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Universidad de BarcelonaFacultad de Biología
Departamento de Ecología
RESPUESTA ECOTOXICOLÓGICA DECOMUNIDADES MICROBENTÓNICAS
DE RÍOS MEDITERRÁNEOS
Tesis doctoral presentada por Enrique Navarro Rodríguezpara optar al grado de Doctor en Biología
Programa de EcologíaBienio 1996-1998
Vº y Bº del director de la tesis
Sergi Sabater i CortésProfesor titular de Ecología
Facultad de Biología
Tesis doctoral presentada por Enrique Navarro Rodríguezpara optar al grado de Doctor en Biología
Programa de EcologíaBienio 1996-1998
Vº y Bº del director de la tesis
Sergi Sabater i CortésProfesor titular de Ecología
Facultad de Biología
Universidad de BarcelonaFacultad de Biología
Departamento de Ecología
RESPUESTA ECOTOXICOLÓGICA DECOMUNIDADES MICROBENTÓNICAS
DE RÍOS MEDITERRÁNEOS
5 Índice
Agradecimientos 7
Capítulo 1: Introducción1.1 Antecedentes 91.2 Aproximaciones ecotoxicológicas 101.3 Uso de ríos artificiales 101.4. Efecto de los herbicidas sobre las comunidades
de algas microbentónicas. El caso de la atrazina. 111.5. Efecto de los metales pesados sobre las comunidades
de algas microbentónicas. El caso del cobre. 131.6. Objetivos generales de la investigación 151.7. Objetivos específicos de la investigación 16
Capítulo 2: Materiales y métodos2.1. Experimentación con canales artificiales 172.2. Análisis físicos y químicos 192.2.1. Analítica del agua y cálculo de la velocidad en los canales 192.2.2 Analítica de tóxicos 202.3. Análisis biológicos 202.3.1. Clorofilas 202.3.2. Valoración de la actividad fotosintética mediante
incorporación de carbono-14 202.3.3. Valoración de la actividad fotosintética mediante fluorimetría 212.3.4. Composición y estructura de las comunidades microbentónicas242.3.5. Observaciones con Microscopio Electrónico de Scanning 242.4. Confección de curvas dosis-respuesta, y cálculos
de EC50, N.O.E.C. y F.E.C. 242.5. Herramientas estadísticas 25Fotografías del capítulo 2 27
Capítulo 3: Influencia de la velocidad del agua en el efectotóxico del cobre y la atrazinaInfluencia de la velocidad del agua en el efecto tóxico de la
atrazina sobre las comunidades microbentónicas 333.1. Introducción 333.2. Material y métodos 343.3. Resultados 343.4. Discusión 35Influencia de la velocidad del agua en el efecto tóxico del cobre
sobre las comunidades microbentónicas 373.5. Introducción 373.6. Material y métodos 383.7. Resultados 403.8. Discusión 44
ÍNDICE
Índice 6
Capítulo 4: Influencia del herbivorismo en el efecto tóxicodel cobre y la atrazina 49Influencia del herbivorismo en el efecto tóxico de la atrazina
sobre las comunidades microbentónicas 494.1. Introducción 494.2. Material y métodos 504.3. Resultados 524.4. Discusión 55Influencia del herbivorismo en el efecto tóxico del cobre
sobre las comunidades microbentónicas 574.5. Introducción 574.6. Material y métodos 584.7. Resultados 604.8. Discusión 63
Capítulo 5: Uso de las comunidades algales microbentónicasen tests ecotoxicológicos para la valoración de la calidaddel agua. El caso del río Ter 675.1. Introducción 675.2. Material y métodos 685.3. Resultados 705.4. Discusión 72Fotografías del capítulo 5 77
Capítulo 6: La respuesta ecotoxicológica en condicionesextremas: el caso del río Tinto 836.1. Introducción 836.2. Material y métodos 846.3. Resultados 866.4. Discusión 89Fotografías del capítulo 6 95
Capítulo 7: Resumen y conclusiones 99
Bibliografía 103
7 Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
La lista de personas que de un modo u otro me han ayudado podría abarcar varias páginas. Segu-ramente me dejaré a alguien por el camino, pero espero que sepa perdonarlo. Si alguien cree quedebería estar en esta lista y no lo está, que no se preocupe; ocupará siempre algún lugar entre misrecuerdos. Simplificando al máximo, la lista podría ser:
-A mi familia, Carmen, Enrique y Eduardo, que no ha dejado nunca de presionarme y animarmepara que acabara lo que había empezado.
-A mi director, Sergi, por lo mismo que a mi familia. Además me ha enseñado que si quieresdedicarte a la ciencia, en general, y a la ecología en particular debes prestar atención a los detallesy mantener la capacidad de asombrarte e ilusionarte.
-A mis compañeros del grupo de trabajo, del despacho y del departamento. Para los que leais estaslíneas, sabed que habéis contribuido a hacer de mi estancia en el departamento uno de los periodosmás felices de mi vida. No pongo nombres, por miedo a dejarme a alguno...pero os llevo a todosjunto a los buenos momentos pasados en el departamento.
-Pero vamos a ver...¿cuándo lees?-; la eterna pregunta de mis amigos...esos amigos, con los que hecompartido el tiempo de ocio durante estos años y que gracias a su lejanía con el departamento ycon la ecología, me han ayudado a “desconectar” y a tener una visión más amplia y crítica de estaciencia y de este estilo de vida. Además, el que mes tras mes tuviera que contestarles con la mismacoletilla: -...dentro de tres meses...- también ha servido como acicate.
A Ricardo y al resto del personal del “Servicio de Campos experimentales de la Universidad deBarcelona”, su ayuda técnica en la fase de diseño y construcción del sistema de canales artificialesy el alojamiento una vez puesto en marcha.
A los “Servicios Científicos y Técnicos de la Universidad de Barcelona” el servicio prestado enforma de instalaciones y de apoyo técnico, en el trabajo de análisis de atrazina, cobre y nutrientes.
A los “Guasos”(encargados de parte del mantenimiento de la División III), la ayuda técnica y elmaterial prestados durante todo este tiempo.
Además durante estos últimos años he disfrutado del soporte económico de tres proyectos euro-peos: ”Effects of chemicals on benthic micro-algae in pristine and polluted european rivers:physiological tests or community analysis”(EV5VB-CT94-0402); ”Microbenthic communities ineuropean rivers used to assess effects of land-derived toxicans” (EV5VB-CT96-0298) y ”Use ofBiofilms as high-tech conditioners for drinking waters” (EV5VB-CT96-0298). También he recibi-do 3 ayudas económicas de la Universidad de Barcelona para asisistir a congresos.
9 Capítulo 1
INTRODUCCIÓN
1.1. Antecedentes
Anualmente la industria química fabrica 400 millones de toneladas de productos químicos enforma de 70.000 compuestos diferentes. Sobre el 75 % de ellos no se tienen datos precisos de sutoxicidad (EEA-UNEP, 2000). Muchos de ellos, por su finalidad o por accidente acaban liberándo-se en el medio ambiente. La ecotoxicología es la parte de la toxicología que intenta conocer losefectos de estos productos cuando son liberados en los ecosistemas, como por ejemplo en los ríos.
Los ríos son, desde los albores de la civilización, una de las vías usadas por el hombre para des-prenderse de parte de sus desechos. Desde esta posición de transportador entre la tierra y el mar, lossistemas fluviales han sido espectadores privilegiados de la evolución industrial y tecnológica delhombre, sufriendo en sus aguas los vertidos de sustancias cada vez más tóxicas para las comunida-des naturales. Una parte del agua que circula por estos sistemas, llega directamente por precipita-ción de lluvia o nieve, pero la mayor parte llega tras circular sobre la superficie o tras infiltrarse enlos terrenos de la cuenca (Giller et al., 1998), entrando en íntimo contacto con todos los materialesdepositados en ellos, incluyendo los tóxicos. Por este motivo los sistemas fluviales poseen un granvalor como puntos de control ecotoxicológico.
A lo largo del curso de un río encontramos un gradiente continuo de diferentes variables ambien-tales, que condicionan la distribución y actividad de las comunidades de organismos que podemosencontrar (Vannote et al., 1980). Uno de los aspectos a tener en cuenta al trabajar con ríos medite-rráneos es la marcada variabilidad espacial y temporal que presentan. La acentuada estacionalidaddel caudal es una de las responsables de los cambios observados en el río y sus comunidades(Sabater et al., 1989). Por este motivo, cualquier estudio que pretenda valorar la respuesta de lascomunidades de este tipo de ríos, debe contemplar estudios en diferentes épocas del ciclo anual.
Un ecosistema fluvial funciona como un sistema de procesado y transporte de materiales orgánicose inorgánicos. Estas funciones le son conferidas por sus características hidrodinámicas y por lapresencia de comunidades de organismos. El término comunidad se refiere al conjunto de pobla-ciones de diferentes especies que interaccionan unas con otras coincidiendo en el tiempo y en elespacio (Krebs, 1985; Chapman and Reiss, 1992). La comunidad que nos interesa en este estudioes la compuesta por algas, hongos, bacterias y microinvertebrados que aparece compartiendo espa-cio con detritus y partículas minerales englobadas en una matriz gelatinosa de polisacáridos. Estacomunidad se desarrolla sobre sustratos sumergidos y se denomina microbentos, perifiton o biofilm(Lewis, 1995) siendo capaz de procesar, asimilar y liberar de nuevo al medio gran cantidad decompuestos. Además es una importante fuente de alimento para numerosos organismos (Stevenson,1996). En los últimos años y ante la necesidad de contar con instrumentos de control que ayuden ala gestión de la calidad de las aguas los investigadores se han fijado en estos componentes de lacomunidad acuática. Ciertas características, como su fijación en el sustrato, su periodo de creci-miento, la variabilidad en la composición específica y su facilidad de recolección la convirtieronen base de numerosos índices de calidad del agua. Esas mismas razones son las que hemos valo-rado a la hora de seleccionar esta comunidad como sujeto de nuestros experimentos (Kelly et al.,1995; Whitton and Kelly, 1995; Prygiel and Coste, 1996).
Capítulo 1 10
1.2. Aproximaciones ecotoxicológicas
Frente a la necesidad de valorar la toxicidad delos compuestos liberados al medio, se han idodesarrollando métodos de trabajo que han per-mitido conocer el efecto que estos tienen sobrelos organismos a los que no están destinados.Uno de los más utilizados es el test de dosis-respuesta monoespecífico. Una vez obtenido uncultivo puro del organismo en cuestión se expo-nen diferentes submuestras de éste a concentra-ciones crecientes del tóxico. Generalmente sepuede obtener una ecuación que relaciona lacantidad de tóxico con el efecto sobre elparámetro valorado (crecimiento, mortalidad,fotosíntesis, síntesis de proteínas, etc.). Así sehan calculado multitud de NOEC (NonObserved Effect Concentration). También secalculaban los valores de EC
x (X% Effect
Concentration), LCx (X% Lethal Concentration),
FEC (First Effect Concentration). Todos estosparámetros vienen descritos en la OECDGuideline 201 de 1984 (OECD, 1984). Este tipode cálculos, aunque totalmente correctos desdeel punto de vista fisiológico, no sonextrapolables al valorar una exposición en con-diciones naturales. Los valores calculados deEC
50 se obtienen tras exponer a los organismos
a concentraciones que difícilmente, por no de-cir nunca, se presentarán en condiciones natu-rales. Aunque este tipo de pruebas podía apor-tar mucha información desde el punto de vistafisiológico de la especie, contribuía poco al co-nocimiento de su comportamiento dentro de lared de relaciones interespecíficas que se man-tienen en la comunidad biológica.
Durante gran parte del desarrollo de laecotoxicología se prestó especial atención a lasespecies. Kimball y Levin supervisaron 699 tra-bajos, relacionados con ecotoxicología entre1980 y 1982. Tan solo el 12 % de ellos evaluabalos efectos al nivel de comunidad o ecosistema.Dada su simplicidad, bajo coste y potencial deestandarización, los tests monoespecíficos ju-garon un papel primordial en el establecimientode criterios de gestión de calidad de aguas fren-te a metales y pesticidas.
Los métodos basados en test monoespecíficosestán limitados cuando se pretenden extrapolarlos resultados a los ecosistemas (Kimball andLevin, 1985). La idea de trabajar con las espe-cies clave para determinar la sensibilidad de un
ecosistema, también se ha demostrado ineficaz(Cairns, 1986; Niederlehner et al., 1986), ya queresulta difícil conocer a priori cual será la espe-cie clave, y si su comportamiento será el mismoen un test monoespecífico que en una situaciónreal, interaccionando con el resto de especiesdel ecosistema. Por esta razón, se ha sugeridoque es preferible trabajar con las especies másabundantes (Kimball and Levin, 1985; Mountet al., 1985) a hacerlo con las más sensibles.Siguiendo este tipo de métodos, generalmente,se llega a sobreestimaciones de la toxicidadmedioambiental de los compuestos (Carlson etal., 1986). Además hay que tener en cuenta quela tolerancia al tóxico se puede ver modificadapor las relaciones interespecíficas y en testsmonoespecíficos este efecto no se verá refleja-do (Giesy, 1985; Niederlehner et al., 1986;Cairns and Pratt, 1989b).
Esta tendencia perdió fuerza al sugerirse que laprotección de los niveles superiores delecosistema no podía basarse en los resultadosobtenidos a partir de tests monoespecíficos(Cairns, 1988; Cairns and Pratt, 1989a). Se ha-cía obvia la necesidad de desarrollar métodos yherramientas que permitiesen exponer a comu-nidades complejas a concentraciones realistasde tóxicos, contrastando así los resultados delos tests monoespecíficos (Cairns, 1983; Odum,1984; Kimball and Levin, 1985; Clements et al.,1988). Se precisaba tender puente entre los en-sayos de laboratorio y los sistemas naturales.Una de las posibles aproximacionesmetodológicas era el uso de ríos artificiales.
1.3. Uso de ríos artificiales
Una solución realista a los problemas expues-tos anteriormente es la de comprobar el efectodel tóxico en un sistema ecológico complejo.De ese modo, diversos tipos de organismos, conmecanismos diferentes de incorporación y sus
Grafica 1.Evolución en el con-sumo de triazinas,entre las cuales se en-cuentra la atrazina. Elgrafico se ha confec-cionado con datosextraidos de la web dela FAO.
