamente com marcadores RAPD. Com o intuito de maximizar a utilização deste BAG, recentemente foi criada uma Coleção Nuclear, que apresenta pelo menos 80% da diversidade genética do BAG. Este trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade e estrutura genética dos acessos que compõem a Coleção Nuclear, além de verificar as relações genéticas entre as raças primitivas e populações silvestres por meio de 17 loci microssatélites desenvolvidos para a pupunha. Inicialmente o programa STRUCTURE foi utilizado para verificar os agrupamentos formados por estas populações. Foram identificados 11 agrupamentos que mostraram-se consistentes às análises genéticas com RAPD e por isso utilizados nas análises posteriores. Os 17 loci microssatélites detectaram 302 alelos com uma média de 17,8 alelos por lócus, evidenciando o alto conteúdo informativo destes marcadores. A média de heterozigosidade observada foi 0,66 e a heterozigosidade total (HT) foi 0,87, similar a estudos anteriores. A AMOVA detectou 87% de variação dentro das populações e 13% entre, confirmada pelos índices de estruturação genética [GST (0,13), RST (0,19) e FST (0,13)]. Os dendrogramas das distâncias de alelos compartilhados (DAS) e Nei (1978) mostraram que as raças estão muito relacionadas, mas com a formação de dois grupos: um formado pela raça Pará, a população sintética do alto Rio Madeira e var. chichagui tipo 1; e outro formado pelas demais raças da Amazônia Ocidental e América Central, bem como a população sintética do Rio Ucayali e var. chichagui tipo 3. O fluxo gênico médio foi 1,24, com o maior fluxo entre as raças Putumayo e Pampa Hermosa (Nm=17,04). O fluxo entre a raça Pará e a população sintética do alto Rio Madeiras justifica a aproximação destas populações no dendrograma; foi observado

ainda um baixo fluxo entre Pará e as raças Ocidentais. Todos os resultados deste estudo apoiam estudos anteriores que validam as raças Pará, Putumayo, Pampa Hermosa, Utilis e Juruá. O conjunto formado pela raça Pará, a população sintética do alto Rio Madeira e var.chichagui tipo 1 sugere dispersão do sudoeste da Amazônia até Amazônia Oriental. O conjunto formado pelas demais raças primitivas, a população sintética do Rio Ucayali e var. chichagui tipo 3 sugere a dispersão do sudoeste da Amazônia para a Amazônia Ocidental até América Central. A associação entre as populações cultivadas e as silvestres tipo 1 e 3 sugere introgressão, como visto em estudos anteriores.

Palavras chave: Bactris gasipaes, caracterização molecular, diversidade genética, relações genéticas.

ABSTRACT

Peach palm (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) is the only domesticated Neotropical palm. It was probably first domesticated for its wood and then for its oily and starchy fruits. Peach palm has extensive phenotypic variability within its wild and cultivated populations, the latter the result of the domestication process that occurred over 10,000 years. The cultivated populations (var. gasipaes) are organized into landraces with distinctive characteristics. Some of these landraces have been characterized morphometrically, chemically and genetically. The INPA (Manaus, Amazonas, Brazil) maintains an Active Germplasm Bank (BAG) of Peach Palm with a sample of these landraces and two wild relatives (var. chichagui) that were genetically characterized with RAPD markers. In order to maximize the use of the BAG, a Core Collection was created recently, which contains at least 80% of the genetic variability of the BAG. The current study aimed to evaluate the genetic diversity and population structure of the accessions that make up the Core Collection, as well as to define the genetic relationships among landraces and wild populations using 17 microsatellite loci developed for peach palm. Initially, the STRUCTURE program was used to identify the groups formed by these populations. We identified 11 groups that were consistent with RAPD genetic analysis and therefore used them in further analysis. The 17 microsatellite loci detected 302 alleles, with an average of 17.8 alleles per locus, demonstrating the high information content of these markers. The average observed heterozygosity was 0.66 and total heterozygosity (HT) was 0.87, similar to previous studies. The AMOVA detected 87% of variation within populations and 13% among populations, which was confirmed by other measures of genetic divergence [GST (0.13), RST (0.19) and FST (0.13)]. The dendrograms of shared alleles distances (DAS) and Nei’s unbiased distance (1978) showed that the races are closely related, but with the formation of two groups: one formed by the Pará landrace, the synthetic population of the upper Madeira River and var. chichagui type 1; and another formed by the other races of Western Amazonia and Central America, the synthetic population of the Rio Ucayali and var. chichagui type 3. The average gene flow was 1.24, with the highest flow between the Putumayo and Pampa Hermosa landraces (Nm = 17.04). The flow between the Pará landrace and the synthetic population of the upper Madeira River justifies their grouping in the dendrogram; low gene flow was observed between the Pará and the western landraces. All results of this study support previous studies that validated the Pará, Putumayo, Pampa Hermosa, Utilis and Juruá landraces. The group formed by the Pará landrace, the synthetic

population of the upper Madeira River and var. chichagui type 1 suggests dispersal from southwestern Amazonia to eastern Amazonia. The group formed by the other landraces, the synthetic population of the Ucayali River and var. chichagui type 3 suggests dispersal from southwestern Amazonia to western Amazonia and then to Central America. The association between wild populations of type 1 and 3 and adjacent cultivated populations suggests introgression, as seen in previous studies.

Key words: Bactris gasipaes, molecular characterization, genetic variability, genetic relationships.

1. INTRODUÇÃO

A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) é amplamente distribuída nos

trópicos úmidos americanos e foi um importante cultivo para os primeiros povos desta

região antes da conquista das Américas pelos europeus. O modelo de roça utilizado por

estes povos propiciaram a criação de diferentes tipos de pupunha (CLEMENT, 1987)

apresentando atualmente ampla diversidade genética em suas populações silvestres e

cultivadas em virtude dos diferentes estágios de domesticação. Este processo de

domesticação resultou em um complexo de raças primitivas com características particulares,

sendo que uma parte deste complexo foi caracterizada morfológica (MORA URPÍ, 1984;

MORA URPÍ & CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988; MORA URPÍ, 1992;

CLEMENT, 1995) e geneticamente (RODRIGUES et al., 2004; SILVA, 2004; CRISTO-

ARAÚJO, 2008). É esperado que o estudo dessas raças primitivas contribua para o

entendimento do processo de domesticação das populações cultivadas, como também de

sua origem, que ainda não é bem determinada é vem sendo assunto de especulação com

três hipóteses em discussão: os Andes da Colômbia, o sudoeste da Amazônia e múltiplas

origens, sendo que as duas últimas prevalecem nas discussões atuais.

Estudos de recursos genéticos de pupunha permitiram a identificação de raças

primitivas e populações híbridas modernas, as quais estão parcialmente representadas

no Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Pupunha mantido pelo Instituto Nacional

de Pesquisas da Amazônia. Sendo composto por plantas vivas, o BAG requer altos

custos para sua manutenção e poucos são os recursos financeiros disponíveis para sua

caracterização e avaliação. Desta forma em 2008 foi estabelecida uma Coleção Nuclear

dentro do BAG de pupunha, representando 10% do BAG e 80% de sua diversidade

genética (CRISTO-ARAÚJO, 2008). Esta Coleção auxiliará em estudos de relações

entre raças e populações silvestres, assim como planejar adequadamente programas de

conservação e melhoramento da pupunha.

18

Marcadores moleculares contribuíram para caracterizar as plantas presentes no

BAG de pupunha, validando as raças primitivas e ajudando a decifrar a origem do processo

de domesticação da espécie. Todas as análises que antecederam a constituição da Coleção

Nuclear foram realizadas com marcadores RAPD que apresentam certas limitações, dentre

as quais se ressalta o fato de ser um marcador dominante. Dentre os marcadores

moleculares disponíveis, os marcadores microssatélites se mostraram bastante eficiente em

estudos de relações entre populações silvestres e cultivadas. Hernandez et al., (2008)

utilizaram quatro marcadores microssatélites em análises de diversidade e estrutura genética

entre populações silvestres e cultivadas de pupunha. Com apenas estes quatro marcadores

encontraram uma alta diversidade genética. No mesmo estudo, os autores analisaram as

relações de parentesco entre estas populações e sugeriram uma origem múltipla para a

pupunha cultivada com processos de domesticação independente em pelo menos três

regiões.

O presente estudo teve por finalidade avaliar a diversidade e estrutura genética das

plantas que compõem os acessos da Coleção Nuclear de Pupunha (INPA), validar estudos

genéticos anteriores e verificar as relações genéticas entre estas raças primitivas e

populações silvestres, utilizando 17 locos microssatélites desenvolvidos para Bactris gasipaes

(MARTINEZ et al., 2002; BILLOTTE et al., 2004 e RODRIGUES et al., 2004a).

1. Introdução 19

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Características da espécie

A pupunheira é uma palmeira cespitosa (multicaule) (MORA-URPÍ; WEBER;

CLEMENT, 1997). O tronco pode atingir até 20 m de comprimento, é dividido em nós

(cicatrizes deixadas por folhas) e entrenós com presença de espinhos (CLEMENT, 1987;

MORA-URPÍ et al., 1984), existindo mutações sem espinho. O diâmetro do caule varia de

15 a 30 cm e o comprimento do entrenó de 1 a 30 cm. A parte terminal do estipe apresenta

um broto (meristema ou gema terminal) protegido pelas bainhas de folhas jovens,

constituindo o palmito (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997) e na região do ápice

há uma coroa compostas de 12 a 25 folhas pinadas (CLEMENT, 1986). O sistema

radicular é fasciculado, como em outras monocotiledôneas, estendendo-se até 7 m do

estipe e 2 m de profundidade.

A pupunheira é monóica com flores masculinas e femininas na mesma

inflorescência (MORA-URPÍ & SOLIS, 1980). A inflorescência possui de 50 a 80 cm de

comprimento, 20 a 60 espigas que produzem de 50 a 1000 flores femininas e de 10.000 a

30.000 masculinas, aparecendo entre o 1º ao 3º ano após o plantio em campo (MORA-

URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997)

É predominantemente alógama, embora a autopolinização possa acontecer entre

estipes, quando a pupunheira cresce em touceira. Rodrigues (2007) pesquisou o sistema

reprodutivo de um ensaio de progênies de polinização aberta (provenientes de três

populações da raça Pampa Hermosa) utilizando oito loci microssatélites e constatou altas

taxas de cruzamento para todas as populações, sugerindo um sistema misto de reprodução,

com predominância de fecundação cruzada.

Os frutos são drupas de formatos que variam entre globoso, ovóide ou elipsóide,

com base mais ou menos plana. Uma vez maduro, a coloração do fruto pode ser

alaranjada, vermelho ou amarelo, que pode ter estrias superficiais, pesando entre 10 e 250 g

20

(Figura 1). O sabor e a textura do mesocarpo também apresentam variantes estendendo-se

do oleoso ao amiláceo (YUYAMA et al., 2002), sendo a textura determinada pela

quantidade de compostos do fruto: água, óleo, fibras e amido (CLEMENT, 1986). Os

frutos podem ou não conter sementes, embora o mais comum seja a ocorrência de frutos

férteis (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).

A pupunheira cultivada é amplamente adaptada a uma gama de condições

ecológicas, de 10 a 1200 m anm, sendo mais produtiva em solos relativamente profundos,

férteis e bem drenados, com chuvas abundantes e bem distribuídas (2000-5000 mm/ano) e

temperaturas médias acima de 24o C (CLEMENT, 2008).

Figura 1.Figura 1.Figura 1.Figura 1. Variedades de frutos de uma população de pupunha de Benjamim Constant, Amazonas, Brasil (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).

2.2 Utilidades da pupunheira

Praticamente tudo pode ser aproveitado desta espécie (CLEMENT, MORA-URPÍ,

1987); no entanto, seu mercado se restringe ao palmito como principal produto de

exploração comercial (CLEMENT, 1987; BOVI, 2000) e ao fruto como principal produto

de consumo local. Os frutos são ricos em propriedades nutritivas, químicas e

organolépticas, e deles podem ser obtidos uma série de derivados (CLEMENT, 2000;

CLEMENT; MORA-URPÍ 1987). Os primeiros povos americanos utilizavam a pupunha

na produção de “chicha”, uma bebida resultante da fermentação do fruto (CAMACHO,

2.2 Utilidades da pupunheira 21

1972; CLEMENT et al., 1987). Alguns autores sugerem a introdução do fruto nas dietas

infantis devido à riqueza nutritiva que este apresenta, principalmente pela presença do

retinol, precursor da vitamina A, nutriente frequentemente deficiente na alimentação

(SALAS & BLANCO, 1990). O preparo de farinha seca aponta um novo mercado para o

produto; no entanto, a relação custo/ benefício ainda não é satisfatória (CLEMENT, 2008).

Outra utilidade do fruto, como também das folhas, é na produção de ração animal, que

pode ser empregado em substituição ao milho e sorgo (MURILLO & ZUMBADO 1990;

MURILLO 1991; MURI-PINEDO et al., 1999).

Do tronco pode ser extraída a celulose e sua madeira também pode ser aproveitada,

pois é de grande resistência e elasticidade. Os ameríndios foram os primeiros povos a

utilizarem sua madeira, principalmente na confecção de instrumentos de pesca, caça e

guerra, assim como nas moradias (CLEMENT, 1987).

Nos últimos anos o palmito da pupunheira vem se consolidando em um mercado

de franca expansão no Brasil com perspectivas de ampliação para o exterior (YUYAMA et

al., 2005). O Brasil é o maior produtor e consumidor do produto, concentrando-se em São

Paulo, o maior mercado mundial (YUYAMA, 2002). A maioria deste produto era

proveniente do extrativismo, sendo as principais espécies exploradas as palmeiras de açaí

(Euterpe oleracea), na região do delta do Rio Amazonas, e a juçara (Euterpe edulis), na

mata Atlântica das regiões Sul e Sudeste. A contínua expansão do mercado consumidor,

acompanhado da exploração predatória do palmito de juçara e açaí, tornou o palmito de

pupunheira uma excelente alternativa para agricultores que buscam novas opções de cultivo

em substituição aos tradicionais (BOVI, 1997).

Certas vantagens são atribuídas ao palmito de pupunheira em relação ao de juçara a

açaí, como rápido crescimento e perfilhamento, maior diâmetro do palmito e vantagem de

não escurecer rapidamente após o corte, possibilitando outras formas de comercialização

do produto (BOVI, 1997; YUYAMA et al., 2002; FERREIRA et al., 1982; MORA-URPÍ

et al., 1997). Além disso, a pupunheira é bem adaptada a muitos ecossistemas brasileiros e

responde muito bem ao manejo (BOVI, 2000).

2.2 Utilidades da pupunheira 22

2.3 Taxonomia

Durante algum tempo a pupunheira era considerada como um cultígeno, uma

espécie cultivada sem parentes silvestres (SCHULTES, 1984). Isto foi devido à confusa

organização taxonômica do gênero Bactris.

Henderson (2000) auxiliou no esclarecimento taxonômico da espécie com uma

revisão do gênero Bactris, que reduzia os 13 nomes historicamente associados à pupunha

em um único nome: Bactris gasipaes Kunth. O autor reuniu todos os nomes atribuídos à

pupunha cultivada na variedade gasipaes e todos os nomes atribuídos à pupunha silvestre

na variedade chichagui (H. Karsten) Henderson. Uma das desvantagens desta revisão é o

fato de que dois grupos de populações silvestres, com distribuição e características

morfológicas e ecológicas distintas, estarem incluídos em uma mesma variedade.

O conceito da B. gasipaes var. chichagui apresentada por Henderson (2000) possui

uma distribuição disjunta. Ao norte, o táxon se distribui ao longo dos dois lados dos Andes

e nos vales interandinos na Colômbia e Venezuela até 1200 m acima do nível do mar

(anm); originalmente incluiu dois táxons – B. macana e B. caribaea (agora sinônimos). No

sul, o táxon é distribuído no sudoeste da Amazônia ao longo dos Andes (até 1000 m anm) e

na hiléia ao sul do rio Solimões e ao oeste da bacia do rio Tapajós; originalmente incluiu

pelo menos os táxons B. ciliata e B. dahlgreniana (agora sinônimos). A distribuição na hiléia

sugere importantes diferenças na adaptação ecológica de B. dahlgreniana comparada com

B. macana no norte, o que sugere uma história de isolamento genético entre as populações

do norte e do sul que provavelmente possui uma duração de diversos milhões de anos. B.

dahlgreniana, a pupunha brava, considerada por Henderson (2000) como sinônimo de

Bactris gasipaes var. chichagui, é um possível progenitor da pupunha no sudoeste da

Amazônia (CLEMENT et al., 1989).

