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PRISCILA AKEMI MORETTI NAKAMURA

Resistência aos antimicrobianos entre amostras de Streptococcus

agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário

NITERÓI

2010

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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Microbiologia e Parasitologia

Aplicadas da Universidade Federal Fluminense,

como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Rosana Rocha Barros

NITERÓI

2010




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em

Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade

Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção

do grau de Mestre.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________________________________

Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira

UFF

_______________________________________________________________________

Dra. Fabiola Cristina de Oliveira Kegele

FIOCRUZ

_______________________________________________________________________

Profa. Dra. Lenise Arneiro Teixeira

UFF

NITERÓI

2010

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo sustento, pelas bênçãos, enfim por mais essa etapa vencida.

Agradeço a Prof. Dra. Rosana Rocha Barros pela atenção, pelos conhecimentos transmitidos e

pela orientação fundamental à realização deste trabalho.

Aos professores do departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFF, em especial, ao prof.

Aloysio de Mello F. Cerqueira e aos professores da disciplina de virologia pela disponibilidade de

equipamentos de seus laboratórios.

Às professoras Lúcia M. Teixeira e Regina Maria C.P. Domingues, Instituto de Microbiologia,

UFRJ e a Dra. Fabiola Cristina O. Kegele, Fiocruz, pela doação de insumos utilizados nesse estudo.

À rede de laboratórios NKB pela doação das amostras.

Ao professor Felipe Piedade G. Neves, pela revisão da dissertação.

Agradeço aos meus pais, Yasuyuki Nakamura e Valdiléa Moretti Nakamura, por terem me dado à

oportunidade de completar um curso superior e por me apoiarem em todos os momentos e

decisões.

Aos meus avós pelo carinho, amor e ajuda não apenas durante a pesquisa, mas por toda vida.

Agradeço ao João Ronaldo Hübner, pela ajuda na realização desse trabalho.

À Pro-Reitoria de Pesquisa, Pós-graduação e Inovação, PROPPI/UFF e à Fundação Carlos Chagas

de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, FAPERJ, pelo auxílio financeiro.

LISTA DE ABREVIATURAS

ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists

ATCC American Type Culture Collection

CAMP Christie, Atkins, Munch-Peterson

CDC Centers for Disease Control and Prevention

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMB Instituto Biomédico

CMI Concentração Mínima Inibitória

CO2 dióxido de carbono

DNA ―deoxyribonucleic acid‖

dNTP desoxirribonucleotídeos fosfatados

EGB Estreptococos do grupo B

erm ―erythromycin ribosome methylation‖

E-test

Epsilometer test

f ―forward‖

gyrA gene que codifica as subunidades A e B da DNA girase

I Intermediário

ITU Infecções do Trato Urinário

kDa kiloDaltons

M fenótipo M

Mef “ macrolide efflux”

MgCl2 Cloreto de magnésio

MHA-S Agar Müeller Hinton acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro

min minutos

MLSB macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B

MLSBi fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B indutivo

MLSBc fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B constitutivo

µg micrograma

µL microlitro

mL mililitro

µm micrômetros

µM micromolar

mm milímetros

mM milimolar

P sítio peptil

parC gene que codifica as subunidades A e B da topoisomerase IV

pb pares de bases

PBP ―Penicillin Binding Protein‖

PCR ―Polimerase Chain Reaction‖

pH potencial hidrogeniônico

r ―reverse‖

R Resistente

RAPD ― Randon Amplified Polymorphic DNA‖

RNAt ― ribonucleic acid‖

rpm rotação por minuto

QRDR ― Quinolone Resistance Determining Region‖

S sensível

23S subunidade 23

TBE Tris- borato-EDTA

tet determinante genético de resistência à tetraciclina

TSA-S Agar Trypticase Soy suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro

TE Tris- EDTA

U unidades

UFC Unidade Formadoras de Colônias

UFF Universidade Federal Fluminense

UI Unidades Internacionais

UPGMA ―Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean‖

UV ultra-violeta

V volts

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Seqüência dos iniciadores para amplificação dos genes ermA, ermB e

mefA/E.------------------------------------------------------------------------------------------------

19

Tabela 2 - Reagentes utilizados na reação de amplificação dos genes de resistência

ermA, ermB e mefA/E.-------------------------------------------------------------------------------

19

Tabela 3 - Parâmetros de amplificação para PCR.---------------------------------------------- 20

Tabela 4 – Reagentes utilizados no RAPD-PCR.------------------------------------------------

21

Tabela 5 – Parâmetros de amplificação para RAPD-PCR.------------------------------------

21

Tabela 6. Total de amostras submetidas aos testes de sensibilidade a antimicrobianos,

através do método de difusão em agar.-----------------------------------------------------------

25

Tabela 7. Informações sobre as 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena ou

intermediária à eritromicina pelo teste de difusão em agar.------------------------------------

26

Tabela 8. Distribuição das 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena e

intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar, CMI pelo método de

diluição em agar, fenótipos e genes de resistência. --------------------------------------

27

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ocorrência de resistência aos antimicrobianos entre as amostras isoladas a

partir da urina (30), trato genital masculino (esperma, secreções uretral e de prepúcio -

19) e trato genital feminino (secreções vaginal e cervical - 51).-----------------------------

28

Figura 2. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae resistentes

à eritromicina, obtidos por RAPD-PCR. -------------------------------------------------------

29

Figura 3. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos

das amostras de S. agalactiae resistentes à eritromicina.-------------------------------------

30

Figura 4. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae sensíveis

à eritromicina obtidos por RAPD-PCR.---------------------------------------------------------

31


das amostras de S. agalactiae sensíveis à eritromicina.---------------------------------------

32


das amostras de S. agalactiae resistentes e sensíveis à eritromicina.------------------------

33

RESUMO

Streptococcus agalactiae (estreptococos do grupo B - EGB) é uma das espécies de estreptococos de maior

relevância clínica. Membro da microbiota de mucosas, coloniza os tratos gastrintestinal e genitourinário

humanos, podendo causar infecções em neonatos, gestantes e adultos não grávidos, principalmente entre

indivíduos com idade avançada, imunodebilitados, dentre outros fatores de risco. Infecções urinárias por

EGB compreendem uma das manifestações mais freqüentes, acometendo indivíduos de todas as idades. O

objetivo desse estudo foi avaliar, entre amostras de EGBs isoladas de espécimes do trato genitourinário de

indivíduos não grávidos, o perfil de resistência aos antimicrobianos recomendados para tratamento das

infecções causadas por esta espécie, bem como estudar características genéticas entre amostras que

apresentaram resistência ao antimicrobiano eritromicina. Foram analisadas 100 amostras isoladas a partir

de espécimes do trato genitourinário [secreção vaginal (49), urina (30), esperma (17), outras secreções (4)],

de indivíduos não grávidos (73 do sexo feminino e 27 do sexo masculino, com faixa etária variando de 6 a

79 anos) residentes na área metropolitana do Rio de Janeiro, entre 2008 e 2009. As amostras foram

caracterizadas como cocos Gram positivos, beta-hemolíticas, capazes de hidrolisar o hipurato e em 98% o

fator CAMP foi detectado. As amostras foram submetidas ao teste de susceptibilidade a antimicrobianos,

pelo método de difusão em agar. Todas as amostras foram sensíveis à ceftazidima, penicilina e

vancomicina. Foi observada resistência à levofloxacina em uma amostra, cuja concentração mínima

inibitória (CMI) foi superior a 32 g/mL, através do teste epsilométrico (E-test ). A resistência plena e

intermediária à tetraciclina ocorreu em 83 e 6 amostras respectivamente. A resistência à eritromicina foi

observada em 11 amostras, que apresentaram os fenótipos M (2), MLSB indutivo (4) e MLSB constitutivo

(5), este último conferindo também resistência à clindamicina. Foi ainda observada resistência

intermediária à eritromicina em 4 amostras, com os fenótipos M (1) e MLSBi (3). Todas as amostras que

apresentaram resistência plena ou intermediária à eritromicina foram resistentes, pelo método de difusão

em agar, à tetraciclina e à azitromicina. As amostras resistentes à eritromicina foram submetidas à

determinação da CMI pelo método de diluição em agar, cujos valores variaram entre 0,5 a > 256 g/mL.

Houve discrepância de interpretação entre as duas metodologias utilizadas em três amostras. As amostras

resistentes à eritromicina foram submetidas à pesquisa de determinantes genéticos de resistência. As

amostras com fenótipo M (3) apresentaram o produto de amplificação compatível com o esperado para o

gene mefA/E. O gene ermA foi observado nas amostras com fenótipo MLSBi (5) e MLSBc (4), enquanto o

gene ermB foi encontrado somente em uma amostra, cujo fenótipo foi MLSBi e apresentou

simultaneamente dois genes de resistência (ermA e ermB). Outra amostra de fenótipo MLSBi também

albergou simultaneamente os genes ermA e mefA/E. Uma amostra cujo fenótipo foi MLSBc não gerou

nenhum produto de amplificação após as reações com os iniciadores utilizados. Empregando-se a

metodologia de RAPD-PCR, observou-se diversidade tanto entre amostras resistentes como entre amostras

sensíveis à eritromicina, porém, notou-se a presença de perfis genéticos de significativa similaridade entre

amostras que albergam diferentes determinantes genéticos de resistência, assim como entre amostras

resistentes e sensíveis a este antimicrobiano, indicando que a aquisição destes genes não provocou

alterações no genoma detectáveis pela metodologia utilizada, ou ainda, que estes eventos ocorrem de forma

aleatória na população de amostras circulantes, não sendo capazes, portanto, de determinar a ocorrência de

grupos clonais específicos.