Consumo de Triazinas en el mundo
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997
Tm d
e pr
inci
pio
activ
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0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
11 Introducción
respectivas relaciones interespecíficas podránser afectadas por el tóxico y consecuentemente,valorar el efecto del tóxico en el ámbito delecosistema. Dado que no siempre es posible (niéticamente apropiado) liberar un tóxico en elmedio, o controlar todos los parámetros que nosinteresan, una de las posibles soluciones pasapor desarrollar réplicas simplificadas de los sis-temas naturales. En nuestro caso, esas réplicasfueron los ríos o canales artificiales. Los ríosartificiales se definen como cualquier tipo decanal, con flujo de agua controlable, usado paraestudiar las propiedades físicas, químicas, o bio-lógicas de los sistemas naturales (Warren andDavis, 1971). Los usos posibles de los canalesartificiales en ecotoxicología van desde validarlos resultados obtenidos en el laboratorio omicrocosmos (Belanger et al., 1990) a valorarla influencia de factores ambientales sobre elefecto de los tóxicos (Clements, 1991), hasta lainvestigación de la influencia de otros nivelestróficos sobre la respuesta ecotoxicológica(Clements, 1991; Stewart and Hill, 1993; Brocket al., 1995; Kiffney and Clements, 1996).
Otro de los aspectos a tener en cuenta a la horade valorar el efecto de tóxicos es el tiempo deexposición. Los canales artificiales al poseer sis-temas de renovación de agua y de control de latemperatura permitirán obtener unos tiempos deexposición mayores que en cultivos in vitro,manteniendo unas condiciones similares a las
naturales. Si lo que se pretende es ver cambiosen la composición de las comunidades, o induc-ción de tolerancia, deberá pensarse siempre entiempos de exposición de días. Otro motivo paraalargar la duración de las exposiciones puedeser el de trabajar a concentraciones muy bajas,mucho menores de las necesarias para obtenerun efecto en los tests dosis-respuesta omonoespecíficos. De ese modo, si se inducencambios en la comunidad, que no se reflejan enlos parámetros fisiológicos, podrán ser valo-rados. Si solo buscamos medir el efecto sobrealguna variable metabólica, pueden bastar ho-ras.
1.4. Efecto de los herbicidas sobre las comu-nidades de algas microbentónicas. El caso dela atrazina.
Los fertilizantes sintéticos y los pesticidas handesempeñado durante décadas un papel domi-nante en la intensificación agrícola tanto en lospaíses industrializados como en los países endesarrollo. El consumo mundial de pesticidasen 1995 alcanzó los 2,6 millones de toneladasde los denominados ingredientes activos, es de-cir, de los productos químicos biológicamenteactivos que se encuentran en las fórmulas de lospesticidas comerciales, con un valor de merca-do de 38.000 millones de dólares USA. Aproxi-madamente el 85 por ciento de este consumo sedestinó a la agricultura (FAO, 2001). Unas tres
Grafica 2.Evolución en los úl-timos 150 años de laproducción y emisiónde los metales pesa-dos más explotadospor el hombre. Elabo-rada a partir de datosde “A Histor of Glo-bal Metal Pollution”de J.O. Nriagu.
Producción y emisión de Cobre, Zinc y Plomo
1850
-190
0
1901
-191
0
1911
-192
0
1921
-193
0
1931
-194
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-195
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1951
-196
0
1961
-197
0
1971
-198
0
1981
-199
0
Mill
on
es
de
Tm
mé
tric
as
0
50
100
150
200
250
Mill
on
es
de
Tm
mé
tric
as
0
20
40
60
80
100Producción de PbProducción de CuProducción de ZnEmisión de PbEmisión de CuEmisión de Zn
Capítulo 1 12
TABLA 1.Algunas de lascaracterísticasquímicasde laatrazina.
cuartas partes del total de los agroquímicos seutilizan en los países desarrollados, sobre todoen Norteamérica, Europa Occidental y Japón,donde los elevados índices de aplicación deplaguicidas son muy corrientes.
Los factores que influyen en el impacto que unpesticida puede ocasionar, dependerán de sutoxicidad, de su persistencia en el medio y de lacantidad de éste que se libere. Los herbicidaspor el modo de uso acaban contaminando confrecuencia las aguas continentales. Una vez li-berados en el medio, el agua de riego y de lluvia(Huber, 1993) se encargan de arrastrar lo queno ha sido incorporado por las plantas. Este la-vado superficial y sub-superficial acaba siem-pre en algún curso de agua y finalmente llega alas costas. De ese modo se han calculado apor-tes anuales de hasta 6600 Kg de sustancia acti-va (atrazina) para una zona costera atlántica delos Estados Unidos (Alegria et al., 2000). Laatrazina es, precisamente, uno de los herbicidasmás ampliamente usados (Grafica 1). Sus tra-zas se encuentran en el agua, aire (en zonas delcentro Europeo se han medido concentracionesde entre 1400 y 51260 pg m-3, dependiendo dela proximidad a áreas agrícolas (Sanusi, 2000)e incluso en la orina de personas no expuestas(Baker et al., 2000).La atrazina fue desarrollada a partir de 1952, enlos laboratorios de Geigy Chemical Companyof Basel
© (Suiza). Fue registrada en Suiza en el
año 1958, y desde entonces ha sido uno de lospesticidas más utilizados. El efecto que tiene esel de inhibir de un modo reversible la fotosínte-sis, actuando únicamente en condiciones de luz.
La atrazina es un herbicida usado en el controlde las malas hierbas anuales en cultivos, espe-cialmente en los de maíz. Es un compuesto po-lar, no iónico, con una moderada solubilidad enagua (Tabla 1) (Lynch et al., 1982). La atrazinapenetra en las plantas superiores a través delfollaje y de la raíz y a través de la superficiecelular en los organismos fotosintéticosunicelulares (Hull, 1994). Aunque las triazinas,grupo de moléculas al cual pertenece la Atrazina,son productos con una baja toxicidad, son em-pleados en cantidades muy elevadas en los paí-ses industrializados. Este hecho conjuntamentecon su persistencia y su alta solubilidad, haceque sean consideradas como productos que sedeben controlar desde el punto de vistaecotoxicológico.
La atrazina se encuentra en la “lista negra” deproductos tóxicos editada por CE (EEC, 1976).También se encuentra en la lista de pesticidas atener en cuenta en la prevención de la contami-nación de aguas subterráneas y potables deEuropa (EEC, 1980). La atrazina fue prohibidaen Suecia en 1989, pero es usada habitualmenteen el resto de países industrializados. En USAse aplican anualmente 35 millones de kilogra-mos (Hoagland et al., 1996), en Holanda192.000 Kg (1992), y en España 250.000 Kg(1990). Dado el elevado riesgo de contamina-ción ambiental se han generado un gran númerode estudios sobre el efecto de la atrazina y otrastriazinas, con la finalidad de estudiar su movili-dad y el efecto sobre la biota (Huber, 1993;Solomon et al., 1996).
Nombre: Atrazina
Nomenclatura: 2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-s-
triazina
Estructura:
Peso molecular: 215.68 g mol-1
Presión de vapor: 2.89x10-7 mm Hg (20ºC)
Solubilidad en agua: 70 mg L-1 (25ºC)
Log Kow
: 2.68 (25ºC)
Hidrólisis: estable 30 días a pH 5-9 y 25ºC
Fotolisis acuosa: (luz natural) t1/2
335 días a pH 7
Fotolisis en suelo: (luz natural) t1/2
12 días
13 Introducción
La atrazina es altamente selectiva, ya que lasplantas objetivo no poseen la misma capacidadde metabolizar el compuesto que los cultivossobre los que es aplicada (Huber, 1993; Tang etal., 1997). La atrazina se liga específicamentecon la proteína D1 en el fotosistema II (PSII),inhibiendo el transporte de electrones(Moreland, 1980). Debido a esta especificidadpor el ligando, es especialmente tóxica para lasalgas, y mucho menos para el resto de organis-mos. Su moderada solubilidad en agua, su bajapresión de vapor y el resto de característicasquímicas, facilitan el lavado de los suelos trata-dos durante los riegos o lluvias (Huber, 1993).Dada su baja tasa de fotólisis acuosa (Tabla 1),es de esperar una gran persistencia una vez lle-ga al agua. La vida media en sistemas acuáti-cos, dependiendo de las condiciones ambienta-les, oscila entre 3 y 300 días (Huber, 1993). Perose han encontrado valores de 5 horas cuando seha expuesto la atrazina a medios ácidos y a emi-siones de luz de baja longitud de onda, 290 nm(Burkhard and Guth, 1976).
Otro hecho que motiva la gran persistencia dela atrazina en las aguas continentales es la pre-sencia en su estructura del anillo de s-triazina,lo que la hace difícilmente atacable por las bac-terias (Howard, 1991). Todas estas característi-cas hacen que la degradación química en elmedio sea mucho más importante que la bioló-gica (Bend and James, 1978; Huber, 1993b). Ladegradación química se da por tres vías: porhidrólisis del carbono 2, por N-dealkilación delcarbono 4, o por rotura del anillo de s-triazina(Knuesli et al., 1969; Wolf and Martin, 1975;Klaine, 1987).
En las comunidades puede aparecer una resis-tencia ligada a un cambio en la comunidad, cre-ciendo en proporción los taxones más resisten-tes (Hamilton et al., 1987; Hoagland et al.,1993). También pueden aparecer respuestas alnivel de la especie por mutación en la proteínaD1. La mutación aparece en el gen psbA, pro-vocando en la proteína el cambio de una serinapor una glicina. La D1 mutante es mucho me-nos afín de la Atrazina, siendo 1000 veces másresistente frente a ella que la D1 normal. Losmecanismos usados por las plantas que son to-lerantes se basan en la 2-hidroxilación, la N-desalquilación (Stratton, 1984; Schiavon, 1988a; Schiavon, 1988 b) y la conjugación conglutatión (Shimabukuro, 1967; Lamoureux et
al., 1970; Tang et al., 1998).
La concentración de atrazina en el agua, depen-derá por tanto de muchos factores. Primero de-berán tenerse en cuenta las características quí-micas del compuesto, el periodo de aplicaciónen los campos, la degradación, la retención enel suelo, las condiciones climáticas y lahidrología de la cuenca. Luego, una vez que elherbicida haya llegado al medio acuático, en-trarán en juego los factores ambientales y bio-lógicos propios de las comunidades. La sensi-bilidad frente a la atrazina de los diferentes gru-pos de organismos presentes en los ríos sería:fitoplancton > macrófitos acuáticos > bentos >zooplancton > peces (Solomon et al., 1996). Sehan descrito efectos a partir de concentracionesde tan solo 1 mg L-1 para algunas especies defitoplancton (Loepky and Tweedy, 1969; Butleret al., 1975; Veber et al., 1981; Stratton, 1984)mientras que hay autores que han encontradoNOEC superiores a 10.000 mg L-1 para ciertospeces de agua dulce (Nishiushi and Hashimoto,1969). Numerosos autores han sugerido que laconcentración de 20 mg L-1 es una NOEC bas-tante general para los ecosistemas acuáticos(Huber, 1993b; Solomon et al., 1996). Las al-gas microbentónicas de ríos europeos estudia-dos por Guasch et al. (1999a) presentan EC
50 de
entre 0.189 y 0.560 mg L-1.
1.5. Efecto de los metales pesados sobre lascomunidades de algas microbentónicas. Elcaso del cobre.
Desde la Revolución Industrial la producciónde metales pesados tales como el plomo, el co-bre y el zinc ha ascendido vertiginosamente.Entre 1850 y 1990 la producción de estos tresmetales se multiplicó por diez, con el corres-pondiente incremento de sus emisiones (Nriagu,1996) (Grafica 2) .
Los metales pesados se han usado de diversasformas,al menos, durante los últimos dos milaños. Por ejemplo, el plomo se ha utilizado enlas tuberías y el arseniato de plomo se ha usadopara combatir los insectos de las manzanas. Losromanos añadían plomo al vino para mejorar elsabor, y el mercurio se utilizaba como bálsamopara aliviar el dolor de muelas en los niños pe-queños.
La toxicidad de estos metales ha quedado docu-
Capítulo 1 14
mentada a lo largo de la historia: los médicos,tanto griegos como romanos, diagnosticaron sín-tomas de envenenamientos agudos por plomomucho antes de que la toxicología se convirtie-ra en ciencia. Hoy día se conoce mucho mássobre los efectos de los metales pesados, cuyaexposición está relacionada con retrasos en eldesarrollo, varios tipos de cáncer, daños en elriñón, e incluso con casos de muerte cuando laexposición ha sido excesiva.
Los metales, una vez emitidos, pueden perma-necer en el ambiente durante cientos de años omás. Muestras de explotaciones de metales pe-sados por parte de los seres humanos han sidohalladas en el interior de los hielos deGroenlandia y en el agua de mar de la Antártida.El contenido de cobre de las capas de hielo de-positadas anualmente en Groenlandia (desde1770 hasta la fecha) evidencia un aumento con-tinuado que corre parejo con el renacer (tras suesplendor y caida durante el imperio Romano,entre el 500 a.c. y el 300 d.c.) de la minería enEuropa, alcanzando valores muy superiores alnivel natural (Hong et al., 1996).
La mayor parte del cobre que usaron los roma-nos vino de la isla de Chipre, que ellos llamaron“Cyprium” y de la cual derivó la palabra“Cuprum” dando origen a “Cu” como símboloquímico del cobre. El cobre, sus compuestos yaleaciones son usados ampliamente en muchasactividades humanas. La capacidad del cobrepara resistir la corrosión y otras propiedades(Tabla 3) hizo que este metal se utilizara tantode modo ornamental como funcional, durantela Edad Media y los sucesivos siglos de la revo-lución industrial, hasta nuestros días. El cobrealcanzó su real dimensión de metal imprescin-dible para el desarrollo industrial del mundo en1831, cuando Faraday descubrió el generadoreléctrico, y desde entonces su demanda ha cre-cido de forma notable.
En estado casi nativo, se usa en cables eléctri-cos, tuberías, herramientas, partes de motores ygeneradores, soldadura, pinturas, conservantes,catalizadores, monedas, arte (estatuas, pinturas),biocidas, medicinas, aleación de metales, fabri-cación de equipamiento eléctrico (Kosalwat andKnight, 1987). Toda esta actividad provoca quecada año se liberen al medio más de 300.000toneladas de cobre. El cobre, otras veces, enforma de óxidos o sulfatos se utiliza en la for-
mulación de pesticidas (McIntosh, 1974).La cantidad de un metal que hay en el agua,muchas veces no se corresponde con la canti-dad disponible para los organismos obiológicamente activa. Uno de los problemas dedeterminar la toxicidad del cobre, reside en lacomplejidad de su química en el agua (Morel etal., 1988). Hay muchas formas diferentes decobre coexistiendo en el medio acuático. Haydesde cobre libre o complejado con hidróxidos,carbonatos y gran cantidad de compuestos or-gánicos, con los que el cobre puede formar com-plejos estables. La proporción de cada forma estácontrolada por el pH, alcalinidad (Allen andHansen, 1996) y los ligandos orgánicos einorgánicos disponibles como sedimentos ymaterial particulado (Stumm and Morgan, 1981;Carlson et al., 1986). Se muestra un cálculo delas diversas formas en la tabla 4. Diversos estu-dios demuestran además que la presencia demateria orgánica reduce la toxicidad del cobre(Swallow et al., 1978). Se ha demostrado que latoxicidad del cobre no depende de la cantidadtotal de cobre, sino de la cantidad de cobre li-bre, Cu2+ (Sunda and Guillard, 1976; Andersonand Morel, 1978). Del cobre total, únicamenteuna pequeña fracción se encuentra en esta for-ma. Este ión es particularmente tóxico para unagran variedad de organismos acuáticos(Anderson and Morel, 1978; Toledo et al., 1979;Muramoto, 1982; Swartzman et al., 1990; Xueand Sigg, 1990). La tolerancia entre las espe-cies de algas varía enormemente (Thomas et al.,1977); siendo, en general los más sensibles losdinoflagelados y cianófitos y más resistentes losflagelados fotosintéticos.