A distribuição de B. dahlgreniana (B. gasipaes var. chichagui) no sudoeste da

Amazônia é extensa, com variação morfológica principalmente na parte reprodutiva. Os

frutos deste táxon, presentes na região de Rio Branco, Acre, são extremamente menores

que os encontrados ao longo do Rio Ucayali (CLEMENT et al., 1989). Três análises

discriminantes entre B. dahlgreniana e pupunha mostraram que estas espécies são

2.3 Taxonomia 23

vegetativamente similares e reprodutivamente distintas, sugerindo que a primeira é

progenitora da segunda (CLEMENT et al., 1989).

2.4 Origem e Distribuição geográfica

A revisão sistemática de Henderson (2000) sugeriu uma nova hipótese filogenética

para a pupunheira, propondo que as populações cultivadas foram originadas a partir da

variedade chichagui. Henderson propôs a existência de pelo menos três tipos de frutos

dentro da variedade chichagui (Figura 2):

• Tipo 1 – com frutos muito pequenos (0,9 a 1,6 cm de comprimento por 0,5 a 1,5

cm de diâmetro), distribuídos desde o centro-leste do Pará até os Andes no Sul da

Amazônia;

• Tipo 2 – com frutos muito pequenos (1,0 a 1,5 cm de comprimento por 1,0 a 1,4

cm de diâmetro) com distribuição ao norte dos Andes, na Colômbia e Venezuela, incluindo

os vales dos Rios Cauca e Magdalena;

• Tipo 3 – com frutos pequenos (1,5 a 2,9 cm de comprimento por 1,4 a 2,8 cm de

diâmetro) com distribuição na Colômbia, Equador, Peru, Bolívia e no Brasil, sendo

encontrado no sul da Amazônia, Acre e Rondônia.

Entretanto, o “Tipo 2” apresenta organização dos poros germinais da semente

diferente dos outros tipos da variedade chichagui e da variedade gasipaes, sugerindo que

este tipo não está envolvido na origem das populações cultivadas (FERREIRA, 1999).

Couvreur et al. (2006) realizaram uma análise morfológica entre as pupunhas cultivadas e

selvagens e, mesmo limitando suas análises a uma pequena escala geográfica, os autores

encontraram o “Tipo 3”, da variedade chichagui, ao longo do Pacífico na planície costeira

do Equador, incluindo o sul e o norte, menos a região mais úmida do Chocó no extremo

noroeste do Equador. As análises constituem uma boa evidência para a introgressão entre

populações silvestres e cultivadas com base no tamanho do fruto.

2.4 Origem e Distribuição geográfica 24

Figura 2.Figura 2.Figura 2.Figura 2. Distribuição aproximada dos três tipos de Bactris gasipaes var. chichagui (HENDERSON, 2000) baseadas em informações organizadas por C. R. Clement e E. Ferreira (CLEMENT et al., 2009a).

A origem da pupunha cultivada ainda não é bem determinada e tem sido assunto de

especulação por mais de um século. Atualmente há três hipóteses em discussão sobre a

origem da pupunha: 1) os Andes da Colômbia; 2) o sudoeste da Amazônia; e 3) múltiplas

origens. As segunda e terceira hipóteses dominam as discussões atuais. A segunda hipótese

sugere uma domesticação da pupunha em algum lugar do sudoeste da Amazônia, próximo

aos Andes Centrais (CLEMENT 1995; HUBER 1904; SEIBERT, 1950), embora Spruce

(1871) sugeriu o norte dos Andes (hipótese 1). A terceira hipótese supõe várias

domesticações da pupunha em diversos locais da variedade chichagui (MORA-URPÍ 1992,

1993). A evidência que permitirá confirmar uma dessas hipóteses deverá incluir a

distribuição da variabilidade morfológica, química e genética dos táxons uma vez atribuídos

a Guilielma, e sua relação com a variabilidade das raças primitivas criadas pelos povos

indígenas da América tropical (CLEMENT, 2001).

A possível origem da pupunha domesticada no sudoeste da Amazônia tem

movimentado uma contínua especulação desde o início do século 20, devido à existência de

pelo menos dois tipos da variedade chichagui e devido à presença de populações de

pupunha cultivada menos modificadas pela domesticação nesta região (CLEMENT et al.,

2009). Evidencias morfo-anatômicas (FERREIRA, 1999) e estudos moleculares dos últimos

2.4 Origem e Distribuição geográfica 25

dez anos (ROJAS-VARGAS et al., 1999; RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004;

CRISTO-ARAÚJO, 2008) fundamentam esta hipótese, apontando para uma área que

corresponde ao norte da Bolívia, o sudeste do Peru e o oeste Brasileiro. Rodrigues et al.

(2004a) avaliaram a estrutura genética e o relacionamento entre populações de pupunha

cultivadas e silvestres, mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Pupunha do

INPA (Manaus, Amazonas, Brasil) utilizando marcadores RAPD. Os autores verificaram

que estas populações estão bem relacionadas, com maior diversidade dentro e menor entre

as populações. Esta caracterização molecular, apoio a hipótese de uma única origem para a

pupunha cultivada com duas vertentes migratórias: uma para o Oriente e outra para o

Ocidente até a América Central.

Mora-Urpí (1999) defende uma origem polifilética, resultante da síntese de

domesticação de várias ecoespécies. Segundo o autor a participação humana no processo

de domesticação originou numerosas morfo-raças primitivas que se encontram distribuídas

nos trópicos úmidos americano. Hernandez et al. (2008) utilizaram quatro marcadores

microssatélites para investigar relações de parentesco entre cinco populações silvestres e

onze cultivadas, obtendo resultados similares ao de Rodrigues et al. (2004a). Entretanto, os

autores asseguram que a formação de três grupos em suas análises indica um processo de

domesticação independente em pelo menos três regiões, sugerindo múltiplas origens para a

pupunha cultivada.

As populações cultivadas encontram-se amplamente distribuídas nos trópicos

úmidos americanos (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997), desde ao norte de

Honduras, ao longo da costa do Oceano Atlântico na América Central e América do Sul,

até São Luís do Maranhão, e ao longo da costa do Oceano Pacífico, abrangendo do sul da

Costa Rica ao norte do Peru (ALMEYDA; MARTIN, 1980). De acordo com Henderson

(2000), as populações cultivadas na Amazônia apresentam maior variabilidade.

2.5 Domesticação

A pupunheira cultivada (Bactris gasipaes Kunth var. gasipaes) é a única palmeira

domesticada nos Neotrópicos (CLEMENT, 1988), embora existam outras palmeiras semi-

domesticadas ou de domesticação incipiente (CLEMENT, 1999). O processo de

2.5 Domesticação 26

domesticação, segundo Harlan (1992) e Clement (1999), é co-evolutivo, onde humanos

selecionam fenótipos de plantas individuais e garantem a propagação destas plantas para

originarem novas (sub) populações.

Clement et al (2009a) citam três possíveis hipóteses sobre as razões da domesticação

da pupunha: a utilização da madeira, frutos ricos em oleosos e frutos ricos em amido.

Provavelmente o interesse pela espécie iniciou-se por sua madeira, pois era preferida para

fabricação de vários instrumentos de caça e pesca, bem como para a construção (PATINÕ,

1989). Populações silvestres frequentemente ocorrem ao longo dos leitos dos rios, onde

também estavam acampamentos de caçadores e coletores. É provável que estes humanos

foram os primeiros a utilizarem sua madeira, no entanto pouco provável que os mesmos

tenham propagado a pupunheira (CLEMENT et al., 2009a). De alguma forma a

intervenção humana contribuiu para a abundância desta espécie, pois a derrubada da árvore

ocasionava uma abertura na mata para o trabalho, o que acentuava a iluminação para estas

plantas, possibilitando o sucesso reprodutivo (CLEMENT et al., 2009a).

Os frutos ricos em óleos significavam verdadeiras fontes de energia. É provável que

os povos consumidores do fruto, os utilizassem especialmente para a produção de um suco

saboroso. O transporte de frutos (sementes) em regiões de própria ocorrência de

populações silvestres poderia ter ocasionado hibridização entre populações diferentes,

resultando em uma variabilidade fenotípica para cor e tamanho do fruto, sendo que este

último seria o aspecto mais importante para a seleção, dando um novo rumo para a

domesticação (CLEMENT et al., 2009a). Sendo o tamanho do fruto, agora, objeto de

seleção, o aumento de teor de amido foi apenas uma consequência direta desta seleção.

Com o aumento da quantidade de amido nestes frutos, novas utilidades foram encontradas.

Os frutos possuíam considerável importância nas regiões do Noroeste da América do Sul e

sul da América Central, antes da conquista européia, pois além de serem consumidos

cozidos, serviam para a produção de uma bebida fermentada, a caissuma, consumida nos

festejos da safra (PATINÕ, 2002). Esta região é a área de ocorrência das raças primitivas do

tipo “macrocarpa” Putumayo e Vaupés, sendo observados nestes frutos os resultados deste

processo de domesticação (CLEMENT et al., 2009a).

Tornando-se a pupunha um cultivo de costume entre estes povos, é possível que

com o tempo tenha alcançado um espaço importante dentro de suas economias. Como já

2.5 Domesticação 27

mencionado, seria comum a troca de sementes entre vizinhos e entre regiões, quando a

ocorrência de migração por estes povos. Desta maneira o comércio, a mobilidade e a

migração foram fatores eminentes na propagação da domesticação desta espécie

(CLEMENT et al., 2009b).

2.6 Raças primitivas e populações híbridas

O processo de domesticação da pupunheira resultou na criação de várias raças

primitivas (variedades crioulas ou landraces) com características morfológicas, químicas e

produtivas próprias (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997; CLEMENT; AGUIAR;

ARKCOLL, 1998). Para Clement (2001), uma raça primitiva é um conjunto de populações

domesticadas, selecionadas em paisagens cultivadas numa área geográfica restrita, que

possui elevada variabilidade fenotípica e variabilidade genética razoável. Algumas

populações de pupunha são amiláceas ou oleosas, com frutos grandes ou pequenos, com

muita ou pouca fibra, algumas ricas em caroteno, outras não, com ou sem espinhos

(CLEMENT, 2001). Como consequência as raças primitivas são muito variáveis nessas

características, embora existam padrões de diferenças morfométricas e quimiométricas

(CLEMENT; AGUIAR; ARKCOLL, 1998), como também genéticas (RODRIGUES et

al., 2004a).

As raças primitivas foram classificadas de acordo com o tamanho do fruto em

(Figura 3): “Microcarpa”, com frutos pequenos (10-20 g), incluindo as raças Pará e Juruá;

“Mesocarpa”, com frutos intermediários (20-70 g), incluindo as raças Pastaza, Pampa

Hermosa, Solimões, Inirida, Tigre, Utilis, Guatuso, Cauca e Tuíra; e “Macrocarpa”, com

frutos grandes (70-200 g), incluindo as raças Putumayo e Vaupés (CLEMENT & MORA-

URPÍ, 1988). Parte deste conjunto de raças foi parcialmente caracterizada

morfologicamente e mapeada (MORA-URPÍ; CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988;

MORA-URPÍ, 1992; CLEMENT, 1995).

O Brasil apresenta dois representantes do grupo microcarpa: Pará e Juruá. A raça

Pará está distribuída ao longo do Rio Amazonas, sendo portadora de frutos pequenos,

oleosos e fibrosos, apresentando muitos frutos por cacho (CLEMENT, 1987). A raça Juruá

2.6 Raças primitivas e populações híbridas 28

localiza-se ao longo do alto Rio Juruá, possui fruto ovóide, oleoso e fibroso de

aproximadamente 20 g (MORA-URPÍ, 1993; CLEMENT, 1992). Na Bolívia, há

ocorrência da raça Tembé, com frutos de forma ovóide e aproximadamente 12 g (MORA-

URPÍ, 1993).

A Solimões é a única representante de uma raça mesocarpa no Brasil. É distribuída

ao longo do rio Solimões, no estado do Amazonas, e apresenta frutos de 30 a 80 g, com

razoáveis níveis de caroteno e óleo, sendo uma das melhores para o consumo humano.

Utilizando marcadores moleculares RAPD, Rodrigues et al. (2004a) observaram que a raça

Solimões não é geneticamente diferente da raça Putumayo, sugerindo que a área de

ocorrência da raça Solimões seja uma zona de hibridização ou introgressão entre as raças

Pará e Putumayo.

Existem ainda, outras raças mesocarpa na Amazônia. A raça Pampa Hermosa

encontra-se próximo a Yurimaguas, no Peru, e foi primeiramente selecionada pelos índios

devido à qualidade do fruto e a ausência de espinhos no tronco, o que facilita seu manejo.

Grande parte das sementes de pupunha inerme utilizada no agronegócio do palmito é

proveniente desta raça (BOVI, 2000). A raça Pastaza é localizada no sopé dos Andes, no

Equador, e parece ser a raça mais primitiva, pois possui frutos muito pequenos e com

muitos espinhos no estipe. A raça Inirida é distribuída ao longo do Rio Inirida, na

Colômbia, e possui frutos achatados, com baixos níveis de óleo e fibra. A raça Tigre

localiza-se no Rio Tigre, no Peru, ostentando frutos ovóides com cerca de 60 g

(CLEMENT, 1987, 1988; MORA-URPÍ et al., 1993).

Na parte Ocidental, as raças mesocarpas são: Utilis, encontrada no Panamá e Costa

Rica, com frutos de aproximadamente 41 g (FONSECA, 1989); Rama, ocorrendo na

Nicarágua e com frutos de 31 g (MORA-URPÍ, 1993); Tuíra, encontrada no Panamá, na

Província de Darién e na Cuenca del Canal, com frutos de até 36 g (MORERA MONGE,

1981); Guatuso, localizada próximo a San Carlos, Costa Rica, com frutos de peso médio de

37 g e frequentemente sem espinhos (CLEMENT, 1986); e Cauca, encontrada no Valle del

Cauca e Buenaventura, na Colômbia, possuindo frutos de 40 a 50 g (MORA-URPÍ, 1993).

As raças macrocarpa são Putumayo e Vaupés. A raça Putumayo é encontrada ao

longo do alto Rio Solimões (Brasil) e em áreas próximas de Colômbia e Peru; possui frutos

grandes, de aproximadamente 50 a 250 g, ricos em amido e seco, apresentando poucos


frutos por cacho. A raça Vaupés é localizada no alto Rio Negro, no próprio rio Vaupés

(Brasil) e nos seus tributários em território colombiano; seus frutos são grandes, de 60 a 240

g, ricos em amido e seco. Seus frutos se diferem da raça Putumayo devido ao formato mais

achatado, sendo mais largo que comprido. Clement (1987) indica essas raças como as mais

modificadas pelo processo de domesticação.

As raças amazônicas foram identificadas e classificadas com base na caracterização

morfométrica e análise multivariada a partir de uma lista mínima de descritores para uso in

situ e ex situ (MORA-URPÍ; CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988; MORA-URPÍ, 1992;

CLEMENT, 1995). Foi proposta a ocorrência de pelo menos oito raças de pupunheira na

Amazônia e de pelo menos mais cinco raças ao noroeste dos Andes (MORA-URPÍ;

WEBER; CLEMENT, 1997). Clement (2000) defende a existência de mais raças de

pupunheira a serem identificadas e descritas, uma vez que a distribuição de pupunheira é

bem maior que a área com raças descritas.

Figura 3.Figura 3.Figura 3.Figura 3. Distribuição geográfica das raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes var. gasipaes) nos Neotrópicos. MICROCARPA: 6. Tembé, 7. Juruá, 8. Pará; MESOCARPA: 1. Rama, 2. Guatuso, 3. Utilis, 4. Tuíra, 5. Cauca, 9. Solimões, 10. Pampa Hermosa, 11. Tigre, 12. Pastaza, 13. Inirida; MACROCARPA: 14. Putumayo, 15. Vaupés (RODRIGUES et al., 2004a; CRISTO-ARAÚJO, 2008).


Mora-Urpí e Clement (1988) sugeriram a existência de outras variedades de

pupunha provenientes das raças primitivas; tratam-se de populações híbridas, que são

centros modernos que armazenam grande variabilidade genética. Devido à constante

introdução de novos e diferentes alelos, as populações híbridas apresentam um dinamismo

extremamente alto de variabilidade genética (HARLAN, 1971). Existem pelo menos quatro

populações híbridas modernas na Amazônia, todas vinculadas a importantes centros

urbanos: Belém (Pará), Manaus (Amazonas), Iquitos e Yurimaguas (Loreto, Peru) (MORA-

URPÍ & CLEMENT, 1988).

