Relatório 1/2012

Relatórios técnicosSoft Tissues: Pé e Bisso

2013

GT343Controle do mexilhão-dourado:Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas.

I. Coleta e preparo de amostras

(página deixada em branco intencionalmente)

SOFT TISSUES: PÉ E BISSO

belo HoriZonte, 11 de noVembro de 2013

Este documento constitui um conjunto com três relatórios técnicos sobre o conjunto de tecidos moles do mexilhão-dourado, referentes ao Projeto “GT343 – Controle do Mexilhão-dourado: Bioengenharia e novos materiais para aplicações em ecossistemas e usinas hidrelétricas”, realizada durante os anos de 2012 e 2013.

relatÓrioS tÉcnicoS

3

Relatório técnicoSoft Tissues

2013

Através de uma rede que conecta empresas

e o governo, sob a liderança da Cemig,

o Centro de Bioengenharia de Espécies

Invasoras de Hidrelétricas busca soluções para

amenizar os impactos ecológicos, industriais e

econômicos causados por espécies invasoras. A

proliferação descontrolada destes organismos

acaba eliminando outras espécies nativas

e comprometendo atividades humanas que

dependem de recursos naturais, como agricultura,

pecuária e geração de energia hidrelétrica.

Por que o CBEIH foi criado?

A proliferação descontrolada destes organismos

acaba eliminando outras espécies nativas e com-

prometendo atividades humanas que dependem

de recursos naturais, como agricultura, pecuária e

geração de energia hidrelétrica.

Como o CBEIH funciona?

Atuando nas frentes de Bioengenharia, Modela-

gem e Monitoramento Ambiental, o CBEIH tem

por objetivo amenizar e combater os impactos

ecológicos, industriais e econômicos causados por

espécies invasoras.

Quem são os parceiros do CBEIH?

O CBEIH é o resultado de uma união entre o CETEC

e a Cemig, com a gestão financeira da Fundep.

Av. José Cândido da Silveira, 2000 Horto - Belo Horizonte (MG)

www.cbeih.org / [email protected]

centro de bioengenHaria de eSpÉcieS

inVaSoraS de HidrelÉtricaS (cbeiH)

4

Fig. A

Diagrama das áreas de atuação do CBEIH. Para saber mais, acesse www.cbeih.org.

Fig. B

Mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei) aderido ao substrato natural.

Esta espécie de molusco bivalve é invasora nos ecossistemas brasileiros e é causador de di-

versos problemas de ordem ecológica, econômica e social e tornou-se especialmente danoso

para o funcionamento das hidrelétricas.

B

A

UFMG | CENTRO DEMICROSCOPIA

LABORATÓRIO

MICROSCOPIA

PREVENÇÃO ECONTENÇÃO

CONTROLE EERRADICAÇÃO

CULTIVO DEMEXILHÕESCOLETA EM

CAMPO

EXPERIMENTOS

CONHECERESPÉCIE

bioengenharia

modelagem monitoramento

ÁREASDE RISCO

UHECEMIG

DIVULGAÇÃOCIENTÍFICA

CONVERGIRPESQUISADORES

MODELOS DEDISTRIBUIÇÃO

ÁREASINFESTADAS

comunicaçãocientífica

base colaborativade dados

WEBSITE

O mexilhão-dourado (Limnoperna fortunei), molusco bivalve da família Mytilidae, é originário dos dois maiores

rios da China, o Yantsé e o Pearl. Introduzido no Japão e em Hong Kong, foi disseminado por grande parte

do sudeste asiático. Possui características de colonizador invasivo bem sucedido: curto período de vida,

crescimento acelerado, altas taxas de fecundidade e ampla tolerância fisiológica aos fatores abióticos.

Sua introdução no continente sul americano se deu provavelmente na água de lastro de navios cargueiros.

Observado inicialmente na Argentina em 1991 (Pastorino et al 1993), entra no Brasil pelo rio Paraguai, na

região do Pantanal, em 1998 (Oliveira et al 2003). Segundo Barbosa (2009), a competição com as comunidades

nativas, a diminuição da turbidez da água, alterações na ciclagem de nutrientes, redução do fitoplâncton e o

aumento das macrófitas aquáticas foram alguns dos problemas que surgiram com a introdução do mexilhão-

dourado no ecossistema. Além desses fatores relacionados à ecologia, esse bivalve tem uma importância

econômica muito grande para o país. Ele obstrui tubulações e motores de usinas hidrelétricas, adere às

grades que permitem a passagem de água e reduz o fluxo da mesma. Os custos anuais para a remoção de

tais animais são muito elevados e cerca de R$ 10 milhões de reais já foram investidos em pesquisas pela

Cemig (PASINI, M., 2011).

introdUÇÃo

1

Fig. 1 - Mexilhão-dourado jovem (3mm) com o pé exposto (imagem obtida com Lupa óptica). O pé se revelou uma importante estrutura na constituição do bisso

6

Inicialmente, o projeto propôs estudos compartimentalizados de cada estrutura componente do organismo