Esta complejidad en la respuesta química haceespecialmente difícil el uso de medios de culti-vo. Se ha podido constatar que, en el caso dedesmidiáceas, si se usa un medio artificial, sesobreestima la toxicidad y si se usa uno artifi-
Nombre: Cobre
Peso molecular medio: 63.54
Densidad: 8.96 g cm-1
Isótopos: Cu-63 (69.17%)
Cu-65 (31.83%)
Punto de fusión: 1083 ºC
Punto de ebullición: 2595 ºC
Estado de oxidación: +2
Tabla 3.Algunas de las ca-racterísticas físicasy químicas del co-bre.
15 Introducción
cial con queladores, se infravalora (Ivorra et al.,1995). La respuesta obtenida con el medio na-tural era intermedia. Por tanto, a la hora de plan-tearse la valoración de la toxicidad del cobre encomunidades acuáticas, una buena aproximaciónserá trabajar con sistemas lo más similares po-sibles a los naturales. Una de esas posiblesaproximaciones es el uso de canales artificia-les.
La incorporación de metales pesados por losmicroorganismos presentes en el perifiton pue-de dividirse en dos fases con distinta cinética:unión de los cationes a los gruposelectronegativos de la superficie celular -fasepasiva- y la fase de incorporación intracelular -fase activa- que es dependiente del metabolis-mo celular. La primera parte del proceso ocurrerápidamente. La segunda parte tiene una cinéticamucho más lenta (Khummongkol et al., 1982;Les and Walker, 1984). Además, muchos delos metales pesados (Cu, Zn, Fe, Ni, Co) no sontóxicos en pequeñas concentraciones, sinomicronutrientes (Fiore and Trevors, 1994).
La sensibilidad al cobre varía enormemente en-tre especies y grupos de organismos. El rangode concentración de cobre capaz de inhibir elcrecimiento va desde 30 mg L-1 en cianobacterias(Wurtsbaugh and Horne, 1982) hasta EC
50 de
18.000 mg L-1 en euglenófitos (Girling et al.,2000).
El cobre en los organismos está ligado al trans-porte de oxígeno y de electrones y a la oxida-ción de amidas y aldehidos, entre otros proce-sos. La concentración intracelular se regulamediante la excreción de exudados de compues-tos orgánicos que ligan metales. La toxicidaddel cobre sobre los organismos fotosintéticosparece basarse en la actividad que tiene sobrela parte oxidativa del PSII, reduciendo el con-
tenido de ATP a concentraciones menores quelas necesarias para afectar a la fotosíntesis (Cidet al., 1995). También se han descrito cambiosen la composición pigmentaria (incremento deun alómero de la clorofila-a), atribuibles a cam-bios del pH en el estroma.
La exposición al cobre provoca el desarrollo demecanismos de tolerancia. La formación detrampas intracelulares, como los cuerpos depolifosfatos, es una de las estrategias más fre-cuentes (Cid et al., 1995). Ciertas cepas de al-gas resistentes producen exudados quecomplejan al cobre (Fogg and Westlake, 1955;Wang and Tischer, 1973; Murphy et al., 1976;Clarke et al., 1987) reduciendo su toxicidad.Algunas levaduras utilizan mecanismosmetabólicos (ligados a plásmidos, algunos) queexcluyen metales de la célula. Algunoscianófitos, además de los métodos descritos,poseen mecanismos internos de detoxificacióny transformación de metales (Reed and Gadd,1990). Se han descrito también sistemas liga-dos a metalotioneinas, que secuestran diversosmetales del medio interno celular (Nordberg andKojima, 1979; Olafson et al., 1979; Olafson,1981).
Tras la exposición a cobre los cambios de tole-rancia de la comunidad pueden deberse tanto ala inducción de mecanismos de tolerancia en lasespecies presentes, como a cambios de compo-sición taxonómica, con incremento de las espe-cies más resistentes (Foster, 1982a; Foster,1982b; Leland and Carter, 1984; Clements,1991). De todos modos, hay especies que sontolerantes al cobre aún antes de haber sido ex-puestas (Foster, 1982a), pudiendo relacionar estatolerancia con los mecanismos de protecciónfrente a condiciones ambientales extremas, comopor ejemplo pH bajos (Peterson et al., 1984;Campbell and Stokes, 1985; Gross, 2000).
A pesar de las abundantes pruebas de estos efec-tos nocivos para la salud, la exposición a losmetales pesados continúa y puede incrementarsea falta de una política consensuada y concreta.
1.6. Objetivos generales de la investigación
El objetivo general de esta tesis es el estudio dela importancia que los factores ambientales tie-nen sobre la respuesta de las comunidadesmicrofitobentónicas frente a un pesticida de uso
Max Min
pH 7.6 7.38
alk 6.52 5.31
%Cu2+ 1.31 2.66
%CuOH 1.65 2.02
%CuOH2 0.13 0.1
%CuCO3 92.18 91.93
%Cu(CO3)2 4.08 2
%CuSO4 0.6 1.22
%CuCl 0.04 0.07
Tabla 4.Proporción de las dife-rentes formas de cobre enlas aguas de nuestros ex-perimentos calculadas apartir de las constantesde equilibrio de Stummy Morgan (1981).
Capítulo 1 16
muy extendido y frente a un metal pesado degran importancia económica (la atrazina y elcobre). Estos estudios se llevarán a cabo en elcampo y en el laboratorio mediante el uso decanales artificiales.
1.7. Objetivos específicos de la investigación
Las hipótesis a testar en esta tesis son las si-guientes:1-Los resultados obtenidos en el laboratoriomediante el uso de sistemas artificiales, que per-mitan mantener comunidades naturales simpli-ficadas, serán extrapolables a los sistemas natu-rales.
2-La velocidad del agua modificará el efectotóxico que el cobre y la atrazina tienen sobre lascomunidades microbentónicas. Los cambios enla velocidad afectarán a esta relación.
3-El efecto de los herbívoros modificará la toxi-cidad del cobre y de la atrazina, ya que los cam-bios provocados por los herbívoros no permiti-rán el desarrollo de mecanismos de tolerancia oadaptación a los tóxicos.
4-La variabilidad en la respuesta ecotoxicológicade las comunidades de un río reflejará la varia-bilidad biológica, espacial y estacional del sis-tema fluvial.
5-Las comunidades expuestas de un modo cró-nico a concentraciones de tóxico son más tole-rantes que las no expuestas (PICT concept).
Lo que sigue a continuación es un detalle deldesarrollo de la tesis:
-Primera parte (capítulo 2): dedicada al desa-rrollo de un sistema de canales que permitamantener comunidades translocadas desde lossistemas naturales durante al menos 3 semanas.En ese periodo se deben poder controlar losparámetros propios de un sistema fluvial, comopendiente, caudal, temperatura e irradiancia.También debe permitir el muestreo de la comu-nidad perifítica y de herbívoros. Debe permitirla dosificación de los tóxicos estudiados, ennuestro caso atrazina y Cobre. Deberá poseer lacapacidad de trabajar con réplicas. Simultánea-mente deberá desarrollarse un sistema desustratos que puedan colocarse en los ríos ytranslocarse, una vez colonizados, a los canales
artificiales. Además deberán ser adecuados paratrabajos de toxicología.
-Segunda parte (capítulos 3 y 4): dedicada a laexperimentación en laboratorio. Los experimen-tos se basarán en dos métodos, el exponencialy el factorial. En los experimentos del primertipo estudiaremos la relación entre un factor yel efecto sobre los parámetros medidos, expo-niendo a las comunidades a diferentes cantida-des del factor . En el segundo tipo se estudiarála interacción entre 2 factores, con los cuatrotratamientos posibles: control, Factor1, Factor2,Factores1+2. Mediante estos diseños se estudia-rá la interacción de los tóxicos con la velocidaddel agua y con los herbívoros, en experimentosque durarán entre 1 y 3 semanas. Además serealizarán como complemento experimentosdosi-respuesta para cálculo de las EC
50.
-Tercera parte (capítulo 5): se basa en la aplica-ción en el medio natural de los métodos desa-rrollados en el laboratorio. En nuestro caso serealizará la estimación del riesgo ecológico quetendrían los vertidos de atrazina y cobre a lolargo del río Ter, centrándonos en el efecto so-bre las comunidades microbentónicas. Estosriesgos deberán relacionarse con parámetrosfisico-químicos propios del río y de las comu-nidades, para poder convertirse en herramien-tas de gestión eficaces. Se estudiará también lavariabilidad en la respuesta de las comunida-des.
-Cuarta parte (capítulo 6): Las comunidades delrío Tinto están expuestas a bajos pH y concen-traciones muy elevadas de metales, lo que nospermitirá establecer una comparativa entre suscomunidades y las comunidades con las que tra-bajamos normalmente. El objetivo de esta com-paración será el de complementar el estudio delos mecanismos que regulan la respuesta de lascomunidades microbentónicas frente al cobre.
17 Capítulo 2
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Experimentación con canales artificiales
Mediante los diseños de tipo factorial y exponencial, se han obtenido resultados complementariossobre distintos aspectos del efecto de un toxico. El diseño tipo regresión, proporciona una red deseguridad al investigador, en comparación con el diseño factorial, donde el número de tratamientoses menor. En los diseños factoriales, al tener pocos tratamientos, se limita la interpretación de losefectos que puedan ocurrir, como gradientes a lo largo del rango de exposición al tóxico empleado(Belanger, 1997). En los diseños de tipo factorial, al tener que reducirse el número de tratamientos,será imprescindible elegir correctamente las concentraciones de tóxico que se emplearán. Este esun problema que en un diseño tipo regresión no suele darse.
Un diseño tipo factorial permite distinguir el efecto de los factores aislados y combinados. Si sedesea maximizar el número de tratamientos, debe tenerse en cuenta que ello acarreará una pérdidaen la replicidad. Con el fin de evitar la “pseudoreplicidad” (Kosinski, 1989) el número de trata-mientos no puede crecer a expensas de las réplicas. Se debe asegurar que la utilización de lainferencia estadística sea la correcta; en nuestro caso hemos buscado la interacción de los tóxicoscon alguno de los factores naturales, de modo que la potenciación o inhibición del efecto se puedaatribuir a ese factor.
En los diseños exponenciales, si se elige un rango lo suficientemente amplio de concentraciones seencontrará un efecto relacionado con una concentración; el efecto observado será el provocado poruna cierta concentración de tóxico. Es por lo que este tipo de diseños resultan idóneos en el contex-to de la valoración de riesgos. En los experimentos bien diseñados, la presión selectiva de lasdiferentes concentraciones de tóxico es substancialmente más importante que la variabilidad den-tro de cada canal; logrando de este modo resultados concluyentes en un alto porcentaje de casos(Belanger, 1997).
Conociendo las ventajas de un tipo de diseño y de otro, es posible complementar la aproximaciónecotoxicológica, usando ambos. Para un tóxico cuyo efecto a diferentes concentraciones es desco-nocido, puede resultar una buena aproximación el diseño tipo regresión. Con este tipo de aproxi-mación se obtendrán aquellas concentraciones del tóxico que posteriormente se podrán relacionarcon unos efectos valorables. Cuando se conoce la concentración de tóxico a partir de la cual seobservan ciertos efectos sobre las comunidades, el experimentador se podrá basar en diseñosfactoriales para estudiar el efecto que tendrá otro factor cualquiera sobre la acción del tóxico. Aposteriori, podrá exponer esas mismas comunidades a diseños tipo regresión, para conocer comoha evolucionado la tolerancia frente al tóxico bajo el efecto del factor estudiado.
El uso de canales artificiales en ecotoxicología ha demostrado ser apropiado ya sea en diseños detipo exponencial o factorial. Su uso resultó ser especialmente útil en aquellos experimentos a largoplazo, donde fue necesario el control de determinados factores, a lo largo de varias semanas. Supolivalencia permite estudiar la interacción de tóxicos con otros factores. Los diseños utilizadosnos permitieron controlar el factor estudiado y la detección de sus efectos sobre la comunidadalgal. Han demostrado así mismo ser un buen soporte para el desarrollo de comunidades algales yde macroinvertebrados herbívoros (Lamberti and Steinman, 1993), lo suficientemente complejascomo para obtener resultados extrapolables a los sistemas naturales.
En el uso de canales artificiales se deben considerar distintos factores. El tamaño de los canalesserá uno de los elementos primordiales. Los canales deben tener el tamaño suficiente para permitirel desarrollo y supervivencia de la biota que se estudia. También para permitir la expresión de los
Capítulo 2 18
factores que se pretenden controlar y que servi-rán para testar nuestra hipótesis.
Los muestreos (extracción de biota) no debenconstituir un impacto excesivo sobre la comu-nidad de los canales. Por otra parte, la comple-jidad de la comunidad estará influida, en parte,por el tamaño de los canales, por el tipo deinóculo que se aporte, por el acceso que tenganlos organismos libres a ellos (en el caso de ca-nales artificiales, situados en la naturaleza) y porsu configuración. Canales pequeños (de menosde 5 metros) pueden poseer una comunidad losuficientemente compleja, para obtener resulta-dos extrapolables a las comunidades naturales(Belanger, 1997). Es cierto sin embargo, quecanales que simulen la heterogeneidad propiade los sistemas fluviales (p. e., zonas de rápidosy zonas de remansos), son imprescindibles altrabajar con niveles tróficos superiores, comofiltradores o depredadores (Lamberti andSteinman, 1993).
