Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L ...€¦ · ácidos nucleicos, proteínas, aminoácidos, coenzimas entre otras biomoléculas. Este compuesto es esencial para

Facultad de Ciencias

Licenciatura en Ciencias Biológicas

Profundización Microbiología

Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.)

a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas

Bach. Martín Beracochea

Orientador: Dra. Margarita Sicardi

Co-Orientador: Dra. Adriana Montañez

Laboratorio de Microbiología de Suelos – Facultad de Ciencias

Tribunal: Dr. Federico Battistoni

Dra. Alicia Arias

Montevideo

Noviembre 2011

Agradecimientos.

A Margarita que fue mi mentora en este proceso, a lo largo del mismo siempre estuvopresente para responder mis “mil y una” dudas. Que “rico es comer” frase que siemprellevare conmigo.

A Claudia, compañera de muchas horas y muchos mates. Siempre es un placer trabajar asu lado.

Adriana, tus aportes siempre sumaron.

A los “gurises” del laboratorio Hugo, Lucia y Diana con quienes compartimos por unratito la mesada.

A Federico Battistoni y Alicia Arias cuyas rápidas correcciones mejoraronsustancialmente este trabajo.

A mis padres y mi hermano que nunca aflojaron y donde siempre encontré valiososconsejos.

A Mary y José que me brindaron un segundo hogar.

A Cintia con quien compartimos tantos viajes en la vida, sin su cariñosa compañía esto nohubiera sido posible.

Dedicada a todos aquellos que me preguntaron “¿Para cuándo la tesis?”.

Respuesta de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas nativas

Índice general

RESUMEN 1

1 - INTRODUCCIÓN 2

1.1 - NITRÓGENO COMO NUTRIENTE VEGETAL 2

1.2 - CICLO DEL NITRÓGENO 3

1.3 – FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO 4

1.4 - LOS CEREALES: MAÍZ (ZEA MAYS, L.) 5

1.5 - MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL 6

1.5.1 - BACTERIAS ENDÓFITAS 6

1.6 - MECANISMOS DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN GRAMÍNEAS 9

1.6.1 - FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO 9

1.6.2 - SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATO 11

1.6.3 - PRODUCCIÓN DE ÁCIDO INDOL-ACÉTICO (AIA) 11

1.7 - INOCULACIÓN DE GRAMÍNEAS CON MPCV 12

1.8 - ESTUDIOS DE FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN MAÍZ EN URUGUAY. 12

2 - OBJETIVOS 14

2.1 - OBJETIVO GENERAL 14

2.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14

3 - MATERIALES Y MÉTODOS 15

3.1 - CEPAS BACTERIANAS 15

3.2 - SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATO INORGÁNICO IN VITRO 16

3.3 - BACTERIZACIÓN DE SEMILLAS DE MAÍZ Y CRECIMIENTO DE LA RADÍCULA 17

3.4 - TOLERANCIA AL HERBICIDA GLIFOSATO 18

3.5 - RESPUESTA DE MAÍZ A LA INOCULACIÓN CON BACTERIAS ENDÓFITAS-DIAZÓTROFAS 18

3.5.1 - ENSAYO EN CONDICIONES GNOTOBIÓTICAS 18

3.5.2 - ENSAYO EN INVERNÁCULO 19


4 - RESULTADOS Y DISCUSIÓN 21

4.1 - CAPACIDAD DE SOLUBILIZAR FOSFATO INORGÁNICO IN VITRO 21

4.2 - EFECTO DE LA BACTERIZACIÓN DE SEMILLAS EN EL CRECIMIENTO DE LA RADÍCULA 24

4.3 - TOLERANCIA AL GLIFOSATO 27

4.4 - RESPUESTA DE MAÍZ A LA INOCULACIÓN BACTERIANA 29

4.4.1 - ENSAYO EN CONDICIONES GNOTOBIÓTICAS 29

4.4.2 - ENSAYO EN INVERNÁCULO 32

5 - CONCLUSIONES 37

6 - PERSPECTIVAS 38

7 – ANEXO 1 39

MEDIOS DE CULTIVO 39

8 - BIBLIOGRAFÍA 41


Índice de Figuras

Figura 1 - Ciclo biogeoquímico del nitrógeno. 3

Figura 2 - Complejo enzimático nitrogenasa. 4

Figura 3 - Microscopia confocal de tallos y raíz de cortes de maíz infectados con

Klebsiella pneumoniae. 9

Figura 4 - Placa de NBRIP sembrada con las cepas EMA-35 y EMA-38. 21

Figura 5 - Placa de agar-agua con semillas de maíz germinando. 24

Figura 6 - Sistema de crecimiento de plántulas de maíz in vitro. 29

Figura 7 - Peso seco parte aérea y peso seco radical de las variedades NK940, PAU871 y

Maizón 33

Índice de Tablas

Tabla 1- Subconjunto de bacterias endófitas descritas para distintas plantas 7

Tabla 2 - Cepas bacterianas asociadas a maíz (Zea mays L.) 16

Tabla 3 - Capacidad de solubilización de P in vitro 22

Tabla 4 - Longitud media de radícula de semillas de maíz bacterizadas 25

Tabla 5 - Tolerancia de cepas endófitas-diazótrofas al glifosato 28

Tabla 6 - Valores medios de peso seco parte aérea y peso seco radical de plantas de

maíz 30

Tabla 7 - Valores de índice relativo de peso seco de la parte aérea. 31

Tabla 8 - Valores medios de peso seco parte aérea y raíz, % de átomos en exceso

de 15N, concentración de N y acumulación de N en ensayo de invernáculo. 34


1

Resumen

El maíz (Zea mays L.) es uno de los cereales de mayor importancia en el mundo,

tanto para la alimentación humana como animal. Recientemente, su cultivo se ha

incentivado en los países para utilizarlo en la producción de etanol y biodiésel, productos

de gran importancia energética, económica y social. En Uruguay, el área de siembra de

maíz se incrementó significativamente en los últimos años.

En nuestro país y en general en muchos otros países, los altos rendimientos en el

cultivo de maíz están asociados a altas dosis de fertilización nitrogenada. Este concepto

erróneo, trajo y trae un excesivo empleo de fertilizantes en los cultivos y graves

problemas ambientales asociados. Un alto porcentaje del fertilizante añadido a un

cultivo se volatiliza y/o es lixiviado del suelo (50%) y se acumula como nitrato en las

aguas de arroyos y ríos. Esto trae el problema de efectos perjudiciales en la salud

humana y daño ecológico. En Brasil, la fijación biológica de nitrógeno (FBN) en

gramíneas por bacterias que viven en la rizósfera o en el interior de las plantas

(endófitas) ha revolucionado la agricultura nacional y regional, en las últimas décadas,

por los resultados promisorios de numerosas investigaciones. Si el objetivo es minimizar

los problemas ambientales y económicos que trae la fertilización nitrogenada la FBN es

una alternativa biológica con alto potencial de aplicación y que justifica los esfuerzos

que se hagan en su estudio. En Uruguay, el tema de la FBN en gramíneas no es nuevo.

Existen antecedentes sobre la presencia en variedades comerciales de maíz, de varios

géneros de bacterias nativas fijadoras de nitrógeno atmosférico (diazótrofas).

El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas endófitas-diazótrofas nativas con

características de promoción del crecimiento vegetal y evaluar la respuesta de su

inoculación de variedades comerciales de maíz (Zea mays L.) utilizadas en Uruguay.

Los resultados muestran que las bacterias endófitas asociadas a maíz utilizadas en

este trabajo tienen la capacidad de solubilizar fosfato y son tolerantes al herbicida

glifosato. La respuesta de variedades comerciales de maíz demostró que existe

especificidad en la interacción cepa-variedad. Mediante la técnica de dilución isotópica

de 15N se detectaron combinaciones cepa-variedad que tienen la capacidad de contribuir

con la nutrición nitrogenada de maíz en las condiciones experimentales utilizadas.


2

1 - Introducción

1.1 - Nitrógeno como nutriente vegetal

El nitrógeno (N) es un nutriente fundamental para la vida, formando parte de

ácidos nucleicos, proteínas, aminoácidos, coenzimas entre otras biomoléculas. Este

compuesto es esencial para el crecimiento vegetativo vigoroso de las plantas y para el

contenido de proteína en grano (Urzúa, 2000). En el suelo este se encuentra en un 98%

en formas orgánicas no asimilables por vegetales. El balance de N en los suelos agrícolas

suele ser negativo, se retira en mayores proporciones del que ingresa naturalmente, y

por su baja biodisponibilidad es un elemento limitante del crecimiento vegetal. Es por

los motivos expuestos que se emplean fertilizantes nitrogenados para suplir su falta y

lograr buenos rendimientos en los cultivos. Los fertilizantes utilizados derivan del

proceso químico industrial de Haber-Bosch (Galloway et al., 2004). Este proceso tiene un

costo energético elevado y se basa en la quema de combustibles fósiles. La creciente

escasez de combustibles a nivel mundial ha causado, como consecuencia, un aumento en

el precio de los fertilizantes nitrogenados; en nuestro país se importan y representan el

insumo agrícola de mayor costo. Otro problema a tener en cuenta en este contexto es la

baja eficiencia de estos fertilizantes, solo el 50% es absorbido el resto se pierde por

causas biológicas y factores ambientales. Parte se pierde por el proceso biológico de

desnitrificación, sobre todo en ambientes anegados. Otra fracción se volatiliza como

amonio, mientras que el resto de la pérdida de N está representado por el lixiviado de

nitratos y nitritos. A su vez, los nitritos (muy tóxicos) y los nitratos van a los cauces de

agua potable provocando su eutrofización. Esta problemática ha llevado a intensificar,

en los últimos años, la investigación de la fijación biológica de nitrógeno (FBN) como

alternativa para lograr una agricultura sustentable (Bhattacharjee et al., 2008;

Adesemoye y Kloepper 2009).


3

1.2 - Ciclo del Nitrógeno

La transferencia de nitrógeno inorgánico desde el ambiente a la biomasa, y el

proceso inverso conforma lo que se conoce como el ciclo del nitrógeno.

El ciclo del N comprende los distintos estados de oxidación y reducción de este

elemento, así como sus interacciones juegan un rol fundamental los microorganismos

del suelo. Las plantas absorben el N en forma de amonio (NH4+) y nitrato (NO3

-). El

amonio es producido a partir de restos animales, vegetales y microbianos. Esta

conversión de materia orgánica en amonio forma parte de la mineralización, proceso que

llevan a cabo microorganismos muy variados. Es posible que el amonio sea oxidado a

NO2-, y este a NO3

-, este proceso es llamado nitrificación. El nitrato es la principal fuente

de N para las plantas en el suelo. En condiciones de baja concentración de O2, el nitrato

es empleado como aceptor final de electrones por bacterias produciendo formas

gaseosas (desnitrificación) como NO y N2O, ocasionando pérdidas para el sistema suelo-

planta. Las entradas de N al sistema suelo-planta están representadas por la actividad

Figura 1. Ciclo biogeoquímico del nitrógeno. Fuente Cumming (2009) con modificaciones.