ABSTRACT

Streptococcus agalactiae (group B streptococci - GBS) is one of the major clinical relevant

streptococcal species. Member of the mucosal microflora, it colonizes the human gastrointestinal

and genitourinary tracts and can cause diseases in newborns, pregnant women and non-pregnant

adults, especially among the elderly, immunocompromised and other risk factors. Urinary tract

infections by GBS comprise one of the most frequent clinical manifestations, affecting individuals

of all ages. The aim of this study was to evaluate, among GBS isolates recovered from specimens

of the genitourinary tract of non pregnant individuals, the resistance to antimicrobial agents

recommended for treatment of infections caused by this species and to study the genetic

characteristics of erythromycin resistant isolates. One hundred isolates recovered from

genitourinary tract specimens [vaginal discharge (49), urine (30), sperm (17), other secretions (4)]

of non-pregnant individuals (73 females and 27 males, with ages ranging from 6 to 79 years)

living in the metropolitan area of Rio de Janeiro, between 2008 and 2009 were analyzed. The

isolates were characterized as Gram positive cocci, beta-hemolytic, able to hydrolyze hippurate

and in 98% the CAMP factor was detected. The isolates were submitted to antimicrobial

susceptibility tests by agar diffusion method. All isolates were susceptible to ceftazidime,

penicillin and vancomycin. One isolate was resistant to levofloxacin, with minimum inhibitory

concentration (MIC) higher than 32 µg/mL by E-test . Resistance and intermediary resistance to

tetracycline was found in 83 and 6 isolates respectively. Resistance to erythromycin was observed

in 11 isolates, which showed the M (2), inductive MLSB (4) and constitutive MLSB (5)

phenotypes, the latter also conferring resistance to clindamycin. It was also observed intermediary

resistance to erythromycin in four isolates, with the M (1) iMLSB (3) phenotypes. All samples that

showed full or intermediary resistance to erythromycin were resistant by agar diffusion method to

tetracycline and azithromycin. These isolates were submitted to MIC determination by agar

dilution method, with values ranging from 0.5 to > 256 µg/mL. There was a discrepancy in

methodologies interpretation in three isolates. Isolates resistant to erythromycin were tested for the

most common genetic determinants of resistance. In isolates with M phenotype (3) an amplicon

consistent with that expected for the gene mefA/E was detected. The ermA gene was observed in

isolates with phenotype iMLSB (5) and cMLSB (4), while the ermB gene was found only in one

isolate, with iMLSB phenotype, that presented two resistance genes (ermA and ermB)

simultaneously. Another isolate with iMLSB phenotype also harbored ermA and mefA/E

simultaneously. One isolate with cMLSB phenotype did not generate any amplification product

after PCR with primers used. By RAPD-PCR methodology, it was observed diversity among

erythromycin resistant and susceptible isolates. However, the presence of genetic profiles of

significant similarity among isolates that harbored different determinants of resistance, as well as

among resistant and susceptible isolates, indicates that the acquisition of these genes have not

caused detectable changes in the genome when analyzed by this methodology, or even that these

events occur randomly in the population of circulating strains, therefore, they are not able to

determine the occurrence of specific clonal groups.

SUMÁRIO

1. Introdução ------------------------------------------------------------------------------------ 1

1.1 Histórico ------------------------------------------------------------------------------------ 1

1.2 Características gerais ---------------------------------------------------------------------- 1

1.3 Síndromes clínicas ------------------------------------------------------------------------- 3

1.4 Antibioticoterapia e resistência a antimicrobianos ------------------------------------ 7

2. Objetivos ------------------------------------------------------------------------------------- 14

3. Material e Métodos ------------------------------------------------------------------------- 15

3.1) Amostras bacterianas --------------------------------------------------------------------- 15

3.2) Caracterização fisiológica --------------------------------------------------------------- 15

3.2.1) Observação das características morfológicas e hemólise ---------------- 15

3.2.2) Observação do fator CAMP-------------------------------------------------- 15

3.2.3) Teste de Hidrólise do Hipurato ---------------------------------------------- 16

3.3) Caracterização sorológica --------------------------------------------------------------- 16

3.4) Teste de susceptibilidade a antimicrobianos ------------------------------------------ 16

3.4.1) Método de difusão em agar -------------------------------------------------- 16

3.4.2) Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) --------------- 17

A) Diluição em agar ----------------------------------------------------------

B) Teste Epsilométrico (E test ) --------------------------------------------

17

18

3.5) Ensaios envolvendo realização de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ------ 18

3.5.1) Obtenção de DNA ------------------------------------------------------------ 18

3.5.2) Detecção de determinantes genéticos de resistência a macrolídeos --- 18

3.5.3) Análise do polimorfismo do DNA através de PCR com amplificação

randômica do DNA (RAPD-PCR) --------------------------------------------------

20

3.5.4) Análise dos perfis eletroforéticos obtidos a partir de RAPD-PCR----- 21

4. Resultados ------------------------------------------------------------------------------------ 22

5. Discussão ------------------------------------------------------------------------------------- 34

6. Conclusão ------------------------------------------------------------------------------------ 38

7. Referências Bibliográficas ----------------------------------------------------------------- 39

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico

Streptococcus agalactiae ou Estreptococos do grupo B (EGB) foi inicialmente descrito

por Nocard & Mollereau, em 1889, isolado de mastite bovina, com a designação de

―Streptococcus nocardi‖ e posteriormente renomeado Streptococcus agalactiae (apud KEEFE,

1997). A partir da década de 1930, esses microrganismos foram reconhecidos tanto como

integrantes da microbiota anfibiôntica de humanos, como agentes etiológicos de infecções pós-

parto, assim como infecções em adultos não grávidos, especialmente aqueles de idade avançada.

A partir da década de 1960, observou-se o envolvimento desta espécie em infecções sistêmicas

em neonatos e, na década seguinte, o EGB emergiu como o principal agente de infecção neonatal

(apud SCHUCHAT & WENGER, 1994; apud EDWARD & BAKER, 2005).

1.2 Características gerais

O gênero Streptococcus é formado por cocos Gram positivos, que se dispõem em cadeias

ou aos pares quando cultivados em meios líquidos. São anaeróbios facultativos e algumas

espécies necessitam de dióxido de carbono (CO2 – crescimento capnofílico) para o seu

desenvolvimento. Ao fermentarem a glicose, produzem predominantemente o ácido láctico,

sendo denominados homofermentadores. São oxidase e catalase negativos. Geralmente

necessitam de meios enriquecidos com sangue ou soro para o seu isolamento. Quando cultivados

em meio sólido contendo sangue, são observados os seguintes padrões de atividade hemolítica:

hemólise alfa ( ), caracterizada por uma zona esverdeada ao redor das colônias, resultado da lise

incompleta das hemácias (hemólise parcial) e hemólise beta ( caracterizada por uma zona clara

e/ou transparente ao redor das colônias devido à lise completa das hemácias (hemólise total). As

espécies que não são capazes de promover um dos tipos de hemólise são conhecidas como não

hemolíticas (KONEMAN et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

Os constituintes da parede celular de EGB são basicamente peptideoglicana, ácidos

teicóicos, glicoproteínas e proteínas antigênicas de superfície. Essas bactérias tanto podem fazer

parte da microbiota de seres humanos e animais, colonizando principalmente as mucosas dos

2

tratos genitourinário e gastrointestinal, quanto serem patógenos destes hospedeiros (KONEMAN

et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

Rebecca Lancefield, em 1933, desenvolveu o sistema sorológico para diferenciação de

amostras -hemolíticas. Os antígenos detectados por este sistema são polissacarídeos grupo-

específicos presentes na parede celular. Através deste sistema, as amostras -hemolíticas dos

grupos A, B, C, F e G são rapidamente identificadas na rotina do laboratório clínico. Na espécie

Streptococcus agalactiae, encontra-se o antígeno do grupo B, composto por ramnose, N-

acetilglicosamina e galactose (KONEMAN et al, 2001; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER,

2006).

Micromorfologicamente, os EGB apresentam-se como células esféricas ou ovóides, com

0,6 a 1,2 micrômetros (µm) de diâmetro que formam pares ou cadeias de tamanhos variados.

Macromorfologicamente, possuem colônias com dimensões de três a quatro milímetros (mm),

superfície plana, coloração amarelada e/ou acizentada. São exigentes em termos nutricionais e

possuem temperatura ótima de crescimento de aproximadamente 35oC. Ressalta-se ainda que

esses microrganismos são em sua maioria hemolíticos, porém, podem ser -hemolíticos ou

menos freqüentemente, não hemolíticos (MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006;

JAWETZ, MELNICK & ADELBERG, 2009).

Morfologia colonial, padrões de hemólise em ágar-sangue, composição antigênica grupo-

específica da parede celular e testes fisiológicos como resistência à bacitracina e capacidade de

hidrolisar o hipurato de sódio, são combinações úteis na identificação dos EGBs, sendo este

último teste amplamente utilizado na identificação presuntiva desses microrganismos

(KONEMAN et al, 2001). Outro teste presuntivo tradicionalmente empregado na identificação

dos EGBs é a produção do fator CAMP, denominado por Christie, Atkins, Munch-Peterson, em

1944. Os EGBs possuem uma proteína extracelular termoestável de 23,5 kiloDaltons (kDa) com

capacidade de difusão, denominada de fator CAMP, que intensifica a capacidade hemolítica de

algumas amostras de Staphylococcus aureus (amostras produtoras de uma esfingomielinase C,

que apresenta propriedade de se ligar à membrana dos eritrócitos). Quando amostras de S. aureus

produtoras de lisina e S. agalactiae são inoculados perpendicularmente sobre a superfície do

agar-sangue, ocorre um sinergismo de hemólise, tipicamente com formato de ponta de seta

(KEEFE, 1997; KONEMAN et al, 2001; HENSLER et al, 2008). Além de seu papel na

identificação presuntiva, o fator CAMP tem sido apontado como um importante fator de

3

virulência da espécie, uma vez que promove poros em hemácias e é capaz de se ligar às

imunoglobulinas G e M via fração Fc. (SKALKA & SMOLA, 1981; JURGENS, STERZIK &

FEHRENBACH, 1987; DORAN & NIZET, 2004).

