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R E L A T Ó R I O D E E S T Á G I O
P R O F I S S I O N A L I I
CÁTIA VANESSA DIAS RESENDE
RELATÓRIO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE LICENCIADO EM FARMÁCIA
julho | 2014
Escola Superior de Saúde
Instituto Politécnico da Guarda
CURSO FARMÁCIA - 1º CICLO
4º ANO / 1º SEMESTRE
RELATÓRIO DE ESTÁGIO PROFISSIONAL II
CÁTIA VANESSA DIAS RESENDE
ORIENTADORES E SUPERVISORES: PROFESSOR MAXIMIANO RIBEIRO
E PROFESSORA PAULA COUTINHO
julho|2014
Escola Superior de Saúde
Instituto Politécnico da Guarda
SIGLAS
BSA – Albumina sérica de bovino
LES – Lúpus Eritematoso Sistémico
SLC – Sistemas de Libertação Controlada
ABREVIATURAS
g – gramas
mg – miligramas
mL – mililitros
µL - microlitros
Dedico este trabalho a todos aqueles que nunca duvidaram das minhas capacidades e me
apoiaram, ao longo de todo o percurso, nos momentos positivos e menos positivos,
incentivando sempre um passo firme em direção ao futuro.
Agradeço, de forma especial, ao professor Maximiano Ribeiro e à professora Paula Coutinho
pela amabilidade, disponibilidade, compreensão, empenho e, especialmente, pela orientação e
paciência tidos durante o período de estágio e que contribuíram pela maior motivação no
desenvolver de todos os processos que o trabalho laboratorial exigiu.
Agradeço, de igual forma, aos restantes professores e comunidade escolar pelo interesse
demonstrado pelo projeto, pela curiosidade despertada, pelo empenho quando alguma
dificuldade surgia e pelo otimismo sempre transmitido.
A todos, MUITO OBRIGADA!
“Nada se manifesta à mente humana, se esta não começa por mostrar-se acessível ao
conhecimento que generosamente se apresenta à sua investigação.”
Carlos Bernardo González Pecotche
RESUMO
Este trabalho tem como objetivo primordial a produção de um sistema de libertação
controlada de fármacos com base em polímeros naturais com potencial utilização na
libertação de fármacos a nível intestinal e na libertação de fármacos em locais alvo. Um
sistema de libertação promissor são as micropartículas. Este foi o sistema escolhido para o
tratamento do lúpus.
Foram sintetizadas micropartículas de alginato e micropartículas de alginato revestidas
com quitosano. Ambas as partículas tinham encapsulada albumina sérica de bovino (BSA) –
proteína modelo.
Foi determinada a percentagem de encapsulação da BSA nos dois tipos de
micropartículas e avaliado o perfil de libertação da proteína in vitro. Para isso, procedeu-se à
elaboração de uma solução que simula-se o pH gástrico e outra que simula-se o pH entérico.
A quantificação de proteína libertada e encapsulada foi realizada pelo método de Bradford.
Depois dos testes de solubilidade efetuados e da verificação da proteína libertada, concluiu-se
que as micropartículas alginato/quitosano apresentam um melhor sistema de libertação
controlada, uma vez que as micropartículas de alginato apresentaram uma taxa de eficácia de
67,88% (ou seja, libertou-se 1,88mg de 2,77mg de BSA) e as micropartículas de
alginato/quitosano apresentaram uma taxa de eficácia de 74,93% (ou seja, libertou-se 3,08mg
de 4,12mg de BSA).
Este estudo serviria de modelo para a síntese de micropartículas que encapsulassem
fármacos com inúmeros efeitos secundários indesejáveis utilizados no tratamento do lúpus.
PALAVRAS-CHAVE: micropartículas, alginato, quitosano, BSA, encapsulação, testes de
solubilidade, lúpus.
ABSTRACT
The main goal of this work was the synthesis of a delivery system for the controlled
release of drugs based on natural polymers with potential use in drug delivery at the intestinal
and target places. A promising system of release is the microparticulated systemes, which was
selected for this work for the preliminary evaluation for lupus treatment.
Microparticles of Alginate and microparticles of alginate crosslinked with quitosano
were synthesized. Both systems had bovine serum albumin (BSA) (protein model)
encapsulated.
The percentage of encapsulation of BSA was determined for both types of
microparticles and the protein release profile measured in vitro. For this, was used and
prepared solutions that simulates gastric pH and the enteric pH. The quantification of released
and encapsulation of protein was performed by the Bradford method. After the solubility test
and the evaluation of the protein release, it was concluded that the alginate / chitosan
microparticles are a better controlled release system.
This preliminary study can be used for the development of delivery systems adapted to
the drugs used to treat lupus, and that have been refered for their undesirable side effects
mostly associated to a deficient release system.
KEYWORDS: microparticles, alginate, chitosan, BSA, encapsulation, solubility tests, lupus.
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 – (a) monómeros que constituem o alginato (b) alginato em cadeia (c) sequência esquemática
da conformação da cadeia de alginato (Draget et al) ............................................................................ 21
Figura 2 – Estrutura do quitosano (Santos, 2006) ................................................................................. 23
Figura 3 – Espectrofotómetro ................................................................................................................ 32
Figura 4 – Amostras em banho maria a uma temperatura constante de 37ºC ....................................... 33
Figura 5 – Micropartículas de alginato ................................................................................................. 35
Figura 6 – Micropartículas de alginato/quitosano ................................................................................. 35
Figura 7 – Gotejamento de alginato com BSA em cloreto de cálcio .................................................... 37
Figura 8 – Micropartículas de alginato ................................................................................................. 37
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 – Tratamento medicamentoso em diferentes comprometimentos (Sato et. al) ......... 15
Tabela 2 – Tratamento não medicamentoso (Sato et. al & Araújo et. al) ................................ 16
Tabela 3 – Vantagens dos sistemas de libertação controlada (adaptada de Lyra et. al 2007 [12]
) ................................................................................................................................................. 18
Tabela 4 – Exemplos de polímeros naturais utilizados na síntese de SLC (Adaptado de
Coimbra,2010 [13] ) ................................................................................................................. 20
Tabela 5 – Propriedades do alginato que o tornam alvo de interesse na síntese de SLC
(adaptado de Gombotz et. al [21]) ............................................................................................ 22
Tabela 6 – Propriedades do quitosano (Adaptado de Coimbra, 2010) ..................................... 24
Tabela 7 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA ....................................... 37
Tabela 8 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA nas micropartículas de
alginato ..................................................................................................................................... 38
Tabela 9 – Determinação da massa de BSA libertada .............................................................. 39
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Reta de calibração ................................................................................................. 36
Gráfico 2 – Perfil de libertação de BSA no suco gástrico nas micropartículas de alginato e nas
de alginato/quitosano ................................................................................................................ 41
Gráfico 3 – Perfil de libertação de BSA em suco entérico nas micropartículas de
alginato/quitosano. O perfil de libertação de BSA no mesmo suco em micropartículas de
alginato não está representado pelos valores díspares obtidos. ................................................ 41
ÍNDICE
CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO................................................................................................ 10
1.1. LÚPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO ................................................................... 11
1.1.1. Caracterização da patologia: causas, fatores de risco, prognóstico, diagnóstico,
controlo e prevenção ......................................................................................................... 11
1.1.2. Tratamento .......................................................................................................... 14
1.2. LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS ................................................ 17
1.3. SISTEMAS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE BASE POLIMÉRICA ........ 18
1.3.1. Polímeros de origem natural: aplicações nos sistemas de libertação controlada
de fármacos ....................................................................................................................... 19
1.4. MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS .................................................................. 24
1.5. LIBERTAÇÃO IN VITRO DE FÁRMACOS E PROTEÍNAS MODELO ............... 25
1.5.1. Suco Gástrico Artificial ...................................................................................... 26
1.5.2. Suco Entérico Artificial ...................................................................................... 26
1.5.3. Métodos de quantificação de fármacos e proteínas ............................................ 26
1.6. OBJETIVOS .............................................................................................................. 28
CAPÍTULO II: MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 29
2.1. MATERIAIS .................................................................................................................. 30
2.2. MÉTODOS ................................................................................................................ 30
2.2.1. Síntese de micropartículas de alginato com BSA ............................................... 30
2.2.2. Síntese de micropartículas de alginato revestidas com quitosano ...................... 31
2.2.3. Reta de calibração ............................................................................................... 31
2.2.4. Determinação da eficiência de encapsulação de BSA em Alginato e
alginato/quitosano ............................................................................................................. 31
2.2.5. Determinação da libertação in vitro de BSA em diferentes pH ......................... 32
CAPÍTULO III: RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 34
3.1. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS ................................................... 35
3.2EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA EM ALGINATO ................................ 35
3.2. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA NAS MICROPARTÍCULAS DE
ALGINATO/QUITOSANO ................................................................................................. 38
3.3. DETERMINAÇÃO DA LIBERTAÇÃO IN VITRO DE BSA EM DIFERENTES pH 39
CAPÍTULO IV: CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS ............................................. 42
4. CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS ............................................................. 43
CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 44
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 45
ANEXOS .................................................................................................................................. 47
10
CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO
11
1.1.LÚPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
O lúpus eritematoso sistémico (LES) é uma doença autoimune crónica. Lupus é o latim
utilizado para lobo e refere-se, desta forma, à erupção cutânea que se verifica na face de
grande parte dos doentes afetados por esta patologia e que se assemelha à mordida de um
lobo. Já Sistémica é a palavra usada para traduzir uma doença que pode afetar os órgãos e
tecidos por todo o corpo.