2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA)

Com o intuito de conservar e utilizar a variabilidade genética existente nos recursos

genéticos vegetais, grandes coleções de germoplasma tem sido criada nos últimos anos. No

entanto, este aumento nos números de coleções não foi acompanhado por seu uso,

ocasionando um desequilíbrio entre a disponibilidade do germoplasma e sua real utilidade

(CORDEIRO; ABADIE, 2007). A conservação de recursos genéticos pode ser in situ,

quando estes são preservados em seus locais de ocorrência, ou ex situ, sendo que neste caso

podem ser mantidos indivíduos, sementes, embriões ou outras estruturas vegetais sob

diversas condições, dependendo do material coletado.

Desde 1975, pesquisadores do INPA tem se empenhado na coleção de recursos

genéticos de pupunha, resultando na criação do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de

Pupunha, apoiado e reconhecido pelo Sistema Brasileiro de Recursos Genéticos,

coordenado pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. O BAG é resultado de

várias coletas realizadas em três décadas e está localizado na Estação Experimental de

Fruticultura do INPA, km 38 da Rodovia BR-174, Manaus AM, Brasil (CLEMENT;

YUYAMA; CHAVÉZ-FLORES, 2001). É constituído de plantas vivas e hoje possui 326

acessos de populações cultivadas e silvestres (Figura 4). Foi criado com o intuito de auxiliar

no melhoramento genético da espécie (CLEMENT, 1996; CLEMENT; YUYAMA;

CHAVÉZ-FLORES, 2001), mas tem contribuído pouco para essa finalidade (CLEMENT

et al., 2004).

2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA) 31

Clement et al. (1997) destacam que as primeiras coletas realizadas para o BAG

ocorreram sem metodologia específica, sendo desenhadas para a instalação de um ensaio

agroflorestal. As coletas realizadas para o BAG foram resultado de numerosas prospecções

na área de distribuição da pupunha, entretanto sua representatividade ficou altamente

viciada em torno das principais raças e populações híbridas brasileiras, e da raça Pampa

Hermosa. Assim o BAG não teve uma estrutura adequadamente desenhada, que permitisse

a comparação entre os acessos. Sua estrutura dificulta a seleção massal e exige polinização

controlada.

Sendo composto por plantas vivas, o BAG requer gastos extremamente altos para a

sua manutenção e poucos recursos financeiros são disponíveis para sua caracterização e

avaliação. Holden et al. (1984) alertam sobre a importância da caracterização e avaliação

dos recursos genéticos mantidos nos bancos de germoplasma, para que estes sejam melhor

utilizados. As plantas presentes no BAG, mantido pelo INPA, não foram completamente

caracterizadas (CLEMENT et al., 1993; CLEMENT & CORADIN, 1995), embora exista

uma lista de descritores (CLEMENT, 1986). Por estes e outros problemas, o BAG pouco

tem contribuído para o melhoramento da pupunha (CLEMENT et al., 2004; CLEMENT

et al., 2005; van LEEUWEN et al., 2005), mesmo assim foi fundamental para o

entendimento do seu processo de domesticação (CLEMENT et al., 2001).

Figura 4.Figura 4.Figura 4.Figura 4. Representatividade do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha, INPA, Manaus, AM, Brasil, em termos de número de acessos por raças e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008).

2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA) 32

Coleção Nuclear de Pupunha (INPA)

A criação de uma Coleção Nuclear (CN) seria a forma mais eficiente para

conservação e utilização do germoplasma disponível no BAG (VILELA-MORALES;

VALOIS; NASS, 1997), por esta razão recentemente foi constituída uma CN dentro do

Banco Ativo de Germoplasma de pupunha do INPA (CRISTO-ARAÚJO, 2008). Uma

coleção nuclear consiste num conjunto de acessos proveniente de um banco de

germoplasma, onde os acessos escolhidos devem representar a variabilidade genética de

todo o banco com o mínimo de redundância (BROWN, 1989; NASS, 1997). A coleção

nuclear visa uma melhor acessibilidade à diversidade genética conservada pelos melhoristas

de plantas (HAMON et al., 1995).

Dentro de uma coleção nuclear, 10% dos acessos deveriam conter pelo menos 70%

da diversidade genética presente na coleção inteira (BROWN & SPILLANE, 1999); na

prática as proporções variam de 5 a 30 % dos acessos e 70 a 90 % da diversidade.

Geralmente as coleções são criadas apoiadas em informações morfo-geográfica, que para

pupunha significa raças primitivas, sendo grande parte destas raças já validadas por análises

genéticas (RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004, CRISTO-ARAÚJO, 2008).

Cristo-Araújo (2008) desenhou uma coleção nuclear dentro do BAG de pupunha

(INPA) com base em três critérios: distribuição geográfica, caracterização genética e

morfológica, pois estes estavam entre os mais utilizados na formação de CN (BROWN;

SPILLANE, 1999; ABADIE et al., 2005). No desenho da coleção, os acessos foram

distribuídos em dois grupos de acordo com o grau de domesticação: silvestres e cultivadas,

sendo as populações cultivadas subdivididas em raças primitivas, populações híbridas e

populações não designadas a raças. Na ausência de caracteres morfométricos, foram

utilizadas as análises genéticas com marcadores RAPD. Não foi possível agrupar todos os

resultados em uma única matriz, devido ao diferente número de bandas geradas em cada

análise, assim os acessos dentro das raças e populações foram selecionados com base na

divergência observada em matrizes de similaridade de Jaccard ou Dice previamente

publicadas (SILVA et al., 2003; RODRIGUES et al., 2004a; SILVA 2004; SANTOS et al

(submetido; CRISTO-ARAÚJO, 2008) e na distancia geográfica de cada raça e população.

Coleção Nuclear de Pupunha (INPA) 33

A coleção nuclear é constituída por 40 acessos que representam 10 % do banco de

germoplasma, composto por 390 acessos na época de sua constituição (Figura 5). Dos 40

acessos, 28 são de raças primitivas, três de populações híbridas, cinco de populações não

designadas e quatro de populações silvestres. Estima-se que pelo menos 80% da

variabilidade genética contida no BAG está amostrada na coleção nuclear (CRISTO-

ARAÚJO, 2008). As raças e populações com baixa representatividade no BAG foram

representadas na coleção nuclear em proporção ao seu número: Juruá (2); Cauca (2);

Guatuso (2); Pastaza (1); Tuira (1); Utilis (2); Vaupés (2); populações não designados (5); e

as populações silvestres tipo 1 e 3 (4). Os acessos de raças e populações bem representadas

foram alocados conforme o logaritmo do seu número: Pará (5); Putumayo (4); Solimões

(3); Pampa Hermosa (4); e populações híbridas (3).

Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. Representatividade da Coleção Nuclear de Pupunha, dentro do BAG, em termos de números de acessos por raça e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008).

A coleção nuclear permitirá a caracterização e avaliação dos recursos mantidos, além

de tornar possível o planejamento de programas de conservação e melhoramento

(CRISTO-ARAÚJO, 2008). A coleção também auxiliará no estudo das relações entre raças

e populações silvestres, assim como no estudo da origem da espécie. Cristo-Araújo (2008)

maximizou a variabilidade presente em cada raça primitiva via a seleção de populações

geográfica e geneticamente divergentes. Esse desenho essencialmente aumenta as chances

de detectar fluxo gênico entre populações geograficamente próximas, mesmo que de raças

distintas, o que é especialmente comum na Amazônia Ocidental.

Coleção Nuclear de Pupunha (INPA) 34

2.8 Marcadores Moleculares

Os marcadores utilizados em estudos genéticos para o melhoramento de plantas até

meados da década de 60 eram os marcadores morfológicos. Genes associados a caracteres

morfológicos contribuíam de forma significativa no entendimento teórico de ligações

gênicas e construções dos primeiros mapas genéticos. No entanto, estes marcadores

estavam restritos apenas a um pequeno número de espécies de plantas utilizadas como

sistemas modelos em análises genéticas, limitando seu uso a espécies que apresentavam

considerável importância econômica. Outro fator limitante para estes marcadores é o fato

de que frequentemente são afetados pela ação gênica de dominância, efeito ambiental,

pleiotropia e epistasia, dificultando a caracterização do genótipo. Desta forma o reduzido

número e a natureza dos marcadores morfológicos restringiram os estudos dos caracteres

quantitativos às espécies onde havia sido alcançada uma caracterização genética substancial.

Este quadro modificou-se com o desenvolvimento de marcadores isoenzimáticos,

permitindo ampliar o número de espécies de plantas estudadas com facilidade. Entretanto

este tipo de marcador não permitiu uma avaliação muito precisa dos níveis de diversidade

genética e de estrutura populacional (PRAKASH & LEWONTIN, 1968). Foi apenas com

o advento das novas técnicas de biologia molecular que este quadro ganhou grande

impulso, uma vez que estas possibilitaram a detecção de variabilidade ao nível de DNA,

tornando possível estimar o grau de variação genética, estrutura genética e história evolutiva

das populações.

Marcadores moleculares podem ser definidos por características de DNA que

diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdadas geneticamente (MILACH, 1998;

FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Marcadores moleculares cobrem amplamente

todo o genoma do organismo e, ao contrário dos marcadores morfológicos ou fenotípicos,

marcadores moleculares não são afeitados pelo ambiente, podendo ser utilizados em

qualquer estágio de desenvolvimento da planta sem interferir na interpretação dos

resultados.

Atualmente, estão disponíveis várias técnicas moleculares que se diferem entre si

pela habilidade em detectar divergência entre indivíduos, custo, facilidade de uso,

consistência e repetibilidade. Marcadores RFLP (Restriction Fragment Length

2.8 Marcadores Moleculares 35

Polymorphism; BOSTEIN et al., 1980) e VNTR (Variable Number of Tandem Repeats;

JEFFREYS et al., 1985) identificam polimorfismo por hibridação de DNA com sondas

específicas. Já marcadores como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA:

WILLIAMS et al., 1990), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; VOS et al.,

1995) e SSR (Simple Sequence Repeat: LITT & LUTTY, 1989) revelam polimorfismo

através da amplificação de fragmentos a partir da reação em cadeia da polimerase (PCR)

(MULLIS & FALOONA, 1987).

Marcadores moleculares podem ter expressão co-dominante ou dominante. Em

marcadores co-dominante, como os SSR e RFLP, os cromossomos homólogos podem

revelar fragmentos de um mesmo tamanho ou de tamanhos diferentes, ou seja, ambos os

alelos podem ser discriminados e identificados num indivíduo heterozigoto. No caso dos

dominantes, como RAPD e AFLP, alelos de um mesmo loco são revelados pela presença

ou ausência de uma banda, sendo impossível saber se o loco amplificado apresenta-se em

homozigose ou heterozigose (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).

Marcadores moleculares têm contribuído para caracterizar e validar a existência das

raças primitivas. Sousa et al. (2001) e Clement et al. (2002) utilizaram diferentes técnicas

moleculares para examinar a validade de três raças primitivas de pupunha (Pará, Putumayo

e Solimões) ao longo dos rios Amazonas e Solimões, no Brasil. Ambos estudos sugeriram a

inexistência da raça Solimões, pois as amostras utilizadas foram misturadas em subgrupos

sem ordem aparente e sem relação com as raças propostas (Solimões e Putumayo). As

raças Pará e Putumayo foram validadas, entretanto não foi possível determinar os limites

destas raças no Rio Solimões.

Rodrigues et al. (2004a) utilizaram marcadores RAPD para avaliar a existência

genética de sete raças de pupunha. Sugeriram a existência de uma única raça na América

Central (Utilis, com Guatuso e Tuíra como populações), prevalecendo o nome Utilis.

Também sugeriram a existência de uma única raça ao longo do Rio Solimões, com o nome

Putumayo, pois verificaram que as raças Solimões e Putumayo não se diferem

geneticamente, e a raça Solimões parece ser resultado de uma zona de contato entre as

raças Putumayo e Pará, confirmado pelos altos fluxos gênicos detectados nesta região, e

corroborando com as análises de Sousa et al. (2001) e Clement et al. (2002). Estas análises

ainda validaram a existência da raça Pampa Hermosa e observaram a separação da raça

Pará de todas as demais raças e uma relação significativa entre a distância geográfica e a


distância genética. Rodrigues et al. (2004a) verificaram no dendrograma das distâncias de

Nei (1972) a formação de dois grupos: um formado por Pará e outro composto pelas raças

Putumayo, Pampa Hermosa e Utilis. Desta forma a divisão dos Andes não parece ser

apropriada e estas análises sugeriram a hipótese de uma única origem para a pupunha

cultivada no sudoeste da Amazônia, com duas vertentes migratórias: uma para o Oriente e

outra para o Ocidente até a América Central.

Silva (2004) validou as análises de Rodrigues et al. (2004a), além de incluir outros

materiais em suas análises. Verificou o posicionamento da raça Juruá junto às três raças

ocidentais (Pampa Hermosa, Putumayo e Utilis), sugeriu que a similaridade genética entre

estas raças seria resultado de uma origem comum a este conjunto de raças. As outras raças

analisadas (Vaupés, Cauca e Inirida) tiveram pouca representação, não permitindo uma

conclusão mais precisa. No entanto se mostram relacionadas às raças ocidentais, também

indicando uma origem comum.

Três populações ao redor de Yurimaguas (Peru) foram analisadas, sendo observado

que não se diferenciavam da raça Pampa Hermosa (SILVA et al., 2003). Esta conclusão

contrariou as sugestões de Mora-Urpí e Clement (1988), que, baseados na variabilidade

morfométrica da população híbrida de Yurimaguas, consideraram que poderia existir

outras raças naquela região além da raça Pampa Hermosa. Adin et al. (2004) utilizaram

marcadores AFLP para comparar a variabilidade genética entre populações domesticadas

ao longo dos Rios Paranapura e Cuiparillo (Yurimaguas, Peru) e verificaram pouca

divergência genética e alto fluxo gênico, reforçando a hipótese de uma única raça (Pampa

Hermosa) para as populações desta localidade. Rodrigues (2007) validou estas conclusões

ao avaliar a diversidade e estrutura genética da raça Pampa Hermosa por meio de oito loci

microssatélites.

Santos et al. (submetido) estudaram a divergência genética de populações híbridas

presentes no Banco Ativo de Germoplasma de pupunha do INPA e compararam com as

raças primitivas ao redor. Observaram que as populações híbridas de Belém (Pará), Iquitos

(Loreto, Peru) e Yurimaguas (Loreto, Peru) possuem variabilidade genética menos

expressiva que a população híbrida de Manaus, talvez porque Manaus seja o ponto de

encontro de dispersão das raças orientais e ocidentais. Estas análises mostram que a

população de Yurimaguas não é tão divergente como anteriormente descrita e, ao contrário


do imaginado, indicam que as raças primitivas possuem maior variabilidade genética que

populações híbridas.

Marcadores RAPD foram utilizados em todas as caracterizações genéticas do BAG

de pupunha que antecederam a CN. A técnica RAPD é simples, de fácil acesso, necessita

de pequena quantidade de DNA, requer baixo custo operacional e de implementação e

permite alto número de marcadores. Todavia também apresentam limitações: é um

marcador dominante, apresenta baixo conteúdo informativo por loci, possui elevada

sensibilidade e baixa reprodutibilidade (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Dentre

estas limitações, destaca-se o fato de ser um marcador dominante, pois como não são

capazes de distinguir a natureza do alelo (homozigoto e heterozigoto), as estimativas de

heterozigosidade são superestimadas, por serem calculadas a partir do alelo nulo (WEIR,

1996). Isto é importante por que um dos fatores primordiais na confecção da CN foi a

divergência genética entre os acessos, obtidos pelas análises conjuntas dos dendrogramas

gerados em todas as análises genéticas do BAG. Rodrigues (2001) observou nos

dendrogramas de similaridade de Jaccard a presença de 10% dos indivíduos analisados

estarem em grupos mal resolvidos, atribuindo este fato a possíveis erros no plantio, na

coleta ou mesmo a erros nos procedimentos laboratoriais. Contudo, as mesmas

inconsistências foram observadas por Santos et al., (2001) e outras por Silva (2004),

demonstrando imperfeições nas instalações do BAG, e logo também presentes na CN.

Marcadores Microssatélites

Dentre os marcadores moleculares disponíveis, os microssatélites ou Seqüências

Simples Repetidas (SSR) constituem uma ferramenta ideal para análise de parentesco,

análise forense, fluxo gênico, mapeamento, sistemas de cruzamento e estudos sobre os

padrões e níveis de organização da variabilidade genética (FERREIRA &

GRATTAPAGLIA, 1998), tanto por seu caráter informativo como por sua facilidade de

identificação (CONDIT & HUBBELL, 1991; MORGANTE & OLIVIERI, 1993). Estes

marcadores consistem de pequenas sequências repetidas de DNA em tandem compostas

de um a seis nucleotídeos, encontradas com frequência e amplamente distribuídas no

genoma dos eucariotos (LITT & LUTY, 1989; FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).