Outro componente celular é a cápsula, de natureza polissacarídica. Esta tem sido

considerada um fator de virulência essencial em S. agalactiae, já que inibe a fagocitose e a

ativação do complemento na ausência de anticorpos específicos. São descritos nove sorotipos de

polissacarídios capsulares (Ia, Ib, II a VIII), além de um décimo sorotipo (IX), recentemente

relatado (DOGAN et al, 2005; KARUNAKARAN et al, 2009). A cápsula é constituída por

galactose e glicose, combinados com 2-acetoamino-2-deoxiglicose, ramnose ou N-

acetilglicosamina e com a porção terminal formada por ácido siálico (KILLIAN, 1998). Foi

demonstrado que o ácido siálico, presente na porção terminal desses polissacarídeos, é essencial

para a maior patogenicidade de alguns sorotipos, entre eles o sorotipo III, classicamente

associado às infecções neonatais causadas por EGB (KONEMAN et al, 2001; MURRAY,

ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

O conhecimento dos sorotipos é de extrema importância para a epidemiologia da doença,

desenvolvimento de vacinas, além de estarem associados à resistência bacteriana aos

antimicrobianos. É de conhecimento que mulheres grávidas, neonatos e adultos não grávidos são

comumente infectados pelos sorotipos Ia, III e V, este último emergindo como a principal causa

de enfermidade em adultos não grávidos, bem como está relacionado à resistência à eritromicina

(SAVOIA et al, 2008; KARUNAKARAN et al, 2009). Estes mesmos sorotipos são considerados

os principais causadores de infecções do trato urinário (ITU), enquanto que os sorotipos Ib, II e

IV são menos comumente associados à ITU em adultos (SAVOIA et al, 2008;

KARUNAKARAN et al, 2009; ULETT et al, 2009)

1.3 Síndromes clínicas

Os EGBs são normalmente isolados de amostras oriundas do reto, área perianal, uretra,

cérvice e vagina. A taxa de colonização é em média entre 20 a 35% em adultos não grávidos. Os

sítios anatômicos com menor freqüência de colonização incluem pele e faringe. Provavelmente a

aquisição desta bactéria no trato genitourinário é causada por contato íntimo, uma vez que a

prevalência é maior em pessoas sexualmente ativas (SCHUCHAT & WENGER, 1994; SENDI,

JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008). O papel da atividade sexual tem sido

4

demonstrado em alguns estudos como de Franciosi e colaboradores, em 1973 (apud SHUCHAT

& WENGER, 1994), que observaram que parceiros de mulheres carreadoras de EGBs também

carreavam o microrganismo, inclusive de mesmo sorotipo capsular. A colonização por EGBs no

trato urinário em mulheres pode sobrevir através da ascensão dos EGBs a partir da vagina, sendo

provavelmente o caminho para a maioria das bacteriúrias assintomáticas (ULETT et al, 2009).

Esses microrganismos estão associados às infecções em neonatos, mulheres grávidas e

adultos não grávidos, estes, em especial, com condições debilitantes, tais como imunossupressão,

idade avançada, diabetes, entre outras. As portas de entrada para o microrganismo são: pele e

tecidos moles, ossos e articulações, tratos urinário, respiratório e gastrointestinal. A integridade e

funcionalidade da mucosa e da pele representam a primeira linha de defesa do hospedeiro.

Alterações nessas barreiras permitem o escape do patógeno, ocasionando doença invasiva.

Manifestações clínicas em adultos não grávidos incluem infecções do trato urinário (ITU), da

pele e tecidos moles, de ossos e articulações, bacteremia primária, pneumonia, urosepse,

peritonite, meningite, endocardite, além de miosite e síndrome do choque tóxico (HO et al, 2006;

SENDI, JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008).

Apesar de estarem associados às doenças em adultos, os EGBs são tradicionalmente

considerados um patógeno de neonatos. Existem duas formas distintas de síndromes clínicas

ocasionadas por EGBs em neonatos, que incluem a síndrome precoce, onde a infecção ocorre nos

primeiros dias de vida, e a síndrome de ocorrência tardia, cuja infecção ocorre em crianças com

uma semana de vida até três meses de idade (DORAN & NIZET, 2004; BEITUNE, DUARTE &

MAFFEI, 2005).

Na síndrome precoce, o neonato pode infectar-se ainda na vida intrauterina, devido à

aspiração do líquido amniótico contaminado ou no momento do parto, por transmissão vertical

quando o paciente entra em contato com o trato genital materno colonizado por EGB. O primeiro

sintoma é, em sua maioria, a dificuldade respiratória nas primeiras 24 horas de vida. Outros

sintomas incluem: cianose e apnéia, pneumonia por aspiração, celulite, osteomielite, artrite

séptica, choque, septicemia e meningite (DORAN & NIZET, 2004; POGERE et al, 2005).

Na síndrome tardia, a contaminação pode ocorrer durante a passagem do neonato pelo

canal vaginal, por ingestão de leite materno, pelo contato íntimo com a mãe nos primeiros dias de

vida ou ainda por transmissão horizontal, por meio de fontes nosocomiais. Inicialmente, a criança

desenvolve febre, letargia, irritabilidade, dificuldade de se alimentar e taquipnéia, e comumente

5

evolui para meningite, podendo desenvolver seqüelas neurológicas permanentes, como paralisia

cerebral, retardo mental e surdez (DORAN & NIZET, 2004; POGERE et al, 2005).

Em gestantes, S. agalactiae está associado a doenças que variam desde infecção urinária

branda até quadros invasivos graves. A doença invasiva em gestantes e em mulheres após o parto

é identificada quando S. agalactiae é isolado de sítios estéreis, como sangue e líquido

cefalorraquidiano. A maior parte das infecções invasivas são sanguíneas, mas quadros de

osteomielite, endocardite e meningite já foram descritos (SCHUCHAT, 1998).

As síndromes não invasivas associadas ao S. agalactiae durante a gravidez e o período

após o parto incluem, em adição à infecção no trato urinário, geralmente bacteriúria

assintomática, quadros de infecções intra-amnióticas (corioamnionite), endometrites, infecções de

feridas cirúrgicas (pós-cesariana e outros), celulite e fascite. Os EGBs são isolados do trato

genital de cerca de 25% das mulheres. Sendo assim, estes microrganismos podem disseminar-se

para sítios adjacentes e então isolados a partir de outros espécimes, como as superfícies

placentárias, mesmo sem estarem associados à etiologia de algumas patologias (SCHUCHAT,

1998; BEITUNE, DUARTE & MAFFEI, 2005).

De acordo com recomendações do CDC - Centers for Disease Control and Prevention - e

do ACOG - American College of Obstetricians and Gynecologists - vários países vêm adotando

medidas profiláticas para a prevenção da infecção neonatal por EGB em gestantes que

apresentam fatores de risco para o desenvolvimento da doença neonatal ou que tenham sido

submetidas à pesquisa de EGB durante as 35a - 37

a semanas de gestação, com isolamento do

microrganismo. A medida mais eficaz consiste na administração, durante o trabalho de parto, de

penicilina, ou outros agentes, como cefazolina, clindamicina, eritromicina ou vancomicina, de

acordo com a sensibilidade da parturiente à penicilina G e com o perfil de susceptibilidade a

antimicrobianos das amostras de EGB isoladas nestas mulheres (SCHRAG et al, 2002; APGAR

et al, 2005). Tais medidas têm contribuído para uma redução significativa da ocorrência destas

infecções nos diferentes locais aonde foram implantadas (ISAACS & ROYLE, 1999; SCHRAG

et al, 2000).

As informações coletadas para estudos epidemiológicos sobre as infecções por EGBs

incluem idade, gênero, possível sítio de infecção, existência de condições debilitantes e

microrganismos isolados no caso de culturas polimicrobianas (KARUNAKARAN et al, 2009).

Em um estudo realizado nos EUA que abrangeu 10 estados, no período de 1990 a 2007,

6

observou-se 19.512 casos de doença invasiva por esta espécie em adultos não-grávidos, com

aumento significativo da incidência ao longo dos anos. Em 1990, a incidência foi de 3,6

casos/100.000 habitantes, enquanto que em 2007, a incidência foi de 7,3 casos/100.000 habitantes

(SKOFF et al, 2009). Neste mesmo estudo, os autores observaram, como principais fatores

associados, idade avançada e ocorrência de diabetes.

A evolução de casos de doença invasiva e bacteremia entre pacientes idosos pode estar

associada ao aumento de condições clínicas crônicas. Cerca de 17-30% dos casos de infecção por

EGBs ocorrem num período superior a 48 horas após internação hospitalar, provavelmente

devido a exposição a técnicas de instrumentação. O risco de morte do paciente por infecção

invasiva aumenta proporcionalmente ao avanço de sua idade. Para indivíduos acima de 84 anos,

os casos excedem a 30 por 100.000 admissões. Porém, quando comparado a infecções associadas

a Streptococcus pneumoniae, a incidência é menor (25,4 e 42,2 casos/ 100.000 admissões,

respectivamente) (EDWARDS & BAKER, 2005; HO et al, 2006; SENDI, JOHANSSON &

NORRBY-TEGLUND, 2008).

As ITU são caracterizadas pelo desenvolvimento de microrganismos nas vias urinárias,

que percorrem o trajeto da uretra até a bexiga (cistite) (VALLADA, 1995; HARRISON, 2002). A

pielonefrite bacteriana precedida freqüentemente por infecção da bexiga, deve-se à ascensão dos

microrganismos para os rins e seus sistemas coletores (LENZ, 1994; ROBBINS et al, 1996;

HARRISON, 2002). É de conhecimento que o S. agalactiae causa cistite e pielonefrite em

gestantes, bem como em homens, mulheres não grávidas e crianças. A pielonefrite e abscesso

renal são ainda possíveis complicações da disseminação hematogênica do S. agalactiae,

caracterizando a urosepse (KONEMAN et al, 2001).

Diversos estudos têm reconhecido os EGBs como causa de ITU em adultos (PERSSON et

al, 1988; MUÑOZ et al, 1992). EGB é a segunda causa mais comum de infecção urinária entre

membros da família Streptococacceae em adultos não grávidos, depois dos enterococos

(GIRGITZOVA, MINKOV & ZOZIKOV, 1991). Estes autores correlacionaram o isolamento de

EGB em amostras de urina com a sintomatologia apresentada pelo paciente. Foram analisados 54

pacientes sintomáticos (com sinais clínicos de infecção urinária de causa bacteriana

desconhecida, incluindo disúria, febre, dores em baixo ventre, leucocitúria e leucocitose).

Diabéticos, mulheres com vaginite crônica e homens com uretrites não responsivas, além de

pacientes imunossuprimidos também foram incluídos na pesquisa. O EGB foi isolado em 32

7

amostras (59,2%), sete oriundas de homens e 25 de mulheres acima de 14 anos. Destes, 15,6%

eram diabéticos, 31,2% tinham ITU pós operatória e 53,2% tinham ITU primária, sendo que

destes 64,7% apresentavam cistites. Infecções urinárias recorrentes foram observadas em 28,1%

do total dos isolados. Além disso, houve isolamento de EGBs em quatro amostras uretrais e 11

amostras vaginais. EGB foi ainda isolado nas fezes de 90,9% das pacientes que apresentavam

colonização vaginal.

Os EGBs são comumente isolados em amostras urinárias comunitárias de idosos,

associados, em ambos os sexos, a doenças de base, como diabetes, cirrose hepática e

insuficiência renal crônica, além de anomalias no trato urinário que incluem cálculos e hipertrofia

prostática (HERNÁIZ et al, 2004; EDWARDS & BAKER, 2005). Hernáiz e colaboradores

(2004) relatam que a cistite não complicada é o diagnóstico mais encontrado nos casos de ITU

por EGB em adultos não grávidos, seguida da bacteriúria assintomática .