O lúpus eritematoso sistémico é apenas um dos tipos de lúpus existentes. Este tipo é o
mais comum e o que pode levar a complicações sistémicas graves. Outras formas de lúpus
incluem: lúpus eritematoso cutâneo (que se limita à pele não afetando outras partes do corpo),
lúpus eritematoso discóide (um tipo de lúpus eritematoso cutâneo que apresenta erupções sob
forma de disco na face, no couro cabeludo e/ou nos ouvidos), lúpus induzido por fármacos
(forma temporária e leve de lúpus causada por alguns medicamentos antihipertensores como a
hidralazina, inibidores da enzima de conversão da angiotensina e bloqueadores dos canais de
cálcio e diuréticos como é o caso da hidroclorotiazida) e lúpus neonatal (forma rara de lúpus
que afeta recém-nascidos que as mães são portadoras de LES e que nascem com problemas de
fígado e de sangue, com erupções cutâneas e que podem desenvolver problemas cardíacos)
[1].
1.1.1. Caracterização da patologia: causas, fatores de risco, prognóstico, diagnóstico,
controlo e prevenção
O sistema imunitário é o sistema de defesa do organismo. Quando saudável este
sistema produz anticorpos que defendem o corpo humano de agentes agressores,
reconhecendo-os e atuando para os eliminar. Em doentes portadores de LES, o sistema
imunológico está debilitado e, em vez de produzir anticorpos que protegem o organismo,
produz autoanticorpos que atacam e destroem equivocadamente células e os tecidos saudáveis
do próprio paciente. Estes autoanticorpos provocam inflamação anormal dos vasos
sanguíneos, acabando por danificar células, tecidos e, consequentemente, órgãos [1].
Não se sabe exatamente o que desponta uma resposta imune anormal, no entanto, o
mais provável é a combinação de fatores genéticos e ambientais. Existem, assim, diversos
fatores de risco que podem desencadear uma predisposição para a patologia são eles o género
12
(cerca de 90% dos pacientes com LES são mulheres em idade fértil), a idade (grande parte dos
pacientes com LES desenvolvem a patologia entre os 15 e os 44 anos), a raça e etnia (afro-
americanos e asiáticos são mais suscetíveis à patologia), a história de família e causas
ambientais e externas (vírus, radiação ultravioleta, fumo, químicos, terapia de reposição
hormonal e contracetivos orais)[2].
O número e a variedade de anticorpos que podem estar presentes no lúpus são maiores
do que em qualquer outra doença e, juntamente com outros fatores como os referidos
anteriormente, determinam os sintomas que se desenvolvem. Assim, os sintomas e a sua
intensidade bem como gravidade, variam muito de caso para caso. O LES pode ser ligeiro,
devastador, incapacitante ou mesmo mortal [3]. Esta patologia tem associada uma ampla
gama de sintomas, sendo os mais comuns dor nas articulações, erupções cutâneas e febre sem
outra causa. Outros sintomas comuns incluem: dor no peito aquando de uma respiração
profunda, fadiga, desconforto geral, alopecia, úlceras na cavidade oral, fotossensibilidade e
edema dos gânglios linfáticos. Há sintomas que dependem especificamente da parte do corpo
que é afetada. Quando o cérebro e o sistema nervoso são afetados verifica-se uma
predominância de sintomas como: cefaleias, (formigueiro/dormência), convulsões, problemas
visuais e alterações de personalidade. No caso de afetar o aparelho digestivo verifica-se dor
abdominal, náuseas e vómitos e no caso de ser o coração o órgão afetado as arritmias tornam-
se os sintomas mais evidentes. Tosse com sangue e dificuldade em respirar são sintomas
predominantes quando o pulmão de encontra afetado e cor de pele irregular bem como
fenómeno de Raynaud são sintomas associados à pele. Algumas pessoas apresentam apenas
sintomas de pele, o que se denomina de lúpus discoide.
Embora o lúpus possa ser crónico e persistente, este manifesta-se de forma
intermitente, ou seja, é marcado por períodos de remissão (onde há uma ausência de sintomas)
alternados com crises em que a patologia se encontra ativa e os sintomas tendem em piorar,
sendo que estas crises diminuem, habitualmente, após a menopausa. Os períodos de ausência
de sintomas podem, por vezes, durar anos, mas o curso do LES é imprevisível e varia muito
de pessoa para pessoa. Alguns pacientes apresentam uma forma leve de lúpus manifestada por
erupções de pele ocasionais, febre, fadiga ou dores musculares e articulares. Por vezes, o
lúpus permanece na sua forma leve, outras vezes pode evoluir para uma forma mais grave. O
lúpus grave envolve sérias complicações de saúde e danos nos órgãos. Devido a um
tratamento mais eficaz e agressivo, o prognóstico para o LES tem melhorado
significativamente ao longo das últimas duas décadas. Um tratamento precoce que controle a
13
inflamação inicial pode melhorar as perspetivas a longo prazo. Mais de 95% dos pacientes
sobrevivem pelo menos 10 anos e, muitos deste, têm uma expetativa de vida normal [2].
O Colégio Americano de Reumatologia criou uma lista de sintomas e medidas que os
médicos podem utilizar como guia para decidir se o paciente tem lúpus, para isso, o paciente
tem de apresentar pelo menos quatro dos seguintes problemas:
Erupções:
o Rash malar;
o Erupção discoide;
o Erupção na pele exposta ao sol
Úlceras na boca e nariz: feridas na boca ou nariz que persistem durante alguns
dias ou mais de um mês;
Artrite: dor e edema com duração de algumas semanas;
Envolvimento cardiopulmonar: inflamação do tecido que reveste os pulmões
(pleurite) ou o coração (pericardite) que pode causar dor no peito ao respirar
profundamente;
Problema renal: sangue ou proteína na urina, ou testes que sugiram
insuficiência renal;
Problema neurológico: convulsões, derrames ou psicoses;
Alterações hematológicas: anemia hemolítica, baixa contagem de glóbulos
brancos ou baica contagem de plaquetas;
Alterações imunológicas:
o Anti ds-DNA;
o Anti-Sm;
o Anticorpos anti fosfolípido baseado em:
Níveis anormais de anticorpos anti cardiolipina IgG ou IgM;
Anticoagulante lúpico positivo;
Teste serológico falso positivo confirmado para Treponema
palidum, durante pelo menos 6 meses;
Presença de anticorpos antinucleares (ANA)[1].
Devido à diversidade de sintomas esta patologia parece-se com muitas outras doenças
o que torna difícil o seu diagnóstico. Exemplo disso é o facto de esta patologia ser várias
vezes confundida com a artrite reumatoide por afetar o tecido conjuntivo das articulações [3].
14
No controlo da atividade do LES devem realizar-se hemogramas, avaliação da
velocidade de sedimentação, da função renal (ureia/creatinina), dos anticorpos anti-dsDNA,
dos fatores do complemento C3 e C4 (e, se ambos apresentarem valores normais, CH50) e do
anti-C1q (para despiste de nefropatia lúpica).
Como forma de prevenção, o paciente com lúpus deve realizar regularmente consultas
de rotina para reavaliar sintomas, sinais observados pelo médico e análise e exames realizados
com o intuito de reajustar, se necessário, o tratamento; evitar o stress; recorrer ao uso diário
de protetores solares e vestuário adequado para prevenir a exposição solar e evitar exposição a
luz fluorescente e raios UV; fazer um repouso adequado; evitar esforços físicos exagerados;
tratar precocemente as infeções e pedir sempre aconselhamento sobre qual o melhor
contracetivo oral para evitar a administração de altas doses de estrogénio [4].
1.1.2. Tratamento
O tratamento para o LES não tem como objetivo a cura mas sim o alívio dos sintomas
que a patologia envolve. O tratamento varia de paciente para paciente, dependendo da
gravidade dos seus sintomas e de que parte do seu corpo é afetado. A maioria dos doentes
com LES é visto regularmente por um especialista que orienta a sua terapêutica. Assim, o
tratamento pode dividir-se em medicamentoso convencional, não medicamentoso e novos
sistemas terapêuticos já desenvolvidos.
1.1.2.1.Medicamentoso convencional
O tratamento medicamentoso convencional utilizado, independentemente do órgão ou
do sistema afetado, prende-se com o uso contínuo de antimaláricos (utilizados com o intuito
de reduzir a atividade da doença, reduzir a administração de corticoides e o risco de
tromboses), glicocorticóides e imunossupressores [5, 6].