Marcadores Microssatélites 38

Microssatélites podem ser classificados de acordo com o tipo de repetição da sequência em:

perfeitos, quando a sequência não contém interrupções; imperfeitos, quando ocorre uma

base entre as sequências repetidas; interrompidos, quando há uma sequência diferente

dentro da sequência repetida; e compostos, quando a sequência do microssatélite apresenta

duas repetições diferentes e adjacentes.

Os loci microssatélites possuem expressão co-dominante, ou seja, num indivíduo

heterozigoto ambos os alelos são visualizados. São altamente multi-alélicos devido à alta

taxa de mutação existente, apresentando elevado conteúdo informativo por loco. Seu

polimorfismo pode ser estudado via PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando-se um

par de iniciadores (“primers”) específicos que flanqueiam a região do DNA contendo as

unidades repetidas (WEBER & MAY, 1989). Podem ainda ser automatizáveis em sistema

multiplex, que permite avaliar de forma rápida um grande número de indivíduos para um

grande numero de loci em pouco tempo.

Palmeiras como Cocos nucifera (RIVERA et al., 1999), Euterpe edulis (GAIOTT et

al., 2001), Elais guineensis (BILLOTTE et al., 2001) e Bactris gasipaes (MARTÍNEZ et al.,

2002; BILLOTTE et al., 2004; RODRIGUES et al., 2004b), já apresentam microssatélites

desenvolvidos e demonstraram que estes marcadores são altamente multi-alélicos e

informativos para estudos de estrutura genética de populações, estimando com precisão

heterozigosidade, distância genética, relações de parentesco e fluxo gênico. Para

pupunheira, atualmente existem 46 loci microssatélites (MARTÍNEZ et al., 2002;

BILLOTTE et al., 2004; RODRIGUES et al., 2004b) mostrando-se eficientes em estudos

de diversidade e estrutura genética entre populações silvestres e cultivadas (COUVREUR et

al., 2005; COLE et al., 2006; HERNANDEZ, 2005; RODRIGUES, 2007).

2.9 Diversidade e Estrutura Genética de Populações

As populações adquirem continuamente diversidade genética por meio de mutação,

recombinação e fluxo gênico, e essa diversidade pode ser perdida por deriva genética,

endocruzamento e pela maior parte dos tipos de seleção natural (NEI, 1978). Estes fatores

responsáveis pela variabilidade genética nas populações são fundamentais para o processo

2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 39

evolutivo uma vez que as adaptações de cada espécie que ocorre ao longo das gerações

estão ligadas a existência da variabilidade sobre a qual a seleção natural possa atuar

(BRAMMER, 1993).

A genética de populações tornou-se uma importante ferramenta por descrever a

variação genética em populações e estudar mecanismos de manutenção desta variabilidade

(NEI, 1978). Estudos de variabilidade genética de populações de uma determinada espécie

envolvem duas questões: a quantificação dos níveis de variabilidade dentro das populações

e a caracterização dos níveis de estruturação genética entre populações (HAMRICK, 1982).

O estudo destes fatores tem contribuído para o entendimento dos processos

microevolutivos dentro de populações de plantas nativas, uma vez que auxiliam as

estratégias de domesticação, manejo e conservação dessas espécies (CARTHEW, 1993).

No entanto, em espécies com populações domesticadas, as forças evolutivas contam com a

influência da seleção humana, deriva devido ao tamanho do plantio, eventos migratórios

mediados por humano, que ainda prezam em conservar mutações curiosas ou

interessantes.

Os parâmetros genéticos mais utilizados para quantificar a variabilidade genética em

populações de plantas são o número de alelos por loco (A), a heterozigosidade esperada

(HE), prevista segundo o Equilíbrio de Hardy-Weinbeg, heterozigosidade observada (HO),

porcentagem de loci polimórficos (P) e índice de fixação (f) (HAMRICK, 1983). Conte

(2004) cita o número de alelos por lócus e a porcentagem de loci polimórficos como os

índices de diversidade mais utilizados em estudos de populações naturais, por caracterizar e

comparar os níveis de variação genética nestas populações. A frequência de heterozigotos,

para Weir (1996) e Nei (1973), se faz um importante indicador de variabilidade pelo fato

de cada heterozigoto ser composto de dois alelos diferentes, representando melhor a

variação existente em populações de espécies autógamas e alógamas.

Estrutura genética pode ser definida como a distribuição não aleatória de alelos e

genótipos dentro da espécie (HAMRICK, 1982) ou, simplesmente, a forma como a

variabilidade genética está distribuída dentro e entre populações. Na caracterização da

estrutura genética de populações, três metodologias têm sido amplamente usadas: as

estatísticas F (WRIGHT, 1965; NEI 1977); a análise da diversidade gênica em populações

subdivididas (NEI, 1973, 1977, 1987); e a análise de variância das freqüências gênicas


(Cockerham, 1969; Weir, 1996). Adotando as estatísticas F de Wright é possível

caracterizar a distribuição da variabilidade genética entre as populações (FST), assim como o

valor médio de endogamia em nível de população (FIS) e total (FIT) (WRIGHT, 1965). A

análise da diversidade genética em populações subdivididas torna possível a comparação

dos níveis de heterozigosidade entre e dentro das populações, assim como a obtenção de

estimativas de divergências (GST) a partir de uma base diferente da que se fundamentam as

estimativas FST e θ (NEI, 1977). Nei (1978) destaca a importância das estimativas das

frequências gênicas de uma população em estudos evolutivos, porque mudanças genéticas

de uma população podem ser avaliadas através das alterações nas frequências alélicas. A

análise das frequências gênicas proposta por Cockerham (1969) parte do pressuposto de

que as populações são originadas de uma população ancestral, permitindo assim a

estimativa de coeficientes de parentesco (coancestralidade) e endogamia. Outra

pressuposição é a de que a deriva genética e o sistema reprodutivo são responsáveis pelos

desvios de panmixia. Desta forma, igualmente as estatísticas F, a análise das frequências

gênicas fornece informações sobre os níveis de fixação de alelos dentro das populações (f) e

totais das populações (F), assim como a divergência genética entre populações ou o

coeficiente de parentesco entre indivíduos dentro da população (θp). As três metodologias

possuem bases genéticas similares, sendo complementares em relação ao significado

biológico das estimativas obtidas, principalmente se os marcadores forem neutros, a

amostragem aleatória e as populações forem originadas de uma única população ancestral

(Reis, 1966).

Desde o advento da técnica de PCR, marcadores microssatélites têm sido

amplamente utilizados em estudos genéticos. Entender o modelo de mutação destes

marcadores era fundamental para o desenvolvimento de estatísticas que refletissem a

estrutura genética pelos microssatélites. Kimura & Crow (1964) desenvolveram o modelo

de alelos infinitos (IAM), onde cada mutação cria um novo alelo a uma determinada taxa.

Este modelo não permite homoplasia e possuem baixas taxas de mutação, o que não

condizia com dados microssatélites. Mais adiante, Kimura & Otha (1978) criaram SMM

(“stepwise mutation model” – modelo passos de mutação), onde a mutação para um novo

alelo de um determinado marcador microssatélite ocorre em passos. Assim alelos com

tamanhos mais próximos são considerados mais similares do que alelos com tamanhos

mais distantes (BALLOUX; LUGON; MOULIN, 2002). Desta forma, foi criada a


estatística RST (SLATKIN, 1995), que admite o modelo SMM, sendo desenvolvida

especificamente para dados microssatélites.

Outra estimativa importante em estudos de estruturas populacionais é o fluxo

gênico, que pode ser definido como todos os mecanismos que resultam no movimento de

alelos de uma população para outra (SLATKIN, 1981, 1985). O fluxo ou a dispersão de

pólen e sementes entre populações reduz a diferenciação genética entre elas, sendo um dos

mecanismos responsáveis pela introdução de novas variações genéticas na população

receptora (WRIGHT, 1931). As estimativas de fluxo gênico podem ser medidas em termos

do número equivalente de migrantes que se move de uma população para outra

(SILVERTOWN & DOUST, 1993). Adin et al. (2004) utilizaram marcadores AFLP para

investigar o fluxo gênico entre populações de pupunha nas comunidades indígenas e

tradicionais ao longo dos Rios Paranapura e Curiparillo, perto de Yurimaguas, Peru,

encontrando um alto fluxo entres estas populações, ao ponto de não ser possível diferenciá-

las, evidenciando que o fluxo gênico influência não só na estrutura genética como também

nos próprios limites das populações.

Um quesito fundamental em qualquer inferência sobre estrutura de população é a

definição das próprias populações. A determinação da população é normalmente baseada

na origem geográfica dos indivíduos e fenótipos. Entretanto a estrutura genética das

populações nem sempre é refletida na proximidade geográfica dos indivíduos. Populações

não delimitadas geograficamente podem ser geneticamente estruturadas, devido às barreiras

não identificadas para o fluxo gênico. Além disso, grupos com diferentes localizações

geográficas, fenótipo ou padrões de comportamento, não são geneticamente diferenciados.

Pritchard et al. (2000) desenvolveram um método (software Structure) para delinear

agrupamentos de indivíduos (K) com base em seus genótipos em locos múltiplos usando

uma abordagem bayesiana. O método assume o equilíbrio de Hardy-Weinberg e a ligação

dentro das populações, a fim de encontrar um número de grupos que melhor se ajuste aos

dados. A vantagem deste método é que as populações não precisam ser definidas à priori,

sendo identificadas pelos dados gerados com marcadores moleculares. De acordo com

Evanno et al. (2005), o software Structure não é tão eficiente para detectar o verdadeiro

número de agrupamentos (K) em amostras de indivíduos cujo padrão de dispersão entre as

populações não é homogêneo, como ocorre no modelo de ilhas. Em populações cujas

migrações são baseadas em outros modelos, em que as taxas de migração variam entre


subpopulações ou que exista algum tipo de hierarquia, são obtidos resultados mais reais de

agrupamentos quando se utiliza a fórmula de ∆K:

∆K = m|L′′(K)|/s[L(K)]

Onde:

L′′(K) = primeira ordem de mudanças das estimativas [L′(K + 1) – L′(K)];

L′(K) = segunda ordem de mudanças das estimativas [L(K) – L(K – 1)];

m = média

s = desvio padrão.

Zhang et al. (2009) analisaram a estrutura genética e a diferenciação intra-específica

de 3.024 acessos de uma coleção nuclear de arroz na China por meio de 36 loci

microssatélites. Os autores utilizaram o software Structure, com ∆K proposto por Evanno

et al. (2005), para delimitar populações de arroz de acordo com o seu ecotipo. Em uma

primeira simulação com 3.024 acessos, os gráficos gerados mostraram alguma evidencia de

grupos em K=2, indicando duas populações divergentes; no entanto, também observaram

algum agrupamento em K=6. Devido à divergência observada entre as duas populações,

fizeram uma segunda simulação com os dois grupos de forma independente e notaram a

existência de três subpopulações em cada uma das duas populações inferidas, confirmando

o agrupamento encontrado em K=6 na primeira simulação. Estes agrupamentos foram

consistentes com as análises da estrutura da população, que mostraram duas subespécies

distintas, cada uma com três ecotipos. O programa Structure está se tornando uma

ferramenta poderosa em análise de genética de populações e será usado nesta dissertação

para avaliar as populações e raças de pupunha com metodologia diferente de Rodrigues et

al. (2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008).

O modelo de agrupamento desenvolvido por Pritchard et al. (2000) também

contribuí nas análises de Silveira e colaboradores (2009) que analisaram a variabilidade

genética de 180 indivíduos de caroá (Neoglaziovia variegata) por meio de marcadores

RAPD. Neste estudo os autores consideraram o modelo de informação à priori da

população para definição dos grupos e freqüências alélicas independentes. Os resultados

gerados permitiram identificar os grupos já existentes e relações de parentescos entre os


indivíduos avaliados, mostrando que dos 180 indivíduos, 63 apresentavam ancestral em

outras populações.

Sigrist (2009) caracterizaram a divergência genética entre acessos brasileiros de

cúrcuma (Curcuma longa L.), bem como compararam com materiais oriundos de outros

países, por meio de 19 loci microssatélites. O autor utilizou o programa Structure para

verificar os números possíveis de agrupamentos (K), de acordo com o ∆K de Evanno et al.

(2005) e sem informações hierárquicas à priori. As análises indicaram a formação de três

grupos (K=3) como o melhor número de agrupamentos, mas também mostraram alguma

evidencia em K=6. A observação dos três grupos mostra que dos 50 acessos brasileiros

analisados, 84% estiveram presentes em um mesmo grupo, outro grupo foi composto por

acessos de Porto Rico e por uma parte dos acessos brasileiros e um terceiro grupo foi

formado por acessos indianos e brasileiros. Entretanto os agrupamentos formados nos

dendrogramas mostraram a formação de cinco grupos, dois a mais que os evidenciados

pelo programa Structure, pois discriminou 84% dos acessos brasileiros em um único grupo,

isolou os acessos de Porto Rico, Índia e separou os acessos brasileiros unidos aos de Porto

Rico e os acessos brasileiros unidos aos da Índia, no programa Structure.

As estimativas de similaridade ou distâncias genéticas normalmente são

proporcionais ao tempo de divergência dos genótipos em relação a um ancestral comum

(Weir, 1996). Segundo Milach (1998) estes estimadores podem ser divididos em dois

grandes grupos: a) as distâncias geométricas: destacando-se as distâncias de Roger

modificado; o índice de similaridade de Nei & Li (1979); assim como as estimativas de

distancias de D de Barbosa Neto et al. (1997), as quais variam de zero a um, facilitando a

interpretação dos resultados; b) as distâncias que requerem pressuposições genéticas, sendo

que a mais empregada é a distancia de Nei (1978) que mensura as proporções de genes

iguais entre e dentro de populações e é diretamente proporcional ao tempo de divergência

das duas populações sob comparação.

Segundo Cruz (1990), os métodos de agrupamentos têm por finalidade separar um

grupo original de observações em vários subgrupos, de forma a existir homogeneidade

entre eles. A técnica depende, sobretudo, das medidas de distâncias ou similaridades,

estimadas previamente. Os métodos aglomerativos mais utilizados são os de otimização,

que dividem os genótipos em subgrupos não vazios e mutuamente exclusivos; e os


hierárquicos, onde os genótipos são agrupados por um processo repetido em vários níveis,

até o ajustamento de um dendrograma ou diagrama de árvore (CRUZ & REGAZZI, 1994).

Um dos métodos de grupamento utilizados na construção de dendrograma é o Neighbor

Joining, em que agrupa sequencialmente os pares de sequência mais intimamente

relacionados. O método reconstrói arvores filogenéticas a partir dos dados da distância

evolutiva e seu princípio é encontrar pares de unidades taxonômicas operacionais (OTUs

[= vizinhos]) que minimizam o comprimento total dos ramos, em cada fase do agrupamento

de OTUs começando com uma árvore starlike. (SAITOU & NEI, 1987).


3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material Vegetal e Extração de DNA

Amostras de 36 acessos (3 a 5 plantas por acesso) de pupunha cultivada (B. gasipaes

var. gasipaes) e 4 acessos (2 a 5 plantas por acesso) de pupunha silvestres (B. gasipaes var.

chichagui) pertencentes à Coleção Nuclear, foram coletadas do Banco Ativo de

Germoplasma de Pupunha, localizado na BR 174, Km 38, Manaus, Amazonas, Brasil

(Tabela 1). A identificação exata das plantas está no Apêndice.

A fim de esclarecer algumas designações utilizadas neste trabalho, definimos:

ACESSO ACESSO ACESSO ACESSO – Representa uma progênie obtida de um único cacho de uma matriz no campo;

POPULAÇÃOPOPULAÇÃOPOPULAÇÃOPOPULAÇÃO – Conjunto de indivíduos que ocorre em uma região geográfica restrita,

onde pode haver fluxo de pólen ou sementes;

RAÇARAÇARAÇARAÇA – Conjunto de populações com origem genética similar e diferente de outras raças,

mesmo havendo fluxo gênico entre elas (raças).

A extração do DNA genômico foi realizada com o reagente CTAB 2% (DOYLE &

DOYLE, 1987) com modificações. O DNA foi quantificado em gel de agarose 1% corado

com GELRED (UNISCIENSE), por comparação com marcadores de massa molecular

conhecida (DNA de fago lambda a 50, 100 e 200 ng/µl).

46

TabelaTabelaTabelaTabela 1111.... Acessos de pupunha cultivada e silvestre proveniente do Banco de Germoplasma de pupunha do INPA, Manaus, AM, Brasil que compõem a Coleção Nuclear. Classe de tamanho do fruto; designação raça ou população; localização geográfica dos acessos: Brasil (BR), Colômbia (CO), Costa Rica (CR), Equador (EC), Panamá (PA) e Peru (PE); número de passaporte dos acessos no banco de dados do INPA e número de amostras de cada acesso utilizadas neste estudo.