Em um estudo populacional conduzido por Ulett e colaboradores (2009), observou-se

1,1% (387/34.367) de urinoculturas positivas para EGBs. Deste total, 89,4% foram obtidas por

micção espontânea e 10,6% foram oriundas de pacientes cateterizados. A maioria das culturas

positivas foi obtida de mulheres (83,2%). Quanto à origem, foram obtidas de pacientes da

comunidade (52,4%), seguido por mulheres em cuidados obstétricos (21,0%), hospitalizados

(18,8%) e pacientes em emergências (7,8%). O diagnóstico de ITU por EGB foi definido a partir

dos achados de bacteriúria (>107

UFC/L) associada ao isolamento do microrganismo em cultura

pura, além de pelo menos um sintoma clínico de ITU. O isolamento de EGB em cultura pura

ocorreu em 207 amostras de urina e destas, 62 apresentavam contagem compatível com

bacteriúria. Associando-se os achados microbiológicos e clínicos, foi possível observar que 50 e

12 pacientes apresentavam quadros de cistite e pielonefrite, respectivamente. Nenhum dos 62

pacientes estava em uso de cateter urinário e um paciente apresentou concomitantemente EGB no

sangue, indicando a ocorrência de urosepse.

1.4 Antibioticoterapia e resistência a antimicrobianos

No que tange ao tratamento das infecções causadas por estreptococos β-hemolíticos, a

droga de escolha é a penicilina, devido à contínua susceptibilidade destes microrganismos ao

antimicrobiano (CULEBRAS et al, 2002; DOGAN et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005; SENDI,

JOHANSSON & NORRBY-TEGLUND, 2008; PINHEIRO et al, 2009). O mecanismo de ação

8

deste β-lactâmico consiste na ligação covalente do antimicrobiano a proteínas, estas denominadas

de proteínas fixadoras de penicilinas (PBP, do inglês, Penicillin Binding Protein), ancoradas na

membrana citoplasmática. Essas proteínas participam ativamente da síntese da peptidioglicana,

atuando como transglicosidases, transpeptidases e carboxipeptidases, durante a formação da

parede celular. Quando a penicilina se liga às PBPs, bloqueiam a formação da parede celular e

estimulam a produção bacteriana de autolisinas, promovendo assim a lise da célula bacteriana

(SILVA, 1999; CHAMBERS, 2000). Os β-lactâmicos são antimicrobianos que apresentam baixa

toxicidade e baixo custo. Podem causar, entre outros efeitos adversos, granulopenia e diarréias.

Contudo, o efeito colateral mais grave associado aos β-lactâmicos é a alergia. Este efeito deve-se

aos produtos de degradação do antimicrobiano (como o ácido penicilóico) que ao se combinarem

com as proteínas do paciente, sensibilizam o sistema imune (SILVA, 1999).

Na profilaxia intra-parto, recomenda-se alternativamente cefalosporinas para pacientes

alérgicas e com baixo risco de reações anafiláticas (CDC, 2002; CHOHAN et al, 2006; CLSI,

2009). Pacientes com alto risco de reação anafilática devem ser tratadas com macrolídeos, como

a eritromicina e lincosamídeos, como a clindamicina (DE MOUY et al, 2001; CHOHAN et al,

2006; PINHEIRO et al, 2009). Devido à emergência da resistência a estes dois últimos

antimicrobianos, observada em diversos estudos, não é recomendada, em pacientes alérgicos e

com risco de anafilaxia, a utilização destes antimicrobianos sem a prévia realização do teste de

susceptibilidade (CDC, 2002; HEELAN, HASENBEIN & MCADAM, 2004; MARTÍNEZ et al,

2004; BORGER et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005; GHERARDI et al, 2007). Na ocorrência de

resistência a estes antimicrobianos, recomenda-se a vancomicina (CDC, 2002; CHOHAN et al,

2006; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

As cefalosporinas também são representantes da classe de antimicrobianos β-lactâmicos,

apresentando similaridades à penicilina em relação à estrutura e modo de ação, porém possuem

maior espectro antibacteriano, são resistentes a muitas β-lactamases (enzimas que hidrolisam o

anel β-lactâmico) e possuem melhores propriedades farmacológicas. Estes antimicrobianos são

derivados do ácido 7-aminocefalosporânico (fusão do anel β-lactâmico com o anel diidrotiazina

de seis átomos de carbono, ao invés do anel de tiazolina de cinco átomos de carbono,

característico das penicilinas). São classificadas em quatro grupos e/ou gerações de acordo com o

espectro de ação (SILVA, 1999; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006). Não há relatos

9

de resistência à cefalosporinas entre os EGBs (MOTLOVÁ et al, 2004; MARTÍNEZ et al, 2004;

BORGER et al, 2005).

A vancomicina é um glicopeptídeo que interrompe a síntese do peptideoglicano da parede

celular bacteriana. Este antimicrobiano interage com o dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala das

cadeias laterais dos pentapeptídeos, interferindo estericamente na formação das ligações cruzadas

entre as cadeias de peptideoglicano (SILVA, 1999; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER,

2006). Apesar da resistência intrínseca ou adquirida à vancomicina, observada entre enterococos

e outros gêneros da família Streptococacceae, esta nunca foi relatada em EGBs, e assim mantêm-

se efetiva para tratamento de infecções causadas por estes microrganismos (UTTLEY et al, 1989;

HEELAN, HASENBEIN & MCADAM, 2004; BORGER et al, 2005; GONZALEZ et al, 2005;

KARUNAKARAN et al, 2009).

A eritromicina é um antimicrobiano pertencente à classe dos macrolídeos. É constituída

por um anel macrocíclico de lactona, contendo 14 átomos de carbono, ligado a duas porções de

açúcar (cladinose e desosamina). Nesta classe encontram-se outros representantes que diferem no

número de átomos de carbonos no anel lactona (15 ou 16), como a azitromicina, josamicina, entre

outros (STEIGBIGEL, 1991; MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

A lincomicina e seu derivado mais potente, a clindamicina, pertencem à outra classe de

antibiótico, os lincosamídeos, os quais possuem propriedades semelhantes quanto aos

mecanismos de ação, atividade antimicrobiana e farmacologia clínica (STEIGBIGEL, 1991;

MURRAY, ROSENTHAL & PFALLER, 2006).

Tanto os macrolídeos quanto os lincosamídeos atuam sobre a subunidade 50S, impedindo

a síntese protéica. O primeiro se liga ao ribossomo impedindo sua translocação, logo não

permitindo que o RNAt descarregado abandone o sítio peptil (P), enquanto o segundo, inibe a

peptidiltranferase bacteriana e assim impedindo a união dos aminoácidos (SILVA, 1999;


A resistência aos macrolídeos e lincosamídeos entre EGB tem sido relatada por diversos

autores e tem, como principal conseqüência, a não utilização destas drogas, consideradas as

principais alternativas de tratamento para pacientes sensíveis à penicilina. Os principais

mecanismos de resistência aos macrolídeos pelos EGBs são mediados por dois determinantes

genéticos:

10

erm (erythromycin ribosome methylation) – envolvendo principalmente os genes ermA e

ermB. O gene ermB está presente no cromossomo dos EGBs dentro de um transposon.

Codifica uma metiltransferase, que na presença de eritromicina, induz uma modificação

ribossômica, ao adicionar dois radicais metil a um sítio no RNAr 23S próximo a região

ligante aos macrolídeos, assim alterando a conformação e reduzindo a afinidade aos

macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B (MLSB). A resistência pode ser induzida

(MLSBi) ou constitutiva (MLSBc). A resistência tanto à clindamicina quanto à

eritromicina caracteriza o fenótipo MLSBc, indicando produção contínua da enzima

metilase. A resistência à eritromicina e a diminuição da susceptibilidade à clindamicina,

com achatamento do halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do disco de

clindamicina na região próxima ao disco de eritromicina, é caracterizada pelo fenótipo

MLSBi, devido à produção de metilase apenas na presença de eritromicina (SUTCLIFFE,

TAIT-KAMRADT & WONDROCK, 1996).

mef (macrolide efflux) – Possui como principais variantes mefE e mefA, as quais foram

originalmente descritos em S. pneumoniae e Streptococcus pyogenes, respectivamente.

Estudos posteriores mostraram que devido à alta homologia, estes podem ser

considerados um único gene, mefA/E. Codifica uma proteína hidrofóbica ligada à

membrana, que promove uma bomba de efluxo, que retira a droga ativamente do

microrganismo. Este mecanismo caracteriza o fenótipo M, que confere resistência a

macrolídeos de 14 ou 15 átomos de carbono, mas não aos macrolídeos de 16 átomos de

carbono, aos lincosamídeos e às estreptograminas (SUTCLIFFE, TAIT-KAMRADT &

WONDROCK, 1996).

Além da resistência aos macrolídeos e liconsamídeos, o EGB desenvolveu resistência a

outras classes de antimicrobianos, tais como as tetraciclinas e fluoroquinolonas. A resistência à

tetraciclina é bastante disseminada em diversas espécies bacterianas e seus determinantes

genéticos são freqüentemente encontrados em elementos móveis como plasmídeos ou

transposons, muitas vezes associados aos determinantes de resistência aos macrolídeos

(CHOPRA & ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002). A tetraciclina age por formar um

complexo com os íons de magnésio (Mg2+

), que no interior celular, se une a radicais fosfato da

subunidade 30S dos ribossomos, diminuem a afinidade do aminoacil-RNAt no sitio A do

ribossomo e assim impedindo o alongamento da cadeia péptica em formação (SILVA, 1999;

11

CHOPRA & ROBERTS, 2001). Os mecanismos de resistência à tetraciclina são o efluxo da

droga mediado pela expressão de bombas de efluxo que se localizam na membrana e a

modificação do sítio alvo devido à proteção enzimática do ribossomo. São descritos diversos

determinantes genéticos de resistência à tetraciclina, conhecidos como genes tet. Os principais,

entre EGB, são os genes tetK e tetL, que codificam proteínas que participam da bomba de efluxo

e tetM e tetO, que codificam proteínas que conferem proteção ribossomal a este antimicrobiano

(CHOPRA & ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002).