Las condiciones impuestas artificialmente en loscanales, podrán provocar cambios en las carac-terísticas del agua, que deberán ser controlados.Entre estos cambios cabe considerar la sedimen-tación (si disminuimos la velocidad del aguarespecto al punto de suministro, el material ensuspensión puede sedimentar...), o la precipita-ción de solutos (si existen cambios de tempera-tura, pH o estado redox). Esto es particularmen-te importante en lo que se refiere a larecirculación del agua. La recirculación puede
provocar que los productos residuales del me-tabolismo, generados por las comunidades, seacumulen, afectando así a las características ori-ginales del agua. En nuestro caso se ha evitadola recirculación, contando siempre con un su-ministro continuo de agua.
El sistema de ríos artificiales usados en estamemoria constaba de 14 canales de metacrilatode 5 mm de grosor (Figura 1). Los canales te-nían una longitud, dependiendo del experimen-to de entre 0.85 y 1.7 m, y una anchura y alturade 0.1 m. La alimentación de los canales se rea-lizaba por goteros. Esto resulta una novedad,respecto a los sistemas descritos en otros traba-jos. Los goteros (NETAFIM
®, con un caudal de
24 l/hora), usados habitualmente en riego porgoteo, proveen un caudal constante de agua den-tro de unos márgenes de presión. De este modouna sola bomba y una sola canalización (dondese disponían los goteros), era suficiente paraalimentar todos los canales. Los goteros propor-cionaban un flujo de 1.5 l/min a cada canal. Loscanales se iluminaban con focos halógenos(OSRAM HALOLINE
® R7s 230v-500w) que
proporcionaban una irradiancia de entre 110-130µE m-2 s-1, de radiación fotosintéticamente acti-va (400 a 1000 nm). El fotoperíodo se sincronizócon el natural, dependiendo de la época, entre8-12 horas de luz y 16-12 horas de oscuridad.Con el fin de evitar un calentamiento excesivodel agua, la instalación disponía de 6 ventilado-res y un extractor. La inyección del tóxico serealizaba con una bomba peristáltica (COLE-
Figura 1.Diagrama del sistema decanales utilizados en loscampos experimentales.En estos campos se dis-ponía de un local habili-tado para servir de labo-ratorio, con tod lo nece-sario para el funciona-miento de los canales ar-tificiales.
19 Materiales y métodos
PARMER® 7521-10, tubos Masterflex-Norprene
6404-14), a partir de un depósito (250 litros)donde se dispuso el tóxico objeto de estudio(Figura 1).
La elección del tipo de substrato, que se usa enlos canales, es siempre complicada, ya que elmaterial seleccionado afectará al comportamien-to y efectos que manifiesten las comunidades yel tóxico respectivamente. Los sustratos suscep-tibles de ser usados son naturales: rocas, guija-rros, gravas, sedimentos, materia orgánica...) oartificiales: cerámica, vidrio, metacrilato, plás-ticos diversos. El vidrio esmerilado o granuladoes especialmente indicado en estudiosecotoxicológicos, pues es inerte, y permite lacolonización de las algas; además, proporcionaespacios a las algas, fuera del alcance de larádula de los herbívoros, evitando una limpiezatotal del sustrato, y facilitando el mantenimien-to de una cierta biomasa algal, que permitirá unarecuperación de la comunidad.
La superficie de cada canal se recubrió con cris-tales esmerilados de 12x9 cm que proporciona-ron soporte a los organismos colonizadores, asícomo una superficie homogénea a lo largo delcanal. Entre ellos se situaron los cristales de1.2x1.2 cm que serían las unidades de muestreo.Todos los cristales se expusieron a un periodode colonización, de entre 2 y 4 semanas, en so-portes de metacrilato diseñados específicamentepara la sujeción de los cristales (ver Figura 2),en diferentes ríos (Avencó, Brugent, Francolí yFuirosos, NE de España). Los cristales coloni-zados se transportaban en un tiempo corto (1h.), desde el río hasta el laboratorio. Una vezsituados en los canales correspondientes, loscristales colonizados se aclimataron durante una
semana a las condiciones definidas en el expe-rimento.
2.2. Análisis físicos y químicos
2.2.1 Analítica del agua y cálculo de la velo-cidad en los canales
La medición de las velocidades del agua en loscanales se llevó a cabo mediante la adición deNaCl, y siguiendo la evolución de laconductividad (Triska, 1984). En otras ocasio-nes se utilizaron sondas anemométricas (tabla1). El resto de parámetros físicos y químicosfueron medidos mediante los métodos descritosen la tabla 1. Las medidas de campo se realiza-ron siempre con sondas multiparamétricas. Lasmuestras para el análisis de nutrientes yalcalinidad se recogían y se conservaban con-geladas, hasta el momento del análisis.
Para nitratos y fosfatos se usó un sistema deelectroforesis capilar de MILLIPORE
©, (mod.
Waters CIA Quanta 5000) según el procedimien-to descrito por Romano (1993). La alcalinidadtotal se midió mediante el método descrito porKramer (1982); la titulación se realizó utilizan-do H
2SO
4 0.02 N, realizando lecturas en conti-
nua con un TITROPROCESSOR deMETROHM
©. Los valores de alcalinidad así
obtenidos, junto con los de conductividad, tem-peratura, pH eran utilizados en el programaCARBOCAR desarrollado a partir del WATEQ(van Gaans, 1989), para calcular el carbono to-tal disuelto. El DOC se analizaba filtrando elagua en filtros GF/F (previamente se habían ca-lentado a 450 ºC durante 4 horas) mediante oxi-dación catalítica a alta temperatura, en unShimadzu
© TOC Analyzer.
Figura 2.Los soportes (A) estanhechos con metacrilato,con cuatro canales (seña-lados por la flecha) don-de caben unos 25 crista-les (B) de 1.2x1.2 cm. Enel perfil (C) puede obser-varse como los cristalesquedan encajados. Lossoportes eran colocadosen zonas de corriente,orientados de modo quelos cristales se situaranhacia la luz.
A
B
C
Capítulo 2 20
2.2.2 Analítica de tóxicos
Las muestras de agua para análisis de cobre seconservaron congeladas con ácido nítrico al 1%para su posterior análisis. La concentración decobre se analizó con ICP-OES (Plasma de in-ducción acoplado a emisión espectroscópica).La concentración de atrazina fue medida inicial-mente mediante HPLC (reversed-phase high-performance liquid chromatography) en un sis-tema de la casa WATERS
©, mod. 600E System
Controller and Waters 700 Satellite WISP, equi-pada con un diodo array (mod. 1000S AppliedBiosystems) según el metodo descrito porGuasch (1998). Este método se basa en el deDuran y Barceló (1990).
En una etapa posterior, la analítica de la atrazinamediante HPLC se complementó mediante kitsde inmunoensayo enzimático. Los análisis serealizaron con el test “EnviroGard TriazineQuantiTube Test Kit” (ENVR T00 01,MILLIPORE
®) mucho más rápido, igualmente
fiable y barato (Bushway, 1989; Thurman,1990). Este test, se basa en la metodologíaELISA “enzime-linked inmuno-sorbent assays”.Una cantidad conocida de enzima conjugadocompite con la atrazina por un número limitadode anticuerpos que forran el interior de tubospreparados. Posteriormente se añade uncromógeno que dará color en función de la can-tidad de enzima conjugado que haya quedadounido a los anticuerpos. Habrá más enzima ymás color cuanto menor sea la concentración deatrazina en la muestra. Para valorar los resulta-dos se realiza una recta de regresión con con-centraciones conocidas de atrazina.
2.3. Análisis biológicos
2.3.1. Clorofilas
La concentración de clorofila-a se determinó apartir de cinco cristales de cada canal. Para laextracción de clorofila-a se usó acetona al 90%.Los cristales fueron sonicados para acelerar laextracción, durante tres periodos de 7 minutos(Sabater et al., 1996). La suspensión se filtrabaa través de filtros GF/F. En el extracto se midióla absorción a 665 y 430 nm. con unespectrofotómetro de PERKIN ELMER
© mod.
Lambda2 UV/VIS. La concentración declorofíla-a fue calculada a partir de lasecuaciones de Jeffrey y Humphrey (Jeffrey andHumphrey, 1975).
2.3.2. Valoración de la actividad fotosintéticamediante incorporación de carbono-14
Uno de los métodos usados para valorar la pro-ducción primaria fue la incorporación deH14CO
3. Este método fue introducido por
Steemann-Nielsen (Steemann Nielsen, 1952)para trabajar con fitoplancton, pero con las de-bidas modificaciones, es usado con las comuni-dades bentónicas (Hill and Boston, 1991). Comoventaja respecto a otros métodos tradicionales(como cambios en el oxígeno disuelto), nos ofre-ce una mayor sensibilidad a menores tasas deproducción (Hunding, 1973; Stevenson, 1996).Este método también puede aplicarse al estudiode las algas microbentónicas (Blanck, 1988). Elmétodo aquí descrito es, salvo por algunas mo-dificaciones, el descrito por Romaní (Romaniand Sabater, 1997).
Medidas en campo y canales TécnicapH Elect. pH (WTW
© multiline P4)
Oxígeno disuelto Elect. de oxígeno (WTW © multiline P4))
Conductividad Elect. de conductividad (WTW © multiline P4)
Temperatura Sonda de temperatura (WTW © multiline P4)
Luz incidente LiCor © Quantum sensor (Li-192SB)
Luz subacuática LiCor © Quantum sensor (Li-192SB)
Velocidad del agua MiniAir2, SCHILTKNECHT ©
Análisis de laboratorio TécnicaAmonio Kit colorimétrico (Merck
©)
Fosforo reactivo soluble (SRP) Electroforesis capilar/ Kit colorimétricoNitrato Electroforesis capilar/ Kit colorimétricoCarbono total disuelto Valoración con H
2SO
4 de la alcalinidad
Tabla 1.Métodos empleadostanto en el campocomo en el laborato-rio, para la mediciónde los parámetrosfisicos y químicosdel agua de los ríos yde los canales, a lolargo de los experi-mentos.
21 Materiales y métodos
La incorporación de H14CO3, se determinó so-
bre cinco cristales, procedentes de cada canal.Los cristales eran incubados con la mismairradiancia (110 µE m-2s-1) y temperatura (17-19 ºC) que en el canal, durante una hora. Laincubación se realizaba en viales, con 4 ml deagua del canal correspondiente al vidriomuestreado, en un baño con temperatura con-trolada y agitación. El “quenching” (producciónde fluorescencia que no se deba a la radioactivi-dad de la muestra) y la incorporación nofotosintética de carbono, eran determinados concontroles sin luz, tapando los viales con papelde alumnio. De modo rutinario, se realizabancontroles muertos, añadiendo 200 µL deformaldehido al 40% a un par de viales, paraconocer si el protocolo era llevado a cabo co-rrectamente.
Las incubaciones se comenzaban a la mismahora en que se iniciaba el ciclo de luz en el sis-tema de ríos artificiales. Después de unapreincubación de 30 minutos, se adicionaba 1µCi de NaH14CO
3 (solución madre de 1 mCi mL-
1 de NEN Research Products© ) a cada vial. Tam-
bién se añadía la misma cantidad en viales 4 via-les sin muestra; se les añadía el líquido de cen-telleo y eran llevados a contar, para disponer delas DPM iniciales.
La incorporación se detenía al cabo de una hora,adicionando 0.3 ml de formaldehido al 40%. Elcarbono radioactivo no fijado era eliminadomediante evaporación en medio ácido (adicio-nando 150 µL de HCl al 40%), durante 8 horasen una placa calefactora a 85 ºC. Para incre-mentar la extracción del material fotosintetizadose añadía 1 ml de DMSO (Filbin and Hough,1983). Para finalizar se añadían 8 ml. de líquidode centelleo (Cocktail Biogreen, de Scharlau
©).
La radioactividad de la muestra era medida conun contador de centelleo sólido (Packard
© Tri-
carb liquid scintillation analyser).
Los cálculos del carbono orgánico incorporadoestán basados en la relación directa entre el 12Ctotal disponible y el incorporado y el 14C total yel incorporado, pudiendo expresarse del modosiguiente:
disponibleC
oincorporadC
disponibleC
oincorporadC
−−=
−−
14
14
12
12
Para el cálculo de la incorporación de carbono,se debe conocer la cantidad total de carbono dis-ponible. La fórmula usada para transformar lascuentas obtenidas en el contador, enmicrogramos de carbono fijados, por hora y cen-tímetro cuadrado, es:
a= factor corrector para las algas, por la preferencia a incorporar12C frente al 14Cb= desintegraciones por minuto de la muestrac= desintegraciones por minuto del control incubado sin luzd= carbono inorgánico total, disponibles en el agua de incubaciónen µg C mL-1
e= desintegraciones por minuto del carbono añadida por muestrainicialmente
2.3.3. Valoración de la actividad fotosintéticamediante fluorimetría
Un Fluorímetro de Amplitud Modulada(Photosynthesis yield analyzer MINI-PAM,WALZ, Effeltrich, Alemania), se utilizó de modoalternativo al 14C para valorar la respuesta de lafluorescencia durante la fotosíntesis (Samsonand Popovic, 1988; Schreiber and Bilger, 1993;Hofstraat et al., 1994; Karsten, 1996). Éste mé-todo, al no ser destructivo, permitía realizarmedidas repetidas sobre la misma muestra. Losparámetros F
0 (una medida de la fluorescencia
basal, que se relaciona con la cantidad total declorofila, y por extensión a la biomasa) y el ren-dimiento de fotones o “Yield” (se relaciona conel rendimiento fotosintético), se midieron sobrecinco cristales de cada canal (12 en total). Loscristales se muestrearon al azar, y las medidasde fluorescencia se realizaron en una placa dePetri, con la misma agua en que se encontrabany bajo la misma luz.
El fundamento en que se basan las medidas defluorescencia es el relatado a continuación: du-rante la fotosíntesis la luz es absorbida por lospigmentos de la antena y la energía de excita-ción es transferida a los dos fotosistemas (PSI yPSII). Los pigmentos de la antena, medianteexcitaciones y desexcitaciones transfieren laenergía de los fotones captados hacia los cen-tros de reacción (CR). Los electrones de lospigmentos que componen los centros de reac-ción, se encuentran en orbitales deslocalizados(p). Este hecho les confiere una gran eficienciapara la captura de la energía transferida desde
einiciales
doscurocontrol
cmuestra
ba
DPM
TICDPMDPM )(06.1 −=
Capítulo 2 22
los pigmentos de la antena. Los electrones deestos orbitales pueden experimentar una excita-ción, alcanzando los correspondientes orbitales(p*) más energéticos, cuando son iluminadoscon luz del espectro visible. Los electrones per-manecen en el estadio excitado durante el pe-riodo de vida (el tiempo necesario para que el63% de los electrones vuelvan al orbital de me-nor energía). Este retorno a sus orbitales origi-nales conlleva una emisión de energía que si noes transferida a otras moléculas, o usada en re-acciones, es emitida en forma de fluorescencia.Ésta, será siempre de menor energía que la luzde excitación.