ClasseClasseClasseClasse Raças/OutrasRaças/OutrasRaças/OutrasRaças/Outras Representação GeográficaRepresentação GeográficaRepresentação GeográficaRepresentação Geográfica Nº identificaçãoNº identificaçãoNº identificaçãoNº identificação Nº amostrasNº amostrasNº amostrasNº amostras MacrocarpaMacrocarpaMacrocarpaMacrocarpa Juruá Cruzeiro do Sul (BR)

Cruzeiro do Sul (BR) F - 0199-83 F - 0200-83

5 5

Pará Belém (BR) P - 50 5 Gurupá (BR) F - 0109-83 5 Santarém (BR) F - 0096-80 5 Parintins (BR) F - 0098-83 4 Itacoatiara (BR) F - 0096-83 5

MesocarpaMesocarpaMesocarpaMesocarpa Cauca Buenaventura (CO) Buenaventura (CO)

F - 0005-79 F - 0004-79

5 3

Guatuso 1 San Carlos (CR) San Carlos (CR)

L - 3M - 94 L - 5M - 94

4 5

Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) F - 0161-80 5 Rio Paranapura (PE) F - 0168-80 5 Santa Maria (PE) F - 0174-80 5 Lorenza (PE) F - 0195-80 3 Pastaza Pastaza (EC) F - 0236-84 1 Solimões Coari (BR) F - 0087-83 5 Tefé (BR) F - 0046-79 5 Fonte Boa (BR) F - 0066-83 5 Tuíra Cuenca Del Canal (PA) F - 0204-80 5 Utilis San Isidoro Del General

(CR) F - 0146-80 5

Guapiles (CR) F - 0209-80 5 MicrocarpaMicrocarpaMicrocarpaMicrocarpa Putumayo St. Antônio de Içá (BR) F - 0066-79 4

Benjamim Constant (BR) F - 0052-83 4 Tabatinga (BR) F - 0048-78 4 Pebas (PE) F - 0140-83 3 Vaupés Rio Vaupés (CO)

Rio Vaupés (CO) F - 0211-84 F - 0209-84

5 5

Pop. HíbridasPop. HíbridasPop. HíbridasPop. Híbridas várias Manaus (BR) 1 - P 5 Iquitos (PE)

Iquitos (PE) F - 0121-83 F - 0117-83

5 5

Não DesignadasNão DesignadasNão DesignadasNão Designadas várias Plácido de Castro (BR) F - 0208-83 5 Puerto Maldonado (PE)

Puerto Maldonado (PE) F - 0188-83 F - 0186-83

5 2

Pucalpa (PE) F - 0177-83 5 Contamana (PE) F - 0197-83 5

SilvestresSilvestresSilvestresSilvestres var. chichagui 1 Rio Branco (BR) Rio Branco (BR)

F - 0205-83 F - 0206-83

5 5

var. chichagui 3 Pucalpa (PE) Contamana (PE)

F - 0176-83 F - 0194-83

5 2

TOTALTOTALTOTALTOTAL 40 acessos40 acessos40 acessos40 acessos 179 plantas179 plantas179 plantas179 plantas

3.1 Material Vegetal e Extração de DNA 47

3.2 Amplificação dos loci microssatélites

Testou-se 39 loci microssatélites próprios de pupunha (MARTINEZ et al., 2002,

BILLOTTE et al., 2004 e RODRIGUES et al., 2004b) para seleção de loci com perfis de

amplificação claros e informativos, usando 8 plantas, sendo 6 de populações cultivadas

(Pará, Putumayo e Utilis) e 2 de populações silvestres. A escolha destas plantas baseou-se

na distância geográfica das raças e populações visando aumentar a probabilidade de

encontrar alelos mais divergentes. Os loci selecionados estão amostrados abaixo (Tabela 2).

TabelTabelTabelTabela 2. a 2. a 2. a 2. Características dos 17 loci microssatélites selecionados entre 39 testados e seus respectivos autores.... Ta - temperatura de anelamento; pb - número de pares de base.

locilocilociloci RepetiçãoRepetiçãoRepetiçãoRepetição Ta (°C)Ta (°C)Ta (°C)Ta (°C) Tamanho (pb)Tamanho (pb)Tamanho (pb)Tamanho (pb) AutoresAutoresAutoresAutores

Bg6 (GT)14 50° 180-245 Martinez et al., 2002

Bg10 (CT)18 48° 171-221 Martinez et al., 2002

Bg17 (CT)3(GT)13 52° 231-281 Martinez et al., 2002

Bg 44 (CT)19 50° 155-201 Martinez et al., 2002

mBg57 (GA)17 52° 224-294 Billotte et al., 2004





Bg02_4 (GA)8TA(GA)15 64° 118-178 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_5 (GA)16 64° 179-213 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_6 (CT)14 58° 107-159 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_9 (GA)17 58° 165-221 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_10 (CT)10TT(CT)5 64° 146-178 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_11 (GA)11GG(GA)5 58° 148-192 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_12 (GA)9CA(GA)5 58° 141-177 Rodrigues et al., 2004b

Bg02_19 (CT)23(CA)6 58° 161-221 Rodrigues et al., 2004b

3.2 Amplificação dos loci microssatélites 48

Para detecção dos produtos por fluorescência, adicionou-se a extremidade do

primer Forward de cada lócus a sequência M13 (5’TGTAAAACGACGGCCAGT 3’), e

uma outra sequência marcada com fluorocromo específico (FAM ou HEX) foi utilizada

para marcação dos produtos segundo Schuelke (2000), com algumas modificações. As

reações de PCR tiveram um volume final de 10 µl contendo 4 µl de DNA genômico (40

ng), 1 µl de tampão 10X (TrisHCl 100 mM, KCl 500 mM, pH 8.4), 1 µl dNTP (2,5 µM), 1

µl de MgCl2 (25 mM), 0,8 µl de BSA (2,5 µM), 1 µl do primer Reverse (2,5 µM), 0,5 µl do

primer Forward (1,25µM), 0,5µl do primer M13 (1,25µM) marcado com fluorescência e 0,2

µl de Enzima Taq polimerase (5U/µL) (Biotools). As amplificações foram realizadas em

termociclador Veriti (Applied Biosystem) seguindo o programa: 94ºC por 2 minutos; 25

ciclos de 94ºC por 10 segundos, a temperatura de anelamento do primers (Ta), por 20

segundos, 72ºC por 30 segundos; um ciclo de 72ºC por 10 minutos, 20 ciclos de 94ºC por

10 segundos, 50ºC por 20 segundos, 72ºC por 30 segundos, e uma extensão a 72ºC por 30

minutos. Os produtos gerados pela PCR foram analisados conjuntamente, misturando-se

dois loci microssatélites marcados com diferentes fluorocromos, que posteriormente foram

visualizados em seqüenciador automático (Mega Bace 1000, Ge Healthcare). A estimativa

do tamanho dos alelos (pb – pares de bases) foi realizada com o programa Fragment

Profiler (GE Healthcare) auxiliado pelo marcador de peso molecular (Size Standard, ET-

400ROX, GE Healthcare) para assim gerar os relatórios com os genótipos de cada

indivíduo.

3.3. Análise Genética dos Dados.

As freqüências alélicas e os alelos privados de cada lócus foram calculados por meio

dos programas CONVERT (GLAUBITZ, 2004). Os alelos foram classificados como

comum (freqüência > 0,2), intermediário (>0,05) ou raro (<0,05), bem como privado

(presente em apenas uma população), esporádico (presente de duas a quatro populações)

ou difundido (presente de cinco a onze populações), similar ao esquema de Marshall &

Brown (1975).

O programa Structure 2.2 (PRITCHARD et al.,2000; PRITCHARD &WEN, 2003)

foi utilizado para inferir o melhor K (número de agrupamentos – clusters), verificando o

3.2 Amplificação dos loci microssatélites 49

comportamento e a consistência dos agrupamentos formados e quantificando os indivíduos

semelhantes dentro das “populações” estudadas. Os parâmetros utilizados foram: burn-in

de 10.000 permutações, Markov Chain Monte Carlo (MCMC) com 100.000 permutações,

o modelo de ancestralidade “admixture”, onde cada indivíduo pode ter ancestrais de mais

de uma população, e a freqüência alélica independente (λ=1). A escolha do melhor K foi

realizada por meio dos valores de LnP (D) e de ∆K de acordo com Evanno et al. (2005).

Os agrupamentos consistentes detectados pelo programa STRUCTURE 2.2 foram

utilizados as análises seguintes. As estimativas de diversidade genética - o número de alelos

(A), a heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) - foram calculadas para cada lócus e

para o conjunto de plantas por meio dos programas ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et

al., 2005), que também foram utilizados para obtenção dos níveis de significância dados

pelo p-value e FSTAT v.2.9.3.2 (GOUDET, 2000).

As estimativas dos parâmetros genéticos HT, HS, GST e RST foram calculados pelo

programa FSTAT v.2.9.3.2 (GOUDET, 2000) e as estatísticas F (FIS, FST, FIT) de Wright

(1965) foram calculados por meio do programa ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et al.,

2005). Para determinar a estrutura genética entre e dentro das raças e populações foi

efetuada uma análise hierárquica de variância molecular (AMOVA, MICHALAKIS &

EXCOFFIER, 1996), bem como o grau de diferenciação (FST) entre as raças e populações,

através do programa ARLEQUIN v.3.01 (Excoffier et al., 2006). O fluxo gênico médio foi

estimado assumindo que Nm=(1/ FST -1)/4 (WHITLOCK & MCCAULEY, 1999) e o

número absoluto de migrantes (M=2Nm) entre as raças e populações também foi estimado

com base em FST usando o programa ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et al., 2005).

Com base na matriz de distâncias de alelos compartilhados (DAS), calculados pelo

programa Populations 1.2.28 (LANGELLA, 2002) (CHAKRABORTY & JIN, 1993) e nas

distâncias genéticas de Nei (1978) calculados pelo programa TFPGA (MILLER, 1997), as

raças, populações e o conjunto de acessos do BAG de pupunha foram agrupados pelo

método Neighbour Joining (NJ) com o programa MEGA v.4.0 (KUMAR et al., 2004).

3.3 Análise Genética dos Dados 50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Avaliações das raças primitivas e outras populações.

Uma análise preliminar foi usada para observar o sucesso do programa Structure

(PRITCHARD et al., 2000; PRITCHARD & WEN, 2003) em identificar grupos similares

às raças validadas, e avaliar as relações das populações híbridas, populações não designadas

e populações silvestres em relação às raças validas. A primeira simulação no Structure

ocorreu com todos os 179 indivíduos; o valor do LnP(D) aumentou com o K de 1 a 15,

mostrando alguma evidencia de agrupamentos para ∆K 2, 3, 7 e 9 (Figura 6). Avaliação das

simulações para esses ∆K sugeriu que as hipóteses de Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004),

Cristo-Araújo (2008) e Santos et al. (submetido) tinham validade, e poderiam ser usadas

para re-designar acessos a raças para que os agrupamentos formados fossem mais

consistentes, bem como designar novos grupos, chamados de “populações sintéticas”

(CRISTO-ARAÚJO, 2008). Também nestas análises foi observado que o comportamento

do acesso F-0209-84 da raça Vaupés (Rio Vaupés, Colômbia) não foi consistente, pois os

dois acessos desta raça usados nesta análise deveriam ter se agrupado no mesmo conjunto.

No entanto, o acesso F-0209-84 se juntou as populações do Alto Rio Madeira. Nesta

incerteza, o acesso foi eliminado das análises, pois parece ser erro no plantio do BAG

Pupunha.

Figura 6.Figura 6.Figura 6.Figura 6. Provável validade de grupos populacionais identificados pelo programa Structure baseada em 17 loci microssatélites de pupunha. (∆K com K de 1 a 15, com 15 simulações para todos os 179 indivíduos analisados).

51

Com base em K=3, um grupo, que combina a maioria das plantas de América

Central, sugere que as raças Tuíra e Guatuso são partes da raça Útilis, prevalecendo o

nome Útilis, como sugerido por Rodrigues et al. (2004a). Com base nos agrupamentos em

K=7 e K=9, a raça Solimões, com três acessos, foi dividida de modo que o acesso de Coari

se integrou à raça Pará, e os acessos de Tefé e Fonte Boa se integraram à raça Putumayo,

um pouco diferente da proposta de Sousa et al. (2004) e Rodrigues et al. (2004a), que

sugeriu que até Coari deveria ser parte da raça Putumayo. Também com base nos

agrupamentos em K=7 e K=9, as populações híbridas foram re-designadas às raças mais

próximas, como sugerido por Santos et al. (submetido), com o acesso de Manaus sendo

integrado à raça Pará e os dois acessos de Iquitos integrados à raça Putumayo. Populações

não designadas a raças foram aqui designadas a populações sintéticas, com os acessos de

Plácido de Castro e Puerto Maldonado designados ao “Alto Rio Madeira”, e acessos de

Pucalpa e Contamana designadas ao “Rio Ucayali”, como sugerido por Cristo-Araújo

(2008). Na figura 7 é possível visualizar a re-designação das raças e populações.

Figura 7. Figura 7. Figura 7. Figura 7. Redesignação das raças e populações para consistência dos agrupamentos formados pelo programa Structure.

Na segunda serie de simulações com o programa Structure, com as novas

designações de raças e populações, e sem um acesso da raça Vaupés, os valores de LnP(D)

4.1 Avaliação das raças primitivas e outras populações 52

indicaram ∆K = 4 como o melhor agrupamento, com alguma estrutura em K = 2, 3, 5, 7, 8

e 9 (Figura 2.).

Figura Figura Figura Figura 8888.... Agrupamentos populacionais identificados pelo programa Structure com base em 17 loci microssatélites de pupunha, incluindo a nova designação das raças e populações, e sem o acesso F-0209-83 da raça Vaupés. (∆K com K de 2 a 12, 15 simulações).

Em K=2 ocorre a divisão da raça Pará, população sintética Alto Rio Madeira e var.

chichagui tipo 1 das outras raças e populações, conforme a primeira serie de simulações

com Structure. Esta composição é bastante similar às observações de Rodrigues et al.

(2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008). Contudo, estas simulações ainda apresentaram

inconsistências, exigindo análises mais aprimoradas para explicar estes agrupamentos,

embora permita acreditar que o grupo composto por esta raça e populações seja

suficientemente consistente para aceitar em geral.

Em K=4, o melhor agrupamento segundo o ∆K, a estrutura geral é semelhante a

estudos já realizados (RODRIGUES et al. 2004a; SILVA, 2004; CRISTO-ARAÚJO,

2008), mesmo com algumas inconsistências (Figura 8). A raça Pará, a população sintética

do Alto Rio Madeira e a var. chichagui tipo 1 formaram o mesmo agrupamento como visto

antes. Um segundo conjunto foi formado pelas raças Putumayo, Vaupés, Cauca, Pastaza e

Juruá, todas da Amazônia Ocidental. No terceiro grupo estão a raça Pampa Hermosa, a

população sintética do Rio Ucayali e a var. chichagui tipo 3, todos de uma mesma região

em Peru. A raça Útilis forma o quarto grupo.


FiguraFiguraFiguraFigura 9999.... Probabilidade de associação das 174 plantas em quatro grupos identificados pelo programa Structure (K = 4). As cores representam os grupos e cada planta (linha vertical) é avaliada em termos da probabilidade de compor um determinado grupo, estimado pelo coeficiente de relacionamento (q). O quinto grupo (lado direto) é composto por algumas plantas que o programa não conseguiu determinar um relacionamento firme.

Nos demais valores de K sugeridos nesta série de simulações, a raça Pará, população

sintética Alto Rio Madeira e var. chichagui tipo 1 permaneceram isoladas das demais, assim

como o agrupamento constituído na América Central. Nos valores de K=7, 8 e 9, os

agrupamentos se diferenciam mais de acordo com as raças/localidades. No entanto, embora

surjam agrupamentos mais sólidos, as inconsistências aumentam na mesma proporção,

justificando a baixa saliência mostrada na Figura 7.

Visto que o grupo formado pela raça Pará, a população sintética do Alto Rio

Madeira e a var. B. gasipaes chichagui tipo 1 se divergiram das demais raças e populações

em todas as indicações de agrupamentos mostrados em ∆K, foi feita uma nova simulação

com o programa Structure, como sugerido por Zhang et al. (2009), baseado em K=2. A raça

Pará, as populações sintética do Alto Rio Madeira e a var. chichagui tipo 1 foram retiradas

das novas análises (K de 1 a 9 com 15 simulações), que foram efetuadas a fim de conferir se

a estrutura dos agrupamentos formados corroboram com observações dos estudos

anteriores.