As fluoroquinolonas são agentes quimioterápicos sintéticos derivados do ácido nalidíxico. O

mecanismo de ação consiste na inibição da DNA girase e da topoisomerase IV bacterianas,

enzimas necessárias para a duplicação, recombinação e reparo do DNA. A DNA girase é formada

por duas subunidades α e duas subunidades β, com as quinolonas se ligando à subunidades α. O

principal mecanismo de resistência a estes antimicrobianos ocorre devido a mutações pontuais

nos genes gyrA e parC, em suas regiões internas denominadas regiões determinantes de

resistência à quinolonas (QRDR, do inglês, quinolone resistance-determining region). Outro

mecanismo observado é a diminuição da captação do fármaco. A diminuição da captação decorre

de alterações das proteínas porinas existentes na superfície bacteriana (PIDDOCK, 1999;


Dados mundiais sobre o perfil de susceptibilidade a antimicrobianos indicam que o EGB é

sensível a drogas, como -lactâmicos e vancomicina, enquanto que resistência a macrolídeos,

lincosamídeos, tetraciclina e fluoroquinolonas vem ocorrendo em diferentes regiões geográficas.

Gonzalez e colaboradores (2005), na Espanha, observaram 12,4% e 11,8% de resistência à

eritromicina e à clindamicina, respectivamente. Motlová e colaboradores (2004), na República

Tcheca, observaram taxa de resistência à eritromicina e à clindamicina de aproximadamente

3,0%, enquanto Chohan e colaboradores (2006), nos EUA, observaram 10,0% de resistência a

ambos antimicrobianos. Em um estudo realizado na Grécia, onde analisou-se amostras de EGB

isoladas de diferentes infecções em adultos não grávidos, observou-se susceptibilidade à

penicilina, cefotaxima e vancomicina, enquanto que 44,0% e 14,2% apresentaram-se como não

susceptíveis à eritromicina e à clindamicina, respectivamente (FALAGAS et al, 2006). Nos EUA,

o estudo realizado por Ulett e colaboradores (2009) em amostras urinárias de pacientes adultos

demonstrou resistência de 39,5% à eritromicina e 26,4% à clindamicina. Já Karunakaran e

12

colaboradores (2009) na Malásia, analisando amostras oriundas de pacientes adultos de vários

sítios de infecção, encontraram 2,3% de resistência à eritromicina e 2,4% à clindamicina.

De fevereiro a dezembro de 2002, no Japão, Kawamura e colaboradores (2003) isolaram três

amostras de EGB resistentes a levofloxacina, um de neonato e dois idosos com condições

debilitantes. Na Espanha, Miró e colaboradores (2006), observaram 1,2% de resistência à

levofloxacina entre 172 amostras provenientes de diferentes sítios anatômicos, oriundas de

homens de idade avançada portadores de sonda urinária. A mesma incidência de resistência foi

observada por Wu e colaboradores (2008), em Taiwan, no qual em um total de 1.994 amostras

clínicas de EGBs coletadas entre 1993 a 2006, foram isoladas 26 amostras (1,3%) resistentes à

levofloxacina. Neste estudo, observou-se que após o surgimento da primeira amostra resistente à

fluoroquinolona, isolada em 2004, a incidência anual aumentou gradativamente, de 0,3% em

2004 para 3,8% em 2005 e 5,0% em 2006.

A resistência à tetraciclina é extremamente disseminada na espécie, com relatos de estudos

realizados em diferentes regiões, nos quais a incidência excede 80,0%. Betriu e colaboradores

(2004), na Espanha, encontraram taxa de resistência a este antimicrobiano de 89,8%. Heelan e

colaboradores (2004), nos EUA, observaram susceptibilidade em apenas 15,0% das amostras

estudadas. Savoia e colaboradores (2008), na Itália, relataram 78,1% de resistência a este

antimicrobiano.

Dados referentes a estudos realizados no Brasil são condizentes com os da literatura

internacional, demonstrando, em conjunto, a sensibilidade à penicilina, a alta resistência à

tetraciclina e a resistência variável à eritromicina e clindamicina. D'Oliveira e colaboradores em

2003(a), relataram 87,0% de resistência à tetraciclina, 5,4% à eritromicina e 1,1% à clindamicina

entre 92 amostras isoladas de pacientes residentes do Rio de Janeiro, sem distinção de

manifestação clínica, gênero, idade e ocorrência de gravidez. Na mesma região, Duarte e

colaboradores em 2005(a) observaram que em um total de 151 amostras isoladas de diferentes

sítios anatômicos humanos, todas foram resistentes à tetraciclina, bem como 4,6% destas também

foram resistentes à eritromicina. Em outro estudo realizado no Rio de Janeiro, Borger e

colaboradores (2005), analisaram amostras isoladas de gestantes no período de 2003 a 2004 e

relataram susceptibilidade à cefotaxima, cloranfenicol, meropenem, ofloxacina, penicilina e

vancomicina, além das taxas de resistência de 9,4% à eritromicina e de 6,2% à clindamicina.

13

Devido à freqüência relevante de infecções por EGB e a ocorrência de resistência a

antimicrobianos utilizados no tratamento destas infecções se faz necessário o contínuo

monitoramento do perfil de resistência destes microrganismos em diferentes regiões geográficas,

visando à obtenção de dados que contribuam para uma melhor definição de estratégias de

controle e prevenção de infecções. Dados brasileiros são relativamente limitados e

desatualizados. Desta forma, este estudo tem como objetivo determinar o perfil de resistência dos

EGBs aos antimicrobianos visando às seguintes estratégias.

14

2. OBJETIVOS

2.1) Objetivo Geral

Avaliar, entre amostras de S. agalactiae isoladas de espécimes do trato genitourinário de

indivíduos não grávidos, o perfil de resistência aos antimicrobianos recomendados para

tratamento das infecções causadas por esta espécie, bem como estudar características genéticas

entre amostras que apresentaram resistência ao antimicrobiano eritromicina.

2.2) Objetivos Específicos

2.2.1) Avaliar a performance dos testes fisiológicos tradicionalmente utilizados na identificação da

espécie;

2.2.2) Determinar o perfil de resistência de amostras de S. agalactiae frente aos antimicrobianos

através do método de difusão em agar;

2.2.2) Determinar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de eritromicina e de levofloxacina

entre amostras que se apresentaram resistentes ou intermediárias a estes antimicrobianos, pelo

método de diluição em agar e pelo E-test, respectivamente;

2.2.3) Investigar a presença de determinantes genéticos de resistência aos macrolídeos através de

PCR;

2.2.4) Avaliar a diversidade genética entre amostras resistentes e sensíveis à eritromicina

utilizando-se a metodologia de amplificação randômica do DNA (RAPD-PCR).

15

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1) Amostras bacterianas

Foram estudadas 100 amostras de S. agalactiae isoladas de espécimes do trato

genitourinário, provenientes de uma rede de laboratórios clínicos que atende a região

metropolitana do Rio de Janeiro, no período de fevereiro de 2008 a outubro de 2009. As amostras

são provenientes de indivíduos não grávidos, sendo 73 do sexo feminino e 27 do sexo masculino,

com faixa etária variando de 6 a 79 anos. O isolamento bacteriano foi realizado a partir dos

seguintes espécimes: secreção vaginal (49), urina (30), esperma (17), secreções da cérvice (2),

secreção uretral (1) e secreção de prepúcio (1). Tais amostras pertencem à coleção de cultura do

Laboratório de Cocos Gram-positivos do Depto Microbiologia e Parasitologia, CMB, UFF, e

foram estocadas em leite desnatado a 10% (Nestlé, São Paulo, SP) adicionado de glicerol a 10%

(Reagen, Rio de Janeiro, RJ) a – 20ºC. Este estudo faz parte de um projeto submetido ao CEP

desta Universidade, sob número do protocolo CAAE 0172.0.258.000-08.

3.2) Caracterização fisiológica

3.2.1) Observação das características morfológicas e hemólise

Para observação da morfologia colonial e das propriedades hemolíticas, as amostras foram

cultivadas, a partir do estoque congelado, em Agar Trypticase Soy (Difco - BD, Sparks, MD,

EUA) suplementado com 5% de sangue desfibrinado de carneiro (TSA-S) e incubadas a 35ºC ±

2ºC por 18-24h.

3.2.2) Observação do fator CAMP

O teste de observação do fator CAMP foi realizado semeando-se uma amostra de

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) produtora de β-lisina em TSA-S (Difco) e em seguida,

fez-se estrias perpendiculares próximas a esta com as amostras suspeitas de serem S. agalactiae.

Após incubação a 35ºC ± 2ºC por 18-24h, foi observada reação positiva se houvesse formação de

hemólise em forma de seta na região aonde os dois microrganismos se encontram próximos. A

amostra Streptococcus agalactiae ATCC 13813 foi utilizada como controle positivo.

16

3.2.3) Teste de Hidrólise do Hipurato

As amostras foram semeadas em TSA-S (Difco) a 35ºC ± 2ºC por 18-24h. Após este

período, 2 a 3 colônias foram semeadas em caldo com hipurato de sódio (Inlab, São Paulo, SP,

Brasil) e incubadas durante esse mesmo intervalo e temperatura. O caldo obtido foi centrifugado

a 1500 rotações por minutos (rpm) durante 10 minutos (min). Uma alíquota de 800 µL do

sobrenadante foi transferido para outro tubo e depois adicionado 200µL de solução de cloreto

férrico 12,0% (Vetec, Duque de Caxias, RJ). Os tubos foram homogeneizados e as reações

positivas se caracterizaram pela formação de precipitado (FACKLAM & WILKINSON, 1981).

Foram utilizadas como controle negativo e positivo, as amostras de Streptococcus pyogenes

ATCC 19615 e Streptococcus agalactiae ATCC 13813, respectivamente.

3.3) Caracterização sorológica

Para a determinação do sorogrupo foi utilizado o kit comercial para identificação dos

estreptococos (Streptococal Grouping Kit, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) de acordo com as

orientações do fabricante. Suspensões de 2 a 5 colônias de estreptococos β-hemolíticos foram

feitas em um tubo de ensaio contendo 0,4 mL da enzima extratora e incubadas a 35ºC ± 2ºC por

10 min. Em um cartão foi adicionada uma gota da suspensão bacteriana a ser identificada e sobre

esta, uma gota de antissoro específico para um dos grupos sorológicos (A, B, C, D, F e G) de

estreptococos. Após homogeneização, a amostra foi identificada como pertencente ao grupo

sorológico com o qual é observada uma reação de aglutinação. As amostras pertencentes ao

grupo B foram identificadas como S. agalactiae.

3.4) Teste de susceptibilidade a antimicrobianos

3.4.1) Método de difusão em agar

A detecção da susceptibilidade das amostras bacterianas frente aos antimicrobianos foi

realizada através do teste de difusão em agar seguindo as recomendações do Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) de 2009.

