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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor
actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y
Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la Universidad
Central del Ecuador.
Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de:
Química Farmacéutica
AUTOR: Verónica Estefanía Suquillo Lugmaña
TUTOR: MSc. Dayana Paulina Borja Espín
DMQ, junio, 2017
iii
Suquillo Lugmaña, Verónica Estefanía (2016). Elaboración de una
forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor
actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum,
Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento de
los libros del Área Histórica de la Universidad Central del
Ecuador. Trabajo de investigación presentado como requisito
previo para la obtención del título de Química Farmacéutica.
Carrera de Química Farmacéutica. Quito: UCE. 81 p.
iv
DEDICATORIA
A Dios y mi madre
v
AGRADECIMIENTO
A Dios, por ser mi apoyo incondicional en todo este tiempo.
A mi madre por su invaluable apoyo y por su confianza en mí.
A mi hermano y su familia porque de una u otra forma estuvieron a mi lado durante esta
etapa de mi vida.
También deseo expresar mi agradecimiento a mi tutora, MSc. Dayana Borja por toda su
ayuda y paciencia.
A mis grandes amigas y amigos, Dianita, David, Paúl, Marcos, Germania, Jairo, Alejandro,
Luis por su amistad y apoyo en la etapa universitaria.
vi
vii
viii
ix
x
Índice de Contenidos
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
Capítulo I ................................................................................................................................... 2
1. El problema ............................................................................................................................ 2
1.1. Planteamiento del problema ............................................................................................ 2
1.2. Formulación del problema .............................................................................................. 3
1.3. Objetivos ......................................................................................................................... 3
1.3.1. Objetivo general. ...................................................................................................... 3
1.3.2. Objetivos específicos. ............................................................................................... 3
1.4. Importancia y justificación .............................................................................................. 3
Capítulo II .................................................................................................................................. 5
2. Marco teórico ......................................................................................................................... 5
2.1. Antecedentes de la investigación .................................................................................... 5
2.2. Fundamento teórico ......................................................................................................... 6
2.2.1. Hongos. ..................................................................................................................... 6
2.2.2. Estructura de los hongos filamentosos ..................................................................... 6
2.2.3. Clasificación de los hongos. ..................................................................................... 6
2.2.4. Aspergillus spp. ........................................................................................................ 7
2.2.5. Penicillium spp. ........................................................................................................ 8
2.2.6. Condiciones de crecimiento de los hongos. .............................................................. 8
2.2.7. Los hongos como factores de degradación de documentos bibliográficos. ............. 8
2.2.8. Agentes antifúngicos o antimicóticos. ...................................................................... 9
2.2.9. Aceites esenciales y su actividad antifúngica. .......................................................... 9
2.2.10. Obtención de los aceites esenciales. ....................................................................... 9
2.2.11. Destilación por arrastre de vapor. ......................................................................... 10
2.2.12. Descripción botánica del anís. .............................................................................. 10
2.2.13. Descripción botánica del clavo de olor. ................................................................ 11
2.2.14. Descripción botánica del jengibre. ....................................................................... 11
2.2.15. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ............................................................ 12
2.2.16. Concentración Fungicida Mínima (CFM) ............................................................ 12
2.2.17. Dilución en caldo. ................................................................................................. 12
2.2.18. Formas farmacéuticas ........................................................................................... 12
2.2.19. Emulsiones............................................................................................................ 13
2.2.20. Tipos de emulsiones ............................................................................................. 13
xi
2.2.21. Agentes surfactantes ............................................................................................. 14
2.2.22. Balance Hidrofílico-Lipofílico (BHL) .................................................................. 15
2.2.23. Formulación de emulsiones por el método BHL .................................................. 16
2.3. Fundamento legal. ......................................................................................................... 16
2.4. Hipótesis ........................................................................................................................ 17
2.4.1. Hipótesis alternativa ............................................................................................... 17
2.4.2. Hipótesis nula ......................................................................................................... 17
2.5. Sistema de variables ...................................................................................................... 17
2.5.1. Variables dependientes. .......................................................................................... 18
2.5.2. Variables independientes. ....................................................................................... 18
Capítulo III ............................................................................................................................... 19
3. Metodología de la investigación .......................................................................................... 19
3.1. Diseño de la investigación ............................................................................................ 19
3.2. Metodología .................................................................................................................. 19
3.3. Materiales y reactivos.................................................................................................... 19
3.3.1. Materiales. .............................................................................................................. 19
3.3.2. Equipos. .................................................................................................................. 20
3.3.3. Reactivos. ............................................................................................................... 20
3.4. Procedimientos .............................................................................................................. 21
3.4.1. Extracción de los aceites esenciales. ...................................................................... 21
3.4.2. Activación de las cepas ATCC de hongos.............................................................. 22
3.4.3. Preparación del inóculo. ......................................................................................... 23
3.4.4. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). ............................................................. 25
3.4.5. Concentración Fungicida Mínima (CFM). ............................................................. 26
3.4.6. Formulación de la emulsión ................................................................................... 27
3.4.7. Proceso de manufactura de la emulsión. ................................................................ 27
3.4.8. Proceso de aplicación de la emulsión en los libros. ............................................... 27
3.4.9. Análisis de superficies no planas (libros) por hisopado. ........................................ 28
3.5. Diseño experimental ...................................................................................................... 29
3.5.1. Diseño factorial A x B. ........................................................................................... 29
3.5.2. Etapa 1. ................................................................................................................... 29
3.5.3. Etapa 2. ................................................................................................................... 30
3.6. Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico) ............................................ 32
3.7. Matriz de operacionalización de las variables ............................................................... 32
xii
Capítulo IV............................................................................................................................... 33
4. Análisis y discusión de resultados ....................................................................................... 33
4.1. Extracción de los aceites esenciales .............................................................................. 33
4.1.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Pimpinella
anisum (anís)..................................................................................................................... 33
4.1.2. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Syzygium
aromaticum (clavo de olor). ............................................................................................. 34
4.1.3. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Zingiber
officinale (jengibre). ......................................................................................................... 34
4.1.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales. ........... 34
4.2. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ..................................................................... 35
4.2.1. Preparación del inóculo. ......................................................................................... 35
4.3. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) ................................... 36
4.4. Concentración Fungicida Mínima (CFM) ..................................................................... 37
4.5. Manufactura de la forma farmacéutica a base del aceite esencial que presentó la mejor
actividad antifúngica ............................................................................................................ 38
4.5.1. Formulación de la emulsión. .................................................................................. 38
4.6. Condiciones para la aplicación de la emulsión ............................................................. 45
4.7. Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica ...................................................... 45
4.8. Análisis estadístico de la Eficacia de las emulsiones .................................................... 49
Capítulo V ................................................................................................................................ 53
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................................ 53
5.1. Conclusiones ................................................................................................................. 53
5.2. Recomendaciones .......................................................................................................... 55
Bibliografía: ............................................................................................................................. 56
6. ANEXOS ............................................................................................................................. 58
6.1. Anexo 1: Esquema causa - efecto ................................................................................. 58
6.2. Anexo 2: Diagrama de flujo para la extracción de los aceites esenciales ..................... 59
6.3. Anexo 3: Diagrama de flujo para la aplicación de la emulsión en los libros ................ 59
6.4. Anexo 4: Fotografías ..................................................................................................... 60
xiii
Índice de ecuaciones
Ecuación 3.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial ....................... 22
Ecuación 3.2. Número de esporas ........................................................................................... 23
Ecuación 3.3. Número de esporas por mililitro ...................................................................... 24
Ecuación 3.4. Calculo del factor de dilución .......................................................................... 28
Ecuación 3.5. Unidades formadoras de colonia por cm2 ........................................................ 28
Ecuación 3.6. Porcentaje no reducido de unidades formadoras de colonia ............................ 29
Ecuación 3.7. Porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonias ......................... 29
Ecuación 4.1. BHL total .......................................................................................................... 38
xiv
Índice de gráficos
Gráfico 4.1.Contribución de cada factor en la separación de fases ........................................ 41
Gráfico 4.2.Contribución de cada factor en la redispersión de la emulsión ........................... 43
Gráfico 4.3 Influencia de cada factor sobre la separación de las fases y redispersión. .......... 44
Gráfico 4.4. Influencia de cada factor en el porcentaje de reducción de las unidades
formadoras de colonia (ufc) ..................................................................................................... 51
Gráfico 4.5. Comparación del porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonia
(ufc) con cada formulación ...................................................................................................... 52
xv
Índice de ilustraciones
Ilustración 2.1. Estructura de un hongo filamentoso ................................................................ 6
Ilustración 2.2. Morfología de A. fumigatus ............................................................................. 7
Ilustración 2.3. Morfología de Penicillium spp. ....................................................................... 8
Ilustración 2.4. Semillas de anís ............................................................................................. 10
Ilustración 2.5. Clavo de olor ................................................................................................. 11
Ilustración 2.6. Jengibre ......................................................................................................... 11
Ilustración 2.7. Tipos de emulsiones .................................................................................... 13
Ilustración 2.8. Función del agente surfactante ...................................................................... 14
Ilustración 2.9. Estructura de los emulsificantes .................................................................... 15
Ilustración 2.10. Valores de BHL y su función ...................................................................... 15
Ilustración 3.1. Equipo Clevenger .......................................................................................... 22
Ilustración 3.2. Presentación Kwik Stik ................................................................................. 23
Ilustración 3.3. Cámara de Neubauer ..................................................................................... 24
Ilustración 3.4. Recuento de microorganismos en la cámara de Neubauer ............................ 25
Ilustración 3.5. Distribución de la placa de microdilución..................................................... 26
Ilustración 3.6. Concentraciones de los aceites esenciales en cada pocillo de la placa de
microdilución ........................................................................................................................... 26
xvi
Índice de Tablas
Tabla 2.1. Valores de BHL de algunos agentes surfactantes .................................................. 16
Tabla 3.1. Diseño factorial.. .................................................................................................... 30
Tabla 3.2. Tabla de ANOVA para un diseño factorial a x b con n réplicas............................ 32
Tabla 3.3. Matriz de Operacionalización de variables ............................................................ 32
Tabla 4.1. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Pimpinella anisum (anís) ......... 33
Tabla 4.2. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Syzygium aromaticum (clavo de
olor) .......................................................................................................................................... 34
Tabla 4.3. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Zingiber officinale (jengibre) ... 34
Tabla 4.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de cada aceite esencial. ............. 34
Tabla 4.5. Porcentaje de rendimiento en la extracción de los aceites esenciales .................... 35
Tabla 4.6. Número de esporas por mililitro ............................................................................ 36
Tabla 4.7. Concentración Inhibitoria Mínima, expresada en porcentaje v/v .......................... 36
Tabla 4.8. Concentración Inhibitoria Mínima a intervalos más cortos % v/v ........................ 37
Tabla 4.9. Concentración Fungicida Mínima en porcentaje v/v ............................................. 37
Tabla 4.10. Parámetros que se evaluaron en la formulación de las emulsiones. .................... 38
Tabla 4.11. Porcentajes de Tween 80 y Span 60 para obtener 3 valores de BHL diferentes . 39
Tabla 4.12. Formulaciones evaluadas ..................................................................................... 39
Tabla 4.13. Resultados obtenidos al evaluar la redispersión y la separación de fases de las
emulsiones................................................................................................................................ 40
Tabla 4.14. Análisis de Varianza para la separación de fases ................................................. 40
Tabla 4.15. Contribución de cada factor en la separación de fases ........................................ 41
Tabla 4.16. Análisis de varianza para la redispersión ............................................................. 42
Tabla 4.17.Contribución de cada factor en la redispersión ..................................................... 42
Tabla 4.18. Mejores condiciones en las formulaciones analizadas......................................... 44
Tabla 4.19. Números de experimentos con las mejores condiciones ...................................... 44
Tabla 4.20. Emulsión A, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 46
Tabla 4.21. Emulsión A, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 47
Tabla 4.22. Emulsión B, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 47
Tabla 4.23. Emulsión B, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 48
Tabla 4.24. Emulsión C, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales ................................ 48
xvii
Tabla 4.25. Emulsión C, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales ................................ 49
Tabla 4.26. Factores y niveles para el análisis de varianza..................................................... 49
Tabla 4.27. Promedio del porcentaje de reducción de ufc en cada tratamiento estadístico .... 50
Tabla 4.28. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades formadoras
de colonia (ufc) ........................................................................................................................ 50
Tabla 4.29. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades formadoras
de colonia (ufc) ........................................................................................................................ 51
xviii
Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor
actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y
Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la Universidad
Central del Ecuador.
