UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM AGRONOMIA TROPICAL
Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites
Vanessa Maciel dos Reis
Manaus 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM AGRONOMIA TROPICAL
Vanessa Maciel dos Reis
Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de
pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites
Orientador: Dr. José Odair Pereira Co-Orientadora: Dra. Doriane Picanço Rodrigues
Manaus 2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical, Universidade Federal do Amazonas, como requisito para obtenção de título de Mestre em Agronomia Tropical, área de concentração em Melhoramento de plantas.
Vanessa Maciel dos Reis
Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear de
pupunha (Bactris gasipaes Kunth) avaliadas com microssatélites
ApApApAprovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009rovada em 25 de setembro de 2009
BANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORABANCA EXAMINADORA Dr. José Odair Pereira
Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Dr. Fábio Medeiros Pereira Universidade Federal do Amazonas – UFAM
Dra. Nelcimar Reis Sousa Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical, Universidade Federal do Amazonas, como requisito para obtenção de título de Mestre em Agronomia Tropical, área de concentração em Melhoramento de plantas.
Ficha Catalográfica
(Catalogação realizada pela Biblioteca Central da UFAM)
R375r
Reis, Vanessa Maciel dos
Relações genéticas entre raças e populações da Coleção Nuclear
de pupunha (Bactris gasipaes kunt) avaliadas com microssatélites /
Vanessa Maciel dos Reis. - Manaus: UFAM, 2009.
87 f.; il. color.
Dissertação (Mestrado em Agronomia Tropical) –– Universidade
Federal do Amazonas, 2009.
Orientador: Prof. Dr. José Odair Pereira
Co-orientadora: Doriane Picanço Rodrigues
1. Bactris gasipaes 2. Diversidade genética 3. Germoplasma
vegetal I. Pereira, José Odair II. Rodrigues, Doriane Picanço III.
Universidade Federal do Amazonas IV. Título
CDU 634.61(043.3)
AGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇOAGRADEÇO À Deus e a Maria Santíssima. Meu Tudo. Minha Mãe.
DEDICODEDICODEDICODEDICO À minha família e ao meu noivo.
Meus amados. Minha base.
OFEREÇOOFEREÇOOFEREÇOOFEREÇO À Ciência e Pesquisa.
AGRADECIMENTOS
À Deus. Meu Pai. Meu Senhor e Salvador. Meu Guia e Consolador.
À Maria Santíssima. Minha Mãe. Meu colo. Minha maior intercessora.
À Dra. Doriane Picanço Rodrigues, em quem eu encontrei mais que uma orientadora. Por seu acolhimento, generosidade, disponibilidade, ensinamentos, confiança, conselhos e pelo grande incentivo no meu desempenho e crescimento profissional, muito obrigada!
Ao Dr. Charles Roland Clement, por toda a colaboração nas discussões deste trabalho. Sempre disponível, prestativo, atencioso, generoso em transmitir seus ensinamentos e por ter contribuído em meu crescimento profissional, muito obrigada!
Ao Dr. José Odair Pereira, por disponibilizar o Laboratório de Bioativos e reagentes para realização de algumas etapas laboratoriais no primeiro projeto de pesquisa.
À Dra. Rosana Medeiros Galvão, pela compreensão, acolhimento e auxílio com reagentes no primeiro projeto de pesquisa.
Ao Dr. Pedro de Queiroz Costa Neto, por seu acolhimento e generosidade em ensinar a técnica AFLP. Obrigada pela amizade.
Ao Dr. José Ferreira da Silva, coordenador da Pós-Graduação, por sua compreensão, me possibilitando a alteração de projeto para conclusão deste curso.
À Dra. Maria Teresa Gomes Lopes pelo convite para entrar neste curso de Mestrado e pelo amadurecimento ganho em minha vida pessoal e profissional.
À Universidade Federal do Amazonas, incluindo professores e funcionários, pelo espaço cedido e todo o necessário para a concretização deste trabalho.
Ao Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia, pela disponibilidade de transporte nas coletas e material de trabalho.
Aos funcionários do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha. Ao Bosco, seu João, Paulo e Damião, pela colaboração na coleta do material no campo.
Ao Laboratório de Tecnologia de DNA, principalmente a Dina e ao Jonson, pelo auxílio nas genotipagens.
Ao Dr. Fábio Medeiros e ao mestrando Alessandro Alves pelo auxílio, disponibilidade e paciência em algumas análises estatísticas. Obrigada!
À Michelly Cristo Araújo, pela disponibilidade e auxílio nas primeiras coletas do material no campo. Pelos arquivos e informações que contribuíram neste estudo.
Aos colegas do Laboratório de Evolução Aplicada: Aldecinei, Alessandro, Andrea, Chelsea, Ederly, Francisca, Laura, Marcicleide e Michelly, pela convivência e momentos de descontração. Principalmente a Andrea Amancio (Dedéa), pela “fácil” amizade, confiança, conversas divertidas e construtoras.
Aos alunos e funcionários do Laboratório de Cultura de Tecidos, pelo espaço cedido e pela compreensão. Ao seu Valdemir, pelo auxílio no preparo de soluções. À Sônia, meu socorro nas soluções e materiais autoclavados.
Aos alunos e funcionários do Laboratório de Genética Animal, pela estrutura física para realização de alguns procedimentos laboratoriais.
Aos meus colegas de curso de Mestrado, por todos os momentos de estudo e descontração.
À Raquel Alencar e Liene Picanço, pela amizade, companheirismo e os muitos momentos divertidos. Conseguimos ultrapassar as dificuldades com coragem e determinação.
Ao meu Grupo de Oração, Maria Auxiliadora, pela compreensão da minha ausência. Pela amizade, torcida e oração de todos.
À minha madrinha Margarida Pereira, por suas orações que ajudaram a sustentar a minha espiritualidade nos muitos momentos de correria deste mestrado.
À Maria de Fátima Leonel pela amizade, carinho e preocupação. Por todos os e-mails atenciosos, que mesmo na “distância” parecíamos tão próximas.
À minha família. À minha Mãe por toda a sua garra, coragem e determinação em fazer de mim a pessoa que sou hoje. Ao meu Pai, por seu carinho, atenção, presença e disponibilidade. Ao meu irmão, pelo exemplo de busca, disponibilidade e pelas gracinhas do dia a dia. AMO VOCÊS.
Ao meu noivo Leandro Magno. Meu grande amigo neste momento. Obrigada pela ajuda na plotagem dos dados, pela companhia, apoio, colo, paciência, atenção, carinho e amor. TE AMO.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Obrigada!
“Tudo o que existe é obra de Tuas mãos. Todas as coisas revelam o Teu poder.
Nós também somos parte da Tua criação. O que nós resta é Te agradecer.”
SUMÁRIO
Lista de Figuras Lista de Tabelas Resumo Abstract 1. Introdução.........................................................................................................................18
2. Referencial Teórico...........................................................................................................20
2.1 Características da Espécie..........................................................................................20
2.2 Utilidades da Pupunheira..........................................................................................21
2.3 Taxonomia................................................................................................................23
2.4 Origem e Distribuição Geográfica............................................................................24
2.5 Domesticação............................................................................................................26
2.6 Raças primitivas e populações híbridas.....................................................................28
2.7 Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha (INPA)...............................................31
Coleção Nuclear........................................................................................................33
2.8 Marcadores Moleculares...........................................................................................35
Marcadores Microssatélites.......................................................................................38
2.9 Diversidade e Estrutura Genética de Populações....................................................39
3. Material e Métodos............................................................................................................46
3.1 Material vegetal e Extração de DNA.........................................................................46
3.2 Amplificação dos loci microssatélites........................................................................48
3.3 Análise genética dos dados........................................................................................49
4. Resultados e Discussão......................................................................................................51
4.1 Avaliação das raças primitivas e outras
populações.................................................................................................................51
4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites.........................................................56
4.3 Parâmetros genéticos das populações.......................................................................58
4.4 Relações entre raças e outras populações.................................................................69
5. Conclusões.........................................................................................................................72
6. Referencias Bibliográficas..................................................................................................73
Apêndice – Identificação dos acessos de pupunha utilizados nas análises genéticas.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Figura 1. Figura 1. Figura 1. Variedades de frutos de uma população de pupunha de Benjamim Constant, Amazonas, Brasil (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).........................................21
Figura 2.Figura 2.Figura 2.Figura 2. Distribuição aproximada dos três tipos de B. gasipaes var. chichagui (HENDERSON, 2000) baseadas em informações organizadas por C. R. Clement e E. Ferreira (CLEMENT et al., 2009a).......................................................................................25
FiguraFiguraFiguraFigura 3.3.3.3. Distribuição geográfica das raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes var. gasipaes) nos Neotrópicos. MICROCARPA: 6. Tembé, 7. Juruá, 8. Pará; MESOCARPA: 1. Rama, 2. Guatuso, 3. Utilis, 4. Tuíra, 5. Cauca, 9. Solimões, 10. Pampa Hermosa, 11. Tigre, 12. Pastaza, 13. Inirida; MACROCARPA: 14. Putumayo, 15. Vaupés (RODRIGUES et al., 2004a; CRISTO-ARAÚJO, 2008).....................................................30
Figura 4.Figura 4.Figura 4.Figura 4. Representatividade do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha, INPA, Manaus, AM, Brasil, em termos de número de acessos por raça e população...................32
Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. Representatividade da Coleção Nuclear de Pupunha, dentro do BAG, em termos de números de acessos por raça e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008)..........................34
Figura 6.Figura 6.Figura 6.Figura 6. Provável validade de grupos populacionais identificados pelo programa STRUCTURE baseada em 17 loci microssatélites de pupunha. (∆K com K de 1 a 15, com 15 simulações para todos os 179 indivíduos analisados).......................................................51
Figura 7. Figura 7. Figura 7. Figura 7. Re-designação das raças e populações para consistência dos agrupamentos formados pelo programa STRUCTURE..............................................................................52
Figura 8.Figura 8.Figura 8.Figura 8. Agrupamentos populacionais identificados pelo programa STRUCTURE com base em 17 loci microssatélites de pupunha, incluindo a nova designação das raças e populações, e sem o acesso F-0209-83 da raça Vaupés. (∆K com K de 2 a 12, 15 simulações).............................................................................................................................53
Figura 9.Figura 9.Figura 9.Figura 9. Probabilidade de associação das 174 plantas em quatro grupos identificados pelo programa STRUCTURE (∆K = 4). As cores presentam os grupos e cada planta (linha vertical) é avaliada em termos da probabilidade de compor um determinado grupo, estimado pelo coeficiente de relacionamento (q) (PRITCHARD et al., 2007). O quinto grupo (lado direto) é composto por algumas plantas que o programa não conseguiu determinar um relacionamento firme....................................................................................54
Figura 10.Figura 10.Figura 10.Figura 10. Agrupamentos populacionais estimados pelo programa STRUCTURE, incluindo apenas populações e raças da Amazônia Ocidental até América Central. (com K de 1 a 9, com 15 simulações).................................................................................................55
Figura 11.Figura 11.Figura 11.Figura 11. Relação entre o número total de alelos e o número de alelos privativos amostrados em 17 loci microssatélites em raças e populações de pupunha silvestre e cultivada..................................................................................................................................57
Figura 12.Figura 12.Figura 12.Figura 12. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de alelos compartilhados (Das) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................64
Figura 13.Figura 13.Figura 13.Figura 13. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de Nei (1978) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................65
Figura 14. Figura 14. Figura 14. Figura 14. Dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978) mostrando as relações genéticas de 34 acessos de pupunha cultivada (var. gasipaes) e quatro acessos de pupunha silvestre (var. chichagui tipo 1 e 3) que compõe a Coleção Nuclear e mantidos no BAG de pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil. ................................................................................................................................................68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1. . . . Acessos de pupunha cultivada e silvestre proveniente do Banco de Germoplasma de Pupunha do INPA, Manaus, AM, Brasil que compõem a Coleção Nuclear. Classe de tamanho do fruto; designação raça ou população; localização geográfica dos acessos: Brasil (BR), Colômbia (CO), Costa Rica (CR), Equador (EC), Panamá (PA) e Peru (PE); número de passaporte dos acessos no banco de dados do INPA ;e número de amostras de cada acesso utilizadas neste estudo.................................................................................................47
Tabela 2. Tabela 2. Tabela 2. Tabela 2. Características dos 17 loci microssatélites selecionados entre 39 testados e seus respectivos autores.... Ta - temperatura de anelamento; pb - número de pares de base.........48
Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3. Classificação do número de alelos baseados em sua freqüência e distribuição entre as amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear, mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.......................................................................................................................................57
Tabela 4. Tabela 4. Tabela 4. Tabela 4. Índices de diversidade genética, índices de fixação e diferenciação genética de 17 loci microssatélites em amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, e o conjunto de todas as populações. A – Número de alelos; P – Número de alelos privados; HO – Heterozigosidade observada; HE – Heterozigosidade esperada; HS – Diversidade genética na população; HT – Diversidade genética total; GST – Estimador da diferenciação genética de Nei; RST – Estimador de diferenciação genética (stepwise mutation model); Estimativas das estatística F de Wright: FIS – Coeficiente de endogamia intrapopulacional, FST – Coeficiente de endogamia entre populações e FIT – Coeficiente de endogamia para o conjunto das populações. *Ho - significativamente diferente de HE a p<0,05. *FIS – não diferente de zero a p<0,05.....................................................................................................................................60
Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Matriz de divergência (FST – diagonal abaixo) e fluxo gênico [M(número absoluto de migrantes) = 2Nm – diagonal acima] entre nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, com 17 loci microssatélites.........................................................................................................................67
RESUMO
A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) é a única palmeira domesticada dos Neotrópicos. Provavelmente foi domesticada inicialmente por sua madeira e posteriormente por seus frutos oleosos e amiláceos. Possui ampla variabilidade fenotípica em suas populações cultivadas, resultado do processo de domesticação ocorrido ao longo de 10.000 anos. As populações cultivadas (var. gasipaes) estão organizadas em raças primitivas que possuem características próprias. Algumas dessas raças já foram caracterizadas morfométrica, química e geneticamente. O INPA (Manaus, Amazonas, Brasil) mantém um Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha com uma parte deste complexo de raças primitivas e populações silvestres, que foram caracterizadas geneticamente com marcadores RAPD. Com o intuito de maximizar a utilização deste BAG, recentemente foi criada uma Coleção Nuclear, que apresenta pelo menos 80% da diversidade genética do BAG. Este trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade e estrutura genética dos acessos que compõem a Coleção Nuclear, além de verificar as relações genéticas entre as raças primitivas e populações silvestres por meio de 17 loci microssatélites desenvolvidos para a pupunha. Inicialmente o programa STRUCTURE foi utilizado para verificar os agrupamentos formados por estas populações. Foram identificados 11 agrupamentos que mostraram-se consistentes às análises genéticas com RAPD e por isso utilizados nas análises posteriores. Os 17 loci microssatélites detectaram 302 alelos com uma média de 17,8 alelos por lócus, evidenciando o alto conteúdo informativo destes marcadores. A média de heterozigosidade observada foi 0,66 e a heterozigosidade total (HT) foi 0,87, similar a estudos anteriores. A AMOVA detectou 87% de variação dentro das populações e 13% entre, confirmada pelos índices de estruturação genética [GST (0,13), RST (0,19) e FST (0,13)]. Os dendrogramas das distâncias de alelos compartilhados (DAS) e Nei (1978) mostraram que as raças estão muito relacionadas, mas com a formação de dois grupos: um formado pela raça Pará, a população sintética do alto Rio Madeira e var. chichagui tipo 1; e outro formado pelas demais raças da Amazônia Ocidental e América Central, bem como a população sintética do Rio Ucayali e var. chichagui tipo 3. O fluxo gênico médio foi 1,24, com o maior fluxo entre as raças Putumayo e Pampa Hermosa (Nm=17,04). O fluxo entre a raça Pará e a população sintética do alto Rio Madeiras justifica a aproximação destas populações no dendrograma; foi observado
ainda um baixo fluxo entre Pará e as raças Ocidentais. Todos os resultados deste estudo apoiam estudos anteriores que validam as raças Pará, Putumayo, Pampa Hermosa, Utilis e Juruá. O conjunto formado pela raça Pará, a população sintética do alto Rio Madeira e var.chichagui tipo 1 sugere dispersão do sudoeste da Amazônia até Amazônia Oriental. O conjunto formado pelas demais raças primitivas, a população sintética do Rio Ucayali e var. chichagui tipo 3 sugere a dispersão do sudoeste da Amazônia para a Amazônia Ocidental até América Central. A associação entre as populações cultivadas e as silvestres tipo 1 e 3 sugere introgressão, como visto em estudos anteriores.
Palavras chave: Bactris gasipaes, caracterização molecular, diversidade genética, relações genéticas.
ABSTRACT
Peach palm (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) is the only domesticated Neotropical palm. It was probably first domesticated for its wood and then for its oily and starchy fruits. Peach palm has extensive phenotypic variability within its wild and cultivated populations, the latter the result of the domestication process that occurred over 10,000 years. The cultivated populations (var. gasipaes) are organized into landraces with distinctive characteristics. Some of these landraces have been characterized morphometrically, chemically and genetically. The INPA (Manaus, Amazonas, Brazil) maintains an Active Germplasm Bank (BAG) of Peach Palm with a sample of these landraces and two wild relatives (var. chichagui) that were genetically characterized with RAPD markers. In order to maximize the use of the BAG, a Core Collection was created recently, which contains at least 80% of the genetic variability of the BAG. The current study aimed to evaluate the genetic diversity and population structure of the accessions that make up the Core Collection, as well as to define the genetic relationships among landraces and wild populations using 17 microsatellite loci developed for peach palm. Initially, the STRUCTURE program was used to identify the groups formed by these populations. We identified 11 groups that were consistent with RAPD genetic analysis and therefore used them in further analysis. The 17 microsatellite loci detected 302 alleles, with an average of 17.8 alleles per locus, demonstrating the high information content of these markers. The average observed heterozygosity was 0.66 and total heterozygosity (HT) was 0.87, similar to previous studies. The AMOVA detected 87% of variation within populations and 13% among populations, which was confirmed by other measures of genetic divergence [GST (0.13), RST (0.19) and FST (0.13)]. The dendrograms of shared alleles distances (DAS) and Nei’s unbiased distance (1978) showed that the races are closely related, but with the formation of two groups: one formed by the Pará landrace, the synthetic population of the upper Madeira River and var. chichagui type 1; and another formed by the other races of Western Amazonia and Central America, the synthetic population of the Rio Ucayali and var. chichagui type 3. The average gene flow was 1.24, with the highest flow between the Putumayo and Pampa Hermosa landraces (Nm = 17.04). The flow between the Pará landrace and the synthetic population of the upper Madeira River justifies their grouping in the dendrogram; low gene flow was observed between the Pará and the western landraces. All results of this study support previous studies that validated the Pará, Putumayo, Pampa Hermosa, Utilis and Juruá landraces. The group formed by the Pará landrace, the synthetic
population of the upper Madeira River and var. chichagui type 1 suggests dispersal from southwestern Amazonia to eastern Amazonia. The group formed by the other landraces, the synthetic population of the Ucayali River and var. chichagui type 3 suggests dispersal from southwestern Amazonia to western Amazonia and then to Central America. The association between wild populations of type 1 and 3 and adjacent cultivated populations suggests introgression, as seen in previous studies.