A partir de culturas recentes, foram feitas suspensões bacterianas em solução salina estéril

0,9% (Vetec), com turvação equivalente à escala 0,5 de MacFarland. As suspensões foram

semeadas com auxílio de um swab estéril sobre a superfície de agar Müeller Hinton (Difco)

17

acrescido de 5% de sangue desfibrinado de carneiro (MHA-S). Após a semeadura, foram

aplicados os discos de antimicrobianos, contudo, os discos de eritromicina e clindamicina foram

dispostos a uma distância de aproximadamente 15-20 mm entre eles, objetivando a observação

dos fenótipos de resistência (MLSBi, MLSBc e M). Os meios foram incubados em atmosfera de

5% de CO2, a 35ºC ± 2ºC por 20-24h.

Os antimicrobianos utilizados foram: ceftriaxona (30µg), clindamicina (2µg), eritromicina

(15µg), levofloxacina (5µg), penicilina G (10UI), tetraciclina (30µg) e vancomicina (30µg)

(Cecon, São Paulo, SP). As amostras que apresentaram resistência à eritromicina e à

levofloxacina foram ainda submetidas ao teste de susceptibilidade à azitromicina (15µg) e à

ciprofloxacina (5µg) (Cefar, São Paulo, SP) respectivamente.

O comportamento das amostras frente aos antimicrobianos foi analisado pela medição do

halo de inibição do crescimento bacteriano. A interpretação da leitura do teste de sensibilidade

aos antimicrobianos foi realizada segundo as normas do CLSI (2009). A amostra de

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 foi utilizada como controle.

3.4.2) Determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI)

A) Diluição em agar

A determinação da CMI de eritromicina foi realizada em todas as amostras de S.

agalactiae com resistência plena ou intermediária ao antimicrobiano, através do método de

diluição em ágar. O teste foi realizado de acordo com as recomendações do CLSI (2009).

Diluições seriadas de eritromicina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) foram adicionadas ao

MHA-S (Difco) durante o seu preparo, a fim de se obter meio de cultura com concentrações de

antimicrobiano que variaram entre 0,125 a 256 µg/mL. A partir de culturas recentes, os

microrganismos foram suspensos em solução salina 0,9% estéril (Vetec) até atingir uma turvação

semelhante a escala 0,5 de MacFarland. As suspensões foram diluídas em 1:10 na mesma solução

e 1µL destas foi depositado em um local de cada placa contendo MHA-S (Difco) e sua respectiva

concentração de antimicrobiano, resultando num inóculo bacteriano final de 104 UFC.

Após incubação por 24 horas a 35ºC ± 2ºC em atmosfera de 5% de CO2, a CMI foi

definida como menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano. Como controle, foi

utilizada a amostra de Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

18

B) Teste Epsilométrico (E test )

Uma amostra com resistência à levofloxacina foi submetida à determinação da CMI para

este antibiótico utilizando o sistema E test (AB Biodisk, Solna, Suécia). Este método consiste

em uma estreita fita, contendo um gradiente de concentração do antimicrobiano, variando de

0,002 a 32μg/mL o qual foi aplicado na superfície do MHA-S (Difco) previamente semeada com

a amostra em questão. Após incubação por 24 horas a 35ºC ± 2ºC em atmosfera de 5% de CO2, a

CMI foi definida como a concentração no qual se inicia a formação da elipse de inibição do

crescimento bacteriano (MENDES et al, 1993; SILVA, 1999).

3.6) Ensaios envolvendo realização da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

3.5.1) Obtenção de DNA

A preparação do DNA genômico foi baseada nas recomendações de Beall e colaboradores

(1996), com modificações. Os microrganismos foram suspensos em 300µL de solução salina

estéril 0,9% (Vetec) até atingir uma turvação semelhante a 3,0 da escala MacFarland. As

suspensões foram centrifugadas a 5000 rpm por 5 min e o sedimento ressuspenso em 200µL de

tampão TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM) pH 8 (Amresco, Solon, OH, EUA) acrescido de 5µL

de solução de mutanolisina 2000U/mL (Sigma). As suspensões foram incubadas a 35ºC por 30

min e em seguida, a 100ºC por 5 min. Depois, centrifugadas a 3000 rpm por 30 segundos e

mantidas a – 20oC. O sobrenadante foi utilizado como molde de DNA nas reações de

amplificação.

3.5.2) Detecção de determinantes genéticos de resistência a macrolídeos

O DNA bacteriano foi utilizado como molde em reações de amplificação conforme os

protocolos específicos (PÉREZ-TRALERO et al, 2007). Todos os reagentes envolvidos nas

reações de PCR (específicos e randômico) foram provenientes do mesmo fabricante (Fermentas,

Burlington, ON, Canadá), exceto os iniciadores (Imprint do Brasil, Campinas, SP). A

amplificação do DNA ocorreu em termociclador Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, Foster

City, CA, EUA), com os parâmetros descritos nas Tabelas 1, 2 e 3. Os produtos de amplificação

foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2% (Fermentas), em tampão TBE 0,5X

(TBE 10X, Tris base 1M, Ácido bórico 1M e EDTA 0,01M) pH 8,4 (Amresco), utilizando-se um

19

marcador molecular de 100 pb (Fermentas), com voltagem de aproximadamente 100V. Os

fragmentos correspondentes a estes produtos foram visualizados após coloração do gel com

solução de brometo de etídio, sob luz UV.

Tabela 1. Seqüência dos iniciadores para amplificação dos genes ermA, ermB e mefA/E.

Iniciador Seqüência Tamanho do

produto (pb)

ermB forward (f) ATTGGAACAGGTAAAGGGC 442

ermB reverse (r) GAACATCTGTGGTATGGCG

ermA forward(f) AACTTGTGGAAATGAGTCAACGG 375

ermA reverse (r) CAGAATCTACATTAGGCTTAGGG

mefA/E forward(f) AGTATCATTAATCACTAGTGC 345

mefA/E reverse (r) TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG

Tabela 2. Reagentes utilizados na reação de amplificação dos genes de resistência ermA, ermB e

mefA/E.

Reagentes

Concentração da Reação

Volume de

1 reação

MgCl2 2,0 mM 2,4 µL

Tampão 1x 3,0 µL

dNTP 0,2 mM 3,0 µL

Iniciadores (f) e (r) 1,0 µM 3,0 µL (x2)

Taq DNA Polimerase 1,0 U 0,2 µL

H2O – 12,4 µL

DNA 3,0 µL 3,0 µL

Volume Total da Reação 30µL

20

Tabela 3. Parâmetros de amplificação para PCR.

Temperatura (ºC) Tempo (minutos) Ciclos

94 3

94 1

52/50* 1 35

72 1

72 5

* Temperatura de anelamento (Ta) para ermA e ermB: 52

oC, e para mefA/E: 50

oC.

3.5.3) Análise do polimorfismo do DNA através de PCR com amplificação randômica do DNA

(RAPD-PCR)

A diversidade genética das amostras que apresentaram resistência a eritromicina (15) e

amostras susceptíveis representativas (10), selecionadas a fim de contemplar todos os espécimes

e período estudado, foi avaliada pela reação de amplificação utilizando-se o iniciador 1254 (CCG

CAG CCA A), descrito por Pacheco e colaboradores (1997), que reconhecem alvos no DNA

genômico randomicamente. A amplificação do DNA ocorreu em termociclador Gene Amp 9700

(Applied Biosystems), com os parâmetros descritos nas Tabelas 4 e 5. Os produtos de

amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,2% (Fermentas), em tampão

TBE 0,5X (Amresco) utilizando-se um marcador molecular de 100 pb (Fermentas), com

voltagem de aproximadamente 100V. Os fragmentos correspondentes a estes produtos foram

visualizados após coloração com solução de brometo de etídio, sob luz UV.

21

Tabela 4. Reagentes utilizados no RAPD-PCR

Reagentes

Concentração da Reação

Volume de

1 reação

MgCl2 2,0 mM 1,2 µL

Tampão 1x 3,0 µL

dNTP 0,2 mM 3,0 µL

Iniciador 1,0 µM 3,0 µL

Taq DNA Polimerase 1,0 U 0,2 µL

H2O – 16,6 µL

DNA 3,0 µL 3,0 µL

Volume Total da Reação 30µL

Tabela 5. Parâmetros de amplificação para RAPD-PCR.

Temperatura (ºC) Tempo (minutos) Ciclos

94 3

94 1

37 1 35

72 1

72 5

3.5.4) Análise dos perfis eletroforéticos obtidos a partir de RAPD-PCR.

A análise comparativa dos perfis eletroforéticos de RAPD-PCR foi realizada utilizando-se

o programa Molecular Analyst Fingerprint Plus 1.12 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). A

similaridade entre os perfis foi estimada pelo coeficiente de Dice, e os agrupamentos gerados

pelo método de UPGMA, com índice de tolerância de 1,0%.

22

4. RESULTADOS

As 100 amostras selecionadas para o estudo foram submetidas às provas fisiológicas

presuntivas para identificação dos EGBs (fator CAMP e teste de hidrólise de hipurato). A

determinação sorológica do carboidrato de parede foi realizada quando um dos testes de

identificação presuntiva apresentou resultados inesperados. Todas as amostras apresentaram

reação positiva no teste de hidrólise de hipurato e em 98 amostras detectou-se o fator CAMP. O

carboidrato do grupo B de Lancefield foi detectado nas duas amostras CAMP negativas.

Os perfis de resistência aos antimicrobianos das 100 amostras são apresentados na Tabela

6. A ocorrência de resistência entre amostras isoladas em diferentes espécimes clínicos é

apresentada na Figura 1. Não foi detectada resistência à ceftriaxona, penicilina e vancomicina,

contudo foi observada resistência à levofloxacina em uma amostra oriunda de paciente do sexo

feminino de 66 anos, isolada em abril de 2008, com evidência de ITU (≥ 105 UFC/mL), esta

também resistente à ciprofloxacina pelo teste de difusão em ágar e com CMI para levofloxacina

superior a 32µg/mL, detectado através de E-test . A resistência plena e intermediária à tetraciclina

ocorreu em 83 e seis amostras, respectivamente. A resistência à eritromicina foi observada em 11

amostras, as quais apresentaram os fenótipos M (2), MLSB indutivo (4) e MLSB constitutivo (5),

este último conferindo também resistência à clindamicina. Ressalta-se ainda que quatro amostras

apresentaram resistência intermediária à eritromicina, com os fenótipos M (1) e MLSBi (3). Todas

as amostras que apresentaram resistência à eritromicina foram também resistentes à tetraciclina e à

azitromicina, através do método de difusão em agar. Informações a respeito da origem destas

amostras são listadas na Tabela 7.

