Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP

Instituto de Química – IQBioquímica II – QG651

Módulo II: Carboidratos

Profª Ljubica TasicPEDS: Alessandra Prando

Fábio Henrique dos Santos Rodrigues

Aluno RAEduardo José Creatto 083454

Data do experimento: 6, 13 e 20 de Junho de 20111. Introdução

Carboidratos, também conhecidos como hidratos de carbono devido a formula empírica muito freqüente Cn(H2O)n, glicídios, glícidos, glucídeos, glúcidos, glúcides, sacarídeos , açúcares, ou hidratos de carbono , são as biomoléculas mais abundantes na natureza, constituídas principalmente por carbono, hidrogênio e oxigênio, podendo apresentar nitrogênio, fósforo ou enxofre em sua composição1. Os carboidratos, são mais simplesmente definidos como pollidroxialdeidos ou cetonas e seus derivados2.

Os monossacarídeos, também chamados de açúcares simples, consistem numa só unidade poliidroxialdeídica ou cetônica. O monossacarídeo mais abundante é o açúcar de seis carbonos D-glicose; é o monossacarídeo fundamental de onde muitos outros são derivados. A D-glicose é o principal combustível para a maioria dos organismos e o monômero primário básico dos polissacarídeos mais abundantes, tais como o amido e a celulose. Os polissacarídeos contem muitas unidades monossacarídicas unidas em longas cadeias lineares ou ramificadas. A maioria dos polissacarídeos possui unidades monossacarídicas repetitivas de uma única espécie ou de duas espécies alternadas2.

Entre as diversas funções atribuídas aos carboidratos, a principal é a função energética. Também atuam como elementos estruturais e de proteção na parede celular das bactérias, fungos e vegetais, bem como em tecidos conjuntivos e envoltório celular de animais. Agem como lubrificantes das articulações esqueléticas e fornecem coesão entre as células. Podem funcionar como sinalizadores celulares. Alguns carboidratos, como a ribose e a desoxirribose, fazem parte da estrutura de nucleotídeos e dos ácidos nucléicos1. Todos os monossacarídeos simples são sólidos, cristalinos, brancos e altamente solúveis em água devido seus grupos carbonilicos e alcólicos participarem de ligações de hidrogênio com esta, e insolúveis em solventes orgânicos apolares.

Todos os monossacarídeos, exceto a diidroxiacetona, contém um ou mais átomos de carbono assimétrico e, portanto, são moléculas quirais. Deve ser lembrado que D e L-gliceraldeídos são os compostos de referência para designar a configuração absoluta de todos os compostos estereoisometicos (Figura 1). A classificação D e L não possui ligação obvia entre d e l, de dextrorrotatório e levorrotatório, sendo estes baseados na rotação do plano da luz polarizada2.

L-gliceraldeído D-gliceraldeídoFigura 1: Estereoisômeros do gliceraldeído.

Os métodos cromatográficos têm revolucionado a arte de isolar, separar e identificar os açúcares e seus derivados. A cromatografia em papel e a cromatografia de camada delgada são as mais empregadas. Para maior separação e análise, as misturas de açúcares são cromatografadas em colunas de troca iônica na presença de ácido bórico em excesso, o qual transforma os açúcares neutros em seus boratos complexos, fracamente ácidos, e permite-lhes serem mais efetivamente separados com base na diferença de propriedades ácido-básicas. A estrutura desses complexos de borato não é conhecida com certeza; eles se dissociam facilmente, formando o açúcar livre e ácido bórico2.

2

A refratometria é muito utilizada para determinar a concentração de açúcar em um fluido, também conhecido por índice de Brix, em frutas, doces preparados, mel e outros alimentos, pela medida do índice de refração dessa substância3.

Como veremos, há também testes específicos para caracterização de carboidratos, como a reação do lugol, reação de Molish e reação com reagente de Fehling.