Key words: Bactris gasipaes, molecular characterization, genetic variability, genetic relationships.
1. INTRODUÇÃO
A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth, Arecaceae) é amplamente distribuída nos
trópicos úmidos americanos e foi um importante cultivo para os primeiros povos desta
região antes da conquista das Américas pelos europeus. O modelo de roça utilizado por
estes povos propiciaram a criação de diferentes tipos de pupunha (CLEMENT, 1987)
apresentando atualmente ampla diversidade genética em suas populações silvestres e
cultivadas em virtude dos diferentes estágios de domesticação. Este processo de
domesticação resultou em um complexo de raças primitivas com características particulares,
sendo que uma parte deste complexo foi caracterizada morfológica (MORA URPÍ, 1984;
MORA URPÍ & CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988; MORA URPÍ, 1992;
CLEMENT, 1995) e geneticamente (RODRIGUES et al., 2004; SILVA, 2004; CRISTO-
ARAÚJO, 2008). É esperado que o estudo dessas raças primitivas contribua para o
entendimento do processo de domesticação das populações cultivadas, como também de
sua origem, que ainda não é bem determinada é vem sendo assunto de especulação com
três hipóteses em discussão: os Andes da Colômbia, o sudoeste da Amazônia e múltiplas
origens, sendo que as duas últimas prevalecem nas discussões atuais.
Estudos de recursos genéticos de pupunha permitiram a identificação de raças
primitivas e populações híbridas modernas, as quais estão parcialmente representadas
no Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Pupunha mantido pelo Instituto Nacional
de Pesquisas da Amazônia. Sendo composto por plantas vivas, o BAG requer altos
custos para sua manutenção e poucos são os recursos financeiros disponíveis para sua
caracterização e avaliação. Desta forma em 2008 foi estabelecida uma Coleção Nuclear
dentro do BAG de pupunha, representando 10% do BAG e 80% de sua diversidade
genética (CRISTO-ARAÚJO, 2008). Esta Coleção auxiliará em estudos de relações
entre raças e populações silvestres, assim como planejar adequadamente programas de
conservação e melhoramento da pupunha.
18
Marcadores moleculares contribuíram para caracterizar as plantas presentes no
BAG de pupunha, validando as raças primitivas e ajudando a decifrar a origem do processo
de domesticação da espécie. Todas as análises que antecederam a constituição da Coleção
Nuclear foram realizadas com marcadores RAPD que apresentam certas limitações, dentre
as quais se ressalta o fato de ser um marcador dominante. Dentre os marcadores
moleculares disponíveis, os marcadores microssatélites se mostraram bastante eficiente em
estudos de relações entre populações silvestres e cultivadas. Hernandez et al., (2008)
utilizaram quatro marcadores microssatélites em análises de diversidade e estrutura genética
entre populações silvestres e cultivadas de pupunha. Com apenas estes quatro marcadores
encontraram uma alta diversidade genética. No mesmo estudo, os autores analisaram as
relações de parentesco entre estas populações e sugeriram uma origem múltipla para a
pupunha cultivada com processos de domesticação independente em pelo menos três
regiões.
O presente estudo teve por finalidade avaliar a diversidade e estrutura genética das
plantas que compõem os acessos da Coleção Nuclear de Pupunha (INPA), validar estudos
genéticos anteriores e verificar as relações genéticas entre estas raças primitivas e
populações silvestres, utilizando 17 locos microssatélites desenvolvidos para Bactris gasipaes
(MARTINEZ et al., 2002; BILLOTTE et al., 2004 e RODRIGUES et al., 2004a).
1. Introdução 19
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Características da espécie
A pupunheira é uma palmeira cespitosa (multicaule) (MORA-URPÍ; WEBER;
CLEMENT, 1997). O tronco pode atingir até 20 m de comprimento, é dividido em nós
(cicatrizes deixadas por folhas) e entrenós com presença de espinhos (CLEMENT, 1987;
MORA-URPÍ et al., 1984), existindo mutações sem espinho. O diâmetro do caule varia de
15 a 30 cm e o comprimento do entrenó de 1 a 30 cm. A parte terminal do estipe apresenta
um broto (meristema ou gema terminal) protegido pelas bainhas de folhas jovens,
constituindo o palmito (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997) e na região do ápice
há uma coroa compostas de 12 a 25 folhas pinadas (CLEMENT, 1986). O sistema
radicular é fasciculado, como em outras monocotiledôneas, estendendo-se até 7 m do
estipe e 2 m de profundidade.
A pupunheira é monóica com flores masculinas e femininas na mesma
inflorescência (MORA-URPÍ & SOLIS, 1980). A inflorescência possui de 50 a 80 cm de
comprimento, 20 a 60 espigas que produzem de 50 a 1000 flores femininas e de 10.000 a
30.000 masculinas, aparecendo entre o 1º ao 3º ano após o plantio em campo (MORA-
URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997)
É predominantemente alógama, embora a autopolinização possa acontecer entre
estipes, quando a pupunheira cresce em touceira. Rodrigues (2007) pesquisou o sistema
reprodutivo de um ensaio de progênies de polinização aberta (provenientes de três
populações da raça Pampa Hermosa) utilizando oito loci microssatélites e constatou altas
taxas de cruzamento para todas as populações, sugerindo um sistema misto de reprodução,
com predominância de fecundação cruzada.
Os frutos são drupas de formatos que variam entre globoso, ovóide ou elipsóide,
com base mais ou menos plana. Uma vez maduro, a coloração do fruto pode ser
alaranjada, vermelho ou amarelo, que pode ter estrias superficiais, pesando entre 10 e 250 g
20
(Figura 1). O sabor e a textura do mesocarpo também apresentam variantes estendendo-se
do oleoso ao amiláceo (YUYAMA et al., 2002), sendo a textura determinada pela
quantidade de compostos do fruto: água, óleo, fibras e amido (CLEMENT, 1986). Os
frutos podem ou não conter sementes, embora o mais comum seja a ocorrência de frutos
férteis (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).
A pupunheira cultivada é amplamente adaptada a uma gama de condições
ecológicas, de 10 a 1200 m anm, sendo mais produtiva em solos relativamente profundos,
férteis e bem drenados, com chuvas abundantes e bem distribuídas (2000-5000 mm/ano) e
temperaturas médias acima de 24o C (CLEMENT, 2008).
Figura 1.Figura 1.Figura 1.Figura 1. Variedades de frutos de uma população de pupunha de Benjamim Constant, Amazonas, Brasil (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997).
2.2 Utilidades da pupunheira
Praticamente tudo pode ser aproveitado desta espécie (CLEMENT, MORA-URPÍ,
1987); no entanto, seu mercado se restringe ao palmito como principal produto de
exploração comercial (CLEMENT, 1987; BOVI, 2000) e ao fruto como principal produto
de consumo local. Os frutos são ricos em propriedades nutritivas, químicas e
organolépticas, e deles podem ser obtidos uma série de derivados (CLEMENT, 2000;
CLEMENT; MORA-URPÍ 1987). Os primeiros povos americanos utilizavam a pupunha
na produção de “chicha”, uma bebida resultante da fermentação do fruto (CAMACHO,
2.2 Utilidades da pupunheira 21
1972; CLEMENT et al., 1987). Alguns autores sugerem a introdução do fruto nas dietas
infantis devido à riqueza nutritiva que este apresenta, principalmente pela presença do
retinol, precursor da vitamina A, nutriente frequentemente deficiente na alimentação
(SALAS & BLANCO, 1990). O preparo de farinha seca aponta um novo mercado para o
produto; no entanto, a relação custo/ benefício ainda não é satisfatória (CLEMENT, 2008).
Outra utilidade do fruto, como também das folhas, é na produção de ração animal, que
pode ser empregado em substituição ao milho e sorgo (MURILLO & ZUMBADO 1990;
MURILLO 1991; MURI-PINEDO et al., 1999).
Do tronco pode ser extraída a celulose e sua madeira também pode ser aproveitada,
pois é de grande resistência e elasticidade. Os ameríndios foram os primeiros povos a
utilizarem sua madeira, principalmente na confecção de instrumentos de pesca, caça e
guerra, assim como nas moradias (CLEMENT, 1987).
Nos últimos anos o palmito da pupunheira vem se consolidando em um mercado
de franca expansão no Brasil com perspectivas de ampliação para o exterior (YUYAMA et
al., 2005). O Brasil é o maior produtor e consumidor do produto, concentrando-se em São
Paulo, o maior mercado mundial (YUYAMA, 2002). A maioria deste produto era
proveniente do extrativismo, sendo as principais espécies exploradas as palmeiras de açaí
(Euterpe oleracea), na região do delta do Rio Amazonas, e a juçara (Euterpe edulis), na
mata Atlântica das regiões Sul e Sudeste. A contínua expansão do mercado consumidor,
acompanhado da exploração predatória do palmito de juçara e açaí, tornou o palmito de
pupunheira uma excelente alternativa para agricultores que buscam novas opções de cultivo
em substituição aos tradicionais (BOVI, 1997).
Certas vantagens são atribuídas ao palmito de pupunheira em relação ao de juçara a
açaí, como rápido crescimento e perfilhamento, maior diâmetro do palmito e vantagem de
não escurecer rapidamente após o corte, possibilitando outras formas de comercialização
do produto (BOVI, 1997; YUYAMA et al., 2002; FERREIRA et al., 1982; MORA-URPÍ
et al., 1997). Além disso, a pupunheira é bem adaptada a muitos ecossistemas brasileiros e
responde muito bem ao manejo (BOVI, 2000).
2.2 Utilidades da pupunheira 22
2.3 Taxonomia
Durante algum tempo a pupunheira era considerada como um cultígeno, uma
espécie cultivada sem parentes silvestres (SCHULTES, 1984). Isto foi devido à confusa
organização taxonômica do gênero Bactris.
Henderson (2000) auxiliou no esclarecimento taxonômico da espécie com uma
revisão do gênero Bactris, que reduzia os 13 nomes historicamente associados à pupunha
em um único nome: Bactris gasipaes Kunth. O autor reuniu todos os nomes atribuídos à
pupunha cultivada na variedade gasipaes e todos os nomes atribuídos à pupunha silvestre
na variedade chichagui (H. Karsten) Henderson. Uma das desvantagens desta revisão é o
fato de que dois grupos de populações silvestres, com distribuição e características
morfológicas e ecológicas distintas, estarem incluídos em uma mesma variedade.
O conceito da B. gasipaes var. chichagui apresentada por Henderson (2000) possui
uma distribuição disjunta. Ao norte, o táxon se distribui ao longo dos dois lados dos Andes
e nos vales interandinos na Colômbia e Venezuela até 1200 m acima do nível do mar
(anm); originalmente incluiu dois táxons – B. macana e B. caribaea (agora sinônimos). No
sul, o táxon é distribuído no sudoeste da Amazônia ao longo dos Andes (até 1000 m anm) e
na hiléia ao sul do rio Solimões e ao oeste da bacia do rio Tapajós; originalmente incluiu
pelo menos os táxons B. ciliata e B. dahlgreniana (agora sinônimos). A distribuição na hiléia
sugere importantes diferenças na adaptação ecológica de B. dahlgreniana comparada com
B. macana no norte, o que sugere uma história de isolamento genético entre as populações
do norte e do sul que provavelmente possui uma duração de diversos milhões de anos. B.
dahlgreniana, a pupunha brava, considerada por Henderson (2000) como sinônimo de
Bactris gasipaes var. chichagui, é um possível progenitor da pupunha no sudoeste da
Amazônia (CLEMENT et al., 1989).
A distribuição de B. dahlgreniana (B. gasipaes var. chichagui) no sudoeste da
Amazônia é extensa, com variação morfológica principalmente na parte reprodutiva. Os
frutos deste táxon, presentes na região de Rio Branco, Acre, são extremamente menores
que os encontrados ao longo do Rio Ucayali (CLEMENT et al., 1989). Três análises
discriminantes entre B. dahlgreniana e pupunha mostraram que estas espécies são
2.3 Taxonomia 23
vegetativamente similares e reprodutivamente distintas, sugerindo que a primeira é
progenitora da segunda (CLEMENT et al., 1989).
2.4 Origem e Distribuição geográfica
A revisão sistemática de Henderson (2000) sugeriu uma nova hipótese filogenética
para a pupunheira, propondo que as populações cultivadas foram originadas a partir da
variedade chichagui. Henderson propôs a existência de pelo menos três tipos de frutos
dentro da variedade chichagui (Figura 2):
• Tipo 1 – com frutos muito pequenos (0,9 a 1,6 cm de comprimento por 0,5 a 1,5
cm de diâmetro), distribuídos desde o centro-leste do Pará até os Andes no Sul da
Amazônia;
• Tipo 2 – com frutos muito pequenos (1,0 a 1,5 cm de comprimento por 1,0 a 1,4
cm de diâmetro) com distribuição ao norte dos Andes, na Colômbia e Venezuela, incluindo
os vales dos Rios Cauca e Magdalena;
• Tipo 3 – com frutos pequenos (1,5 a 2,9 cm de comprimento por 1,4 a 2,8 cm de
diâmetro) com distribuição na Colômbia, Equador, Peru, Bolívia e no Brasil, sendo
encontrado no sul da Amazônia, Acre e Rondônia.
Entretanto, o “Tipo 2” apresenta organização dos poros germinais da semente
diferente dos outros tipos da variedade chichagui e da variedade gasipaes, sugerindo que
este tipo não está envolvido na origem das populações cultivadas (FERREIRA, 1999).
Couvreur et al. (2006) realizaram uma análise morfológica entre as pupunhas cultivadas e
selvagens e, mesmo limitando suas análises a uma pequena escala geográfica, os autores
encontraram o “Tipo 3”, da variedade chichagui, ao longo do Pacífico na planície costeira
do Equador, incluindo o sul e o norte, menos a região mais úmida do Chocó no extremo
noroeste do Equador. As análises constituem uma boa evidência para a introgressão entre
populações silvestres e cultivadas com base no tamanho do fruto.
2.4 Origem e Distribuição geográfica 24
Figura 2.Figura 2.Figura 2.Figura 2. Distribuição aproximada dos três tipos de Bactris gasipaes var. chichagui (HENDERSON, 2000) baseadas em informações organizadas por C. R. Clement e E. Ferreira (CLEMENT et al., 2009a).
A origem da pupunha cultivada ainda não é bem determinada e tem sido assunto de
especulação por mais de um século. Atualmente há três hipóteses em discussão sobre a
origem da pupunha: 1) os Andes da Colômbia; 2) o sudoeste da Amazônia; e 3) múltiplas
origens. As segunda e terceira hipóteses dominam as discussões atuais. A segunda hipótese
sugere uma domesticação da pupunha em algum lugar do sudoeste da Amazônia, próximo
aos Andes Centrais (CLEMENT 1995; HUBER 1904; SEIBERT, 1950), embora Spruce
(1871) sugeriu o norte dos Andes (hipótese 1). A terceira hipótese supõe várias
domesticações da pupunha em diversos locais da variedade chichagui (MORA-URPÍ 1992,
1993). A evidência que permitirá confirmar uma dessas hipóteses deverá incluir a
distribuição da variabilidade morfológica, química e genética dos táxons uma vez atribuídos
a Guilielma, e sua relação com a variabilidade das raças primitivas criadas pelos povos
indígenas da América tropical (CLEMENT, 2001).
A possível origem da pupunha domesticada no sudoeste da Amazônia tem
movimentado uma contínua especulação desde o início do século 20, devido à existência de
pelo menos dois tipos da variedade chichagui e devido à presença de populações de
pupunha cultivada menos modificadas pela domesticação nesta região (CLEMENT et al.,
2009). Evidencias morfo-anatômicas (FERREIRA, 1999) e estudos moleculares dos últimos
2.4 Origem e Distribuição geográfica 25
dez anos (ROJAS-VARGAS et al., 1999; RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004;
CRISTO-ARAÚJO, 2008) fundamentam esta hipótese, apontando para uma área que
corresponde ao norte da Bolívia, o sudeste do Peru e o oeste Brasileiro. Rodrigues et al.
(2004a) avaliaram a estrutura genética e o relacionamento entre populações de pupunha
cultivadas e silvestres, mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Pupunha do
INPA (Manaus, Amazonas, Brasil) utilizando marcadores RAPD. Os autores verificaram
que estas populações estão bem relacionadas, com maior diversidade dentro e menor entre
as populações. Esta caracterização molecular, apoio a hipótese de uma única origem para a
pupunha cultivada com duas vertentes migratórias: uma para o Oriente e outra para o
Ocidente até a América Central.
Mora-Urpí (1999) defende uma origem polifilética, resultante da síntese de
domesticação de várias ecoespécies. Segundo o autor a participação humana no processo
de domesticação originou numerosas morfo-raças primitivas que se encontram distribuídas
nos trópicos úmidos americano. Hernandez et al. (2008) utilizaram quatro marcadores
microssatélites para investigar relações de parentesco entre cinco populações silvestres e
onze cultivadas, obtendo resultados similares ao de Rodrigues et al. (2004a). Entretanto, os
autores asseguram que a formação de três grupos em suas análises indica um processo de
domesticação independente em pelo menos três regiões, sugerindo múltiplas origens para a
pupunha cultivada.
As populações cultivadas encontram-se amplamente distribuídas nos trópicos
úmidos americanos (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997), desde ao norte de
Honduras, ao longo da costa do Oceano Atlântico na América Central e América do Sul,
até São Luís do Maranhão, e ao longo da costa do Oceano Pacífico, abrangendo do sul da
Costa Rica ao norte do Peru (ALMEYDA; MARTIN, 1980). De acordo com Henderson
(2000), as populações cultivadas na Amazônia apresentam maior variabilidade.
2.5 Domesticação
A pupunheira cultivada (Bactris gasipaes Kunth var. gasipaes) é a única palmeira
domesticada nos Neotrópicos (CLEMENT, 1988), embora existam outras palmeiras semi-
domesticadas ou de domesticação incipiente (CLEMENT, 1999). O processo de
2.5 Domesticação 26
domesticação, segundo Harlan (1992) e Clement (1999), é co-evolutivo, onde humanos
selecionam fenótipos de plantas individuais e garantem a propagação destas plantas para
originarem novas (sub) populações.
Clement et al (2009a) citam três possíveis hipóteses sobre as razões da domesticação
da pupunha: a utilização da madeira, frutos ricos em oleosos e frutos ricos em amido.