Autor: Verónica Suquillo
Tutor: MSc. Dayana Borja
RESUMEN
Entre las plagas que amenazan a diario las colecciones de bibliotecas y archivos, los hongos
son los más significativos. Estos microorganismos son perjudiciales para los documentos en
papel ya que provocan extensas manchas, afectan las tintas, degradan del papel ocasionando
pérdida de información. El objetivo de ésta investigación fue, elaborar una forma
farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor actividad antifúngica de entre las
especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento
de los libros del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador.
En primer lugar, se extrajo el aceite esencial de las tres especies vegetales mediante arrastre
de vapor. Luego se identificó la concentración mínima inhibitoria, la concentración mínima
fungicida de cada aceite esencial utilizando el método de dilución en caldo y siembra por
extensión en agar, respectivamente. Con los resultados obtenidos de las pruebas anteriores, se
determinó que el aceite esencial de jengibre (Zingiber officinale) presenta la mejor actividad
antifúngica, con una concentración fungicida mínima de 25% v/v sobre la cepa de Aspergillus
niger y de 30% v/v sobre la cepa de Penicillium chrysogenum.
Posteriormente, con el aceite esencial de jengibre (Zingiber officinale) se elaboraron varias
emulsiones o/w, con las que se estudió el efecto de tres factores: el valor del BHL, porcentaje
de tensoactivo y el tiempo de agitación en la estabilidad de la emulsión. Con las 3 emulsiones
que se obtuvieron los mejores parámetros de estabilidad se realizó la aplicación en los libros
para determinar reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia. El análisis de
los datos se realizó mediante un diseño experimental factorial. Se obtuvieron los mejores
resultados en la reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia con la
formulación A (tiempo de agitación de 5 minutos, concentración de tensoactivo del 5% y un
BHL de 12) y un tiempo de aplicación de 40 segundos por cada zona de aplicación a través
de un aerógrafo.
Palabras claves:
ACEITES ESENCIALES HONGOS DOCUMENTOS BIBLIOGRÁFICOS
xix
Develop a pharmaceutical form with the essential oil that present the best antifungal
activity of between species Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, and Zingiber
officinale for the treatment of the books of the Historical Area of the Central University
of Ecuador.
Author: Verónica Suquillo
Tutor: MSc. Dayana Borja
ABSTRACT
Pests that threaten daily holdings of libraries and archives, fungi are the most significant.
These microorganisms are harmful to paper documents as they cause extensive, affect the
inks, degrade the paper causing loss of information. The objective of this research was to
develop a pharmaceutical form with the essential oil that present the best antifungal activity
of between species Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, and Zingiber officinale for the
treatment of the books of the Historical Area of the Central University of Ecuador.
In the first place, we extracted the essential oil of the three plant species through steam. Then
identified 4the minimum inhibitory concentration, the minimum concentration fungicide of
each essential oil using the broth dilution method and by extension in agar, respectively. With
the results of previous tests, it was determined that the essential oil of ginger (Zingiber
officinale) presents the best antifungal activity, with a minimum fungicide of 25% v/v on the
strain of Aspergillus niger and 30% v/v on the strain of Penicillium chrysogenum.
Subsequently, with the essential oil of ginger (Zingiber officinale) has developed a number of
o/w emulsions, which study the effect of three factors: the value of the BHL, percentage of
surfactant and the time of upheaval in the stability of the emulsion. With the 3 emulsions
obtained the best parameters of stability of the application in the books to determine
percentage reduction in colony forming units. The analysis of the data was conducted by
means of a factorial experimental design. The best results were obtained in the percentage
reduction in colony forming units with the formulation A (time of upheaval of 5 minutes, 5%
surfactant concentration and a BHL of 12) and a time of 40 seconds for each application area
through an airbrush.
Keywords:
ESSENTIAL OILS FUNGUS BIBLIOGRAPHIC DOCUMENTS
1
INTRODUCCIÓN
Gran parte de nuestra historia que constituye el patrimonio cultural está registrado en
documentos o diversos trabajos de arte hechos en papel y al estar expuestos constantemente a
las influencias del medio ambiente, como son las condiciones físicas, químicas y biológicas,
sufren procesos de degradación. Entre los más comunes que afectan a los documentos
bibliográficos se encuentran los factores biológicos, por ejemplo, los hongos. Por éste motivo
es importante la conservación y preservación de los documentos.
En la búsqueda de nuevos productos y métodos que sean efectivos en la conservación
documental, se han tomado en cuenta a los aceites esenciales, que desde la antigüedad han
sido reconocidos por tener actividades biológicas.
La investigación se llevará a cabo con los documentos bibliográficos del Área Histórica de la
Universidad Central del Ecuador que actualmente cuenta con un área de cuarentena en la cual
se encuentran 190 libros contaminados con hongos.
En el presente trabajo de investigación en el capítulo I se describe el planteamiento y
formulación del problema, el objetivo planteado fue “Elaborar una forma farmacéutica con el
aceite esencial que presente la mejor actividad antifúngica de entre las especies Pimpinella
anisum, Syzygium aromaticum, y Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área
Histórica de la Universidad Central del Ecuador”, además se especifica la importancia y
justificación para el desarrollo de la investigación.
Todo lo referente a los antecedentes investigativos, marco teórico y legal que sustentan el
desarrollo de la investigación, las hipótesis planteadas y el sistema de variables, se
encuentran detalladas en el capítulo II. En cuanto a la metodología de la investigación, que
incluye el diseño de la investigación, métodos y materiales, el diseño experimental junto con
el análisis estadístico que se utilizó se encuentra explicado en el capítulo III. El análisis y
discusión de los resultados se explica en el capítulo IV. Finalmente, las conclusiones y
recomendaciones se describen en el capítulo V.
2
Capítulo I
1. El problema
1.1. Planteamiento del problema
Las bibliotecas clásicas, principalmente las antiguas y con obras incunables son depósitos
de una gran riqueza de colecciones organizadas de libros, publicaciones impresas en
papel y otros tipos de documentos gráficos, con un gran significado cultural e histórico
para un determinado pueblo o nación, y que varias obras no se encuentran en otro lugar
del mundo. Constituyendo escenarios de importancia que proporcionan herramientas
para conocer e interpretar de mejor manera el desarrollo de nuestro entorno social al
considerar a los libros como vínculos de la cultura.
La conservación de los libros y documentos en general, ha sido el punto que se le ha
prestado la menor atención a lo largo de los años y ahora está tomando fuerza. Debido al
uso, el tiempo y las condiciones desfavorables de almacenamiento que han estado
sometidos, los documentos patrimoniales han envejecido y sufrido deterioro en sus
estructuras a lo largo de su vida útil en beneficio de la sociedad.
Por los motivos antes descritos, en la actualidad se están implementando actividades de
conservación y restauración documental, ya que los principales problemas que se han
presentado en los libros, son los agentes fúngicos, que causan daños importantes como
manchas obscuras y hojas quebradizas, ocasionando la pérdida de la información.
En el Área Histórica del Centro de Información Integral de la Universidad Central del
Ecuador se encuentra un repositorio bibliográfico de alrededor 40000 libros, los mismos
que formaban parte del fondo de la Biblioteca General y de las diferentes redes de
bibliotecas que constituyen parte del Campus Universitario. Estos bienes documentales y
bibliográficos están comprendidos entre los años 1845 y 1960, abarcando un período de
once décadas. Algunos de los ejemplares se encuentran afectados principalmente con
Penicillium y Aspergillus, hongos potencialmente patógenos que además de causar
problemas con los libros, también son un peligro potencial para las personas que trabajan
en el Área Histórica en las actividades de conservación y restauración documental.
.
3
1.2. Formulación del problema
Debido a la problemática generada por la contaminación de los documentos
bibliográficos del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador, con hongos,
principalmente Aspergillus spp., Penicillium spp. y a la búsqueda de nuevas alternativas
de control de la contaminación. Se plantea la siguiente interrogante:
¿El uso de una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor
actividad antifúngica, podrá eliminar los hongos presentes en los libros del Área Histórica
de la Universidad Central del Ecuador?
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivo general.
Elaborar una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor actividad
antifúngica de entre las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y
Zingiber officinale para el tratamiento de los libros del Área Histórica de la
Universidad Central del Ecuador.
1.3.2. Objetivos específicos.
Extraer el aceite esencial de las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum, y
Zingiber officinale por arrastre de vapor.
Determinar la concentración mínima inhibitoria (CIM) de los aceites esenciales de
tres especies vegetales Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum y Zingiber officinale
frente a los hongos, Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.
Determinar la concentración mínima fungicida (CFM) de los aceites esenciales de tres
especies vegetales, Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum y Zingiber officinale
frente a las cepas Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.
Elegir el aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica para la elaboración
de una forma farmacéutica.
Evaluar la eficacia de la forma farmacéutica en el tratamiento de los libros
contaminados con hongos.
1.4. Importancia y justificación
A lo largo de la historia el ser humano ha utilizado la escritura en papel para manifestar
los conocimientos adquiridos sobre la realidad y sus vivencias, como constancia para la
posteridad. Para el caso del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador estos
documentos bibliográficos están citados desde la expulsión de los jesuitas a mediados del
siglo XVIII.
4
Por lo tanto, los documentos bibliográficos son la evidencia de la historia, por lo que es
importante la conservación, entre las actividades que podemos describir se encuentran:
proteger de contaminantes ambientales, fluctuaciones tanto en temperatura y humedad,
evitar la proliferación de hongos que son los principales agentes contaminantes de los
libros.
Los métodos tradicionalmente utilizados, presentan algunos inconvenientes, como son, el
elevado costo de los agentes antifúngicos, uso de solventes tóxicos que representan un
riesgo potencial para la salud del personal que realizan las actividades de conservación y
restauración documental.
Por la elevada contaminación que presentan los documentos del Área Histórica,
principalmente con hongos, además el uso de métodos y técnicas con escasos resultados
positivos, confiere importancia a ésta investigación, que busca reducir o eliminar la
contaminación por hongos en los documentos bibliográficos. Además, el presente estudio
se enfoca en la utilización de productos naturales, como son los aceites esenciales,
productos amigables con el medio ambiente, y que representan un bajo riesgo de
toxicidad para el personal que labora en el Área Histórica de la Universidad Central del
Ecuador.
5
Capítulo II
2. Marco teórico
2.1. Antecedentes de la investigación
El trabajo titulado: Formulación de una solución antifúngica para el tratamiento de libros
del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador. Realizado por David Campués,
es el primer trabajo realizado en el campo de la restauración documental en la
Universidad Central del Ecuador. En esta investigación se identificó a los géneros
Aspergillus spp y Penicillium spp como los principales contaminantes de los documentos
bibliográficos; además se elaboró una solución utilizando fluconazol y una mezcla de tres
solventes en diferentes proporciones metanol: etanol: agua. (Campues, 2016)
Existen artículos científicos relacionados al presente tema, como se cita a continuación:
El trabajo titulado: Essential Oils of Plants as Biocides against Microorganisms Isolated
from Cuban and Argentine Documentary Heritage (Aceites esenciales de plantas como
biocidas contra microorganismos aislados del Patrimonio Documental de Cuba y
Argentina). Realizado por: Sofia Borrego y colaboradores. Publicado el 23 agosto de
2012. En este trabajo se obtuvieron los siguientes resultados:
Los aceites esenciales de anís y ajo mostraron la mejor actividad antifúngica en
todas las concentraciones estudiadas, mientras que el aceite de orégano logró prevenir
la esporulación.
Los aceites esenciales de naranja dulce y laurel tuvieron una actividad negativa contra
las cepas fúngicas. (Borrego, 2012)
La investigación titulada: Antifungals on paper conservation (Antifúngicos para la
conservación del papel). Realizado por: S. Sequeira y colaboradores. Publicado el 14 de
agosto de 2012. Realizado en el Departamento de Conservación y Restauración,
Universidad de Nova de Lisboa, Portugal. En esta investigación se llegaron a las
siguientes conclusiones:
Se encontró que la eficacia de un compuesto o método antifúngico puede cambiar con
varios factores, por ejemplo, su mecanismo de acción, la concentración o intensidad
utilizada, y el período de contacto o acción.
La susceptibilidad de los hongos a un compuesto antifúngico en particular o método
puede depender de la cepa fúngica, su etapa de desarrollo, o si es o no parte de una
biopelícula.
En relación con los compuestos químicos antifúngico (fungistáticos o fungicidas), el
propionato de calcio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico (parabenos) y etanol, son los
que combinan menores efectos secundarios para la salud y un menor impacto negativo
en las propiedades del papel. (Sequeira, 2012)
6
2.2. Fundamento teórico
2.2.1. Hongos.
Son un grupo muy diverso de seres vivos, diferentes de las plantas y de los animales.