4

humana (fertilización), por la fijación por fenómenos atmosféricos y la fijación biológica

de nitrógeno (FBN) (Frioni, 2011).

1.3 – Fijación biológica de nitrógeno

El aire está compuesto en un 80% de N2, molécula compuesta por 2 átomos de N

unidos por un triple enlace de alta energía lo que la hace una molécula prácticamente

inerte. Solamente algunos organismos procariotas son capaces de llevar a cabo la

reducción catalítica de N2 a NH3, proceso denominado FBN (Buchanan et al., 2000). La

ecuación general del proceso es:

N2 + 8e- + 8H+ + 16MgATP -> 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

La conversión enzimática de nitrógeno molecular a amonio es catalizada por la

nitrogenasa (Figura 2). Este complejo enzimático está compuesto por 2 metaloenzimas.

El componente 1 también designado proteína MoFe o dinitrogenasa es un

heterotetrámero de 220.000 Da formado por 2 subunidades diferentes (α2β2). Esta

proteína contiene 2 copias de 2 centros metálicos: el cofactor FeMo-co (MoFe7S8:

homocitrato) y grupos P (cluster-P). Es a nivel de estos centros que ocurre la reducción

del N2. Por otro lado el componente 2 denominado proteína Fe o dinitrogenasa

reductasa es un homodimero, de 68.000 Da, que coordinan un único cluster 4Fe:4S. Esta

enzima se desactiva irreversiblemente frente al O2 por lo cual existen diversos

mecanismos de protección frente al mismo (Rees y Howard, 2000).

Figura 2. Complejo enzimático nitrogenasa. Fuente Taiz y Zeiger (2006) con

modificaciones.


5

El flujo de electrones en la nitrogenasa es: donador de e- -> dinitrogenasa

reducatasa -> dinitrogenasa -> N2. El mecanismo básico de acción involucra 4 pasos:

formación de un complejo entre la proteína Fe (con 2 moléculas de ATP) y la proteína

Mo-Fe, transferencia de e- entre las proteínas acoplada a la reducción de ATP,

disociación de la proteína Fe volviendo a reducirse y cambio de ATP por ADP. Finalmente

cuando un número suficiente de e- se acumula se reduce el N2. Si bien son necesarios 6 e-

para reducir una molécula de N2 a NH3 se consumen 8 e-, 2 de los cuales se pierden como

H2 por motivos que se desconocen (Rees y Howard 2000; Seefeldt et al., 2009).

Solamente un subgrupo de microorganismos procariotas puede llevar a cabo la FBN.

Aquellos capaces de realizar la FBN se los denomina diazótrofos (di, 2; azo, nitrógeno).

Existe una gran diversidad metabólica y ecológica dentro de los diazótrofos existiendo

microorganismos aerobios, anaerobios, quimiorganotrofos, quimiolitotrofos y

fototrofos (Madigan et al., 2003). Algunos solo son capaces de fijar nitrógeno cuando

forman simbiosis con ciertas plantas constituyendo un grupo de gran importancia

agrícola. Anualmente la FBN es responsable del 60% del total de nitrógeno incorporado

al suelo, la fijación industrial del 30% y el 10% restante se debe a motivos no biológicos

atmosféricos (Frioni, 2011).

1.4 - Los cereales: maíz (Zea mays, L.)

La familia Poaceae incluye cultivos de gran importancia como el trigo, sorgo, maíz,

arroz y caña de azúcar. Dichos cereales son fundamentales en la alimentación animal y

humana. El maíz (Zea mays L.) es uno de los principales cereales del mundo. Es un cultivo

multipropósito, sus principales usos son alimentación humana y animal; pero en los

últimos años se emplea para la producción de biocombustibles. En Uruguay el área de

siembra asciende a 96 mil hectáreas sembradas en la zafra 2010 (DIEA/MGAP, 2010). A

nivel internacional es uno de los cultivos de mayor importancia en área sembrada luego

del trigo y el arroz (FAO, 2009). Sus usos no se limitan a la alimentación humana, animal y

biocombustibles, la industria utiliza muchos subproductos derivados del maíz. Uno de los

más importantes es el almidón, el cual es utilizado por ejemplo en la industria alimenticia

y en la industria del papel.

Una de las dificultades de este cultivo es que necesita grandes aportes de

fertilizante nitrogenado para obtener altos rendimientos. Este alto requerimiento en N

de los cereales en general, condujo a que en las últimas décadas, el estudio de los


6

microorganismos promotores del crecimiento vegetal (MPCV) en maíz y arroz, haya sido

y es un área de activa investigación en busca de tecnologías que suministren ese y otros

nutrientes en forma biológica, de manera de promover los sistemas agrícolas

sustentables (Avis et al., 2008; Franche et al., 2009).

1.5 - Microorganismos promotores del crecimiento vegetal

El estudio de microorganismos benéficos en cereales comprende a los

microorganismos promotores del crecimiento vegetal (MPCV). Los mecanismos por los

cuales los MPCV promueven el crecimiento vegetal se dividen en directos e indirectos.

Los mecanismos directos son: FBN, producción de fitohormonas y solubilización de

minerales; los mecanismos indirectos son : control biológico de patógenos e inducción

del sistema inmune vegetal (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).

1.5.1 - Bacterias endófitas

Tomado literalmente endófito significa “dentro de la planta” (endo: “dentro”;

phyton: “planta”). El término endófito fue definido por Wilson (1995) en referencia a

hongos o bacterias que cumplen parte o todo su ciclo de vida dentro de las plantas vivas

sin causar síntomas de enfermedad. Esta definición incluye huéspedes que pueden

tener estrategias de vida muy diferentes como saprofitas, parásitos y simbiontes.

Posteriormente Reinhold-Hurek y Hurek (1998) plantearon el criterio de endófitos

“verdaderos” para aquellas bacterias que fueran aisladas de tejidos desinfectados

superficialmente y que exista evidencia microscópica de su presencia en los tejidos

vegetales. Existen varias definiciones para endófitos una de ellas y la que definición de

Bacon y Hinton (2006) : bacterias capaces de colonizar tejidos vegetales sanos sin causar

síntomas evidentes de enfermedad.

En la Tabla 1 se muestra un subconjunto de especies bacterianas endófitas

descritas distintos cultivos (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).


7

Tabla 1, subconjunto de bacterias endófitas descritas para distintas plantas. FuenteRosenblueth y Martínez-Romero(2006) con modificaciones

Endófito Especie vegetalα-Proteobacteria

Azorhizobium caulinodans ArrozAzospirillum brasilense Banana

Azospirillum amazonense Banana y AnanáBradyrhizobium japonicum Arroz

Gluconacetobacter diazotrophicus Caña de azúcar y caféMethylobacterium mesophilicuma Cítricos

Methylobacterium extorquens Pino y CítricosRhizobium leguminosarum Arroz

Rhizobium (Agrobacterium) radiobacter Zanahoria, arrozSinorhizobium meliloti Boniato

Sphingomonas paucimobilisa Arrozß-Proteobacteria

Azoarcus sp. Pasto de Kallar y ArrozBurkholderia pickettiia MaízBurkholderia cepacia Altramuz amarillo y Cítricos

Burkholderia sp. Banana, Ananá y ArrozChromobacterium violaceuma Arroz

Herbaspirillum seropedicae Caña de azúcar, Arroz, Maíz, Sorgo y BananaHerbaspirillum rubrisulbalbicans Caña de azúcar

γ-ProteobacteriaCitrobacter sp. Banana

Enterobacter spp. MaízEnterobacter sakazakiia SojaEnterobacter cloacaea Cítricos y Maíz

Enterobacter agglomeransa SojaEnterobacter asburiae Boniato

Erwinia sp. SojaEscherichia coli LechugaKlebsiella sp. Trigo, Boniato y Arroz

Klebsiella pneumoniae SojaKlebsiella variicola Banana, Arroz, Maíz y Caña de azúcarKlebsiella terrigena ZanahoriaKlebsiella oxytoca Soja

Pantoea sp. Arroz y SojaPantoea agglomerans Cítricos y Boniato

Pseudomonas chlororaphis Zanahoria y caléndulaPseudomonas putida Zanahoria

Pseudomonas fluorescens ZanahoriaPseudomonas citronellolis SojaPseudomonas synxantha Pino

Salmonella enterica Alfalfa, Zanahoria, Rábano y TomateSerratia sp. Arroz

Serratia marcescensa ArrozStenotrophomonas Pasto de las dunas

FirmicutesBacillus spp. Cítricos

Bacillus megaterium Maíz, Zanahoria y CítricosClostridium Pasto Miscanthus sinesis

Paenibacillus odorifer BoniatoStaphylococcus saprophyticus Zanahoria

BacteroidetesSphingobacterium sp. Arroz

ActinobacteriaArthrobacter globiformis Maíz

Curtobacterium flaccumfaciens CítricosKocuria varians Caléndula

Microbacterium esteraromaticum CaléndulaMicrobacterium testaceum Maíz

Mycobacterium sp. Trigo, PinoNocardia sp. Cítricos

Streptomyces Trigo


8

Los endófitos habitan principalmente los espacios intercelulares de la planta, que

son ambientes ricos en azucares, ácidos orgánicos, aminoácidos e iones inorgánicos,

suficientes para sustentar el crecimiento microbiano. A su vez, estos se encuentran

protegidos del estrés ambiental y se encuentran en un lugar óptimo para el intercambio

metabólico (Bacon y Hinton, 2006).

Las bacterias endófitas pueden clasificarse en obligadas o facultativas, los

obligados con bacterias que dependen del huésped para su crecimiento, sobrevivencia y

dispersión. Mientras que las facultativas cumplen una etapa de su ciclo fuera del

hospedero, generalmente en el suelo (Hardoim et al., 2008). En este ambiente es donde

se encuentra la mayor fuente de bacterias endófitas y generalmente es donde comienza

el proceso de colonización (Sturz et al., 2000). Es posible que la colonización sea pasiva

como por ejemplo que los endófitos se encuentren naturalmente en las semillas

utilizando las mismas como medio de dispersión (Coombs y Franco, 2003). En las plantas

que se propagan vegetativamente los endófitos pasan de un lugar a otro con las yemas

(Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006). Por otro lado la colonización activa involucra 3

pasos. El primer paso es el acercamiento espacial de la bacteria a la superficie de la raíz a

través del movimiento motivado por quimiotaxis. Los principales quimioatrayentes son

ácidos orgánicos, carbohidratos y aminoácidos excretados por la raíz. Luego que la

bacteria entra en contacto con la raíz esta se adhiere a la misma y finalmente se ancla a

la superficie. En estos sitios comienza a multiplicarse la bacteria y se generan

microcolonias comenzando el siguiente paso que es la colonización de la superficie, es

desde estos lugares donde comienza la invasión de los tejidos internos (Hardoim et al.,

2008). La penetración al interior puede ser mediante la liberación de enzimas hidrolíticas

en bajos niveles o espontáneamente por aberturas naturales. En cuanto las células de

endófitos se encuentran dentro de la planta comienzan a multiplicarse colonizando los

principalmente los espacios intercelulares. Los endófitos pueden permanecer en un

tejido específico o lograr una colonización sistémica disparándose por el sistema

vascular o el apoplasto (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2006).