“É importante o diagnóstico diferencial entre atividade da doença e infeção,
lembrando da possibilidade de coexistência de ambas, assim como da presença de co
morbidades”
A definição da terapêutica para cada paciente é determinada pela sintomatologia
persistente (Tabela 1) [5].
15
Tabela 1 – Tratamento medicamentoso em diferentes comprometimentos (Sato et. al)
Tratamento medicamentoso
Comprometimento cutâneo
- Terapia tópica com corticoide não fluorado
na face;
- Terapia com corticoide fluorado em lesões
hipertróficas aplicada sob forma oclusiva ou
de infiltração
Comprometimento articular
- Artrites agudas: sem comprometimento
sistémico - anti-inflamatórios não hormonais,
prednisolona em doses baixas, antimalárico
ou metotrexato; com comprometimento
sistémico – infiltração com glicocorticóides
Comprometimento hematológico
- Prednisolona;
- Metilprednisolona (em casos graves);
- Associação de prednisolona a
imunossupressores;
- Imunoglobulina intravenosa (em pacientes
com anemia hemolítica autoimune);
Comprometimento cardiopulmonar
- Corticosteróides;
- Imunossupressores;
- Vasodilatadores;
- Anticoagulantes.
Comprometimento Neuropsiquiátrico
- Glucocorticoides e/ou imunossupressores
(principalmente ciclofosfamida);
- Anticoagulantes (em caso de doenças
cerebrovasculares);
- Anticonvulsivantes (para tratamento de
convulsões)
16
1.1.2.2.Não medicamentoso
O tratamento não medicamentoso do LES prende-se a algumas orientações essenciais
para os portadores (Tabela 2)[5, 6].
Tabela 2 – Tratamento não medicamentoso (Sato et. al & Araújo et. al)
Tratamento não medicamentoso
Atividade física
Repouso nos surtos da patologia devido ao
condicionamento físico.
Nos períodos de remissão estimular a atividade
física regular
Dieta Adoção de uma dieta equilibrada evitando
excessos de sal, hidratos de carbono e lípidos.
Outros
Utilização diária de protetor solar.
Evitar o tabagismo.
Não usar anticoncecionais orais.
A educação do paciente é também um fator a ter em conta. Explicar aos pacientes e
aos seus familiares o que é a doença, quais as suas implicações e tratamentos é essencial para
que se consiga viver uma vida sem condicionantes de maior. O apoio psicológico é outro
aspeto a não esquecer, uma vez que o paciente necessita de otimismo e motivação para
concretizar/atingir projetos de vida.
1.1.2.3. Novos Sistemas Terapêuticos
Os novos sistemas terapêuticos sintetizados para o tratamento de LES são anticorpos
monoclonais: rituximab, epratuzumab e belimumab.
O rituximab é responsável pela depleção de linfócitos B de maneira a evitar a sua
diferenciação em plasmócitos e, desta forma, diminuir a produção de autoanticorpos.
O epratuzumab tem ainda o seu mecanismo de ação pouco conhecido, mas acredita-se
que também atue influenciando a depleção das células B circulantes.
O belimumab foi o primeiro inibidor do estimulador dos linfócitos B e assegura a sua
redução em pacientes com lúpus.
17
1.2.LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS
“O principal objetivo de um fármaco, quando administrado, é atingir
concentrações plasmáticas ou níveis de concentrações adequadas nos tecidos,
sendo terapeuticamente efetivo e não tóxico, por um longo tempo”.[7]
O desenvolvimento de novos e eficazes sistemas de libertação controlada de fármacos
é fundamental na melhoria dos perfis farmacológicos de muitos grupos farmacoterapêuticos,
uma vez que combatem algumas lacunas existentes no que toca a efeitos indesejáveis mas
também a forma farmacêutica de apresentação dos mesmos [8], apresentando, assim,
inúmeras vantagens tanto farmacológicas como a nível de eficácia terapêutica no que toca à
adesão do paciente (Tabela 3).
De forma a minimizar a degradação e perda de substância ativa, bem como, evitar
efeitos secundários indesejáveis e aumentar a biodisponibilidade do fármaco na zona
requerida, têm sido desenvolvidos diversos sistemas de libertação. Estes sistemas de
libertação têm como objetivo o direcionamento e distribuição efetiva do fármaco. Entre os
veículos de fármacos pode-se destacar os polímeros solúveis, lipossomas, micelas,
micropartículas biodegradáveis (naturais e sintéticas), micropartículas de polímeros
insolúveis, microcápsulas [9], lipossomas, micelas poliméricas, nanopartículas poliméricas e
de cerâmica e dendrimeros [10]. Cada um destes veículos apresenta vantagens e desvantagens
próprias, tendo de ser, por isso, escolhido consoante as necessidades e especificações do
fármaco [9].
Assim, consideramos que os SLC foram desenvolvidos com o intuito principal de
manter uma concentração controlada de fármaco dentro da janela terapêutica do mesmo
diminuindo, desta forma, o risco de toxicidade [11].
18
Tabela 3 – Vantagens dos sistemas de libertação controlada (adaptada de Lyra et. al 2007 [12] )
Vantagens
Farmacológicas
- Manter nível terapêutico;
- Impedir efeitos colaterais indesejados e níveis tóxicos;
- Evitar subníveis terapêuticos;
- Aumentar segurança na administração de fármacos
Eficácia terapêutica
- Maior comodidade devido à diminuição do número de tomas
diárias;
- Facilidade na adesão à terapêutica por parte do paciente
- Redução dos efeitos secundários indesejados
1.3.SISTEMAS DE LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE BASE POLIMÉRICA
“Os materiais poliméricos, pela sua variedade, versatilidade e
propriedades, são a classe de materiais mais investigada no desenvolvimento
de SLC.”[13]
Cada vez mais, com o conhecimento das propriedades e do desenvolvimento de novos
polímeros, tem exigido a criação de veículos de libertação de fármacos mais eficientes e mais
funcionais. Assim, são sintetizados polímeros com funções específicas no que diz respeito à
libertação dos fármacos como, por exemplo, a sua solubilidade em diferentes pH e
direcionamento pretendido, de forma a solucionar problemas emergentes [11].
A escolha do polímero a utilizar é, sobretudo, feita de acordo com o princípio ativo,
uma vez que a interação excipiente-fármaco influencia os mecanismos de desintegração,
libertação, absorção e biodisponibilidade do princípio ativo, ou seja, o perfil
farmacoterapêutico é diretamente correlacionado com a interação do fármaco com o
polímero[14].
Nos SLC de fármacos de base polimérica, o princípio ativo encontra-se encapsulado
numa matriz polimérica moldada conforme a via de administração [7], ou seja, num sistema
constituído por cadeias polimerizadas de uma ou várias substâncias químicas que são agentes
19
moduladores da libertação do mesmo [15]. A libertação da substância ativa é controlada por
mecanismos como a erosão, difusão e intumescimento [7].
É exigido, na preparação de um SLC, que os produtos de degradação do mesmo não
sejam tóxicos e que tenham uma boa biocompatibilidade nos tecidos para onde são
direcionados [13].
Segundo Coimbra [13], os SLC de fármacos de base polimérica podem classificar-se
em:
Sistemas de libertação controlados por difusão (que podem ser de reservatório
ou matricial);
Sistemas de libertação ativados pelo solvente (controlados pela pressão
osmótica ou pela absorção de água);
Sistemas de libertação controlados por ação química (de cadeias pendentes ou
de sistemas biodegradáveis).
1.3.1. Polímeros de origem natural: aplicações nos sistemas de libertação controlada de
fármacos
Os polímeros naturais são produzidos por organismos vivos e amplamente utilizados
na síntese de SLC [13], essencialmente micropartículas e nanopartículas poliméricas [16].
Os peptídeos, as proteínas, os polissacarídeos e os polihidroxialcanoatos são os
polímeros naturais que se destacam na preparação de SLC com base em polímeros naturais
(Tabela 4) [16].
Estes polímeros são utilizados na indústria farmacêutica como agentes emulsionantes e
adjuvantes no desenvolvimento de produtos farmacêuticos e cosméticos [17].
As vantagens desta classe de polímeros incluem a bioadesão (à mucosa ocular,
urinária, gastrointestinal, vaginal e nasal), a biocompatibilidade, a biodegradabilidade e
biodisponibilidade. Por outro lado, a desvantagem mais verificada é a variação do processo de
obtenção e purificação de lote para lote [16].
Para a realização do trabalho laboratorial utilizaram-se dois polissacarídeos: o alginato
e o quitosano.