Cuando un sistema fotosintético es expuesto ala oscuridad, la cooperación entre los dosfotosistemas se pierde. El sistema fotosintéticose encontrará en el “estado I”, con todos los cen-tros de reacción abiertos (esperando la llegadade fotones). Al volver a iluminar, la emisión defluorescencia seguirá una cinética llamada “efec-to Kautsky”(Figura 3). Se pueden distinguir dosfases: una fase de emisión rápida de fluorescen-cia (Fm), que se completa en un tiempo de 100a 500 milisegundos, y una segunda fase en quela fluorescencia decrece lentamente (Fd), hastaun estadio estacionario (Figura 3). En célulastotalmente funcionales, esta fase lenta se lleva acabo en un tiempo de 3 a 5 minutos. Una vezalcanzado el estadio estacionario, todos los cen-tros de reacción se encontrarán cerrados “esta-
do II” (todos habrán recibido fotones). En esemomento la actividad fotosintética habrá alcan-zado el máximo rendimiento.
La fluorescencia en el nivel basal se denomina“fluorescencia constante” y proviene de las mi-graciones energéticas que se danespontaneamente (sin necesidad de luz), en lospigmentos de la antena. Este valor se puede re-lacionar con la biomasa o con la concentraciónde pigmento. En cambio la “fluorescencia va-riable” Fv, la que se mide entre F
0 y Fm, solo es
detectable cuando las células realizan la foto-síntesis. En el punto de máxima fluorescencia,todo el pool de moléculas transportadoras deelectrones, se encuentran reducidas (cargadascon electrones), los centros de reacción del PSII,se encuentran cerrados.La técnica que basándose en estos procesos midelos parámetros citados anteriormente se deno-mina “Pulse Amplified Modulation ChlorophyllFluorometry”; (PAM). Los fluorómetros soncapaces de registrar la dinámica de la emisiónfluorescencia, pero para poder medir la F
0 ha sido
necesario combinar el método del pulso de sa-turación con las técnicas de modulación de fluo-rescencia (Schreiber and Bilger, 1993). En estatécnica la luz para la medición de la fluorescen-cia es aplicada separadamente de la luz actínica(la usada para realizar la fotosíntesis). De estemodo, se puede trabajar con luz natural, sin quesea necesario un periodo previo de oscuridad.
F0
Fm
Estado II
3 minutos0.3 seg.
LUZOSCURIDAD
Figura 3.Cinética de la emisión defluorescencia de la cloro-fila (efecto Kautsky), des-pués de iluminar una hojaexpuesta anteriormente aoscuridad (Lichtenthalerand Rinderle 1988).
23 Materiales y métodos
La emisión de fluorescencia es provocada me-diante pulsos de luz cortos de baja intensidad.Gracias a un sistema de amplificación selecti-va, solo la fluorescencia provocada por estospulsos es registrada, obteniendo la F
0 (ver figu-
ra 4). Cuando se aplica la luz actínica, se obtie-ne entonces la cinética del efecto Kautsky(Gently et al., 1989).
En el método del PAM pueden distinguirse di-ferentes fases (ver figura 4). Al inicio del méto-do, los parámetros F
0 y Fm son definidos usan-
do luz modulada (ML) y un solo pulso saturante(SP) respectivamente. Luego, la muestra es ilu-minada con luz actínica (AL) obteniendo el“efecto Kautsky”. En el estadio estacionario (F),Fm’ es calculada emitiendo otro pulso saturante(SP) que se añade a la luz actínica. Finalmentela fuente de luz actínica es apagada, y se ilumi-na la muestra con infrarrojo, hasta alcanzar F
0’.
La eficiencia fotosintética del PSII, por fotónabsorbido, se calcula a partir de la siguiente ex-presión (Gently et al. 1989):
m
m
m
m
m
mPSII F
FF
FF
FFx
F
FF
'
'
''
'
'
''
0
0 −=
−−−
=Φ
Considerando que el flujo de electrones del PSIy el PSII, una vez alcanzado el estadio estacio-nario, es igual, y que no hay deficiencias, nidaños estructurales en el resto del sistema
fotosintético, se puede asumir que el valor defPSII
es un buen estimador de la eficiencia del flujodel transporte de electrones en el aparatofotosintético.
El rendimiento fotoquímico del centro de reac-ción del PSII abierto, resulta del cálculo f
Po=
Fv/Fm. Es equivalente al producto de la proba-bilidad de transferencia de la excitación entre laantena y el centro de reacción del PSII, y vice-versa. El valor obtenido de f
Po nos proporciona
una idea de la función fotosintética potencial.Aporta información sobre el inicio de las reac-ciones fotoquímicas, pero no ofrece informaciónsobre el proceso completo.
Las aplicaciones de la fluorimetría de amplitudmodulada en estudios ecotoxicológicos son nu-merosas. Los organismos fotosintéticos, por sufijación al sustrato (dependiendo de los taxones),por su facilidad de recolección y por ser la basede las cadenas tróficas de los ríos se conviertenen “registros” de los eventos ocurridos en untramo cualquiera. Además, el PAM realiza unaintegración del estado de todos los organismosfotosintéticos cuya fluorescencia es capaz decaptar. Gracias a este método, cualquier productocuyo efecto tóxico sobre los organismosfotosintéticos sea el de alterar la fotosíntesispodrá ser estudiado. Este método nos permitirávalorar el estado fisiológico instantaneamente,valorando tanto la respuesta frente a exposicio-
Tiempo
Fm
Fm Fv
Fv’
F F
0
F0’
ML SP AL SP -AL +FR
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
Figura 4.Cinética de la emisiónde fluorescencia du-rante el desarrollo de latécnica de “PulseAmplified ModulationC h l o r o p h y l lFluorometry” (VanKooten and Snel1990).
Capítulo 2 24
nes breves al tóxico, como frente a exposicio-nes crónicas.
Es importante tener en cuenta que necesitare-mos siempre la referencia del estado fisiológicode la comunidad, anterior a la exposición, parapoder establecer comparaciones. Otro tipo decomparaciones seran las que se podrán estable-cer entre diferentes comunidades.
2.3.4. Composición y estructura de las comu-nidades microfitobentónicas
Para el estudio de la comunidad se conservaron2 cristales de cada canal, en 2 ml de formol al4%, tomados a lo largo del experimento. La com-posición de la comunidad y su estructura fuecaracterizada después de sonicar los sustratosde vidrio, durante 2 periodos de 2 minutos(Sabater et al., 1998).
Un mínimo de 400 células fue contado e identi-ficado en cada muestra, usando la técnica deUtermöhl. Los diferentes taxones se clasifica-ron, además, en diferentes clases, atendiendo asu morfología y fijación al sustrato (Gregory,1983).
2.3.5. Observaciones con Microscopio Elec-trónico de Scanning
En algunos de los experimentos se realizaronobservaciones con un microscopio de Scanning,HITACHI
© S-2300. Para este proposito se fija-
ron las muestras seleccionadas (cristales con lacomunidad adherida) con gluteraldehido al2.5%, en tampón fosfato de pH 7.5 y conserva-das en oscuridad. Posteriormente las muestrasse liofilizaron y fueron recubiertas mediante unelectrodo de sublimación de carbono y oro.
2.4. Confección de curvas dosis-respuesta, ycálculos de EC50, N.O.E.C. y F.E.C.
Para los distintos experimentos, se aplicó unmodelo de regresión entre la concentración deltoxico empleado (en escala logarítmica) y labiomasa (representada por la concentración declorofíla-a) o actividad algal (representada porla incorporación de carbono o el rendimientode fotones, dependiendo del método empleado),para calcular la NOEC (“Non Observed EffectConcentration”) y la EC
50 (“Effective
Concentration” que provoca una reducción del50% del parámetro estudiado). La NOEC sedeterminó mediante interpolación lineal de larecta de regresión, con la media de los canalescontrol. La FEC (“First Effect Concentration”),mediante interpolación lineal de la recta de re-gresión y el límite inferior de confianza de loscanales control. La EC
50 se determinó mediante
interpolación lineal de la recta de regresión, conel punto en el que el parámetro utilizado pre-sentaba la mitad del valor medio medido res-pecto a los canales control (ver gráfica 1). Dadala importancia de todos estos parámetros en lagestión y estudio de los sistemas naturales han
1 0 1 0 0
Fo
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0 Gráfica 1.Valor de la F
0 versus con-
centración de tóxico (ejeY). La NOEC se deter-minó medianteinterpolación lineal dela recta de regresión, conla media de los valoreesen los canales control. LaFEC, mediante lainterpolación de la rectade regresión con el límiteinferior de confianza delos canales control. LaEC50 se determinó me-diante interpolación li-neal con el punto en elque el parámetro utili-zado presentaba la mi-tad del valor medio delos canales control.
NOEC FEC EC50
25 Materiales y métodos
sido definidos por la “Organization forEconomic Co-operation and Development”(OECD, 1984) e incorporados por numerosasagencias gubernamentales.
Estas son las herramientas que permiten com-parar la respuesta de las diferentes comunida-des, o valorar la evolución de una comunidad alo largo del tiempo. La NOEC es la concentra-ción que no provoca efectos mensurables sobreel parámetro estudiado y el FEC, es la concen-tración en la que comienzan a ser mensurableslos efectos sobre el parámetro estudiado. Estosdos parámetros son los que podrían servir comoreferencia para administraciones públicas y ges-tores a la hora de establecer los límites de losdiversos productos en el medio natural. Los va-lores de EC
x en cambio, serán valores de utili-
dad a la hora de conocer la respuesta de los di-ferentes taxones o comunidades ante un tóxico,lo que permitirá establecer prioridades de pro-tección.
2.5. Herramientas estadísticas
Las diferencias de los parámetros estudiados enlos diferentes tratamientos, se valoraron usandoun análisis de la varianza (ANOVA), de medi-das repetidas (Winer, 1971). El fin de los expe-rimentos era siempre el de detectar diferenciasentre los diferentes tratamientos, entre el expues-to al tóxico y el control, para poder atribuir altóxico el efecto observado. En los experimen-tos de interacción el fin era detectar diferenciasentre el control, el expuesto al tóxico y el ex-puesto al tóxico y al factor estudiado. De esemodo podríamos demostrar una modulación porparte del factor sobre el efecto que tiene el tóxi-co. Cuando las diferencias eran significativas,la comparativa múltiple se llevaba a cabo conun test TUKEY HSD o LSD (Winer, 1971).Todos los cálculos se llevaron a cabo con el pro-grama STATISTICA (versión 4.B de StatsoftInc.
©, 1993). Los parámetros estudidados fue-
ron la incorporación de carbono, el rendimientode fotones, la concentración de clorofila, la efi-ciencia fotosintética (expresada como el cocienteentre µg C incorporado/µg de Chl-a) y losbiovolumenes de los taxones.
Capítulo 2 26
27 Fotografías
FOTOGRAFÍAS
Foto 1. Sistema de canales artificiales. Las fotos mostradas permiten que de una ojeadapuedan conocerse los métodos de trabajo (canales artificiales y soportes de colonización)descritos en este capítulo. El orden en que se muestran guarda relación con la secuenciatemporal de trabajo. La primera tarea fue siempre la preparación y puesta a punto del sistemade canales de acuerdo con el diseño del experimento diseñado. Sobre las dos mesas seencuentran dispuestos 12 canales de metacrilato, alimentados mediante 4 goteros (los tu-bos delgados que parten de la tubería negra que cruza ambas mesas). A la izquierda seobserva el tanque de recepción del agua que provenía de un pozo cercano. En el suelo ydebajo de la mesa, encontramos el tanque de solución de tóxico (agua con cobre o atrazina)y el canal de desagüe de los canales. Sobre la mesa de la derecha se situa la bomba peristálticaque inyecta el tóxico en los canales correspondientes a los tratamientos con tóxico. Lailuminación corre a cargo de 16 focos halógenos de 500 W.
Capítulo 5 28
2
Fotos 2 y 3. Soportes de metacrilato con los sustratos artificiales de vidrio. El siguiente paso en la experimen-tación consistía en depositar los soportes en lugares apropiados del río estudiado. Tras un periodo decolonización variable, dependiendo de la época del año, se recogían y se transportaban en recipientes conagua del propio río hasta el laboratorio. El tono pardo de la foto superior se debe a la colonización de lasdiatomeas. En la foto inferior se puede observar en cambio una colonización dominada por las clorofíceas,de ahí el tono verdoso del soporte. En amba fotografías, pueden observarse además invertebrados y restos dela actividad de estos.
3
2
29 El caso del río Tinto
Fotos 4, 5 y 6. Una vez en el laboratorio loscristales colonizados eran extraídos de lossoportes y se colocaban en los canales. Enlos experimentos a largo plazo, el reparto delos cristales por los canales se realizaba alazar (Foto 4), disponiéndolos en grupos de54 (Foto 6) y colocando cristales grandes en-tre estas agrupaciones para mantenerlos ensu sitio y proporcionar una superficie homo-génea. Estos cristales grandes también se co-lonizaban en el mismpo punto que los pe-queños. El tipo de colocación dependía delexperimento. Si el tipo de experimento era dedosis-respuesta, en cada canal se exponíancristales colonizados en diversos puntos aconcentraciones diferentes de tóxico. Por ellose colocaban únicamente 5 cristales por pun-to y claramente separados (Foto 5).
6
4 5
Capítulo 5 30
Fotos 7, 8 y 9. Una vez que los cristales se habían colocado en los canales habia un periodo de aclimatación.Durante este tiempo crecía la comunidad, homogeneizándose la superficie por la que discurría el agua ylogrando de ese modo reducir la varianza entre réplicas. El tipo de circulación del agua dependía del tipo deexperimento. Se utilizaba un circuito abierto (Foto 7) en los experimentos a largo plazo, pero en los de dosisrespuesta se utilizaba un circuito cerrado (Foto 8), que reutilizaba el agua con el tóxico empleado paraasegurar la exposición a una concentración constante de tóxico. En la foto 7 se observa como el agua de loscanales se desagua al final, en cambio en la 8 el agua se recoge en una garrafa donde una bomba impulsa denuevo el agua hasta el inicio del canal. Estas garrafas se mantenían a temperatura constante mediante unbaño termostático, y el pH se controlaba mediante adición de ácido clorhídrico diluido. Una vez transcurridoel periodo de aclimatación se comenzaba con el experimento, exponiendo a la comunidad a los factores aestudiar y recogiendo muestras (Foto 9) para trabajar con ellas. La selección de los cristales a muestrear serealizaba aleatoriamente.