La planta muestra una leve respuesta defensiva permitiendo la infección pero a su

vez regulando la misma. La presencia de endófitos está descrita para todos los órganos

vegetales, pero se puede decir que existe un número mayor en raíz, disminuyendo a

medida que ascienden por el tallo hasta llegar a las hojas y por ultimo frutos e

inflorescencias (Bacon y Hinton, 2006).


9

En la Figura 3 se observa la colonización de tallo y raíz de maíz por la bacteria

Klebsiella pneumoniae. Las bacterias fueron transformadas con un plásmido que codifica

para la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) (Chelius y Triplett, 2000).

1.6 - Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal en gramíneas

Como se hizo mención anteriormente los MPCV poseen mecanismos directos e

indirectos de promoción del crecimiento vegetal. A continuación se detallaran 3

mecanismos directos:

1.6.1 - Fijación biológica de nitrógeno

A finales de la década del 60, la Dra. Döbereiner y su grupo en Brasil comenzaron la

investigación de las bacterias diazótrofas asociadas a gramíneas. Sus primeros estudios

se centraron en bacterias diazótrofas rizosféricas, posteriormente junto a otros

Figura 3. Microscopia confocal de tallos (a) y raíz (b – d) de maíz. a,

Corte longitudinal del tallo de maíz (rojizo) colonizado por K.

pneumoniae (verde amarillento) se señala un grupo de células

bacterianas. b a d, Raíces de maíz (verde oscuro) colonizadas por K.

pneumoniae (verde claro). Barras, 20 (a y b) o 10 (c y d) μm. Fuente

Chelius y Triplett (2000) con modificaciones.


10

investigadores describieron los primeros endófitos diazótrofos al aislar bacterias del

interior de gramíneas capaces de crecer en medios semi-sólidos sin nitrógeno ( Baldani y

Baldani, 2005). Con el empleo de esta metodología se aislaron y describieron distintas

especies de bacterias endófitas diazótrofas como Azospirillum spp. (Tarrand et al., 1978),

Azoarcus sp. (Reinhold et al., 1986) y Herbaspirillim spp. (Baldani et al., 1986).

Los medios semi-sólidos sin N como el JNFb (Boddey et al., 1995), proveen un

ambiente con la presión de O2 necesaria para que se lleve a cabo la FBN. Uno de los

avances que impulsó el estudio de la FBN en gramíneas fue el desarrollo de la técnica de

reducción de acetileno (ARA). La misma se basa en la capacidad de la nitrogenasa de

reducir además del nitrógeno atmosférico, a otras moléculas con triple enlace como el

cianuro y el acetileno. Esta característica permite estimar la FBN inyectando en un

sistema cerrado acetileno y midiendo la producción de etileno en un cromatógrafo de

gases (Boddey y Knowles, 1987).

Existen otras técnicas que permiten medir la FBN con mayor exactitud que ARA.

Entre ellas se encuentra el método de dilución isotópica de 15N de aplicación en

invernáculo y campo. Esta metodología es sensible y permite obtener información útil

para cuantificar la FBN (Boddey y Knowles, 1987; Barraclough, 1995). El nitrógeno posee

2 isótopos estables 14N y 15N, mientras que el primero es el más abundante en la

naturaleza, representa el 99,634%, 0,366% corresponde al isotopo 15N. La técnica de

dilución isotópica de 15N se basa en que plantas creciendo en sustratos con

enriquecimiento homogéneo de 15N tendrán el mismo patrón de absorción de 15N/14N.

Existen 2 posibilidades para aplicar dilución isotópica de 15N: utilizar N2 o fertilizante

nitrogenado marcado como urea u otro compuesto. Debido a las dificultades para

trabajar bajo atmósferas controladas enriquecidas de 15N, generalmente se opta por

fertilizantes marcados. Cuando existe aporte de la FBN a la planta, ésta incorpora N

atmosférico el cual tiene una relación 15N/14N menor a la del sustrato fertilizado con 15N,

“diluyendo” la relación isotópica en la planta. Es posible medir la FBN conociendo la

relación 15N/14N y teniendo como referencia una planta “no fijadora” (Eldor, 2007).

Investigaciones recientes han aislado endófitos diazótrofos de distintas variedades

de maíz (Zinniel et al., 2002; Dermastia et al., 2007). De este cultivo se obtuvieron los

géneros: Herbaspirillum sp. (Palus et al., 1996), Klebsiella sp. (Chelius y Triplett, 2000) y

Burkholderia spp., Herbaspirillum spp., Pantoea spp., Rhanella spp. (Montañez et al.,

2009). Asimismo, Roesch y colaboradores, (2008) realizaron un estudio de biodiversidad

de bacterias endófitas-diazótrofas asociadas a maíz utilizando técnicas independientes


11

de cultivo encontrando que las proteobacterias son el grupo dominante capaces de

colonizar tanto la raíz, como el tallo y la hoja. En raíz las α-proteobacterias son el grupo

dominante mientras que en tallo no existe predominancia por parte de algún grupo. Los

géneros bacterianos más abundantes encontrados por los autores fueron Azospirillum,

Herbaspirillum, Ideonella, Klebsiella y Raoultella (Roesch et al., 2008).

1.6.2 - Solubilización de fosfato

El fósforo (P) es un nutriente necesario para el crecimiento vegetal vigoroso. Al

igual que el N, es un macronutriente de vital importancia en procesos bioquímicos y

fisiológicos. Si bien la concentración del mismo en el suelo puede ser alta, el P no se

encuentra en formas fácilmente disponibles para los vegetales. Esto se debe a que pasa

rápidamente a formas orgánicas (inmovilización) o inorgánicas formando complejos

insolubles con Al y Fe en suelos ácidos, Ca y Mg en suelos alcalinos (Calderón-Vázquez et

al., 2009).

Las bacterias solubilizadoras de fosfato mediante la liberación de fosfatasas

alcalinas, fitasas, producción de ácidos orgánicos, fosfonatasas entre otras, aumentan la

concentración de P biodisponible. Las plantas se benefician de las bacterias que habitan

las rizósfera mediante la solubilización de fosfato (Rodríguez et al., 2006). Por su lado se

postula que las bacterias endófitas mejoran la nutrición de P de las plantas durante los

primeras etapas de la colonización (Kuklinsky-Sobral et al., 2004).

En los últimos años los microoganismos del suelo se han venido estudiando en

muchos países, como una nueva tecnología sustentable y con posibilidades de aplicación

en el sector agrícola.

1.6.3 - Producción de ácido indol-acético (AIA)

Otra característica de PCV que se evalúa en bacterias es la producción de

fitohormonas por endófitos vegetales, por ejemplo, el ácido indol-acético (AIA). Esta

fitohormona está involucrada principalmente en la elongación y división celular. El AIA

promueve el crecimiento radical en bajas concentraciones, en concentraciones altas

inhibe el crecimiento principalmente activando la producción de etileno, hormona que

afecta el crecimiento radical (Taiz y Zeiger, 2006). Existen 2 vías principales de

producción de AIA en bacterias, la vía indol-3-piruvato (IpyA) y la vía indol-3-acetamida

(IAM), ambas dependientes de triptófano (Lambrecht et al., 2000). La producción de AIA

bacteriana se relaciona con un mayor crecimiento de la raíz y el desarrollo de un mayor

número de pelos radicales, favoreciendo la producción vegetal (Perrig et al., 2007).


12

1.7 - Inoculación de gramíneas con MPCV

La inoculación con rizobios es una biotecnología ampliamente utilizada en

leguminosas de interés agrícola. Los rizobios forman una simbiosis con las leguminosas,

son bacterias gram-negativas que pertenecen a la división proteobacteria. Una de las

características únicas y más destacables es que ingresan a tejidos vegetales y forman

estructuras tipo saco llamadas nódulos. Dentro de estas estructuras establecen una

íntima relación con su hospedero, aportándole nitrógeno mediante la FBN y reciben

fotosintatos de la planta (Frioni, 2011). La biotecnología leguminosa-rizobio es utilizado

mundialmente, en nuestro país la inoculación de las semillas de leguminosas con rizobios

eficientes en FBN, es una tecnología utilizada rutinariamente debido a las ventajas

económicas y ambientales que presenta (Baraibar et al., 1999). Es así que desarrollar una

biotecnología similar al cultivo de maíz, tendría gran impacto en la alimentación humana

y animal así como en el medio ambiente. Sustituir parte del fertilizante químico con

bacterias diazótrofas eficientes es una alternativa a incentivar. Para lograr e incorporar

esta tecnología son necesarios estudios sobre nuevos microorganismos, variedades de

hospederos, condiciones ambientales y fundamentalmente profundizar más en el

conocimiento sobre la interacción bacteria-planta-suelo (Weyens et al., 2009).

Últimamente se ha observado en la literatura un gran esfuerzo en realizar evaluaciones

de la inoculación de gramíneas con bacterias PCV tratando de seleccionar aquellas más

promisorias en diferentes condiciones ambientales (Wu et al., 2005; Pedraza et al., 2009;

Mehnaz et al., 2010; Marques et al., 2010). Si bien se han realizado numerosas pruebas en

invernáculo con éxito, todavía existen inconsistencias en los resultados de ensayos en

campo (Bhattacharjee et al., 2008).

1.8 - Estudios de fijación biológica de nitrógeno en maíz en Uruguay.

En Uruguay, las investigaciones en fijación biológica de nitrógeno en maíz, se

iniciaron en el laboratorio de Microbiología del Suelo (LMS) de la Facultad de Ciencias. En

el mismo se realizaron 2 proyectos financiados por la Agencia Internacional de Energía

Atómica (IAEA). Los resultados de esos estudios, permitieron: a) identificar las

variedades comerciales de maíz más promisorias en FBN (metodología de 15N) y b)

obtener una colección de bacterias endófitas-diazótrofas nativas aisladas de ellas.

Posteriormente, se eligieron 15 cepas de esa colección las cuales fueron caracterizadas

bioquímicamente e identificadas, dicha aproximación permitió la identificación de varios


13

géneros de bacterias, entre ellos Brevundimonas, Pantoea, Pseudomonas, Rhanella,

Agrobacterium, Herbaspirillum y Azospirillum (Montañez et al., 2009).

El presente trabajo continua las investigaciones sobre FBN en el cultivo de maíz. La

hipótesis que nos planteamos es que las bacterias endófitas diazótrofas benefician a las

plantas de maíz, ya sea por fijación de nitrógeno o por otra característica promotora del

crecimiento vegetal.

Se pretende validar en ensayos de laboratorio e invernáculo, el efecto de la

inoculación de las raíces de plantas de maíz con cepas diazótrofas nativas seleccionadas.

Esta información será de utilidad para el avance en los conocimientos sobre la FBN en

maíz en nuestro país y conocer su contribución al crecimiento de las plantas.


14

2 - Objetivos

2.1 - Objetivo general

Seleccionar cepas endófitas-diazótrofas nativas con características de promoción

del crecimiento vegetal y evaluar la respuesta de su inoculación de variedades

comerciales de maíz (Zea mays L.) utilizadas en Uruguay.