2. Parte Experimental2.1. Extração do Amido da Batata

Limpou-se 4 batatas medias e cortou-as em pedaços. Triturou-se as mesmas com o auxílio de um triturador elétrico. A pasta obtida foi transferida para um béquer de 800 mL previamente pesado. Adicionou-se 200 mL de água destilada e misturou-se com uma bagueta. Separou-se o amido suspenso na água, do dendrito, pela filtração com pano para outro béquer de massa conhecida. O filtrado foi retornado ao béquer contendo o amido e filtrado novamente. Este processo foi repetido 8 vezes. A última retirada de água foi feita com uma pipeta de Pasteur conectada a uma trompa d'água. Secou-se o amido em estufa e guardou-o em geladeira. Determinou-se a porcentagem de amido na batata.

2.2.Cromatografia em Camada Delgada (CCD)Aplicou-se em duas placas de alumínio cobertas com alumina na altura de 2 cm da

borda inferior, amostras de concentração 0,1 mol L-1 de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil-α-D-glicopiranosídeo. Utilizou-se como fase móvel uma mistura de n-butanol:ácido acético:éter de etíla:água na proporção de 10:2:3:1 (v/v/v/v). Deixou-se eluir por cerca de 40 min, após a eluição secou-se as placas ao ar e borrifou-se solução de ácido sulfúrico e deixou-as por 15 min em estufa a 110 ºC.

2.3.Reações de Caracterização de carboidratos Reação do Lugol: adicionou-se em um tubo de ensaio 2 mL de solução de amido

1% e 2 gotas de lugol (1 g de iodo e 5 g de KI em 100 mL de água). Aqueceu-se. E posteriormente resfriou-se.

Reação de Molish: adicionou-se em oito tubos de ensaio enumerados água destilada e as soluções 1 % de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil-α-D-glicopiranosídeo, respectivamente. Adicionou-se 1 mL do reagente de Molish (5 g de β-naftol em 100 mL de álcool etílico) em cada um dos tubos. A seguir, adicionou-se 2 mL de ácido sulfúrico concentrado a cada um todos tubos, deixando escorrer pela parede, de forma que os líquidos não se misturem.

Reação com Reagente de Fehling: enumerou-se oito tubos de ensaio e adicionou-se água destilada e as soluções 1 % de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil-α-D-glicopiranosídeo, respectivamente. Adicionou-se em cada um dos tubos 2 mL do reagente de Fehling (Fehling A: 34,6 g de sulfato de cobre pentahidratado em 1 L de água, Fehling B: 173 g de tartarato de sódio e 125 g de NaOH em 1 L de água) misturado. Deixou-os em banho fervente por 1min.

Hidrólise da Sacarose: Colocou-se em um tubo de ensaio 5,0 mL de da solução de sacarose (0,1 mol/L) e 1,0 mL de ácido clorídrico 3,0 mol/L. Colocou-se o tubo durante em banho de água fervente por 5 min. Resfriou-se e alcalinizou-se com 18 gotas de NaOH 6 mol/L. Adicionou-se 2,0 mL de Fehling. Aqueceu-se novamente o tubo por 1 min.

2.4.Hidrólise Ácida do Amido

3

Enumerou-se 10 tubos de ensaio e adicionou-se 5,0 mL de água destilada em cada um. Adicionou-se 30 mL de solução de amido 1% e 30 mL de ácido clorídrico 3 mol/L em um erlenmayer de 125 mL. Colocou-se o erlenmayer em banho de água quente, coletou-se imediatamente uma alíquota de 2 mL e transferiu-a para o tubo número 1. Após 4 min coletou-se outra alíquota de 2,0 mL e adicionou-se o tubo 2. O mesmo foi feito para os demais tubos. Após isto, adicionou-se 2 gotas de solução de lugol. A seguir alcalinizou-se o meio com 13 gotas de NAOH 6,0 mol/L e adicionou-se 2,0 mL da solução do reagente de Fehling em cada tubo. Aqueceu-se os tubos em banho de água fervente por 5 min.