Limnoperna fortunei. Porém, na medida em que avançamos na compreensão destas estruturas, a relação

intrínseca entre estas se mostrou patente. Impossível compreender a construção do bisso como estrutura isolada;

sem relacioná-la à organização cito-histológica do pé e as propriedades morfo-fisiológicas deste, perde-se todo o

vasto universo de informações definidas pelo contexto. Da mesma forma, o pé conecta-se ao sistema muscular e

nervoso do mexilhão dourado, atuando não só como membro locomotor (como o nome “pé” sugere) mas também

como órgão táctil, cuja sensibilidade aos estímulos físicos e químicos funciona como interface sensória entre o

organismo e o meio ambiente. Estes estudos também revelaram o papel fundamental desta estrutura na formação

do bisso: através de um canal na porção ventral do pé encontra-se um canal por onde migram secreções mucosas

ali produzidas para que seja formado o bisso.

Assim, frente aos resultados parciais do projeto, e às mais recentes pesquisas em âmbito internacional, o CBEIH

optou por dividir o mexilhão dourado em duas grandes categorias de materiais:

• SOFT TISSUES: termo utilizado na Engenharia de Materiais e de Tecidos para designar aqueles

tecidos orgânicos tidos como “macios”, devido à sua constituição, organização e à acentuada

presença de água. No caso do mexilhão-dourado, soft tissues compreende pé (e naturalmente

o bisso), tecido muscular, nervoso, brânquias, gônadas, glândulas, tecidos de armazenamento e

metabolismo, etc.

• HARD TISSUES: como esperado, abrange aqueles tecidos cuja composição se dá,

majoritariamente, por componentes biomineralizados, como fosfato de cálcio, carbonato de

cálcio, derivados do silício, do ferro, etc. No mexilhão-dourado, essa categoria é representada

pela concha, composta quase exclusivamente por polimorfos de carbonato de cálcio (calcita e

aragonita), organizados em camadas com diferentes organizações arquitetônicas. Entretanto,

é importante ressaltar, que mesmo dentro da categoria hard tissues, encontramos, em

porcentagens pequenas (1 a 5%) matriz orgânica, composta principalmente por água (na forma

de géis) e proteínas. A matriz orgânica atua como scaffold, onde a matriz mineral é depositada

por meio de processos celulares e físico-químicos.

A importância deste estudo reside no fato de que compreendendo a relação e a atuação das estruturas, estudos

posteriores podem buscar estratégias efetivas para controlar processos como o de adesão, e interromper o

biofouling por L. fortunei.

7

FormaÇÃo e conStitUiÇÃo do biSSo

2

Fig. 2 - Filamentos de bisso observados através de microscopia óptica.

Os membros da família Mytilidae são capazes de secretar uma estrutura chamada bisso, estrutura de

fixação formada por um apêndice muscular conhecido como pé (BRAZEE e CARRINGTON, 2006).

Dentre várias possibilidades, o processo de formação do bisso mais bem aceito, foi proposto, inicialmente,

por Brown, em 1952, para o mexilhão Mytilus edulis. Porém, avanços na Ciência dos Materiais, somados

auma compreensão aguçada dos mercanismos biológicos, proporcionam um ponto de vista inovador, onde

os processo são observados e inferidos no contexto ambiental e orgânico. As estruturas fazem parte de um

todo, e funcionam em consonância neste; uma ótica reducionista limitaria a apreensão desse todo.

Percebemos, hoje, que a produção do bisso é um processo complexo, onde processos menores acontecem

simultaneamente em locais distintos do pé. E que esses processos menores também são desencadeados

em etapas, reguladas por mecanismos físicos (tensão superficial, diferença entre densidades, polaridade) e

químicos (ação enzimática, polimerização, oxi-redução, etc.).

8

O bisso é um conjunto de polímeros secretados pelas glândulas do pé, e pode ser divido em três partes:

uma raiz fibrosa ligada aos músculos retratores do bisso; uma haste que se extende da raiz, composta por

bainhas sobrepostas; emaranhados fibrosos que se projetam individualmente de cada bainha. Os fios de

bisso, por sua vez, são produzidos na canaleta ventral do órgão podal do mexilhão. Eles são compostos

por um eixo interior flexível de colágeno revestido por uma proteína polifenólica curada e endurecida,

que compõe a cutícula bissal. Acredita-se que a proteína em questão envolva um processo de quinona-

tanagem com uma enzima catecol oxidase específica. O tipo proteico depende do gênero e da espécie

do animal, por exemplo, a Mefp-1 (Mytilus edulis foot protein-1) para o mexilhão-azul, Mytilus edulis,

e a Lffp-1 (Limnoperna fortunei foot protein-1) para o mexilhão dourado Limnoperna fortunei (BROWN,

1952; SILVERMAN, ROBERTO, 2007). Todo o conjunto é coberto por uma cutícula polimérica que evita a

degradação por fungos e bactérias. A adesão entre o bisso e o substrato se dá em escala nanométrica, por

interações do tipo capilaridade e forças de van der Waals (MEYERS, 2009), permitindo que o mexilhão se

fixe em praticamente qualquer substrato sólido, de pedras, troncos e conchas de outros moluscos a cascos

de barco, redes de pesca e placas de vidro.