2.2 - Objetivos específicos

a) Evaluar la capacidad de solubilizar fosfato y promover el crecimiento de la

radícula de plantas de maíz por cepas endófitas-diazótrofas nativas.

b) Determinar la tolerancia al herbicida glifosato de las cepas en estudio.

c) Determinar la respuesta de diferentes variedades de maíz a la inoculación con

cepas en condiciones de laboratorio e invernáculo, midiendo el posible aporte de

la FBN con la técnica de dilución isotópica de 15N.


15

3 - Materiales y Métodos

3.1 - Cepas bacterianas

El laboratorio de Microbiología de Suelos (LMS) de la Facultad de Ciencias mantiene

una colección de 270 aislamientos de bacterias endófitas-diazótrofas de maíz (Zea mays

L.) identificada con la sigla EMA. La colección se formó durante la realización de 2

proyectos de investigación sobre la fijación biológica de N2 en maíz, iniciados en los años

2004 y 2006 (Barloco, 2008; Montañez et al., 2009). Los aislamientos bacterianos se

obtuvieron de hoja, raíz y tallo de 19 variedades de maíz comerciales. Veintidós de esos

aislamientos se caracterizaron como bacterias diazótrofas por crecer en medios de

cultivo sin nitrógeno (N), así como por presentar el gen estructural fundamental de la

nitrogenasa (nifH) y capacidad de reducir acetileno (ARA) (Barloco, 2008). Así mismo, se

las diferenció por ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analyses) y GTG-PCR

(tipificación mediante repetidos GTG) (Montañez et al., 2009). De esa colección de cepas

se eligieron las utilizadas en este trabajo (Tabla 2). Las cepas se conservaron en medio

TY-glicerol al 50% (Beringer, 1974)(Anexo 1), con una subcolección a -20ºC y otra a -80ºC.

La primera actividad realizada con las cepas elegidas (conservadas a -20ºC) fue

repicar las mismas por agotamiento en placas con medio TY para reactivar su

crecimiento.


16

Tabla 2. Características de las cepas bacterianas asociadas a maíz (Zea mays L.) utilizadas en este trabajo.

Cepabacteriana1 Variedad Origen ARA* Presencia de

nifH Identificación

EMA-15 DK688 Raiz + + Pantoea sp.

EMA-35 PAU785 Semilla - + Pantoea sp.

EMA-38 PAU786 Raíz - +Pseudomonas

fluorescens

EMA-46 PAU674 Hoja - + Ranhella sp.

EMA-68 Tendem Tallo + +Pseudomonas

fluorescens

EMA-82 Topacio Tallo + + Pantoea sp.

EMA-83 Topacio Tallo + + Ranhella sp.

EMA-117 NK940 Tallo + +Herbaspirillum

frisingense

EMA-130 Suco Raiz - +Pantoea

agglomerans

EMA-149 Maizon Raiz - + no identificada

EMA-169 Cheyenne Tallo basal + + Ranhella sp.

EMA-171 Cheyenne Raíz - + Burkholderia sp.

EMA-175 Cheyenne Tallo basal - + Ranhella aquatilis

EMA-176 PAU871 Raiz - + Rhizobium sp.

EMA-177 PAU871 Raiz + + Brevundimonas sp.

1 Colección del laboratorio de Microbiología del Suelo, Facultad Ciencias.* ensayo de reducción de acetileno.

3.2 - Solubilización de fosfato inorgánico in vitro

La capacidad de solubilizar fosfato (CSP) inorgánico in vitro se determinó en las

cepas en estudio (Tabla 2) así como la estabilidad o permanencia de esa característica en

sucesivos repiques. El medio de cultivo empleado fue el NBRIP (National Botanical

Research Institute Phosphate's growth medium) (Anexo 1) con Ca3PO4 como fuente de

fósforo (P) insoluble a pH 7 (Nautiyal, 1999).

En primera instancia, las cepas se sembraron en placas de Petri conteniendo medio

TY incubándose a 28ºC repicándose en tubos conteniendo medio líquido TY,

incubándolas a 28ºC en baño mecánico con agitación (100 rpm) durante 24 horas. Las

células bacterianas libres de medio TY se obtuvieron por centrifugación (MiniSpin -

Eppendorf) a 12100 g durante 4 min resuspendiendo el en 1ml de NaCl 0,85% (p/v). El

procedimiento se repitió 3 veces y de la última suspensión de cada cepa se utilizaron

10µl para inocular tubos con 10 ml de medio NBRIP (Anexo 1). Los cultivos se incubaron


17

a 28ºC por 3 días en agitación hasta la observación visual de crecimiento por turbidez.

Diez microlitros de cultivo de cada cepa se placas conteniendo 20 ml de medio NBRIP

por quintuplicado, y se incubaron a 28ºC durante 4 días.

La capacidad de solubilizar fosfato se determinó por formación de un halo

transparente visible alrededor y debajo de la colonia. Las colonias de las cepas

solubilizadoras se repicaron, con palillos de madera estériles, a otra placa con medio

NBRIP por cuadruplicado de manera de medir el diámetro del halo de solubilización y el

diámetro de la colonia en cm. La estabilidad o permanencia de esa característica se

determinó por repiques sucesivos de las cepas en placas con medio TY. Al final del ciclo

de repiques, se evaluó nuevamente su CSP siguiendo los pasos descritos, teniendo

cuidado de mantener las mismas condiciones de crecimiento de los cultivos. Los

resultados se expresan en cm de halo formado sobre cm de cada colonia (Nautiyal,

1999).

3.3 - Bacterización de semillas de maíz y crecimiento de la radícula

El objetivo fue determinar si la bacterización de las semillas de maíz con las cepas

en estudio tiene algún efecto sobre la germinación y el crecimiento de la radícula. La

hipótesis fue que las bacterias excretan metabolitos (por ejemplo, fitohormonas como

las auxinas) que promueven el crecimiento de la radícula una vez germinada la semilla.

Se utilizaron semillas de la variedad NK900 porque se destacó como uno de las

variedades promisorias en fijación biológica de nitrógeno (FBN) en condiciones

controladas en el ensayo realizado por Montañez y colaboradores (2009). Esta

variedades un híbrido utilizado en nuestro país en la alimentación animal. Los inóculos

de las cepas se prepararon individualmente, en 100 ml de medio TY, con incubación a

28ºC, 24 h en agitación (100 rpm). Por otra parte, las semillas de maíz se esterilizaron

superficialmente por inmersión en NaCLO4 4% (v/v) durante 5 min, seguido de 5

enjuagues con agua destilada estéril (Sauer y Burroughs, 1986). Se utilizaron inóculos de

cada cepa sin diluir y diluidos al medio para embeber las semillas por 1 h, manteniendo

en todos los casos condiciones asépticas. Como tratamientos controles se utilizaron

semillas esterilizadas superficialmente, embebidas en medio TY estéril. Las semillas se

colocaron asépticamente en placas con agar-agua 1,5% (p/v) con precaución de lograr

una distribución uniforme de ellas en todas las placas. Se las colocó en los vértices de un

hexágono, enfrentadas entre sí de tal manera que se minimizara el efecto de dispersión

del inóculo y el efecto que podría tener la germinación de una semilla sobre otra


18

adyacente. Las placas se incubaron en estufa a 28ºC en oscuridad, midiéndole la la

radícula de cada semilla a las 48 hs.

3.4 - Tolerancia al herbicida glifosato

Se determinó el efecto del herbicida glifosato sobre las cepas en estudio, bajo la

hipótesis de que este produce un efecto negativo sobre su crecimiento in vitro. La

evaluación se realizó en placas con medio TY y con el agregado de dos concentraciones

de glifosato en la formulación “Roundup®” (Glifotec® de Agritec), 250 mg.l-1 y 500 mg.l-1

respectivamente siguiendo los lineamientos de Zabaloy y Gómez (2005). El glifosato se

esterilizó por filtración, utilizando una jeringa de 10 ml con filtro de poro de 0.22 µm

(Zabaloy y Gómez, 2005). El glifosato estéril se agregó asépticamente al medio TY

fundido y termostatizado a 45ºC y luego se dispensó en placas de Petri. Las cepas en

estudio se crecieron en medio TY (agitador, 100 rpm) a 28ºC y se ajustó la densidad

óptica (D.O.) de cada una por lectura en espectrofotómetro (M302, CamSpec) a 620 nm,

en el rango 0,8-1,0 con NaCl 0,85 % (p/v) estéril. Con los inóculos calibrados, se

prepararon diluciones seriadas 10-4, 10-5 y 10-6 en NaCl 0,85% (p/v). De cada dilución se

transfirieron 3 alícuotas de 10 µl a las placas de TY con glifosato. El control se preparó

con las mismas diluciones de cada cepa sembradas en placas con TY sin glifosato. Todos

los tratamientos se realizaron por duplicado y las placas se incubaron durante 48 h a

28ºC. Los resultados se expresan como Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml

de suspensión bacteriana de cada cepa (Somasegaran y Hoden, 1994).

3.5 - Respuesta de maíz a la inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas

3.5.1 - Ensayo en condiciones gnotobióticas

Se determinó la respuesta en biomasa aérea y radical de plantas de maíz a la

inoculación con bacterias endófitas-diazótrofas en sistemas estériles y en condiciones de

luz y temperatura controladas. Las semillas de las variedades NK900 y DK682,

seleccionadas por tamaño homogéneo, se esterilizaron superficialmente (Ítem 3.3) y se

hidrataron en agua destilada estéril durante 4 horas las mismas fueron pre-germinadas

en placas con agar-agua 1.5% (p/v) a 28 ºC por 24h hasta la observación visual de la

radícula. Cada semilla fue transferida asépticamente a tubos (20 cm de largo x 2,5 cm de

diámetro) con “zona estrecha” (reducción de diámetro) para sostener la misma (1 semilla

por tubo). Los tubos contenían 18 ml de medio con sales minerales sin nitrógeno

(Fahraeus, 1957)(Anexo 1). Los inóculos bacterianos se prepararon en 20 ml de medio TY

(Ítem 3.3). La inoculación de las semillas se realizó 24h después, con 1 ml de inóculo de


19

cada cepa por tubo. El recuento de células viables (UFC.ml-1) de cada inóculo para

conocer la densidad celular se realizó en medio TY (Ítem 3.3). Además de los

tratamientos inoculados con cada cepa, se incluyeron tratamientos controles, con

semillas esterilizadas superficialmente, pre-germinadas, sin inocular y con 0, 35 y 70 ppm

de N en forma de NH4NO3. El nitrógeno se agregó en forma de solución en dos

momentos del ensayo, en la siembra y a los 5 días, usando cada vez 250 µl de la solución

por tubo. Las plántulas se desarrollaron en cuarto iluminado, con temperatura y

fotoperíodo controlados: 12/12 h de luz/oscuridad y 30ºC respectivamente. Se utilizó un

diseño experimental completamente aleatorio con 5 repeticiones por tratamiento. Los

tratamientos controles con y sin N se incluyeron en todos los ensayos. A los 20 d

después de la siembra, las plántulas fueron extraídas cuidadosamente, separando la

parte aérea de la radical para la determinación de peso seco. Para determinar el peso

seco las muestras se colocaron en estufa a 60ºC hasta alcanzar peso constante. Los

resultados se expresaron en mg por planta de peso seco de la parte aérea y de la raíz, los

datos se analizaron por ANOVA y Fisher LSD (p<0,05) (Di Rienzo et al., 2010).