As amostras que se apresentaram com resistência plena ou intermediária à eritromicina

pelo método de difusão em agar foram submetidas à determinação da CMI, através da metodologia

de diluição em agar, cujos valores variaram de 0,5 a >256 µg/mL (Tabela 8). Houve concordância

entre os resultados obtidos pelos dois métodos empregados, exceto em três amostras, pois

apresentaram resistência intermediária pelo método de difusão e se mostraram resistentes pelo

método de diluição em agar. Considerando-se os resultados de CMI, conclui-se que a resistência à

eritromicina foi de 14,0%. Observou-se uma correlação entre valores mais elevados de CMI e

ocorrência do fenótipo MLSBc.

Estas amostras foram ainda submetidas à detecção, através de PCR, dos genes ermA, ermB

e mefA/E, os quais estão associados à resistência do S. agalactiae a este antimicrobiano. Observou-

23

se que as três amostras com fenótipo M apresentaram o produto de amplificação compatível com o

esperado para o gene mefA/E. O gene ermA foi detectado isoladamente nas amostras com fenótipo

MLSBi (5) e MLSBc (4), enquanto o gene ermB foi encontrado somente em uma amostra, cujo

fenótipo foi MLSBi e apresentou simultaneamente dois genes de resistência (ermA e ermB).

Ressalta-se ainda, a presença simultânea de dois determinantes genéticos de resistência em uma

amostra de fenótipo MLSBi, os genes ermA e mefA/E. Uma amostra, cujo fenótipo foi MLSBc não

gerou nenhum produto de amplificação após as reações com os iniciadores utilizados. A

correlação entre CMI, fenótipos e genes de resistência detectados nestas amostras pode ser

observada na Tabela 8.

O polimorfismo do DNA obtido a partir de RAPD-PCR pode ser observado nas Figuras 2 e

4, as quais mostram os perfis representativos de amostras resistentes e sensíveis à eritromicina,

respectivamente. O dendrograma resultante da análise de amostras representativas resistentes à

eritromicina é apresentado na Figura 3. Observou-se dois agrupamentos (I e II), nos quais as

amostras pertencentes a cada um compartilham no mínimo 60,0% de similaridade. Outras

amostras analisadas em um ensaio de RAPD-PCR anterior também compartilharam similaridade

significativa com as incluídas nesta análise, alocando-se no grupo I (amostra 316) e no grupo II

(amostras 277 e 380). Informações a respeito destas amostras são apresentadas na Tabela 7. Três

amostras estudadas no mesmo ensaio foram excluídas da análise computadorizada devido ao

número escasso de bandas de amplificação de DNA. Amostras de dois subgrupos pertencentes ao

grupo II apresentaram o maior grau de similaridade entre si (aproximadamente 90,0%). As

amostras 242 e 208 foram oriundas de secreções genitais masculina e feminina, respectivamente,

de pacientes com faixa etária de 24 e 26 anos, isoladas em 06/2008 e 03/2008 e apresentavam em

comum, o mesmo fenótipo de resistência à eritromicina (MLSBc). As amostras 200 e 225 foram

oriundas de urina de pacientes do sexo feminino, com idade de 32 e 25 anos, isoladas em 03/2008

e 04/2008, respectivamente. Estas amostras não compartilharam fenótipos (M e MLSBi) ou

genótipos (mefA/E e ermA) de resistência a eritromicina.

Os perfis de RAPD-PCR de amostras sensíveis à eritromicina são apresentados na Figura

4. A Figura 5 traz o dendrograma gerado a partir da análise desta imagem. As amostras

distribuíram-se em quatro pares, cada qual com aproximadamente 90,0% de similaridade.

Observa-se o agrupamento de amostras oriundas de espécimes diferentes. Ressalta-se que as

amostras 221 e 222, com 94,0% de similaridade, foram coletadas no mesmo dia, de espécimes

24

(urina e secreção vaginal) de duas pacientes distintas. A amostra 221 apresentou resistência à

levofloxacina, enquanto a amostra 222 mostrou-se sensível a este antimicrobiano.

O dendrograma gerado a partir da análise conjunta dos perfis de RAPD-PCR obtidos revela

a distribuição da maioria das amostras em dois grupos de similaridade principais, os quais alocam

amostras resistentes e sensíveis à eritromicina concomitantemente (Figura 6).

25

Tabela 6. Total de amostras submetidas aos testes de sensibilidade a antimicrobianos, através do

método de difusão em agar.

Antimicrobianos

Sensível

(S)

Intermediário

(I)

Resistente

(R)

Total

(N)

Ceftriaxona

(CRO)

100

—

—

100

Clindamicina

(CLI)

95

—

5

100

Eritromicina*

(ERI)

85

4

11

100

Levofloxacina**

(LVX)

99

—

1

100

Penicilina

(PEN)

100

—

—

100

Tetraciclina

(TET)

11

6

83

100

Vancomicina

(VAN)

100

—

—

100

*Todas as amostras resistentes à eritromicina foram também resistentes à azitromicina.

** A amostra resistente à Levofloxacina foi também resistente à ciprofloxacina.

26

Tabela 7. Informações sobre as 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena ou

intermediária à eritromicina pelo teste de difusão em agar.

Amostra Data de coleta

(mês/ano)

Material Clínico Gênero Faixa etária

(anos)

190 03/2008 Secreção Vaginal Feminino 38


200 03/2008 Urina Feminino 32



210 03/2008 Urina Masculino 37



242 06/2008 Secreção Uretral Masculino 24

277 08/2008 Esperma Masculino 44


309

316

380

414

10/2008

02/2009

05/2009

08/2009

Urina

Urina

Secreção Vaginal

Esperma

Masculino

Feminino

Feminino

Masculino

24

27

63

25

27

Tabela 8. Distribuição das 15 amostras de S. agalactiae com resistência plena e intermediária à

eritromicina pelo método de difusão em agar, CMI pelo método de diluição em agar, fenótipos e

genes de resistência.

Amostra Difusão em agar

(I / R)

Diluição em agar

(CMI - µg/mL

/Interpretação dos

resultados)

Fenótipos Genes de

resistência

ermA ermB mefA/E

190 R >256 / R MLSBc - - -

196 I 0,5 / I MLSBi + - -

200 R 2 / R M - - +

206 R >256 / R MLSBc + - -

208 R >256 / R MLSBc + - -

210 R 2 / R MLSBi + - -

212 R 2 / R MLSBi + - -

225 R 2 / R MLSBi + - -

242 R >256 / R MLSBc + - -

277 I 2 / R M - - +

304 R 4 / R MLSBi + + -

309 R 16 / R MLSBc + - -

316 R 2 / R M - - +

380 I 2 / R MLSBi + - +

414 I 8 / R MLSBi + - -

MLSBi, fenótipo macrolídeos, lincosamideos e estreptogramina B indutivo; MLSBc, fenótipo macrolídeos,

lincosamideos e estreptogramina B constitutivo; M, fenótipo M; CMI, Concentração Mínima Inibitória; R,

Resistente; I, Intermediário; erm, erythromycin ribosome methylation; mef, macrolide efflux.

28

29

Figura 2. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae resistentes à

eritromicina, obtidos por RAPD-PCR.

MM, marcador molecular (pb); 1, 414; 2, 309; 3, 200; 4, 212; 5, 225; 6, 304;

7, 242; 8, 196; 9, 190; 10, 206; 11, 208; 12, 210.

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 MM

100

500

1000

30

Figura 3. Dendrograma obtido após análise computadorizada dos perfis eletroforéticos das

amostras de S. agalactiae resistentes à eritromicina.

414

210

309

242

208

212

200

225

304

I

II

31

Figura 4. Perfis eletroforéticos de amostras representativas de S. agalactiae sensíveis à

eritromicina, obtidos por RAPD-PCR.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PM

MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MM

100

500

1000

MM, marcador molecular (pb); 1, 221; 2, 222; 3, 286;

4, 305; 5, 306; 6, 310; 7, 335; 8, 342; 9, 383; 10, 410.

32


amostras de S. agalactiae sensíveis à eritromicina

306

342

383

410

221

222

286

310

33


amostras de S. agalactiae resistentes e sensíveis à eritromicina

S, sensível à eritromicina.

309 410 S 306 S 342 S 414 210

212 221 S 222 S 383 S 225 242 208 200 286 S

310 S 304

34

5. DISCUSSÃO Streptococcus agalactiae compartilha algumas características morfológicas e fisiológicas

com outras espécies do gênero. A identificação da espécie pode ser realizada a partir da utilização

de testes fisiológicos presuntivos (hidrólise do hipurato e fator CAMP), bem como do teste

sorológico, já que a detecção do carboidrato antigênico de Lancefield, é considerada o método

definitivo de identificação. Contudo, pelo menos duas metodologias devem ser utilizadas em

conjunto. O fator CAMP, proposto originalmente por Christie e colaboradores, em 1944, é um

teste comumente usado em laboratórios clínicos devido a sua simplicidade e baixo custo, além de

possuírem alta sensibilidade e especificidade (apud ZÁRATE et al, 2005). Porém, assim como

observado neste estudo, algumas amostras podem apresentar resultados negativos, como relatado

por ZÁRATE e colaboradores em 2005. Mesmo a sorologia não deve ser utilizada isoladamente

na identificação da espécie, uma vez que outras espécies de estreptococos beta-hemolíticos, como

Streptococcus porcinus, podem gerar reações positivas com o anticorpo do grupo B (DUARTE et

al, 2005b).

Um dos maiores problemas no tratamento das infecções bacterianas está na relação entre

as falhas no tratamento e o uso indiscriminado de antibióticos pelos pacientes, fatores estes que

favorecem a emergência da resistência aos antimicrobianos. No presente estudo, não houve

resistência aos antimicrobianos ceftriaxona, penicilina e vancomicina. Contudo, foi observada

resistência à tetraciclina, eritromicina, clindamicina e levofloxacina. Enquanto que a resistência

aos três primeiros antimicrobianos tem sido amplamente relatada em estudos realizados em

diferentes regiões geográficas, inclusive no Brasil (D’OLIVEIRA et al, 2003a; DUARTE et al,

2005a; BORGER et al, 2005; FALAGAS et al, 2006; MIRÓ et al, 2006; GHERARDI et al, 2007,

SAVOIA et al, 2008; WU et al, 2008; KARUNAKARAN et al, 2009; ULETT et al, 2009), em

relação às fluoroquinolonas, este parece ser o primeiro relato de resistência de EGB a estas

drogas no país. Em estudos realizados por Kawamura e colaboradores (2003), no Japão e por

Miró e colaboradores (2006), na Espanha, os EGBs apresentaram taxas de resistência à

levofloxacina semelhantes à encontrada neste estudo.