2.5.Precipitação do AmidoA 5 mL de solução de amido adicionou-se 5 mL de solução saturada de sulfato de

amônio. Agitou-se fortemente e deixou-se em repouso por cerca de 20 min. Filtrou-se e determinou-se a presença de amido no filtrado e no precipitado pelo teste do lugol. A 1 mL de solução de amido adicionou-se 5 mL de álcool etílico, agitou-se e filtrou-se. Determinou-se a presença de amido no filtrado e no precipitado pelo teste do lugol.

2.6.D-Glicose do AmidoRessuspendeu-se o amido obtido em 100 mL de água e transferiu-se para o balão

de 500 mL. Adicionou-se HCl concentrado até obter concentração de 6 mol/L, e montar um sistema de refluxo com pedras de ebulição. Utilizou-se manta aquecedora e deixou-se o sistema em ebulição por 1 h. resfriou-se o hidrolisado em água corrente, e em seguida filtrou-se com carvão ativo. Os demais procedimento não puderam ser realizados por erros ocorridos.

3. Resultados e Discussão3.1.Extração do Amido da Batata

Amido é um polissacarídeo, sintetizado pelos vegetais para ser utilizado como reserva energética. Sua função, portanto, é análoga ao do glicogênio nos animais. Amido é uma mistura de dois polissacarídeos, amilose e amilopectina, cujos monômeros são a glicose.

A amilose é constituída de 250 a 300 resíduos de D-glicopiranose, ligadas por pontes glicosídicas α-1,4, que conferem à molécula uma estrutura helicoidal. A amilopectina, menos hidrossolúvel que a amilose, é constituída de aproximadamente 1400 resíduos de α-glicose ligadas por pontes glicosidicas α-1,4, ocorrendo também ligações α-1,6, que dão a ela uma estrutura ramificada. A amilopectina constitui, aproximadamente, 80% dos polissacarídeos do amido. Isto confere a baixa solubilidade do amido em água, que foi utilizada neste experimento para separar-lo do dendrito.

Com este procedimento pode-se determinar o teor de amido na batata de 10,65% (m/m), bem próximo do valor de 13% encontrado na literatura [4]. O menor valor encontrado sugere que o método falha ao extrair totalmente o amido do tubérculo.

3.2.Cromatografia em Camada Delgada (CCD)A cromatografia em camada delgada baseia-se na afinidade entre as moléculas do

analito e do solvente. A mistura de solventes utilizada como fase móvel apresenta-se majoritariamente apolar, assim, espera-se que os carboidratos cuja estrutura seja apolar percorra maior distância e apresente maior Rf. As duas corridas realizadas encontram-se em anexo, a ordem de aplicação foi, da esquerda para a direita, sacarose, xilose, lactose, glicose, frutose, metil-α-D-glicopiranosídeo e amido. Os Rf's encontrados para cada molécula encontram-se na Tabela 1.

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Tabela 1: Dados da cromatografia em camada delgada.Molécula RfSacarose 0,05

Xilose -

Lactose 0,05

Glicose 0,34

Frutose 0,34metil-α-D-glicopiranosídeo 0,41

Amido 0,00

Os resultados obtidos podem ser explicados pela estrutura de cada molécula, como mostrado a seguir. Não se sabe o que houve com a amostra de xilose, que aparentemente não foi revelada. Já o amido não eluiu pelo seu tamanho.

Sacarose Xilose Lactose

Glicose Frutose metil-α-D-glicopiranosídeo

Amido

2.5.Reações de Caracterização de carboidratos Reação do Lugol: o lugol ou solução de Lugol é uma solução de I2 em equilíbrio

com KI em água destilada. Foi nomeada em honra ao médico francês J. G. A. Lugol. O iodeto de potássio é adicionado para aumentar a solubilidade do iodo por formação do ânion triatômico I3

- [5]:

I 2 + I− → I 3−

Com o amido a coloração típica é o azul escuro, resultante da incorporação do triiodeto a hélice de β-amilose, como mostrado na Figura 2.