3.5.2 - Ensayo en invernáculo

Se determinó en ensayo en invernáculo el aporte de la FBN en 3 variedades

comerciales de maíz inoculadas con 4 de las cepas endófitas-diazótrofas en estudio. Las

variedades utilizadas fueron NK940, PAU871 y Maizón; las dos primeras son comerciales

y Maizón es una variedad uruguaya con menor uso en las siembras comerciales. NK940 y

PAU871 al igual que NK900 y DK682 (Ítem 3.3) son materiales empleados en la

alimentación animal, mientras que Maizón se utiliza para la alimentación humana. Las

cepas utilizadas en este ensayo fueron elegidas teniendo en cuenta los resultados de su

caracterización: Herbaspirillum frisigense-EMA117, Pantoea sp.-EMA82, Rahnella sp.-

EMA83 y Pseudomonas fluorescens-EMA38. Se utilizaron macetas conteniendo 3kg de

una mezcla suelo:arena (2:1). Las principales características químicas del suelo son: pH 5

(en H20); materia orgánica 1.3%; N-total 0.065%; P extraíble 10ppm (Bray I); K 0.29, Ca

0.6, Mg 0.4 y Na 0.06 Meq/100g de suelo. Para la determinación de la FBN se utilizó la

técnica de dilución isotópica 15N siguiendo los lineamentos generales de los trabajos de

Boddey y colaboradores(1995) y Boddey y Knowles (1987) para ensayos en invernáculo.

Como fertilizante nitrogenado marcado se utilizó sulfato de amonio ((15NH4)2SO4) con

10,16% de átomos en exceso de 15N (%a.e.15N.) obtenido de la Agencia Internacional de

Energía Atómica (IAEA)-Viena, Austria. A partir de la misma se preparó una solución al

7% (p/v), disolviendo 5,68 g de (15NH4)2SO4 en 800 ml de agua destilada. Previo a la


20

incorporación del fertilizante marcado, las macetas se regaron a capacidad de campo con

agua destilada estéril. A las 24 h se dispensaron 10 ml de la solución de (15NH4)2SO4 por

maceta (equivalente a 15 mg de N.maceta-1) y se mezcló cuidadosamente el sustrato con

varilla de vidrio con el fin de homogenizar el máximo posible el 15N en espacio y

profundidad, dejándolas sin ningún tratamiento por 48 hs.

Los inóculos de cada una de las 4 cepas se prepararon como fue descrito en el ítem

3.3 en 100 ml de TY hasta D.O.620 de 0.8. La determinación del número de UFC ml-1 se

realizó como fue descrito en el ítem 3.3. Se sembraron 4 semillas esterilizadas

superficialmente (Ítem 3.3) por maceta y en los tratamientos inoculados se distribuyó

homogéneamente 3 ml de cultivo bacteriano sobre cada semilla, procediendo a tapar las

semillas inmediatamente. A los 2 días después de la siembra, se seleccionaron las

plántulas por tamaño homogéneo, dejando 2 por maceta. Los tratamientos evaluados

fueron: 3 variedades, 4 cepas y 1 control sin inocular. A los controles se les aplicó igual

cantidad de fertilizante-15N que a los tratamientos inoculados. El ensayo se llevó a cabo

en el invernáculo del CIN (Facultad de Ciencias) y las plantas se regaron con agua

corriente y 2-3 veces por semana con medio Farhaeus sin N. La cosecha se realizó a los 60

días después de la siembra. Las plantas se extrajeron de las macetas y se lavaron las

raíces cuidadosamente con agua corriente. Se determinó el peso seco de la parte aérea y

radical (Ítem 3.5.1). Una muestra de la parte aérea de las plantas se molió (polvo fino) en

molino para analizar el de nitrógeno (%N) y el % 15N a.e. por espectrometría de masa (VG

Prism Series II, Universidad Autónoma de Madrid). El porcentaje de N derivado de la

atmósfera (%Ndda) se determinó por la siguiente fórmula:

%Ndda = [(1 – (%15N a.e.F / %15N a.e.NF) X100]

El %15N a.e.F corresponde al enriquecimiento en 15N de las plantas fijadoras y %15N

a.e.NF al enriquecimiento de las plantas no fijadoras (Eldor, 2007). En este experimento

no se incluyeron plantas como no fijadoras controles y se utilizó como tratamiento no

fijador (NF) las plantas del tratamiento con el mayor valor de enriquecimiento de 15N.

Los datos fueron analizados por ANOVA con LSD-Fisher (p<0,05) (Di Rienzo et al., 2010).

Con los datos de %N en la parte aérea se calculó la concentración de N por mg de peso

seco (mg/gPSPA) y la acumulación de mg de N por planta (mg N/pl.)


21

4 - Resultados y discusión

En el trabajo se utilizaron 15 cepas de bacterias endófitas-diazótrofas nativas,

seleccionadas de una colección de aislamientos de 19 variedades comerciales de maíz

(Zea mays L.). Se eligieron teniendo en cuenta la variedad de maíz, órgano vegetal del

que fueron aisladas, capacidad de reducción de acetileno (ARA), presencia del gen nifH y

que correspondieran a diferentes géneros (Tabla 2).

4.1 - Capacidad de solubilizar fosfato inorgánico in vitro

Todas las cepas estudiadas mostraron capacidad de solubilizar fosfato in vitro,

excepto Herbaspirillum frisingense-EMA117 que no formó el típico halo translúcido en el

medio de cultivo (Tabla 3). En la Figura 4 se muestra una placa con medio NBRIP. Se

obtuvo el índice de solubilización de fosfato, clasificando las cepas en tres categorías:

bajo 0-2, media de 2-3 y alta solubilización mayor a 3.

Los resultados mostraron 6 cepas con baja capacidad de solubilizar fosfato (CSP), 8

con media y 1 que no solubiliza (Tabla 3) en las condiciones experimentales establecidas.

Si bien EMA-171, 130, 15 y 149 mostraron una CSP baja y a sus ves son aislamientos

provenientes de raíz, a grandes rasgos no se encuentra relación entre la solubilización de

fosfato y el órgano o variedad del cual se aisló la cepa (Tabla 3). Por otra parte, los

resultados indican que la solubilización de fosfato es una característica constante de las

cepas, varió solamente en EMA-149, 35, 46, 175 y 82 (Tabla 3). Las cepas EMA-149, 35 y

46 mostraron un incremento en su CSP, mientras que EMA-82 disminuyó su CSP (Tabla

3).

Figura 4. Placa de NBRIPsembrada con las cepas EMA-35 yEMA-38.


22

CepaÍndice de solubilización de P**

CSP CSPp

Burkholderia sp. (EMA-171) 1,4 1,8

Pantoea agglomerans (EMA-

130)1,5 1,6

Enterobacter sp. (EMA-15) 1,7 1,7

No identificada (EMA-149) 1,9 2,1

Pantoea sp. (EMA-35) 1,9 2,3

Rahnella sp. (EMA-46)1,9 2,6


Pantoea sp. (EMA-82)2,1 1,4


Pseudomona fluorescens (EMA-

68)2,2 2,5

Rhizobium sp. (EMA-176)2,3 2,0


Brevundimonas sp. (EMA-177) 2,6 2,4

Pseudomonas fluorescens

(EMA-38)2,9 2,1

Herbaspirillum frisingense

(EMA-117)NS* NS

* NS: No solubiliza. ** Los valores indican la relación entre el diámetro de la coloniay el diámetro del halo de solubilización. (n= 4).

Luego del nitrógeno, el fósforo es el segundo macronutriente en importancia para

el crecimiento de las plantas. Su concentración en el suelo puede ser alta pero no está en

formas disponibles para los vegetales (Calderón-Vázquez et al., 2009). Sin embargo,

existen bacterias rizosféricas y endófitas que mediante la liberación de enzimas o

producción de ácidos orgánicos, solubilizan el fosfato haciéndolo disponible para las

plantas ( Kuklinsky-Sobral et al., 2004; Rodríguez et al., 2006). Los resultados de este

Tabla 3. Capacidad de solubilización de P (CSP) in vitro por lascepasendófitas-diazótrofas asociadasa maíz y CSP luego de sucesivosrepiques en medio rico TY (CSPp).


23

trabajo indican que la CSP es una característica bastante común en las cepas estudiadas,

o sea que tienen “potencial” de PCV por esa característica en particular. Por el contrario,

llama la atención que Pantoea sp.-EMA82 fue la única cepa de las 15 estudiadas que

mostró disminución en su CSPp. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos por

Azziz (2010) quien determinó que de 13 cepas aisladas de suelos agrícolas uruguayos, 7

mostraron su CSP disminuida. En la metodología empleada por Azziz (2010) se realizan

12 subcultivos en medio rico mientras que en el presente trabajo se realizaron 5, esto

puede ser una de las razones en la diferencia de los resultados, teniendo en cuenta que

se utilizó el mismo medio de cultivo y condiciones de crecimiento bacteriano similares

para evaluar la CSPP. Asimismo, en el estudio mencionado, los géneros bacterianos

estudiados fueron Pseudomonas spp., Enterobacter spp. y un aislamiento de Rahnella

spp. (Azziz, 2010). En nuestro caso, las cepas de Rahnella sp. EMA-46 y 175 aumentaron o

mantuvieron EMA-169 y 83 su CSP, mientras que Azziz (2010) encontró una disminución

de la CSP en ese género. Los resultados evidencian que si bien es una característica fácil

de detectar in vitro, es a su vez muy variable por la incidencia de factores biológicos y

ambientales. La observación de que el 64% de las cepas estudiadas conservan un nivel

de solubilización invariable luego de sucesivos repiques en medio rico, indicaría que es

una característica intrínseca de las cepas y no solamente el producto de una respuesta

ambiental. Por lo tanto, se destaca que la solubilización de fosfato es una característica

común de las cepas endófitas-diazótrofas estudiadas en este trabajo y que es estable en

las condiciones de cultivo utilizadas. Sin duda, queda por saber si es una característica

funcional en otras condiciones ambientales. Las investigaciones cuyo principal objetivo

es detectar bacterias solubilizadoras de fosfato son numerosas en la bibliografía

(Rodríguez et al., 2006; Avis et al., 2008; Adesemoye y Kloepper, 2009).En Argentina, se

recomienda la inoculación de trigo con una cepa de Pseudomonas sp. solubilizadora de

fosfato para obtener mejores rendimientos en el cultivo (Ventimiglia et al., 2008). Para

maíz existen en Argentina formulaciones comerciales con cepas de Pseudomonas sp. que

muestran incrementos en el rendimiento de hasta el 17% comparado con plantas sin

inocular (Carrasco y Zamora, 2002). La co-inoculación en arroz y trigo con bacterias

solubilizadoras de fosfato y fijadoras de nitrógeno mostró un efecto sinérgico sobre la

promoción del crecimiento vegetal (Kundu y Gaur, 1980; Gyaneshwar et al., 2002). La

solubilización de P en bacterias endófitas puede aumentar la disponibilidad de P durante

las etapas iniciales de la colonización (Kuklinsky-Sobral et al., 2004).Nuestros resultados

y los de la bibliografía resaltan el interés real en continuar con la selección de bacterias


24

que fijen N y solubilicen fosfato para al menos, un suministro parcial de esos nutrientes,

reduciendo la aplicación de fertilizantes en cultivos de importancia para la alimentación

humana y animal.

