Research Meeting

R4 김경원

2004 년도 현재 연구 상황

Micropapillary carcinoma of thyroid Clinical and pathological review Braf V599E mutation analysis

Role of H2O2 generation and its effect of thyroid hormone synthesis and damage of thyrocyte TSH 에 의한 catalase, GPx, PRx 변화 TSH 에 의한 H2O2 생산의 변화

Proliferation of thyroid cell

TSH mediated, cAMP-dependent PKA

In WRT (Winstar rat thyroid) cell, microinjection of PKA inhibitor partially inhibited TSH induced DNA synthesis

TSH mediated, cAMP-independent PKA TSH mediated, cAMP-dependent MAPK (small G-protein Rap1, and B-Raf are invo

lved)Molecular Pharmacology 2001, 60 (5)

Mitogen-Activated Protein Kinase

Raf protein and cancer

30% of human tumor : mutations in one of the 3 Ras genes (KRAS>> NRAS, HRAS) KRAS : ↑ level of Ras.GTP active ERKs pancreas adenocarcinoma, colon ca, lung adenocarcinoma

In mammals : A-raf, B-raf, raf-1(c-raf, c-raf-1)

No RAF1 mutation were detected in cancer cell lime (Davies et al. Nature 417(2002) 949-954)

Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1653,25-40

Raf proteins and cancer

BRAF gene mutation : melanoma (75%), colon cancer (15%) may not be actual cause of the cancer Prerequisite for development of tumor

Cancer studies identified B-Raf rather than Raf-1 as more important of the Raf proteins for mediating Ras effects and for activating MEK/ERK

BRAF and KRAS are equivalent in their tumourigenic effects

Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1653,25-40

B-RAF

B-Raf : highly restricted expression in neuronal tissue, other in the testis, spleen

BRAF gene mutation melanoma (70%), colon cancer (15%), ovarian

cancer, thyroid cancer most frequent site 599 : Val(V) Glu (E) ↑kinase activity in vitro Induce constitutive activation of ERK G1/S transition of the cell cycle through regula

tion of the expression of cyclin D and E

Micropapillary thyroid cancer

갑상선 암 조직파라핀 고정 조직의 사용이 가능한 환자방법 : DNA extraction (QIAGEN®)and PC

RB-RAF V599E 돌연변이 분석 후 이와

임상 결과와 비교 예정

Micropapillary thyroid cancer

대상 1970 년 부터 2004 년 서울대병원 , 분당 서울대 병원 , 보라매병원에서 수술 받은

환자 의무기록 리뷰를 통한 후향적 연구 병리학적 소견과 임상 소견 ( 진단 시 연령 , 성별 , 경과 )

분석 100 명 구축 (200 명 예정 ) Sample :

갑상선 암 frozen tissue : 20 여개 (SNUBH) 파라핀 고정 조직 : 100 명 (SNU)

Tissue Array

갑상선 조직 : BRMH & SNUH Normal, adenoma, PTC, PMC, FC, AC, HT

Tissue array 제작 , immunohistochemistry

Screening PTC vs PMC Follicular Carcinoma vs Adenoma

2004 년도 현재 연구 상황

Micropapillary carcinoma of thyroid Clinical and pathological review Braf V599E mutation analysis

Role of H2O2 generation and its effect of thyroid hormone synthesis and damage of thyrocyte TSH 에 의한 catalase, GPx, PRx 변화 TSH 에 의한 H2O2 생산의 변화

Thyroid hormone synthesis

Thyroid hormone synthesis

H2O2

Produced by a Ca 2+ dependent NADPH oxidase

Electron acceptor in the TPO-catalyzed iodination of thyroglobulin Key control point in hormonogenesis

Potent inducers of apoptosis

Degradation of H2O2

In FRTL-5 cells, TSH increase the exogenous H2O2 degradation rate (nmol/mg DNA) (Bjö

rkman et al. Molecular and Cellular Endocrinology 111(1995))

GPx is involved in the low H2O2 (100umol/L)

Catalase is required at high H2O2 (mmol/L)

Eur J Endocrinology 2004, 150,841-849

Degradation of H2O2

2 GPx in thyroid tissue, active in cytosol Cytosolic GPx(GPx 1) phospholipid hydroperoxide GPx(GPx 4) More important than catalase 단기간에 많이 생성된 H2O2 를 제거하는 데는 불충분 Se deficiency necrosis and fibrosis of thyroid gl