A resistência à tetraciclina é extremamente disseminada entre EGB, com relatos de

incidência superiores a 80% (BETRIU et al, 2004; SAVOIA et al, 2008). Neste estudo, a taxa de

resistência a este antimicrobiano foi 83%, muito semelhante à observada em estudos anteriores

conduzidos na mesma região (D’OLIVEIRA et al, 2003a; DUARTE et al, 2005a).

35

Neste estudo, foi observada resistência à eritromicina em 14,0% das amostras de EGB.

Este dado, quando comparado a estudos anteriores, realizados na mesma região, por D’Oliveira e

colaboradores (2003a) e por Duarte e colaboradores (2005a) que obtiveram 5,4% e 4,6% de

amostras resistentes a este antimicrobiano, respectivamente, revelando um aumento pontual no

isolamento de amostras resistentes. Tal fato aponta para a formulação de estratégias que

contemplem o monitoramento contínuo do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos, bem como

políticas de racionamento do uso de macrolídeos, uma vez que entre espécies relacionadas, a

ocorrência de resistência está diretamente relacionada ao consumo da droga (SEPPALA et al,

1997).

O teste de susceptibilidade à eritromicina, a partir do emprego das metodologias de difusão

e diluição em agar, revelou discrepância de interpretação de resultados em três amostras. Estas

discrepâncias relacionadas à metodologia utilizada foram observadas em outros estudos

envolvendo diferentes espécies de estreptococos beta-hemolíticos (D’OLIVEIRA et al, 2003a;

D’OLIVEIRA et al, 2003b). Tais resultados demonstram que, para fins terapêuticos, as amostras

de EGBs que apresentam resistência intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar,

devem ser consideradas resistentes à mesma, a fim de garantir o sucesso do tratamento.

Foi observada resistência à azitromicina entre todas as amostras resistentes à eritromicina.

Esta representante da classe dos azalídeos, cujos membros são derivados dos macrolídeos, foi

incluída neste estudo devido suas diferenças em relação à eritromicina, seu anel lactona é

constituído por 15 átomos de carbono e contém um átomo de nitrogênio enquanto que o anel

lactona da eritromicina é constituído por 14 átomos, não possuindo o átomo de nitrogênio. Estas

diferenças são responsáveis pelas melhores características farmacológicas da azitromicina, ou

seja, seu espectro de ação é mais amplo frente aos microorganismos, sua difusão tecidual é mais

rápida e mais elevada e, sua meia-vida biológica é mais prolongada do que a de outros

macrolídeos, porém seu espectro de ação é semelhante ao da eritromicina. Todas estas vantagens

têm contribuído para o amplo uso deste antimicrobiano em nosso meio (STEIGBIGEL, 1991;

SILVA, 1999; HARRISON, 2002).

Neste estudo foram observados os fenótipos de resistência a macrolídeos M (3), MLSBi (7)

e MLSBc (5). A distribuição destes três fenótipos de resistência à eritromicina, em amostras

oriundas de diferentes espécimes clínicos têm sido relatada em diversos estudos (BETRIU et al,

2004; DUARTE et al, 2005a; GHERARDI et al, 2007; PUOPOLO et al, 2007; PINHEIRO et al,

http://pt.wikipedia.org/wiki/Eritromicina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Lactona

http://pt.wikipedia.org/wiki/Nitrog%C3%AAnio

36

2009). Todas as amostras de EGBs, independente do mecanismo de resistência à eritromicina,

mostraram-se também resistentes à tetraciclina, como relatado por Duarte e colaboradores em

2005(a). Isso se deve ao fato de que os determinantes genéticos de resistência à tetraciclina são

freqüentemente encontrados em elementos móveis como transposons ou plasmídeos, os quais

estão associados aos determinantes genéticos de resistência aos macrolídeos (CHOPRA &

ROBERTS, 2001; CULEBRAS et al, 2002).

Comparando-se os valores de CMI, fenótipos e genótipos de resistência, foi possível

detectar neste estudo que todas as amostras com fenótipo M (3) apresentaram o gene mefA/E e

CMI 2µg/mL, resultados condizentes com os observados anteriormente (VARMAN et al, 2005;

GHERARDI et al, 2007; PINHEIRO et al, 2009). Das amostras com fenótipo MLSBi (7), cinco

apresentaram o gene ermA, uma apresentou simultaneamente ermA e ermB e uma apresentou

ermA e mefA/E. A CMI variou entre 0,5 a 8,0 µg/mL. A presença simultânea de dois

determinantes genéticos em uma mesma amostra já foi relatada por outros autores (CULEBRAS et

al, 2002; BETRIU et al, 2004; PEREZ-TRALLERO et al, 2007; PINHEIRO et al, 2009). Entre as

amostras com fenótipo MLSBc (5), quatro apresentaram somente o gene ermA, com CMI variando

entre 16 a > 256 µg/mL. Valores de CMI mais elevados entre amostras com fenótipo MLSBc

também foram observados por Varman e colaboradores (2005) e Pinheiro e colaboradores (2009).

Uma amostra cujo fenótipo foi MLSBc não apresentou nenhum produto de amplificação a partir

dos iniciadores utilizados. A ausência de amplificação com os genes ermA e ermB ou mefA/E entre

amostras que apresentavam o fenótipo MLSBc foi previamente relatada por outros autores

(BETRIU et al, 2004; PINHEIRO et al, 2009). Ainda que os genes pesquisados sejam os mais

freqüentemente encontrados entre amostras de EGB que apresentam resistência aos macrolídeos,

outros genes, tais como ermC e msrA podem estar envolvidos (PINHEIRO et al. 2009).

Estudos de diversidade genética e tipagem epidemiológica podem ser realizados com a

utilização de uma grande variedade de técnicas moleculares. Através de RAPD-PCR, diversos

autores (BERG, AKOPYANTS & KERSULYTE, 1994; LIMANSKY et al, 1998; PUOPOLO et

al; 2007) observaram diversidade entre os perfis de amplificação randômica do DNA, indicando a

ocorrência de eventos genéticos entre amostras de uma dada espécie. RAPD-PCR como

ferramenta de tipagem de S. agalactiae tem revelado-se como uma metodologia de maior poder

discriminatório quando comparada à sorotipagem capsular ou eletroforese de isoenzimas (MLEE)

e comparável à eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE), considerada a metodologia

37

padrão-ouro para análise de diversidade genética entre esta espécie (CHATELLIER et al, 1997;

MARTINEZ et al. 2000; ZHANG, KOTIW & DAGGARD, 2002).

Embora o RAPD-PCR tenha gerado perfis com poucas bandas, o que limitou o potencial

discriminatório da metodologia, foi possível observar a ocorrência de diferentes perfis entre

amostras que apresentaram o mesmo comportamento frente ao antimicrobiano, assim como foi

possível detectar amostras resistentes e sensíveis com perfis genéticos similares. Empregando-se o

RAPD-PCR para a análise de amostras resistentes à eritromicina, observou-se perfis genéticos de

significativa similaridade entre amostras que albergam diferentes determinantes genéticos de

resistência, indicando que a aquisição destes genes não provocou alterações no genoma detectáveis

pela metodologia utilizada. Da mesma forma, a análise de amostras sensíveis a este antimicrobiano

revelou a ocorrência de grupos de similaridade que alocam amostras de diferentes origens clínicas.

É importante ressaltar a significativa similaridade entre uma amostra sensível e outra resistente à

levofloxacina. A ocorrência de amostras significativamente similares e com diferenças de

comportamento frente a antimicrobianos, como as fluoroquinolonas, corrobora as observações

sobre a similaridade de perfis genéticos entre amostras resistentes e sensíveis à eritromicina,

observada no dendrograma resultante na análise conjunta dos perfis de RAPD-PCR. É interessante

notar neste dendrograma que nos dois grupos de similaridade encontram-se amostras resistentes e

sensíveis, o que indica que a aquisição de resistência ocorre de maneira aleatória na população de

EGB circulante, uma vez que não foram observados perfis genéticos específicos. Portanto, a

aquisição de determinantes genéticos de resistência aos antimicrobianos parece não ser suficiente

para definir um único grupo clonal entre as amostras desta espécie.

38

6. CONCLUSÃO

Os testes fisiológicos tradicionalmente empregados na identificação de S. agalactiae, quando

utilizados em conjunto, apresentaram excelente performance;

As amostras estudadas apresentaram-se uniformemente sensíveis a alguns antimicrobianos,

sobretudo beta-lactâmicos e vancomicina. Contudo, foi observada resistência à tetraciclina,

eritromicina, clindamicina e levofloxacina;

A resistência à eritromicina sugere que, em nosso meio, macrolídeos só devem ser utilizados

para tratamento das infecções por EGB após a obtenção do perfil de sensibilidade da amostra

frente a estes antimicrobianos;

Comparando-se os resultados de sensibilidade à eritromicina pelas duas metodologias

utilizadas, tais resultados demonstram que, para fins terapêuticos, as amostras de EGB que

apresentam resistência intermediária à eritromicina pelo método de difusão em agar, devem ser

consideradas resistentes, a fim de garantir o sucesso do tratamento;

Em relação à levofloxacina, este parece ser o primeiro relato de resistência de EGB a esta

droga no Brasil, revelando o aumento pontual da resistência a este antimicrobiano usualmente

empregado em infecções do trato urinário em indivíduos não-gestantes;

Pela técnica de PCR, foram detectados os genes de resistência a macrolídeos (ermA, ermB e

mefA/E), cujos fenótipos de resistência quando associados a estes genes (MLSBi, MLSBc e M)

foram condizentes com dados da literatura nacional e internacional;

Empregando-se a metodologia de RAPD-PCR, observou-se diversidade de perfis tanto entre

amostras sensíveis quanto entre amostras resistentes aos macrolídeos. Porém, a análise conjunta

destes perfis revelou significativa similaridade entre amostras com diferentes comportamentos a

este antimicrobiano, sugerindo que a aquisição de genes de resistência não determinou o

surgimento de um ou poucos grupos clonais.

39

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Resistência aos antimicrobianos entre amostras de ...livros01.livrosgratis.com.br/cp152889.pdf · concentration (MIC) higher than 32 µg/mL by E-test . Resistance and intermediary