Provavelmente o interesse pela espécie iniciou-se por sua madeira, pois era preferida para
fabricação de vários instrumentos de caça e pesca, bem como para a construção (PATINÕ,
1989). Populações silvestres frequentemente ocorrem ao longo dos leitos dos rios, onde
também estavam acampamentos de caçadores e coletores. É provável que estes humanos
foram os primeiros a utilizarem sua madeira, no entanto pouco provável que os mesmos
tenham propagado a pupunheira (CLEMENT et al., 2009a). De alguma forma a
intervenção humana contribuiu para a abundância desta espécie, pois a derrubada da árvore
ocasionava uma abertura na mata para o trabalho, o que acentuava a iluminação para estas
plantas, possibilitando o sucesso reprodutivo (CLEMENT et al., 2009a).
Os frutos ricos em óleos significavam verdadeiras fontes de energia. É provável que
os povos consumidores do fruto, os utilizassem especialmente para a produção de um suco
saboroso. O transporte de frutos (sementes) em regiões de própria ocorrência de
populações silvestres poderia ter ocasionado hibridização entre populações diferentes,
resultando em uma variabilidade fenotípica para cor e tamanho do fruto, sendo que este
último seria o aspecto mais importante para a seleção, dando um novo rumo para a
domesticação (CLEMENT et al., 2009a). Sendo o tamanho do fruto, agora, objeto de
seleção, o aumento de teor de amido foi apenas uma consequência direta desta seleção.
Com o aumento da quantidade de amido nestes frutos, novas utilidades foram encontradas.
Os frutos possuíam considerável importância nas regiões do Noroeste da América do Sul e
sul da América Central, antes da conquista européia, pois além de serem consumidos
cozidos, serviam para a produção de uma bebida fermentada, a caissuma, consumida nos
festejos da safra (PATINÕ, 2002). Esta região é a área de ocorrência das raças primitivas do
tipo “macrocarpa” Putumayo e Vaupés, sendo observados nestes frutos os resultados deste
processo de domesticação (CLEMENT et al., 2009a).
Tornando-se a pupunha um cultivo de costume entre estes povos, é possível que
com o tempo tenha alcançado um espaço importante dentro de suas economias. Como já
2.5 Domesticação 27
mencionado, seria comum a troca de sementes entre vizinhos e entre regiões, quando a
ocorrência de migração por estes povos. Desta maneira o comércio, a mobilidade e a
migração foram fatores eminentes na propagação da domesticação desta espécie
(CLEMENT et al., 2009b).
2.6 Raças primitivas e populações híbridas
O processo de domesticação da pupunheira resultou na criação de várias raças
primitivas (variedades crioulas ou landraces) com características morfológicas, químicas e
produtivas próprias (MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997; CLEMENT; AGUIAR;
ARKCOLL, 1998). Para Clement (2001), uma raça primitiva é um conjunto de populações
domesticadas, selecionadas em paisagens cultivadas numa área geográfica restrita, que
possui elevada variabilidade fenotípica e variabilidade genética razoável. Algumas
populações de pupunha são amiláceas ou oleosas, com frutos grandes ou pequenos, com
muita ou pouca fibra, algumas ricas em caroteno, outras não, com ou sem espinhos
(CLEMENT, 2001). Como consequência as raças primitivas são muito variáveis nessas
características, embora existam padrões de diferenças morfométricas e quimiométricas
(CLEMENT; AGUIAR; ARKCOLL, 1998), como também genéticas (RODRIGUES et
al., 2004a).
As raças primitivas foram classificadas de acordo com o tamanho do fruto em
(Figura 3): “Microcarpa”, com frutos pequenos (10-20 g), incluindo as raças Pará e Juruá;
“Mesocarpa”, com frutos intermediários (20-70 g), incluindo as raças Pastaza, Pampa
Hermosa, Solimões, Inirida, Tigre, Utilis, Guatuso, Cauca e Tuíra; e “Macrocarpa”, com
frutos grandes (70-200 g), incluindo as raças Putumayo e Vaupés (CLEMENT & MORA-
URPÍ, 1988). Parte deste conjunto de raças foi parcialmente caracterizada
morfologicamente e mapeada (MORA-URPÍ; CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988;
MORA-URPÍ, 1992; CLEMENT, 1995).
O Brasil apresenta dois representantes do grupo microcarpa: Pará e Juruá. A raça
Pará está distribuída ao longo do Rio Amazonas, sendo portadora de frutos pequenos,
oleosos e fibrosos, apresentando muitos frutos por cacho (CLEMENT, 1987). A raça Juruá
2.6 Raças primitivas e populações híbridas 28
localiza-se ao longo do alto Rio Juruá, possui fruto ovóide, oleoso e fibroso de
aproximadamente 20 g (MORA-URPÍ, 1993; CLEMENT, 1992). Na Bolívia, há
ocorrência da raça Tembé, com frutos de forma ovóide e aproximadamente 12 g (MORA-
URPÍ, 1993).
A Solimões é a única representante de uma raça mesocarpa no Brasil. É distribuída
ao longo do rio Solimões, no estado do Amazonas, e apresenta frutos de 30 a 80 g, com
razoáveis níveis de caroteno e óleo, sendo uma das melhores para o consumo humano.
Utilizando marcadores moleculares RAPD, Rodrigues et al. (2004a) observaram que a raça
Solimões não é geneticamente diferente da raça Putumayo, sugerindo que a área de
ocorrência da raça Solimões seja uma zona de hibridização ou introgressão entre as raças
Pará e Putumayo.
Existem ainda, outras raças mesocarpa na Amazônia. A raça Pampa Hermosa
encontra-se próximo a Yurimaguas, no Peru, e foi primeiramente selecionada pelos índios
devido à qualidade do fruto e a ausência de espinhos no tronco, o que facilita seu manejo.
Grande parte das sementes de pupunha inerme utilizada no agronegócio do palmito é
proveniente desta raça (BOVI, 2000). A raça Pastaza é localizada no sopé dos Andes, no
Equador, e parece ser a raça mais primitiva, pois possui frutos muito pequenos e com
muitos espinhos no estipe. A raça Inirida é distribuída ao longo do Rio Inirida, na
Colômbia, e possui frutos achatados, com baixos níveis de óleo e fibra. A raça Tigre
localiza-se no Rio Tigre, no Peru, ostentando frutos ovóides com cerca de 60 g
(CLEMENT, 1987, 1988; MORA-URPÍ et al., 1993).
Na parte Ocidental, as raças mesocarpas são: Utilis, encontrada no Panamá e Costa
Rica, com frutos de aproximadamente 41 g (FONSECA, 1989); Rama, ocorrendo na
Nicarágua e com frutos de 31 g (MORA-URPÍ, 1993); Tuíra, encontrada no Panamá, na
Província de Darién e na Cuenca del Canal, com frutos de até 36 g (MORERA MONGE,
1981); Guatuso, localizada próximo a San Carlos, Costa Rica, com frutos de peso médio de
37 g e frequentemente sem espinhos (CLEMENT, 1986); e Cauca, encontrada no Valle del
Cauca e Buenaventura, na Colômbia, possuindo frutos de 40 a 50 g (MORA-URPÍ, 1993).
As raças macrocarpa são Putumayo e Vaupés. A raça Putumayo é encontrada ao
longo do alto Rio Solimões (Brasil) e em áreas próximas de Colômbia e Peru; possui frutos
grandes, de aproximadamente 50 a 250 g, ricos em amido e seco, apresentando poucos
2.6 Raças primitivas e populações híbridas 29
frutos por cacho. A raça Vaupés é localizada no alto Rio Negro, no próprio rio Vaupés
(Brasil) e nos seus tributários em território colombiano; seus frutos são grandes, de 60 a 240
g, ricos em amido e seco. Seus frutos se diferem da raça Putumayo devido ao formato mais
achatado, sendo mais largo que comprido. Clement (1987) indica essas raças como as mais
modificadas pelo processo de domesticação.
As raças amazônicas foram identificadas e classificadas com base na caracterização
morfométrica e análise multivariada a partir de uma lista mínima de descritores para uso in
situ e ex situ (MORA-URPÍ; CLEMENT, 1988; CLEMENT, 1988; MORA-URPÍ, 1992;
CLEMENT, 1995). Foi proposta a ocorrência de pelo menos oito raças de pupunheira na
Amazônia e de pelo menos mais cinco raças ao noroeste dos Andes (MORA-URPÍ;
WEBER; CLEMENT, 1997). Clement (2000) defende a existência de mais raças de
pupunheira a serem identificadas e descritas, uma vez que a distribuição de pupunheira é
bem maior que a área com raças descritas.
Figura 3.Figura 3.Figura 3.Figura 3. Distribuição geográfica das raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes var. gasipaes) nos Neotrópicos. MICROCARPA: 6. Tembé, 7. Juruá, 8. Pará; MESOCARPA: 1. Rama, 2. Guatuso, 3. Utilis, 4. Tuíra, 5. Cauca, 9. Solimões, 10. Pampa Hermosa, 11. Tigre, 12. Pastaza, 13. Inirida; MACROCARPA: 14. Putumayo, 15. Vaupés (RODRIGUES et al., 2004a; CRISTO-ARAÚJO, 2008).
2.6 Raças primitivas e populações híbridas 30
Mora-Urpí e Clement (1988) sugeriram a existência de outras variedades de
pupunha provenientes das raças primitivas; tratam-se de populações híbridas, que são
centros modernos que armazenam grande variabilidade genética. Devido à constante
introdução de novos e diferentes alelos, as populações híbridas apresentam um dinamismo
extremamente alto de variabilidade genética (HARLAN, 1971). Existem pelo menos quatro
populações híbridas modernas na Amazônia, todas vinculadas a importantes centros
urbanos: Belém (Pará), Manaus (Amazonas), Iquitos e Yurimaguas (Loreto, Peru) (MORA-
URPÍ & CLEMENT, 1988).
2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA)
Com o intuito de conservar e utilizar a variabilidade genética existente nos recursos
genéticos vegetais, grandes coleções de germoplasma tem sido criada nos últimos anos. No
entanto, este aumento nos números de coleções não foi acompanhado por seu uso,
ocasionando um desequilíbrio entre a disponibilidade do germoplasma e sua real utilidade
(CORDEIRO; ABADIE, 2007). A conservação de recursos genéticos pode ser in situ,
quando estes são preservados em seus locais de ocorrência, ou ex situ, sendo que neste caso
podem ser mantidos indivíduos, sementes, embriões ou outras estruturas vegetais sob
diversas condições, dependendo do material coletado.
Desde 1975, pesquisadores do INPA tem se empenhado na coleção de recursos
genéticos de pupunha, resultando na criação do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de
Pupunha, apoiado e reconhecido pelo Sistema Brasileiro de Recursos Genéticos,
coordenado pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. O BAG é resultado de
várias coletas realizadas em três décadas e está localizado na Estação Experimental de
Fruticultura do INPA, km 38 da Rodovia BR-174, Manaus AM, Brasil (CLEMENT;
YUYAMA; CHAVÉZ-FLORES, 2001). É constituído de plantas vivas e hoje possui 326
acessos de populações cultivadas e silvestres (Figura 4). Foi criado com o intuito de auxiliar
no melhoramento genético da espécie (CLEMENT, 1996; CLEMENT; YUYAMA;
CHAVÉZ-FLORES, 2001), mas tem contribuído pouco para essa finalidade (CLEMENT
et al., 2004).
2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA) 31
Clement et al. (1997) destacam que as primeiras coletas realizadas para o BAG
ocorreram sem metodologia específica, sendo desenhadas para a instalação de um ensaio
agroflorestal. As coletas realizadas para o BAG foram resultado de numerosas prospecções
na área de distribuição da pupunha, entretanto sua representatividade ficou altamente
viciada em torno das principais raças e populações híbridas brasileiras, e da raça Pampa
Hermosa. Assim o BAG não teve uma estrutura adequadamente desenhada, que permitisse
a comparação entre os acessos. Sua estrutura dificulta a seleção massal e exige polinização
controlada.
Sendo composto por plantas vivas, o BAG requer gastos extremamente altos para a
sua manutenção e poucos recursos financeiros são disponíveis para sua caracterização e
avaliação. Holden et al. (1984) alertam sobre a importância da caracterização e avaliação
dos recursos genéticos mantidos nos bancos de germoplasma, para que estes sejam melhor
utilizados. As plantas presentes no BAG, mantido pelo INPA, não foram completamente
caracterizadas (CLEMENT et al., 1993; CLEMENT & CORADIN, 1995), embora exista
uma lista de descritores (CLEMENT, 1986). Por estes e outros problemas, o BAG pouco
tem contribuído para o melhoramento da pupunha (CLEMENT et al., 2004; CLEMENT
et al., 2005; van LEEUWEN et al., 2005), mesmo assim foi fundamental para o
entendimento do seu processo de domesticação (CLEMENT et al., 2001).
Figura 4.Figura 4.Figura 4.Figura 4. Representatividade do Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha, INPA, Manaus, AM, Brasil, em termos de número de acessos por raças e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008).
2.7 Banco de Germoplasma de Pupunha (INPA) 32
Coleção Nuclear de Pupunha (INPA)
A criação de uma Coleção Nuclear (CN) seria a forma mais eficiente para
conservação e utilização do germoplasma disponível no BAG (VILELA-MORALES;
VALOIS; NASS, 1997), por esta razão recentemente foi constituída uma CN dentro do
Banco Ativo de Germoplasma de pupunha do INPA (CRISTO-ARAÚJO, 2008). Uma
coleção nuclear consiste num conjunto de acessos proveniente de um banco de
germoplasma, onde os acessos escolhidos devem representar a variabilidade genética de
todo o banco com o mínimo de redundância (BROWN, 1989; NASS, 1997). A coleção
nuclear visa uma melhor acessibilidade à diversidade genética conservada pelos melhoristas
de plantas (HAMON et al., 1995).
Dentro de uma coleção nuclear, 10% dos acessos deveriam conter pelo menos 70%
da diversidade genética presente na coleção inteira (BROWN & SPILLANE, 1999); na
prática as proporções variam de 5 a 30 % dos acessos e 70 a 90 % da diversidade.
Geralmente as coleções são criadas apoiadas em informações morfo-geográfica, que para
pupunha significa raças primitivas, sendo grande parte destas raças já validadas por análises
genéticas (RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004, CRISTO-ARAÚJO, 2008).
Cristo-Araújo (2008) desenhou uma coleção nuclear dentro do BAG de pupunha
(INPA) com base em três critérios: distribuição geográfica, caracterização genética e
morfológica, pois estes estavam entre os mais utilizados na formação de CN (BROWN;
SPILLANE, 1999; ABADIE et al., 2005). No desenho da coleção, os acessos foram
distribuídos em dois grupos de acordo com o grau de domesticação: silvestres e cultivadas,
sendo as populações cultivadas subdivididas em raças primitivas, populações híbridas e
populações não designadas a raças. Na ausência de caracteres morfométricos, foram
utilizadas as análises genéticas com marcadores RAPD. Não foi possível agrupar todos os
resultados em uma única matriz, devido ao diferente número de bandas geradas em cada
análise, assim os acessos dentro das raças e populações foram selecionados com base na
divergência observada em matrizes de similaridade de Jaccard ou Dice previamente
publicadas (SILVA et al., 2003; RODRIGUES et al., 2004a; SILVA 2004; SANTOS et al
(submetido; CRISTO-ARAÚJO, 2008) e na distancia geográfica de cada raça e população.
Coleção Nuclear de Pupunha (INPA) 33
A coleção nuclear é constituída por 40 acessos que representam 10 % do banco de
germoplasma, composto por 390 acessos na época de sua constituição (Figura 5). Dos 40
acessos, 28 são de raças primitivas, três de populações híbridas, cinco de populações não
designadas e quatro de populações silvestres. Estima-se que pelo menos 80% da
variabilidade genética contida no BAG está amostrada na coleção nuclear (CRISTO-
ARAÚJO, 2008). As raças e populações com baixa representatividade no BAG foram
representadas na coleção nuclear em proporção ao seu número: Juruá (2); Cauca (2);
Guatuso (2); Pastaza (1); Tuira (1); Utilis (2); Vaupés (2); populações não designados (5); e
as populações silvestres tipo 1 e 3 (4). Os acessos de raças e populações bem representadas
foram alocados conforme o logaritmo do seu número: Pará (5); Putumayo (4); Solimões
(3); Pampa Hermosa (4); e populações híbridas (3).
Figura 5. Figura 5. Figura 5. Figura 5. Representatividade da Coleção Nuclear de Pupunha, dentro do BAG, em termos de números de acessos por raça e população (CRISTO-ARAÚJO, 2008).
A coleção nuclear permitirá a caracterização e avaliação dos recursos mantidos, além
de tornar possível o planejamento de programas de conservação e melhoramento
(CRISTO-ARAÚJO, 2008). A coleção também auxiliará no estudo das relações entre raças
e populações silvestres, assim como no estudo da origem da espécie. Cristo-Araújo (2008)
maximizou a variabilidade presente em cada raça primitiva via a seleção de populações
geográfica e geneticamente divergentes. Esse desenho essencialmente aumenta as chances
de detectar fluxo gênico entre populações geograficamente próximas, mesmo que de raças
distintas, o que é especialmente comum na Amazônia Ocidental.
Coleção Nuclear de Pupunha (INPA) 34
2.8 Marcadores Moleculares
Os marcadores utilizados em estudos genéticos para o melhoramento de plantas até
meados da década de 60 eram os marcadores morfológicos. Genes associados a caracteres
morfológicos contribuíam de forma significativa no entendimento teórico de ligações
gênicas e construções dos primeiros mapas genéticos. No entanto, estes marcadores
estavam restritos apenas a um pequeno número de espécies de plantas utilizadas como
sistemas modelos em análises genéticas, limitando seu uso a espécies que apresentavam
considerável importância econômica. Outro fator limitante para estes marcadores é o fato
de que frequentemente são afetados pela ação gênica de dominância, efeito ambiental,
pleiotropia e epistasia, dificultando a caracterização do genótipo. Desta forma o reduzido
número e a natureza dos marcadores morfológicos restringiram os estudos dos caracteres
quantitativos às espécies onde havia sido alcançada uma caracterização genética substancial.
Este quadro modificou-se com o desenvolvimento de marcadores isoenzimáticos,
permitindo ampliar o número de espécies de plantas estudadas com facilidade. Entretanto
este tipo de marcador não permitiu uma avaliação muito precisa dos níveis de diversidade
genética e de estrutura populacional (PRAKASH & LEWONTIN, 1968). Foi apenas com
o advento das novas técnicas de biologia molecular que este quadro ganhou grande
impulso, uma vez que estas possibilitaram a detecção de variabilidade ao nível de DNA,
tornando possível estimar o grau de variação genética, estrutura genética e história evolutiva
das populações.