Catalase enclosed in the peroxisomes Not directly accessible at the site of H2O2 production

Peroxiredoxin

Eur J Endocrinology 2004, 150,841-849

Role of Peroxiredoxin

Prx I : expression is stimulated by TSH and H2O2 and

MMI (Kim et al. J Biol Chem 2000,275, 18266-18270) thyroid tumor (Cancer Lett. 1999 Oct 18;145(1-2):127-32)

Prx II : also called TSA (thiol specific antioxidant) expression is NOT stimulated by TSH and H2

O2 and MMI (Kim et al. J Biol Chem 2000,275, 18266-18270)

TSH regulate TSA mRNA (Kim et al. Cell Physiol Biochem 2001,11, 247-252)

may eliminate cytosolic H2O2 in resting and TSH-stimulated thyroid cell ?

Autoimmune Thyroid disease

다른 기관에 생기는 자가면역질환은 세포파괴나 기능저하와 관련

그레이브스병은 TSH receptor antibody 를 통한 갑상선 기능 항진증을 유발

자가항체가 많이 생기는 이유가 혹시 H2O2 를 많이 생성하는 것과 관련이 있을 가능성은 ?

연구 내용 및 방법

갑상선 세포에서 H2O2 생성 측정법 Amplex Red H2O2 Assay kit Fluorometer using DCHF

갑상선 자극 호르몬 양에 따른 H2O2 제거 효소 변화 관찰 TSH 를 제거한 5H , F12 배지에서 FRTL-5 cell

를 키운 후 Prx 양을 측정 (Western blot) TSH deficient media 에서 다시 TSH 를

공급하였을 때 시간에 따른 Prx 의 변화

esterase

2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCHF-DA)

2’7’-dichlorofluorescein (DCF)

2’7’-dichlorofluorescein (DCF)

H2O2, OH-

Cell

Cell preparation for H2O2

FRTL-5 cellCells were shift to 5H5 media, after

incubation in this medium, TSH were added

Incubated in Krebs-Ringer solution + DCHF-DA

Cell preparation for Prx5H5

5H5 5H5

5H5 5H5 F12

5H5 5H5 F12

5H5 5H5 F12

5H5 5H5 F12

5H5

6H5

TSH

5H5 5H5

6H56H5

TSHTSH

0 3 6 7.5 8 8.5 9 days

Western Blotting

Cell lysisConcentration 측정 (BCA, microplate)Cell sample preparationElectrophoresisMembrane TransferPrimary antibody (1:3000- 1:6000) incubationExposure

Western Blotting

Actin

Prx I

5H 6d 5H6dF12

5H6dF12

6H0.5

5H6dF12

6H1d

5H6dF12

6H1.5

5H6dF12

5H1.5

5H6dF12

TSH0.5

5H6dF12

TSH1.5

5H6dF12

TSH1.0

Western Blotting

Actin

Prx I

5H 6d5H6dF12

5H6dF12

6H0.5

5H6dF12

6H1d

5H6dF12

6H1.5

5H6dF12

5H1.5

5H6dF12

TSH0.5

갑상선 세포의 성장 신호 전달 체계

s

cAMP

AC

Cellular Growth & Proliferation

TSH/TSAbCytokine

STATPP

PJAK

PKA PKC

Shc

Ras/MAPK PI3K

PLC

IP3+DAG

q

JAK/STAT

IRS

IGF-1/insulin

성장인자에 따른 갑상선세포에 미치는 영향

1st incub.2nd incub.