Os resultados gerados apontaram a existência de quatro subpopulações (K=4) para

este conjunto de raças inferidas, com alguma estrutura de grupos em K=3 e 5 (Figura 9).

Em K=4, notamos a separação de Juruá das demais raças e populações da Amazônia

Amazônia Oriental Amazônia Ocidental Norte Amazônia Ocidental Sul América Central


Ocidental. Ocorre um segundo conjunto formado pelas raças Putumayo, Vaupés, var.

chichagui tipo 3, a população sintética do Rio Ucayali e Pastaza. Neste grupo, as

consistências estão entre a var. chichagui tipo 3 e a população sintética do Rio Ucayali, pois

os acessos são da mesma localidade e a associação pode representar introgressão, como

visto por Couvreur et al. (2006). O terceiro grupo apresentou alguns indivíduos das raças

Putumayo, Pampa Hermosa e Cauca. Além das relações já observadas entre Putumayo e

Pampa Hermosa, a raça Cauca é geograficamente próxima a Putumayo, embora no outro

lado dos Ande, o que pode explicar esse conjunto. O quarto grupo é formado pela raça

Utilis da América Central. Em K=3 os agrupamentos se dividem em Amazônia Ocidental

Sul, Amazônia Oriental Norte e América Central; e em K=5 o único agrupamento definido

é o da América Central.

Figura Figura Figura Figura 10101010.... Agrupamentos populacionais estimados pelo programa Structure, incluindo apenas populações e raças da Amazônia Ocidental até América Central. (com K de 1 a 9, com 15 simulações).

Em geral, as simulações com o programa Structure confirmaram as validações de

Rodrigues et al. (2004a) e Silva (2004), bem como a proposta de populações sintéticas de

Cristo-Araújo (2008), todas baseadas em RAPD. As relações observadas para as raças com

pouca representação (Vaupés, Cauca e Pastaza) são consistentes com suas relações

geográficas, sugerindo que essas raças também são válidas, mesmo que não existam

suficientes acessos no BAG Pupunha para testar sua validade com precisão. As relações

entre as populações silvestres (var. chichagui tipos 1 e 3) com as populações cultivadas a seu

redor sugerem a existência de introgressão, como observado por Couvreur et al. (2006) no

Equador. No entanto o programa Structure não conseguiu validar todas as raças da


Amazônia Ocidental, mas isto certamente se deve ao desenho da Coleção Nuclear, em que

Cristo-Araújo (2008) maximizou a variabilidade presente em cada raça primitiva via a

seleção de populações geográfica e geneticamente divergentes. Esse desenho

essencialmente aumenta as chances de detectar fluxo gênico entre populações

geograficamente próximas, mesmo que de raças distintas, o que é especialmente comum na

Amazônia Ocidental. No entanto, este conjunto de simulações com o programa Structure

sugere que as análises posteriores, feitas com base nas raças primitivas e populações

mencionadas, permitirão ver relações genéticas com razoável probabilidade de refletir

relações reais. As raças e populações determinadas pelo programa foram:

• Raças primitivas – Pará, Putumayo, Juruá, Pampa Hermosa, Vaupés, Cauca e Utilis;

• Populações sintéticas – Alto Rio Madeira e Rio Ucayali;

• Populações silvestres – var. chichagui tipo 1 e var. chichagui tipo 3.

4.2. Variabilidade genética dos loci microssatélites

Dos 39 loci microssatélites testados para a seleção de perfis claros e informativos, 35

loci amplificaram produtos de tamanho esperado e quatro não amplificaram. Em 25 loci

foram notados perfis claros, sem a presença de ‘stutter’, quatro loci apresentaram ‘stutter’ e

seis loci tiveram perfis não definidos. Assim, foram selecionados os 17 loci microssatélites

com perfis mais claros e informativos para este estudo (Tabela 1).

Os 17 loci selecionados detectaram 302 alelos dentre as raças e populações

analisadas, com uma média de 17,8 alelos por locús, demonstrando que esses marcadores

são muito informativos para estudos genéticos com pupunheira, como observado por

Martinez et al. (2002), Billotte et al. (2004) e Rodrigues et al. (2004b). O número de alelos

por lócus variou de 12 (Bg44) a 29 (mBg62), o nível de variação nas populações foi alto,

com 67 a 184 alelos por raça e/ou população.

Os alelos foram classificados de acordo com suas freqüências e distribuição entre as

raças e populações (Tabela 3). A maioria dos alelos foi classificada como raros, dos quais

4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites 56

100 alelos são compartilhados as populações e 63 são privados em populações específicas.

A raça Putumayo (n=35) apresentou o maior número de alelos (184) e Vaupés (n=5) o

menor número (67), provavelmente por estar representado por um único acesse (Figura

11). A raça Pampa Hermosa (n=18) apresentou um total de 141 alelos e o maior número

de alelos privados. As raças Vaupés e Cauca, com cinco e oito indivíduos, respectivamente,

apresentaram dois alelos privados cada uma. Utilizando oito marcadores microssatélites,

Rodrigues (2007) encontrou 87 alelos raros, sendo 14 alelos privativos, entre três

populações inermes da raça Pampa Hermosa e a população do mercado da cidade de

Yurimaguas. Cole et al. (2007), com apenas três loci microssatélites, encontraram seis alelos

privativos em quatro populações de pupunheira cultivada por comunidades indígenas e de

camponeses na região de Iquitos, Peru (raça Putumayo).

Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3. Classificação do número de alelos baseados em sua freqüência e distribuição entre as amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (Bactris gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear, mantida no BAG de pupunha do INPA (AM, Brasil).

Comum Intermediário Raro TOTALTOTALTOTALTOTAL

(> 0,2) (> 0,05) (< 0,05) Privado 0 0 63 63636363

Esporádico 0 13 100 113113113113 Difundido 14 85 27 126126126126 TOTALTOTALTOTALTOTAL 14141414 98989898 190190190190 302302302302

Figura 11.Figura 11.Figura 11.Figura 11. Relação entre o número total de alelos e o número de alelos privativos amostrados em 17 loci microssatélites em raças e populações de pupunha silvestre e cultivada.

4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites 57

4.3. Parâmetros genéticos das populações

Em geral estimativas das heterozigosidades observadas (HO) e esperadas (HE)

mostraram-se altas e similares entre todas as raças e populações analisadas, sendo maiores

para Putumayo, Pampa Hermosa e var. chichagui tipo 3 (Tabela 3). O lócus Bg02_19

(0,89) apresentou a maior média de heterozigosidade observada e o lócus Bg44 (0,42) a

menor. Os valores de HO foram inferiores aos valores de HE na maioria dos loci, mesmo

apresentado alguns desvios significativos em um lócus da raça Putumayo e cinco loci da

raça Juruá. Diferenças significativas (p<0,05) de heterozigosidade esperada (HE) em relação

à heterozigosidade observada (HO) foram observadas nos loci Bg10, Bg44, mBg62, Bg02_06

e Bg02_12, indicando deficiência de heterozigotos. Diferenças similares foram observadas

por Rodrigues (2007), Couvreur et al. (2006) e Cole et al. (2007). O lócus Bg02_06 foi

totalmente monomorfico para a raça Vaupés, provavelmente por apresentar apenas cinco

indivíduos nestas análises.

As estimativas da diversidade total (HT) foram altas (Tabela 4), com valores entre

0,82 (Bg10) a 0,95 (mBg62), similares aos obtidos por Rodrigues (2007) com oito loci

microssatélites, Cole et al. (2007) com três, e Couvreur et al. (2006), que utilizaram oito loci

em populações de pupunha cultivadas e silvestres. Estudos com outras palmeiras cultivadas

também detectaram altas diversidades totais com loci microssatélites, como em Cocos

nucifera (oito loci SSR; PERERA et al., 2000), Elaeis guineensis e E. oleifera (21 loci SSR;

BILLOTTE et al., 2001). As estimativas de heterozigosidade em nível de população (HS)

também foram altas, com média de 0,76, apresentando maior valor no lócus mBg62 (0,86).

Os níveis de endogamia estimados pelos índices de fixação de Wright (1965) foram

altamente significativos (p<0,05) na maioria dos loci. O maior valor de endogamia dentro

das raças e populações (FIS) foi detectado pelo lócus Bg44, e não foram significativamente

diferentes de zero para Bg17, mBg57, mBg94 e Bg02_19. Semelhante ao encontrado por

Hernandez et al. (2008), o maior nível de endogamia foi visto na raça Pará (0,28), enquanto

que Juruá e Vaupés não apresentaram endogamia. O coeficiente de endogamia entre as

raças e populações (FST) foi 0,13 e para o total (FIT) foi 0,27, confirmando as observações de

deficiência de heterozigotos nestes loci. Utilizando oito marcadores microssatélites,

Rodrigues (2007) investigou o sistema reprodutivo de três populações de pupunheira da

raça Pampa Hermosa e constatou uma significativa endogamia biparental, fenômeno

4.3 Parâmetros genéticos das populações 58

esperado em pequenas populações sob a influencia de seleção humana, dado a abundância

de parentes numa área pequena (CLEMENT, 1988; COLE et al., 2007).


Tabela 4.Tabela 4.Tabela 4.Tabela 4. Índices de diversidade genética, índices de fixação e diferenciação genética de 17 loci microssatélites em amostras de nove populações de pupunha cultivada (B.gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B.gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil e o conjunto de todas as populações. A – Número de alelos; P – Número de alelos privados; HO – Heterozigosidade observada; HE – Heterozigosidade esperada; HS – Diversidade genética na população; HT- Diversidade genética total; GST – Estimador da diferenciação genética de Nei; RST – Estimador de diferenciação genética (stepwise mutation model); Estimativas das estatística F de Wright: FIS – Coeficiente de endogamia intrapopulacional, FST – Coeficiente de endogamia entre populações e FIT – Coeficiente de endogamia para o conjunto das populações. *HO - significativamente diferente de HE a p<0,05. *FIS – não diferente de zero a p<0,05.

Raça/População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-

09 Bg02-

10 Bg02-

11 Bg02-

12 Bg02-

19 Total

Pará A 9 8 10 6 10 14 11 7 12 9 8 9 8 12 8 9 11 161

(N=34) P - - - - - 1 1 - - 1 1 1 - 1 - 1 2 9

HO 0,56 0,47 0,76 0,27 0,69 0,63 0,32 0,33 0,79 0,81 0,39 0,56 0,47 0,53 0,82 0,44 0,82 0,57

HE 0,78 0,83 0,78 0,69 0,74 0,85 0,89 0,71 0,84 0,83 0,53 0,81 0,80 0,90 0,85 0,74 0,89 0,77

FIS 0,28 0,43 0,03 0,61 0,07 0,26 0,63 0,53 0,05 0,03 0,25 0,31 0,41 0,41 0,03 0,40 0,08 0,28

Putumayo A 8 7 7 8 13 11 16 10 14 8 10 11 13 10 12 11 15 184

(N=35) P 1 1 - - - - 1 - - - 2 2 - - 1 - 2 10

HO 0,62 0,48 0,73 0,50 0,76 0,70 0,76 0,48 0,79 0,76 0,82 0,58 0,80 0,71 0,77 0,76 0,91 0,70

HE 0,80 0,59 0,75 0,80 0,90 0,81 0,91 0,78 0,87 0,84 0,88 0,83 0,92 0,77 0,89 0,88 0,88 0,83

FIS 0,24 0,18 0,02 0,36 0,16 0,13 0,16 0,38 0,10 0,07 0,06 0,31 0,12 0,07 0,14 0,13 -0,04 0,15

Juruá A 4 3 6 6 4 9 7 6 4 3 3 3 4 5 5 3 7 82

(N=10) P 1 1 1 - - - 1 - - - - - - - 1 - - 4

HO 0,60 0,40 0,90 0,60 0,50 1,00 1,00 0,89 0,60 0,60 0,90* 0,40 0,70 0,70 0,70 0,20 0,90 0,68

HE 0,70 0,73 0,71 0,85 0,71 0,86 0,83 0,80 0,57 0,47 0,57* 0,66 0,61 0,79 0,56 0,62 0,83 0,70

FIS 0,08 0,40 -0,30 0,29 0,21 -0,17 -0,22 -0,11 -0,21 -0,30 -0,62 0,31 -0,17 0,08 -0,27 0,66 -0,10 -0,02

var.chichagui 1 A 6 7 6 3 3 10 8 9 8 7 7 6 9 5 5 4 7 110

(N=10) P - 1 - 2 - - 1 - - - - - - - - 1 1 6

HO 0,88 0,30 0,80 0,38 0,30 1,00 0,63 0,90 0,90 0,60 0,70 0,40 0,90 0,56 0,60 0,50 0,90 0,66

HE 0,84 0,85 0,83 0,75 0,36 0,89 0,88 0,89 0,84 0,86 0,79 0,84 0,82 0,77 0,74 0,43 0,83 0,78

FIS -0,04 0,63 0,03 0,46 -0,08 -0,13 0,30 -0,01 -0,13 0,26 0,06 0,53 -0,10 0,22 0,20 -0,17 -0,09 0,13

Alto Madeira A 8 5 9 5 5 9 9 9 5 5 7 7 10 10 6 6 9 124

(N=12) P - - - 1 1 - - - - - - - 1 - - - 1 4

HO 0,92 0,42 0,92 0,36 0,80 0,73 0,36 0,50 0,67 0,54 0,55 0,58 0,83 0,67 0,75 0,70 0,83 0,65

HE 0,82 0,82 0,87 0,74 0,73 0,90 0,90 0,90 0,75 0,81 0,70 0,86 0,91 0,90 0,83 0,82 0,89 0,83

FIS -0,13 0,47 -0,05 0,50 -0,11 0,18 0,60 0,44 0,12 0,34 0,16 0,29 0,07 0,26 0,07 0,11 0,07 0,20

60

Continuação Tabela 4.

População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-

09 Bg02-

10 Bg02-

11 Bg02-

12 Bg02-

19 Total

Pampa Hermosa A 7 4 7 7 8 8 14 8 12 11 7 5 10 6 8 9 10 141

(N=18) P - - - 1 1 - - 1 2 2 - - - 2 2 - 11

HO 0,72 0,67 0,65 0,43 0,83 0,53 0,78 0,72 0,94 0,72 0,71 0,67 0,83 0,82 0,89 0,71 0,89 0,74

HE 0,80 0,65 0,80 0,84 0,83 0,87 0,93 0,86 0,91 0,88 0,79 0,72 0,89 0,78 0,88 0,73 0,89 0,83

FIS 0,08 -0,07 0,18 0,50 -0,02 0,38 0,16 0,17 -0,04 0,17 0,10 0,07 0,06 -0,08 -0,01 0,03 0,00 0,10

Ucayali A 4 7 7 5 7 7 6 6 9 6 7 7 8 5 7 4 9 111

(N=10) P 1 - - - - - - - 2 - - 1 - - - - - 4

HO 0,40 0,80 0,80 0,10 0,80 0,25 0,40 0,90 0,90 0,80 0,63 0,60 0,80 0,50 0,80 0,67 1,00 0,66

HE 0,60 0,79 0,78 0,82 0,87 0,94 0,72 0,78 0,91 0,83 0,84 0,74 0,86 0,63 0,82 0,83 0,90 0,80

FIS 0,27 -0,08 -0,09 0,87 0,03 0,73 0,46 -0,17 -0,02 -0,01 0,22 0,20 0,08 0,21 0,02 0,15 -0,12 0,16

var.chichagui 3 A 5 5 4 6 7 6 5 8 6 6 6 5 10 6 3 4 6 98

(N=07) P - - 1 - 1 - - - 1 - - - - 1 - - 1 5

HO 0,71 1,00 0,67 0,71 0,83 0,83 0,00 0,71 0,86 1,00 1,00 0,71 1,00 0,86 0,50 0,50 1,00 0,76

HE 0,77 0,82 0,80 0,89 0,86 0,86 0,89 0,92 0,68 0,81 0,81 0,81 0,95 0,85 0,44 0,86 0,85 0,82

FIS 0,08 -0,25 0,15 0,16 0,04 -0,04 1,00 0,23 -0,29 -0,25 -0,25 0,06 -0,06 -0,01 -0,15 0,40 -0,20 0,05

Vaupés A 3 4 3 3 3 4 6 6 6 4 3 1 5 3 4 4 5 67

(N=05) P - - - - - - 1 - 1 - - - - - - - - 2

HO 0,40 0,40 1,00 0,60 0,75 0,80 1,00 0,80 1,00 0,40 0,60 MONO 1,00 1,00 0,80 0,40 0,80 0,73

HE 0,76 0,84 0,64 0,82 0,68 0,73 0,84 0,91 0,84 0,78 0,60 MONO 0,80 0,64 0,78 0,76 0,76 0,76

FIS 0,39 0,48 -0,67 0,14 -0,13 -0,10 -0,21 0,11 -0,21 0,41 0,00 NA -0,29 -0,67 -0,03 0,41 -0,07 -0,02

Cauca A 6 4 7 5 7 3 6 2 5 5 4 2 6 4 7 5 6 84

(N=08) P - 1 - - - - - - - - - - - 1 - - 2

HO 0,88 0,86 0,88 0,25 0,86 0,33 0,50 0,38 0,75 1,00 0,63 0,00 0,50 0,63 0,75 0,75 1,00 0,64

HE 0,83 0,66 0,86 0,88 0,91 0,32 0,83 0,43 0,82 0,83 0,65 0,35 0,89 0,77 0,83 0,73 0,87 0,73

FIS -0,05 -0,33 -0,02 0,71 0,03 -0,05 0,40 -0,17 0,05 -0,23 0,04 1,00 0,42 0,17 0,11 -0,14 -0,17 0,09

Útilis A 9 5 7 5 8 7 10 5 9 7 6 5 7 6 8 7 10 121

(N=24) P 1 - - - - 1 3 - - - - - - - - - - 5

HO 0,79 0,50 0,57 0,41 0,79 0,27 0,68 0,52 0,54 0,58 0,52 0,71 0,67 0,42 0,21 0,48 0,74 0,55

HE 0,80 0,66 0,67 0,62 0,79 0,49 0,86 0,64 0,53 0,69 0,70 0,67 0,85 0,69 0,52 0,80 0,84 0,70

FIS 0,01 0,21 0,13 0,31 0,00 0,44 0,20 0,19 -0,04 0,15 0,23 -0,06 0,22 0,37 0,58 0,38 0,11 0,19

61

Continuação Tabela 4.