4.2 - Efecto de la bacterización de semillas en el crecimiento de la radícula

El objetivo fue determinar si las cepas en estudio afectan el crecimiento de la

radícula al estar en contacto con las semillas durante su germinación. El interés

específico fue determinar mediante un método indirecto algún indicio de presencia de

metabolitos que promovieran el crecimiento de la radícula en la variedad NK900. Las

semillas se inocularon y colocaron en placas de agar-agua para su germinación como se

observa en la Figura 5.

En la Tabla 4 se presentan las medias de longitud de la radícula de semillas tratadas

con inóculos de alta y media densidad de bacterias.ml-1 y las de semillas sin inocular. Los

resultados muestran una respuesta variable, dependiendo de la cepa y de la dilución del

inóculo. En general, las semillas tratadas con inóculos diluidos presentaron en promedio

radículas de mayor longitud (3,10 cm) comparado con aquellas con inóculos sin diluir

(2,48 cm).

Figura 5. Placa de agar-agua con semillas

de maíz germinando e inoculadas con EMA-

117.


25

La aplicación de Pseudomonas fluorescens-EMA38 mostró un valor medio de

longitud de radícula significativamente mayor al control, efecto no observado cuando se

utilizó el inóculo diluido (Tabla 4). Brevundimonas sp.-EMA177 dio una media de radícula

de 3,44 cm con inóculo sin diluir, valor más alto que el control cuando se inoculo con

107UFC.ml-1, pero sin diferencia significativa. La inoculación con EMA-15, 130, 117 redujo

significativamente el crecimiento de las radículas, independientemente de la

concentración bacteriana en el inóculo. Por el contrario, el empleo de inóculos sin diluir

Cepa InoculadaLargo de radícula (cm)

Densidad celular en inóculos

107 UFC ml-1 103 UFC ml-1

Control sin inocular 3.37 e 3.45 d-f

Pantoea agglomerans (EMA-130) 1.28 a 1.65 a

Enterobacter sp. (EMA-15) 1.4 ab 2.11 ab

Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 1.5 ab 1.96 ab

Pantoea sp. (EMA-35) 1.98 bc 3.25 c-e

Rahnella sp. (EMA-169) 2.63 cd 3.58 ef

Rahnella sp. (EMA-46) 2.75 de 3.26 c-e

Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 2.79 de 2.55 bc

Burkholderia sp. (EMA-171) 2.83 de 3.68 ef

Rhizobium sp. (EMA-176) 2.84 de 3.69 ef

Pantoea sp. (EMA-82) 2.97 de 3.24 c-e

Sin identificar (EMA-149) 2.99 de 3.41 d-f

Rahnella sp. (EMA-175) 3.11 de 2.83 cd

Rahnella sp. (EMA-83) 3.21 de 3.81 ef

Brevundimonas sp. (EMA-177) 3.44 ef 3.49 d-f

Pseudomonas flourscens (EMA-38) 4.10 f 4.09 f

Letras diferentes indican diferencia significativa según Fisher-LSD (p>0,05). (n= 12)

Tabla 4. Longitud media de radícula de semillas bacterizadas con inóculossin diluir y diluidos de las cepas en estudio (48h después de labacterización)


26

de EMA-169 y EMA-35 mostraron valores significativamente menores al control (Tabla

4).

Como se mencionó hubo un incremento significativo en la longitud promedio de las

radículas cuando se utilizó la cepa P.fluorescens-EMA38, lo cual sugeriría la posibilidad de

que excrete al medio algún metabolito promotor del crecimiento; probablemente con

un inóculo diluido la concentración del compuesto pierde el efecto promotor. Por el

contrario, es más difícil explicar el efecto en la reducción de las radículas, se podría

asumir que es consecuencia de la producción, por las bacterias, de algún metabolito

inhibitorio o en concentración inhibitoria. Investigaciones de Barazani y Friedman (1999)

demostraron que concentraciones de ácido indol-acético (AIA) de 195 μM reducen el

crecimiento radical de semillas de lechuga (Lactuca sativa) mientras que valores de 51

μM lo promueven. Se ha observado que las bacterias endófitas de distintos vegetales

son capaces de producir diversas sustancias bioreactivas como antibióticos,

antioxidantes, antivirales entre otros (Guo et al., 2008). Los resultados de la bibliografía

consultada, sugieren que en nuestro caso es probable que algunas de las bacterias

estudiadas produzcan sustancias inhibitorias. El empleo de bajas concentraciones de

bacterias en el inóculo resultaron en mayor longitud de radícula en comparación a los sin

diluir, el menor largo radical de los últimos puede ser causado por componente del

medio o por productos del metabolismo bacteriano liberados que actúen en detrimento

del poder germinativo de las semillas. El tiempo transcurrido desde la bacterización

hasta la medida de las radículas, es un factor que incide en los resultados. En un ensayo

previo con la misma variedad y similares condiciones, no se obtuvo incremento en el

largo de la radícula medido a las 24 hs de la bacterización (datos no mostrados). En la

bibliografía se menciona que la producción de diversas sustancias por bacterias está

regulada por Quorum sensing, mecanismo de comunicación celular que es controlado por

la densidad poblacional (Badri et al., 2009). La existencia de Quorum sensing en alguno de

los casos de inoculación de semillas estudiados, podría explicar los resultados obtenidos.

Sería interesante determinar si las cepas estudiadas se comunican para la producción de

sustancias estimulantes o inhibidoras involucradas en el crecimiento de la radícula. Las

bacterias deberán evaluarse en otras variedades de maíz, con concentraciones

bacterianas aún menores a las utilizadas en este trabajo y con tiempos de exposición

más amplios. Dichos factores podrían ampliar la información sobre la interacción

cepa/semilla en el desarrollo radical temprano.


27

4.3 - Tolerancia al glifosato

En nuestro país, el cultivo extensivo de maíz se realiza por siembra directa. Este

sistema de producción implica el uso de un herbicida, por lo general “Roundup®”, que es

de amplio espectro, de aplicación por aspersión y utilizado para controlar la vegetación

antes de la siembra o post-emergencia. Este producto ampliamente utilizado en la

agricultura, sobre todo en cultivos transgénicos que son tolerantes al mismo. El

ingrediente activo es el glifosato, más exactamente, la sal isopropilamina de glifosato y

su modo de acción es inhibir la 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, lo que resulta en

el agotamiento de los aminoácidos aromáticos esenciales necesarios para la

supervivencia de las plantas (Beste, 1983). El glifosato es aplicado por lo menos 1 mes

antes de la siembra (Dabalá, 2009).

Como conocimiento adicional de las cepas en estudio, se determinó su tolerancia al

glifosato en su formulación “Roundup®” (Glifotec® de Agritec). El lapso que deja el

agricultor entre la aplicación del herbicida al suelo y la siembra de maíz, es

razonablemente prolongado como para anular un efecto negativo del agroquímico sobre

las bacterias ubicadas alrededor de las semillas (en caso de estar bacterizadas). Para

corroborar esta hipótesis se determinó la capacidad de tolerancia de las cepas al

glifosato semejando una “inoculación” de las semillas y teniendo en cuenta que el efecto

podría no deberse al ingrediente activo sino a otros ingredientes químicos de la

formulación como solventes, coadyuvantes, colorantes, etc. La tolerancia de las cepas al

glifosato se evaluó en medio de cultivo TY con 250 y 500 mg.l-1 y se determinó las UFC

ml-1 de cultivo (Tabla 5).


28

Tabla 5. Tolerancia de cepas endófitas-diazótrofas a glifosato: 250 mg.l-1 (G250) y 500 mg.l-1(G500).

Cepa Control G250 G500

Enterobacter sp. (EMA-15) 8,5 8,7 8,6

Pantoea sp. (EMA-35) 8,6 <6 <6

Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 8,7 8,7 8,7

Rahnella sp. (EMA-46) 7,6 <6 <6

Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 8,7 8,6 8,6

Pantoea sp. (EMA-82) 9,0 8,9 8,9

Rahnella sp. (EMA-83) 7,7 7,9 7,8

Sin identificar (EMA-149) 8,8 8,8 8,8

Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 8,6 8,4 8,5

Pantoea agglomerans (EMA-130) 8,5 8,6 8,5

Rahnella sp. (EMA-169) 8,7 8,6 8,7

Burkholderia sp. (EMA-171) 8,6 8,7 8,6

Rhanella sp. (EMA-175) 7,5 7,6 7,5

Rhizobium sp. (EMA-176) 8,9 <6 <6

Brevundimonas sp. (EMA-177) 7,5 7,6 7,6

Valores en log UFC ml-1 de cultivo. (n=6).

Las dosis de glifosato utilizadas no afectaron el crecimiento de 12 de las 15 cepas

estudiadas, pero si inhibieron el crecimiento de EMA-35, 46 y 176 en ambas dosis

utilizadas (Tabla 5). Si bien el 87% de las cepas estudiadas mostraron tolerancia a los dos

niveles de glifosato, es interesante notar que ninguna de las cepas mostró un mayor

crecimiento por el herbicida en el supuesto de que lo utilizara en su metabolismo como

fuente de algún nutriente. Para ninguna cepa se observó inhibición total del crecimiento

(Tabla 5). Por otra parte, llama la atención que no fueran afectadas un mayor número de

cepas dadas las altas concentraciones de glifosato utilizadas. Es probable, que al utilizar

en la siembra las cepas crecidas en medio TY líquido, se haya atenuado el efecto del

glifosato sobre las mismas. La sensibilidad que presentan las cepas de EMA 35, 46 y 176

probablemente se debe a algún compuesto químico en la formulación del “RoundUp®”,

como por ejemplo el surfactante o algún vehículo empleado en el producto. Rizobios

tolerantes a 250 mg.l-1 de glifosato fueron aislados de suelos agrícolas de Argentina por

Zabaloy y Gómez (2005). Por otro lado, Moneke y Anyanwu (2010) estudiaron bacterias

rizosféricas de arroz en medio rico con distintas concentraciones de “Roundup®” y

obtuvieron bacterias tolerantes a 250 mg.ml-1 de glifosato. Existen 2 vías para la

biodegradación del glifosato, formando glicina o aminomethylphosphonate (AMPA)

(Pipke et al., 1987; Jacob et al., 1988; Kremer y Means, 2009). La vía de AMPA conlleva a

la producción de fosfato biodisponible para la bacteria, la misma se encuentra regulada


29

por las necesidades nutricionales bacterianas de este elemento (Jacob et al., 1988;

Moneke y Anyanwu, 2010). Esto podría representar una ventaja competitiva respecto a

microorganismos rizosféricos incapaces de biodegradar glifosato por esa vía.