Amygdalum (pearly-mussels) (a)

Arcuatula (bag-mussels) (b)

Austromytilus (beaked-mussels) (c)

Brachidontes (mussels) (d)

Gibbomodiola (horse-mussels) (e)

Gregariella (mussels) (f)

Limnoperna (mussels) (g-i)

Modiolus (horse-mussels) (j)

Musculus (mussels) (k-l)

Mytilus (mussels) (m)

algUnS gÊneroS de molUScoS pertencenteS

À FamÍlia mYtilidae

4

3

Fig. 4 - Alguns gêneros de moluscos da família Mytilidae.

FONTE: www.molluscsoftasmania.net / Copyright Simon Grove

Fig. 3 - Mexilhão-azul Mytilus edulis

FONTE: www.wikipedia.com.br

9

1.0 mm5

Fig. 5 - Pé do mexilhão-dourado com bissos em sua base (MEV, 50X)

Unidade i

Coleta e Preparo de Amostras

• Coletar e manter, em laboratório de cultivo, indivíduos saudáveis,

para realização períódica de testes diversos;

• Coletar amostras de bisso para a realização de análises estruturais,

de composição, de natureza físico-química e biológica;

• Coletar e preparar amostras de pé, com todas as estruturas

preservadas e fixadas por diferentes técnicas, para observação;

• Produzir artigos e relatórios para publicação em periódicos

especializados e divulgação científica.

obJetiVoS

12

6 Mexilhão aderido ao substrato natural.

13

COLETA E MANUTENÇÃO DOS INDIVíDUOS

A coleta se dá periodicamente, durante as atividades de monitoramento, nas represas das UHE de São Simão

e Volta Grande. Os indivíduos encontrados em substratos diversos (bóias de sinalização, pedras e estruturas

de concreto) são retirados manualmente, por raspagem com espátula ou arranque, de forma a preservar, o

quanto possível, os agregados de organismos. Estes agregados são imediatamente lavados no mesmo local de

coleta, a fim de retirar o restante de substrato acumulado entre os indivíduos. A metodologia utilizada implica

na destruição de muitos fios de bisso, mas quantidade suficiente é preservada ao manter os agregados.

Os mexilhões são então acomodados em caixas plásticas aeradas, contendo água do local da coleta. Para

aumentar a taxa de sobrevivência dos mexilhões durante a viagem de volta ao CETEC (Belo Horizonte, MG), a

temperatura da água é reduzida pela adição de escamas de gelo. O objetivo é reduzir as taxas metabólicas dos

organismos transportados, diminuindo a liberação de metabólitos na água e o estresse relacionado à remoção

e o transporte.

mÉtodo

Fig. 6 e 7 - Os mexilhões-dourados são coletados em substratos artificiais e naturais, como bóias de navegação (Fig. 6) e paliteiros (Fig. 6).

876

9

Fig.9

Alimentação dos Mexilhões por técnico de

laboratório capacitada.

Fig. 10

Aquários de cultivo da espécie. 10

No CETEC, os mexilhões são novamente lavados e

distribuídos em aquários previamente preparados,

com água declorada, temperatura aproximada de

19 oC e pH semelhante àquele do ambiente natural

onde foram coletados. O laboratório é monitorado

a fim de manter as propriedades físicas da água

semelhantes àquelas encontradas na natureza.

O bisso produzido pelos mexilhões-dourados

nos aquários também foi utilizado nos referidos

testes e apresentou, por motivos desconhecidos,

diferenças significativas na cor, espessura e

resistência à tração.

Os mexilhões foram mantidos em aquário no

laboratório de cultivo do CBEIH e alimentados

com ração e algas, com aeração constante e

temperatura controlada.

15

a partir da experiÊncia adQUirida no cUltiVo em laboratÓrio do mexilHÃo-doUrado

neSte p&d, Foi elaborado Um proJeto de laboratÓrio de cUltiVo aUtomatiZado, capaZ de

oFerecer condiÇÕeS ainda melHoreS para oS experimentoS Já realiZadoS pelo cbeiH, alÉm

de permitir QUe noVoS experimentoS QUe medirÃo, por exemplo, a inFlUÊncia do FlUxo, do

material daS tUbUlaÇÕeS e doS SUbStratoS na FixaÇÃo do mexilHÃo-doUrado.

16

17

11

12 13

Fig. 11, 12 E 13 - Mexilhões-dourados jovens, com pé e outros tecidos moles expostos, vistos por meio de Lupa óptica.

18

SELEÇÃO DE ANIMAIS E RETIRADA DO BISSO

Foi realizada uma seleção aleatória para a dissecação, processo que consiste na abertura das valvas e retirada do

bisso. Com o auxílio de um bisturi, duas seringas e também uma pinça para a abertura da concha do animal, foi

possível coletar 14 bissos inteiros; essas amostras foram colocadas em tubos eppendorf de 1,5ml, identificadas e

refrigeradas. Alguns bissos foram retirados de animais vivos, outros de animais mortos e alguns foram coletados

de emaranhados soltos no aquário. Esse processo não alterou na qualidade das amostras selecionadas. Iniciou-se

então a observação das amostras na Lupa - Estereomicroscópio Motic - para a verificação da integridade e nível de

limpeza das 14 amostras.