20
Tabela 4 – Exemplos de polímeros naturais utilizados na síntese de SLC (Adaptado de Coimbra,2010 [13] )
Classe Exemplos
Polímeros de base proteica Gelatina, albumina, colagénio, fibrina e
proteína de soja
Polissacarídeos
Alginato, agarose, ácido hialurónico, amido,
pectina, dextrano, quitosano, carragenina,
derivados de celulose e sulfato de condroitina
Polihidroxialcanoatos Poli(3-hidroxibutirato) e poli(3-
hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato)
1.3.1.1.Polissacarídeos: estrutura, propriedades e aplicações
Polissacarídeos são biopolímeros que apresentam elevado peso molecular. Estes
biopolímeros são constituídos por monossacarídeos ligados entre si através de ligações
glicosídicas [18].
A conformação em cadeia e as associações intermoleculares irão influenciar as
propriedades físico-químicas desta classe de polímeros e o arranjo mais estável dos átomos
que constituem o polissacarídeo será aquele que satisfaça as forças intra e intermoleculares.
Eles são classificados consoante os monossacáridos que os constituem e as ligações entre eles,
assim como pela configuração absoluta que adquirem (D- ou L-).
Estes polímeros podem ser obtidos através de fontes microbianas, animais ou vegetais
e mostram apresentar hemocompatibilidade elevada provavelmente pelas suas caraterísticas
químicas serem semelhantes com a heparina. Os polissacarídeos não são tóxicos e, em
comparação com outros polímeros naturais, têm baixos custos o que também tem
impulsionado a sua utilização na engenharia de tecidos (em particular nas cartilagens), em
sistemas para imobilização de células e em veículos de SLC de fármacos[19].
O alginato e o quitosano, os dois polissacarídeos envolvidos no trabalho laboratorial e
que de seguida se apresentam, são dois polissacarídeos com uma extensa história na medicina,
farmácia e ciências básicas, uma vez que são facilmente extraídos de plantas marinhas e de
casca de crustáceos [20].
21
1.3.1.1.1. Alginato
O alginato é um polímero natural com aplicações crescentes na indústria
biotecnológica. Este polímero tem sido amplamente utilizado na alimentação e nas bebidas
devido às suas propriedades espessantes, gelificantes e estabilizadoras. Nos últimos tempos
tem sido investigada a sua aplicação em SLC de fármacos pelas propriedades únicas que
apresenta (Tabela 5) [21].
Este polissacarídeo apresenta uma estrutura linear não ramificada que contém blocos
de repetição das unidades de 1,4-ligado-β-D-ácido manurónico (M) e α-L-ácido gulurónico
(G) (Figura 1) [22], presentes nas algas marinhas das quais derivam [23]. Os blocos são
compostos por resíduos consecutivos de M (MMMMM), por resíduos consecutivos de G
(GGGGGG) e por alternância entre eles (GMGMGM) [24].
Os alginatos comerciais são extraídos de algas castanhas (Phaeophyce) de espécies
como Laminaria hyperborea, Ascophyllum nodosum e Macroscystis pyrifera por tratamento
por soluções alcalinas, como é o caso do hidróxido de sódio (NaOH) [21].
A gelificação deste polímero natural é facilmente conseguida através da adição de
catiões bivalentes (como o cálcio – Ca2+
) [24]. Esta gelificação efetua-se pela interação
cooperativa dos blocos de monómeros L com o catião Ca2+
que forma pontes entre as cadeias
dos diferentes polímeros iónicos [25].
Figura 1 – (a) monómeros que constituem o alginato (b) alginato
em cadeia (c) sequência esquemática da conformação da cadeia de
alginato (Draget et al)
22
A solubilidade do alginato em água é regulada pelo pH do solvente, pela força iónica
do meio e pela presença de iões de gelificação. Assim, para que o alginato seja solúvel no
meio é fundamental que o pH se encontre acima do valor crítico e os grupos de ácido
carboxílico se encontrem desprotonados. Alternando a força iónica do meio, a conformação
do polímero, a extensão da cadeia e a viscosidade consegue-se alterar a solubilidade do
alginato. Outro fator importante para que o alginato se consiga dissolver é a ausência de
agentes reticulantes no meio em que se pretende solubilizar. Quanto à degradação enzimática
esta é realizada pelo mecanismo de β-eliminação e a sua taxa aumenta a pH acima de 10 e
abaixo de 5. Acima de pH 10 verifica-se a β-eliminação, no entanto, abaixo de pH 5 é
verificada uma hidrólise catalisada por ácido [26].
Na engenharia de tecidos, a função do alginato é, sobretudo, a de assegurar a
integridade mecânica e a transmissão inicial de sinais mecânicos para as células e para o
desenvolvimento dos tecidos [25], já na síntese de SLC este polímero é utilizado pela sua
biocompatibilidade, baixa toxicidade e boa capacidade de gelificação [24].
Tabela 5 – Propriedades do alginato que o tornam alvo de interesse na síntese de SLC (adaptado de Gombotz et. al [21])
Propriedades do alginato
Interior da matriz contém um meio aquoso relativamente inerte
Processo de encapsulamento a temperatura ambiente livre de solventes orgânicos
Gel com porosidade que permite elevadas taxas de difusão de macromoléculas
Capacidade de controlar porosidade por processos de revestimento simples
Dissolução e biodegradação do sistema sob condições fisiológicas normais
1.3.1.1.2. Quitosano
O quitosano (Figura 2) é sintetizado pela desacetilação da quitina (que está presente na
natureza nos exoesqueletos de artrópodes ou nas paredes celulares de fungos e leveduras[27])
em meio alcalino. O método da preparação do quitosano varia consoante a fonte e, por isso,
origina algumas diferenças na amostra obtida [28]. Habitualmente, todos os derivados da
quitina designam-se por quitosano quando esta apresenta um grau de acetilação inferior a 40%
[13].
23
No estado sólido, o quitosano é um polímero semi-cristalino e a sua solubilidade é
habitualmente testada em ácido acético, dissolvendo-o em ácido acético a 1% (a quantidade
de ácido acético necessária depende da quantidade de quitosano a ser dissolvido). Na
realidade a solubilidade é um parâmetro difícil de controlar, uma vez que se relaciona com a
concentração iónica, o pH, a natureza do ácido aquando da protonação e a distribuição dos
grupos acetil ao longo da cadeia [29].
O quitosano, devido à sua versatilidade tem inúmeras aplicações nas mais diversas áreas.
Na biomedicina é utilizado, por exemplo, nas membranas de hemodiálise, nas suturas
biodegradáveis, como substituinte artificial da pele, como agente cicatrizante em queimaduras
e em SLC de fármacos. Na química analítica, por sua vez, é utilizado no fabrico de eletrodos
específicos para metais, na absorção de iões de metais pesados e em cromatografia. É também
utilizado em cosméticos, em cremes para a pele e para o corpo assim como na dietética (em
adelgaçantes). Na agricultura é utilizado como aditivo para alimento dos animais e na
formulação de pesticidas. É, de igual forma, aplicado na indústria têxtil, do papel e alimentar
bem como, no tratamento de água (na remoção de metais e surfatantes) [30].
Ao longo dos últimos anos, o quitosano tem sido alvo de diversas investigações pelos
seus potenciais e propriedades (Tabela 6) que apresenta na utilização enquanto
biomaterial[13].
Figura 2 – Estrutura do quitosano (Santos, 2006)
24
Tabela 6 – Propriedades do quitosano (Adaptado de Coimbra, 2010)
1.4.MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS
As micropartículas são partículas em que as suas dimensões se situam entre 1 e
1000µm[31]. O termo micropartícula é usado para descrever microcápsulas e microesferas e
são vários os motivos pelos quais lhes são incorporados fármacos. Nas microcápsulas o
fármaco (no estado sólido ou líquido) encontra-se envolvido numa membrana polimérica num
sistema vesicular, enquanto que nas microesferas o fármaco encontra-se disperso ou
solubilizado numa matriz polimérica maciça [13].
Estes veículos podem ser utilizados para controlar a libertação de fármaco, disfarçar
características organoléticas (sabor e odor), proteger os fármacos da degradação e proteger o
organismo de efeitos nocivos [32]. Assim, o SLC de fármacos através de micropartículas
poliméricas beneficia a proteção do fármaco encapsulado e também o controlo da libertação
da substância ativa, melhorando a adesão do paciente à terapêutica [33].
A utilização de micropartículas deve ter em atenção a via de administração escolhida
[33]. Por exemplo, por via oral, o fármaco encontra várias barreiras que alteram a sua
biodisponibilidade final como a permeabilidade gástrica, intestinal, os metabolismos intestinal
e hepático, a solubilidade e o tamanho, a finalidade do uso de micropartículas seria superar
estas limitações direcionando o fármaco para o local alvo [34]. Para além deste facto, a
Propriedades do quitosano
Biodegradibilidade
Biocompatibilidade
Bioadesividade/mucoadesividade
Promotor de absorção
Atividade antiflamatória, antifúngica e antibacteriana
Promotor da regeneração de vários tecidos
Hemoestático
Antitrombogénico
Processabilidade
25
administração de fármacos por este sistema apresenta inúmeras vantagens, uma vez que as
micropartículas podem ser administradas via oral ou intravenosa e adaptam-se ao perfil de
libertação desejado.