Cabe resaltar que se considera de interés determinar la tolerancia al herbicida en

otras condiciones experimentales, ambientales y en medio de cultivo líquido, para poder

ponderar los resultados con las cepas estudiadas.

4.4 - Respuesta de maíz a la inoculación bacteriana

Se estudió la respuesta de variedades de maíz a la inoculación con las cepas

endófitas-diazótrofas en condiciones gnotobióticas e invernáculo. Ambas

aproximaciones tuvieron el objetivo de detectar algún efecto positivo sobre el

crecimiento de las plantas de maíz.

4.4.1 - Ensayo en condiciones gnotobióticas

En una primera instancia se evaluó la respuesta a la inoculación en condiciones de

laboratorio utilizando tubos para planta con zona estrecha (Figura 6).

Figura 6. Sistema de crecimiento de

plántulas de maíz in vitro.

Como se muestra en la Tabla 6 la variedad NK900 sin inocular mostró valores de

peso seco parte aérea (PSPA) y peso seco radical (PSR) más altos en comparación a

DK682 en los tratamientos sin N (-N), con 35 (+N35) y 70 (+N70) ppm de N. Este

resultado indica que esa variedad es capaz de lograr mayor producción de biomasa en las

condiciones de crecimiento utilizadas. Para el variedad NK900, los valores medios de


30

PSPA obtenidos con las cepas EMA-38, 82 y 149 son significativamente más altos que el

de las plantas control –N, pero sin diferencia de aquellas con +N35 y +N70 (Tabla 6).

Tratamiento

Peso seco (mg.planta-1)

NK900 DK682

PSPA PSR PSPA PSR

-N 81.3 bc 88.4 bc 67.2 ab 74.3 b-e

+ N35 110.3 gh 89.9 bc 101.8 gh 87.7 b-f

+ N70 110.1 f-h 82.8 a-c 102.1 h 80.5 b-e

Rahnella sp. (EMA-169) 69.7 ab 71.4 a 87.6 d-f 93.4 d-f

Pseudomonas fluorescens (EMA-68) 79.2 a-c 75.3 ab 91.2 e-h 110.0 f

Rahnella sp. (EMA-175) 86.1 b-d 85.2 a-c 64.6 ab 67.8 a-d

Rahnella sp. (EMA-83) 87.7 c-e 80.1 ab 74.0 a-d 62.4 ab

Pantoea sp. (EMA-35) 89.9 c-e 76.2 ab 101.8 gh 98.0 ef

Brevundimonas sp. (EMA-177) 92.4 c-e 80.4 ab 81.0 c-e 83.2 b-e

Enterobacter sp. (EMA-15) 96.4 d-f 90.4 b-d 66.1 ab 49.2 a

Enterobacter sp. (EMA-130) 94.0 c-e 68.7 a 89.0 d-g 84.7 b-f

Rahnella sp. (EMA-46) 89.7 c-e 74.4 ab 62.2 a 50.7 a

Rhizobium sp. (EMA-176) 92.5 c-e 74.5 ab 91.7 e-h 90.4 c-f

Pantoea sp. (EMA-82) 95.9 c-e 83.2 a-c 79.5 b-e 69.7 a-d

Enterobacter sp. (EMA-149) 103.4 e-g 99.6 cd 67.9 a-c 72.2 a-e

Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 101.3 d-g 82.7 a-c 75.9 a-e 64.1 a-c

Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 121.1 h 104.0 d 86.6 d-f 80.3 b-e

Burkholderia sp. (EMA-171) 63.8 a 69.5 a 79.5 b-e 88.1 b-f

La inoculación con EMA-117 en NK900 produjo valores de PSPA significativamente

más altos que con el resto de los tratamientos inoculados (Tabla 6). Un 66% de las cepas

inoculadas en NK900 no produjeron diferencias de PSR respecto a los controles con y sin

N. Cuando se inoculó con EMA-35, 130, 169, 171 y 176 la respuesta en PSR fue

significativamente menor a los controles con y sin N (Tabla 6).

La inoculación de DK682 con EMA-130, 35, 68, 176 y 169 resultó en valores medios

de PSPA significativamente superiores a los de plantas -N pero similares a las que

Los valores en la misma columna seguidos por la misma letra no son significativamentediferentes según Fisher-LSD (p<0.05). –N control no inoculado y sin N, +N35 control sin inoculary fertilizado con 35ppm de N, +N75 control sin inocular y fertilizado con 70 ppm de N.

Tabla 6. Valores medios de peso seco parte aérea y peso seco radical de plantas de

maíz variedades NK900 y DK682 inoculadas con cepas de endófitos-diazótrofos. (n =

5).


31

presentaron +N35 y +N70 (Tabla 6). Los valores de PSR en la variedad DK682, al igual

que en NK900, no mostraron diferencias entre los controles con y sin nitrógeno. Once de

las 15 cepas estudiadas no indujeron diferencias en el PSR respecto al control -N. A

diferencia de NK900, EMA-46 y EMA-15 provocaron un aumento significativo de los

valores de PSR respecto a -N, +N35 y +N70 en DK682. Al inocular con EMA-68 el PSR en

DK682 aumentó significativamente respecto -N y +N70 (Tabla 6).

Teniendo en cuenta los datos de los 2 variedades conjuntamente, las plantas

inoculadas con H.frisigense-EMA117 mostraron PSPA significativamente mayor (46% de

incremento) a las plantas sin inocular y -N (Tabla 7)). La inoculación con Rahnella sp.-

EMA46 disminuyó un 23% el PSR respecto al control sin inocular (Tabla 7).

TratamientoVariedad

NK900 DK682

Burkholderia sp. (EMA-171) -23 a 13 a-d

Rahnella sp. (EMA-169) -10 ab 29 c-e

Pseudomonas fluorescens (EMA-68) -1 b-d 37 d-f

Rahnella sp. (EMA-175) 7 b-d 5 ab

Brevundimonas sp. (EMA-177) 13 cd 16 b-d

Rahnella sp. (EMA-83) 14 cd 9 a-d

Pantoea sp. (EMA-35) 14 cd 52 ef

Enterobacter sp. (EMA-15) 16 cd 3 ab

Enterobacter sp. (EMA-130) 16 c-e 40 ef

Rahnella sp. (EMA-46) 16 c-e 8 a

Rhizobium sp. (EMA-176) 16 c-e 35 d-f

Pantoea sp. (EMA-82) 19 de 13 a-d

Enterobacter sp. (EMA-149) 19 de 0 a-c

Pseudomonas fluorescens (EMA-38) 25 de 6 a-c

+N35 33 e 49 ef

+N70 34 e 52 f

Herbaspirillum frisingense (EMA-117) 35 e 18 b-d

Los resultados de la Tabla 7 muestran que varias de las cepas promueven el

crecimiento de la parte aérea de plantas de maíz en las condiciones experimentales

Los valores en la misma columna seguidos por la misma letra no sonsignificativamente diferentes según Fisher-LSD (p<0.05). –N control no inoculadoy sin N, +N35 sin inocular y fertilizado con 35ppm de N, +N75 sin inocular yfertilizado con 70 ppm de N.

Tabla 7. Valores de índice relativo de peso seco de la parte aérea

respecto al control sin nitrógeno (control=100) en las variedades

NK 900 y DK682 inoculados con cepas de endófitos diazótrofos.

(n = 5)


32

utilizadas. La mayoría de los valores de PSPA fueron significativamente mayores a los del

tratamiento control sin N, alcanzando un 52% de incremento en DK682 inoculado con

Rhanella sp.-EMA83 (Tabla 7).

Los resultados indican además especificidad entre la cepa inoculada y la variedad

utilizada, dicha relación debe ser tenida en cuenta en futuros experimentos de

inoculación. La cepa H.frisingense-EMA117 se destaca dado que es capaz de promover el

crecimiento de la parte aérea en NK900 y DK682 (35% y 18%, respectivamente)

comparado al control sin N. La cepa Pantoea sp.-EMA35 mostró valores de PSPA iguales a

los controles +N35, +N70 diferenciándose del -N, siendo su respuesta es similar en

ambos variedades.

En la literatura, H. frisingense se señala como bacteria endófita diazótrofa

promotora del crecimiento vegetal asociada a importantes cultivos como arroz, caña de

azúcar, sorgo y maíz (Elbeltagy et al., 2001; Roncato-Maccari et al., 2003).

Los resultados de Shaharoona y colaboradores (2006) mostraron un incremento del

11,7% en la biomasa aérea de las plantas de maíz al inocularlas con rizobacterias en

condiciones axénicas. Experimentos gnotobióticos en maíz realizados por Gutiérrez-

Zamora y E Martínez-Romero (2001) obtuvieron respuestas a la inoculación con

aumentos de biomasa entre 26-40% respecto a controles sin inocular.

Es de destacar, que los valores de incremento de PSPA obtenidos en estas

condiciones de crecimiento de las plantas concuerdan en general con los obtenidos en la

bibliografía para este cultivo. Con la finalidad de continuar la evaluación se

seleccionaron las cepas más promisorias y se evaluaron en invernáculo.

4.4.2 - Ensayo en invernáculo

Se evaluó la respuesta de PAU871, NK940 y Maizón a la inoculación con Rahnella

spp.-EMA83, H. frisingense-EMA117, Pantoea sp.-EMA82 y P. fluorescens-EMA-38 estos

aislamientos fueron seleccionados por su capacidad de solubilizar fosfato, promover el

crecimiento de la radícula de semillas, tolerar el glifosato y presentar respuesta positiva

a la inoculación de plántulas en condiciones gnotobióticas.


33

La variedad NK940 mostró en promedio menor respuesta a la inoculación que

PAU871 y Maizón (Figura 7, Tabla 8). Por lo tanto, la respuesta a la inoculación seria

PAU871 > Maizón > NK940. Se observó que los valores medios de PSPA de las plantas de

PAU871 inoculadas con Rahnella sp.-EMA83 y Pantoea sp.-EMA82 fueron

significativamente más altos que el control pero no entre ellas (Gráfico 1, Tabla 8); la

combinación PAU871-EMA83 produjo valores de PSPA más altos que P.fluorescens.-

EMA38.

En las variedades Maizón y NK940, la inoculación con Rahnella sp.-EMA83 resultó en

valores PSPA significativamente mayores a las plantas inoculadas con Pantoea sp.-

EMA82 (Figura 7). Para NK940, la inoculación con Pantoea sp.-EMA82 redujo los valores

de PSPA y PSR respecto a las plantas control, lo cual indicaría que la cepa tiene un efecto

negativo en el crecimiento de las plantas de NK940. Este resultado no se observó en

PAU871, indicando interacción cepa vs. variedad.

Figura 7. Peso seco parte aérea (azul) y peso seco radical (rojo) de las variedades NK940, PAU871 y

Maizón inoculados con las cepas EMA-117, 38, 82 y 83. El análisis estadístico se realizó para cada variedad,

letras diferentes indican diferencias estadísticas según Fisher-LSD (p<0,05).


