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Mecanismos de reparación del DNA
•Reparación reversa directa (direct reversal of damage)•Lectura de prueba de la DNA polimerasa•Reparación de fotodímeros por fotoliasas• Escisión de grupos alquilo por alquil-transferasas.
•Reparación por escisión•Escisión de base (BER)•Escisión de nucleótido (NER)•Reparación por apareamiento incorrecto (mismatch repair)
•Reparación por recombinación•Recombinación homóloga•Unión de extremos no homólogos
Mecanismos de reparación del DNA
Las células vivas han evolucionado una serie de sistemas enzimáticos que reparan los daños del DNA en una forma muy variada.La baja tasa de mutación que existe es un indicativo de la eficiencia de éstos sistemas de reparaciónLa falla de éstos sistemas conduce a un incremento en la tasa de mutación.Un número de enfermedades humanas son causadas por defectos en la reparación del DNA.En éste módulo examinaremos como la célula integra éstos sistemas de reparación en una estrategia global para reparar el DNA.
Subdiviciones del sistema de reparación
Los sistemas de reparación se pueden subdividir en:
• Reparación reversa directa
• Reparación por escisión
• Reparación por recombinación
Reparación reversa directa(direct reversal of damage)
•Lectura de prueba de la DNA polimerasa•Reparación de fotodímeros por fotoliasas• Escisión de grupos alquilo por alquil-transferasas.
Reparación reversa directa
La forma más fácil de reparar un daño es revertirlo directamente, de ésta manera, regenerando la base normal
La reversión no es siempre posible ya que algunos daños son irreversibles
Sin embargo, en algunos casos es posible, por ejemplo, fotodímeros causados por luz UV
Reparación reversa directa: lectura de prueba de la DNA polimerasa
Si los nucleótidos correctos son incorporados en el término 3´-OH la cadena permanece el el sitio Pol. Cuando hay un nucleótido mal incorporado, la cadena se transfiere a la unidad catalítica Exo.
Reparación reversa directa: fotoliasas
El fotodímero ciclobutano de pirimidina se puede reparar por una fotoliasa que se ha encontrado en bacterias y en eucariontes menores pero no en humanos.
Esta enzima se une al fotodímero y lo separa en presencia de luz visible. Esta enzima no opera en la obscuridad en cuyos casos se utilizan otras rutas para reparar el daño de UV.
Reparación reversa directa: alquil-transferasas
Las alquil-transferasas también son enzimas que reparan directamente la lesión.
Remueven ciertos grupos alquilos que han sido unidos a la posición O-6 de guanina, por ejemplo por metanosulfonato (EMS)
Esta enzima transfiere el grupo metilo de metil-guanina O-6 a un residuo de cisteína en la proteína.
Reparación por escisión
BER: procariontesBER: eucariontesNER: procariontesNER: eucariontes
Reparación por escisión
El sistema general de reparación por escisión rompe un enlace fosfodiéster en ambos lados de la lesión en la misma cadena resultando en la escisión de un oligonucleótido.Esto deja un espacio en la cadena que es reparado por medio de síntesis de DNA y ligado con ligasaEn procariontes se remueven de 12 a 13 nucleótidos mientras que en eucariontes de 27 a 29 nucleótidos son eliminados
Reparación por escisión
Repara daños ocasionados en un simple nucleótido, el cual pudo haber sido causado por: alquilación, oxidación, hidrólisis y desaminación.
En el humano existen alrededor de 40 genes que participan en esta vía de reparación.
Existen varios mecanismos de reparación por escisión
Reparación por escisión de bases (BER: base escision repair)
Reparación por escisión de nucleótidos (NER: nucleotide escision repair)
Reparación de bases mal apareadas (mismatch repair)
Método de reparación por escisión de base (BER)
Reparación por escisión de bases (BER)
La reparación por escisión de bases se lleva a cabo por DNA glicosilasas que generan un corte N-glucosídico entre el azúcar y la base, de ésta manera liberando las bases dañadas y resultando en sitios apúrinicos o apirimídicos (AP). Que son reparados por la ruta de AP endonucleasas específicas.