As micropartículas devem cumprir alguns critérios[33]:
Apresentarem elevada eficiência de encapsulação;
Preservarem a atividade do fármaco durante o encapsulamento e o
armazenamento;
Facilitarem a administração para o local alvo;
Controlarem a taxa de libertação de forma a alcançarem um efeito terapêutico
minimizando os efeitos secundário.
Diversos métodos têm sido utilizados para a preparação de micropartículas poliméricas
na área da microencapsulação. O método escolhido para a preparação determina o tamanho e
tipo de micropartícula sintetizada [32].
Ao longo do período de estágio foram desenvolvidas micropartículas de alginato
precipitadas em cloreto de cálcio e micropartículas de alginato precipitadas em cloreto de
cálcio, revestidas com quitosano e precipitadas em tripolifosfato. Nestas micropartículas
poliméricas foi incorporada uma proteína modelo – a BSA.
A BSA é a proteína mais abundante no sangue bovino. Apresenta-se sob a forma de
cadeia polipeptídica simples e pode formar dímeros, especialmente em altas concentrações ou
na sua forma cristalizada. Na sua estrutura primária, a BSA não é carregada uniformemente.
Esta proteína, a pH 7, apresenta uma carga negativa e altera a sua conformação entre pH 4 e 8.
A BSA carateriza-se pelo elevado número de cisteína, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina,
arginina e aminoácidos carregados e baixo número de triptofano e metionina [35].
Esta proteína é utilizada em diversas áreas. A nível bioquímico, por exemplo, a BSA é
utilizada na estabilização de algumas enzimas durante a digestão do ADN, para determinar a
quantidade de outras proteínas e como nutriente em cultura de células microbianas.
1.5.LIBERTAÇÃO IN VITRO DE FÁRMACOS E PROTEÍNAS MODELO
Para se proceder à síntese de um SLC de fármacos, é necessário conhecer os diferentes
mecanismos de libertação dos mesmos, para isso, é essencial avaliar a libertação in vitro de
fármacos, ou como é o caso, da proteína modelo. Esta avaliação in vitro pode ser avaliada
26
submetendo o sistema sintetizado a uma solução de suco gástrico artificial e suco entérico
artificial e a sua quantificação efetuada pelo método de Bradford e espectrofotometria.
1.5.1. Suco Gástrico Artificial
O suco gástrico artificial, como o próprio nome indica, é uma solução que mimetiza o
meio gástrico, tendo características idênticas ao mesmo. O suco gástrico possui, na sua
constituição, água, enzimas, sais inorgânicos, uma pequena quantidade de ácido lático e ácido
clorídrico e que é o principal responsável pelo pH ácido do meio. No estomago, as enzimas
digestivas começam a degradar o fármaco e, se este não possuir um invólucro que o proteja do
meio, parte da substância ativa será, já no estomago, absorvida e passa para a corrente
sanguínea [36].
1.5.2. Suco Entérico Artificial
Assim como o suco gástrico artificial, o suco entérico artificial mimetiza, in vitro, o
suco entérico produzido no intestino delgado. O suco entérico é uma solução rica em enzimas
e com pH alcalino. É no intestino que ocorre a maior absorção de substância ativa, uma vez
que este órgão é rodeado por inúmeros vasos sanguíneos. Os fármacos sendo,
maioritariamente, facilmente solúveis atravessam as membranas permeáveis do intestino e
penetram nos vasos que farão o transporte dos mesmos ao local alvo [36].
1.5.3. Métodos de quantificação de fármacos e proteínas
Métodos rápidos e precisos para quantificar proteínas e fármacos são essenciais nas
áreas de bioquímica e biologia [37].
Existem diversos métodos de quantificação de fármacos e proteínas. Os métodos mais
utilizados são:
Método do biureto;
Método de Lowry;
27
Método de Bradford;
Método de Smith ou BCA;
Método de absorção ultra-violeta.
Para quantificar a proteína modelo no trabalho laboratorial, utilizou-se o método de
Bradford e espectrofotometria, descritos de seguida.
1.5.3.1. Método de Bradford
O método de Bradford é baseado na ligação do corante de azul de Coomassie G-250 à
proteína [38] formada por aminoácidos com cadeias laterais aromáticas ou básicas [39].
A interação entre a proteína e o corante provoca a alteração do corante para a sua
forma aniónica que absorve e é detetável a um comprimento de onda de 595nm [39].
Este método é muito utilizado por utilizar apenas um reagente corante para
quantificação da amostra de proteína, por ser rápido, por se poder realizar à temperatura
ambiente sem sofrer interferência [40] e por manterem estabilidade de cor durante, pelo
menos, uma hora ao abrigo da luz [41].
Catiões como o sódio, o potássio ou hidratos de carbono não mostram interferir neste
método. A solução de Bradford apresenta modificação de cor aquando a presença de proteína,
de um azul acastanhado para um azul mais forte [41].
O método de Bradford tem a sua aplicação de proteínas totais em meios como o
plasma, a saliva humana, o leite humano, em tecidos de plantas, em produtos alimentares e em
detergentes [39].
1.5.3.2.Espectrofotometria
A espectrofotometria é um procedimento analítico pelo qual se determina a
concentração de espécies químicas aquando a absorção de luz. Este método é utilizado em
estudos químicos e biológicos.
O espectrofotómetro é o aparelho que permite comparar a radiação absorvida ou
transmitida por uma solução com uma concentração desconhecida de determinada substância,
determinada por este método[42].
28
1.6.OBJETIVOS
Este estudo teve como objetivo principal a síntese de um SLC para incorporação de um
fármaco utilizado no tratamento do LES, alterando a via da administração do mesmo, de
forma a aumentar a adesão à terapêutica por parte do paciente. No entanto, para testar o SLC
foi necessária a incorporação de uma proteína modelo – a BSA. Assim, o estudo teve como
objetivos secundários a incorporação da BSA no SLC, a determinação da concentração da
proteína quando sujeita a diferentes pH (pH gástrico e entérico), otimização das
micropartículas para promover a libertação da proteína apenas em pH entérico para que,
quando se incorporasse o fármaco, este ser resistente a pH gástrico e assim minimizar efeitos
secundários indesejados.
29
CAPÍTULO II: MATERIAL E MÉTODOS
30
2.1. MATERIAIS
Para o desenvolvimento de micropartículas utilizou-se alginato de sódio da Applichem
Panreac®
, cloreto de cálcio dihidratado da Scharlau®, quitosano da Acros Organics
®, vinagre
de vinho branco (Ácido Acético) da Cigalou®, tripolifosfato da Acros Organics
® e BSA da
Sigma®.
Para testar in vitro a solubilidade da proteína nos diferentes sucos orgânicos,
procedeu-se ao desenvolvimento da solução de suco gástrico artificial e da solução de suco
entérico artificial segundo a Farmacopeia Portuguesa.
Na solução do suco gástrico artificial utilizou-se como reagentes cloreto de sódio do
laboratório Panreac® e ácido clorídrico a 33% do laboratório José M. Vaz Pereira, S.A.
®.
Na solução do suco entérico artificial utilizou-se como reagentes fosfato
monopotássico e hidróxido de sódio da Merck®.
Para se poder efectuar a quantificação da proteína na encapsulação do BSA nas
micropartículas de alginato e quitosano procedeu-se ao desenvolvimento de uma solução. A
solução do Método de Bradford foi constituída por azul de coomassie (G-250) do laboratório
Fisher Scientific®, metanol do laboratório Scharlau
® e ácido fosfórico a 85% do laboratório
José M.Vaz Pereira, S.A®.
2.2.MÉTODOS
2.2.1. Síntese de micropartículas de alginato com BSA
Inicialmente, para efetuar a síntese de micropartículas de alginato com BSA são efetuados
os cálculos de forma a determinar o peso de BSA, de alginato e de cloreto de cálcio
necessários para, posteriormente, executar as soluções precisas para a síntese.
De seguida, são pesadas as substâncias em causa e é realizada a dissolução da BSA no
alginato sob agitação. A solução final, de 2 mL, tem uma concentração de BSA de 20mg/mL.
A solução obtida é colocada numa seringa, 1 mL e posteriormente, gotejado para um gobelé
onde se encontra uma solução de cloreto de cálcio a 4%. Desta forma, o alginato com BSA
precipita no cloreto de cálcio e dá-se a formação de micropartículas.
As partículas que se obtêm são filtradas e de seguida pesadas.
31
2.2.2. Síntese de micropartículas de alginato revestidas com quitosano
A primeira parte do processo de síntese de micropartículas de alginato revestidas com
quitosano é igual ao processo descrito anteriormente em 2.2.1..
Após a divisão e pesagem dos quatro grupos, as micropartículas são inseridas numa
solução de quitosano a 1% na qual são revestidas, após são adicionadas a uma solução de
tripolifosfato a 4 % cada um, onde são precipitadas.
As partículas obtidas são filtradas e pesadas.
A solução de quitosano a 1% é obtida pela dissolução de quitosano em ácido acético a
1%.