5

a) b)Figura 2: Milhares de moléculas de glicose polimerizam-se para formar moléculas

imensas de β-amilose, como mostrado esquematicamente em a). Em b) é apresentado um esquema em que a espécie de iodo I3

- é incorporada a hélice de amilose [6].

Observou-se que ao adicionar o lugol a solução ficou azul intensa, resultado da interação do triiodeto com o amido. Ao aquecer-se a solução, esta ficou amarelada. Isto ocorre, pois o aquecimento abre a estrutura helicoidal do amido, liberando o íon I3

-, perdendo assim sua coloração característica. Ao resfriar-se novamente, a estrutura é fechada com adsorção da espécie de iodo, retomando sua coloração inicial.

Reação de Molish: os monossacarídeos podem ser facilmente desidratados por ação de ácidos fortes concentrados, como o ácido sulfúrico. O ácido rompe facilmente as ligações glicosídicas presentes em moléculas de polissacarídeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacarídeos. Esses, por sua vez, são desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacarídeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF são substâncias incolores, impedindo que a reação seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenólico ao meio, o β-naftol. Este reage com os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de coloração lilás, como mostrado na Figura 3.

6

Figura 3: Esquema reacional da Reação de Molish7.

A Tabela 2 apresenta os dados encontrados neste teste.

Tabela 2: Resultado da Reação de Molish.Conteúdo Fase inferior Interface Fase superior

Água IncolorAnéis amarelo e

brancoAmarelada

Glicose IncolorAnéis amarelo, preto e branco

Amarelada

Lactose IncolorAnéis preto e

cinzaAmarelada

Sacarose CastanhoAnel castanho e

precipitado amarelo

Amarelada

Amido IncolorAnéis amarelo e

pretoPrecipitado branco

coloidal

Xilose IncolorAnéis castanho, violeta e branco

Amarelada

Frutose IncolorAnéis castanho e

brancoAmarelada

metil-α-D-glicopiranosídeo

IncolorAnéis verde e

brancoAmarelada

Comparando-se os resultados com o branco, não vemos claramente a coloração violeta, apenas para a xilose, porém, as colorações castanha, verde, preta e etc, servem também como resultados positivos, como era de se esperar.

Reação com Reagente de Fehling: a solução de Fehling, também chamada de reagente de Fehling, é uma solução desenvolvida pelo químico alemão Hermann von Fehling, usada para se diferenciar entre os grupos funcionais cetona e aldeído, muito aplicada a carboidratos. A solução a ser testada é aquecida junto com a solução de Fehling; um precipitado de cor vermelha indica a presença de um aldeído. As cetonas não reagem. A reação é dada por8

R−CHO⏟aldeído

+ 2CuOunderbracealignc reagente ¿⏟de ¿

Fehling ¿¿ Δ⃗ R−COOHunderbracealignc ácido ¿⏟carboxílico ¿

¿ + Cu2O↓underbracealignc óxido cuproso ¿⏟( ppt vermelho ) ¿

¿¿

7

Apenas as soluções de amido, xilose e metil-α-D-glicopiranosídeo não apresentaram o precipitado vermelho, inclusive o branco. Assim, confirma-se que estas não apresentam grupamento aldeído disponível para a oxidação, enquanto as demais amostras são aldoses. O amido, apesar de conter glicose em sua estrutura, não apresenta resultado positivo para o teste pois seu grupo aldol está associado a outra molécula no polímero, impossibilitando a reação. A solução de sacarose apresentou coloração castanha mesmo não tendo grupos aldeídos livres, indicando contaminação desta.

Hidrólise da Sacarose: como dito, carboidratos podem ser hidrolisados por ácidos fortes, neste caso o ácido clorídrico. A hidrólise acida da sacarose gera glicose e frutose. Dessa forma o teste de Fehling após a hidrólise deve apresentar resultado positivo para aldeído devido a presença dessas carboidrato livres para a reação de oxidação.