Pertenecen al reino Fungi. Son organismos eucariotas, heterótrofos, pueden ser
unicelulares o pluricelulares. (Casal, 2012). Su membrana citoplasmática está
constituida por proteínas y esteroles, principalmente el ergosterol. Por el exterior de la
membrana citoplasmática se encuentra la pared celular que contiene polisacáridos y
proteínas. Los polisacáridos más importantes son la quitina, el manano y el glucano.
(Aristegui, 2002).
2.2.2. Estructura de los hongos filamentosos
Son hongos formados por filamentos llamados hifas, el conjunto de las cuales forman
el micelio. Las hifas aéreas constituyen el micelio aéreo y forman las esporas. Las
hifas subterráneas originan el micelio subterráneo, que es el encargado de la nutrición.
Las esporas pueden ser pigmentadas y le dan el color al hongo. En el centro de la
colonia se ubican las hifas fértiles que dan origen a las esporas. (Sánchez, 2014)
Ilustración 2.1. Estructura de un hongo filamentoso (Sánchez, 2014)
2.2.3. Clasificación de los hongos.
Los hongos presentan los siguientes estados morfológicos:
Levaduras: Son unicelulares, redondos o elipsoides. Se reproducen por gemación o
fisión binaria. Dan lugar a colonias lisas. Ejemplo: Saccharomyces cerevisiae.
(Aristegui, 2002)
Mohos: También llamados filamentosos, micelares. Son multicelulares. La hifa es el
elemento tubular que emerge, el cual crece y se ramifica, formando un conjunto,
denominado micelio. Parte de las hifas se introducen en el sustrato para obtener
7
nutrientes, formando el micelio vegetativo; las hifas que se proyectan hacia el exterior
constituyen el micelio aéreo, donde se produce los elementos de propagación que
pueden ser esporas, conidios, etc. Producen colonias algodonosas o pulverulentas.
Ejemplo: Penicillium, Aspergillus. (Uribarren, 2015)
Setas: Son basidiomicetos filamentosos que forman cuerpos fructíferos, que
constituyen la parte comestible llamada seta. Durante la mayor parte de su existencia
viven en forma de micelio creciendo en el suelo, en los desechos de las hojas y los
troncos. Cuando las condiciones del medio son favorables, principalmente en períodos
húmedos y fríos, se desarrolla primero como un pequeño botón y luego como seta
madura. (Madigan, 2008)
Algunos hongos presentan dimorfismo, ya que tienen la capacidad de adoptar la forma de
levadura o producir la forma filamentosa, según ciertas condiciones ambientales o de
nutrientes. Uno de los factores ambientales más importantes para el crecimiento de una u
otra forma es la temperatura, a 25-28 °C crecen en forma de hongos filamentosos y a 35-
37 °C crecen en forma de levaduras. Ejemplos: Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis. (Giusiano, 2012)
2.2.4. Aspergillus spp.
Pertenece al filo Ascomycota. Es un hongo filamentoso, saprofito que se encuentra en
el suelo, restos vegetales y el aire ambiental. Está formado por hifas hialinas septadas
y puede tener reproducción sexual (con formación de ascosporas) y asexual (con
formación de conidios).
Existen características para cada especie, entre las que podemos nombrar el tamaño,
textura que puede ser aterciopelada, granular y algodonosa; tasa de crecimiento y
color de la colonia, por ejemplo, verde-amarillento en A. flavus, negro para A. niger,
marrón para A. terreus. La coloración aparece en todas las estructuras aéreas.
(Higiene, 2012)
Macroscópico Microscópico
Ilustración 2.2. Morfología de A. fumigatus (Mendez, 2015)
8
2.2.5. Penicillium spp.
Son hongos filamentosos, que se encuentran en suelo, en el aire. La mayoría de
especies son considerados contaminantes. Su reproducción es asexual y sexual.
Las colonias pueden ser blancas, aplanadas, de superficie lisa y aterciopelada, cuando
esporula su centro es de color verde. Con el tiempo la superficie de las colonias se
torna radiada. (Higiene, 2012)
2.2.6. Condiciones de crecimiento de los hongos.
Temperatura: El rango de crecimiento óptimo es de 20 °C a 30 °C, aunque algunos
hongos crecen entre 0 °C a 35 °C.
Humedad: El rango de crecimiento óptimo es de 70% a 93% de humedad relativa.
Sin embargo, una humedad superior al 40% permite la germinación y el crecimiento.
Oxígeno: Son organismos aeróbicos, que requieren oxígeno para el crecimiento.
Luz: No es necesaria. El crecimiento del hongo puede continuar indefinidamente sin
luz. (Peart, 2001).
2.2.7. Los hongos como factores de degradación de documentos bibliográficos.
Los hongos se reproducen por esporulación. Para su desarrollo, necesitan de
materiales orgánicos tales como papel, cuero, fibras naturales, debido a que se
alimentan de la glucosa obtenida por la alteración de la molécula de celulosa. (Arce,
2000)
Macroscópico Microscópico
Ilustración 2.3. Morfología de Penicillium spp. (Mendez, 2015)
9
La presencia de hongos es notoria debido a que provocan perforaciones, moteado o
foxing y pigmentaciones amarillentas. Se han identificado más de 200 especies de
hongos que afectan a los archivos y bibliotecas, entre los más conocidos están:
Aspergillus y el Penicillium que producen manchas redondas de coloración amarilla o
pardo obscura que se extienden y contagian los archivos. (Briand, 2011)
2.2.8. Agentes antifúngicos o antimicóticos.
Engloba a las sustancias que son capaces de producir una alteración en las estructuras
de un hongo o célula fúngica, alterar su capacidad de supervivencia o viabilidad, que
consiga inhibir su desarrollo de forma directa o indirecta. (Gregori, 2005)
2.2.9. Aceites esenciales y su actividad antifúngica.
Los productos de origen vegetal han sido estudiados en su parte química, con énfasis
en los metabolitos secundarios, los cuales están implicados en el control biológico
contra patógenos o plagas.
Los aceites esenciales son la principal fuente natural de monoterpenos, encontrándose
también en menor cantidad otros terpenos como sesquiterpenos, diterpenos y
compuestos fenólicos como fenilpropenoides. Su efecto antimicrobiano y antifúngico
es atribuido a la presencia de monoterpenos y compuestos fenólicos que los
componen. (Lizcano, 2007)
Los aceites esenciales se componen principalmente de terpenoides, que son
hidrocarburos aromáticos cíclicos, debido a su carácter hidrófobo se acumulan en la
bicapa lipídica de la membrana celular de los microorganismos de acuerdo con un
coeficiente de partición que es específico para cada compuesto. Esta acumulación
conduce a la alteración de la estructura y función de la membrana, es decir, ejercer
efectos negativos sobre la fuerza motriz de los protones. (Borrego, 2012)
2.2.10. Obtención de los aceites esenciales.
Los aceites esenciales fueron extraídos a partir del material vegetal fresco, mediante
destilación por arrastre con vapor de agua, en un aparato tipo clevenger durante 3h.
Posteriormente, los aceites obtenidos fueron separados del agua mediante un embudo
de separación y fueron almacenados en oscuridad a 8ºC. (Dambolena, 2011).
Los aceites esenciales de las tres especies vegetales fueron obtenidos mediante
arrastre de vapor para evitar el consumo de solventes orgánicos y mantener el enfoque
de la investigación en productos amigables con el medio ambiente.
10
2.2.11. Destilación por arrastre de vapor.
Se lleva a cabo con la vaporización selectiva del componente volátil que se encuentra
en una mezcla. Se logra a través de la inyección de vapor de agua directamente en la
mezcla, denominándose, vapor de arrastre. En realidad, el componente volátil se
condensa en el matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la
mezcla a destilar para lograr su evaporación.
La condición más importante en este tipo de destilación es que el componente volátil
sea insoluble en agua ya que el producto destilado formará dos capas al condensarse
(orgánica y acuosa), lo cual permitirá la separación del producto y del agua
fácilmente. (Neumayer, 2004)
2.2.12. Descripción botánica del anís.
Ilustración 2.4. Semillas de anís (Shojaii, 2012)
Nombre científico: Pimpinella anisum
Nombre vulgar: Anís, anís verde
Familia botánica: Apiaceae.
Origen: Mediterráneo
Características del fruto: Los frutos son de color gris verdoso o verde
amarillento, ovoides y oblongos, con pelos cortos, sedosos y curvados sobre su
cara dorsal convexa.
Propiedades medicinales: Las semillas o frutos de anís se utilizan principalmente
para tratar malestares digestivos (indigestión, gases); son también la materia prima
para la obtención del aceite esencial.
Principios activos: En el aceite esencial se encuentra el anetol, estragol,
limoneno, timol, eugenol, terpenos, flavonoides. (Shojaii, 2012)
11
2.2.13. Descripción botánica del clavo de olor.
Ilustración 2.5. Clavo de olor (Aguilar, 2012)
Nombre científico: Syzygium aromaticum, Eugenia caryophyllata
Nombre vulgar: Clavo de olor
Familia botánica: Myrtaceae
Origen: Indonesia
Características del fruto: Los clavos de olor, son los capullos sin abrir
Propiedades medicinales: En trastornos digestivos y diarrea. Posee muy variados
efectos dentro de las que destacan el antiséptico, analgésico, antibacteriano,
antifúngico, anestésico, como diurético. En odontología como antiséptico.
Principios activos: El aceite esencial es rico principalmente en eugenol,
cariofileno y acetato de eugenilo. (Aguilar, 2012)
2.2.14. Descripción botánica del jengibre.
Ilustración 2.6. Jengibre (Ceballos, 2016)
Nombre científico: Zingiber officinale
Nombre vulgar: Jengibre, Gengibre
Familia botánica: Zingiberaceae.
Origen: De las zonas tropicales del sureste asiático
12
Características de la raíz o rizoma: Forma nudosa, dura, de dos centímetros de
diámetro.
Propiedades medicinales: Ayuda a aliviar la sensación de mareo, náuseas y
vómitos para tratar el mal del viajero. Es expectorante, antitusiva, laxante e
hipoglucemiante. También se utiliza como antiséptica, antiinflamatoria y
analgésica. Reduce los niveles de colesterol.
Principios activos: En el aceite esencial se encuentra principalmente el
zingibereno, en un 60% del total del aceite y resinas que son responsable de su
sabor picante y amargo debido al gingerol, shogaol y zingerona. (Ceballos, 2016)
2.2.15. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
Es la concentración más baja que inhibe el crecimiento fúngico en un período
determinado de tiempo.
2.2.16. Concentración Fungicida Mínima (CFM)
Es la concentración que ha inhibido como mínimo el 99.99% del crecimiento fúngico.
2.2.17. Dilución en caldo.
Es una técnica en la cual se realizan diluciones seriadas del antifúngico en un medio
líquido el cual se inocula con un número estandarizado de microorganismos y se
incuba durante un periodo de tiempo determinado. Mediante ésta técnica se determina
la concentración inhibitoria mínima. (Rodriguez, 2012)
2.2.18. Formas farmacéuticas
Las formas farmacéuticas son preparados que se elaboran con uno o más principios
activos y excipientes (materia farmacológicamente inactiva) para constituir un
medicamento.
Existen tres tipos de formas farmacéuticas:
Sólidas:
Polvos, comprimidos, tabletas, supositorios, óvulos.
Semi-sólidas:
Pomadas, pastas, cremas, geles.
Líquidas:
Soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires, lociones. (Aulton, 2004)
13
2.2.19. Emulsiones
Es un sistema de dos fases, constituido por la combinación de dos líquidos
inmiscibles, donde un líquido es dispersado uniformemente en otro líquido en forma
de pequeñas gotas, el líquido dispersado se llama fase discontinua o interna. Y el otro
líquido es el medio de dispersión, fase externa o fase continua. La mayoría de
emulsiones incorpora una fase acuosa dentro de una fase no acuosa, o viceversa. Para
estabilizar la emulsión se requiere de un componente denominado, agente
emulsificante o tensoactivo. (Remington, 2001)
Un requisito esencial para la formación y estabilidad de las emulsiones es obtener una
tensión de superficie de contacto baja.
Los surfactantes no iónicos se usan para fabricar emulsiones estables y tienen la
ventaja de que son menos sensibles a los electrolitos, a los cambios de pH, y menos
tóxicos. Estos emulsificantes no poseen carga, por lo que ninguna fuerza de repulsión
eléctrica contribuye a la estabilidad. (Aulton, 2004)
2.2.20. Tipos de emulsiones
Emulsión aceite en agua: Cuando una sustancia oleosa es dispersada en una fase
acuosa, el sistema se denomina (O/W).