Marcadores moleculares podem ser definidos por características de DNA que
diferenciam dois ou mais indivíduos e são herdadas geneticamente (MILACH, 1998;
FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Marcadores moleculares cobrem amplamente
todo o genoma do organismo e, ao contrário dos marcadores morfológicos ou fenotípicos,
marcadores moleculares não são afeitados pelo ambiente, podendo ser utilizados em
qualquer estágio de desenvolvimento da planta sem interferir na interpretação dos
resultados.
Atualmente, estão disponíveis várias técnicas moleculares que se diferem entre si
pela habilidade em detectar divergência entre indivíduos, custo, facilidade de uso,
consistência e repetibilidade. Marcadores RFLP (Restriction Fragment Length
2.8 Marcadores Moleculares 35
Polymorphism; BOSTEIN et al., 1980) e VNTR (Variable Number of Tandem Repeats;
JEFFREYS et al., 1985) identificam polimorfismo por hibridação de DNA com sondas
específicas. Já marcadores como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA:
WILLIAMS et al., 1990), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; VOS et al.,
1995) e SSR (Simple Sequence Repeat: LITT & LUTTY, 1989) revelam polimorfismo
através da amplificação de fragmentos a partir da reação em cadeia da polimerase (PCR)
(MULLIS & FALOONA, 1987).
Marcadores moleculares podem ter expressão co-dominante ou dominante. Em
marcadores co-dominante, como os SSR e RFLP, os cromossomos homólogos podem
revelar fragmentos de um mesmo tamanho ou de tamanhos diferentes, ou seja, ambos os
alelos podem ser discriminados e identificados num indivíduo heterozigoto. No caso dos
dominantes, como RAPD e AFLP, alelos de um mesmo loco são revelados pela presença
ou ausência de uma banda, sendo impossível saber se o loco amplificado apresenta-se em
homozigose ou heterozigose (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Marcadores moleculares têm contribuído para caracterizar e validar a existência das
raças primitivas. Sousa et al. (2001) e Clement et al. (2002) utilizaram diferentes técnicas
moleculares para examinar a validade de três raças primitivas de pupunha (Pará, Putumayo
e Solimões) ao longo dos rios Amazonas e Solimões, no Brasil. Ambos estudos sugeriram a
inexistência da raça Solimões, pois as amostras utilizadas foram misturadas em subgrupos
sem ordem aparente e sem relação com as raças propostas (Solimões e Putumayo). As
raças Pará e Putumayo foram validadas, entretanto não foi possível determinar os limites
destas raças no Rio Solimões.
Rodrigues et al. (2004a) utilizaram marcadores RAPD para avaliar a existência
genética de sete raças de pupunha. Sugeriram a existência de uma única raça na América
Central (Utilis, com Guatuso e Tuíra como populações), prevalecendo o nome Utilis.
Também sugeriram a existência de uma única raça ao longo do Rio Solimões, com o nome
Putumayo, pois verificaram que as raças Solimões e Putumayo não se diferem
geneticamente, e a raça Solimões parece ser resultado de uma zona de contato entre as
raças Putumayo e Pará, confirmado pelos altos fluxos gênicos detectados nesta região, e
corroborando com as análises de Sousa et al. (2001) e Clement et al. (2002). Estas análises
ainda validaram a existência da raça Pampa Hermosa e observaram a separação da raça
Pará de todas as demais raças e uma relação significativa entre a distância geográfica e a
2.8 Marcadores Moleculares 36
distância genética. Rodrigues et al. (2004a) verificaram no dendrograma das distâncias de
Nei (1972) a formação de dois grupos: um formado por Pará e outro composto pelas raças
Putumayo, Pampa Hermosa e Utilis. Desta forma a divisão dos Andes não parece ser
apropriada e estas análises sugeriram a hipótese de uma única origem para a pupunha
cultivada no sudoeste da Amazônia, com duas vertentes migratórias: uma para o Oriente e
outra para o Ocidente até a América Central.
Silva (2004) validou as análises de Rodrigues et al. (2004a), além de incluir outros
materiais em suas análises. Verificou o posicionamento da raça Juruá junto às três raças
ocidentais (Pampa Hermosa, Putumayo e Utilis), sugeriu que a similaridade genética entre
estas raças seria resultado de uma origem comum a este conjunto de raças. As outras raças
analisadas (Vaupés, Cauca e Inirida) tiveram pouca representação, não permitindo uma
conclusão mais precisa. No entanto se mostram relacionadas às raças ocidentais, também
indicando uma origem comum.
Três populações ao redor de Yurimaguas (Peru) foram analisadas, sendo observado
que não se diferenciavam da raça Pampa Hermosa (SILVA et al., 2003). Esta conclusão
contrariou as sugestões de Mora-Urpí e Clement (1988), que, baseados na variabilidade
morfométrica da população híbrida de Yurimaguas, consideraram que poderia existir
outras raças naquela região além da raça Pampa Hermosa. Adin et al. (2004) utilizaram
marcadores AFLP para comparar a variabilidade genética entre populações domesticadas
ao longo dos Rios Paranapura e Cuiparillo (Yurimaguas, Peru) e verificaram pouca
divergência genética e alto fluxo gênico, reforçando a hipótese de uma única raça (Pampa
Hermosa) para as populações desta localidade. Rodrigues (2007) validou estas conclusões
ao avaliar a diversidade e estrutura genética da raça Pampa Hermosa por meio de oito loci
microssatélites.
Santos et al. (submetido) estudaram a divergência genética de populações híbridas
presentes no Banco Ativo de Germoplasma de pupunha do INPA e compararam com as
raças primitivas ao redor. Observaram que as populações híbridas de Belém (Pará), Iquitos
(Loreto, Peru) e Yurimaguas (Loreto, Peru) possuem variabilidade genética menos
expressiva que a população híbrida de Manaus, talvez porque Manaus seja o ponto de
encontro de dispersão das raças orientais e ocidentais. Estas análises mostram que a
população de Yurimaguas não é tão divergente como anteriormente descrita e, ao contrário
2.8 Marcadores Moleculares 37
do imaginado, indicam que as raças primitivas possuem maior variabilidade genética que
populações híbridas.
Marcadores RAPD foram utilizados em todas as caracterizações genéticas do BAG
de pupunha que antecederam a CN. A técnica RAPD é simples, de fácil acesso, necessita
de pequena quantidade de DNA, requer baixo custo operacional e de implementação e
permite alto número de marcadores. Todavia também apresentam limitações: é um
marcador dominante, apresenta baixo conteúdo informativo por loci, possui elevada
sensibilidade e baixa reprodutibilidade (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Dentre
estas limitações, destaca-se o fato de ser um marcador dominante, pois como não são
capazes de distinguir a natureza do alelo (homozigoto e heterozigoto), as estimativas de
heterozigosidade são superestimadas, por serem calculadas a partir do alelo nulo (WEIR,
1996). Isto é importante por que um dos fatores primordiais na confecção da CN foi a
divergência genética entre os acessos, obtidos pelas análises conjuntas dos dendrogramas
gerados em todas as análises genéticas do BAG. Rodrigues (2001) observou nos
dendrogramas de similaridade de Jaccard a presença de 10% dos indivíduos analisados
estarem em grupos mal resolvidos, atribuindo este fato a possíveis erros no plantio, na
coleta ou mesmo a erros nos procedimentos laboratoriais. Contudo, as mesmas
inconsistências foram observadas por Santos et al., (2001) e outras por Silva (2004),
demonstrando imperfeições nas instalações do BAG, e logo também presentes na CN.
Marcadores Microssatélites
Dentre os marcadores moleculares disponíveis, os microssatélites ou Seqüências
Simples Repetidas (SSR) constituem uma ferramenta ideal para análise de parentesco,
análise forense, fluxo gênico, mapeamento, sistemas de cruzamento e estudos sobre os
padrões e níveis de organização da variabilidade genética (FERREIRA &
GRATTAPAGLIA, 1998), tanto por seu caráter informativo como por sua facilidade de
identificação (CONDIT & HUBBELL, 1991; MORGANTE & OLIVIERI, 1993). Estes
marcadores consistem de pequenas sequências repetidas de DNA em tandem compostas
de um a seis nucleotídeos, encontradas com frequência e amplamente distribuídas no
genoma dos eucariotos (LITT & LUTY, 1989; FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Marcadores Microssatélites 38
Microssatélites podem ser classificados de acordo com o tipo de repetição da sequência em:
perfeitos, quando a sequência não contém interrupções; imperfeitos, quando ocorre uma
base entre as sequências repetidas; interrompidos, quando há uma sequência diferente
dentro da sequência repetida; e compostos, quando a sequência do microssatélite apresenta
duas repetições diferentes e adjacentes.
Os loci microssatélites possuem expressão co-dominante, ou seja, num indivíduo
heterozigoto ambos os alelos são visualizados. São altamente multi-alélicos devido à alta
taxa de mutação existente, apresentando elevado conteúdo informativo por loco. Seu
polimorfismo pode ser estudado via PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando-se um
par de iniciadores (“primers”) específicos que flanqueiam a região do DNA contendo as
unidades repetidas (WEBER & MAY, 1989). Podem ainda ser automatizáveis em sistema
multiplex, que permite avaliar de forma rápida um grande número de indivíduos para um
grande numero de loci em pouco tempo.
Palmeiras como Cocos nucifera (RIVERA et al., 1999), Euterpe edulis (GAIOTT et
al., 2001), Elais guineensis (BILLOTTE et al., 2001) e Bactris gasipaes (MARTÍNEZ et al.,
2002; BILLOTTE et al., 2004; RODRIGUES et al., 2004b), já apresentam microssatélites
desenvolvidos e demonstraram que estes marcadores são altamente multi-alélicos e
informativos para estudos de estrutura genética de populações, estimando com precisão
heterozigosidade, distância genética, relações de parentesco e fluxo gênico. Para
pupunheira, atualmente existem 46 loci microssatélites (MARTÍNEZ et al., 2002;
BILLOTTE et al., 2004; RODRIGUES et al., 2004b) mostrando-se eficientes em estudos
de diversidade e estrutura genética entre populações silvestres e cultivadas (COUVREUR et
al., 2005; COLE et al., 2006; HERNANDEZ, 2005; RODRIGUES, 2007).
2.9 Diversidade e Estrutura Genética de Populações
As populações adquirem continuamente diversidade genética por meio de mutação,
recombinação e fluxo gênico, e essa diversidade pode ser perdida por deriva genética,
endocruzamento e pela maior parte dos tipos de seleção natural (NEI, 1978). Estes fatores
responsáveis pela variabilidade genética nas populações são fundamentais para o processo
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 39
evolutivo uma vez que as adaptações de cada espécie que ocorre ao longo das gerações
estão ligadas a existência da variabilidade sobre a qual a seleção natural possa atuar
(BRAMMER, 1993).
A genética de populações tornou-se uma importante ferramenta por descrever a
variação genética em populações e estudar mecanismos de manutenção desta variabilidade
(NEI, 1978). Estudos de variabilidade genética de populações de uma determinada espécie
envolvem duas questões: a quantificação dos níveis de variabilidade dentro das populações
e a caracterização dos níveis de estruturação genética entre populações (HAMRICK, 1982).
O estudo destes fatores tem contribuído para o entendimento dos processos
microevolutivos dentro de populações de plantas nativas, uma vez que auxiliam as
estratégias de domesticação, manejo e conservação dessas espécies (CARTHEW, 1993).
No entanto, em espécies com populações domesticadas, as forças evolutivas contam com a
influência da seleção humana, deriva devido ao tamanho do plantio, eventos migratórios
mediados por humano, que ainda prezam em conservar mutações curiosas ou
interessantes.
Os parâmetros genéticos mais utilizados para quantificar a variabilidade genética em
populações de plantas são o número de alelos por loco (A), a heterozigosidade esperada
(HE), prevista segundo o Equilíbrio de Hardy-Weinbeg, heterozigosidade observada (HO),
porcentagem de loci polimórficos (P) e índice de fixação (f) (HAMRICK, 1983). Conte
(2004) cita o número de alelos por lócus e a porcentagem de loci polimórficos como os
índices de diversidade mais utilizados em estudos de populações naturais, por caracterizar e
comparar os níveis de variação genética nestas populações. A frequência de heterozigotos,
para Weir (1996) e Nei (1973), se faz um importante indicador de variabilidade pelo fato
de cada heterozigoto ser composto de dois alelos diferentes, representando melhor a
variação existente em populações de espécies autógamas e alógamas.
Estrutura genética pode ser definida como a distribuição não aleatória de alelos e
genótipos dentro da espécie (HAMRICK, 1982) ou, simplesmente, a forma como a
variabilidade genética está distribuída dentro e entre populações. Na caracterização da
estrutura genética de populações, três metodologias têm sido amplamente usadas: as
estatísticas F (WRIGHT, 1965; NEI 1977); a análise da diversidade gênica em populações
subdivididas (NEI, 1973, 1977, 1987); e a análise de variância das freqüências gênicas
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 40
(Cockerham, 1969; Weir, 1996). Adotando as estatísticas F de Wright é possível
caracterizar a distribuição da variabilidade genética entre as populações (FST), assim como o
valor médio de endogamia em nível de população (FIS) e total (FIT) (WRIGHT, 1965). A
análise da diversidade genética em populações subdivididas torna possível a comparação
dos níveis de heterozigosidade entre e dentro das populações, assim como a obtenção de
estimativas de divergências (GST) a partir de uma base diferente da que se fundamentam as
estimativas FST e θ (NEI, 1977). Nei (1978) destaca a importância das estimativas das
frequências gênicas de uma população em estudos evolutivos, porque mudanças genéticas
de uma população podem ser avaliadas através das alterações nas frequências alélicas. A
análise das frequências gênicas proposta por Cockerham (1969) parte do pressuposto de
que as populações são originadas de uma população ancestral, permitindo assim a
estimativa de coeficientes de parentesco (coancestralidade) e endogamia. Outra
pressuposição é a de que a deriva genética e o sistema reprodutivo são responsáveis pelos
desvios de panmixia. Desta forma, igualmente as estatísticas F, a análise das frequências
gênicas fornece informações sobre os níveis de fixação de alelos dentro das populações (f) e
totais das populações (F), assim como a divergência genética entre populações ou o
coeficiente de parentesco entre indivíduos dentro da população (θp). As três metodologias
possuem bases genéticas similares, sendo complementares em relação ao significado
biológico das estimativas obtidas, principalmente se os marcadores forem neutros, a
amostragem aleatória e as populações forem originadas de uma única população ancestral
(Reis, 1966).
Desde o advento da técnica de PCR, marcadores microssatélites têm sido
amplamente utilizados em estudos genéticos. Entender o modelo de mutação destes
marcadores era fundamental para o desenvolvimento de estatísticas que refletissem a
estrutura genética pelos microssatélites. Kimura & Crow (1964) desenvolveram o modelo
de alelos infinitos (IAM), onde cada mutação cria um novo alelo a uma determinada taxa.
Este modelo não permite homoplasia e possuem baixas taxas de mutação, o que não
condizia com dados microssatélites. Mais adiante, Kimura & Otha (1978) criaram SMM
(“stepwise mutation model” – modelo passos de mutação), onde a mutação para um novo
alelo de um determinado marcador microssatélite ocorre em passos. Assim alelos com
tamanhos mais próximos são considerados mais similares do que alelos com tamanhos
mais distantes (BALLOUX; LUGON; MOULIN, 2002). Desta forma, foi criada a
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 41
estatística RST (SLATKIN, 1995), que admite o modelo SMM, sendo desenvolvida
especificamente para dados microssatélites.
Outra estimativa importante em estudos de estruturas populacionais é o fluxo
gênico, que pode ser definido como todos os mecanismos que resultam no movimento de
alelos de uma população para outra (SLATKIN, 1981, 1985). O fluxo ou a dispersão de
pólen e sementes entre populações reduz a diferenciação genética entre elas, sendo um dos
mecanismos responsáveis pela introdução de novas variações genéticas na população
receptora (WRIGHT, 1931). As estimativas de fluxo gênico podem ser medidas em termos
do número equivalente de migrantes que se move de uma população para outra
(SILVERTOWN & DOUST, 1993). Adin et al. (2004) utilizaram marcadores AFLP para
investigar o fluxo gênico entre populações de pupunha nas comunidades indígenas e
tradicionais ao longo dos Rios Paranapura e Curiparillo, perto de Yurimaguas, Peru,
encontrando um alto fluxo entres estas populações, ao ponto de não ser possível diferenciá-
las, evidenciando que o fluxo gênico influência não só na estrutura genética como também
nos próprios limites das populações.
Um quesito fundamental em qualquer inferência sobre estrutura de população é a
definição das próprias populações. A determinação da população é normalmente baseada
na origem geográfica dos indivíduos e fenótipos. Entretanto a estrutura genética das
populações nem sempre é refletida na proximidade geográfica dos indivíduos. Populações
não delimitadas geograficamente podem ser geneticamente estruturadas, devido às barreiras
não identificadas para o fluxo gênico. Além disso, grupos com diferentes localizações
geográficas, fenótipo ou padrões de comportamento, não são geneticamente diferenciados.
Pritchard et al. (2000) desenvolveram um método (software Structure) para delinear
agrupamentos de indivíduos (K) com base em seus genótipos em locos múltiplos usando
uma abordagem bayesiana. O método assume o equilíbrio de Hardy-Weinberg e a ligação
dentro das populações, a fim de encontrar um número de grupos que melhor se ajuste aos
dados. A vantagem deste método é que as populações não precisam ser definidas à priori,
sendo identificadas pelos dados gerados com marcadores moleculares. De acordo com
Evanno et al. (2005), o software Structure não é tão eficiente para detectar o verdadeiro
número de agrupamentos (K) em amostras de indivíduos cujo padrão de dispersão entre as
populações não é homogêneo, como ocorre no modelo de ilhas. Em populações cujas
migrações são baseadas em outros modelos, em que as taxas de migração variam entre
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 42
subpopulações ou que exista algum tipo de hierarquia, são obtidos resultados mais reais de
agrupamentos quando se utiliza a fórmula de ∆K:
∆K = m|L′′(K)|/s[L(K)]
Onde:
L′′(K) = primeira ordem de mudanças das estimativas [L′(K + 1) – L′(K)];
L′(K) = segunda ordem de mudanças das estimativas [L(K) – L(K – 1)];
m = média
s = desvio padrão.
Zhang et al. (2009) analisaram a estrutura genética e a diferenciação intra-específica
de 3.024 acessos de uma coleção nuclear de arroz na China por meio de 36 loci
microssatélites. Os autores utilizaram o software Structure, com ∆K proposto por Evanno
et al. (2005), para delimitar populações de arroz de acordo com o seu ecotipo. Em uma
primeira simulação com 3.024 acessos, os gráficos gerados mostraram alguma evidencia de
grupos em K=2, indicando duas populações divergentes; no entanto, também observaram
algum agrupamento em K=6. Devido à divergência observada entre as duas populações,
fizeram uma segunda simulação com os dois grupos de forma independente e notaram a
existência de três subpopulações em cada uma das duas populações inferidas, confirmando
o agrupamento encontrado em K=6 na primeira simulação. Estes agrupamentos foram
consistentes com as análises da estrutura da população, que mostraram duas subespécies
distintas, cada uma com três ecotipos. O programa Structure está se tornando uma
ferramenta poderosa em análise de genética de populações e será usado nesta dissertação
para avaliar as populações e raças de pupunha com metodologia diferente de Rodrigues et
al. (2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008).