Método de reparación de BER
Formación de un hueco apurínico apirimídicoUna glicosilasa rompe el enlace glicosílico, quedando el azúcar sin la base (sitio AP)Una endonucleasa realiza un corteUna exonucleasa libera el segmento de DNA dañado.Una polimerasa sintetiza una cadena nueva de DNAUna ligasa sella el enlace fosfodiéster.
Glicosilasas Deaminación de citosina y 5-metil-citosina
Existen numerosas DNA glicosilasas
La uracilo-DNA glicosilasa remueve uracilo del DNA que resultan de la deaminación de la citosina y que pueden conducir a una transición C»T si el daño no se repara
La maquinaria de reparación reconoce fácilmente el uracilo ya que ésta no es una base del DNA
En cada célula humana se generan diariamente unos 10000 sitios AP que son reparados por una máquina proteica, el reparosoma, formado por cuatro proteínas que actúan concertadamente:
UDG (Uracil-DNA glicosilasa, que elimina el uracilo),
HAP1 o APE1 (AP endonucleasa, que corta la cadena azúcar-fosfato)
polimerasa β (que introduce el nucletido que faltaba)
la ligasa (que sella el corte).
.Reparación por escisión de bases (BER) en humanos
Método de reparación por escisión de nucleótido (NER)
. Reparación por escisiónde nucleótido (NER)
Proceso similar al de reparación por escisión de base excepto, en que éste no es precedido por una remoción selectiva de bases y porque se elimina un segmento de polinucleótidos más largo (2-30 bases).
Reconoce una amplia variedad de daños que distorsionan la molécula de DNA, como los ocasionados por dímeros de pirimidina
Un ejemplo de éste mecanismo de reparación es el sistema UvrABC endonuclease en E. coli.
Proporcionan un medio para reparar los dímeros de pirimidinas para aquellos organismos que no cuentan con un sistema de fotorreactivación, como en el humano.
1.- Unión del complejo multienzmático UvrAB
(trimero: 2 UvrA y 1 UVrB) al DNA dañado.
2.- Liberación del UvrA que provoca la UvrA que provoca la unión de UvrC a UvrBunión de UvrC a UvrB
3.- El dímero UvrB-C corta el 3.- El dímero UvrB-C corta el polinucleótidopolinucleótido
a ambos lados de la región dañada.a ambos lados de la región dañada.
4.- El segmento cortado es removido 4.- El segmento cortado es removido como como
un oligonucleótido y se libera UvrB y un oligonucleótido y se libera UvrB y UvrCUvrC
5.- EL gap es reparado por la acción 5.- EL gap es reparado por la acción de la DNA polimerasa I y sellado por de la DNA polimerasa I y sellado por la ligasala ligasa
Método de reparación del DNA Método de reparación del DNA por escisión (NER), en E. colipor escisión (NER), en E. coli (complejo enzimático uvrABC)(complejo enzimático uvrABC)
Modelo para la reparación de nucleótidos por escisión (NER) en mamíferos.
Acoplado a transcripciónReparación global del genoma
Factoresreplicación
Corte en 3´
Corte en 5´
Desnaturalizacióndel DNA
escisión
síntesis
Existen dos sub-rutas que difieren únicamente en el reconocimiento del daño
REPARACIÓN POR ESCISIÓN DE NUCLEÓTIDOS EN MAMÍFEROS
XPC= detección inicial
XPA= reconocimietno daño
XPB y XPD= desenrrollan la doble helice
XPG y XPF= rompen cadena
Factoresreplicación
TFIH, RPA, RF-C, PCNA = factores de transcripción que actúan con el sistema de reparación
XPA y XPG están relacionados con la enfermedad xeroderma pigmentosum (XP).