COLETA DE BISSO E TECIDOS MOLES

Várias amostras de bisso foram utilizadas nos testes realizados. Fios de bisso preservados produzidos em condições

naturais foram coletados nos animais trazidos de campo. Quando comparados qualitativamente com os fios de bisso

produzidos em laboratório, o bisso produzido em condições naturais se mostra mais escuro e mais resistente, com

maior diâmetro na secção transversal do fio.

Em laboratório, dois métodos de coleta de bisso foram empregados: o primeiro consistiu em coletar amostras

produzidas espontaneamente pelos organismos nos aquários. Nesse método, pode-se perder a placa adesiva ou

a raiz do feixe de bissos, já que a retirada do indivíduo se dá abruptamente, sem controle apropriado; o segundo

método empregou o uso de indivíduos aleatoriamente selecionados, depositados em béqueres aerados, cuja parede

foi coberta com lâminas de vidro, usualmente empregadas em microscopia ótica. O espaço limitado e a aeração

ostensiva acentuaram o comportamento padrão dos organismos mantidos em cativeiro, que tendem a se deslocar ao

longo das paredes dos aquários, fixando-se por meio dos bisso na linha d’água, preferencialmente perto do aerador.

PRESERVAÇÃO E FIXAÇÃO DAS ESTRUTURAS

Após a extração, os soft tissues foram fixados em solução de karnoviski ou glutaraldeído, desidratadas em banhos

sucessivos de álcool em diferentes concentrações. Os protocolos de produção e uso das soluções de fixação são

descritos nas páginas seguintes.

19

CONTAGEM DOS FIOS DE BISSO

Com as 14 amostras identificadas, foi realizada a contagem dos fios de cada bisso, com o auxilio de uma lupa, de

seringas para separar os fios e de água para mergulhar as amostras e retirar assim resíduos das estruturas. As 14

amostras foram contadas totalizando 4.402 fios, que foram separados em uma tabela pelos seguintes critérios:

1. fios inteiros: aqueles que estavam completos, ou seja, com placas adesivas e foram cortados bem próximos da

haste.

2. fios sem placa adesiva: aqueles que estavam arrebentados, porém não muito próximos à haste.

3. fios muito arrebentados: aqueles que estavam arrebentados próximos da haste.

Fig. 14

Fotomicrografia de fios do bisso, parte

próxima à haste. Pode-se visualizar a dis-

posição dos fios agrupados com diferentes

diâmetros.

Fig. 15

Fotomicrografia de fios do bisso, parte

próxima à placa adesiva. Pode-se visualizar

a disposição dos fios agrupados com dife-

rentes diâmetros.

14

15

20

A remoção e o protocolo de transporte possibilitaram a sobrevivência da grande maioria dos indivíduos

coletados. Assim, amostras variadas de bisso permaneceram viáveis mesmo após a viagem e o período de

adaptação aos aquários. Além disso, novas amostras de bisso foram produzidas no laboratório de cultivo. Os

indivíduos produzem bisso para se fixarem nos aquários, principalmente próximos à lâmina d’água e na região

do aerador, mas também produziram bisso em situações induzidas, dentro de béqueres previamente revestidos

com lâminas de microscopia.

conclUSÃo

21

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pdf/10126_2007_Article_9053.pdf> Acesso 05/02/2013

23

Centro de Bioengenharia de Espécies

Invasoras de Hidrelétricas | CBEIH.org

Equipe CBEIH

Expediente

Endereço

Av. José Cândido da Silveira, 2000

Horto - Belo Horizonte (MG)

Telefone: +55 31 3489 2320

Web: www.cbeih.org / [email protected]

Coordenador

Antônio Valadão Cardoso

Pesquisadores

Antônio Valadão Cardoso

Arnaldo Nakamura Filho

Arthur Corrêa de Almeida

Fabiano Alcísio e Silva

Gabriela Rabelo Andrade

Hélen Regina Mota

Hernan Roberto Espinoza Riera

Mônica de Cássia Souza Campos

Estagiários de Iniciação Científica

Anna Carolina Guañabens

Frederico Magalhães Vieira

Gabriel Cardoso Salgado

João Locke Ferreira De Araujo

Vinicius Sergio Rodrigues Diniz

Técnico de Laboratório

Kelly Carneiro de Souza Lima

Revisão: Arthur Corrêa de Almeida

Design Gráfico: Gabriela Rabelo Andrade

Data: Novembro de 2012

crÉditoS

Relatório técnicoSoft Tissues

2013

Piscicultura entre as UHEs Igarapava e Jaguara (MG)

54

anexo i

55

Protocolos

tampÃo FoSFato 0,2 mNo preparo da solução tampão deve-se atentar para o número de moléculas de água presente nos sais, caso

contrário a solução resultante apresentará molaridade incorreta.