O modelo de agrupamento desenvolvido por Pritchard et al. (2000) também
contribuí nas análises de Silveira e colaboradores (2009) que analisaram a variabilidade
genética de 180 indivíduos de caroá (Neoglaziovia variegata) por meio de marcadores
RAPD. Neste estudo os autores consideraram o modelo de informação à priori da
população para definição dos grupos e freqüências alélicas independentes. Os resultados
gerados permitiram identificar os grupos já existentes e relações de parentescos entre os
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 43
indivíduos avaliados, mostrando que dos 180 indivíduos, 63 apresentavam ancestral em
outras populações.
Sigrist (2009) caracterizaram a divergência genética entre acessos brasileiros de
cúrcuma (Curcuma longa L.), bem como compararam com materiais oriundos de outros
países, por meio de 19 loci microssatélites. O autor utilizou o programa Structure para
verificar os números possíveis de agrupamentos (K), de acordo com o ∆K de Evanno et al.
(2005) e sem informações hierárquicas à priori. As análises indicaram a formação de três
grupos (K=3) como o melhor número de agrupamentos, mas também mostraram alguma
evidencia em K=6. A observação dos três grupos mostra que dos 50 acessos brasileiros
analisados, 84% estiveram presentes em um mesmo grupo, outro grupo foi composto por
acessos de Porto Rico e por uma parte dos acessos brasileiros e um terceiro grupo foi
formado por acessos indianos e brasileiros. Entretanto os agrupamentos formados nos
dendrogramas mostraram a formação de cinco grupos, dois a mais que os evidenciados
pelo programa Structure, pois discriminou 84% dos acessos brasileiros em um único grupo,
isolou os acessos de Porto Rico, Índia e separou os acessos brasileiros unidos aos de Porto
Rico e os acessos brasileiros unidos aos da Índia, no programa Structure.
As estimativas de similaridade ou distâncias genéticas normalmente são
proporcionais ao tempo de divergência dos genótipos em relação a um ancestral comum
(Weir, 1996). Segundo Milach (1998) estes estimadores podem ser divididos em dois
grandes grupos: a) as distâncias geométricas: destacando-se as distâncias de Roger
modificado; o índice de similaridade de Nei & Li (1979); assim como as estimativas de
distancias de D de Barbosa Neto et al. (1997), as quais variam de zero a um, facilitando a
interpretação dos resultados; b) as distâncias que requerem pressuposições genéticas, sendo
que a mais empregada é a distancia de Nei (1978) que mensura as proporções de genes
iguais entre e dentro de populações e é diretamente proporcional ao tempo de divergência
das duas populações sob comparação.
Segundo Cruz (1990), os métodos de agrupamentos têm por finalidade separar um
grupo original de observações em vários subgrupos, de forma a existir homogeneidade
entre eles. A técnica depende, sobretudo, das medidas de distâncias ou similaridades,
estimadas previamente. Os métodos aglomerativos mais utilizados são os de otimização,
que dividem os genótipos em subgrupos não vazios e mutuamente exclusivos; e os
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 44
hierárquicos, onde os genótipos são agrupados por um processo repetido em vários níveis,
até o ajustamento de um dendrograma ou diagrama de árvore (CRUZ & REGAZZI, 1994).
Um dos métodos de grupamento utilizados na construção de dendrograma é o Neighbor
Joining, em que agrupa sequencialmente os pares de sequência mais intimamente
relacionados. O método reconstrói arvores filogenéticas a partir dos dados da distância
evolutiva e seu princípio é encontrar pares de unidades taxonômicas operacionais (OTUs
[= vizinhos]) que minimizam o comprimento total dos ramos, em cada fase do agrupamento
de OTUs começando com uma árvore starlike. (SAITOU & NEI, 1987).
2.9Diversidade e Estrutura genética de Populações 45
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal e Extração de DNA
Amostras de 36 acessos (3 a 5 plantas por acesso) de pupunha cultivada (B. gasipaes
var. gasipaes) e 4 acessos (2 a 5 plantas por acesso) de pupunha silvestres (B. gasipaes var.
chichagui) pertencentes à Coleção Nuclear, foram coletadas do Banco Ativo de
Germoplasma de Pupunha, localizado na BR 174, Km 38, Manaus, Amazonas, Brasil
(Tabela 1). A identificação exata das plantas está no Apêndice.
A fim de esclarecer algumas designações utilizadas neste trabalho, definimos:
ACESSO ACESSO ACESSO ACESSO – Representa uma progênie obtida de um único cacho de uma matriz no campo;
POPULAÇÃOPOPULAÇÃOPOPULAÇÃOPOPULAÇÃO – Conjunto de indivíduos que ocorre em uma região geográfica restrita,
onde pode haver fluxo de pólen ou sementes;
RAÇARAÇARAÇARAÇA – Conjunto de populações com origem genética similar e diferente de outras raças,
mesmo havendo fluxo gênico entre elas (raças).
A extração do DNA genômico foi realizada com o reagente CTAB 2% (DOYLE &
DOYLE, 1987) com modificações. O DNA foi quantificado em gel de agarose 1% corado
com GELRED (UNISCIENSE), por comparação com marcadores de massa molecular
conhecida (DNA de fago lambda a 50, 100 e 200 ng/µl).
46
TabelaTabelaTabelaTabela 1111.... Acessos de pupunha cultivada e silvestre proveniente do Banco de Germoplasma de pupunha do INPA, Manaus, AM, Brasil que compõem a Coleção Nuclear. Classe de tamanho do fruto; designação raça ou população; localização geográfica dos acessos: Brasil (BR), Colômbia (CO), Costa Rica (CR), Equador (EC), Panamá (PA) e Peru (PE); número de passaporte dos acessos no banco de dados do INPA e número de amostras de cada acesso utilizadas neste estudo.
ClasseClasseClasseClasse Raças/OutrasRaças/OutrasRaças/OutrasRaças/Outras Representação GeográficaRepresentação GeográficaRepresentação GeográficaRepresentação Geográfica Nº identificaçãoNº identificaçãoNº identificaçãoNº identificação Nº amostrasNº amostrasNº amostrasNº amostras MacrocarpaMacrocarpaMacrocarpaMacrocarpa Juruá Cruzeiro do Sul (BR)
Cruzeiro do Sul (BR) F - 0199-83 F - 0200-83
5 5
Pará Belém (BR) P - 50 5 Gurupá (BR) F - 0109-83 5 Santarém (BR) F - 0096-80 5 Parintins (BR) F - 0098-83 4 Itacoatiara (BR) F - 0096-83 5
MesocarpaMesocarpaMesocarpaMesocarpa Cauca Buenaventura (CO) Buenaventura (CO)
F - 0005-79 F - 0004-79
5 3
Guatuso 1 San Carlos (CR) San Carlos (CR)
L - 3M - 94 L - 5M - 94
4 5
Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) F - 0161-80 5 Rio Paranapura (PE) F - 0168-80 5 Santa Maria (PE) F - 0174-80 5 Lorenza (PE) F - 0195-80 3 Pastaza Pastaza (EC) F - 0236-84 1 Solimões Coari (BR) F - 0087-83 5 Tefé (BR) F - 0046-79 5 Fonte Boa (BR) F - 0066-83 5 Tuíra Cuenca Del Canal (PA) F - 0204-80 5 Utilis San Isidoro Del General
(CR) F - 0146-80 5
Guapiles (CR) F - 0209-80 5 MicrocarpaMicrocarpaMicrocarpaMicrocarpa Putumayo St. Antônio de Içá (BR) F - 0066-79 4
Benjamim Constant (BR) F - 0052-83 4 Tabatinga (BR) F - 0048-78 4 Pebas (PE) F - 0140-83 3 Vaupés Rio Vaupés (CO)
Rio Vaupés (CO) F - 0211-84 F - 0209-84
5 5
Pop. HíbridasPop. HíbridasPop. HíbridasPop. Híbridas várias Manaus (BR) 1 - P 5 Iquitos (PE)
Iquitos (PE) F - 0121-83 F - 0117-83
5 5
Não DesignadasNão DesignadasNão DesignadasNão Designadas várias Plácido de Castro (BR) F - 0208-83 5 Puerto Maldonado (PE)
Puerto Maldonado (PE) F - 0188-83 F - 0186-83
5 2
Pucalpa (PE) F - 0177-83 5 Contamana (PE) F - 0197-83 5
SilvestresSilvestresSilvestresSilvestres var. chichagui 1 Rio Branco (BR) Rio Branco (BR)
F - 0205-83 F - 0206-83
5 5
var. chichagui 3 Pucalpa (PE) Contamana (PE)
F - 0176-83 F - 0194-83
5 2
TOTALTOTALTOTALTOTAL 40 acessos40 acessos40 acessos40 acessos 179 plantas179 plantas179 plantas179 plantas
3.1 Material Vegetal e Extração de DNA 47
3.2 Amplificação dos loci microssatélites
Testou-se 39 loci microssatélites próprios de pupunha (MARTINEZ et al., 2002,
BILLOTTE et al., 2004 e RODRIGUES et al., 2004b) para seleção de loci com perfis de
amplificação claros e informativos, usando 8 plantas, sendo 6 de populações cultivadas
(Pará, Putumayo e Utilis) e 2 de populações silvestres. A escolha destas plantas baseou-se
na distância geográfica das raças e populações visando aumentar a probabilidade de
encontrar alelos mais divergentes. Os loci selecionados estão amostrados abaixo (Tabela 2).
TabelTabelTabelTabela 2. a 2. a 2. a 2. Características dos 17 loci microssatélites selecionados entre 39 testados e seus respectivos autores.... Ta - temperatura de anelamento; pb - número de pares de base.
locilocilociloci RepetiçãoRepetiçãoRepetiçãoRepetição Ta (°C)Ta (°C)Ta (°C)Ta (°C) Tamanho (pb)Tamanho (pb)Tamanho (pb)Tamanho (pb) AutoresAutoresAutoresAutores
Bg6 (GT)14 50° 180-245 Martinez et al., 2002
Bg10 (CT)18 48° 171-221 Martinez et al., 2002
Bg17 (CT)3(GT)13 52° 231-281 Martinez et al., 2002
Bg 44 (CT)19 50° 155-201 Martinez et al., 2002
mBg57 (GA)17 52° 224-294 Billotte et al., 2004
mBg58 (GA)17 52° 270-330 Billotte et al., 2004
mBg62 (GA)16 52° 119-240 Billotte et al., 2004
mBg71 (GA)17 52° 111-155 Billotte et al., 2004
mBg94 (GA)15 52° 189-251 Billotte et al., 2004
Bg02_4 (GA)8TA(GA)15 64° 118-178 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_5 (GA)16 64° 179-213 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_6 (CT)14 58° 107-159 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_9 (GA)17 58° 165-221 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_10 (CT)10TT(CT)5 64° 146-178 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_11 (GA)11GG(GA)5 58° 148-192 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_12 (GA)9CA(GA)5 58° 141-177 Rodrigues et al., 2004b
Bg02_19 (CT)23(CA)6 58° 161-221 Rodrigues et al., 2004b
3.2 Amplificação dos loci microssatélites 48
Para detecção dos produtos por fluorescência, adicionou-se a extremidade do
primer Forward de cada lócus a sequência M13 (5’TGTAAAACGACGGCCAGT 3’), e
uma outra sequência marcada com fluorocromo específico (FAM ou HEX) foi utilizada
para marcação dos produtos segundo Schuelke (2000), com algumas modificações. As
reações de PCR tiveram um volume final de 10 µl contendo 4 µl de DNA genômico (40
ng), 1 µl de tampão 10X (TrisHCl 100 mM, KCl 500 mM, pH 8.4), 1 µl dNTP (2,5 µM), 1
µl de MgCl2 (25 mM), 0,8 µl de BSA (2,5 µM), 1 µl do primer Reverse (2,5 µM), 0,5 µl do
primer Forward (1,25µM), 0,5µl do primer M13 (1,25µM) marcado com fluorescência e 0,2
µl de Enzima Taq polimerase (5U/µL) (Biotools). As amplificações foram realizadas em
termociclador Veriti (Applied Biosystem) seguindo o programa: 94ºC por 2 minutos; 25
ciclos de 94ºC por 10 segundos, a temperatura de anelamento do primers (Ta), por 20
segundos, 72ºC por 30 segundos; um ciclo de 72ºC por 10 minutos, 20 ciclos de 94ºC por
10 segundos, 50ºC por 20 segundos, 72ºC por 30 segundos, e uma extensão a 72ºC por 30
minutos. Os produtos gerados pela PCR foram analisados conjuntamente, misturando-se
dois loci microssatélites marcados com diferentes fluorocromos, que posteriormente foram
visualizados em seqüenciador automático (Mega Bace 1000, Ge Healthcare). A estimativa
do tamanho dos alelos (pb – pares de bases) foi realizada com o programa Fragment
Profiler (GE Healthcare) auxiliado pelo marcador de peso molecular (Size Standard, ET-
400ROX, GE Healthcare) para assim gerar os relatórios com os genótipos de cada
indivíduo.
3.3. Análise Genética dos Dados.
As freqüências alélicas e os alelos privados de cada lócus foram calculados por meio
dos programas CONVERT (GLAUBITZ, 2004). Os alelos foram classificados como
comum (freqüência > 0,2), intermediário (>0,05) ou raro (<0,05), bem como privado
(presente em apenas uma população), esporádico (presente de duas a quatro populações)
ou difundido (presente de cinco a onze populações), similar ao esquema de Marshall &
Brown (1975).
O programa Structure 2.2 (PRITCHARD et al.,2000; PRITCHARD &WEN, 2003)
foi utilizado para inferir o melhor K (número de agrupamentos – clusters), verificando o
3.2 Amplificação dos loci microssatélites 49
comportamento e a consistência dos agrupamentos formados e quantificando os indivíduos
semelhantes dentro das “populações” estudadas. Os parâmetros utilizados foram: burn-in
de 10.000 permutações, Markov Chain Monte Carlo (MCMC) com 100.000 permutações,
o modelo de ancestralidade “admixture”, onde cada indivíduo pode ter ancestrais de mais
de uma população, e a freqüência alélica independente (λ=1). A escolha do melhor K foi
realizada por meio dos valores de LnP (D) e de ∆K de acordo com Evanno et al. (2005).
Os agrupamentos consistentes detectados pelo programa STRUCTURE 2.2 foram
utilizados as análises seguintes. As estimativas de diversidade genética - o número de alelos
(A), a heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) - foram calculadas para cada lócus e
para o conjunto de plantas por meio dos programas ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et
al., 2005), que também foram utilizados para obtenção dos níveis de significância dados
pelo p-value e FSTAT v.2.9.3.2 (GOUDET, 2000).
As estimativas dos parâmetros genéticos HT, HS, GST e RST foram calculados pelo
programa FSTAT v.2.9.3.2 (GOUDET, 2000) e as estatísticas F (FIS, FST, FIT) de Wright
(1965) foram calculados por meio do programa ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et al.,
2005). Para determinar a estrutura genética entre e dentro das raças e populações foi
efetuada uma análise hierárquica de variância molecular (AMOVA, MICHALAKIS &
EXCOFFIER, 1996), bem como o grau de diferenciação (FST) entre as raças e populações,
através do programa ARLEQUIN v.3.01 (Excoffier et al., 2006). O fluxo gênico médio foi
estimado assumindo que Nm=(1/ FST -1)/4 (WHITLOCK & MCCAULEY, 1999) e o
número absoluto de migrantes (M=2Nm) entre as raças e populações também foi estimado
com base em FST usando o programa ARLEQUIN v.3.01 (EXCOFFIER et al., 2005).
Com base na matriz de distâncias de alelos compartilhados (DAS), calculados pelo
programa Populations 1.2.28 (LANGELLA, 2002) (CHAKRABORTY & JIN, 1993) e nas
distâncias genéticas de Nei (1978) calculados pelo programa TFPGA (MILLER, 1997), as
raças, populações e o conjunto de acessos do BAG de pupunha foram agrupados pelo
método Neighbour Joining (NJ) com o programa MEGA v.4.0 (KUMAR et al., 2004).
3.3 Análise Genética dos Dados 50
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliações das raças primitivas e outras populações.
Uma análise preliminar foi usada para observar o sucesso do programa Structure
(PRITCHARD et al., 2000; PRITCHARD & WEN, 2003) em identificar grupos similares
às raças validadas, e avaliar as relações das populações híbridas, populações não designadas
e populações silvestres em relação às raças validas. A primeira simulação no Structure
ocorreu com todos os 179 indivíduos; o valor do LnP(D) aumentou com o K de 1 a 15,
mostrando alguma evidencia de agrupamentos para ∆K 2, 3, 7 e 9 (Figura 6). Avaliação das
simulações para esses ∆K sugeriu que as hipóteses de Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004),
Cristo-Araújo (2008) e Santos et al. (submetido) tinham validade, e poderiam ser usadas
para re-designar acessos a raças para que os agrupamentos formados fossem mais
consistentes, bem como designar novos grupos, chamados de “populações sintéticas”
(CRISTO-ARAÚJO, 2008). Também nestas análises foi observado que o comportamento
do acesso F-0209-84 da raça Vaupés (Rio Vaupés, Colômbia) não foi consistente, pois os
dois acessos desta raça usados nesta análise deveriam ter se agrupado no mesmo conjunto.
No entanto, o acesso F-0209-84 se juntou as populações do Alto Rio Madeira. Nesta
incerteza, o acesso foi eliminado das análises, pois parece ser erro no plantio do BAG
Pupunha.
Figura 6.Figura 6.Figura 6.Figura 6. Provável validade de grupos populacionais identificados pelo programa Structure baseada em 17 loci microssatélites de pupunha. (∆K com K de 1 a 15, com 15 simulações para todos os 179 indivíduos analisados).
51
Com base em K=3, um grupo, que combina a maioria das plantas de América
Central, sugere que as raças Tuíra e Guatuso são partes da raça Útilis, prevalecendo o
nome Útilis, como sugerido por Rodrigues et al. (2004a). Com base nos agrupamentos em
K=7 e K=9, a raça Solimões, com três acessos, foi dividida de modo que o acesso de Coari
se integrou à raça Pará, e os acessos de Tefé e Fonte Boa se integraram à raça Putumayo,
um pouco diferente da proposta de Sousa et al. (2004) e Rodrigues et al. (2004a), que
sugeriu que até Coari deveria ser parte da raça Putumayo. Também com base nos
agrupamentos em K=7 e K=9, as populações híbridas foram re-designadas às raças mais
próximas, como sugerido por Santos et al. (submetido), com o acesso de Manaus sendo
integrado à raça Pará e os dois acessos de Iquitos integrados à raça Putumayo. Populações
não designadas a raças foram aqui designadas a populações sintéticas, com os acessos de
Plácido de Castro e Puerto Maldonado designados ao “Alto Rio Madeira”, e acessos de
Pucalpa e Contamana designadas ao “Rio Ucayali”, como sugerido por Cristo-Araújo
(2008). Na figura 7 é possível visualizar a re-designação das raças e populações.