34

El PSR en plantas inoculadas de Maizón fue mayor en promedio que en PAU871 y

NK940. Es de destacar la mayor producción significativa de raíces en Rahnella sp.-EMA83

en PAU871 y Maizón; en NK940 produjo mayor PSR que el control pero sin diferencias

significativas (Figura 7, Tabla 8). En general, la mayoría de los tratamientos inoculados

mostraron valores más altos en PSR que el tratamiento control (Figura 7, Tabla 8).

También se observaron valores de PSR más altos que las plantas control al inocular

Maizón con P. fluorescens.-EMA38 y PAU871 con H. frisingense-EMA117. Estos resultados

podrían indicar que esas cepas de bacterias producen algún metabolito estimulante del

crecimiento radical en esas condiciones, los cuales podrían inducir una mayor producción

de parte aérea.

Estos resultados conjuntamente con los obtenidos en el ensayo en condiciones

gnotobióticas muestran que la cepa H. frisingense-EMA117 promueve la producción de

biomasa aérea, reafirmando la posibilidad de que sea una bacteria PCV en las

condiciones experimentales empleadas. Existe concordancia de nuestros resultados con

los de la bibliografía (Marques et al., 2010; Mehnaz et al., 2010). Riggs y colaboradores

(2001) evaluaron 160 combinaciones cepa-variedad con y sin agregado de fertilizante

nitrogenado (224 kg de N/ha) en ensayo de invernáculo. Los autores obtuvieron

aumento del índice de biomasa vegetal respecto al control sin inocular en 30

combinaciones cuando fertilizaron con N y en 16 cuando no fertilizaron. Según los

autores, cuando no agregan N, la inoculación no alivia los síntomas de déficit de N en las

plantas a pesar del incremento de biomasa respecto a las plantas sin inocular. Por otro

lado, Wu y colaboradores, (2005) señalan los beneficios de la inoculación de maíz con

microorganismos PCV en condiciones controladas. Ellos inocularon plantas de maíz con

una combinación de cepas bacterianas: Azospirillum chroccocum (fijador de N), Bacillus

megaterium (solubilizador de fosforo), Bacillus mucilaginous (solubilizador de K) y 2

especies de hongos micorrícicos. Los autores encontraron que las plantas co-inoculadas

con micorrizas y bacterias PCV triplicaron en biomasa seca a las plantas de maíz que

crecieron con fertilizante orgánico y fosfato de roca. También en maíz, Mehnaz y

colaboradores (2010) demostraron que la inoculación con bacterias PCV endófitas

resulta en un incremento en el PSPA y PSR de 32% y 31%, respectivamente, comparado a

plantas sin inocular.


35

Tabla 8. Valores medios de peso seco parte aérea (PSPA) y raíz (PSR), % de átomos en exceso de 15N

(%a.e. 15N), concentración de N (mgN/gPSPA) y acumulación de N (mg N/pl.) en ensayo de inoculación de

variedades de maíz en invernáculo. (n = 5).

Variedad Cepa inoculada PSPA (g/pl.) PSR (g/pl.) % a.e.15N N en PSPA(mg/gPSPA)

Acumulaciónde N (mg N/pl)

Maizón

H. frisingense(EMA-117)

23,5 bc 12,3 ab 0,22 ab 5,4 b 126,9 ab

Rahnella sp.(EMA-83) 24,7 c 14,4 b 0,19 a (5%)* 6,4 ab 158,1 c

Pantoea sp.(EMA-82)

15,8 a 7,0 a 0,32 b 6,1 ab 96,4 a

P. fluorescens(EMA-38)

20,4 a-c 14,6 b 0,26 ab 6,7 ab 136,7 bc

Control 18,5 ab 7,7 a 0,20 a 6,9 a 127,7 a-c

PAU871

H. frisingense(EMA-117) 22,6 ab 9,4 b 0,19 a (30%)* 6,0 a 135,6 a

Rahnella sp.(EMA-83)

26,9 b 11,5 b 0,18 a (34%)* 4,7 b 126,4 a

Pantoea sp.(EMA-82)

24,5 b 7,8 ab 0,19 a (30%)* 5,5 ab 134,8 a


19,5 a 8,8 ab 0,32 b 5,8 ab 113,1 a

Control 16,5 a 5,4 a 0,27 ab 5,5 ab 90,8 a

NK940

H. frisingense(EMA-117)

21,2 b 8,7 a 0,25 ab 5,6 b 118,7 a

Rahnella sp.(EMA-83)

23,8 b 7,2 a 0,22 ab 5,5 b 130,9 a

Pantoea sp.(EMA-82)

16,8 a 5,3 a 0,28 b 6,6 ab 110,9 a


19,3 ab 8,4 a 0,25 ab 7,3 a 140,9 a

Control 22,3 b 6,8 a 0,16 a 5,8 b 129,4 a

El análisis estadístico se realizó independientemente para cada variedad. Los valores en la misma columnaseguidos por la misma letra no son significativamente diferentes según Fisher-LSD (p<0.05). * %Ndda


36

En la Tabla 8 se presentan los resultados de la determinación de la capacidad de

FBN de las plantas utilizadas. Valores menores de enriquecimiento en %15Na.e. indican

que las plantas incorporaron mayor proporción de nitrógeno atmosférico (14N) en

relación al del fertilizante marcado en el sustrato. El %a.e.15N en Maizón fue más alto en

los tratamientos inoculados comparado con el control, excepto para Rahnella sp.-EMA83,

sin diferencia significativa. Se calculó un valor de 5 %Ndda (%N derivado de la

atmósfera) para esa cepa, destacándose que también muestra el mayor valor de

acumulación N, no significativo.

En PAU871, la FBN se evidencio con la inoculación de EMA-117, 82 y 83 al presentar

valores de 30%, 34% y 30% de %Ndda respectivamente. Esto concuerda con los valores

de acumulación y concentración de N mayor (no significativa) obtenida en las

mencionadas combinaciones cepa-variedad (Tabla 8). En el caso de NK940, ninguno de

los tratamientos inoculados dieron valores de %a.e.15N menores que el control. Cabe

destacar que en esta variedad todos los tratamientos muestran valores similares de

concentración y acumulación de N (Tabla 8). Se observa en la Tabla 8 la posible

interacción cepa-variedad, un ejemplo es la cepa P. fluorescens-EMA38 que inhibe la FBN

en PAU871 pero no así en Maizón y NK940.

En un ensayo previo, Montañez y colaboradores (2009) determinaron por dilución

isotópica de 15N el potencial de aporte de la FBN a plantas de varios variedades de maíz

sin inocular. Los resultados mostraron que los valores de %15N a.e. fueron más altos que

los hallados en el presente trabajo: 0,43% PAU871, 0,43% Maizón y 0,40% NK940,

indicando variaciones posiblemente debido a diferencias en la microbiota, disponibilidad

de nutrientes y contenido de materia orgánica del sustrato empleado como también en

las condiciones experimentales como temperatura y fotoperíodo. Si bien el nitrógeno

combinado puede inhibir la FBN también se sabe que una disponibilidad de ese

elemento puede nutrir la planta durante el crecimiento inicial (Reis et al., 1994). Plantas

más vigorosas durante esta etapa posiblemente permitan que la planta hospede una

población mayor o más activa de bacterias endófitas.

La inoculación con H. frisigense-EMA117 en PAU-871 represento un beneficio dado

que aumentó el contenido en N de la planta, el cual posiblemente deriva de la FBN

considerando el bajo valor de %15Na.e reportado, no significativo. También esta

combinación cepa-variedad logro PSPA mayores, aunque no significativamente

diferentes al control sin inocular.


37

5 - Conclusiones

A partir de los resultados del presenta trabajo se pueden extraer las siguientes

conclusiones:

a) Se detectaron cepas, de diferentes géneros y aisladas de diferentes órganos de

plantas de maíz con potencial de fijar biológicamente nitrógeno (diazótrofas) y

con la capacidad estable de solubilizar fosfato inorgánico in vitro.

b) El herbicida glifosato en concentraciones recomendadas comercialmente no

afecto el crecimiento de las cepas in vitro.

c) La cepa de Pseudomonas fluorescens-EMA38 promovió significativamente el

crecimiento temprano de la radícula de maíz, efecto que atribuido a la producción

de algún metabolito que favorece el crecimiento radical.

d) La inoculación de maíz con Herbaspirillum frisingense-EMA117 produjo un

aumento significativo en la biomasa aérea de las plantas de NK900 medida a los

20 días de crecimiento en condiciones controladas.

e) La metodología de dilución isotópica 15N mostró que la inoculación de la variedad

PAU871 resulta en mayor fijación de N que las variedades Maizón y NK940 en

condiciones de invernáculo. Se detectó que combinaciones maíz-cepa tienen la

capacidad de contribuir a la nutrición nitrogenada de maíz en las condiciones

experimentales utilizadas (siendo EMA-38 y EMA-117 las más promisorias en la

variedad PAU871).


38

6 - Perspectivas

Las perspectivas que plantea este trabajo son: continuar con el estudio y selección

de nuevas características promotoras del crecimiento vegetal (producción de

sideróforos y AIA, control de fitopatógenos etc.) en Pseudomonas fluorescens-EMA38, H.

frisingense-EMA117, Rahnella sp.-EMA83 que aparecen como promisorias. Dar un paso

adelante con algunas cepas pre-seleccionadas para evaluarlas en medios de cultivo semi-

industriales, conjuntamente con su sobrevivencia en soportes utilizados en inoculantes y

en la rizosfera, estudios en etapa piloto. Posteriormente acentuar los ensayos de

inoculación de nuevas combinaciones de variedades de maíz-cepa en invernáculo y luego

en campo. Evaluar otros métodos de inoculación brindaría mayor robustez a los datos

obtenidos hasta el presente. El desafío es continuar con los esfuerzos de identificar

bacterias fijadoras de nitrógeno para lograr la producción de maíz como una práctica

agrícola sustentable.


39

7 – Anexo 1

Medios de cultivo

TY

Reactivo Cantidad por litro

Extracto de levadura 3 g

Triptona de soja 5 g

CaCl2 (2,5 % ó 3.3%

c/H2O)

H2O csp.

4 ml

1 litro

Para solidificar se utilizó agar a una concentración de 17 g/l. pH 7.

NBRIP


Glucosa 10 g

Ca3(PO4)2 5 g

MgCl2 · 7H2O 0,25 g

KCl 0,2 g

(NH4)2SO4

H2O csp.

0,1 g

1 litro

Para solidificar se utilizó agar a una concentración de 17 g/l. pH 7.


40

Fahreus

Reactivo (concentración) Cantidad por litro

CaCl2 (10g/l) 10 ml

MgSO4 · 7H2O (12g/l) 10 ml

KH2PO4 (10g/l) 10 ml

Na2PO4 · 2H2O (15g/l) 10 ml

FeC6H6O7 (0,5 g/l) 10 ml

Solución micronutrientes

H2O csp.

1 ml

1 litro

pH 7.

Solución micronutrientes


CuSO4 5H2O 0,40 g

ZnSO4 7 H2O 0,12 g

H3BO3 1,40 g

Na2MoO4 2 H2O 1 g

MnSO4 H2O

H2O csp.

1,50 g

1 litro

pH 7.


41

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