Enzimas involucradas en NER en el humano 53
Humanenzyme
Function
XPA Damage recognition
XPB Helicase
XPC DNA binding (initial damage detection)
XPD Helicase
XPF endonuclease
XPG endonuclease
ERCC1 Dimer with XPF
Se presenta por una mutación Se presenta por una mutación en uno de los genes de las en uno de los genes de las proteínas participantes en la proteínas participantes en la reparación por escisión de reparación por escisión de nucleótido (XPA-XPG)nucleótido (XPA-XPG)
Los afectados presentan una Los afectados presentan una hipersensibilidad a la luz hipersensibilidad a la luz ultravioleta por lo que sufren ultravioleta por lo que sufren muchas mutaciones que llegan muchas mutaciones que llegan a producir cáncer de piel.a producir cáncer de piel.
Xeroderma pigmentosum
Reparación por apareamiento incorrecto (mismatch repair)
Reparación por apareamiento incorrecto
Este sistema reconoce errores después de la replicación.
El mecanismo radica en tres pasos• Reconocimiento de las bases mal apareadas
• Determinar que base es la incorrecta
• Escisión de la base incorrecta y reparación.
Este sistema repara errores que escapan delEste sistema repara errores que escapan del “proofreading” . “proofreading” . Los sistemas de reparación por escición NO corrigen los Los sistemas de reparación por escición NO corrigen los nucleotidos mal apreados porque éstos no son nucleótidos nucleotidos mal apreados porque éstos no son nucleótidos anormales, son A, C, G or T que están mal apareados y anormales, son A, C, G or T que están mal apareados y son iguales a cualquier otro nucléotido. son iguales a cualquier otro nucléotido. Una vez encontrado el “mismatch” el sistema de reparación Una vez encontrado el “mismatch” el sistema de reparación corta el polinucleótido de la hebra hija donde esta el error y corta el polinucleótido de la hebra hija donde esta el error y polimeriza el “gap” en forma similar a la de reparación de polimeriza el “gap” en forma similar a la de reparación de excision de nucleótidos.excision de nucleótidos.
.Reparación por apareamiento incorrecto de bases Reparación por apareamiento incorrecto de bases
(Mismatch repair MMR)(Mismatch repair MMR)
La reparación debe de efectuarse en la cadena hija, porque ésta es la La reparación debe de efectuarse en la cadena hija, porque ésta es la que se acaba de sintetizar y es la que tiene el error, mientras que la que se acaba de sintetizar y es la que tiene el error, mientras que la cadena parental tiene la secuencia correcta. cadena parental tiene la secuencia correcta.
Como sabe el sistema de reparación cual es cual?Como sabe el sistema de reparación cual es cual?
La discriminación se basa en el grado de metilación de las cadenas. Las La discriminación se basa en el grado de metilación de las cadenas. Las secuncias GATC se metilan en la A, pero esto no se realiza en forma secuncias GATC se metilan en la A, pero esto no se realiza en forma inmediata despues de la replicación, por lo que la cadena hija recién inmediata despues de la replicación, por lo que la cadena hija recién sintetizada no esta metilada. sintetizada no esta metilada.
El sistema más conocido es el El sistema más conocido es el mutLHSmutLHS de E. coli, de E. coli, que funciona que funciona inmediatamente después de la replicación.inmediatamente después de la replicación.
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Reparación por apareamiento incorrecto de bases Reparación por apareamiento incorrecto de bases
¿Como reconoce el sistema cuál es la base incorrecta?
En bacterias la adenina en la secuencia CTAG está metilada.Después de la replicación, la adenina se tarda un poco en ser metilada.El sistema reconoce ésta cadena por la falta de metilación de la adenina y así reconoce la base mal incorporada.
Modelo de reparación del apareamiento incorrecto por el sistema MutHLS de E. coli
Mut H se une a la secuencia hemimetilada GATC al sitio incorrecto de apareamiento.Mut S se une al sitio de apareamiento incorrecto.Posteriormente, la unión de Mut L activa la actividad exonucleasa de MutH que corta un segmento de la cadena hija conteniendo la mutación. La síntesis de DNA seguido por el ligamiento es llevado a cabo por DNA polimerasa y ligasa respectivamente.
oEste sistema de reparación es similaral de E. coli, se diferencia en que la cadena recién sintetizada se distinguede la parental en que ésta contiene“strand breaks”
oMutS y MutL se unen a la sección porReparar lo que activa la acción de una helicasa y una exonucleasa, eliminando La sección dañada.
oPosteriormente con la participación dela DNA polimerasa y ligasa cierra el gap.