Emulsión agua en aceite: Cuando el agua o una solución acuosa es dispersado en
un material oleoso, el sistema se llama (W/O).
Se puede mencionar en términos generes que el predominio de las características
polares o no polares del agente emulsificante, lo cual es función de la solubilidad
relativa del agente emulsificante (la fase en la cual el emulsificante es más soluble)
será la fase continua, es lo que contribuye al tipo de emulsión que se forma. Además,
la fase presente en mayor cantidad se convierte finalmente en la fase continua. (Oliva,
2012)
Ilustración 2.7. Tipos de emulsiones (Aulton, 2004)
14
2.2.21. Agentes surfactantes
Ciertos compuesto, debido a su estructura química, tienden a acumularse en el límite
entre dos fases, son los compuestos anfifílicos o surfactantes.
• La adsorción de esta substancia en sólidos, líquidos o gases, cambia la naturaleza de
la interface, lo cual tiene considerable importancia.
• Posibilitan la formación de una emulsión, disminuyendo la tensión interfacial entre la
fase acuosa y oleosa. (Remington, 2001)
Ilustración 2.8. Función del agente surfactante (Oliva, 2012)
Características de los agentes surfactantes:
Tienen dos regiones de distinta estructura química:
• Hidrofílica
• Hidrofóbica
Son moléculas anfipáticas
Las porciones hidrofóbicas son usualmente:
• Cadenas hidrocarbonadas saturadas
• Cadenas hicrocarbonadas no saturadas
• Anillos heterocíclicos
• Anillos aromáticos
Las porciones hidrofílicas pueden ser:
• Aniónicas
• Catiónicas
• No iónicas (Aulton, 2004)
15
2.2.22. Balance Hidrofílico-Lipofílico (BHL)
En este sistema, un número HLB se asigna a un surfactante dependiendo de su
polaridad relativa. El concepto BHL se basa en un método experimental que consiste
en atribuir un cierto número BHL a los agentes emulsionantes a partir de datos
relativos a la estabilidad de una emulsión.
El hecho de que las películas interfaciales hidrofílicas favorezcan las emulsiones
O/W; y las películas no polares favorezcan las emulsiones W/O, hace posible el
sistema HLB.
Por medio de este número se establece un rango de eficiencia para cada surfactante:
(Aulton, 2004)
Ilustración 2.10. Valores de BHL y su función (Aulton, 2004)
Ilustración 2.9. Estructura de los emulsificantes (Remington, 2001)
16
• Altos números de HLB (máximo teórico de 20) indican que el surfactante exhibe
principalmente características hidrofílicas o polares.
• Bajos números de HLB significa que el en el surfactante predominan las propiedades
lipofílicas o no polares. (Aulton, 2004)
Tabla 2.1. Valores de BHL de algunos agentes surfactantes
(Oliva, 2012)
2.2.23. Formulación de emulsiones por el método BHL
En la práctica es necesario preparar una serie de emulsiones usando una mezcla de un
par dado de emulgentes no iónicos que cubran un amplio rango de valores HLB.
El valor HLB de la mezcla emulgente que genere la emulsión más estable es el
valor requerido para esa fase oleosa.
La estabilidad de la emulsión puede evaluarse por observación de la separación de
fases luego de la centrifugación. (Remington, 2001)
2.3. Fundamento legal.
Constitución de la República del Ecuador
Expedida por la Asamblea Constituyente-Montecristi 2008
Publicada: Registro Oficial No. 440
Fecha de publicación 20-oct-2008
Artículo 379.- Son parte del patrimonio cultural tangible e intangible relevante para la
memoria e identidad de las personas y colectivos, y objeto de salvaguarda del Estado,
17
entre otros: …3. Los documentos, objetos, colecciones, archivos, bibliotecas y museos
que tengan valor histórico, artístico, arqueológico, etnográfico o paleontológico.
Objetivos del plan nacional del buen vivir
Objetivo 8.5.- Prevé para el fortalecimiento de la identidad nacional y de su
diversidad, como país plurinacional e intercultural, la promoción y el apoyo a los “…
procesos de preservación, valoración, fortalecimiento, control y difusión de la
memoria colectiva e individual y del patrimonio cultural y natural del país, en toda su
riqueza y diversidad”, para lo cual la meta trazada es la de “aumentar al 30% los
bienes patrimoniales con acceso a la ciudadanía al 2013.
Ley de patrimonio cultural. Registro Oficial Suplemento 465 de 19 de noviembre
de 2004
Art 7.- Declárense bienes pertenecientes al Patrimonio Cultural del Estados, los
comprendidos en las siguientes categorías: c) Los manuscritos antiguos e incunables,
ediciones raras de libros, mapas y otros documentos importantes.
2.4. Hipótesis
2.4.1. Hipótesis alternativa:
Una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor actividad
antifúngica, puede constituirse como una alternativa para el tratamiento de
contaminaciones fúngicas presentes en los documentos bibliográficos.
2.4.2. Hipótesis nula:
Una forma farmacéutica elaborada con el aceite esencial que posea la mejor actividad
antifúngica, no pueden constituirse como una alternativa para el tratamiento de
contaminaciones fúngicas presentes en los documentos bibliográficos.
2.5. Sistema de variables
El presente proyecto de investigación consta de dos etapas:
ETAPA 1:
Evaluación de la actividad antifúngica de los aceites esenciales de tres especies vegetales,
anís (Pimpinella anisum), clavo de olor (Syzygium aromaticum) y jengibre (Zingiber
officinale), frente a los hongos Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum; y elección
del aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica frente a las cepas de hongos
evaluadas.
18
2.5.1. Variables dependientes.
Efecto antifúngico sobre las cepas de hongos.
2.5.2. Variables independientes.
El tipo de aceite esencial.
La concentración de los aceites esenciales.
ETAPA 2:
Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la mejor
actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los documentos
bibliográficos contaminados con hongos.
2.5.3. Variables dependientes.
Reducción Porcentual de las unidades formadoras de colonias (Porcentaje de
Eficiencia).
2.5.4. Variables independientes.
Formulaciones.
Tiempo de aplicación.
19
Capítulo III
3. Metodología de la investigación
3.1. Diseño de la investigación
En el presente trabajo investigativo se hará referencia a un enfoque científico
experimental conocido como paradigma cuantitativo o positivista. Porque representa un
conjunto de procesos que son secuenciales. Las hipótesis y las variables se establecen de
las preguntas de la investigación; se establece un diseño para probarlas; se miden las
variables; y analizan las mediciones obtenidas utilizando métodos estadísticos, para
establecer una serie de conclusiones respecto de las hipótesis.
El nivel de investigación definido será el nivel correlacional, ya que la finalidad es
conocer la relación o asociación que existe entre dos o más variables en un problema en
particular y miden cada una de las variables, cuantifican y analizan la relación.
Los tipos de investigación que se utilizaron fueron:
Investigación bibliográfica o documental: que estudia los problemas con el propósito
de profundizar y ampliar el conocimiento sobre un tema en particular con el apoyo de
trabajos previos e información de medios electrónicos o impresos.
Investigación de laboratorio: se desarrolla en un lugar que puede controlar las variables
de forma artificial. (Sampieri, 2010).
3.2. Metodología
El trabajo de investigación está dividido en dos etapas:
Etapa 1: Evaluación de la actividad antifúngica de los aceites esenciales de tres especies
vegetales, anís (Pimpinella anisum), clavo de olor (Syzygium aromaticum) y jengibre
(Zingiber officinale), frente a los hongos Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum; y
elección del aceite esencial que posea la mejor actividad antifúngica frente a las cepas de
hongos evaluadas.
Etapa 2: Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente la
mejor actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los
documentos bibliográficos contaminados con hongos.
3.3. Materiales y reactivos
3.3.1. Materiales.
Vasos de precipitación de 250, 100 ml.
Matraces erlenmeyer de 1000, 500, 250, 150 ml.
20
Pipeta graduada de 10, 5, 1 ml.
Papel aluminio.
Probeta de 100 ml.
Cajas petri de vidrio.
Tubos de ensayo pequeños y grandes.
Mechero bunsen.
Gradillas.
Micropipetas de 200, 100, 50, 20 μL.
Soportes universales.
Frascos ámbar de 50 ml.
Pera de succión.
Papel empaque.
Asa de digralsky.
Placas de microdilución.
Hisopos estériles.
Para la extracción de los aceites esenciales
Semillas de anís.
Botones sin abrir de clavo de olor.
Rizomas de jengibre.
Material Biológico:
Cepa ATCC de Aspergillus niger (10106).
Cepa ATCC de Penicillium chrysogenum (16888).
3.3.2. Equipos.
Balanza analítica.
Equipo clevenger.
Incubadora microbiológica.
Cabina de flujo laminar.
Autoclave.
Cocinetas.
Vórtex.
3.3.3. Reactivos.
Etanol 96% .
Alcohol Antiséptico.
Agua destilada.
Medios de cultivo para hongos:
o Sabouraud dextrosa agar.
o Sabouraud dextrosa caldo.
21
3.4. Procedimientos
3.4.1. Extracción de los aceites esenciales.
Se utilizó como materia prima las semillas de anís (Pimpinella anisum), botones sin
abrir de clavo de olor (Syzygium aromaticum) y rizomas de jengibre (Zingiber
officinale), adquiridos en el mercado de la ciudad de Sangolquí.
El material vegetal no se secó para su extracción, y se sometió al siguiente proceso:
Se eliminó cuidadosamente y de forma manual materias extrañas en el caso del anís y
clavo de olor, mientras que en los rizomas de jengibre se eliminó la tierra adherida y
las raíces utilizando un cuchillo de acero inoxidable.
Se lavó el material vegetal utilizando un colador y mediante un flujo continuo de agua
potable a temperatura ambiente para eliminar los vestigios de polvo o tierra.
Se desinfectó las muestras vegetales con alcohol al 70%.
Luego se deja escurrir el exceso de agua por 15 minutos.
Se pesó por separado cada material vegetal como se detalla en la tabla 4.1, 4.2, 4.3.
Se disminuyó el tamaño de partícula del material vegetal fresco, previo al proceso de
extracción, se trituró ligeramente el anís y el clavo de olor, respectivamente,
utilizando un mortero y un pistón de porcelana; en el caso de los rizomas de jengibre
se fragmentó utilizando una licuadora.
Se colocó 4 núcleos de ebullición junto con 400 ml agua destilada y el material
vegetal correspondiente en un balón de 1 litro.
Se armó el equipo clevenger como se ilustra en la ilustración 3.1.
Se procedió a extraer el aceite esencial por arrastre de vapor con el equipo clevenger
durante 3 horas, cuando se mantiene constante el volumen de aceite esencial, se llega
al punto final de la extracción.
Posteriormente se separó el aceite esencial del agua en un embudo de separación, por
la diferencia de densidades fue posible separar la mayor parte del agua. El agua
remanente se separó mediante congelación, para lo que se utilizó un congelador
doméstico.
Finalmente, el aceite esencial obtenido de cada material vegetal se almacenó a 8°C en
frascos color ámbar con tapa rosca.
22
Ilustración 3.1. Equipo Clevenger (Aguilar, 2012)
Se determinó el porcentaje de rendimiento (%R) mediante la ecuación 3.1. Se tomó en
cuenta el volumen de aceite esencial extraído hasta agotamiento de la muestra y se
relacionó con la cantidad de muestra vegetal inicial.
Ecuación 3.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial.
%𝑅 =𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100
3.4.2. Activación de las cepas ATCC de hongos.
Preparación del medio de cultivo SAB (Sabourand dextrosa agar).
o Se pesó 65 g de del medio de cultivo.
o Se dispersó en 1 litro de agua destilada.
o Se calentó en una plancha de calentamiento hasta su total disolución.
o Se esterilizó en autoclave. (121 ºC, 20 minutos).
o Se distribuyó el medio de cultivo en cajas Petri a una temperatura
aproximadamente de 45ºC.
Se utilizaron cepas ATCC en la presentación Kwik Stik.
Se colocó durante 1 hora las cepas a temperatura ambiente.
Se presionó en la parte superior del dispositivo Kwik Stik de tal manera que se rompa
la ampolla que contiene el líquido de hidratación y el pellet que contiene los hongos
se hidrate.
Se homogenizó.
Se sembró cada cepa por hisopado en cajas petri que contenían sabourand dextrosa
agar.
23
Ilustración 3.2. Presentación Kwik Stik (Casal, 2012)
3.4.3. Preparación del inóculo.
El inóculo se preparó a partir de un cultivo de 7 días de crecimiento a 35 ºC en
sabourand dextrosa agar.