00 TSH

0 0IGF-1

TSHIGF-1

IGF-1TSH

Rela

tive D

NA

sy

nth

esi

s

IGF-1 EGF InsulinControl TSH

* Immunoblotting : anti-Shc

• TSH 에 의해 변화된 세포 내 물질의 시간에 따른 변화 (preconditioning) 는 다른 성장인자에 의한 세포 증식 조절에 매우 중요한 역할을 담당

• TSH 및 여러 성장인자 자극 후 세포내 물질의 변화는 성장 인자에 따른 다양한 반응 양상을 설명 가능

TSH 수용체 성장신호전달 체계에서 중요한 역할을 담당하는 S6K1 을 S6K1 특이 - 억제제인 rapamycin 을 이용하여 억제한 후 유전자의 변화를 살펴봄으로써 , S6K1 의 주요 하부 신호 전달 체계를 규명

이상의 microarray 를 이용한 유전자의 발현 양상의 비교 분석은 갑상선 세포 성장기전 연구의 방향 설정에 중요한 정보를 제공할 것으로 기대됨

cAMP, PKA

GsAC p85 p110

Thyrocyte proliferationRegulation of follicle activity

TSH Receptor

PI3K

S6Cyclin D1Bcl xLICAM-1VEGF

STAT3

Tumor Suppressor (p53, MDM2)

Akt/PKBS6K1

mTOR

rapamycin

PD

K-1

연구 목적

1) FRTL-5 갑상선 세포에서 TSH 자극 후 시간에 따른

2) TSH, IGF-1, insulin 등 성장 인자의 종류에 따른

3) 갑상선 세포에서 TSH 자극에 의한 중요한

성장신호전달체계인 S6K1 활성 유무에 따른

갑상선 세포의 유전자 발현 양상의 변 화를 살펴봄으로써 ,

갑상선 세포의 증식조절기전의 연구의 방향을 제시하고 , 궁

극적으로는 갑상선종의 발생 기전 연구의 토대를 마련하고자

함

실험 방법 세포 : normal rat thyroid cell-line (FRTL-5 cell)

세포배양조건 : 6H5 - 5H5 - 3H0.5 o/n - 3H0.5 + 조건 control 조건 : 3H0.5

실험 조건 TSH 자극 시간 변화 : 6, 24, 48, 72h (x3) 성장인자 종류 : TSH, IGF-1, insulin, 24h (x2) S6K1 억제 : Rapamycin, TSH+Rapa, TSH, 6h (x2)

1 월 2 월 3 월 4 월 5 월 6 월

RNA 준비 : 연구자RNA 준비 : 연구자cDNA chip 실험 : 인간유전체연구소cDNA chip 실험 : 인간유전체연구소

자료분석 : 인간유전체연구소자료분석 : 인간유전체연구소

Normalization, Transformation &Identification of Differential Expressed Gene (DEG)

TSH 처리시간에 따른유전자 발현의 분포 및 변화 경향 분석

 Gene (DEG)

12h ∩ 24h

24h ∩ 48h

Up number 1 7

difference

Down number 3 14

difference

• 12h vs. 24h : 서로 다른 종류의 유전자 발현 • 24h vs. 48h : 비슷한 유전자 발현 양상 (24h 에서 DEG 는 48h 에서도 모두 DEG)

발현 정도는 시간에 따라 감소

12h

24h

48h

Up 11 7 45

Down

22 14 28

TSH 처리시간에 따라 발현하는 유전자 규명 및 그 변화 양상과 상호 관계 분석

Gene (DEG) 12h 24h 48h

Up

Casein kinase 1 gamma 3 isoform Chondrotin sulfaye proteoglycan 6 etc ??? (unknown gene) Regulator of G-protein signaling 8 Similar to phosphoprotein enriched astrocytes 15 Rab 38, cyclin G1, MAP kinase 14 casein kinase 1 gamma 3 isoform, IFNg inducible protein 1 Nestin, NF kappa B p105 subunit, syntenin, etc

Down

Aggrecan 1, myosin iE, p21-activated kinase 1 BMP 4, BMP receptor type 1A, etc Cyclin dependent kinase-4 MAP kinase-activated protein kinase2, PIPPin protein fatty acid binding protein 4, GABA transporter protein Nucleoside phophorylase, splicing factor VT521-B, etc CD151, cytochrome oxidase subunit Vic Homeo box, msh-like 1

향후 계획

분석 완료 후 , 통계적으로 의미 있는 발현 변화를 보인 유전자의 identification

유전자 발현 변화 확인 실험 : RT-PCR, Southern blot 등 발현의 변화가 확인된 유전자의 functional assay, 상호관계

분석 갑상선 세포 증식 기전 연구의 중심 item 설정

TSH 의 작용 기전과 다른 성장인자들과의 상호작용에 따른 갑상선 세포의 증식 기전 연구의 방향 설정