Figura 7. Figura 7. Figura 7. Figura 7. Redesignação das raças e populações para consistência dos agrupamentos formados pelo programa Structure.
Na segunda serie de simulações com o programa Structure, com as novas
designações de raças e populações, e sem um acesso da raça Vaupés, os valores de LnP(D)
4.1 Avaliação das raças primitivas e outras populações 52
indicaram ∆K = 4 como o melhor agrupamento, com alguma estrutura em K = 2, 3, 5, 7, 8
e 9 (Figura 2.).
Figura Figura Figura Figura 8888.... Agrupamentos populacionais identificados pelo programa Structure com base em 17 loci microssatélites de pupunha, incluindo a nova designação das raças e populações, e sem o acesso F-0209-83 da raça Vaupés. (∆K com K de 2 a 12, 15 simulações).
Em K=2 ocorre a divisão da raça Pará, população sintética Alto Rio Madeira e var.
chichagui tipo 1 das outras raças e populações, conforme a primeira serie de simulações
com Structure. Esta composição é bastante similar às observações de Rodrigues et al.
(2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008). Contudo, estas simulações ainda apresentaram
inconsistências, exigindo análises mais aprimoradas para explicar estes agrupamentos,
embora permita acreditar que o grupo composto por esta raça e populações seja
suficientemente consistente para aceitar em geral.
Em K=4, o melhor agrupamento segundo o ∆K, a estrutura geral é semelhante a
estudos já realizados (RODRIGUES et al. 2004a; SILVA, 2004; CRISTO-ARAÚJO,
2008), mesmo com algumas inconsistências (Figura 8). A raça Pará, a população sintética
do Alto Rio Madeira e a var. chichagui tipo 1 formaram o mesmo agrupamento como visto
antes. Um segundo conjunto foi formado pelas raças Putumayo, Vaupés, Cauca, Pastaza e
Juruá, todas da Amazônia Ocidental. No terceiro grupo estão a raça Pampa Hermosa, a
população sintética do Rio Ucayali e a var. chichagui tipo 3, todos de uma mesma região
em Peru. A raça Útilis forma o quarto grupo.
4.1 Avaliação das raças primitivas e outras populações 53
FiguraFiguraFiguraFigura 9999.... Probabilidade de associação das 174 plantas em quatro grupos identificados pelo programa Structure (K = 4). As cores representam os grupos e cada planta (linha vertical) é avaliada em termos da probabilidade de compor um determinado grupo, estimado pelo coeficiente de relacionamento (q). O quinto grupo (lado direto) é composto por algumas plantas que o programa não conseguiu determinar um relacionamento firme.
Nos demais valores de K sugeridos nesta série de simulações, a raça Pará, população
sintética Alto Rio Madeira e var. chichagui tipo 1 permaneceram isoladas das demais, assim
como o agrupamento constituído na América Central. Nos valores de K=7, 8 e 9, os
agrupamentos se diferenciam mais de acordo com as raças/localidades. No entanto, embora
surjam agrupamentos mais sólidos, as inconsistências aumentam na mesma proporção,
justificando a baixa saliência mostrada na Figura 7.
Visto que o grupo formado pela raça Pará, a população sintética do Alto Rio
Madeira e a var. B. gasipaes chichagui tipo 1 se divergiram das demais raças e populações
em todas as indicações de agrupamentos mostrados em ∆K, foi feita uma nova simulação
com o programa Structure, como sugerido por Zhang et al. (2009), baseado em K=2. A raça
Pará, as populações sintética do Alto Rio Madeira e a var. chichagui tipo 1 foram retiradas
das novas análises (K de 1 a 9 com 15 simulações), que foram efetuadas a fim de conferir se
a estrutura dos agrupamentos formados corroboram com observações dos estudos
anteriores.
Os resultados gerados apontaram a existência de quatro subpopulações (K=4) para
este conjunto de raças inferidas, com alguma estrutura de grupos em K=3 e 5 (Figura 9).
Em K=4, notamos a separação de Juruá das demais raças e populações da Amazônia
Amazônia Oriental Amazônia Ocidental Norte Amazônia Ocidental Sul América Central
4.1 Avaliação das raças primitivas e outras populações 54
Ocidental. Ocorre um segundo conjunto formado pelas raças Putumayo, Vaupés, var.
chichagui tipo 3, a população sintética do Rio Ucayali e Pastaza. Neste grupo, as
consistências estão entre a var. chichagui tipo 3 e a população sintética do Rio Ucayali, pois
os acessos são da mesma localidade e a associação pode representar introgressão, como
visto por Couvreur et al. (2006). O terceiro grupo apresentou alguns indivíduos das raças
Putumayo, Pampa Hermosa e Cauca. Além das relações já observadas entre Putumayo e
Pampa Hermosa, a raça Cauca é geograficamente próxima a Putumayo, embora no outro
lado dos Ande, o que pode explicar esse conjunto. O quarto grupo é formado pela raça
Utilis da América Central. Em K=3 os agrupamentos se dividem em Amazônia Ocidental
Sul, Amazônia Oriental Norte e América Central; e em K=5 o único agrupamento definido
é o da América Central.
Figura Figura Figura Figura 10101010.... Agrupamentos populacionais estimados pelo programa Structure, incluindo apenas populações e raças da Amazônia Ocidental até América Central. (com K de 1 a 9, com 15 simulações).
Em geral, as simulações com o programa Structure confirmaram as validações de
Rodrigues et al. (2004a) e Silva (2004), bem como a proposta de populações sintéticas de
Cristo-Araújo (2008), todas baseadas em RAPD. As relações observadas para as raças com
pouca representação (Vaupés, Cauca e Pastaza) são consistentes com suas relações
geográficas, sugerindo que essas raças também são válidas, mesmo que não existam
suficientes acessos no BAG Pupunha para testar sua validade com precisão. As relações
entre as populações silvestres (var. chichagui tipos 1 e 3) com as populações cultivadas a seu
redor sugerem a existência de introgressão, como observado por Couvreur et al. (2006) no
Equador. No entanto o programa Structure não conseguiu validar todas as raças da
4.1 Avaliação das raças primitivas e outras populações 55
Amazônia Ocidental, mas isto certamente se deve ao desenho da Coleção Nuclear, em que
Cristo-Araújo (2008) maximizou a variabilidade presente em cada raça primitiva via a
seleção de populações geográfica e geneticamente divergentes. Esse desenho
essencialmente aumenta as chances de detectar fluxo gênico entre populações
geograficamente próximas, mesmo que de raças distintas, o que é especialmente comum na
Amazônia Ocidental. No entanto, este conjunto de simulações com o programa Structure
sugere que as análises posteriores, feitas com base nas raças primitivas e populações
mencionadas, permitirão ver relações genéticas com razoável probabilidade de refletir
relações reais. As raças e populações determinadas pelo programa foram:
• Raças primitivas – Pará, Putumayo, Juruá, Pampa Hermosa, Vaupés, Cauca e Utilis;
• Populações sintéticas – Alto Rio Madeira e Rio Ucayali;
• Populações silvestres – var. chichagui tipo 1 e var. chichagui tipo 3.
4.2. Variabilidade genética dos loci microssatélites
Dos 39 loci microssatélites testados para a seleção de perfis claros e informativos, 35
loci amplificaram produtos de tamanho esperado e quatro não amplificaram. Em 25 loci
foram notados perfis claros, sem a presença de ‘stutter’, quatro loci apresentaram ‘stutter’ e
seis loci tiveram perfis não definidos. Assim, foram selecionados os 17 loci microssatélites
com perfis mais claros e informativos para este estudo (Tabela 1).
Os 17 loci selecionados detectaram 302 alelos dentre as raças e populações
analisadas, com uma média de 17,8 alelos por locús, demonstrando que esses marcadores
são muito informativos para estudos genéticos com pupunheira, como observado por
Martinez et al. (2002), Billotte et al. (2004) e Rodrigues et al. (2004b). O número de alelos
por lócus variou de 12 (Bg44) a 29 (mBg62), o nível de variação nas populações foi alto,
com 67 a 184 alelos por raça e/ou população.
Os alelos foram classificados de acordo com suas freqüências e distribuição entre as
raças e populações (Tabela 3). A maioria dos alelos foi classificada como raros, dos quais
4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites 56
100 alelos são compartilhados as populações e 63 são privados em populações específicas.
A raça Putumayo (n=35) apresentou o maior número de alelos (184) e Vaupés (n=5) o
menor número (67), provavelmente por estar representado por um único acesse (Figura
11). A raça Pampa Hermosa (n=18) apresentou um total de 141 alelos e o maior número
de alelos privados. As raças Vaupés e Cauca, com cinco e oito indivíduos, respectivamente,
apresentaram dois alelos privados cada uma. Utilizando oito marcadores microssatélites,
Rodrigues (2007) encontrou 87 alelos raros, sendo 14 alelos privativos, entre três
populações inermes da raça Pampa Hermosa e a população do mercado da cidade de
Yurimaguas. Cole et al. (2007), com apenas três loci microssatélites, encontraram seis alelos
privativos em quatro populações de pupunheira cultivada por comunidades indígenas e de
camponeses na região de Iquitos, Peru (raça Putumayo).
Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3.Tabela 3. Classificação do número de alelos baseados em sua freqüência e distribuição entre as amostras de nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (Bactris gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear, mantida no BAG de pupunha do INPA (AM, Brasil).
Comum Intermediário Raro TOTALTOTALTOTALTOTAL
(> 0,2) (> 0,05) (< 0,05) Privado 0 0 63 63636363
Esporádico 0 13 100 113113113113 Difundido 14 85 27 126126126126 TOTALTOTALTOTALTOTAL 14141414 98989898 190190190190 302302302302
Figura 11.Figura 11.Figura 11.Figura 11. Relação entre o número total de alelos e o número de alelos privativos amostrados em 17 loci microssatélites em raças e populações de pupunha silvestre e cultivada.
4.2 Variabilidade genética dos loci microssatélites 57
4.3. Parâmetros genéticos das populações
Em geral estimativas das heterozigosidades observadas (HO) e esperadas (HE)
mostraram-se altas e similares entre todas as raças e populações analisadas, sendo maiores
para Putumayo, Pampa Hermosa e var. chichagui tipo 3 (Tabela 3). O lócus Bg02_19
(0,89) apresentou a maior média de heterozigosidade observada e o lócus Bg44 (0,42) a
menor. Os valores de HO foram inferiores aos valores de HE na maioria dos loci, mesmo
apresentado alguns desvios significativos em um lócus da raça Putumayo e cinco loci da
raça Juruá. Diferenças significativas (p<0,05) de heterozigosidade esperada (HE) em relação
à heterozigosidade observada (HO) foram observadas nos loci Bg10, Bg44, mBg62, Bg02_06
e Bg02_12, indicando deficiência de heterozigotos. Diferenças similares foram observadas
por Rodrigues (2007), Couvreur et al. (2006) e Cole et al. (2007). O lócus Bg02_06 foi
totalmente monomorfico para a raça Vaupés, provavelmente por apresentar apenas cinco
indivíduos nestas análises.
As estimativas da diversidade total (HT) foram altas (Tabela 4), com valores entre
0,82 (Bg10) a 0,95 (mBg62), similares aos obtidos por Rodrigues (2007) com oito loci
microssatélites, Cole et al. (2007) com três, e Couvreur et al. (2006), que utilizaram oito loci
em populações de pupunha cultivadas e silvestres. Estudos com outras palmeiras cultivadas
também detectaram altas diversidades totais com loci microssatélites, como em Cocos
nucifera (oito loci SSR; PERERA et al., 2000), Elaeis guineensis e E. oleifera (21 loci SSR;
BILLOTTE et al., 2001). As estimativas de heterozigosidade em nível de população (HS)
também foram altas, com média de 0,76, apresentando maior valor no lócus mBg62 (0,86).
Os níveis de endogamia estimados pelos índices de fixação de Wright (1965) foram
altamente significativos (p<0,05) na maioria dos loci. O maior valor de endogamia dentro
das raças e populações (FIS) foi detectado pelo lócus Bg44, e não foram significativamente
diferentes de zero para Bg17, mBg57, mBg94 e Bg02_19. Semelhante ao encontrado por
Hernandez et al. (2008), o maior nível de endogamia foi visto na raça Pará (0,28), enquanto
que Juruá e Vaupés não apresentaram endogamia. O coeficiente de endogamia entre as
raças e populações (FST) foi 0,13 e para o total (FIT) foi 0,27, confirmando as observações de
deficiência de heterozigotos nestes loci. Utilizando oito marcadores microssatélites,
Rodrigues (2007) investigou o sistema reprodutivo de três populações de pupunheira da
raça Pampa Hermosa e constatou uma significativa endogamia biparental, fenômeno
4.3 Parâmetros genéticos das populações 58
esperado em pequenas populações sob a influencia de seleção humana, dado a abundância
de parentes numa área pequena (CLEMENT, 1988; COLE et al., 2007).
4.3 Parâmetros genéticos das populações 59
Tabela 4.Tabela 4.Tabela 4.Tabela 4. Índices de diversidade genética, índices de fixação e diferenciação genética de 17 loci microssatélites em amostras de nove populações de pupunha cultivada (B.gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B.gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil e o conjunto de todas as populações. A – Número de alelos; P – Número de alelos privados; HO – Heterozigosidade observada; HE – Heterozigosidade esperada; HS – Diversidade genética na população; HT- Diversidade genética total; GST – Estimador da diferenciação genética de Nei; RST – Estimador de diferenciação genética (stepwise mutation model); Estimativas das estatística F de Wright: FIS – Coeficiente de endogamia intrapopulacional, FST – Coeficiente de endogamia entre populações e FIT – Coeficiente de endogamia para o conjunto das populações. *HO - significativamente diferente de HE a p<0,05. *FIS – não diferente de zero a p<0,05.
Raça/População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-
09 Bg02-
10 Bg02-
11 Bg02-
12 Bg02-
19 Total
Pará A 9 8 10 6 10 14 11 7 12 9 8 9 8 12 8 9 11 161
(N=34) P - - - - - 1 1 - - 1 1 1 - 1 - 1 2 9
HO 0,56 0,47 0,76 0,27 0,69 0,63 0,32 0,33 0,79 0,81 0,39 0,56 0,47 0,53 0,82 0,44 0,82 0,57
HE 0,78 0,83 0,78 0,69 0,74 0,85 0,89 0,71 0,84 0,83 0,53 0,81 0,80 0,90 0,85 0,74 0,89 0,77
FIS 0,28 0,43 0,03 0,61 0,07 0,26 0,63 0,53 0,05 0,03 0,25 0,31 0,41 0,41 0,03 0,40 0,08 0,28
Putumayo A 8 7 7 8 13 11 16 10 14 8 10 11 13 10 12 11 15 184
(N=35) P 1 1 - - - - 1 - - - 2 2 - - 1 - 2 10
HO 0,62 0,48 0,73 0,50 0,76 0,70 0,76 0,48 0,79 0,76 0,82 0,58 0,80 0,71 0,77 0,76 0,91 0,70
HE 0,80 0,59 0,75 0,80 0,90 0,81 0,91 0,78 0,87 0,84 0,88 0,83 0,92 0,77 0,89 0,88 0,88 0,83
FIS 0,24 0,18 0,02 0,36 0,16 0,13 0,16 0,38 0,10 0,07 0,06 0,31 0,12 0,07 0,14 0,13 -0,04 0,15
Juruá A 4 3 6 6 4 9 7 6 4 3 3 3 4 5 5 3 7 82
(N=10) P 1 1 1 - - - 1 - - - - - - - 1 - - 4
HO 0,60 0,40 0,90 0,60 0,50 1,00 1,00 0,89 0,60 0,60 0,90* 0,40 0,70 0,70 0,70 0,20 0,90 0,68
HE 0,70 0,73 0,71 0,85 0,71 0,86 0,83 0,80 0,57 0,47 0,57* 0,66 0,61 0,79 0,56 0,62 0,83 0,70
FIS 0,08 0,40 -0,30 0,29 0,21 -0,17 -0,22 -0,11 -0,21 -0,30 -0,62 0,31 -0,17 0,08 -0,27 0,66 -0,10 -0,02
var.chichagui 1 A 6 7 6 3 3 10 8 9 8 7 7 6 9 5 5 4 7 110
(N=10) P - 1 - 2 - - 1 - - - - - - - - 1 1 6
HO 0,88 0,30 0,80 0,38 0,30 1,00 0,63 0,90 0,90 0,60 0,70 0,40 0,90 0,56 0,60 0,50 0,90 0,66
HE 0,84 0,85 0,83 0,75 0,36 0,89 0,88 0,89 0,84 0,86 0,79 0,84 0,82 0,77 0,74 0,43 0,83 0,78
FIS -0,04 0,63 0,03 0,46 -0,08 -0,13 0,30 -0,01 -0,13 0,26 0,06 0,53 -0,10 0,22 0,20 -0,17 -0,09 0,13
Alto Madeira A 8 5 9 5 5 9 9 9 5 5 7 7 10 10 6 6 9 124
(N=12) P - - - 1 1 - - - - - - - 1 - - - 1 4
HO 0,92 0,42 0,92 0,36 0,80 0,73 0,36 0,50 0,67 0,54 0,55 0,58 0,83 0,67 0,75 0,70 0,83 0,65
HE 0,82 0,82 0,87 0,74 0,73 0,90 0,90 0,90 0,75 0,81 0,70 0,86 0,91 0,90 0,83 0,82 0,89 0,83
FIS -0,13 0,47 -0,05 0,50 -0,11 0,18 0,60 0,44 0,12 0,34 0,16 0,29 0,07 0,26 0,07 0,11 0,07 0,20
60
Continuação Tabela 4.