Se introdujo el asa de cultivo en Tween 20 y se pasó por la superficie del hongo,
después se suspendió en solución salina previamente esterilizada.
Se dejó sedimentar las partículas durante 3-5 minutos, luego se transferió el
sobrenadante a otro tubo de ensayo con solución salina estéril y se agitó
vigorosamente durante 15 segundos.
Las esporas de los hongos fueron cuantificadas mediante recuento en la cámara de
neubauer, para lo cual se colocó 20 uL de la solución de esporas en la rejilla de la
cámara. Luego se observó en el microscopio con el objetivo 40x examinando los
diferentes campos.
De la zona central se escogieron 5 cuadrantes, se contabilizó el número de esporas
utilizando un orden de conteo en forma de zigzag. Existe una convención por la cual,
si las esporas tocan el límite superior o el límite izquierdo del cuadro, deben
contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el límite inferior o el límite derecho.
(Bastidas, 2014)
Se aplicó la ecuación 3.2 para determinar el número de esporas por mililitro.
Ecuación 3.2. Número de esporas
⋕ 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠
𝑚𝑙=
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒
De esta forma se determinó el volumen de cada cuadrante de la zona central en el que
se realizó el conteo del número de esporas:
24
Á𝑟𝑒𝑎 = 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑙𝑎𝑑𝑜 1 ∗ 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑙𝑎𝑑𝑜 2
Á𝑟𝑒𝑎 = 0,2 𝑚𝑚 ∗ 0,2𝑚𝑚
Á𝑟𝑒𝑎 = 0,04 𝑚𝑚2
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = Á𝑟𝑒𝑎 ∗ 𝑃𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 0,04 𝑚𝑚2 ∗ 0,1 𝑚𝑚
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 4𝑥10−3 𝑚𝑚3
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 = 4𝑥10−6 𝑚𝑙
Por lo tanto, la ecuación 3.2 se expresa de la siguiente forma:
Ecuación 3.3. Número de esporas por mililitro.
⋕ 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠
𝑚𝑙=
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
4𝑥10−6 𝑚𝑙
Luego que se determinó el número de esporas en la solución se realizó una dilución
1:100 en el medio líquido sabourand dextrosa. (añadiendo 100 uL de la solución de
esporas en 10 ml de medio líquido sabourand dextrosa). Para obtener
aproximadamente 1-5x104 ufc/ml en los pocillos ya inoculados.
Ilustración 3.3. Cámara de Neubauer (Madigan, 2008)
25
Ilustración 3.4. Recuento de microorganismos en la cámara de Neubauer
(Casal, 2012)
3.4.4. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).
Se realizó mediante el método de dilución en caldo.
La evaluación de la concentración inhibitoria mínima de cada uno de los aceites
esenciales fue desarrollada de acuerdo con algunos lineamientos descritos por el CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute), método M38-A para hongos
filamentosos:
Se preparó 10 diluciones seriadas de cada aceite esencial en las placas de
microtitulación. La distribución de los pocillos en la placa de microtitulación se
muestran en la ilustración 3.5.
Desde el pocillo 2 hasta el 10 se colocó 100 uL de medio líquido sabourand dextrosa
previamente esterilizado y en el pocillo 1 se puso 200 uL del aceite esencial.
Con la ayuda de una micropipeta se cogió 100 uL del pocillo 1 y se añadió al pocillo
2, luego se tomó 100 uL del pocillo 2 y se colocó en el pocillo 3, se repetió este
procedimiento hasta llegar al pocillo 10.
Se colocó 200 uL y 100 uL el medio líquido sabourand dextrosa en los pocillos 11 y
12 respectivamente.
Se inoculó los todos los pocillos, excepto los controles de esterilidad con 100 uL de la
solución de esporas 1:100.
Se cubrió la placa de microtitulación con papel film para evitar la evaporación del
medio de cultivo y del aceite esencial.
Se incubó la placa de microtitulación hasta que se observó crecimiento en el pocillo
control de crecimiento a 30 °C por 3 días.
Se determinó la concentración inhibitoria mínima como la concentración más baja
que produce una inhibición visual del crecimiento.
Los ensayos fueron realizados por triplicado para cada uno de los aceites esenciales y
los microorganismos correspondientes.
26
Ilustración 3.5. Distribución de la placa de microdilución
En las columnas 1 a la 10 se realizó la microdilución de los aceites esenciales, en tres
filas consecutivas. La columna 11 se reservó para el control de esterilidad del medio,
y en la columna 12 se realizó el control de crecimiento del inóculo.
Ilustración 3.6. Concentraciones de los aceites esenciales en cada pocillo de la placa de
microdilución
3.4.5. Concentración Fungicida Mínima (CFM).
Con el asa de digralsky se sembró por extensión 100 uL del pocillo al que se ha
asignado la concentración inhibitoria mínima (CIM) y también los tres pocillos
que correspondían a las tres concentraciones superiores en cajas petri con el medio
sabourand dextrosa agar.
27
Se incubó las cajas petri a 30 °C por 3 días.
Se realizó la lectura de ufc en cada caja petri.
Se determinó la concentración fungicida mínima (CFM) como la concentración más
baja que no permitió el crecimiento de los hongos. (Soto, 2009)
Con los resultados obtenidos se eligió el aceite esencial que presentó la mejor
actividad antifúngica. El parámetro que permitió realizar esta selección fue que el
efecto antifúngico se obtenga a la más baja concentración de aceite esencial.
3.4.6. Formulación de la emulsión
Tomando en cuenta la concentración fungicida mínima (CFM) del aceite esencial
elegido se procedió a formular una emulsión o/w.
Dentro de la formulación se consideraron las materias primas más importantes: fase
acuosa (se utilizó una mezcla de etanol-agua 80:20), agentes tensoactivos y el aceite
esencial. Las concentraciones utilizadas de cada materia prima están dentro de los
rangos sugeridos por la bibliografía.
3.4.7. Proceso de manufactura de la emulsión.
Inicialmente, se procedió a medir los volúmenes necesarios de cada componente de la
formulación.
Luego en un vaso de precipitación se mezcló el agua, etanol. (Fase acuosa).
En otro vaso de precipitación se colocó el aceite esencial y se añadió la mezcla de
surfactantes. (Fase oleosa).
La fase acuosa y la fase oleosa se calentaron hasta 30 ºC.
Posteriormente, se colocó la fase acuosa sobre la fase oleosa y se agitó.
3.4.8. Proceso de aplicación de la emulsión en los libros.
Inicialmente los libros se limpiaron manualmente con una brocha para eliminar el
polvo, en cabinas apropiadas para esta actividad.
Para la aplicación de la emulsión se utilizó un aerógrafo y dentro de una cabina de
flujo laminar.
En primer lugar, se conectó el compresor con el aerógrafo.
Se ubicó el libro con un ángulo de inclinación 80º, respecto a la superficie de la
cabina y a una distancia de 20 cm del aerógrafo.
Se colocó la emulsión en el aerógrafo.
Se procedió a esparcir la emulsión, desde el lado izquierdo hacia el lado derecho y de
arriba hacia abajo, (la zona de aplicación de la emulsión fue de dos páginas continuas
del libro, con un área de aplicación de aproximadamente 1243 cm2).
28
3.4.9. Análisis de superficies no planas (libros) por hisopado.
Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica
Se colocó la plantilla de aluminio de 5cm x 5cm sobre la superficie a muestrear.
Se frotó 4 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección
opuesta a la anterior con un hisopo estéril inclinado en un ángulo de 30º.
Se colocó el hisopo en un tubo que contiene 10 ml de solución salina estéril,
eliminando la parte del hisopo que estuvo en contacto con los dedos del muestreador.
Se tapó el tubo de ensayo y se dejó reposar de 15 a 30 minutos.
Se agitó enérgicamente el tubo que contiene el hisopo (muestra).
Se sembró por extensión 100 ul de la muestra en cajas petri con el medio de cultivo
sabouraud dextrosa agar.
Se incubó las cajas petri a 25 °C por 7 días.
Se registró el número de ufc por caja. (Terán, 2015)
Nota: realizó este procedimiento antes y después de la aplicación de la emulsión para
calcular la eficacia de la forma farmacéutica.
Después de la aplicación de la forma farmacéutica, inicialmente se tomaron muestras
a diferentes tiempos: 1 hora, 2 horas, 4 horas, 10 horas, 24 horas para determinar el
tiempo en el que la emulsión ejerce efecto sobre los hongos. Con este experimento se
determinó que a partir de las 2 horas la emulsión ejerce efecto sobre las cepas de
hongos, y que se observa disminución en el número de unidades formadoras de
colonias y a partir de las 4 horas en adelante se mantiene constante el número de
unidades formadoras de colonias. Por lo tanto, se estableció que las muestras se
tomarán luego de 4 horas de la aplicación de la emulsión sobre los libros.
Para calcular el factor de dilución se aplicó la siguiente ecuación:
Ecuación 3.4. Cálculo del factor de dilución
𝐹𝐷 = 𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑚𝑙 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛
Para el cálculo de las unidades formadoras de colonia por centímetro cuadrado de
hoja antes y después de la aplicación de la forma farmacéutica se aplicó la siguiente
ecuación:
Ecuación 3.5. Unidades formadoras de colonia por cm2
𝑢𝑓𝑐
𝑐𝑚2=
⋕ 𝑢𝑓𝑐 𝑥 𝐹𝐷
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑜
Para calcular la eficacia de cada formulación al ser aplicadas en los libros se aplicó la
ecuación 3.6 y 3.7.
29
Ecuación 3.6. Porcentaje no reducido de unidades formadoras de colonia.
% 𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =
𝑢𝑓𝑐 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2
𝑢𝑓𝑐 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2
𝑥100
Ecuación 3.7. Porcentaje de reducción de unidades formadoras de colonias.
% 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 = 100% − %𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜
3.5. Diseño experimental
3.5.1. Diseño factorial A x B.
Es el conjunto de puntos experimentales o tratamientos que pueden formarse
considerando todas las posibles combinaciones de los niveles de los factores. Permite
el estudio de la interacción entre los factores, es decir, estudiar el grado y forma en la
cual se modifica el efecto de un factor por los niveles de los otros factores. (Salazar,
2013).
3.5.2. Etapa 1.
3.6.2.1. Variables
Independientes:
El tipo de aceite esencial
La concentración de los aceites esenciales
Dependientes:
Efecto fungicida sobre las cepas de hongos.
3.6.2.2. Hipótesis:
𝐻0: Los aceites esenciales no poseen actividad antifúngica.
𝐻1: Los aceites esenciales poseen actividad antifúngica.
En la etapa 1 del presente proyecto de investigación no se realizó un diseño
experimental, ya que el método que se utilizó para evaluar la actividad antifúngica, es
el método de dilución en caldo con diluciones seriadas. Por lo que los resultados son
reportados únicamente como positivos y negativos, para indicar si hubo o no
crecimiento fúngico. Cada concentración seriada se analizó por triplicado. Con los
resultados obtenidos se eligió el aceite esencial que presentó la mejor actividad
antifúngica, es decir que ejerza su acción antifúngica a una concentración baja, en
comparación con los otros aceites esenciales.
30
3.5.3. Etapa 2.
3.6.3.1. Variables
Independientes:
Formulaciones.
Tiempo de aplicación.
Dependientes:
Reducción porcentual de las unidades formadoras de colonias (Porcentaje de
eficiencia).
El diseño experimental que se aplicará en ésta etapa de la investigación, es un diseño
factorial A x B, se estudiarán 6 tratamientos y con 3 repeticiones cada uno.
El análisis estadístico que se empleará será un análisis de varianza (ANOVA).
Factores
Los factores para el presente estudio son de 2 tipos:
Factor A: Las formulaciones.
Factor B: Tiempo de aplicación.
Niveles
Para el factor A se analizarán 3 niveles.
Para el factor B se analizarán 2 niveles.
Tabla 3.1. Diseño factorial. Etapa 2
FACTOR B
Tiempo de aplicación
FA
CT
OR
A
Formulaciones Tiempo 1 Tiempo 2
Formulación 1 A1B1r1 A1B2r1
A1B1r2 A1B2r2
A1B1r3 A1B2r2
Formulación 2 A2B1r1 A2B2r1
A2B1r2 A2B2r2
A2B1r3 A2B2r3
Formulación 3 A3B1r1 A3B2r1
A3B2r2 A3B2r2
A3B2r3 A3B2r3
r1: repetición 1 r2: repetición 2 r3: repetición 3
31
Actualmente el área de cuarentena del Área Histórica de la Universidad Central del Ecuador
cuenta con 150 libros contaminados con hongos.