9
7 8
31 El caso del río Tinto
Fotos 10 y 11. Para la valo-ración de la fotosíntesis seutilizaron dos metodologías,la primera basada en la utili-zación de carbono 14 (Foto10), donde era necesario in-cubar las algas en presen-cia de este isótopo del car-bono. Para ello se disponíade un baño termostático yun agitador que evitaba laformación de gradientes so-bre las algas. Cada muestra(soporte de cristal) se intro-ducía en un bote de vidriodonde se añadía una canti-dad conocida del isótopo.La otra metodología emplea-ba un fluorímetro (Foto 11)que, basándose en la emi-sión de pulsos de luz, eracapaz de medir ciertosparámetros relacionadoscon el funcionamiento delaparato fotosintético de lasalgas.
10
11
Capítulo 5 32
33 Capítulo 3
INFLUENCIA DE LA VELOCIDADDEL AGUA EN EL EFECTO TÓXICO
DE LA ATRAZINA SOBRE LAS CO-MUNIDADES MICROBENTÓNICAS
3.1. Introducción
La atrazina es uno de los pesticidas cuyos efectos sobre los ecosistemas acuáticos continentalesestán más estudiados. La mayoría de los estudios se centran en cómo afecta a la estructura ycomposición de las comunidades algales a corto (agudo) o largo plazo (crónico), y en la modula-ción del efecto de la atrazina por parte de algunos factores ambientales y químicos, incluyendootros tóxicos (Huber, 1993, Solomon et al., 1996). Se desconoce cómo la velocidad del agua puedealterar la respuesta ecotoxicológica de las comunidades. En este capítulo se propone determinar sila velocidad incrementa el efecto tóxico de la atrazina o si contrariamente, no influye en elfuncionamientode las comunidades algales microbentónicas.
Desde hace tiempo se conoce que (dentro de un rango de 0 a 50 cm s-1 y en aguas oligo y mesotróficas)a mayores velocidades del agua corresponden mayores crecimientos algales (Whitford andSchumacher, 1964, McIntire, 1966, Horner et al., 1983, Welch et al., 1988). Para explicar estosresultados, Horner y Welch (Horner and Welch, 1981) proponen algunos mecanismos dependien-tes de la velocidad, para explicar el desarrollo algal. A mayor velocidad el grosor de la capa límitedisminuye (Geankopolis, 1972, Grady and Lin, 1980, Sand-Jensen, 1983, Stevenson, 1983). Comoresultado de esto, disminuye el gradiente de difusión a través de la capa límite, facilitando ladifusión de nutrientes desde las capas de agua más alejadas de la superficie celular, hasta las capasque están en contacto con la célula y de donde son incorporados por las células en crecimiento.Este efecto parece ser significativo a partir de 15 cm s-1 (Whitford and Schumacher, 1964). Si estoocurre con los nutrientes, es lógico pensar que también ocurrirá con los tóxicos. A mayor veloci-dad, mayor disponibilidad de tóxico. Si una comunidad se expone a una concentración de 20 µg L-
1 de atrazina, a velocidades de 1 cm s-1, y 15 cm s-1 la biodisponibilidad del tóxico habrá sidomayor en el caso de 15 cm s-1. Según Huber (1993), la concentración de 20 µg L-1 de atrazina es elumbral en el que numerosos autores sitúan la transición entre el NOEC y los primeros efectossobre determinados taxones. Por ese motivo utilizaremos esta concentración en este experimento.
Al utilizar una combinación de las velocidades 1 y 15 cm s-1 y las concentraciones 0 y 20 µg L-1 deatrazina estamos combinando los dos umbrales de aparición de efectos para ambos factores: el dela velocidad, ya que incrementa la biodisponibilidad de solutos y el de la atrazina, ya que a partirde esta concentración empiezan a observarse los primeros efectos sobre los organismos. De estemodo si aparece realmente una mayor tolerancia a una mayor velocidad se demostrará lo impor-tante que es la interacción de estos dos factores, ya que no será necesario encontrarse grandesconcentraciones de atrazina o velocidades para que este efecto comience a resultar un agente mo-dificador en el desarrollo de las comunidades algales.
¿Cómo comprobar nuestra hipótesis? Blank et al. (Blanck and Wängberg, 1988) propusieron unmarco teórico denominado PICT (Pollution Induced Community Tolerance) que predice el efectode sustancias tóxicas en comunidades de perifiton. El PICT se basa en tres principios:1) La sensibilidad de los individuos y especies que componen una comunidad, frente a una sus-
tancia tóxica es diferente.
Capítulo 3 34
2) Cuando la concentración de la sustanciatóxica excede el nivel necesario para afec-tar a alguno de los individuos, el tóxico co-mienza a comportarse como un agenteestructurador de la comunidad. Los indivi-duos más sensibles de la comunidad des-aparecen, incrementando de este modo latolerancia global de la comunidad frente altóxico.
3) Este incremento en la tolerancia de la co-munidad podrá ser valorado mediante testsfisiológicos.
Basándonos en el concepto propuesto por elPICT, la tolerancia tras la exposición a la atrazinadebería incrementarse, y más aun en el caso deltratamiento con velocidad. Lo que se proponepor tanto, es la valoración del incremento detolerancia que esta exposición diferencial a laatrazina debería producir en las comunidades,con la salvedad de que esta exposición diferen-cial no será debida a diferentes concentracionesde atrazina, sino a la interacción de una mismaconcentración de atrazina con dos velocidadesdel agua diferentes.
3.2. Material y métodos
Los sustratos fueron precolonizados en la rierade L’Avencó, durante 15 días. Tras este perio-do, se dejó un tiempo de aclimatación de 7 díasen los canales artificiales bajo las dos diferentesvelocidades pero sin añadir la atrazina. Despuésy durante los 14 días restantes se mantuvieron 8canales con los siguientes tratamientos: 2 conuna velocidad de 1 cm s-1 y 0 µg L-1 de atrazina[C]; 2 con una velocidad de 1 cm s-1 y 20 µg L-1 de atrazina [Atr]; 2 con una velocidad de 15cm s-1 y 0 µg L-1 de atrazina [V]; velocidad de15 cm s-1 y 20 µg L-1 de atrazina [V+Atr]. Lavelocidad en los canales se valoró mediante adi-ción de cloruro sódico (Marti and Sabater, 1996).El agua que alimentaba los canales procedía deun pozo. La conductividad era elevada ,1900 µScm-1 ligado a una alta concentración de sulfatosy cloruros, los nutrientes también 65-70 mg L-1
de nitratos, 2.5-5 µg L-1 de fosfatos, y el nitritoy el amonio por debajo del límite de detección
[<0.01 mg L-1]. La iluminación se realizó me-diante lámparas halógenas de 500 W, que pro-porcionaban una irradiancia a nivel del aguasuperior siempre a 100 mE m2 s-1. El fotoperiodose ajustó a 8 horas de luz y 16 de oscuridad. Latemperatura del agua se mantuvo constante [20±0.7 ºC].
Se pretendía observar como la interacción deltóxico y la velocidad afectaban a la sensibilidadde las comunidades microbentónicas. Se valoróla incorporación de de 14C en forma deNaH14CO
3 [ver capítulo 1] al inicio y al final
del periodo de exposición. Se realizó un test dedosis-respuesta frente a la atrazina, valorándo-se la incorporación de 14C en forma deNaH14CO
3. Se preparó un banco de diluciones
de atrazina (Gustavson and Wangberg, 1995) de0, 40, 200, 1000 y 4000 µg L-1, a las que se ex-pusieron 10 sustratos [de 1 cm2 cada uno] decada tratamiento.
Se seleccionaron al azar los sustratos de cadatratamiento, y se preincubaron durante una horaen viales con 30 ml. de agua de su propio canal.Después se añadieron 30 ml. de las solucionesde atrazina, logrando así unas concentracionesde 0, 20, 100, 500 y 2000 µg L-1 de atrazina y 1µCi de 14C en forma de solución acuosa deNaH14CO
3. Pasada una hora se interrumpió la
incorporación de carbono matando a las algascon 300 µL de Formol 40%. El cálculo de lasEC
50 se detalla en el capítulo 1.
3.3. Resultados
Tras una exposición de 14 días a 20 µg L-1 deatrazina, la incorporaciones de carbono y lasEC
50 obtenidas fueron las indicados en la tabla
1. La mayor EC50
es la presentada por el trata-miento expuesto a atrazina y a una mayor velo-cidad del agua. Es además el que presenta unincremento proporcional mayor (más de 22 ve-ces el valor inicial) de la incorporación de car-bono mayor los 14 días de exposición. El restode tratamientos incrementan su incorporaciónentre 2.1 y 6.7 veces. La respuesta
Tratamiento Día 0 Día 14 EC50
R2 de EC50
Incorporación 14C [mmmmmg C cm-2 h-1]
[mmmmmg L-1 de atrazina]Control 0.72 ± 0.3 4.82 ± 0.81 656 0.82Atrazina 4.01 ± 3.1 8.67 ± 0.81 507 0.98Velocidad 3.56 ± 1.3 10.17 ± 1.6 382 0.91Velocidad y atrazina 0.39 ± 0.5 8.87 ± 0.53 717 0.88
Tabla 1.Resultados delexper imento,tras 14 días deexposición
35 Atrazina y velocidad
ecotoxicológica de las comunidades frente a unbanco de concentraciones crecientes de atrazina,se puede observar en la figura 1. Es el test dedosis-respuesta. La menor EC
50 es la presenta-
da por el tratamiento de velocidad de 15 cm s-1
y no expuesto a atrazina.
3.4. Discusión
Los resultados confirman la hipótesis inicial. Esdecir, al comparar entre los tratamientos expues-tos a la atrazina, el que presenta una mayor to-lerancia es el expuesto también a una mayorvelocidad. A pesar de haber estado expuesto ala misma concentración de atrazina, la toleran-cia del tratamiento con 15 cm s-1 es un 41% su-perior al tratamiento expuesto a una velocidadde 1 cm s-1 [717 frente a 507 µg L-1 de atrazina].
Si comparamos entre los tratamientos de 1 cms-1, según el PICT-CONCEPT, el tratamientoexpuesto a atrazina debería presentar una ma-yor tolerancia, pero no es así. Se ha descrito quelos nutrientes son un factor que protege ante laatrazina (Barreiro and Pratt, 1994) y dada la altaconcentración de nitratos y la moderadamentealta de fosfatos en el agua utilizada, podemospensar que ha sido un factor importante en lamayor tolerancia que presenta el tratamiento noexpuesto a atrazina. Otro aspecto a tener en cuen-ta, a la hora de explicar la mayor tolerancia, se-ría la de la selección positiva que ejerce la ex-posición a la atrazina sobre los individuos quepresenten mutaciones favorables. Una de estasposibles mutaciones en el gen psbA es la quereduce enormemente la afinidad de la proteínaD1 [parte de la Q
[b]] por la atrazina (Hirshberg
Figura 1.Detalle de lostests de dosis-respuesta. En al-gunos casoscabe destacar elincremento quese observa a ba-jas concentra-ciones deatrazina.
Test dosis-respuesta deltratamiento control (C)
µg L-1de atrazina
0 0.1 1 10 100 1000
% d
e in
corp
orac
ión
de c
arbo
no r
espe
cto
ala
con
cent
raci
ón 0
de
atra
zina 0
25
50
75
100
125
150
Test dosis-respuesta deltratamiento atrazina (Atr)
0 0.1 1 10 100 1000
0
25
50
75
100
125
150
Test dosis-respuesta deltratamiento velocidad (V)
0 0.1 1 10 100 1000
0
25
50
75
100
125
150
µg L-1de atrazina
Test dosis-respuesta deltratamiento atrazina y velocidad (Atr+V)
0 0.1 1 10 100 1000
0
25
50
75
100
125
150
Capítulo 3 36
and McIntosh, 1983). Esta mutación proporcio-naría a sus poseedores una ventaja ante el restode individuos, facilitando su crecimiento.
Numerosos factores relacionados con laeutrofización y polución [PO
4-P, NH
4-N, NO
3-
N, atrazina], han demostrado estar relaciona-dos con la sensibilidad de las comunidades frentea la atrazina (Guasch and Sabater, 1998). Tam-bién, factores propios de la dinámica del biofilm,como la sucesión de especies y la edad de lacomunidad pueden modificar la tolerancia frentea la atrazina (Guasch et al., 1997). Un factorclave como la irradiancia, ha demostrado tam-bién ser un factor importante en el incrementode la tolerancia frente a la atrazina (Mayasich etal., 1986, Millie et al., 1992, Guasch et al.,1997). Todos estos resultados indican que todaslas variables que intervienen en el desarrollo delas comunidades algales son susceptibles de al-terar de algún modo la sensibilidad de las co-munidades frente a los tóxicos.
Generalmente en estos estudios la velocidad hasido utilizada más como un descriptor de lospuntos de muestreo que como una variable deestudio. Shriner y Gregory (1984) no recomien-dan un especial cuidado en la elección de la ve-locidad del agua. Nuestros resultados demues-tran que la velocidad debe ser tenida en cuentacomo una variable clave más de los estudios,por las repercusiones que tiene tanto en el desa-rrollo de las comunidades como en la modifica-ción (a través de cambios en labiodisponibilidad) del efecto de los tóxicos.
Un aspecto a destacar en las gráficas de los testsde dosis respuesta, es el incremento -a bajas con-centraciones de atrazina- en la incorporación decarbono que experimentan los tratamientos con-trol y atrazina-velocidad. Hay varias hipótesispara explicar este fenómeno que se basan en lacompetencia. La atrazina detiene el flujo de elec-trones entre el PSI y el PSII, inhibiendo la rege-neración de NADPH desde NADP+. SinNADPH la fijación de carbono en el ciclo deCalvin es impedida. La fotosíntesis en las espe-cies o individuos más sensibles se interrumpe.A corto plazo en estas células dejan de funcio-nar los mecanismos que requieren energía, comola incorporación de CO
2 y nutrientes (Schubnell
et al., 1999); lo que puede beneficiar a otras al-gas con las que competían, las cuales de repentetienen a su disposición muchos más recursos.
Los estudios de la sensibilidad de las comuni-dades algales frente a los tóxicos y el papel quejuegan los factores ambientales, son una buenamanera de complementar los índices basados enla taxonomía. Estos índices han sido adoptadospor numerosos gobiernos como método de con-trol y gestión de la calidad del agua (Whitton etal., 1991, Prygiel and Coste, 1993, Whitton andRott, 1996). Esta metodología se basa en la res-puesta diferencial de las especies frente a untóxico, siendo unas más tolerantes que otras.Esto nos permite inferir la calidad del agua apartir del conocimiento de las especies que seencuentren en ella. Pero numerosos factorespueden modificar al efecto que el tóxico tengasobre las especies, modificando por tanto el re-sultado de nuestros índices. Gracias a resulta-dos como los que aquí se presentan, los usua-rios y creadores de esos índices podrán dispo-ner de una base de conocimientos más ampliapara su aplicación e interpretación.