População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-
09 Bg02-
10 Bg02-
11 Bg02-
12 Bg02-
19 Total
Pampa Hermosa A 7 4 7 7 8 8 14 8 12 11 7 5 10 6 8 9 10 141
(N=18) P - - - 1 1 - - 1 2 2 - - - 2 2 - 11
HO 0,72 0,67 0,65 0,43 0,83 0,53 0,78 0,72 0,94 0,72 0,71 0,67 0,83 0,82 0,89 0,71 0,89 0,74
HE 0,80 0,65 0,80 0,84 0,83 0,87 0,93 0,86 0,91 0,88 0,79 0,72 0,89 0,78 0,88 0,73 0,89 0,83
FIS 0,08 -0,07 0,18 0,50 -0,02 0,38 0,16 0,17 -0,04 0,17 0,10 0,07 0,06 -0,08 -0,01 0,03 0,00 0,10
Ucayali A 4 7 7 5 7 7 6 6 9 6 7 7 8 5 7 4 9 111
(N=10) P 1 - - - - - - - 2 - - 1 - - - - - 4
HO 0,40 0,80 0,80 0,10 0,80 0,25 0,40 0,90 0,90 0,80 0,63 0,60 0,80 0,50 0,80 0,67 1,00 0,66
HE 0,60 0,79 0,78 0,82 0,87 0,94 0,72 0,78 0,91 0,83 0,84 0,74 0,86 0,63 0,82 0,83 0,90 0,80
FIS 0,27 -0,08 -0,09 0,87 0,03 0,73 0,46 -0,17 -0,02 -0,01 0,22 0,20 0,08 0,21 0,02 0,15 -0,12 0,16
var.chichagui 3 A 5 5 4 6 7 6 5 8 6 6 6 5 10 6 3 4 6 98
(N=07) P - - 1 - 1 - - - 1 - - - - 1 - - 1 5
HO 0,71 1,00 0,67 0,71 0,83 0,83 0,00 0,71 0,86 1,00 1,00 0,71 1,00 0,86 0,50 0,50 1,00 0,76
HE 0,77 0,82 0,80 0,89 0,86 0,86 0,89 0,92 0,68 0,81 0,81 0,81 0,95 0,85 0,44 0,86 0,85 0,82
FIS 0,08 -0,25 0,15 0,16 0,04 -0,04 1,00 0,23 -0,29 -0,25 -0,25 0,06 -0,06 -0,01 -0,15 0,40 -0,20 0,05
Vaupés A 3 4 3 3 3 4 6 6 6 4 3 1 5 3 4 4 5 67
(N=05) P - - - - - - 1 - 1 - - - - - - - - 2
HO 0,40 0,40 1,00 0,60 0,75 0,80 1,00 0,80 1,00 0,40 0,60 MONO 1,00 1,00 0,80 0,40 0,80 0,73
HE 0,76 0,84 0,64 0,82 0,68 0,73 0,84 0,91 0,84 0,78 0,60 MONO 0,80 0,64 0,78 0,76 0,76 0,76
FIS 0,39 0,48 -0,67 0,14 -0,13 -0,10 -0,21 0,11 -0,21 0,41 0,00 NA -0,29 -0,67 -0,03 0,41 -0,07 -0,02
Cauca A 6 4 7 5 7 3 6 2 5 5 4 2 6 4 7 5 6 84
(N=08) P - 1 - - - - - - - - - - - 1 - - 2
HO 0,88 0,86 0,88 0,25 0,86 0,33 0,50 0,38 0,75 1,00 0,63 0,00 0,50 0,63 0,75 0,75 1,00 0,64
HE 0,83 0,66 0,86 0,88 0,91 0,32 0,83 0,43 0,82 0,83 0,65 0,35 0,89 0,77 0,83 0,73 0,87 0,73
FIS -0,05 -0,33 -0,02 0,71 0,03 -0,05 0,40 -0,17 0,05 -0,23 0,04 1,00 0,42 0,17 0,11 -0,14 -0,17 0,09
Útilis A 9 5 7 5 8 7 10 5 9 7 6 5 7 6 8 7 10 121
(N=24) P 1 - - - - 1 3 - - - - - - - - - - 5
HO 0,79 0,50 0,57 0,41 0,79 0,27 0,68 0,52 0,54 0,58 0,52 0,71 0,67 0,42 0,21 0,48 0,74 0,55
HE 0,80 0,66 0,67 0,62 0,79 0,49 0,86 0,64 0,53 0,69 0,70 0,67 0,85 0,69 0,52 0,80 0,84 0,70
FIS 0,01 0,21 0,13 0,31 0,00 0,44 0,20 0,19 -0,04 0,15 0,23 -0,06 0,22 0,37 0,58 0,38 0,11 0,19
61
Continuação Tabela 4.
População Bg6 Bg10 Bg17 Bg44 mBg57 mBg58 mBg62 mBg71 mBg94 Bg02_04 Bg02_05 Bg02_06 Bg02-
09 Bg02-
10 Bg02-
11 Bg02-
12 Bg02-
19 Total
Populações A 16 13 14 12 18 21 29 16 24 16 16 14 19 18 16 16 24 302
(N=173) P 4 4 2 4 3 2 8 1 6 3 3 4 1 2 5 4 7 63
HO 0,68 0,57 0,79 0,42 0,72 0,64 0,58 0,65 0,79 0,71 0,68 0,47 0,77 0,67 0,69 0,56 0,89 0,66
HS 0,75 0,72 0,76 0,76 0,74 0,77 0,86 0,78 0,76 0,76 0,70 0,65 0,84 0,76 0,74 0,72 0,85 0,76
HT 0,82 0,81 0,86 0,84 0,87 0,91 0,95 0,90 0,90 0,88 0,85 0,82 0,92 0,89 0,83 0,88 0,93 0,87
GST 0,08 0,11 0,11 0,09 0,15 0,15 0,10 0,14 0,15 0,13 0,18 0,21 0,09 0,14 0,11 0,18 0,08 0,13
RST 0,18 0,09 0,07 0,12 0,38 0,39 0,15 0,23 0,18 0,09 0,23 0,29 0,21 0,03 0,07 0,12 0,07 0,19
FIS 0,13 0,24 0,01* 0,46 0,06* 0,20 0,32 0,25 0,00* 0,08 0,08 0,25 0,15 0,19 0,10 0,23 0,00* 0,21
FST 0,09 0,13 0,11 0,10 0,16 0,16 0,09 0,15 0,14 0,13 0,18 0,16 0,09 0,15 0,10 0,17 0,07 0,13
FIT 0,21 0,34 0,12 0,51 0,20 0,33 0,39 0,36 0,15 0,19 0,25 0,37 0,22 0,31 0,19 0,36 0,07 0,27
62
A análise de variância molecular estimou a partição da diversidade genética total de
forma hierárquica entre e dentro das raças e populações. Assim como em estudos
anteriores, a AMOVA detectou 87% da variação genética total dentro das raças enquanto
que apenas 13% entre raças. Os índices de estruturação genética calculados [GST (0,13), RST
(0,19) e FST (0,13)] confirmam a estrutura genética mínima entre as raças e populações,
assim como observada por Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004) e Cristo-Araújo (2008),
que analisaram algumas das raças e populações deste estudo. Outros estudos com
populações de pupunheira cultivada (ADIN et al., 2004; COLE et al., 2006; COUVREUR
et al., 2006; RODRIGUES, 2007) também encontraram estruturação pequena. A pouca
estruturação é curioso considerando que populações da var. chichagui foram incluídas em
nosso estudo, como também nos de Rodrigues et al. (2004a), Silva (2004), Couvreur et al.
(2006) e Cristo-Araújo (2008), e deve ser devido a fluxo gênico (veja abaixo).
No dendrograma das distâncias entre as raças e populações, estimado com base nos
alelos compartilhados (DAS), criado pelo método Neighbour – Joining (NJ) houve a
formação de dois grupos: um formado pela raça da América Central e a maioria das raças e
populações do oeste da Amazônia, e outro composto pela raça Juruá, B. gasipaes var.
chichagui tipo 1, Alto Madeira e Pará (Figura 12). A estrutura formada é semelhante aos
agrupamentos formados pelo programa Structure, exceto a posição da raça Juruá. A raça
Putumayo apresentou maior similaridade com a raça Cauca, e depois se juntou à raça
Vaupés e Utilis, que também apresentaram maior semelhança entre si. Essas relações
sugerem a probabilidade de fluxo gênico de oeste e noroeste da Amazônia até o litoral
Pacífico de Colômbia e finalmente até América Central. A raça Pampa Hermosa teve maior
proximidade com o agrupamento anterior, seguida da população sintética do Rio Ucayali e
as populações de B. gasipaes var. chichagui tipo 3. A raça Juruá apresentou-se isolada,
porém mostrando alguma proximidade ao grupo seguinte, o que sugere fluxo gênico entre
as cabeceiras dos altos Rio Madeira e Rio Juruá, o que faz sentido geográfico e étnico, pois
os povos indígenas da região viagem continuamente entre essas regiões. A população de B.
gasipaes. var chichagui tipo 1 mostrou-se bem relacionada à raça Pará, que por sua vez se
uniu às do Alto Rio Madeira, conforme observado por Cristo-Araújo (2008).
O dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978), também criado pelo método
NJ, teve estrutura similar ao dendrograma das distâncias de DAS, com algumas modificações
entre as associações (Figura 13). Permaneceu a aproximação entre Putumayo e Cauca,
4.3 Parâmetros genéticos das populações 63
Vaupés e Utilis, seguida por Pampa Hermosa, a população sintética do Rio Ucayali e, neste
dendrograma, a raça Juruá apresentou-se mais próximo a estas populações, seguida de B.
gasipaes var. chichagui tipo 3. A raça Pará, B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e a população
do Alto Rio Madeira formaram um grupo a parte, sendo que as duas últimas populações
apresentaram maior similaridade entre si. A estrutura deste dendrograma, com a separação
da raça Pará das raças da Amazônia Ocidental, é consistente com as análises anteriores
(ROJAS VARGAS et al., 1999; RODRIGUES et al. 2004; SILVA 2004; CRISTO-
ARAUJO 2008) e com a análise de Structure (seção 4.1 acima).
Putumayo
Cauca
Vaupés
Utilis
Pampa Hermosa
Rio Ucayali
var.chichagui 3
Juruá
var.chichagui 1
Pará
Alto Rio Madeira
0.05
Figura 12.Figura 12.Figura 12.Figura 12. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de alelos compartilhados (Das) mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.
4.3 Parâmetros genéticos das populações 64
Putumayo
Cauca
Vaupés
Utilis
Pampa Hermosa
Rio Ucayali
Juruá
var.chichagui 3
Pará
var.chichagui 1
Alto Rio Madeira
0.1
Figura 13.Figura 13.Figura 13.Figura 13. Dendrograma baseado nas distâncias genéticas de Nei (1978), mostrando as relações genéticas entre sete raças primitivas, duas populações sintéticas e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui tipo 1 e 3) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil.
O fluxo gênico médio entre este conjunto de plantas foi de 1,20 (Tabela 5), similar
ao encontrado por Hernandez et al. (2008) (Nm=1,25), que analisaram a diversidade e
estrutura genética entre populações silvestres e cultivadas de pupunha. Segundo Wright
(1951), quando Nm ≥ 1,0, o número de migrantes por geração impede a divergência entre
populações, isto pode ser observado pela baixa variação molecular entre estas raças e
populações (AMOVA = 13%), refletindo bem a pouca estruturação entre elas. O fluxo
gênico entre Pampa Hermosa e Putumayo (Nm=17,04) foi alto, semelhante ao encontrado
por Rodrigues et al. (2004), Adin et al. (2004) e Cristo-Araújo (2008). O fluxo gênico entre
Pará e as populações do Alto Rio Madeira explica o posicionamento destas plantas nos
dendrogramas das distâncias de alelos compartilhados (DAS) e Nei (1978), mostrando ainda
um baixo fluxo gênico entre Pará e as raças e populações da Amazônia Ocidental. Ainda é
possível verificar um baixo fluxo gênico entre Juruá e as demais raças e populações,
explicando sua separação na análise com Structure. Entre as populações silvestres e
cultivadas é notado um fluxo gênico moderado, sendo o maior entre as raças Pampa
Hermosa e B. gasipaes var. chichagui tipo 3 (Nm=8,56), confirmando o agrupamento
4.3 Parâmetros genéticos das populações 65
encontrado nas análises do Structure e sugerindo alguma introgressão, como notado por
Couvreur et al. (2006) no Equador. A diferenciação genética (FST) entre os pares de
populações foi moderada, sendo consistente com os valores dos fluxos gênicos entre as
populações. Entretanto, devido ao baixo número amostral de algumas populações [Vaupés
(n=05); var. chichagui tipo 3 (n=07); Cauca (n=08)], estes resultados podem ser sub ou
superestimados.
O dendrograma dos 38 acessos de pupunha analisado no presente estudo (distância
de Nei (1978), método NJ) evidencia a formação de dois grupos já observados nos
dendrogramas anteriores (Figura 9). O primeiro grupo é formado pelos acessos de Pará,
Alto Madeira e B. gasipaes var. chichagui tipo 1, e o segundo contém o restante dos
acessos, com duas inconsistências da raça Pará e uma de Alto Madeira. Um acesso de Pará
é formado por indivíduos de Solimões (Coari, Amazonas) e encontra-se próximo a dois
acessos de Pampa Hermosa, sendo mais semelhante ao da região de Lorenza, Peru. Esta
proximidade sugere que a redesignação do acesso de Coari para a raça Pará, baseada na
análise com Structure, foi equivocada e o acesso será redesignado como Putumayo em
futuras análises. Outro acesso de Pará é composto por indivíduos de populações híbridas
de Manaus e formou um grupo isolado. A população sintética de Alto Rio Madeira é
formada por acessos de populações não designadas de Puerto Maldonado (Peru) e
apresentou maior similaridade a um acesso de Pampa Hermosa do Rio Paranapura (Peru).
O segundo grupo apresentou algumas aproximações interessantes. Ambos acessos
de Juruá ficaram próximos a uma acesso Rio Ucayali, seguido de dois acessos de B.
gasipaes var. chichagui tipo 3 e depois de outro acesso do Rio Ucayali. Estas relações
mostram o que foi visualizado no dendrograma das raças e populações de Nei (1978)
(Figura 8), onde Juruá se posicionou entre as populações do Rio Ucayali e de B. gasipaes
var. chichagui tipo 3, diferentemente do dendrograma das distancias de DAS, em que Juruá
aparece isolado. Nota-se a inconsistência de um acesso de Pampa Hermosa (Santa Maria,
Peru) próximo a um acesso de Útilis (San Carlos, Costa Rica) e o relacionamento entre os
acessos de Putumayo e Cauca, Vaupés e Útilis, como o visto nos dendrogramas das raças e
populações.
4.3 Parâmetros genéticos das populações 66
Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Tabela 5. Matriz de divergência (FST – diagonal abaixo) e fluxo gênico [M(número absoluto de migrantes) = 2Nm – diagonal acima] entre nove entre nove populações de pupunha cultivada (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações de pupunha silvestre (B. gasipaes var. chichagui) representadas na Coleção Nuclear e mantidas no BAG de Pupunha do INPA, Manaus, Amazonas, Brasil, com 17 loci microssatélites.
ParáParáParáPará PutumayoPutumayoPutumayoPutumayo JuruáJuruáJuruáJuruá var. var. var. var. chichaguichichaguichichaguichichagui 1111 Alto MadeiraAlto MadeiraAlto MadeiraAlto Madeira Pampa HermosaPampa HermosaPampa HermosaPampa Hermosa UcayaliUcayaliUcayaliUcayali var. var. var. var. chichaguchichaguchichaguchichagui 3i 3i 3i 3 VaupésVaupésVaupésVaupés CaucaCaucaCaucaCauca UtilisUtilisUtilisUtilis
ParáParáParáPará **** 4,43 2,01 5,28 9,42 4,16 3,15 4,79 2,18 2,19 1,97
PutumayoPutumayoPutumayoPutumayo 0,10 **** 2,42 3,38 4,68 17,04 5,37 6,08 4,43 8,45 4,07
JuruáJuruáJuruáJuruá 0,20 0,17 **** 2,12 2,23 2,47 2,08 2,77 1,60 1,61 1,54
var. chichagui 1var. chichagui 1var. chichagui 1var. chichagui 1 0,09 0,13 0,19 **** 7,20 3,77 3,85 3,84 1,79 1,92 1,91
Alto MadeiraAlto MadeiraAlto MadeiraAlto Madeira 0,05 0,10 0,18 0,06 **** 4,20 2,89 4,83 2,14 2,33 2,20
Pampa HermosaPampa HermosaPampa HermosaPampa Hermosa 0,11 0,03 0,17 0,12 0,11 **** 6,32 8,56 4,75 5,82 3,48
UcayaliUcayaliUcayaliUcayali 0,14 0,09 0,19 0,11 0,15 0,07 **** 4,94 2,28 2,61 2,33
var. chichagui 3var. chichagui 3var. chichagui 3var. chichagui 3 0,09 0,08 0,15 0,12 0,09 0,06 0,09 **** 2,56 2,76 3,07
VaupésVaupésVaupésVaupés 0,19 0,10 0,24 0,22 0,19 0,10 0,18 0,16 **** 2,63 2,56
CaucaCaucaCaucaCauca 0,19 0,06 0,24 0,21 0,18 0,08 0,16 0,15 0,16 **** 2,49
UtilisUtilisUtilisUtilis 0,20 0,11 0,25 0,21 0,19 0,13 0,18 0,14 0,16 0,17 ****
67
Jcs1
Jcs2
UcNdcot5
3Silpul3
3Silcot4
UcNdpu4
AMNdpc3
Phrp2
Phph1
PaSolcoa1
Phlor4
PuHibiq3
PuHibiq2
PuSolfb1
Phsm3
UGuasc1
Pubc2
Pusai1
Pupe4
Cabuen1
Cabuen2
Valrv1
UGuasc2
Utsig1
Utgua2
UTucdc1
PuSoltf1
Putab3
PaHibmao1
Paita1
AMNdpc2
1Silrb1
1Silrb2
AMNdpc1
Pabe1
Paprt1
Pagu1
Pasant1
0.2
Figura 14. Figura 14. Figura 14. Figura 14. Dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1978) mostrando as relações genéticas de 34 acessos de pupunha cultivada (var. gasipaes) e quatro acessos de pupunha silvestre (var. chichagui tipo 1 e 3) que compõem a Coleção Nuclear, mantidas no BAG de pupunha do INPA (Manaus, Amazonas, Brasil).
4.3 Parâmetros genéticos das populações 68
AMNdpm2
AMNdpm3
4.4. Relações entre raças e outras populações
As análises apresentadas neste estudo são consistentes com estudos anteriores que
utilizaram estas raças e populações de pupunha com diferentes marcadores moleculares
(RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004; ADIN et al., 2004; HERNANDEZ et al., 2008;
CRISTO-ARAÚJO, 2008).