População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-

09 Bg02-

10 Bg02-

11 Bg02-

12 Bg02-

19 Total

Populações A 16 13 14 12 18 21 29 16 24 16 16 14 19 18 16 16 24 302

(N=173) P 4 4 2 4 3 2 8 1 6 3 3 4 1 2 5 4 7 63

HO 0,68 0,57 0,79 0,42 0,72 0,64 0,58 0,65 0,79 0,71 0,68 0,47 0,77 0,67 0,69 0,56 0,89 0,66

HS 0,75 0,72 0,76 0,76 0,74 0,77 0,86 0,78 0,76 0,76 0,70 0,65 0,84 0,76 0,74 0,72 0,85 0,76

HT 0,82 0,81 0,86 0,84 0,87 0,91 0,95 0,90 0,90 0,88 0,85 0,82 0,92 0,89 0,83 0,88 0,93 0,87

GST 0,08 0,11 0,11 0,09 0,15 0,15 0,10 0,14 0,15 0,13 0,18 0,21 0,09 0,14 0,11 0,18 0,08 0,13

RST 0,18 0,09 0,07 0,12 0,38 0,39 0,15 0,23 0,18 0,09 0,23 0,29 0,21 0,03 0,07 0,12 0,07 0,19

FIS 0,13 0,24 0,01* 0,46 0,06* 0,20 0,32 0,25 0,00* 0,08 0,08 0,25 0,15 0,19 0,10 0,23 0,00* 0,21

FST 0,09 0,13 0,11 0,10 0,16 0,16 0,09 0,15 0,14 0,13 0,18 0,16 0,09 0,15 0,10 0,17 0,07 0,13

FIT 0,21 0,34 0,12 0,51 0,20 0,33 0,39 0,36 0,15 0,19 0,25 0,37 0,22 0,31 0,19 0,36 0,07 0,27

62

A análise de variância molecular estimou a partição da diversidade genética total de

forma hierárquica entre e dentro das raças e populações. Assim como em estudos

anteriores, a AMOVA detectou 87% da variação genética total dentro das raças enquanto

que apenas 13% entre raças. Os índices de estruturação genética calculados [GST (0,13), RST

(0,19) e FST (0,13)] confirmam a estrutura genética mínima entre as raças e populações,

assim como observada por Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008),

que analisaram algumas das raças e populações deste estudo. Outros estudos com

populações de pupunheira cultivada (ADIN et al., 2004; COLE et al., 2006; COUVREUR

et al., 2006; RODRIGUES, 2007) também encontraram estruturação pequena. A pouca

estruturação é curioso considerando que populações da var. chichagui foram incluídas em

nosso estudo, como também nos de Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004), Couvreur et al.

(2006) e Cristo-Araújo (2008), e deve ser devido a fluxo gênico (veja abaixo).

No dendrograma das distâncias entre as raças e populações, estimado com base nos

alelos compartilhados (DAS), criado pelo método Neighbour – Joining (NJ) houve a

formação de dois grupos: um formado pela raça da América Central e a maioria das raças e

populações do oeste da Amazônia, e outro composto pela raça Juruá, B. gasipaes var.

chichagui tipo 1, Alto Madeira e Pará (Figura 12). A estrutura formada é semelhante aos

agrupamentos formados pelo programa Structure, exceto a posição da raça Juruá. A raça

Putumayo apresentou maior similaridade com a raça Cauca, e depois se juntou à raça

Vaupés e Utilis, que também apresentaram maior semelhança entre si. Essas relações

sugerem a probabilidade de fluxo gênico de oeste e noroeste da Amazônia até o litoral

Pacífico de Colômbia e finalmente até América Central. A raça Pampa Hermosa teve maior

proximidade com o agrupamento anterior, seguida da população sintética do Rio Ucayali e

as populações de B. gasipaes var. chichagui tipo 3. A raça Juruá apresentou-se isolada,

porém mostrando alguma proximidade ao grupo seguinte, o que sugere fluxo gênico entre

as cabeceiras dos altos Rio Madeira e Rio Juruá, o que faz sentido geográfico e étnico, pois

os povos indígenas da região viagem continuamente entre essas regiões. A população de B.

gasipaes. var chichagui tipo 1 mostrou-se bem relacionada à raça Pará, que por sua vez se

uniu às do Alto Rio Madeira, conforme observado por Cristo-Araújo (2008).

O dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978), também criado pelo método

NJ, teve estrutura similar ao dendrograma das distâncias de DAS, com algumas modificações

entre as associações (Figura 13). Permaneceu a aproximação entre Putumayo e Cauca,


Vaupés e Utilis, seguida por Pampa Hermosa, a população sintética do Rio Ucayali e, neste

dendrograma, a raça Juruá apresentou-se mais próximo a estas populações, seguida de B.

gasipaes var. chichagui tipo 3. A raça Pará, B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e a população

do Alto Rio Madeira formaram um grupo a parte, sendo que as duas últimas populações

apresentaram maior similaridade entre si. A estrutura deste dendrograma, com a separação

da raça Pará das raças da Amazônia Ocidental, é consistente com as análises anteriores

(ROJAS VARGAS et al., 1999; RODRIGUES et al. 2004; SILVA 2004; CRISTO-

ARAUJO 2008) e com a análise de Structure (seção 4.1 acima).

Putumayo

Cauca

Vaupés

Utilis

Pampa Hermosa

Rio Ucayali

var.chichagui 3

Juruá

var.chichagui 1

Pará

Alto Rio Madeira

0.05

Figura 12.Figura 12.Figura 12.Figura 12. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de alelos compartilhados (Das) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.


Putumayo

Cauca

Vaupés

Utilis

Pampa Hermosa

Rio Ucayali

Juruá

var.chichagui 3

Pará

var.chichagui 1

Alto Rio Madeira

0.1

Figura 13.Figura 13.Figura 13.Figura 13. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de Nei (1978), mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.

O fluxo gênico médio entre este conjunto de plantas foi de 1,20 (Tabela 5), similar

ao encontrado por Hernandez et al. (2008) (Nm=1,25), que analisaram a diversidade e

estrutura genética entre populações silvestres e cultivadas de pupunha. Segundo Wright

(1951), quando Nm ≥ 1,0, o número de migrantes por geração impede a divergência entre

populações, isto pode ser observado pela baixa variação molecular entre estas raças e

populações (AMOVA = 13%), refletindo bem a pouca estruturação entre elas. O fluxo

gênico entre Pampa Hermosa e Putumayo (Nm=17,04) foi alto, semelhante ao encontrado

por Rodrigues et al. (2004), Adin et al. (2004) e Cristo-Araújo (2008). O fluxo gênico entre

Pará e as populações do Alto Rio Madeira explica o posicionamento destas plantas nos

dendrogramas das distâncias de alelos compartilhados (DAS) e Nei (1978), mostrando ainda

um baixo fluxo gênico entre Pará e as raças e populações da Amazônia Ocidental. Ainda é

possível verificar um baixo fluxo gênico entre Juruá e as demais raças e populações,

explicando sua separação na análise com Structure. Entre as populações silvestres e

cultivadas é notado um fluxo gênico moderado, sendo o maior entre as raças Pampa

Hermosa e B. gasipaes var. chichagui tipo 3 (Nm=8,56), confirmando o agrupamento


encontrado nas análises do Structure e sugerindo alguma introgressão, como notado por

Couvreur et al. (2006) no Equador. A diferenciação genética (FST) entre os pares de

populações foi moderada, sendo consistente com os valores dos fluxos gênicos entre as

populações. Entretanto, devido ao baixo número amostral de algumas populações [Vaupés

(n=05); var. chichagui tipo 3 (n=07); Cauca (n=08)], estes resultados podem ser sub ou

superestimados.

O dendrograma dos 38 acessos de pupunha analisado no presente estudo (distância

de Nei (1978), método NJ) evidencia a formação de dois grupos já observados nos

dendrogramas anteriores (Figura 9). O primeiro grupo é formado pelos acessos de Pará,

Alto Madeira e B. gasipaes var. chichagui tipo 1, e o segundo contém o restante dos

acessos, com duas inconsistências da raça Pará e uma de Alto Madeira. Um acesso de Pará

é formado por indivíduos de Solimões (Coari, Amazonas) e encontra-se próximo a dois

acessos de Pampa Hermosa, sendo mais semelhante ao da região de Lorenza, Peru. Esta

proximidade sugere que a redesignação do acesso de Coari para a raça Pará, baseada na

análise com Structure, foi equivocada e o acesso será redesignado como Putumayo em

futuras análises. Outro acesso de Pará é composto por indivíduos de populações híbridas

de Manaus e formou um grupo isolado. A população sintética de Alto Rio Madeira é

formada por acessos de populações não designadas de Puerto Maldonado (Peru) e

apresentou maior similaridade a um acesso de Pampa Hermosa do Rio Paranapura (Peru).

O segundo grupo apresentou algumas aproximações interessantes. Ambos acessos

de Juruá ficaram próximos a uma acesso Rio Ucayali, seguido de dois acessos de B.

gasipaes var. chichagui tipo 3 e depois de outro acesso do Rio Ucayali. Estas relações

mostram o que foi visualizado no dendrograma das raças e populações de Nei (1978)

(Figura 8), onde Juruá se posicionou entre as populações do Rio Ucayali e de B. gasipaes

var. chichagui tipo 3, diferentemente do dendrograma das distancias de DAS, em que Juruá

aparece isolado. Nota-se a inconsistência de um acesso de Pampa Hermosa (Santa Maria,

Peru) próximo a um acesso de Útilis (San Carlos, Costa Rica) e o relacionamento entre os

acessos de Putumayo e Cauca, Vaupés e Útilis, como o visto nos dendrogramas das raças e

populações.


Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Matriz de divergência (FST – diagonal abaixo) e fluxo gênico [M(número absoluto de migrantes) = 2Nm – diagonal acima] entre nove entre nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, com 17 loci microssatélites.

ParáParáParáPará PutumayoPutumayoPutumayoPutumayo JuruáJuruáJuruáJuruá var. var. var. var. chichaguichichaguichichaguichichagui 1111 Alto MadeiraAlto MadeiraAlto MadeiraAlto Madeira Pampa HermosaPampa HermosaPampa HermosaPampa Hermosa UcayaliUcayaliUcayaliUcayali var. var. var. var. chichaguchichaguchichaguchichagui 3i 3i 3i 3 VaupésVaupésVaupésVaupés CaucaCaucaCaucaCauca UtilisUtilisUtilisUtilis

ParáParáParáPará **** 4,43 2,01 5,28 9,42 4,16 3,15 4,79 2,18 2,19 1,97

PutumayoPutumayoPutumayoPutumayo 0,10 **** 2,42 3,38 4,68 17,04 5,37 6,08 4,43 8,45 4,07

JuruáJuruáJuruáJuruá 0,20 0,17 **** 2,12 2,23 2,47 2,08 2,77 1,60 1,61 1,54

var. chichagui 1var. chichagui 1var. chichagui 1var. chichagui 1 0,09 0,13 0,19 **** 7,20 3,77 3,85 3,84 1,79 1,92 1,91

Alto MadeiraAlto MadeiraAlto MadeiraAlto Madeira 0,05 0,10 0,18 0,06 **** 4,20 2,89 4,83 2,14 2,33 2,20

Pampa HermosaPampa HermosaPampa HermosaPampa Hermosa 0,11 0,03 0,17 0,12 0,11 **** 6,32 8,56 4,75 5,82 3,48

UcayaliUcayaliUcayaliUcayali 0,14 0,09 0,19 0,11 0,15 0,07 **** 4,94 2,28 2,61 2,33

var. chichagui 3var. chichagui 3var. chichagui 3var. chichagui 3 0,09 0,08 0,15 0,12 0,09 0,06 0,09 **** 2,56 2,76 3,07

VaupésVaupésVaupésVaupés 0,19 0,10 0,24 0,22 0,19 0,10 0,18 0,16 **** 2,63 2,56

CaucaCaucaCaucaCauca 0,19 0,06 0,24 0,21 0,18 0,08 0,16 0,15 0,16 **** 2,49

UtilisUtilisUtilisUtilis 0,20 0,11 0,25 0,21 0,19 0,13 0,18 0,14 0,16 0,17 ****

67

Jcs1

Jcs2

UcNdcot5

3Silpul3

3Silcot4

UcNdpu4

AMNdpc3

Phrp2

Phph1

PaSolcoa1

Phlor4

PuHibiq3

PuHibiq2

PuSolfb1

Phsm3

UGuasc1

Pubc2

Pusai1

Pupe4

Cabuen1

Cabuen2

Valrv1

UGuasc2

Utsig1

Utgua2

UTucdc1

PuSoltf1

Putab3

PaHibmao1

Paita1

AMNdpc2

1Silrb1

1Silrb2

AMNdpc1

Pabe1

Paprt1

Pagu1

Pasant1

0.2

Figura 14. Figura 14. Figura 14. Figura 14. Dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978) mostrando as relações genéticas de 34 acessos de pupunha cultivada (var. gasipaes) e quatro acessos de pupunha silvestre (var. chichagui tipo 1 e 3) que compõem a Coleção Nuclear, mantidas no BAG de pupunha do INPA (Manaus, Amazonas, Brasil).


AMNdpm2

AMNdpm3

4.4. Relações entre raças e outras populações

As análises apresentadas neste estudo são consistentes com estudos anteriores que

utilizaram estas raças e populações de pupunha com diferentes marcadores moleculares

(RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004; ADIN et al., 2004; HERNANDEZ et al., 2008;

CRISTO-ARAÚJO, 2008).

O relacionamento entre as plantas, observado no programa Structure, e nos

dendrogramas das raças e populações [DAS e Nei (1978)] e dos acessos (Nei, 1978)

evidenciou a separação da raça Pará das demais, tornando esta raça a mais divergente de

todas. Estas mesmas análises revelaram sua associação às populações sintéticas do Alto Rio

Madeira [Plácido de Castro (Acre, BR) e Puerto Maldonado (PE)] e var. chichagui tipo 1

(Rio Branco, Acre), confirmada pelo maior fluxo gênico entre estas populações. A

associação entre Pará e o Alto Rio Madeira é similar ao encontrado por Cristo-Araújo

(2008), assim como os dendrogramas obtidos por Rodrigues et al. (2004a) e Hernandez et

al. (2008), que mostraram uma estreita relação entre Pará e var. chichagui tipo 1 (população

Acre). Mora Urpí (1980) e Rojas Vargas et al. (1999) sugeriram um fluxo gênico da região

do sudoeste da Amazônia (Acre, Rondônia e Bolívia) até a Amazônia Oriental, baseado em

similaridades morfológicas e estudos com isoenzimas, respectivamente, relações vistas aqui

entre os acessos de Pará e var. chichagui tipo 1. Como demonstrado no dendrograma dos

acessos, ambos acessos de var. chichagui tipo 1 posicionaram-se neste grupo, no entanto,

um acesso do Alto Rio Madeira (Puerto Maldonado, Peru) aproximou-se de uma acesso de

Pampa Hermosa.