37 Capítulo 3
INFLUENCIA DE LA VELOCIDADDEL AGUA EN EL EFECTO TÓXI-CO DEL COBRE SOBRE LAS CO-
MUNIDADESMICROBENTÓNICAS
3.5. Introducción
La velocidad del agua es un factor determinante en la distribución de los organismos en losecosistemas lóticos (Stevenson, 1996). Este factor está relacionado, además, con el acúmulo debiomasa (Biggs, 1996), con el tipo de forma vital del perifiton (Biggs et al., 1998) y con lasinteracciones entre algas y herbívoros (Poff and NelsonBaker, 1997). Las respuestas a corto plazodel perifiton ante un incremento de la velocidad son principalmente fisiológicas. Existen abundan-tes trabajos que evidencian que un incremento del flujo de agua se traduce en una estimulación dela fotosíntesis (Pfeifer and McDiffett, 1975), incorporación de nutrientes (Whitford and Schumacher,1961, Lock and John, 1979) y respiración de las algas bentónicas (Whitford and Schumacher,1961). El incremento en la velocidad del flujo provoca una disminución en el grosor de la capalímite alrededor de las células que se traduce en una mayor tasa de renovación de los gases disuel-tos y del suministro de nutrientes (Stevenson and Glover, 1993).
El flujo de iones está relacionado también con los procesos de difusión (Maccrobie, 1974) y laincorporación o adsorción de otros elementos disueltos. De entre estos elementos disueltos, losmetales adquieren una especial relevancia a causa de su toxicidad potencial para las comunidadesde perifiton. La incorporación de metales se lleva a cabo mediante un mecanismo bifase (Genter,1996), la primera es principalmente física (bioadsorción) mientras que la segunda depende delmetabolismo. Durante la segunda fase la incorporación de metal está gobernada tanto por el coefi-ciente de difusión como por el área y grosor de la pared celular implicada, de acuerdo a la primeraley de Fick (Mason and Jenkins, 1995). La incorporación se relaciona por tanto con el grosor de lacapa límite y esta con la velocidad del agua. Estas consideraciones nos llevan a sospechar que laincorporación de metales pesados por parte de las algas estará relacionada con la velocidad delagua y que este factor puede modular el efecto de una cierta concentración de metal sobre lacomunidad algal. Aunque las bases físicas para el efecto de la difusión en la incorporación demetales están bien establecidas (Mason and Jenkins, 1995), las implicaciones ecológicas para lascomunidades algales no han sido exploradas. El establecer y demostrar la relación entre la veloci-dad del agua y el efecto tóxico del cobre, comportará grandes implicaciones en la predicción de latoxicidad de los metales pesados sobre los ecosistemas acuáticos continentales.
En nuestro estudio se usó el sistema de canales artificiales, descritos anteriormente, para determi-nar como la variación de la velocidad del agua modifica el efecto del cobre sobre la estructura dela comunidad, sobre la biomasa y sobre la actividad fotosintética de una comunidad dominada pordiatomeas. Los canales proporcionan la oportunidad de aislar el efecto de las variables ambientalessobre las comunidades algales (McIntire, 1964, Lamberti and Steinman, 1993). Este trabajo secentró particularmente en el efecto, a corto y medio plazo, de concentraciones de cobre halladas enríos moderadamente contaminados. Aunque existen numerosos trabajos acerca del marcado efectoque el cobre tiene sobre la estructura de la comunidad algal y su metabolismo (Eichenberger et al.,1981, Leland and Carter, 1984, Leland and Carter, 1985, Pratt and Rosenberger, 1993), se ha
Capítulo 3 38
escrito muy poco acerca de los factores que pue-den modificar este efecto. Se llevaron a cabotres experimentos para demostrar cómo diferen-tes velocidades del agua (seleccionadas dentrodel rango de condiciones naturales), tienen unefecto diferencial en la respuesta de la comuni-dad algal frente al cobre. Se estudió, además,qué parámetros de la comunidad (funcionales yestructurales) fueron los más sensibles a esta va-riación de velocidades.
3.6. Material y métodos
Los experimentos fueron llevados a cabo du-rante la primavera y verano de 1997 en los ca-nales artificiales. Se usaron 12 canales con cau-dales de 1.5 L min-1. La profundidad del aguavariaba entre 0.1 y 1.4 cm. Al inicio del canal secolocó una pequeña cámara de mezcla para ho-mogeneizar el flujo y la mezcla con la soluciónde cobre. El agua de pozo utilizada tenía unaconductividad elevada 1900 mS cm-1, relacio-nada con altos niveles de sulfatos y cloruros),una baja concentración de fosfatos (2 mg P-PO
4)
y un nivel relativamente elevado de nitrato (13mg N-NO
3). La temperatura en los canales os-
ciló entre los 15 ºC del primer experimento ylos 21 ºC del último.
Variando la pendiente en los canales fue posi-ble regular la velocidad del agua. Las velocida-des en el primer experimento fueron de 1 y 15cm s-1; de 1, 20, 30 y 50 cm s-1, en el segundo yde 20 y 30 cm s-1, en el último. La velocidadmedia en los canales se calculo mediante adi-ción de cloruro sódico (Triska et al., 1989), usan-do el cambio en la conductividad a lo largo deltiempo. La estimación del número de Reynoldspara determinar el tipo de flujo (Allan, 1995),mostró que el flujo en todos los casos fue lami-nar (Re = 306-391). Los canales fueron ilumi-nados mediante lámparas halógenas (OSRAM
©
Haloline R7 s 230v-500W) que producían ra-diación activa fotosintéticamente (en el rangode 400 a 1000 nm). La irradiancia a nivel de lasuperficie del agua era de 110 mmol m-2 s-1. Elfotoperiodo fue ajustado a 8 horas de luz y 16de oscuridad.
El fondo de los canales fue completamente cu-bierto con vidrios matizados, que fueron pre-viamente colonizados en ríos prístinos (Fuirososy Avencó, NE España (descritos en Guasch etal., 1997), situados cerca del laboratorio (1 horaen coche). Los cristales se colocaron en racksde metacrilato y fueron situados en zonas decorriente de ambos ríos durante 2 semanas. Traseste período se transportaban al laboratorio y sesituaban en los canales. Los cristales coloniza-dos se dejaron durante una semana de aclimata-ción a las diferentes velocidades. Se usaron dostipos de sustratos; unos pequeños que servíancomo unidades de muestreo (1.2x1.2 cm) parala incorporación de 14CO
3 H, concentración de
clorofila-a y composición taxonómica. Otrosmayores (12x9 cm) se situaron entre los gruposde pequeños para asegurar la homogeneidad delfondo y mantener un mismo régimen de flujo.El diseño de los tres experimentos está detalla-do en la tabla 1.
La solución de cobre se preparó a partir de clo-ruro de cobre concentrado, Titrisol 1 g L-1 deMerck
©. Esta solución de cobre concentrado se
añadió mediante una bomba peristáltica duran-te 7 días. Las concentraciones de trabajo (15-30mg L-1 Cu son usuales en ríos moderadamentepolucionados del NE de España; valores de 120mg L-1 Cu han sido medidos en ríos muy conta-minados de la misma área geográfica (Armengolet al., 1993). La duración de la exposición alcobre (7 días en todos los casos) nos permitióvalorar los cambios a corto y medio plazo enparámetros estructurales y funcionales. Se re-cogieron muestras de agua para análisis de co-bre a las que se añadió 1% de ácido nítrico an-tes de congelarlas. El análisis de cobre (ICP-OES) confirmó la coincidencia entre las con-centraciones de cobre medidas en los canales yel cobre añadido nominal.
Los cambios en clorofila-a e incorporación decarbono fueron valorados en todos los canaleslos días 0, 1, 3 y 7 del experimento. La estructu-ra y composición de la comunidad se estudiólos días 0 y 7. Se recogieron 15 cristalesaleatoriamente, de cada canal. Ocho, para la in-
Experimentos Tratamientos Velocidad Cobre Controles Número réplicas Tipo diseño
Experimento 1 2 1-15 15 Si 3 factorialExperimento 2 4 1-20-30-50 15 - 3 exponencialExperimento 2 2 20-30 30 Si 3 factorial
Tabla 1.Descripción de losexperimentos; la ve-locidad se da en cms-1 y el cobre en µgL-1.
39 Cobre y velocidad
corporación de carbono (tres usados como con-trol incubados en oscuridad), cinco, para cloro-fila y dos para conocer la estructura de la comu-nidad. Se calculó el índice de Shannon-Wiener(Shannon and Weaver, 1963). Los biovolumenesse calcularon a partir de las estimas de 10 célu-las de cada taxon y usando las fórmulasgeométricas aproximadas de su forma (Lowe andLaliberte, 1996). Los taxones fueron agrupadosen función de su tipo de crecimiento, de acuer-do con su morfología y tipo de unión al sustrato(Gregory, 1983). Los métodos se describen enel capítulo 1.
La tolerancia de las comunidades al cobre(Blanck, 1988) fue valorada al final del primerexperimento, sobre una selección de sustratosseleccionados de los diferentes tratamientos. Lossustratos fueron expuestos a diferentes concen-traciones de cobre (30, 60 y 300 mg L-1 Cu) concinco réplicas por cada concentración, incluidala control ( 0 mg L-1 Cu). Se calcularon los va-lores de la EC
10 (Concentración Efectiva de co-
bre que reduce en un 10% el parámetro valo-rado) para la actividad fotosintética, medianteinterpolación log-linear (ver capítulo de méto-dos).
Las diferencias entre tratamientos se valoraron
examinando las diferencias en incorporación decarbono, (en relación al área y a la cantidad declorofila), y la concentración de clorofila usan-do una ANOVA de medidas repetidas (Winer,1971). Este tipo de ANOVA valora la depen-dencia del tiempo en las observaciones que ca-racterizan la secuencia temporal. La interacción(tiempo x tratamiento) muestra la diferencia através del tiempo causada por la adición de co-bre. Las diferencias significativas entre trata-mientos para la densidad algal, diversidad ybiovolumen de los taxones analizados fueronvaloradas en el día 7 mediante una one-way-ANOVA. Los valores de densidad algal, ybiovolumen fueron log-transformados para elanálisis. Las comparaciones múltiples entremedias fueron analizadas en todos los casosmediante una test TUKEY HSD (HonestSignificant Difference). Este tipo de test es apli-cable a un número relativamente amplio de si-tuaciones (Winer, 1971).
El diseño de los experimentos quería respondera varias preguntas:
1) ¿Modifica la velocidad el efecto tóxico delcobre sobre las comunidades de perifiton?
2) ¿Cómo se ve afectada la interacción obser-vada a diferentes velocidades del agua?
Control Cobre
Velocidad Cobre y Velocidad
holalsakj
Fotografias.Corresponden a los4 tratamientos el úl-timo día de experi-mentos.
100 µm
Capítulo 3 40
3) ¿Cómo se ve afectada la interacción obser-vada a diferentes concentraciones de tóxi-co?
El diseño de los experimentos se muestra en latabla 1. La elección de los parámetros de losexperimentos 2 y 3 se basó en los resultados del1 y del 2 respectivamente. La concentración decobre del p hrimer experimento se basa en lascaracterísticas de los ríos de la zona (Armengolet al., 1993).
3.7. Resultados
Clorofila- a. Experimento 1. Los canales con-trol con una velocidad de 15 cm s-1 mostraron elmayor incremento de clorofila-a tras los 7 díasdel experimento (Figura 1A).
Experimento 2. El único tratamiento que trassiete días de exposición incrementasignificativamente su concentración de clorofi-la es el de 20 cm s-1 (p=0.035). El resto se man-tiene como el primer día. La grafica (Figura1B) muestra una tendencia a incrementar la con-centración de clorofila en los tratamientos develocidades medias (20-30 cm s-1) y a la perdi-da de clorofila en los tratamientos de velocida-des bajas y altas (1-50 cm s-1).Experimento 3. En el tercer experimento nohubo diferencias significativas entre los trata-mientos de 20 y 30 cm s-1 (Figura 1C).
El cobre causó un descenso significativo en lacantidad de chl-a a través del tiempo en los ex-perimentos 1 y 3 (ANOVA de medidas repeti-das, p = 0.0001). Este efecto causó una reduc-ción en la concentración de clorofila de entreun 50% (exposición a 15 mg L-1 Cu) hasta un600% (exposición a 30mg L-1 Cu) en compara-ción con los controles (Figura 1). El efecto di-fiere entre las dos velocidades, tanto en el mo-mento en que aparece como en la magnitud. Enla exposición a 15 mg L-1 Cu (Experimento 1),la clorofila sufre un descenso significativodespues de 7 días a 1 cm s-1 (p=0.00015), perosolo después de tres días a 15 cm s-1 (p=0.00015)(Figura 1A). La exposición a 30 mg L-1 Cu pro-vocó el descenso en la concentración de cloro-fila después del tercer día, tanto a 20 como a 30cm s-1, en comparación con los controles(p=0.0354 y p=0.0188 respectivamente) (Figu-ra 1C). Por otra parte, no hay diferencia signifi-cativa en el descenso provocado por la exposi-ción a 30 mg L-1 Cu, entre el tratamiento a 20 o
a 30 cm s-1.
Incorporación de carbono cm-2. Experimento
1. La incorporación de carbono se incrementaun 300% al variar la velocidad de 1 a 15 cm s-1
tras siete días de experimento (Figura 2A).Experimento 2. Tras siete días de exposición los
Figura 1.Concentraciónde clorofila-a a lolargo de los tresexperimentos,los valores (ejeY) se dan enmicrogramos declorofila-a porcentímetro cua-drado.
0 1 2 3 4 5 6 7
0
6
12
18
24
v1v1-Cuv15v15-Cu
0 1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
1 cm s-1
20 cm s-1
30 cm s -1
50 cm s-1
A
B
0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
v20v20-Cuv30v30-Cu
C
días
41 Cobre y velocidad
0 1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
6
8
1 cm s -1
20 cm s -1
30 cm s -1
50 cm s -1
0 1 2 3 4 5 6 7
Díasµ
g C
cm
-2h-
1
0
2
4
6
8
1 cm s -1
1 cm s -1-15 µg L -1 Cu
15 cm s -1
15 cm s -1-15 µg L -1 Cu
A B1
0 1 2 3 4 5 6 7
0
3
6
9
12
20 cm s -1
20 cm s -1-30 µg L -1 Cu
30 cm s -1
30 cm s -1-30 µg L -1 Cu
C
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
día 0día 1día 3día 7
B2
díasdías
díasvelocidad
µg
C c
m-2
h-1
tratamientos expuestos a 15 µg L-1 de cobre(Figura 2B1) bajo velocidades medias (20 y 30cm s-1) han incrementado significativamente suincorporación de carbono (p=0.000174 y p=0.000177 respectivamente). El día 7 el trata-miento de 20 cm s-1 incorpora significativamentemás carbono que los de 1 cm s-1 y 30 cm s-1 (p=0.0002 y p= 0.0178 -test LSD- respectivamen-te). Tras siete días los tratamientos de 1 y 50 cms-1 no han variado su incorporación de carbonorespecto al día 0.