SolUÇÃo a: FoSFato de SÓdio monobáSico a 0,2 m (baSeado no peSo molecUlar de prodUtoS merck)

(NaH2.PO4.H2O)............2,76 g/100 ml água destilada

ou

(NaH2.PO4.2H2O)...........3,12 g/100 ml água destilada

SolUÇÃo b: FoSFato de SÓdio dibáSico a 0,2 m

(Na2H.PO4.2H2O)...........3,56 g/100 ml água destilada

ou

(Na2H.PO4.7H2O)...........5,37 g/100 ml água destilada

ou

(Na2H.PO4.12H2O)..........7,17 g/100 ml água destilada

Misturar as soluções A e B (0,2 M), segundo a proporção da tabela a seguir, para obter o pH desejado.

tampÃo cacodilato 0,2 mBaseado no peso molecular de produto Sigma (160,0) sem moléculas de H

2O

Solução A: (0,2 M) Cacodilato de sódio 3,2 g

água destilada 100 ml

Solução B: (1,0 M) HCl concentrado (36-38%) 8,3 ml


Baseado no peso molecular de produto Serva ou Polysciences ou EMS (214,0) com 3 moléculas de H2O





pH (25° C) A (ml) B (ml) pH (25° C) A (ml) B (ml)5,8 92,0 8,0 6,8 51,0 49,0

5,9 90,0 10,0 6,9 45,0 55,0

6,0 88,0 12,0 7,0 39,0 61,0

6,1 85,0 15,0 7,1 33,0 67,0

6,2 81,5 18,5 7,2 28,0 72,0

6,3 77,0 23,0 7,3 23,0 77,0

6,4 73,5 26,5 7,4 19,0 81,0

6,5 68,0 32,0 7,5 16,0 84,0

6,6 62,5 37,5 7,6 13,0 87,0

6,7 57,0 43,0 7,7 10,0 90,0

56

SolUÇÃo Final (É a meSma para 2a e 2b):

Solução A 100 ml

Solução B até atingir pH 7,2 a 7,4

Para melhor preservação de membranas biológicas, pode-se adicionar CaCl2 na proporção de 10mM para solução

de tampão cacodilato a 0,2M.

Adiciona-se 0,147 g de CaCl2 (Sigma, PM 147,02 g) para cada 100 ml de tampão 0,2M

*ATENÇÃO: Cuidado ao manuseio do cacodilato. O mesmo contém aproximadamente 30% de arsênico por peso

(0=AsCH3-O-Na), de modo que seu manuseio deve ser feito com precaução, evitando-se a inalação do produto

ou seu contato com pele e mucosas. Evitar descarte na pia. Além disso, a reação de cacodilato com ácidos produz

gás arsênico. A exposição crônica ao arsênico pode causar dermatite, inflamação de mucosas, paralisia e

câncer de pele, fígado e pulmão.

paraFormaldeÍdo 10% para eStoQUe:

1. Adicionar 10,0 g de paraformaldeído em um Béquer e completar para 100mL de água destilada.

2. Aquecer solução em chapa quente sob agitação, até a temperatura de 60-65°C.

3. Quando a solução atingir a temperatura adequada, adicionar algumas gotas de solução NaOH 1,0M. Adicionar

gota a gota até que o paraformaldeído dissolva totalmente e a solução fique transparente.

4. Deixar a solução esfriar. Se necessário completar o volume final para 100mL com água destilada.

5. Filtrar solução.

6. Após resfriamento, congelar solução em tubos/garrafas sem ar à temperaturas menores que -15ºC.

*ATENÇÃO: Trabalhar em capela de exaustão durante toda preparação. O paraformaldeído é cancerígeno.

Observação: A solução estoque pode ser feita em outras concentrações.

Tampão 0,2 M (ml) 50 50 50 50 50

Aldeído glutárico 25% em solução aquosa (ml) 4 6 8 10 12

Água destilada (ml) até 100 100 100 100 100

Concentração final de aldeído glutárico 1% 1,5% 2% 2,5% 3%

glUtaraldeÍdo em tampÃo FoSFato oU cacodilato 0,1m

a) Prepare a solução tampão 0,2 M no pH desejado.

b) Prepare o fixador com:

· Se necessário, ajuste a osmolaridade com sacarose, glicose ou cloreto de sódio.

· Quando utiliza-se glutaraldeído a 50%, o volume a ser adicionado à solução deve ser reduzido à metade.

· Para maior contrastação de membranas celulares e de fibras colágenas e elásticas, pode-se acrescentar à

solução fixadora de glutaraldeído, no momento do uso, 1 a 2% de ácido tânico.

57

SolUÇÃo Fixadora de karnoVSkY modiFicado em tampÃo 0,1 m(2,5% glUtaraldeÍdo, 2% paraFormaldeÍdo)

•50mLdetampão(cacodilatooufosfato)0,2M

•5mLdeGlutaraldeído50%

•20mLdeParaformaldeído10%

•25mLdeáguadestilada

Misturar bem as soluções, alcançando volume final de 100 mL de volume final.