3.4.Hidrólise Ácida do AmidoDa mesma forma como para a sacarose, o amido também pode sofrer hidrólise

ácida, liberando neste caso, apenas moléculas de glicose. Após a adição do lugol, as soluções de menor tempo reacional apresentaram coloração azul bastante intensa, como observa-se no anexo. Clareando até a coloração características do lugol na ausência de amido. Isto indica grande concentração de amido no inicio da reação, e consumo total deste após os 40 min de reação. A adição do reagente de Fehling seguida de aquecimento gerou precipitado vermelho apenas nos tubos de ensaio a partir do número 6. Neste caso, este teste comprova a hidrolise do amido observando a presença de glicose que foi oxidada gerando o óxido cuproso.

3.5.Precipitação do AmidoOs resultados mostraram que a solução saturada com sulfato de amônio precipita o

amido, porém, segundo o teste do lugol indicado pela coloração azul, ainda há amido na solução após filtrada. O sulfato de amônio induz a precipitação do amido devido o aumento da forma iônica, de acordo com o observado pela série de Hofmeister.

Por sua vez, o etanol induz a precipitação pois este interage fortemente com a água, levando a ausência de moléculas de água na solvatação do amido, resultando na sua precipitação. Precipitação esta muito mais eficaz que a do sulfato de amônio, não havendo presença de amido na solução após filtração, como indicado pelo teste do lugol.

3.6.D-Glicose do AmidoNovamente, neste procedimento deseja-se hidrólise do amido, para a obtenção da

D-glicose. Contudo, o aquecimento da mistura reacional foi realizado com manta de aquecimento, provocando a degradação do amido como evidenciado pela coloração preta obtida. Neste caso, o ideal seria promover um aquecimento de forma mais branda pela utilização de banho de água fervente. Na sequência da hidrólise, a D-glicose seria cristalizada e seu teor no amido determinado.

4. ConclusãoNeste experimento pudemos extrair o amido presente na batata por um processo

simples, utilizando apenas água e filtração, baseando-se na baixa solubilidade do amido. Pode-se também determinar a porcentagem deste na batata, com excelente acordo com o encontrado na literatura. Foi realizada também uma cromatografia de

8

camada delgada de diversos carboidratos, onde pode-se relacionar seu tamanho e polaridade as distâncias por estes percorridas.

Reações de caracterização de carboidratos também foram estudadas. Verificou-se a aplicação da reação do lugol na identificação de amido; reação de Molish na identificação de carboidratos em geral; e da reação com reagente de Fehling para identificação de aldoses e cetoses.

Por fim, estudou-se a hidrólise ácida do amido, e a utilização de sulfato de amônio ou etanol na precipitação do mesmo, onde este último apresentou maior eficácia.

5. Referências[1] http://pt.wikipedia.org/wiki/Carboidrato, acessado em 19/06/2011 às 03:15;[2] Lehninger, A. L. Bioquímica; tradução da 2ª edição americana. São Paulo, Edgard

Blücher, 1976, vol. 1 Componente moleculares das células, pg. 109-124;[3] http://pt.wikipedia.org/wiki/Refract%C3%B3metro, acessado em 20/06/2011 às

20:35;[4] http://w3.ufsm.br/ppgcs/congressos/Fertbio2004/Fs356.pdf, acessado em

20/06/2011 às 21:21;[5] http://pt.wikipedia.org/wiki/Lugol, acessado em 20/06/2011 às 23:08;[6] Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, J.; Crouch, S. R. “Fundamentos de Química

Analítica”, Tradução da 8ª edição norte-americana, São Paulo: Thomson Learning, 2007,pg 531-532,541

[7] http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/molisch.htm, acessado em 21/06/2011 às 15:44;

[8] http://pt.wikipedia.org/wiki/Solu%C3%A7%C3%A3o_de_Fehling, acessado em 22/06/2011 às 21:28.

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Anexos

Cromatogramas

Hidrólise Ácida do Amido

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