Modelo de reparación del apareamiento incorrecto mismatch en eucariontes
Las células deficientes en MMR tienen índices de Las células deficientes en MMR tienen índices de mutación de 100-1000 veces más alto que las normales, mutación de 100-1000 veces más alto que las normales, por lo que se incrementa el riesgo de desarrollar cáncer. por lo que se incrementa el riesgo de desarrollar cáncer.
En humanos, las mutaciones en las proteínas involucradas en MMR (MutS and MutL) se asocian con el cáncer colorectal hereditario.
Deficiencia en la reparación por apareamiento Deficiencia en la reparación por apareamiento incorrecto de bases. incorrecto de bases.
Reparación por recombinación
Recombinación homóloga
Unión de extremos no homólogos
Reparación por recombinación (doble cadena)
** Se realiza después de la replicación
Reparación por recombinación homóloga
En los sistemas de reparación de reversa directa y de escisión corrigen DNA dañado antes de la replicación de tal manera que se utiliza la cadena no dañada como templado.
Sin embargo, en la reparación por recombinación homóloga se requiere la presencia de una secuencia idéntica o cercanamente idéntica como templado para reparar el daño.
La maquinaria enzimática utilizada en este proceso es muy parecida a la utilizada en el entrecruzamiento de cromosomas durante la meiosis. Esta vía utiliza la cromátida hermana recién sintetizada como templado., ej: una copia idéntica que esta ligada a la dañada a través del centrómero.
Reparación por recombinación homóloga
dímero de timidina
No ha sido reparado por Escisión. Durante lareplicaciónel sistema se “salta” el dímero.
Se forman dos moléculas hijas. una de ellas esta completa, pero la otra tiene una región no apareada contiene el dímero
Este daño no se puede reparar por los sistemas usuales de reparación. Sin embargo puede ser reparado mediante un sistema de recombinación con una cromátida del cromosoma homólogo.
Los segmentos de la cadena donde se cruzan se unen con la ayuda de una proteína llamada RUv
molécula con un hueco, pero éste se puede llenar por medio de la polimerasa y ligasa
¿Como se puede reparar este daño?
Actúa la proteína RecA que catalizael intercambio o entrecruzamientoentre la molécula dañada y la sintetizada correctamente.
molécula hija que aún tiene al dímero, pero puede repararse por el sistema de escisión.
Unión de extremos no homólogos
(rompimientos de doble cadena)
Mecanismo de reparación por la unión de extremos de cromosomas no homólogos por rompimiento en la doble
cadena
Cuando existen rompimientos de doble cadena, éstos se pueden reparar ya sea• uniendo los extremos rotos de dos cromosomas diferentes. Esto
resulta en translocaciones que pueden resultar en problemas muy serios.
• O uniendo los extremos del mismo cromosoma lo que puede resultar en pérdida de varios pares de bases en el sitio de unión.
Las radiaciones ionizantes son la causa principal de los rompimientos de doble cadena.
Mecanismo de reparación por la unión de extremos de cromosomas no homólogos por rompimiento en la doble cadena
Se unen a los extremos la proteína Ku y una quinasa.Las proteínas Ku forman una región de sinapsis en la cual los extremos rotos se translapan.Ku separa los extremos con su acción helicasa exponiendo regiones homólogas las cuáles se aparean.Los extremos 5´no apareados son eliminados y el daño es reparado con pérdida de varios pares de bases en el sitio de unión
SOS repair
Error prone repair
SOS: mecanismo inducible de reparación del DNA
Se expresa cuando el daño al DNA es muy intensoIntroduce bases al azar en el segmento dañado de DNAEl organismo lo utiliza como último recurso porque muchas veces constituye otra fuente de mutagénesis