*ATENÇÃO:

•Aousartampãofosfato,nãosedeveadicionarCaCl2,poisformam-secristaisdefosfatodecálcio.

•Deve-seutilizarsoluçãodeparaformaldeídonascente(recém-preparada),

•Quandoaarmazenageménecessária,armazenarapenasasoluçãodeparaformaldeídoenãoasoluçãofixadora

completa.

SolUÇÃo Fixadora de karnoVSkY em tampÃo 0,1 m(paraFormaldeÍdo 4% e glUtaraldeÍdo a 5%)

•50mLdetampão(cacodilatooufosfato)0,2M

•10mLdeGlutaraldeído50%

•40mLdeParaformaldeído10%

Misturar bem as soluções, alcançando volume final de 100 mL de volume final.

tetrÓxido de ÓSmio (oso4)

Baseado no peso molecular de produto Sigma (160,0) sem moléculas de H2O





Baseado no peso molecular de produto Serva ou Polysciences ou EMS (214,0) com 3 moléculas de H2O





58

tetrÓxido de ÓSmio (oso4) redUZido

(por Ferrocianeto de potáSSio a 3% oU a 1,6%)

*ATENÇÃO: para maior contrastação de membranas celulares pode-se utilizar ósmio reduzido por ferrocianeto de

potássio a 3% ou a 1,6%.

•Prepararsoluçãodeferrocianetodepotássioa3%oua1,6%emisturar(somentenomomentodouso)na

proporção de 1:1 com solução tamponada de OsO4 a 2%, 0,2 M, pH 7.2-7.4.

•Oósmioreduzidoapresentacoloraçãomarromeapósafixaçãoomaterialadquiretonalidademarromescura,e

não negra como na fixação apenas com OsO4.

•Normalmentefixaromaterialpor30minutosa4ºC.

•Aassociaçãocomferrocianetotambémfavoreceapreservaçãodeglicogênio.

59

araldite

Misturar, na ordem:

Araldite 502 54 g

DDSA 46 g

DMP-30 2,5-3,0 g (Adicionar o acelerador no momento do uso)

* Agitar por 20 min, até que a mistura se torne homogênea.

Seleção e preparo daS amoStraS para meV e microScopia ótica

preparação de reSinaS

epon

•ApósaadiçãodeNMAedeDDSA,amisturadeveseragitadapor10-15minutos.

•ApósadiçãodeDMP-30,agitarpor20minutosouatéquetodoomeioadquiraaparênciahomogênea.

•NãoénecessáriocolocarDMP-30nafórmulautilizadanaprimeirainfiltração(comacetona)

OBSERVAÇÕES:

•MaiorproporçãodeDMP-30tornaosblocosmaisduros,mastambémmaisdifíceisdecortar.

•Lavetodaavidrariaeinstrumentosusadoscomacetona,imediatamentedepoisdeusá-los.

•Eviteaformaçãodebolhasdearduranteagitação.

Opção 1 (mais macia) Opção 2 (mais dura)

Epon 812 13 ml ou 15,4 g 25 ml ou 30,8 g

NMA 9 ml ou 10,1 g 17 ml ou 20,2 g

DDSA 8 ml ou 6,4 g 8 ml ou 12,8 g

DMP-30 0,6 ml (± 27-30 gotas) 32 gotas

60

SpUrr

VCD (polímero) 10,0 g

DER 736 (flexibilizador) 6,0 g

NSA (endurecedor) 26,0 g

DMAE (acelerador) 0,4 g

1. Adicionar o acelerador (DMAE) após misturar gentilmente, os três primeiros ingredientes. Agitar, sem formar

bolhas de ar, até ficar homogênea.

2. Usar meio completo para infiltração.

3. Colocar recipiente com meio pronto no dessecador, caso não vá utilizar imediatamente.

Observação: Pode-se obter meio Spurr com diferentes graus de consistência, variando a concentração de alguns

dos componentes:

* 3 horas na estufa a 70ºC.

Meio Duro Meio Macio Meio de Curagem Rápida*

VCD 10.0 10.0 10.0

DER 736 4.0 7.0 6.0

NSA 26.0 26.0 26.0

DMAE 0.4 0.4 1.0

61

inclUSÃo de material em araldite – inFiltraÇÃo cUrta

Fixação por perfusão ou imersão, de acordo com o objetivo

Fixação Karnovisky modificado

Lavagem em tampão fosfato/cacodilato 0,1M .............................................. 30 min (2x)

OsO4 2% : (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão ............................................. 1 hora

H2O destilada ............................................................................................. 5 minutos (3x)

Álcool 50% ............................................................................................. 10 minutos

Álcool 70% ............................................................................................. 15 minutos

Álcool 85% ............................................................................................. 15 minutos

Álcool 95% ............................................................................................. 15 minutos (2x)

Álcool absoluto ............................................................................................. 20 minutos (2x)

Acetona ............................................................................................. 20 minutos (2x)

1 Acetona : 1 Araldite (recipiente fechado) .............................................. 1 hora

1 Acetona : 3 Araldite (recipiente fechado) .............................................. 1 hora

1 Acetona : 4 Araldite (recipiente fechado) .............................................. Overnight

Araldite pura (recipiente fechado) .............................................................. 2 horas