Para el presente estudio se tomó una muestra de 13 libros, según la Tabla Militar Estándar y
el nivel de inspección general 1. Para evaluar la eficacia de cada una de las formulaciones
con sus diferentes tiempos de aplicación se utilizaron 12 ejemplares, y en 1 ejemplar se
evaluaron los blancos de cada formulación.
Los libros seleccionados poseen 100 páginas, y en cada libro se evaluaron los 6 tratamientos,
cada tratamiento se evaluó con 8 zonas de aplicación. Posteriormente se calculó el promedio
de cada tratamiento evaluado por libro.
3.6.3.2. Hipótesis para el diseño factorial A x B
Para el factor A (Las formulaciones):
𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴 ≠ 0
𝐻0: Las formulaciones no ejercen ningún efecto en la reducción porcentual de las unidades
formadoras de colonia.
𝐻1: Las formulaciones ejercen efecto significativo en la reducción porcentual de las unidades
formadoras de colonia.
Para el factor B (El tiempo de aplicación)
𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐵 ≠ 0
𝐻0: El tiempo de aplicación de las formulaciones no ejercen ningún efecto en la reducción
porcentual de las unidades formadoras de colonia.
𝐻1: El tiempo de aplicación de las formulaciones ejercen efecto significativo en la
reducción porcentual de las unidades formadoras de colonia.
Para la interacción AB (Formulaciones- El tiempo de aplicación):
𝐻0: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 = 0
𝐻1: 𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝐴𝐵 ≠ 0
𝐻0: No hay interacción entre los factores A y B.
𝐻1: Hay interacción entre los factores A y B.
32
3.6. Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico)
El análisis estadístico que se empleará para el diseño factorial A x B, es un análisis de
varianza (ANOVA).
Tabla 3.2. Tabla de ANOVA para un diseño factorial a x b con n réplicas
(Romero, 2012)
3.7. Matriz de operacionalización de las variables
Tabla 3.3. Matriz de Operacionalización de variables
Variable Dimensiones Indicadores
Aceite esencial Actividad antifúngica
Unidades formadoras
de colonia por mililitro.
Concentración del
aceite esencial
Concentración Inhibitoria
Mínima (CIM).
Concentración Fungicida
Mínima (CFM).
Unidades formadoras
de colonia por mililitro.
Formulación
Efecto que ejerce sobre los
hongos.
Efecto que ejerce sobre los
libros.
Unidades formadoras
de colonia por cm2.
Si hay o no afectación
en la estructura del
libro.
La cantidad aplicada
Fuente de Suma de Grados de Cuadrados Estadístico
Variación cuadrados libertad medios F
Efecto A SSA a-1 CMA=SSA/(a-1) CMA/CME
Efecto B SSB b-1 CMB=SSB/(b-1) CMB/CME
Efecto AB SSAB (a-1)(b-1) CMAB=SSAB/((a-1)(b-1)) CMAB/CME
Error SSE ab(n-1) CME=SSE/(ab(n-1))
Total SST abn-1
33
Capítulo IV
4. Análisis y discusión de resultados
4.1. Extracción de los aceites esenciales
La extracción del aceite esencial de las tres especies vegetales se realizó utilizando el
material vegetal fresco para evitar la pérdida de compuestos volátiles, mediante arrastre
de vapor.
El porcentaje de rendimiento de los aceites esenciales se calculó mediante la relación de
ml/g de material vegetal aplicando la ecuación 3.1.
%𝑅 =𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100
4.1.1. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de
Pimpinella anisum (anís).
%𝑅 =𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜
𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙∗ 100
%𝑅 =3,40 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙
500𝑔𝑟𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙∗ 100
%𝑅 = 0,68
Tabla 4.1. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Pimpinella anisum (anís):
N. 𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍
(g)
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆
𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒅𝒐
(ml)
Rendimiento
(%)
1 100 0,70 0,70
2 100 0,70 0,70
3 100 0,60 0,60
4 100 0,80 0,80
5 100 0,60 0,70
Total 500 3,40 0,68
Para la especie Pimpinella anisum se obtuvo el 0,68% de rendimiento en la extracción
del aceite esencial.
34
4.1.2. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Syzygium
aromaticum (clavo de olor).
Tabla 4.2. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Syzygium aromaticum
(clavo de olor):
N. 𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍
(g)
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆
𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒅𝒐
(ml)
Rendimiento
(%)
1 150 1,10 0,73
2 150 1,10 0,73
3 200 1,50 0,75
Total 500 3,70 0,74
Se obtuvo un 0,74% de rendimiento con la especie Syzygium aromaticum.
4.1.3. Porcentaje de rendimiento en la extracción del aceite esencial de Zingiber
officinale (jengibre).
Tabla 4.3. Porcentaje de rendimiento del aceite esencial de Zingiber officinale
(jengibre):
N. 𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍
(g)
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆
𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒅𝒐
(ml)
Rendimiento
(%)
1 100 1,00 1,00
2 100 1,00 1,00
3 100 1,00 1,00
4 100 1,10 1,10
5 100 1,00 1,00
Total 500 5,10 1,02
Con la especie Zingiber officinale se obtuvo el 1,02% de rendimiento. Siendo este
valor el más alto en relación a los rendimientos obtenidos con las dos especies
anteriores.
4.1.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales.
Tabla 4.4. Comparación de los porcentajes de rendimiento de cada aceite esencial.
Nombre
común
Especie
vegetal
𝑴𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂
𝒗𝒆𝒈𝒆𝒕𝒂𝒍
(g)
𝑪𝒂𝒏𝒕𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆
𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂í𝒅𝒐
(ml)
Rendimiento
(%)
Anís Pimpinella
anisum
500 3,40 0,68
Clavo de
olor
Syzygium
aromaticum
500 3,70 0,74
Jengibre Zingiber
officinale
500 5,10 1,02
35
Tabla 4.5. Porcentaje de rendimiento en la extracción de los aceites esenciales
Interpretación:
Como se puede observar en la tabla 4.4 y en el gráfico 4.1 la especie Zingiber
officinale (jengibre) presenta el mayor porcentaje de rendimiento en la extracción del
aceite esencial con el 1,02%. Syzygium aromaticum (clavo de olor) tuvo un porcentaje
de rendimiento del 0,74% y Pimpinella anisum (anís) el 0,68%.
Etapa 1: Evaluación de la actividad antifúngica
4.2. Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
4.2.1. Preparación del inóculo.
Para determinar la concentración inhibitoria mínima de cada aceite esencial en primer
lugar se preparó el inóculo por medio del recuento de esporas en la cámara de
neubauer, aplicando la ecuación 3.3 se obtuvo el número de esporas por mililitro:
⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔
𝒎𝒍=
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
4𝑥10−6 𝑚𝑙
⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔
𝒎𝒍=
26 𝑒𝑠𝑝𝑜𝑟𝑎𝑠
4𝑥10−6 𝑚𝑙
⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔
𝒎𝒍= 6,50 𝑥 106
Luego se realizó una dilución 1:100 en el medio líquido sabourand dextrosa,
añadiendo 100 ul de la solución de esporas en 10 ml de medio líquido.
0,68 0,74
1,02
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Pimpinellaanisum(Anís)
Syzygiumaromaticum
(Clavo de olor)
Zingiber officinale(Jengibre)
% Rendimiento en la extracción de los aceites esenciales
36
Tabla 4.6. Número de esporas por mililitro
Cuadrantes ⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔 𝑷𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐 ⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔
⋕ 𝒆𝒔𝒑𝒐𝒓𝒂𝒔/𝒎𝒍 Dilución
1:100
Aspergillus
niger
1 30
26
6,50 𝑥 106
6,50 𝑥 104
2 25
3 20
4 25
5 30
Penicillium
chrysogenum
1 28
24
6,00 𝑥 106
6,0 𝑥 104
2 22
3 20
4 24
5 26
Posteriormente se realizó la determinación de la concentración inhibitoria mínima.
4.3. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
Cada uno de los aceites esenciales fueron evaluados en un rango de concentraciones
desde 50% v/v hasta 0,1% v/v. La evaluación de la actividad antifúngica se realizó
visualmente, reportándose como crecimiento positivo o negativo según corresponda.
En cada pocillo se colocó 100 ul de la dilución de cada aceite esencial y se inoculó con
100 µl de la suspensión de esporas. En este paso, tanto la concentración del aceite
esencial como el inóculo se diluyen a la mitad.
A continuación, se presentan los resultados obtenidos:
Tabla 4.7. Concentración Inhibitoria Mínima, expresada en porcentaje v/v
Especie vegetal CIM
Aspergillus niger Penicillium chrysogenum.
Pimpinella anisum 50% ---
Syzygium aromaticum 50% 50%
Zingiber officinale 25% 25%
Debido a que el ensayo se realizó con diluciones seriadas, el intervalo entre una
concentración y otra es amplio. Por lo que se procedió a realizar un segundo ensayo
para determinar la CIM a intervalos de concentración más cortos (con un intervalo del
5%). Se evaluó entre el último pocillo que registro el crecimiento fúngico y el pocillo
al que se le asignó la CIM.
37
Tabla 4.8. Concentración Inhibitoria Mínima a intervalos más cortos % v/v
Especie vegetal CIM
Aspergillus niger Penicillium chrysogenum.
Pimpinella anisum 45% ---
Syzygium aromaticum 35% 40%
Zingiber officinale 20% 20%
4.4. Concentración Fungicida Mínima (CFM)
Una vez determinada la CIM para cada aceite esencial se procedió a evaluar la CFM. Se
sembró por la técnica de extensión en caja 100 ul del pocillo al cual se le asignó la CIM,
además se sembró las dos concentraciones superiores. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado.
Tabla 4.9. Concentración Mínima Fungicida en porcentaje v/v
Especie vegetal CFM
Aspergillus niger Penicillium chrysogenum.
Pimpinella anisum --- ---
Syzygium aromaticum 40% 45%
Zingiber officinale 25% 30%
En la tabla 4.8 se detalla los resultados de la concentración fungicida mínima de cada
aceite esencial. Se puede observar que el aceite esencial de anís no presentó un efecto
fungicida, únicamente tuvo un efecto inhibitorio sobre la cepa de Aspergillus niger.
Sin embargo, los aceites esenciales de clavo de olor y jengibre si mostraron un efecto
fungicida frente a las cepas de Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum.
El resultado de mayor relevancia es que el aceite esencial de jengibre presentó un
efecto fungicida a concentraciones bajas en relación al aceite esencial de clavo de
olor, a un 25% v/v y 30%v/v presentó una actividad fungicida frente a las cepas de
Aspergillus niger y Penicillium chrysogenum, respectivamente. Por lo que se eligió
este aceite esencial para elaborar una forma farmacéutica que aplicada en los
documentos bibliográficos constituya una alternativa para el tratamiento de
contaminaciones fúngicas.
En esta primera etapa de la investigación se aceptó la hipótesis alternativa que los
aceites esenciales poseen actividad antifúngica. Y se eligió al aceite esencial de
jengibre para elaborar una forma farmacéutica.
38
Etapa 2: Elaboración de una forma farmacéutica con el aceite esencial que presente
la mejor actividad antifúngica y evaluación de la eficacia en el tratamiento de los
documentos bibliográficos contaminados con hongos.
4.5. Manufactura de la forma farmacéutica a base del aceite esencial que presentó la
mejor actividad antifúngica.
4.5.1. Formulación de la emulsión.
Una vez que se eligió el aceite esencial de jengibre, se procedió a elaborar una forma
farmacéutica que cumpla con algunos requisitos, por ejemplo, que sea de fácil
aplicación, que no provoque un daño físico en los libros, de baja toxicidad y que tenga
un efecto positivo en las contaminaciones provocadas por hongos.
Luego de algunas pruebas preliminares se determinó que la forma farmacéutica más
adecuada para la aplicación en los documentos bibliográficos es una emulsión que
pueda ser aplicada a través de un aerógrafo.
En primer lugar, se procedió a evaluar una serie de formulaciones que nos permita
elegir las condiciones más adecuadas para la elaboración de la emulsión. Se evaluó el
efecto que provoca la concentración del emulsificante, el número de BHL y el tiempo
de agitación en la separación de las fases y en la redipersabilidad de la emulsión.
Como se observa en la tabla 4.9 se analizaron tres concentraciones de emulsificante,
tres números de BHL y dos tiempos de agitación.
Tabla 4.10. Parámetros que se evaluaron en la formulación de las emulsiones.