Acessos da raça Putumayo tiveram um comportamento semelhante nos três

dendrogramas apresentados, exceto o acesso de Tabatinga. Em geral Putumayo apresenta

alguma relação com a raça Pampa Hermosa. A área de ocorrência de Putumayo e Pampa

Hermosa explica a relação, sendo apoiada pelo alto fluxo gênico observada entre estas

raças, que também foi o maior encontrado nestas análises. Também foi observada a

proximidade entre Putumayo e Cauca, o que faz muito sentido geograficamente, apesar da

barreira dos Andes.

Apesar das afinidades encontradas, a raça Pampa Hermosa apresentou-se isolada

nos dendrogramas, sugerindo ser diferente das demais raças possivelmente devido à seleção

contra espinhos, já que esta é uma população com alta freqüência de plantas inermes

4.4 Relações entre raças e outras populações 69

(MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997). Esta diferença é confirmada pela alta

divergência alélica encontrada nestes acessos, assim como o maior número de alelos

privados dentre as demais raças. A baixa taxa de endogamia também ajuda explicar a alta

diversidade da raça.

Como observado em estudos anteriores (RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004;

CRISTO-ARAÚJO, 2008), as populações da América Central não apresentaram estrutura,

confirmando a existência de apenas uma raça, como sugerido por Rodrigues et al. (2004a) e

em contraste com Hernández et al. (2008). Mesmo sendo composto por três raças, este

conjunto apresentou baixa heterozigosidade e polimorfismo. No dendrograma dos acessos

foi notada a inconsistência de um acesso de Guatuso (San Carlos, CR) próximo a um de

Pampa Hermosa (Santa Maria, PE), podendo ser resultado de algum erro no plantio, como

observado em outros estudos no BAG de pupunha. A aproximação de Utilis e Vaupés

requer cautela para propor uma justificativa, uma vez que Vaupés teve pouca

representatividade nestas análises. Assim como pode ser resultado de introgressão, devido à

proximidade geográfica, também pode ser um defeito na composição do plantio, visando o

fato da raça Utilis ter frutos do tipo mesocarpa e Vaupés ser macrocarpa.

Foi verificado nos dendrogramas a aproximação entre a raça da América Central e

as da Amazônia Ocidental, como descrito por Rodrigues et al. (2004a). Apesar de baixo, é

notável o fluxo gênico entres estas raças, sendo maior entre Utilis e Putumayo. Clement

(1986) sugeriu um fluxo gênico histórico ao longo do corredor entre estas áreas. Nesta

hipótese a pupunha primeiramente teria sido domesticada na Amazônia Ocidental para

depois ser introduzida na América Central. As divergências entre estas raças seriam

resultantes de uma deriva genética ao longo das migrações, que também possivelmente

sofreram introgressão de espécies afins já existentes na região, como as relatadas por Mora-

Urpí (1999) na Colômbia, Panamá e Costa Rica.

Nos agrupamentos formados no Structure, primeiramente Juruá mostrou-se bem

relacionado com as raças e populações amazônicas e ocidentais. O comportamento da raça

visualizada nos dendrogramas de populações mostrou inconsistências entre DAS e Nei

(1978), entretanto o dendrograma dos acessos mostra Juruá como uma raça bem

estruturada, confirmado pelo baixo fluxo gênico desta raça com as demais. No entanto,


estes resultados necessitam de uma maior precisão, pois foram utilizados dez amostras da

raça.

As populações do Rio Ucayali mostraram-se próximas a Juruá e var. chichagui tipo 3

nos dendrogramas dos acessos, e o fluxo gênico entre as populações do Rio Ucayali e as

demais raças evidencia um relacionamento genético entre estas populações e raças, sendo

maior entre Putumayo e Pampa Hermosa. Cristo-Araújo (2008) também observou a

associação das populações do Rio Ucayali com as raças ocidentais, destacando que esse

posicionamento é consistente com a proposta de uma origem de pupunha no sudoeste da

Amazônia, como proposta por Rodrigues et al. (2004a).

As populações de B. gasipaes var. chichagui tipo 3 mostraram-se bem relacionadas a

pupunha cultivada da Amazônia Ocidental. Nos agrupamentos formados no Structure, os

acessos de var. chichagui tipo 3 ficaram no mesmo conjunto de Pampa Hermosa, Ucayali e

com alguns indivíduos de Juruá; este relacionamento é bem demonstrado nos

dendrogramas das populações e de acessos, evidenciando bem a proximidade desse

conjunto. Verificando o fluxo gênico também é possível observar o vínculo entre a

população silvestre tipo 3 e as populações cultivadas, sendo o maior fluxo com Pampa

Hermosa e Putumayo, provavelmente facilitado pela geografia das populações, embora

tenha sido um pouco menor com as populações do Rio Ucayali, que apresenta acessos da

mesma região (Pucalpa e Contamana, PE).

As raças cultivadas e populações silvestres (var. chichagui tipo 1 e 3) apresentam-se

bem relacionadas, indicando a existência de introgressão, como observado por Couvreur et

al. (2006) no Equador. A associação entre estes conjuntos de plantas já tinha sido notada

em outras análises [SILVA, 2004; CRISTO-ARAÚJO, 2008; SANTOS et al., (submetido)],

mostrando uma reduzida base genética entre as populações e uma estrutura dentro das

populações, apoiando a hipótese sugerida por Clement et al. (1987) e Rodrigues et al.

(2004a) de uma única origem. Rodrigues et al. (2004a) propôs duas vertentes de migração:

uma com a pupunha sendo levada do sudoeste da Amazônia à Amazônia Oriental; e a

outra com a pupunha sendo levada do sudoeste da Amazônia a América Central, via

Amazônia Ocidental. Esta hipótese é contraria à de Mora Urpí (1999) e Hernández et al.

(2008), que sugerem que a alta diversidade encontrada na pupunha cultivada é resultado de

uma origem polifilética.


5. CONCLUSÃO

• Os 17 loci microssatélites utilizados nestas análises mostraram alto conteúdo

informativo, indicando a qualidade destes marcadores em estudos de diversidade e

estrutura genética em pupunheira;

• Os agrupamentos formados foram consistentes com muitas das análises anteriores,

tornando possível validar as raças Pará, Pampa Hermosa, Utilis e Juruá;

• Os dendrogramas das distancias genéticas das populações e acessos evidenciaram a

formação de dois grupos, sugerindo um processo de dispersão com duas vertentes: do

sudoeste da Amazônia até a Amazônia Oriental e do sudoeste da Amazônia para Amazônia

Ocidental até América Central, com diminuição de variabilidade no extremo norte dessa

dispersão;

• As populações silvestres e cultivadas apresentaram um estreito relacionamento

sugerindo a ocorrência de introgressão.

72

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6. Referências 82

APÊNDICE

Identificação dos acessos de pupunha utilizados neste estudo.

nº UFnº UFnº UFnº UFAMAMAMAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência

J 4 F - 0199-83.1 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 17 F - 0199-83.2 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 18 F - 0199-83.3 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 19 F - 0199-83.5 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 20 F - 0199-83.6 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 7 F - 0200-83.5 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 8 F - 0200-83.7 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 23 F - 0200-83.1 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 26 F - 0200-83.6 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 27 F - 0200-83.8 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) B 8 P - 50.5 Pará Belém (BR)

B 19 P - 50.3 Pará Belém (BR) B 22 P - 50.1 Pará Belém (BR) B 30 P - 50.9 Pará Belém (BR) B 109 P - 50.4 Pará Belém (BR) B 76 F - 109-83.1 Pará Gurupá (BR) B 77 F - 109-83.3 Pará Gurupá (BR) B 78 F - 109-83.7 Pará Gurupá (BR) B 107 F - 109-83.5 Pará Gurupá (BR) B 108 F - 109-83.9 Pará Gurupá (BR) B 46 F - 0096-80.4 Pará Santarém (BR) B 47 F - 0096-80.5 Pará Santarém (BR) B 48 F - 0096-80.7 Pará Santarém (BR) B 49 F - 0096-80.8 Pará Santarém (BR) B 102 F - 0096-80.1 Pará Santarém (BR) B 67 F - 0098-83.2 Pará Parintins (BR) B 69 F - 0098-83.6 Pará Parintins (BR) B 105 F - 0098-83.4 Pará Parintins (BR) B 106 F - 0098-83.7 Pará Parintins (BR) B 97 F - 0096-83.8 Pará Itacoatiara (BR) B 98 F - 0096-83.2 Pará Itacoatiara (BR) B 99 F - 0096-83.9 Pará Itacoatiara (BR) B 103 F - 0096-83.4 Pará Itacoatiara (BR) B 104 F - 0096-83.7 Pará Itacoatiara (BR)

C 2 F - 0005-79.2 Cauca Buenaventura (CO)

Continua

continuação...

nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações ProcedêProcedêProcedêProcedência ncia ncia ncia

C 3 F - 0005-79.5 Cauca Buenaventura (CO) C 4 F - 0005-79.9 Cauca Buenaventura (CO) C 9 F - 0005-79.1 Cauca Buenaventura (CO) C 11 F - 0005-79.8 Cauca Buenaventura (CO) C 1 F - 0004-79.6 Cauca Buenaventura (CO) C 6 F - 0004-79.3 Cauca Buenaventura (CO) C 7 F - 0004-79.7 Cauca Buenaventura (CO)

G 04 L - 3M - 94.4 Guatuso San Carlos (CR) G 14 L - 3M - 94.3 Guatuso San Carlos (CR) G 16 L - 3M - 94.1 Guatuso San Carlos (CR) G 31 L - 3M - 94.2 Guatuso San Carlos (CR) G 32 L - 3M - 94.9 Guatuso San Carlos (CR) G 17 L - 5M - 94.6 Guatuso San Carlos (CR) G 22 L - 5M - 94.3 Guatuso San Carlos (CR) G 36 L - 5M - 94.4 Guatuso San Carlos (CR) G 37 L - 5M - 94.8 Guatuso San Carlos (CR) S 52 F - 0087-83.4 Solimões Coari (BR) S 53 F - 0087-83.6 Solimões Coari (BR) S 54 F - 0087-83.8 Solimões Coari (BR) S 55 F - 0087-83.9 Solimões Coari (BR)

S 131 F - 0087-83.7 Solimões Coari (BR) S 02 F- 0046-79.2 Solimões Tefé (BR) S 13 F- 0046-79.4 Solimões Tefé (BR)

S 125 F- 0046-79.1 Solimões Tefé (BR) S 126 F- 0046-79.3 Solimões Tefé (BR) S 127 F- 0046-79.6 Solimões Tefé (BR) S 69 F - 0066-83.4 Solimões Fonte Boa (BR) S 70 F - 0066-83.8 Solimões Fonte Boa (BR)

S 128 F - 0066-83.1 Solimões Fonte Boa (BR) S 129 F - 0066-83.3 Solimões Fonte Boa (BR) S 130 F - 0066-83.5 Solimões Fonte Boa (BR) D 15 F - 0204- 80.1 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 16 F - 0204- 80.4 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 17 F - 0204- 80.7 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 18 F - 0204- 80.8 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 29 F - 0204- 80.6 Tuíra Cuenca del Canal (PA) U 3 F - 0146-80.7 Utilis San Isidoro del General (CR) U 5 F - 0146-80.9 Utilis San Isidoro del General (CR) U 9 F - 0146-80.5 Utilis San Isidoro del General (CR) U 13 F - 0146-80.4 Utilis San Isidoro del General (CR)

Continua

continuação...

nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência

U 17 F - 0146-80.1 Utilis San Isidoro del General (CR) U-41 F-0209-80.1 Utilis Guapiles (CR) U-42 F-0209-80.4 Utilis Guapiles (CR) U-43 F-0209-80.6 Utilis Guapiles (CR) U-44 F-0209-80.5 Utilis Guapiles (CR) U 59 F-0209-80.2 Utilis Guapiles (CR) P 10 F - 0066-79.3 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 21 F - 0066-79.1 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR)

P 125 F - 0066-79.6 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 126 F - 0066-79.9 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 102 F - 0052-83.1 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 122 F - 0052-83.3 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 123 F - 0052-83.5 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 124 F - 0052-83.7 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 40 F - 0048-78.6 Putumayo Tabatinga (BR) P 41 F - 0048-78.5 Putumayo Tabatinga (BR) P 48 F - 0048-78.4 Putumayo Tabatinga (BR) P 49 F - 0048-78.7 Putumayo Tabatinga (BR) P 34 F - 0140 - 83.8 Putumayo Pebas (PE) P 35 F - 0140 - 83.2 Putumayo Pebas (PE)

P 127 F - 0140 - 83.4 Putumayo Pebas (PE) V-1 F-0211-84.3 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-2 F-0211-84.5 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-3 F-0211-84.7 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-4 F-0211-84.4 Vaupés Rio Vaupés (CO)

V 14 F-0211-84.1 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 8 F - 0209-84.2 Vaupés Rio Vaupés (CO)

V 10 F - 0209-84.3 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 11 F - 0209-84.4 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 12 F - 0209-84.5 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 13 F - 0209-84.7 Vaupés Rio Vaupés (CO) M 44 1 - P.1 População Híbrida Manaus (BR) M 45 1 - P.2 População Híbrida Manaus (BR) M 46 1 - P.6 População Híbrida Manaus (BR) M 47 1 - P.9 População Híbrida Manaus (BR) M 48 1 - P.3 População Híbrida Manaus (BR) I 53 F - 0121-83.2 População Híbrida Iquitos (PE) I 54 F - 0121-83.3 População Híbrida Iquitos (PE) I 55 F - 0121-83.5 População Híbrida Iquitos (PE) I 56 F - 0121-83.7 População Híbrida Iquitos (PE)

Continua

continuação...


I 57 F - 0121-83.9 População Híbrida Iquitos (PE) I 47 F - 0117-83.3 População Híbrida Iquitos (PE) I 49 F - 0117-83.5 População Híbrida Iquitos (PE) I 50 F - 0117-83.7 População Híbrida Iquitos (PE) I 51 F - 0117-83.8 População Híbrida Iquitos (PE) I 52 F - 0117-83.9 População Híbrida Iquitos (PE) Du 8 F - 0208-83.5 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 9 F - 0208-83.8 Raças não designadas Plácido de Castro (BR)

Du 21 F - 0208-83.3 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 22 F - 0208-83.6 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 23 F - 0208-83.1 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 5 F - 0188-83.1 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE)

Du 13 F - 0188-83.5 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 14 F - 0188-83.6 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 15 F - 0188-83.8 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 16 F - 0188-83.4 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 1 F - 0186-83.1 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 2 F - 0186-83.4 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Hb 1 F - 0177-83.3 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 2 F - 0177-83.8 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 8 F - 0177-83.2 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 9 F - 0177-83.4 Raças não designadas Pucalpa (PE)

Hb 10 F - 0177-83.5 Raças não designadas Pucalpa (PE) Du 7 F - 0197-83.7 Raças não designadas Contamana (PE)

Du 17 F - 0197-83.1 Raças não designadas Contamana (PE) Du 18 F - 0197-83.4 Raças não designadas Contamana (PE) Du 19 F - 0197-83.8 Raças não designadas Contamana (PE) Du 20 F - 0197-83.9 Raças não designadas Contamana (PE) E 06 F - 0205-83.1 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 07 F - 0205-83.4 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 08 F - 0205-83.7 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 09 F - 0205-83.9 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 42 F - 0205-83.6 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 10 F-0206-83.1 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 11 F-0206-83.2 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 12 F-0206-83.4 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 13 F-0206-83.8 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 14 F-0206-83.9 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 35 F - 0176-83.1 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 36 F - 0176-83.3 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE)

Continua

continuação...


E 37 F - 0176-83.4 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 38 F - 0176-83.5 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 39 F - 0176-83.7 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 40 F - 0194-83.2 var. chichagui tipo 3 Contamana (PE) E 41 F - 0194-83.6 var. chichagui tipo 3 Contamana (PE) Y 51 F - 0161 - 80.3 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 104 F - 0161 - 80.2 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 105 F - 0161 - 80.5 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 106 F - 0161 - 80.9 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 235 F - 0161 - 80.4 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 54 F - 0168-80.2 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 56 F - 0168-80.4 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 57 F - 0168-80.5 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 236 F - 0168-80.3 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 237 F - 0168-80.8 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 50 F - 0174 - 80.9 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 100 F - 0174 - 80.5 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 101 F - 0174 - 80.6 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 238 F - 0174 - 80.1 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 239 F - 0174 - 80.3 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 241 F - 0195-80.6 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Y 242 F - 0195-80.8 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Y 243 F - 0195-80.9 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Pz 1 F - 0236-84 Pastaza Pastaza

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Relações genéticas entre raças e populações da Coleção ...livros01.livrosgratis.com.br/cp131181.pdf · ApAAppAprovada em 25 de setembro de 2009 rovada em 25 de setembro de