2.2.3. Reta de calibração
Para traçar a reta de calibração faz-se 6 diluições (0,125mg/mL, 0,25mg/mL,
0,5mg/mL, 1mg/mL, 1,5mg/mL e 2mg/mL) da solução-mãe de BSA que se encontra a
20mg/mL. De cada solução-filha obtida retira-se uma alíquota de 20µL e adiciona-se 1000µL
de solução de Bradford. É medida a absorvância pelo espectrofotómetro e traçada a reta de
calibração.
2.2.4. Determinação da eficiência de encapsulação de BSA em Alginato e
alginato/quitosano
De cada solução filtrada, são retiradas 5 alíquotas de 40µL e a cada uma destas
adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a absorvância pelo espectrofotómetro
(Figura 3) e calculada, através dos resultados obtidos e a equação da reta de calibração
previamente traçada, a percentagem de encapsulamento de BSA nas micropartículas.
32
2.2.5. Determinação da libertação in vitro de BSA em diferentes pH
Para proceder à avaliação do perfil de libertação in vitro de BSA foram sintetizadas
duas soluções, uma a simular o suco gástrico e outro a simular o suco entérico, as duas
consoante as indicações da Farmacopeia Portuguesa.
2.2.5.1.Simulação do suco gástrico: pH 1,2
A solução de suco gástrico artificial é constituída por cloreto de sódio, água e ácido
clorídrico a 1M com o intuito de obter uma solução com pH de 1,2. Este pH é acertado com o
auxílio do medidor de pH.
As partículas são subtidas a este suco durante um período de duas horas, a uma
temperatura constante de 37oC em banho-maria (Figura 4). De meia em meia hora as
partículas são filtradas e subtidas a nova solução. Da solução filtrada são retiradas 5 alíquotas
de 40µL e a cada uma destas adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a
absorvância e assim calculada a massa libertada.
Figura 3 – Espectrofotómetro
33
2.2.5.2.Simulação do suco entérico: pH 6,8
A solução de suco gástrico entérico é constituída por fosfato monopotássico, água e
hidróxido de sódio a 0,2M com o intuito de obter uma solução com pH de 6,8. Este pH é
acertado com o auxílio do medidor de pH.
As partículas são subtidas a este suco durante um período de duas horas, a uma
temperatura constante de 37oC. De meia em meia hora as partículas são filtradas e subtidas a
nova solução. Da solução filtrada são retiradas 5 alíquotas de 40µL e a cada uma destas
adicionados 1000µL de solução de Bradford. É medida a absorvância e assim calculada a
massa libertada.
Figura 4 – Amostras em banho maria a uma temperatura constante de 37ºC
34
CAPÍTULO III: RESULTADOS E DISCUSSÃO
35
3.1. CARACTERIZAÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS
Após a formação das partículas estas são observadas e pesadas.
Verificou-se, depois da pesagem, que as partículas de alginato sintetizadas pesavam cerca
de 0,600g e as de alginato/quitosano cerca de 0,900g.
Em relação ao aspeto de cada um dos tipos de micropartículas formadas, as
micropartículas de alginato (Figura 5) apresentavam um aspeto aproximadamente esférico e
esbranquiçado e as micropartículas de alginato/quitosano (Figura 6) um aspeto idêntico
acrescentando o revestimento transparente e gelificado observável a olho nu.
3.2EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA EM ALGINATO
Para se quantificar a concentração de BSA nas amostras, estas são analisadas no
espectrofotómetro a um comprimento de onda de 595nm. A conversão do valor de
absorvância em quantidade de BSA é determinada através da reta de regressão linear obtida
na curva de calibração.
Assim, para se conseguir determinar a eficiência da encapsulação da BSA em alginato é,
inicialmente, necessário traçar a reta de calibração com diferentes concentrações de BSA
(Gráfico 1). A reta de calibração é representada pela equação geral:
em que representa a absorvância e a concentração, desta forma após a obtenção da
equação específica para este caso e da medição das absorvâncias obtidas depois da filtração
das partículas de alginato a 1% com BSA precipitado em cloreto de cálcio a 4%, seria apenas
Figura 5 – Micropartículas de alginato
Figura 6 – Micropartículas de
alginato/quitosano
36
y = 0,7206x + 0,0275
R² = 0,9971
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
Ab
sorv
ânci
a
Concentração de BSA
necessário substituir o pelos valores de absorvância e obter-se assim a concentração de BSA
libertado.
Para se traçar a reta de calibração diluiu-se o BSA de forma a que se obtivesse as
concentrações de 0,125 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1mg/mL, 1,5 mg/mL e a 2mg/mL,
A absorvância foi, para todas as amostras, medida a um comprimento de onda de 595 nm e o
valor obtido a 2mg/mL foi rejeitado.
Depois de se gotejar o alginato a 1% com a BSA para o cloreto de cálcio a 4% (Figura
7 e 8) e de filtrar as partículas obtidas, pesou-se as mesmas determinou-se a percentagem de
encapsulação da BSA pela medição da absorvância de cada amostra (Tabela 7).
A concentração de BSA é calculada como já foi referido anteriormente pela equação
da reta de calibração. A massa, por sua vez é calculada pela equação
em que representa a concentração, a massa em mg e o volume em mL.
A percentagem de encapsulação é calculada recorrendo à fórmula:
Após os cálculos efetuados, verificou-se uma percentagem de encapsulação
relativamente baixa ( 55,4%), o que pode ser devido à falta de destreza na realização do
processo.
Gráfico 1 – Reta de calibração
37
Tabela 7 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA
A percentagem de encapsulação permite saber a massa de BSA que ainda se encontra
encapsulada no alginato. Assim, neste caso concreto, resta libertar aproximadamente 11,1mg.
Ou seja, aproximadamente 2,77 mg para cada grupo de partículas uma vez que foram
equitativamente dividas em quatro. De seguida as partículas foram submetidas a diferentes
pH, dados apresentados na secção 3.3..
Determinação da percentagem de encapsulação de BSA
Absorvância Concentração de BSA Massa %Encapsulação
0,632 0,419442
8,91063 55,44685
0,646 0,429156
0,638 0,423605
0,704 0,4694
0,728 0,486053
Figura 8 – Micropartículas de alginato
Figura 7 – Gotejamento de alginato com BSA em
cloreto de cálcio
38
3.2. EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE BSA NAS MICROPARTÍCULAS DE
ALGINATO/QUITOSANO
Assim como descrito na secção anterior, após o gotejamento de alginato a 1% com BSA
no cloreto de cálcio a 4% foi determinada a percentagem de encapsulação da BSA (Tabela 8).
Tabela 8 – Determinação da percentagem de encapsulação de BSA nas micropartículas de alginato
Determinação da percentagem de encapsulação de BSA
Absorvância Concentração de BSA Massa %Encapsulação
0,953 0,642173
13,54011 54,86632
1,035 0,69907
1,063 0,718498
1,018 0,687274
0,947 0,63801
A percentagem de encapsulação obtida neste ensaio é, de igual forma, baixa
( 54,87%), o que mostra um erro persistente ou mostra que a concentração de alginato ou de
cloreto de cálcio era insuficiente para manter a BSA encapsulada no seu interior ou para
precipitar o alginato, respetivamente.
Assim, e como se mediu 1,5 mL (ou seja, existia 30 mg de BSA aquando da
precipitação) restavam libertar aproximadamente 16,46 mg (aproximadamente 4,11 mg por
grupo).
Após se pesar as partículas obtidas e as dividir em quatro grupos, procedeu-se ao
revestimento das mesmas por quitosano a 1%. De seguida, reticularam-se as partículas já
revestidas em tripolifosfato e, após, se filtrar as partículas procedeu-se à pesagem das mesmas
à medição das absorvâncias do filtrado (Tabela 9).
Devido aos valores negativos de massa libertada obtidos na amostra 3 e na amostra 4
os mesmos são rejeitados. Assim, a massa total média libertada é de aproximadamente
0,11mg, ou seja, aproximadamente 99,6% de BSA encapsulada. Este valor elevado deve-se à
afinidade existente entre o quitosano e o tripolifosfato que confere estabilidade às
micropartículas.
Relativamente às pesagens, verificou-se um aumento de peso da primeira pesagem
(quando a BSA estava encapsulada em alginato a 1% e reticulada por cloreto de cálcio a 4%)
39
para a segunda (em que as micropartículas já estavam revestidas com quitosano a 1% e
precipitadas em tripolifosfato a 4%), em média de 0,200 mg em cada amostra.
Tabela 9 – Determinação da massa de BSA libertada e da eficiência de encapsulação
Determinação da massa de BSA libertada
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,044 0,011449
0,158895
0,047 0,01353
0,060366
0,054 0,018387 0,027 -0,00035
0,053 0,017694 0,042 0,010061
0,052 0,017 0,035 0,005204
0,049 0,014918 0,03 0,001735
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,007 -0,01422
-0,14641
0,01 -0,01214
-0,08673
0,002 -0,01769 0,015 -0,00867
0,008 -0,01353 0,022 -0,00382
0,007 -0,01422 0,018 -0,00659
0,008 -0,01353 0,01 -0,01214
Massa média libertada %Encapsulação
0,109631 99,33395
3.3. DETERMINAÇÃO DA LIBERTAÇÃO IN VITRO DE BSA EM DIFERENTES pH
Após a síntese das micropartículas, estas foram submetidas a diferentes pH.