Parámetros Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3
Concentración del
emulsificante (%v/v)
2,5 5,0 7,5
BHL 9 12 15
Tiempo de agitación
(min)
5 10 ---
Para obtener los tres niveles en el número de BHL se utilizó una mezcla de
tensoactivos, para lo cual se aplicó la ecuación 4.1. Las diferentes proporciones se
pueden apreciar en la tabla 4.11. Se utilizaron tensoactivos no iónicos para evitar
inconvenientes con el pH.
Ecuación 4.1. BHL total
𝐵𝐻𝐿𝑇 =𝑚𝐴𝐵𝐻𝐿𝐴 + 𝑚𝐵𝐵𝐻𝐿𝐵
𝑚𝐴 + 𝑚𝐵
𝑚𝐴 + 𝑚𝐵 = 100
39
Tabla 4.11. Porcentajes de Tween 80 y Span 60 para obtener tres BHL diferentes
𝑩𝑯𝑳𝑴𝑬𝒁𝑪𝑳𝑨
9 12 15
𝑩𝑯𝑳𝑨 𝑻𝑾𝑬𝑬𝑵 𝟖𝟎 = 𝟏𝟓 41,7% 70,9% 100%
𝑩𝑯𝑳𝑩 𝑺𝑷𝑨𝑵 𝟔𝟎 = 𝟒, 𝟕 58,3% 29,1% 0,0%
En la tabla 4.12 se puede apreciar las 18 formulaciones que se analizaron y las
diferentes condiciones.
Cada formulación se analizó por triplicado y la agitación fue manual (en forma
circular).
Tabla 4.12. Formulaciones evaluadas
Nº Tiempo de
agitación
(min)
BHL Concentración del
emulsificante
(%v/v)
1 5 9 2,5
2 5 9 5,0
3 5 9 7,5
4 5 12 2,5
5 5 12 5,0
6 5 12 7,5
7 5 15 2,5
8 5 15 5,0
9 5 15 7,5
10 10 9 2,5
11 10 9 5,0
12 10 9 7,5
13 10 12 2,5
14 10 12 5,0
15 10 12 7,5
16 10 15 2,5
17 10 15 5,0
18 10 15 7,5
Cada una de las formulaciones anteriores fueron analizadas en relación a dos
parámetros:
Separación de las fases de la emulsión luego de someterla a 40 ºC por 40 minutos y 10
minutos de centrifugación a 1000 rpm.
Redispersión en el caso de que las fases de la emulsión se separen y se obtenga como
máximo 2 mm de interfase.
En la tabla 4.13 se presenta el promedio de los resultados obtenidos con cada
formulación.
40
Tabla 4.13. Resultados obtenidos al evaluar la redispersión y la separación de fases
de las emulsiones.
Respuesta
Nº Separación de
las fases
(mm)
Fácil
redispersión
1 8 No
2 6 No
3 10 No
4 7 Si
5 1 Si
6 2 Si
7 3 Si
8 2 Si
9 4 Si
10 10 No
11 7 No
12 5 No
13 6 No
14 2 Si
15 2 Si
16 4 No
17 7 No
18 3 No
Para apreciar de mejor manera los resultados obtenidos se realizó análisis de varianza
para identificar la contribución de cada factor en los dos parámetros analizados: la
separación de fases y la redispersabilidad.
PARÁMETRO 1: Separación de las fases de la emulsión
Tabla 4.14. Análisis de Varianza para separación de fases
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Efectos principales
A: Tiempo agitación 0,5 1 0,5 0,19 0,6827
B: BHL 67,4444 2 33,7222 13,05 0,0177
C: Conc. Tensoactivo 17,4444 2 8,72222 3,38 0,0384
Interacciones
AB 4,33333 2 2,16667 0,84 0,4964
AC 14,3333 2 7,16667 2,77 0,1755
BC 20,5556 4 5,13889 1,99 0,2609
Residuos 10,3333 4 2,58333
Total (corregido) 134,944 17
41
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto
que dos valores P son menores que 0,05 con un 95,0% de nivel de confianza. Se
establece que el número de BHL y la concentración del tensoactivo tiene un efecto
estadísticamente significativo sobre el parámetro separación fases.
Al realizar un análisis de los factores que ejercen un efecto estadísticamente
significativo sobre el parámetro separación fases se puede evidenciar que el factor que
más contribuye a la varianza es la concentración de tensoactivo, su contribución
representa el 55,1859% de la variación total. El número de BHL contribuye con un
44,81% y el tiempo de agitación no ejerce ningún efecto sobre el parámetro
separación de fases.
Análisis de Componentes de Varianza en el parámetro separación de fases
Tabla 4.15. Contribución de cada factor en la separación de fases
Fuente Suma de
Cuadrados Gl Cuadrado
Medio Comp. Var. Porciento
Total (corregido) 134,944 17
Tiempo agitación 0,5 1 0,5 0,0 0,00
BHL 71,7778 4 17,9444 4,24074 44,81
Concentración
Tensoactivo 62,6667 12 5,22222 5,22222 55,19
El gráfico 4.3 permite visualizar la contribución que tiene cada factor sobre el parámetro
separación de fases.
Gráfico 4.1.Contribución de cada factor en la separación de fases
Tiempo agitación
510
Gráfica Multi-Vari para Separación fases
BHL=9,12,15
0
2
4
6
8
10
Sep
ara
ció
n f
ases
Concentración Tensoactivo
2,5 5 7,5
42
En el gráfico 4.1 se puede observar que a una concentración de tensoactivo del 5%, el
BHL de 9 o 12 se son las mejores condiciones para obtener una emulsión en la cual
sus fases no se separen. En estas condiciones el tiempo de agitación no ejerce ningún
efecto.
Este gráfico muestra los diferentes valores que adopta el parámetro separación de
fases en las diferentes combinaciones de los tres factores analizados.
PARÁMETRO 2: Redispersión
Análisis de Varianza para: Redispersión
Tabla 4.16. Análisis de varianza para redispersión
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Efectos principales
A: Tiempo agitación 0,8889 1 0,8889 16,00 0,1161
B: BHL 2,1111 2 1,0555 19,00 0,0091
C: Concen. Tensoactivo 0,1111 2 0,0555 1,00 0,0444
Interacciones
AB 0,7778 2 0,3888 7,00 0,1494
AC 0,1111 2 0,0555 1,00 0,4444
BC 0,2222 4 0,0555 1,00 0,0150
RESIDUOS 0,2222 4 0,0555
Total (corregido) 4,4444 17
Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto
que tres valores P son menores que 0,05 con un 95,0% de nivel de confianza. Se
establece que el número de BHL, la concentración del tensoactivo y la interacción
entre concentración de tensoactivo y el número de BHL tiene un efecto
estadísticamente significativo sobre el parámetro redispersión.
Análisis de componentes de varianza para el parámetro redispersión
Tabla 4.17.Contribución de cada factor en la redispersión.
Fuente Suma de
Cuadrados Gl Cuadrado
Medio Comp. Var. Porciento
Total (corregido) 4,4444 17
Tiempo agitación 0,88889 1 0,8889 0,018518 6,25
BHL 2,88889 4 0,7222 0,222222 75,00
Concen. Tensoactivo 0,66667 12 0,05555 0,055555 18,75
43
Al realizar un análisis de los factores que ejercen un efecto estadísticamente
significativo sobre la redispersión se puede evidenciar que el factor que más
contribuye a la varianza es el número de BHL con un 75,00% de la variación total. La
concentración de tensoactivo contribuye con un 18,75% y el tiempo de agitación
ejerce un efecto menor, con el 6,25 % sobre el parámetro redispersión.
El gráfico 4.3 permite visualizar la contribución que tiene cada factor sobre el
parámetro redispersión.
Gráfico 4.2. Contribución de cada factor en la redispersión de la emulsión.
Este gráfico muestra los diferentes valores que adopta el parámetro redispersión en las
diferentes combinaciones de los tres factores analizados.
Se puede evidenciar que las mejores condiciones para que la emulsión elaborada sea
rápidamente redispersable es con una concentración de tensoactivo del 5%, un BHL
de 12 y el tiempo de agitación no marca la diferencia a estas condiciones.
En el gráfico 4.3 se observa en forma resumida la influencia de cada factor sobre los
parámetros separación de fases y redispersión.
44
Gráfico 4.3 Influencia de cada factor sobre los parámetros separación de fases y
redispersión.
El tiempo de agitación no ejerce un efecto considerable en este experimento, pero el
BHL y la concentración de tensoactivo son los factores que mayor influencia ejercen.
En base a los resultados anteriores se estableció que las condiciones óptimas de la
formulación son las siguientes:
Tabla 4.18. Mejores condiciones en las formulaciones analizadas.
Separación de fases Redispersión
Nivel Descripción Nivel Descripción
Tiempo de agitación 1 5 min 1 5 min
BHL 2 12 2 12
3 15 3 15
Concentración de
tensoactivo
2 5% 2 5%
3 7,5% 3 7,5%
Y corresponde a los siguientes números de experimento.
Tabla 4.19. Números de experimentos con las mejores condiciones
Número de
experimento
Tiempo de
agitación (min)
BHL Concentración del
emulsificante (%v/v)
Separación Redispersión
5 5 12 5,0 1 Si
6 5 12 7,5 2 Si
8 5 15 5,0 2 Si
Con las tres formulaciones que se muestran en la tabla 4.21 se realizaron las pruebas
para evaluar la eficacia de la forma farmacéutica.
0 6,25
44,81
75
55,19
18,75
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Separación de fases Redispersión
Co
ntr
ibu
ció
n (
%)
Contribución de cada factor
Tiempo de agitación
BHL
Concentración de tensoactivo
45
A las tres formulaciones se les asignó las letras A, B y C respectivamente.
Y el tiempo de aplicación se definió de la siguiente manera:
Tiempo 1: 20 segundos por zona de aplicación.
Tiempo 2: 40 segundos por zona de aplicación.
4.6. Condiciones para la aplicación de la emulsión
Las emulsiones se aplicaron a través de un aerógrafo. En las siguientes condiciones:
A una distancia de 20 cm entre el aerógrafo y el libro, para evitar que las hojas se
mojen.
La aplicación se la realizó desde el lado izquierdo hacia el derecho y de arriba hacia
abajo, para asegurar que se toda el área se cubra.
Se requiere el uso de un compresor, con una potencia del motor de 186W, una presión
máxima de 2,8 bar.
4.7. Evaluación de la eficacia de la forma farmacéutica
Cálculo del factor de dilución:
𝐹𝐷 = 𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒
𝑚𝑙 𝑠𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖ó𝑛
𝐹𝐷 = 10 𝑚𝑙
0,1 𝑚𝑙
𝐹𝐷 = 100
Cálculo de las unidades formadoras de colonia por centímetro cuadrado de zona de
aplicación:
𝑢𝑓𝑐
𝑐𝑚2=
⋕ 𝑢𝑓𝑐 𝑥 𝐹𝐷
Á𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑒𝑜
𝑢𝑓𝑐
𝑐𝑚2=
⋕ 𝑢𝑓𝑐 𝑥 𝐹𝐷
25 𝑐𝑚2
𝑢𝑓𝑐
𝑐𝑚2= 2222
La ecuación 3.5 se aplicó para calcular las ufc inicial (antes de la aplicación de la
emulsión) y las ufc final (después de la aplicación de la emulsión).
46
Para calcular el porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc)
que posee cada una de las tres formulaciones al ser aplicadas en los libros se utilizó la
ecuación 3.6 y 3.7.
% 𝑁𝑜 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =
𝑢𝑓𝑐 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2
𝑢𝑓𝑐 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑚2
𝑥100
% 𝑹𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐 = 𝟏𝟎𝟎% − %𝑵𝒐 𝒓𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐
% 𝑁𝑜 𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜 =20
48𝑥100 = 41,66%
% 𝑹𝒆𝒅𝒖𝒄𝒊𝒅𝒐 = 𝟏𝟎𝟎% − 𝟒𝟏, 𝟔𝟔% = 𝟓𝟖, 𝟑𝟑%
Desde la tabla 4.20 hasta la tabla 4.25 se muestra las ufc de hongos antes y después de
la aplicación de la emulsión sobre los libros y el porcentaje de reducción de las
unidades formadoras de colonia (ufc) de cada una de las emulsiones en sus diferentes
tiempos de aplicación.
En cada tabla de visualiza el promedio obtenido para cada tratamiento en cada libro,
expresado como Porcentaje de Reducción (%).