Estufa 40°C ............................................................................................. 2 horas

Estufa 60°C ............................................................................................. 48 horas

reSina:

•54g(mL)resinaAraldite,no502

•46g(mL)DDSA–AnidroDodecenilsuccínico(endurecedor)

•2,5–3,0g(mL)BDMA–Benzildimetilamina(ouDMP-30)

ATENÇÃO: Não homogeneizar com o Becker aberto para evitar umidade

protocoloS de inclUSão em reSina

62

inclUSÃo de material em araldite – tecidoS animaiS e cÉlUlaS

Fixação por perfusão ou imersão, de acordo com o objetivo

Lavagem em tampão fosfato/cacodilato 0,1M ............................................................. 15-30 min (3x)

OsO4 2% : (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão (a 4ºC ou temperatura ambiente) ... 30-60 min

Álcool 35%........................................................................................................................ 10 minutos (2x)

Álcool 50%........................................................................................................................ 10 minutos (2x)

Álcool 70%........................................................................................................................ 10 minutos (2x)

Álcool 85%........................................................................................................................ 10 minutos (2x)

Álcool 95%........................................................................................................................ 10 minutos (2x)

Álcool absoluto ................................................................................................................ 10 minutos (3x)

Acetona............................................................................................................................. 20 minutos (2x)

1 Acetona : 1 Araldite (recipiente fechado).................................................................... 1 hora ou mais

1 Acetona : 3 Araldite (recipiente fechado)................................................................... Overnight

1 Acetona : 4 Araldite (recipiente fechado)................................................................... 1 hora ou mais

Araldite pura (recipiente fechado)................................................................................. 1 hora ou mais

Estufa 35°C (opcional).................................................................................................... Overnight

Estufa 45°C (opcional).................................................................................................... Overnight

Estufa 60°C..................................................................................................................... Overnight ou mais

Observação:

É aconselhado usar na infiltração tempos superiores a 1 hora (entre 4 a 8 horas) mantendo o tecido sob agitação

constante em aparelho giratório.

reSina:

54g (mL) resina Araldite, no 502

46g (mL) DDSA – Anidro Dodecenilsuccínico (endurecedor)

· 2,5 – 3,0g (mL) BDMA – Benzildimetilamina (ou DMP-30)


63

inclUSÃo de material em epon – tecidoS animaiS e cÉlUlaS

Fixação

Lavagem em tampão fosfato 0,1M.................................................................................. 15-30 min (3x)

OsO4 2%: (KFeCN 1,5%, opcional) em tampão (a 4ºC ou temperatura ambiente) .... 30-60 min

Álcool 35% ............................................................................................. 10 minutos (2x)

Álcool 50% ............................................................................................. 10 minutos (2x)

Álcool 70% ............................................................................................. 10 minutos (2x)

Álcool 85% ............................................................................................. 10 minutos (2x)

Álcool 95% ............................................................................................. 10 minutos (2x)

Álcool absoluto .............................................................................. .............. 10 minutos (3x)

Acetona ............................................................................................................. 20 minutos (2x)

2 Acetona : 1 Epon (recipiente fechado) ......................................................... 1 hora ou mais

1 Acetona : 1 Epon (recipiente fechado) ........................................................ 1 hora ou mais

1 Acetona : 2 Epon (recipiente fechado) ........................................................ Overnight

Epon puro (trocar de recipiente - fechado) .................................................... 1 hora ou mais

Estufa 40-45°C ................................................................................................ Mínino 1h

Estufa 60°C ...................................................................................................... 48 horas

reSina:


Opção 1 (mais macia) Opção 2 (mais dura)

Epon 812 13 ml ou 15,4 g 25 ml ou 30,8 g

NMA 9 ml ou 10,1 g 17 ml ou 20,2 g

DDSA 8 ml ou 6,4 g 8 ml ou 12,8 g

DMP-30 0,6 ml (± 27-30 gotas) 32 gotas

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coloração de corteS Semi-finoS com azUl de tolUidina/Borato de Sódio

01. Cortar secções semi-finas (entre 0,5 a 1 mm; cor violeta).

02. Pescar as secções com aro de metal, com pincel, bastão de vidro ou de madeira com ponta afilada.

03. Transferir para uma lâmina de vidro limpa contendo uma gota de água destilada.

04. Deixar secar completamente em chapa quente (58ºC aproximadamente).

05. Cobrir os cortes com uma gota grande do corante.

06. Aquecer na chapa até a borda da gota começar a secar (torna-se metálica).

07. Lavar em água e secar em chapa quente ou ao ar.

08. Montar em lamínula (opcional).

coranteS para corteS SemiFinoS

• Solução de Azul de ToluidinA/BorATo de Sódio

01. Dissolver 1g de borato de sódio em 99 ml de água destilada.

02. Acrescentar 0,5 g de azul de toluidina. Agitar.

03. Filtrar em papel de filtro.

04. Conservar em vidro escuro.

• Solução de Azul de MeTileno/Azur

Solução A: Tetraborato de sódio - 1%

Azul de Metileno - 1%

Solução B: Azur II - 1%

Misturar A + B na proporção de 1:1.