O relacionamento entre as plantas, observado no programa Structure, e nos
dendrogramas das raças e populações [DAS e Nei (1978)] e dos acessos (Nei, 1978)
evidenciou a separação da raça Pará das demais, tornando esta raça a mais divergente de
todas. Estas mesmas análises revelaram sua associação às populações sintéticas do Alto Rio
Madeira [Plácido de Castro (Acre, BR) e Puerto Maldonado (PE)] e var. chichagui tipo 1
(Rio Branco, Acre), confirmada pelo maior fluxo gênico entre estas populações. A
associação entre Pará e o Alto Rio Madeira é similar ao encontrado por Cristo-Araújo
(2008), assim como os dendrogramas obtidos por Rodrigues et al. (2004a) e Hernandez et
al. (2008), que mostraram uma estreita relação entre Pará e var. chichagui tipo 1 (população
Acre). Mora Urpí (1980) e Rojas Vargas et al. (1999) sugeriram um fluxo gênico da região
do sudoeste da Amazônia (Acre, Rondônia e Bolívia) até a Amazônia Oriental, baseado em
similaridades morfológicas e estudos com isoenzimas, respectivamente, relações vistas aqui
entre os acessos de Pará e var. chichagui tipo 1. Como demonstrado no dendrograma dos
acessos, ambos acessos de var. chichagui tipo 1 posicionaram-se neste grupo, no entanto,
um acesso do Alto Rio Madeira (Puerto Maldonado, Peru) aproximou-se de uma acesso de
Pampa Hermosa.
Acessos da raça Putumayo tiveram um comportamento semelhante nos três
dendrogramas apresentados, exceto o acesso de Tabatinga. Em geral Putumayo apresenta
alguma relação com a raça Pampa Hermosa. A área de ocorrência de Putumayo e Pampa
Hermosa explica a relação, sendo apoiada pelo alto fluxo gênico observada entre estas
raças, que também foi o maior encontrado nestas análises. Também foi observada a
proximidade entre Putumayo e Cauca, o que faz muito sentido geograficamente, apesar da
barreira dos Andes.
Apesar das afinidades encontradas, a raça Pampa Hermosa apresentou-se isolada
nos dendrogramas, sugerindo ser diferente das demais raças possivelmente devido à seleção
contra espinhos, já que esta é uma população com alta freqüência de plantas inermes
4.4 Relações entre raças e outras populações 69
(MORA-URPÍ; WEBER; CLEMENT, 1997). Esta diferença é confirmada pela alta
divergência alélica encontrada nestes acessos, assim como o maior número de alelos
privados dentre as demais raças. A baixa taxa de endogamia também ajuda explicar a alta
diversidade da raça.
Como observado em estudos anteriores (RODRIGUES et al., 2004a; SILVA, 2004;
CRISTO-ARAÚJO, 2008), as populações da América Central não apresentaram estrutura,
confirmando a existência de apenas uma raça, como sugerido por Rodrigues et al. (2004a) e
em contraste com Hernández et al. (2008). Mesmo sendo composto por três raças, este
conjunto apresentou baixa heterozigosidade e polimorfismo. No dendrograma dos acessos
foi notada a inconsistência de um acesso de Guatuso (San Carlos, CR) próximo a um de
Pampa Hermosa (Santa Maria, PE), podendo ser resultado de algum erro no plantio, como
observado em outros estudos no BAG de pupunha. A aproximação de Utilis e Vaupés
requer cautela para propor uma justificativa, uma vez que Vaupés teve pouca
representatividade nestas análises. Assim como pode ser resultado de introgressão, devido à
proximidade geográfica, também pode ser um defeito na composição do plantio, visando o
fato da raça Utilis ter frutos do tipo mesocarpa e Vaupés ser macrocarpa.
Foi verificado nos dendrogramas a aproximação entre a raça da América Central e
as da Amazônia Ocidental, como descrito por Rodrigues et al. (2004a). Apesar de baixo, é
notável o fluxo gênico entres estas raças, sendo maior entre Utilis e Putumayo. Clement
(1986) sugeriu um fluxo gênico histórico ao longo do corredor entre estas áreas. Nesta
hipótese a pupunha primeiramente teria sido domesticada na Amazônia Ocidental para
depois ser introduzida na América Central. As divergências entre estas raças seriam
resultantes de uma deriva genética ao longo das migrações, que também possivelmente
sofreram introgressão de espécies afins já existentes na região, como as relatadas por Mora-
Urpí (1999) na Colômbia, Panamá e Costa Rica.
Nos agrupamentos formados no Structure, primeiramente Juruá mostrou-se bem
relacionado com as raças e populações amazônicas e ocidentais. O comportamento da raça
visualizada nos dendrogramas de populações mostrou inconsistências entre DAS e Nei
(1978), entretanto o dendrograma dos acessos mostra Juruá como uma raça bem
estruturada, confirmado pelo baixo fluxo gênico desta raça com as demais. No entanto,
4.4 Relações entre raças e outras populações 70
estes resultados necessitam de uma maior precisão, pois foram utilizados dez amostras da
raça.
As populações do Rio Ucayali mostraram-se próximas a Juruá e var. chichagui tipo 3
nos dendrogramas dos acessos, e o fluxo gênico entre as populações do Rio Ucayali e as
demais raças evidencia um relacionamento genético entre estas populações e raças, sendo
maior entre Putumayo e Pampa Hermosa. Cristo-Araújo (2008) também observou a
associação das populações do Rio Ucayali com as raças ocidentais, destacando que esse
posicionamento é consistente com a proposta de uma origem de pupunha no sudoeste da
Amazônia, como proposta por Rodrigues et al. (2004a).
As populações de B. gasipaes var. chichagui tipo 3 mostraram-se bem relacionadas a
pupunha cultivada da Amazônia Ocidental. Nos agrupamentos formados no Structure, os
acessos de var. chichagui tipo 3 ficaram no mesmo conjunto de Pampa Hermosa, Ucayali e
com alguns indivíduos de Juruá; este relacionamento é bem demonstrado nos
dendrogramas das populações e de acessos, evidenciando bem a proximidade desse
conjunto. Verificando o fluxo gênico também é possível observar o vínculo entre a
população silvestre tipo 3 e as populações cultivadas, sendo o maior fluxo com Pampa
Hermosa e Putumayo, provavelmente facilitado pela geografia das populações, embora
tenha sido um pouco menor com as populações do Rio Ucayali, que apresenta acessos da
mesma região (Pucalpa e Contamana, PE).
As raças cultivadas e populações silvestres (var. chichagui tipo 1 e 3) apresentam-se
bem relacionadas, indicando a existência de introgressão, como observado por Couvreur et
al. (2006) no Equador. A associação entre estes conjuntos de plantas já tinha sido notada
em outras análises [SILVA, 2004; CRISTO-ARAÚJO, 2008; SANTOS et al., (submetido)],
mostrando uma reduzida base genética entre as populações e uma estrutura dentro das
populações, apoiando a hipótese sugerida por Clement et al. (1987) e Rodrigues et al.
(2004a) de uma única origem. Rodrigues et al. (2004a) propôs duas vertentes de migração:
uma com a pupunha sendo levada do sudoeste da Amazônia à Amazônia Oriental; e a
outra com a pupunha sendo levada do sudoeste da Amazônia a América Central, via
Amazônia Ocidental. Esta hipótese é contraria à de Mora Urpí (1999) e Hernández et al.
(2008), que sugerem que a alta diversidade encontrada na pupunha cultivada é resultado de
uma origem polifilética.
4.4 Relações entre raças e outras populações 71
5. CONCLUSÃO
• Os 17 loci microssatélites utilizados nestas análises mostraram alto conteúdo
informativo, indicando a qualidade destes marcadores em estudos de diversidade e
estrutura genética em pupunheira;
• Os agrupamentos formados foram consistentes com muitas das análises anteriores,
tornando possível validar as raças Pará, Pampa Hermosa, Utilis e Juruá;
• Os dendrogramas das distancias genéticas das populações e acessos evidenciaram a
formação de dois grupos, sugerindo um processo de dispersão com duas vertentes: do
sudoeste da Amazônia até a Amazônia Oriental e do sudoeste da Amazônia para Amazônia
Ocidental até América Central, com diminuição de variabilidade no extremo norte dessa
dispersão;
• As populações silvestres e cultivadas apresentaram um estreito relacionamento
sugerindo a ocorrência de introgressão.
72
6. REFERÊNCIAS ABADIE, T. Construção de uma coleção nuclear de arroz para o brasil. Pesq. agropec. Pesq. agropec. Pesq. agropec. Pesq. agropec. brasbrasbrasbras., v. 40, n. 2, p. 129–136, 2005.
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6. Referências 82
APÊNDICE
Identificação dos acessos de pupunha utilizados neste estudo.
nº UFnº UFnº UFnº UFAMAMAMAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência
J 4 F - 0199-83.1 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 17 F - 0199-83.2 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 18 F - 0199-83.3 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 19 F - 0199-83.5 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 20 F - 0199-83.6 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 7 F - 0200-83.5 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 8 F - 0200-83.7 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 23 F - 0200-83.1 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 26 F - 0200-83.6 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) J 27 F - 0200-83.8 Juruá Cruzeiro do Sul (BR) B 8 P - 50.5 Pará Belém (BR)
B 19 P - 50.3 Pará Belém (BR) B 22 P - 50.1 Pará Belém (BR) B 30 P - 50.9 Pará Belém (BR) B 109 P - 50.4 Pará Belém (BR) B 76 F - 109-83.1 Pará Gurupá (BR) B 77 F - 109-83.3 Pará Gurupá (BR) B 78 F - 109-83.7 Pará Gurupá (BR) B 107 F - 109-83.5 Pará Gurupá (BR) B 108 F - 109-83.9 Pará Gurupá (BR) B 46 F - 0096-80.4 Pará Santarém (BR) B 47 F - 0096-80.5 Pará Santarém (BR) B 48 F - 0096-80.7 Pará Santarém (BR) B 49 F - 0096-80.8 Pará Santarém (BR) B 102 F - 0096-80.1 Pará Santarém (BR) B 67 F - 0098-83.2 Pará Parintins (BR) B 69 F - 0098-83.6 Pará Parintins (BR) B 105 F - 0098-83.4 Pará Parintins (BR) B 106 F - 0098-83.7 Pará Parintins (BR) B 97 F - 0096-83.8 Pará Itacoatiara (BR) B 98 F - 0096-83.2 Pará Itacoatiara (BR) B 99 F - 0096-83.9 Pará Itacoatiara (BR) B 103 F - 0096-83.4 Pará Itacoatiara (BR) B 104 F - 0096-83.7 Pará Itacoatiara (BR)
C 2 F - 0005-79.2 Cauca Buenaventura (CO)
Continua
continuação...
nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações ProcedêProcedêProcedêProcedência ncia ncia ncia
C 3 F - 0005-79.5 Cauca Buenaventura (CO) C 4 F - 0005-79.9 Cauca Buenaventura (CO) C 9 F - 0005-79.1 Cauca Buenaventura (CO) C 11 F - 0005-79.8 Cauca Buenaventura (CO) C 1 F - 0004-79.6 Cauca Buenaventura (CO) C 6 F - 0004-79.3 Cauca Buenaventura (CO) C 7 F - 0004-79.7 Cauca Buenaventura (CO)
G 04 L - 3M - 94.4 Guatuso San Carlos (CR) G 14 L - 3M - 94.3 Guatuso San Carlos (CR) G 16 L - 3M - 94.1 Guatuso San Carlos (CR) G 31 L - 3M - 94.2 Guatuso San Carlos (CR) G 32 L - 3M - 94.9 Guatuso San Carlos (CR) G 17 L - 5M - 94.6 Guatuso San Carlos (CR) G 22 L - 5M - 94.3 Guatuso San Carlos (CR) G 36 L - 5M - 94.4 Guatuso San Carlos (CR) G 37 L - 5M - 94.8 Guatuso San Carlos (CR) S 52 F - 0087-83.4 Solimões Coari (BR) S 53 F - 0087-83.6 Solimões Coari (BR) S 54 F - 0087-83.8 Solimões Coari (BR) S 55 F - 0087-83.9 Solimões Coari (BR)
S 131 F - 0087-83.7 Solimões Coari (BR) S 02 F- 0046-79.2 Solimões Tefé (BR) S 13 F- 0046-79.4 Solimões Tefé (BR)
S 125 F- 0046-79.1 Solimões Tefé (BR) S 126 F- 0046-79.3 Solimões Tefé (BR) S 127 F- 0046-79.6 Solimões Tefé (BR) S 69 F - 0066-83.4 Solimões Fonte Boa (BR) S 70 F - 0066-83.8 Solimões Fonte Boa (BR)
S 128 F - 0066-83.1 Solimões Fonte Boa (BR) S 129 F - 0066-83.3 Solimões Fonte Boa (BR) S 130 F - 0066-83.5 Solimões Fonte Boa (BR) D 15 F - 0204- 80.1 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 16 F - 0204- 80.4 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 17 F - 0204- 80.7 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 18 F - 0204- 80.8 Tuíra Cuenca del Canal (PA) D 29 F - 0204- 80.6 Tuíra Cuenca del Canal (PA) U 3 F - 0146-80.7 Utilis San Isidoro del General (CR) U 5 F - 0146-80.9 Utilis San Isidoro del General (CR) U 9 F - 0146-80.5 Utilis San Isidoro del General (CR) U 13 F - 0146-80.4 Utilis San Isidoro del General (CR)
Continua
continuação...
nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência
U 17 F - 0146-80.1 Utilis San Isidoro del General (CR) U-41 F-0209-80.1 Utilis Guapiles (CR) U-42 F-0209-80.4 Utilis Guapiles (CR) U-43 F-0209-80.6 Utilis Guapiles (CR) U-44 F-0209-80.5 Utilis Guapiles (CR) U 59 F-0209-80.2 Utilis Guapiles (CR) P 10 F - 0066-79.3 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 21 F - 0066-79.1 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR)
P 125 F - 0066-79.6 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 126 F - 0066-79.9 Putumayo Santo Antônio de Içá (BR) P 102 F - 0052-83.1 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 122 F - 0052-83.3 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 123 F - 0052-83.5 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 124 F - 0052-83.7 Putumayo Bemjamin Constant (BR) P 40 F - 0048-78.6 Putumayo Tabatinga (BR) P 41 F - 0048-78.5 Putumayo Tabatinga (BR) P 48 F - 0048-78.4 Putumayo Tabatinga (BR) P 49 F - 0048-78.7 Putumayo Tabatinga (BR) P 34 F - 0140 - 83.8 Putumayo Pebas (PE) P 35 F - 0140 - 83.2 Putumayo Pebas (PE)
P 127 F - 0140 - 83.4 Putumayo Pebas (PE) V-1 F-0211-84.3 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-2 F-0211-84.5 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-3 F-0211-84.7 Vaupés Rio Vaupés (CO) V-4 F-0211-84.4 Vaupés Rio Vaupés (CO)
V 14 F-0211-84.1 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 8 F - 0209-84.2 Vaupés Rio Vaupés (CO)
V 10 F - 0209-84.3 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 11 F - 0209-84.4 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 12 F - 0209-84.5 Vaupés Rio Vaupés (CO) V 13 F - 0209-84.7 Vaupés Rio Vaupés (CO) M 44 1 - P.1 População Híbrida Manaus (BR) M 45 1 - P.2 População Híbrida Manaus (BR) M 46 1 - P.6 População Híbrida Manaus (BR) M 47 1 - P.9 População Híbrida Manaus (BR) M 48 1 - P.3 População Híbrida Manaus (BR) I 53 F - 0121-83.2 População Híbrida Iquitos (PE) I 54 F - 0121-83.3 População Híbrida Iquitos (PE) I 55 F - 0121-83.5 População Híbrida Iquitos (PE) I 56 F - 0121-83.7 População Híbrida Iquitos (PE)
Continua
continuação...
nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência
I 57 F - 0121-83.9 População Híbrida Iquitos (PE) I 47 F - 0117-83.3 População Híbrida Iquitos (PE) I 49 F - 0117-83.5 População Híbrida Iquitos (PE) I 50 F - 0117-83.7 População Híbrida Iquitos (PE) I 51 F - 0117-83.8 População Híbrida Iquitos (PE) I 52 F - 0117-83.9 População Híbrida Iquitos (PE) Du 8 F - 0208-83.5 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 9 F - 0208-83.8 Raças não designadas Plácido de Castro (BR)
Du 21 F - 0208-83.3 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 22 F - 0208-83.6 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 23 F - 0208-83.1 Raças não designadas Plácido de Castro (BR) Du 5 F - 0188-83.1 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE)
Du 13 F - 0188-83.5 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 14 F - 0188-83.6 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 15 F - 0188-83.8 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 16 F - 0188-83.4 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 1 F - 0186-83.1 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Du 2 F - 0186-83.4 Raças não designadas Puerto Maldonado (PE) Hb 1 F - 0177-83.3 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 2 F - 0177-83.8 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 8 F - 0177-83.2 Raças não designadas Pucalpa (PE) Hb 9 F - 0177-83.4 Raças não designadas Pucalpa (PE)
Hb 10 F - 0177-83.5 Raças não designadas Pucalpa (PE) Du 7 F - 0197-83.7 Raças não designadas Contamana (PE)
Du 17 F - 0197-83.1 Raças não designadas Contamana (PE) Du 18 F - 0197-83.4 Raças não designadas Contamana (PE) Du 19 F - 0197-83.8 Raças não designadas Contamana (PE) Du 20 F - 0197-83.9 Raças não designadas Contamana (PE) E 06 F - 0205-83.1 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 07 F - 0205-83.4 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 08 F - 0205-83.7 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 09 F - 0205-83.9 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 42 F - 0205-83.6 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 10 F-0206-83.1 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 11 F-0206-83.2 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 12 F-0206-83.4 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 13 F-0206-83.8 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 14 F-0206-83.9 var. chichagui tipo 1 Rio Branco (BR) E 35 F - 0176-83.1 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 36 F - 0176-83.3 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE)
Continua
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nº UFAMnº UFAMnº UFAMnº UFAM nº INPAnº INPAnº INPAnº INPA Raças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/PopulaçõesRaças/Populações Procedência Procedência Procedência Procedência
E 37 F - 0176-83.4 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 38 F - 0176-83.5 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 39 F - 0176-83.7 var. chichagui tipo 3 Pucalpa (PE) E 40 F - 0194-83.2 var. chichagui tipo 3 Contamana (PE) E 41 F - 0194-83.6 var. chichagui tipo 3 Contamana (PE) Y 51 F - 0161 - 80.3 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 104 F - 0161 - 80.2 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 105 F - 0161 - 80.5 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 106 F - 0161 - 80.9 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 235 F - 0161 - 80.4 Pampa Hermosa Pampa Hermosa (PE) Y 54 F - 0168-80.2 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 56 F - 0168-80.4 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 57 F - 0168-80.5 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 236 F - 0168-80.3 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 237 F - 0168-80.8 Pampa Hermosa Rio Paranapura (PE) Y 50 F - 0174 - 80.9 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 100 F - 0174 - 80.5 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 101 F - 0174 - 80.6 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 238 F - 0174 - 80.1 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 239 F - 0174 - 80.3 Pampa Hermosa Santa Maria (PE) Y 241 F - 0195-80.6 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Y 242 F - 0195-80.8 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Y 243 F - 0195-80.9 Pampa Hermosa Lorenza (PE) Pz 1 F - 0236-84 Pastaza Pastaza
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