Os dois tipos de micropartículas sintetizadas apresentaram perfis de libertação diferentes,
entre elas, em pH gástrico e entérico.
Nas micropartículas em que a BSA está encapsulada no alginato, verifica-se uma
libertação considerável na primeira hora e meia em que são submetidas ao suco gástrico e
também na primeira hora em que estão sujeitas ao suco entérico (Gráfico 2). No Gráfico 2
estão representados graficamente os dados obtidos e existentes no ANEXO I. Ao final da
40
primeira hora e meia em meio gástrico já se tinha libertado aproximadamente 1,1 mg de
2,77mg a libertar, aliás, foi ao final da primeira meia hora que se verificou o pico de
libertação ( 0,88mg). Assim, pode-se assumir que o alginato não é resistente a pH gástrico e
liberta grande parte da substância que transporta no estômago não sendo, desta forma, uma
opção viável para o pretendido. Se se procede-se à incorporação de um fármaco em alginato,
este seria libertado no estômago e, assim, não iria minimizar os efeitos secundários do mesmo
(que seria o objetivo da utilização de um veículo diferente para a libertação controlada do
fármaco). O facto de na primeira hora em que as micropartículas são sujeitas ao suco entérico
libertarem uma quantidade significativa de BSA ( 0,54mg) pode prender-se à mudança de
meio e à quebra da restante interação alginato-BSA. Dezassete horas depois voltou-se a medir
a absorvância e verificou-se a libertação de aproximadamente 0,27mg. Assim, no total
verificou-se a libertação de aproximadamente 1,88mg o que significa que ainda faltariam
libertar cerca de 0,89mg. A taxa de eficácia verificada é de sensivelmente 67,88%.
Nas micropartículas de alginato com BSA revestidas com quitosano verifica-se uma
libertação ínfima de BSA no suco gástrico, o que é extremamente relevante neste estudo
(Gráfico 2 e 3). Os dados para obter os gráficos encontram-se no ANEXO II. Quando
submetidas a pH entérico estas micropartículas mostram uma libertação gradual ao longo do
tempo o que as tornam bons exemplos de SLC. No total verificou-se a libertação de
sensivelmente 3,08mg, ou seja, ficou por libertar cerca de 1mg. A taxa de eficácia verificada é
de cerca de 74,93%.
Comparando as taxas de eficácia, pode-se comprovar que as micropartículas
alginato/quitosano apresentam uma maior viabilidade e, portanto, são as mais apropriadas
para as necessidades exigidas. Estas micropartículas, otimizadas, poderiam ser potenciais SLC
de fármacos.
41
Gráfico 2 – Perfil de libertação de BSA no suco gástrico nas micropartículas de alginato e nas de alginato/quitosano
Gráfico 3 – Perfil de libertação de BSA em suco entérico nas micropartículas de alginato/quitosano. O perfil de libertação de
BSA no mesmo suco em micropartículas de alginato não está representado pelos valores díspares obtidos.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 20 40 60 80 100 120 140
% l
iber
taçã
o d
e B
SA
Tempo (min)
Alginato
Alginato/quitosano
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 50 100 150 200
% l
iber
taçã
o d
e B
SA
Tempo (min)
Alginato/quitosano
42
CAPÍTULO IV: CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS
43
4. CONCLUSÃO E PRESPETIVAS FUTURAS
O LES é uma doença autoimune crónica que envolve complicações em vários órgãos e
tecidos do organismo, o que faz com que não exista uma terapêutica base para o tratamento do
LES, ou seja, a terapêutica tem de ser adaptada a cada paciente.
Os fármacos utilizados no tratamento do LES, sobretudo os glucocorticoides, têm
inúmeros efeitos secundários adjacentes e, foi por este aspeto que me propôs a desenvolver
este trabalho. Um trabalho com o intuito de desenvolver um SLC de fármacos que minimiza-
se este impacto e que aumenta-se a adesão à terapêutica por parte dos pacientes.
Os polímeros naturais têm sido dos excipientes mais utilizados em tecnologia
farmacêutica e que proporcionam a sua evolução através das diversas aplicações e
funcionalidades que possuem. A escolha do polímero para um SLC de fármacos depende de
diversos fatores, como por exemplo, as propriedades da substância ativa e o mecanismo de
libertação pretendido.
A concentração de polímero utilizada pode ter sido uma das lacunas neste trabalho, uma
vez que se sabe que o aumento da concentração de polímero reduz a quantidade de fármacos
libertada por unidade de tempo.
O objetivo primordial deste trabalho não foi alcançado, não foi possível, devido ao tempo
de otimização dos processos, encapsular fármaco e verificar o seu perfil de libertação a nível
gástrico e intestinal. No entanto, para testar as micropartículas desenvolvidas encapsulou-se a
BSA (proteína modelo) e verificou uma eficácia superior nas micropartículas
alginato/quitosano relativamente às de alginato.
Futuramente, se conseguir prosseguir o projeto, gostaria de otimizar as micropartículas de
alginato/quitosano e encapsular fármaco de forma a definir os perfis de libertação de forma
fidedigna e conclusiva e poder testar com recurso a outros métodos.
44
CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Systemic Lupus Erythematosus (Lupus) American College of Rheumatology, 2013. 2. Systemic lupus erythematosus. University of Maryland Medical Center, 2013. 3. Dohme, M.S., Lúpus Eritematoso Sistémico. Manual Merck, 2009. 4. Germano de Sousa, C.d.M.L. Núcleo de Excelência - Lúpus. [cited 2014 08/05/2014];
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15. Lopes, C.M., J.M.S. Lobo, and P. Costa, Formas farmacêuticas de liberação modificada: polímeros hidrifílicos. Braz. J. Pharm. Sci, 2005. 41(2).
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18. Fernandes, A.P.S., Caracterização dos polissacarídeos pécticos da ameixa. 2008. 19. Malafaya, P.B., G.A. Silva, and R.L. Reis, Natural–origin polymers as carriers and scaffolds for
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46
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33. Tran, V.-T., J.-P. Benoît, and M.-C. Venier-Julienne, Why and how to prepare biodegradable, monodispersed, polymeric microparticles in the field of pharmacy? International journal of pharmaceutics, 2011. 407(1): p. 1-11.
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36. Gonzalez, F.G. and L.M. Paleari, O ENSINO DA DIGESTÃO-NUTRIÇÃO NA ERA DAS REFEIÇÕES RÁPIDAS E DO CULTO AO CORPO Digestion-nutrition teaching in the fast food and body cult era. Ciência & Educação (Bauru), 2006. 12(1): p. 13-24.
37. Kruger, N.J., The Bradford method for protein quantitation, in The protein protocols handbook. 2009, Springer. p. 17-24.
38. Whiffen, L.K., D.J. Midgley, and P.A. McGee, Polyphenolic compounds interfere with quantification of protein in soil extracts using the Bradford method. Soil Biology and Biochemistry, 2007. 39(2): p. 691-694.