• Azul de ToluidinA/FucSinA BáSicA

Solução estoque 1: azul de toluidina a 1% em solução de borato a 1%.

Solução estoque 2: solução de borato a 1%

Solução estoque 3: fucsina básica a 0,1%

Aquecer água destilada a 100° C, misturar o corante e filtrar.

Modo de corar: Para o azul de toluidina, o modo usual descrito anteriormente e secar. Misturar partes iguais

das soluções estoques 2 e 3. Corar na chapa quente rapidamente, lavar e secar. Montar em meio Polymount

(Polysciences) que impede esmaecimento da coloração.

65

• ciTrATo de chuMBo

Reynolds, J. Cell Biology, 17:208 (1963)

a) Misture num balão volumétrico de 50 ml:

1,33 g de nitrato de chumbo Pb(NO3)2

1,76 g de citrato de sódio Na3(C6H5O7).2H2O

30 ml de água destilada isenta de CO2 (fervida e resfriada)

Para fazer água isenta de CO2, ferva água destilada por 10 minutos e tampe-a ainda quente.

b) Agite intermitentemente por meia hora (a solução torna-se leitosa). Junte então 8 ml de NaOH 1N (a solução

torna-se transparente). A soda deve ser fresca, isenta de CO2. Dilua até 50 ml com água isenta de CO2. O pH deverá

estar em torno de 12.0.

c) Tempo de coloração: 5 a 10 minutos.

OBSERVAÇÕES:

A solução de Reynolds deve ser filtrada (filtro milipore) ou centrifugada (15000 g por 5 minutos) antes do uso.

Não agite o corante no momento de usá-lo.

Procure pipetar apenas a parte central do líquido, evitando o contato da pipeta com os precipitados do fundo da

solução.

Na contrastação feita à base de citrato de chumbo (Reynolds) deve-se empregar pastilhas de NaOH (5 em média)

no recipiente de coloração, a fim de diminuir a precipitação causada pela formação de carbonato de chumbo em

contato com o CO2 atmosférico.

Utilize vidraria absolutamente limpa.

Evite respirar sobre os cortes ou corante no momento da coloração, o que poderia ocasionar a formação de

precipitados.

Mantenha os cortes protegidos da poeira durante a coloração.

Mantenha os vidros de corantes sempre fechados.

Retire toda a poeira do balcão antes de iniciar a coloração.

Renove a água destilada entre as duas etapas da coloração.

• AceTATo de urAnilA A 2%

M.L. Watson, J.B.B.C., 4: 475 (1958).

a) Faça uma solução a 2% de acetato de uranila com água destilada. Filtre e conserve em frasco escuro.

b) Tempo de coloração: 30-40 minutos à temperatura ambiente ou 8-10 minutos a 60 °C

66

• AceTATo de urAnilA A 8%

Inst. Anat., Mainz, Alemanha

a) Solução a 8% em água bidestilada. Filtre e conserve em frasco escuro.

b) Tempo de coloração: 5 minutos a temperatura ambiente.

OBSERVAÇÕES:

A solução de uranila deve ser filtrada no momento de uso.

Não agite o corante no momento de usá-lo.

Procure pipetar apenas a parte central do líquido, evitando o contato da pipeta com os precipitados do fundo da

solução.

Utilize vidraria absolutamente limpa.

Mantenha os cortes protegidos da poeira durante a coloração.

Mantenha os vidros de corantes sempre fechados.

Retire toda a poeira do balcão antes de iniciar a coloração.

Renove a água destilada entre as duas etapas da coloração.

• conTrASTAção coM urAnilA

01. Filtre algumas gotas da solução de uranila a 2% utilizando uma seringa com filtro millipore 0,22 µm e pingue

algumas gotas em uma placa de Petri forrada com parafilm.

02. Coloque cada tela sobre a gota de corante, com os cortes voltados para a mesma.

03. Cubra a placa com a tampa de vidro limpa e leve-a à estufa a 60 °C, por 8-10 minutos. Para vegetais, deixe 15

min.

04. Lave as telas em água destilada isenta de CO2, mergulhando a tela no Becker 20X.

contraStaÇÃo com citrato de cHUmbo

01. Coloque em uma placa de Petri previamente revestida com cera de dentista ou parafilm, 5 a 10 pastilhas de

NaOH e aguarde alguns segundos 02. com a placa tampada.

03. Filtre algumas gotas da solução de Reynolds, utilizando uma seringa com filtro millipore 0,22 µm e pingue

algumas gotas na placa de Petri.

04. Alternativamente, pode-se centrifugar a solução de Reynolds (15000 g por 5 minutos) antes de filtrá-la.

67

Relatórios Técnicos 2013: Soft Tissues

Gt343: controle do mexilhão-dourado:

Bioengenharia e novos materiais para aplicações em

ecossistemas e usinas hidrelétricas.

+55 31 3489-2320

www.cbeih.org

[email protected]

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Relatório 1/2012