Tabla 4.20. Emulsión A, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 12 48 5 20 58,33
2 13 52 5 20 61,54
3 8 32 3 12 62,50
4 8 32 4 16 50,00
5 12 48 5 20 58,33
6 9 36 4 16 55,56
7 9 36 5 20 44,44
8 11 44 4 16 63,64
9 8 32 3 12 62,50
10 12 48 6 24 50,00
11 5 20 2 8 60,00
12 8 32 3 12 62,50
47
Tabla 4.21. Emulsión A, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 10 40 2 8 80,00
2 9 36 2 8 77,78
3 10 40 3 12 70,00
4 9 36 2 8 77,78
5 12 48 3 12 75,00
6 8 32 2 8 75,00
7 12 48 3 12 75,00
8 8 32 1 4 87,50
9 8 32 2 8 75,00
10 8 32 2 8 75,00
11 12 48 2 8 83,33
12 10 40 2 8 80,00
Tabla 4.22. Emulsión B, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 15 60 9 36 40,00
2 9 36 5 20 44,44
3 12 48 7 28 41,67
4 10 40 4 16 60,00
5 9 36 4 16 55,56
6 8 32 5 20 37,50
7 13 52 7 28 46,15
8 9 36 5 20 44,44
9 6 24 2 8 66,67
10 8 32 6 24 25,00
11 6 24 3 12 50,00
12 7 28 4 16 42,86
48
Tabla 4.23. Emulsión B, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 9 36 6 24 33,33
2 8 32 5 20 37,50
3 9 36 7 28 22,22
4 7 28 5 20 28,57
5 3 12 2 8 33,33
6 9 36 6 24 33,33
7 16 64 10 40 37,50
8 9 36 6 24 33,33
9 11 44 7 28 36,36
10 8 32 5 20 37,50
11 7 28 5 20 28,57
12 5 20 4 16 20,00
Tabla 4.24. Emulsión C, tiempo de aplicación 1: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 50 14 56 10 28,57
2 51 8 32 7 12,50
3 52 3 12 2 33,33
4 53 10 40 7 30,00
5 54 7 28 5 28,57
6 55 9 36 7 22,22
7 56 12 48 9 25,00
8 57 4 16 3 25,00
9 58 8 32 6 25,00
10 59 5 20 4 20,00
11 61 10 40 7 30,00
12 62 4 16 3 25,00
49
Tabla 4.25. Emulsión C, tiempo de aplicación 2: ufc iniciales y finales
ufc iniciales ufc finales
N.
repetición
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
𝑢𝑓𝑐𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎⁄
𝑢𝑓𝑐𝑐𝑚2⁄
Porcentaje
Reducción
(%)
1 63 6 24 4 33,33
2 64 8 32 5 37,50
3 65 5 20 3 40,00
4 66 9 36 7 22,22
5 67 9 36 6 33,33
6 68 7 28 5 28,57
7 69 8 32 4 50,00
8 70 10 40 9 10,00
9 71 9 36 7 22,22
10 72 10 40 6 40,00
11 74 9 36 7 22,22
12 75 7 28 5 28,57
Nota: Las pruebas realizadas con los blancos no ocasionaron reducción de las unidades
formadoras de colonia.
4.8. Análisis estadístico de la Eficacia de las emulsiones
El diseño estadístico usado fue un diseño factorial multivariable. Midiendo como variable
respuesta la reducción porcentual de ufc (unidades formadoras de colonia) de hongos. Los
resultados fueron evaluados mediante un análisis de varianza con 2 Factores: el tipo de
formulación y el tiempo de aplicación; con 3 y 2 niveles respectivamente. Se realizó tres
repeticiones por cada ensayo, con un total de 18 tratamientos realizados.
Tabla 4.26. Factores y niveles para el análisis de varianza
Factores Niveles Nomenclatura
Factorial
Tipo de
formulación
Formulación A -1
Formulación B 0
Formulación C +1
Tiempo de
aplicación
20 segundos -1
40 segundos 0
50
Tabla 4.27. Promedio del porcentaje de reducción de ufc en cada tratamiento estadístico.
Factor 2
Factor 1 Tiempo 1 Tiempo 2
Formulación A
58,09 76,39
55,49 78,13
58,75 78,33
Formulación B
46,53 33,53
45,91 34,38
46,13 31,73
Formulación C
26,10 33,26
25,20 30,48
25,00 28,25
Análisis de varianza:
Tabla 4.28. Análisis de Varianza para el porcentaje de reducción de las unidades
formadoras de colonia (ufc)
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Razón-F Valor-P
Efectos principales
A: Formulaciones 4938,08 2 2469,04 1168,16 0,0000
B: Tiempos 77,1573 1 77,1573 36,51 0,0001
Interacciones
AB 826,887 2 413,443 195,61 0,0000
Residuos 25,3633 12 2,11361
Total (corregido) 5867,49 17
El análisis de varianza descompone la variabilidad del porcentaje de reducción de las
unidades formadoras de colonia (ufc) en contribuciones debidas a varios factores. Los
valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores. Puesto que
3 valores-P, el tipo de formulación, el tiempo de aplicación y la interacción entre los
factores antes mencionados, son menores que 0,05, significa que estos factores tienen
un efecto estadísticamente significativo sobre el porcentaje de reducción de las
unidades formadoras de colonia (ufc) con un 95,0% de nivel de confianza.
51
Análisis de Componentes de Varianza
Tabla 4.29. Análisis de los componentes de la varianza para el porcentaje de
reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc)
Fuente Suma de
Cuadrados
Gl Cuadrado
Medio
Comp. Var. Porciento
Total (corregido) 5867,49 17
Formulaciones 4938,08 2 2469,04 361,282 78,01
Tiempos 904,044 3 301,348 99,7448 21,54
Error 25,3633 12 2,11361 2,11361 0,46
La tabla de análisis de varianza divide la varianza del porcentaje de reducción de las
unidades formadoras de colonia (ufc) en 2 componentes, uno para cada factor. El
objetivo de este análisis normalmente es comparar la cantidad de variabilidad con la
que contribuye cada uno de los factores, llamados los componentes de varianza. En
este caso, el factor que más contribuye a la varianza es el tipo de formulación. Su
contribución representa el 78,007% de la variación total en el porcentaje de reducción
de las unidades formadoras de colonia (ufc).
Gráfico 4.4. Influencia de cada factor en el porcentaje de reducción de las unidades
formadoras de colonia (ufc).
En el gráfico 4.4 se puede apreciar que en el tiempo 0 (40 segundo) y con la
formulación A se obtienen los mejores resultados en función del mayor porcentaje de
reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc).
Formulaciones
-10
1
Gráfica Multi-Vari para % Eficacia
25
35
45
55
65
75
85
% E
ficac
ia
Tiempos
-1 0
52
Gráfico 4.5. Comparación del porcentaje de reducción de las unidades formadoras de
colonia (ufc) con cada formulación.
En el gráfico 4.5 se puede observar que con la formulación A y el tiempo de
aplicación de 40 segundos por cada zona de aplicación se obtienen los mejores
resultados en la reducción de las unidades formadoras de colonia.
En la segunda etapa de la investigación se aceptaron las hipótesis alternativas en las
que se menciona lo siguiente:
Las formulaciones y tiempo de aplicación ejercen efecto significativo en la reducción
porcentual de las unidades formadoras de colonia.
57,44
46,19
25,43
77,2
32,21 30,66
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Formulación 1 Formulación 2 Formulación 3
% d
e R
edu
cció
n d
e u
fc
Porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc) de cada formulación
Tiempo de aplicación 20seg.
Tiempo de aplicación 40seg.
53
Capítulo V
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
Se extrajo el aceite esencial de las especies Pimpinella anisum, Syzygium aromaticum,
y Zingiber officinale por arrastre de vapor, obteniéndose los siguientes porcentajes de
rendimiento: Pimpinella anisum 0,68%, Syzygium aromaticum 0,74%, y Zingiber
officinale 1,02%.
La concentración mínima inhibitoria frente a las cepas de Aspergillus niger fue de 45
% v/v para Pimpinella anisum, 35% v/v para Syzygium aromaticum y 20% v/v para
Zingiber officinale.
La concentración inhibitoria mínima frente a las cepas de Penicillium chrysogenum
fue 40% v/v para Syzygium aromaticum, 20% v/v para Zingiber officinale, mientras
que la especie Pimpinella anisum no presentó concentración inhibitoria mínima.
La concentración fungicida mínima frente a las cepas de Aspergillus niger fue de 40%
v/v para Syzygium aromaticum, 25% v/v para Zingiber officinale y la especie
Pimpinella anisum no tuvo efecto fungicida.
La concentración fungicida mínima frente a las cepas de Penicillium chrysogenum fue
45% v/v para Syzygium aromaticum, 30% v/v para Zingiber officinale, mientras que la
especie Pimpinella anisum no presentó efecto fungicida.
Para la elaboración de la forma farmacéutica se eligió el aceite esencial de la especie
Zingiber officinale (jengibre), debido a que su efecto inhibitorio y fungicida se obtuvo
a concentraciones bajas en comparación a las otras dos especies estudiadas.
Se elaboró una forma farmacéutica líquida, una emulsión de tipo o/w, con la siguiente
formulación:
Aceite esencial de la especie Zingiber officinale (jengibre)………....30%
Span 60 …………………………………………………………..….1,5%
Tween 80…………………………………………………………….3,5%
Etanol absoluto………………………………………………………52%
Agua destilada…………………..……………………………….......13%
En la evaluación de la estabilidad de las diferentes emulsiones elaboradas se tomó en
cuenta dos parámetros: la separación de las fases de la emulsión luego de someterlas a
40 ºC por 40 minutos seguido de 10 minutos de centrifugación a 1000 rpm; y el
54
segundo parámetro fue la capacidad de la emulsión para redispersarse en el caso de
que la interfase sea de máximo 2 mm.
La mejor formulación en cuanto a parámetros de estabilidad y el porcentaje de
reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc), se obtuvo con la formulación
A (tiempo de agitación de 5 minutos, concentración de tensoactivo del 5% y un BHL
de 12) y el tiempo de aplicación 2 (40 segundos por cada zona de aplicación, con un
área aproximada de 1243 cm2).
El porcentaje de reducción de las unidades formadoras de colonia (ufc) obtenido con
la formulación A y el tiempo de aplicación 2, fue de 77,62%.
El estado de las hojas y la tinta de los libros no se afectaron con la aplicación de la
emulsión a través del aerógrafo y a una distancia de 20 cm entre el libro y el
aerógrafo.
55
5.2. Recomendaciones
Se recomienda analizar una mezcla de aceites esenciales en diferentes proporciones.
Evaluar otras formas farmacéuticas para la aplicación en documentos bibliográficos.
Evaluar el nivel de toxicidad al que se expondría el personal que labora en áreas de
restauración documental al emplear la emulsión a base del aceite esencial de jengibre.
Buscar otra alternativa para aplicar la forma farmacéutica propuesta en este trabajo de
investigación, de tal forma que se realice en menor tiempo.
Realizar estudios comparativos con otras formulaciones antifúngicas.
56
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58
6. ANEXOS
6.1. Anexo 1: Esquema causa - efecto
Contaminación Fúngica de
los documentos bibliográficos
del Área Histórica
Pocos estudios
Tratamientos
deficientes Condiciones de
Almacenamiento
Humedad no
Controlada
Poca revisión
rutinaria
No hay procesos
de desinfección
Métodos utilizados no
han sido probados
Tóxicos para el
personal
Afectan el papel
Falta de interés en el tema
Falta de financiamiento
59
6.2. Anexo 2: Diagrama de flujo para la extracción de los aceites esenciales
Materia prima Limpiar / Lavar
Orear
Envasar
Purificar
Extraer
Armar el equipo
clevenger
Triturar/Licuar
Colocar
Decantar, congelar
y filtrar
Mortero/Licuadora
Materia prima
Agua destilada
Núcleos de ebullición
3 horas Aceite esencial +
vapor de agua
Aceite esencial
Balón de 1 litro
60
6.3 Anexo 3: Aplicación en los libros:
Libros Seleccionar
Limpiar
Tomar las muestras
por hisopado
Cerrar el libro
Esparcir en cada
zona de aplicación
Ubicar a 20 cm de
distancia
Conectar al
compresor
Colocar en el
aerógrafo
Cubrir con papel
film
Brocha (cada hoja)
Aerógrafo
40 segundos
Aproximadamente
10 mL Emulsión
Conectar a 110 V
Luego de 4h de la
aplicación
61
6.4 Anexo 4: Fotografías
Extracción de los aceites esenciales por arrastre de vapor:
Cultivo de las cepas ATCC de hongos:
Aspergillus niger Penicillium chrysogenum
62
Conteo de esporas en la cámara de Neubauer:
Aspergillus niger Penicillium chrysogenum
Cultivo en la placa de microdilución
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Elaboración de la emulsión:
Limpieza de los libros
Aplicación de la emulsión en los libros