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47
ANEXOS
48
ANEXO I – MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO SUBMETIDAS A SUCO GÁSTRICO
E ENTÉRICO
Libertação de BSA em suco gástrico – 30 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,173 0,10096
1,19831
0,159 0,09124
0,83888
0,211 0,12732 0,123 0,06626
0,219 0,13288 0,144 0,08084
0,212 0,12802 0,154 0,08777
0,186 0,10998 0,162 0,09333
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,111 0,05794
0,7237
0,119 0,06349
0,75423
0,149 0,0843 0,136 0,07528
0,123 0,06626 0,158 0,09055
0,140 0,07806 0,150 0,085
0,136 0,07528 0,118 0,06279
49
Libertação de BSA em suco gástrico – 60 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,064 0,02533
0,27685
0,061 0,02324
0,17555
0,061 0,02324 0,043 0,01075
0,061 0,02324 0,064 0,02533
0,089 0,04267 0,048 0,01422
0,062 0,02394 0,048 0,01422
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,018 -0,00659
-0,04788
0,032 0,00312
0,13808
0,019 -0,0059 0,031 0,00243
0,015 -0,00867 0,046 0,01284
0,028 0,00035 0,077 0,03435
0,023 -0,00312 0,051 0,01631
Libertação de BSA em suco gástrico – 90 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,02 -0,0052
-0,05343
0,034 0,00451
0,02151
0,031 0,00243 0,032 0,00312
0,016 -0,00798 0,031 0,00243
0,014 -0,00937 0,026 -0,00104
0,018 -0,00659 0,030 0,00173
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
-0,018 -0,03157
-0,22273
0,008 -0,01353
-0,14502
-0,007 -0,02394 0,007 -0,01422
-0,013 -0,0281 0,007 -0,01422
0,006 -0,01492 0,005 -0,01561
0,009 -0,01284 0,006 -0,01492
50
Libertação de BSA em suco gástrico – 120 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,006 -0,01492
-0,14363
0,000 -0,01908
-0,16768
0,010 -0,01214 -0,003 -0,02116
0,004 -0,01631 0,015 -0,00867
0,006 -0,01492 -0,002 -0,02047
0,008 -0,01353 0,010 -0,01214
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,008 -0,01353
-0,08211
0,009 -0,01284
-0,17
0,011 -0,01145 0,007 -0,01422
0,014 -0,00937 -0,002 -0,02047
0,022 -0,00382 0,004 -0,01631
0,029 0,00104 0,008 -0,01353
Libertação de BSA em suco entérico – 60 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,095 0,04684
0,4975
0,105 0,05377
0,59326
0,101 0,051 0,121 0,06488
0,088 0,04198 0,118 0,06279
0,108 0,05586 0,100 0,05031
0,104 0,05308 0,128 0,06973
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,123 0,06626
0,4938
0,134 0,0739
0,49611
0,120 0,06418 0,120 0,06418
0,100 0,05031 0,093 0,04545
0,076 0,03365 0,084 0,0392
0,088 0,04198 0,100 0,05031
51
Libertação de BSA em suco entérico – 120 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,006 -0,01492
-0,06869
0,010 -0,01214
-0,14224
0,026 -0,00104 0,002 -0,01769
0,038 0,00729 0,008 -0,01353
0,013 -0,01006 0,011 -0,01145
0,005 -0,01561 0,001 -0,01839
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
-0,038 -0,04545
-0,22551
0,039 0,00798
0,15381
-0,013 -0,0281 0,060 0,02255
-0,014 -0,0288 0,028 0,00035
0,012 -0,01075 0,061 0,02324
0,002 -0,01769 0,055 0,01908
Libertação de BSA em suco entérico – 1020 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,051 0,01631
0,15612
0,025 -0,00173
-0,03122
0,047 0,01353 0,020 -0,0052
0,054 0,01839 0,029 0,00104
0,048 0,01422 0,020 -0,0052
0,054 0,01839 0,023 -0,00312
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,008 -0,01353
-0,23245
0,07 0,02949
0,42904
-0,005 -0,02255 0,08 0,03643
-0,007 -0,02394 0,109 0,05655
-0,006 -0,02324 0,079 0,03573
0,002 -0,01769 0,07 0,02949
52
ANEXO II – MICROPARTÍCULAS DE ALGINATO/QUITOSANO SUBMETIDAS A
SUCO GÁSTRICO E ENTÉRICO
Libertação de BSA em suco gástrico – 30 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
-0,008 -0,02463
-0,20192
0,001 -0,01839
-0,238
0,000 -0,01908 -0,012 -0,02741
-0,003 -0,02116 -0,011 -0,02671
0,001 -0,01839 -0,010 -0,02602
0,002 -0,01769 -0,002 -0,02047
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
-0,063 -0,06279
-0,44754
-0,002 -0,02047
-0,25604
-0,020 -0,03296 -0,010 -0,02602
-0,018 -0,03157 -0,015 -0,02949
-0,028 -0,03851 -0,012 -0,02741
-0,056 -0,05794 -0,008 -0,02463
53
Libertação de BSA em suco gástrico – 60 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,010 -0,01214
-0,09645
0,026 -0,00104
-0,04233
0,015 -0,00867 0,024 -0,00243
0,014 -0,00937 0,012 -0,01075
0,016 -0,00798 0,022 -0,00382
0,013 -0,01006 0,023 -0,00312
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,008 -0,01353
-0,12975
0,013 -0,01006
-0,04788
0,011 -0,01145 0,006 -0,01492
0,009 -0,01284 0,028 0,000347
0,009 -0,01284 0,034 0,00451
0,007 -0,01422 0,022 -0,00382
Libertação de BSA em suco gástrico – 90 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,024 -0,00243
0,024285
0,03 0,001735
0,078407
0,034 0,00451 0,051 0,016306
0,036 0,005898 0,035 0,005204
0,027 -0,00035 0,048 0,014224
0,034 0,00451 0,030 0,001735
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,004 -0,01631
-0,08118
0,016 -0,00798
-0,11171
0,019 -0,0059 0,007 -0,01422
0,022 -0,00382 0,011 -0,01145
0,017 -0,00729 0,015 -0,00867
0,017 -0,00729 0,008 -0,01353
54
Libertação de BSA em suco gástrico – 120 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,041 0,009367
0,147794
0,069 0,028795
0,294893
0,056 0,019775 0,067 0,027408
0,045 0,012143 0,076 0,033653
0,053 0,017694 0,070 0,029489
0,049 0,014918 0,068 0,028102
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,010 -0,01214
-0,11449
0,022 -0,00382
-0,0451
0,009 -0,01284 0,020 -0,0052
0,017 -0,00729 0,019 -0,0059
0,007 -0,01422 0,026 -0,00104
0,012 -0,01075 0,018 -0,00659
Libertação de BSA em suco entérico – 30 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,067 0,027408
0,289689
0,094 0,046142
0,475298
0,076 0,033653 0,092 0,044754
0,071 0,030183 0,102 0,051693
0,063 0,024632 0,090 0,043367
0,078 0,03504 0,102 0,051693
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,127 0,06904
0,698723
0,196 0,116916
1,009575
0,122 0,06557 0,194 0,115529
0,133 0,073203 0,147 0,082917
0,130 0,071121 0,158 0,09055
0,129 0,070427 0,170 0,098876
55
Libertação de BSA em suco entérico – 60 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,188 0,111366
1,256592
0,208 0,125243
1,327366
0,226 0,137732 0,219 0,132875
0,220 0,133569 0,255 0,157855
0,217 0,131488 0,208 0,125243
0,192 0,114141 0,204 0,122467
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,163 0,094019
0,980433
0,203 0,121774
1,152512
0,130 0,071121 0,185 0,109284
0,199 0,118998 0,202 0,12108
0,182 0,107202 0,186 0,109978
0,170 0,098876 0,192 0,114141
Libertação de BSA em suco entérico – 90 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,136 0,075284
0,722315
0,177 0,103733
1,044269
0,134 0,073897 0,165 0,095407
0,130 0,071121 0,163 0,094019
0,130 0,071121 0,196 0,116916
0,128 0,069734 0,189 0,112059
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,136 0,075284
0,825007
0,125 0,067652
0,701499
0,152 0,086386 0,126 0,068346
0,157 0,089856 0,131 0,071815
0,148 0,083611 0,132 0,072509
0,139 0,077366 0,129 0,070427
56
Libertação de BSA em suco entérico – 120 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,02 -0,0052
-0,0451
0,033 0,003816
0,017347
0,027 -0,00035 0,031 0,002429
0,016 -0,00798 0,028 0,000347
0,022 -0,00382 0,031 0,002429
0,02 -0,0052 0,027 -0,00035
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,035 0,005204
0,02151
0,033 0,003816
0,003469
0,029 0,001041 0,023 -0,00312
0,030 0,001735 0,025 -0,00173
0,027 -0,00035 0,025 -0,00173
0,032 0,003122 0,034 0,00451
Libertação de BSA em suco entérico – 150 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,008 -0,01353
-0,10616
0,026 -0,00104
0,00902
0,010 -0,01214 0,028 0,000347
0,007 -0,01422 0,031 0,002429
0,019 -0,0059 0,029 0,001041
0,017 -0,00729 0,030 0,001735
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,015 -0,00867
-0,09922
0,036 0,005898
0,036775
0,013 -0,01006 0,030 0,001735
0,010 -0,01214 0,033 0,003816
0,008 -0,01353 0,035 0,005204
0,020 -0,0052 0,030 0,001735
57
Libertação de BSA em suco entérico – 180 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,028 0,000347
0,006245
0,037 0,006592
0,079795
0,022 -0,00382 0,033 0,003816
0,033 0,003816 0,045 0,012143
0,030 0,001735 0,038 0,007286
0,029 0,001041 0,042 0,010061
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,020 -0,0052
-0,02845
0,032 0,003122
0,033999
0,029 0,001041 0,026 -0,00104
0,023 -0,00312 0,038 0,007286
0,022 -0,00382 0,040 0,008673
0,023 -0,00312 0,026 -0,00104
Libertação de BSA em suco entérico – 1020 min
Amostra 1 Amostra 2
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,014 -0,00937
-0,10061
0,001 -0,01839
-0,12605 0,012 -0,01075 0,012 -0,01075
0,013 -0,01006 0,015 -0,00867
Amostra 3 Amostra 4
Absorvância Concentração Massa Absorvância Concentração Massa
0,010 -0,01214
-0,15381
0,000 -0,01908
-0,16768 0,004 -0,01631 0,002 -0,01769
0,002 --0,01769 0,008 -0,01353