Experimento 3. Tras siete dias la incorporaciónde carbono no es diferente entre 20 y 30 cm s-1
(Figura 2C). Tampoco es diferente la incorpo-ración en los tratamientos expuestos a 30 µg L-
1 de cobre.
El cobre causó un descenso significativo de laincorporación a través del tiempo en los experi-mentos 1 y 3 (ANOVA de medidas repetidas
p=0.0001, 15 mg L-1 Cu; p= 0.009, 30 mg L-1
Cu). La exposición a 15 mg L-1 Cu causó unareducción del 47% en la incorporación en el día3 (p=0.02) a 15 cm s-1, pero la reducción no fuerelevante a 1 cm s-1 (p=0.167). La incorpora-ción de carbono a 1 cm s-1 solo fue afectada porel cobre tras siete días (p=0.0235). La exposi-ción a 30 mg L-1 Cu tiene un mayor efecto so-bre la incorporación (día 1 a 20 cm s-1, 30% dereducción, p=0.032; día 3 a 30 cm s-1, 47% dereducción, p=0.0273). Las diferencias entre losdos tratamientos y los controles en el segundoexperimento se mantienen desde el día 3 en ade-lante. No hay diferencias significativas entre lostratamientos expuestos a cobre a 20 y 30 cm s-1
(Figura 2C).
Incorporación de carbono (por unidad de clo-rofila- a). La incorporación por unidad de clo-rofila-a no fue afectada por el cobre (Figura 3)ni en el experimento 1 ni en el 3 (ANOVA de
Figura 2.Incorporación decarbono a lo lar-go de los tres ex-perimentos. Lagráfica B2 pre-senta la incorpo-ración de carbo-no en función dela velocidad deltratamiento, paracada díamuestreado.
Capítulo 3 42
medidas repetidas, p=0.142 y p=0.261 respecti-vamente). Sólo puede destacarse un ligero des-censo al final de los experimentos, más marca-do al final del experimento 3. Las diferenciassolo fueron significativas después de 7 días,entre los tratamientos a 20 y 30 cm s-1
(p=0.0115). En cambio en el experimento 2, trassiete días de exposición, la velocidad de 1 cm s-
1 incrementó significativamente la incorporaciónde carbono por unidad de clorofila(p=0.000257).
Estructura de la comunidad algal. Lasdiatomeas (Tabla 2) dominan la comunidad algalsiendo las especies colonizadoras mayoritariasen todos los experimentos. Las variaciones sig-nificativas del porcentaje del número de célulasde cada taxon se muestran en la tabla 4.
En el primer experimento, Achnanthesminutissima, Achnanthes lanceolata, Fragilariacapucina, Synedra ulna y Stigeoclonium tenuefueron los taxones dominantes. El incrementode la velocidad del agua de 1 a 15 provocó unincremento en el porcentaje de Synedra ulna,así como de las células basales de Stigeocloniumtenue (Tabla 3). La exposición a 15 mg L-1 Cu,causó una variación en la densidad de célulasde determinados taxones. Synedra ulna sufrióun descenso significativo a 15 cm s-1, mientrasque las células basales de Stigeoclonium tenuey Cocconeis pediculus experimentaron un in-cremento significativo, bajo la misma velocidad,que se vio reflejado en el porcentaje (tablas 2 y3). La exposición a cobre a 1 cm s-1 causó elincremento significativo del porcentaje deAchnanthes minutissima.
En el segundo experimento la comunidad estu-vo dominada por Achnanthes minutissima,Achnanthes lanceolata, una Chlorococcal y unaCianofícea. Mientras que algunas especies venincrementada su proporción en la comunidadconforme incrementa la velocidad a que sonexpuestas al cobre (Chlorococcal, Melosiravarians) otras sufren descensos (Achnanthesminutissima y Achnanthes lanceolata, esta demodo significativo).
La composición de la comunidad algal en el ter-cer experimento fue similar al primero. Las al-gas dominantes fueron Achnanthes minutissima,A. lanceolata y Stigeoclonium tenue (célulasbasales). Fragilaria capucina fue solo dominan-
te a 20 cm s-1 (Tabla 2). La exposición a 30 mgL-1 Cu causó un descenso en el porcentaje de A.minutissima, A. lanceolata y Synedra ulna.Fragilaria capucina incrementó en un 40% a20 cm s-1 (pero más del 1000% a 30 cm s-1) trasla exposición al cobre. Otros taxones mostraron
0 1 2 3 4 5 6 7
0.05
0.10
0.15
0.00
v1v1-Cuv15v15-Cu
0 1 2 3 4 5 6 7
0.0
1.0
2.0
3.0 v20v20-Cuv30v30-Cu
A
0 1 2 3 4 5 6 7
0.0
1.0
2.0
3.0 1 cm s -1
20 cm s -1
30 cm s -1
50 cm s -1
B
C
días
Figura 3.Incorporación de carbo-no en relación a la canti-dad de clorofila-a a lolargo de los tres experi-mentos. El eje Y repre-senta el cociente entremicrogramos de carbonoincorporados por hora ycentímetro cuadrado porcada microgramo de clo-rofila-a.
43 Cobre y velocidad
ligeras variaciones en su porcentaje, tras la ex-posición al cobre (Tabla 3). Considerando ladensidad de células, se encontró que los fila-mentos de Stigeoclonium tenue eran menosabundantes (p=0.049) a 30 cm s-1 tras la exposi-ción al cobre.
Diversidad. Hay también ligeros cambios en ladiversidad de las comunidades tras la exposi-ción al cobre. Se detectó un moderado incre-mento –aunque no significativo- del índice deShannon-Wiener, tras la exposición al cobre enlos experimentos 1 y 3 (Figura 4A y 4C). Encambio, en el experimento 2 todos los tratamien-tos causaron un descenso de la diversidad (67%a 1 cm s-1, 16 % a 20 cm s-1, 41 % a 30 cm s-1 ydel 18 % a 50 cm s-1), siendo significativos losdescensos a 1 y a 30 cm s-1 (p= 0.0000 yp=0.0031 respectivamente).
Biovolumen algal. En el experimento 1 el co-bre causó un descenso significativo delbiovolumen algal a 15 mg L-1, que fue más in-tenso a 15 que a 1 cm s-1 (p=0.0047 y 0.00024respectivamente). El cobre provocó una caidadel 80% a 1 cm s-1 y de más del 90% a 15 cm s-
1 (Figura 5A). Por otra parte, el descenso no fuetan marcado en el tercer experimento (entre el60 y el 85 %) (Figura 5C). La variación debiovolumen no fue significativa en los tratamien-tos expuestos a 30 mg L-1 a 20 y 30 cm s-1 res-pecto a los controles (p=0.61 y 0.41 respectiva-mente). Las diferentes velocidades tampocoafectaron significativamente al biovolumen to-tal en el experimento 3. La proporción de for-mas vitales no presenta grandes diferencias en-tre ninguno de los experimentos. Las formaspedunculadas fueron las dominantes en el ex-perimento 1, en el 2 fueron las postradas ypedunculadas, y en el 3, de nuevo, laspedunculadas. La proporción de las diferentesformas vitales no fue afectada por la exposicióna cobre o velocidad+cobre en ninguno de losexperimentos (Figura 5).
Test de dosis-respuesta. La tolerancia al cobrede las comunidades algales desarrolladas a 1 ya 15 cm s-1 , el primer experimento con 15 mgL-1 Cu, se valoró mediante un rango de concen-traciones de cobre (ver capítulo de métodos).No hay diferencias en la EC
10 a 1 cm s-1 entre la
comunidad expuesta al cobre (EC10
= 134 mg L-1 Cu) y la control (EC
10=135 mg L-1 Cu). Pero
las diferencias fueron mucho mayores entre lascomunidades desarrolladas a 15 cm s-1. Para lacomunidad expuesta a cobre se calculó una EC
10
de 268 mg L-1 Cu, mientras que para la no ex-puesta, fue de 126 mg L-1 Cu.
v1 v1-Cu v15 v15-Cu
0
1
2
3
A
v1 v20 v30 v500
1
2
3
B
v20 v20-Cu v30 v30-Cu0
1
2
3
C
Figura 4.Valores del Índicede Shannon-Wiener al final delos experimentos.
Capítulo 3 44
3.8. Discusión
Las concentraciones moderadas de cobre (15-30 mg L-1 Cu) tienen un efecto tóxico sobre lascomunidades de perifiton que se manifiesta enparámetros estructurales y funcionales. Estasconcentraciones reducen la concentración declorofila-a (Kaufman, 1982, Pratt andRosenberger, 1993), afectan a la productividadprimaria (Leland and Carter, 1985) y alteran lacomposición de la comunidad (Foster, 1982a,Foster, 1982b, Leland and Carter, 1985,Clements, 1991). Estos experimentos confirmanesos efectos y muestran que son aparentes trasperiodos de exposición relativamente cortos,entre 1 y 7 días, dependiendo del parámetro.
Existen varios mecanismos involucrados en laatenuación o amplificación del efecto tóxico delos metales pesados sobre el perifiton. Uno delos mecanismos de atenuación es la formaciónde trampas intracelulares como son los cuerposde polifosfatos que reducen, aunque a veces deun modo transitorio, la toxicidad de ciertos me-tales (Hashemi et al., 1994). Como el metal debeser transportado a través de la membrana, el gro-sor de ésta adquiere una importancia considera-ble (Admiraal et al., 1999). Relacionado con lasmembranas, los exopolímeros pueden actuarcomo protectores de las células (Hsieh et al.,1994, Loaëc et al., 1997). Finalmente, la incor-poración de metales puede ser afectada por labiodisponibilidad. Ésta dependerá de laespeciación del metal concreto en el medio, yde su complejación sobre la superficie de losorganismos o material particulado (Mason andJenkins, 1995). Además, y de modo puntual,otros factores pueden alterar la toxicidad de losmetales sobre los tapetes algales.
En el presente estudio se encontró que la velo-cidad del agua ejerce un efecto amplificador delefecto tóxico del cobre. Esta amplificación afectatanto a parámetros estructurales (clorofila-a,composición taxonómica y biovolumen) comoa funcionales (incorporación de carbono). En elprimero de los experimentos se demuestra quela exposición a 15 µg L-1 de cobre provoca undescenso en la incorporación de carbono res-pecto al control, siendo más precoz este descensoa 15 cm s-1 (en el día 3) que a 1 cm s-1 (en el día7). A pesar de estar expuestos a la misma con-centración, el efecto tóxico ha sido magnificadopor la velocidad. Este resultado sugiere la pre-
gunta de si ocurre lo mismo a todas las veloci-dades. Dado que al incrementar la velocidad seincrementa la disponibilidad, tanto de nutrientescomo de tóxicos, era interesante comprobar quétipo de dinámica seguiría esta interacción. Poreso se planteó el segundo experimento en quese expusieron las comunidades a 15 µg L-1 de
v1 v1-Cu v15 v15-Cu
0
1e+10
2e+10
3e+10
4e+10
5e+10
6e+10
7e+10
8e+10PostradasPedunculadasIncrustantesFilamentosas
v20 v20-Cu v30 v30-Cu
0
1e+9
2e+9
3e+9
4e+9
5e+9
6e+9
7e+9
A
1 20 30 50
0.0
2.0e+8
4.0e+8
6.0e+8
8.0e+8
1.0e+9
1.2e+9B
C
Figura 5.Porcentaje delbiovolumen (enmicrómetros cúbi-cos) de las diferen-tes formas vitalesal finalizar los ex-perimentos.
45 Cobre y velocidad
cobre a diferentes velocidades (1, 20, 30 y 50cm s-1). El resultado fue que el efecto del tóxicoes mayor a velocidades altas y bajas (50 y 1 cms-1) que a intermedias (20 y 30 cm s-1). Se puedeobservar una mayor incorporación de C a velo-cidades medias al observar la figura 2B2. Amedida que pasan los días los tratamientos de20 y 30 cm s-1 incorporan más carbono que elresto.
Para una velocidad de 20 cm s-1, el efecto tóxi-co de la exposición a 15 µg L-1 de cobre esmenor que para 1, 30 y 50 cm s-1. Uno de losmotivos que se pueden aducir es que al incre-mentar la velocidad se incrementa tanto labiodisponibilidad de tóxico como de nutrientes,y parece que en 20 cm s-1 podría hallarse la com-binación óptima entre la incorporación denutrientes y la de tóxico. En cambio al duplicarla concentración de cobre (30 µg L-1 ) ya noencontramos diferencias entre los tratamientos.El incremento de velocidad de 20 a 30 cm s-1,no tiene un efecto sobre la incorporación de car-bono (los controles muestran la misma incorpo-ración tras siete días) y la exposición a 30 µg L-
1 de cobre afecta por igual tanto a 20 como a 30cm s-1. Parece que se ha superado un umbral entreestos dos experimentos. Si a 20 cm s-1 se en-cuentra el óptimo para 15 µg L-1 de cobre, yano lo es para 30 µg L-1, porque no se diferenciade 30 cm s-1.
La exposición al cobre causó una reducción dela incorporación de carbono en todos los casos,encontrándose una mayor reducción a veloci-dades de agua mayores, tras 7 días de exposi-ción (Figura 2). La clorofila-a experimentó undescenso mayor y más precoz a mayores velo-cidades (Figura 1). El cobre afectó también albiovolumen de la comunidad algal a 1 y a 15cm s-1, pero este efecto no fue significante amayores velocidades. El hecho de que lainteracción entre cobre y el incremento de velo-cidad es positivo para parámetros estructurales,implica que el efecto sobre la comunidad algalno fue transitorio, sino permanente. Por otraparte, la diversidad y la proporción de formasvitales no reflejan el efecto de la interacciónentre cobre y velocidad. Se ha observado quelas pequeñas especies adnatas eran más toleran-
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3
velocidad cm s-1 1 1 15 15 1 20 30 50 20 20 30 30cobre ug L 0 15 0 15 15 15 15 15 0 30 0 30
Achnanthes lanceolata 3 10.2 0 10.2 0.5 9.3 4.2 2.3 19 7.5 17.8 7.6Achnanthes minutissima 1.6 17.7 1 5.6 89.0 71.2 73.5 57.4 43.7 36.6 60.4 45.5Amphipleura pellucida 0.1 0.0 0.1 0.2 0 0.1 0 0Amphora sp.Aphanothece sp. 0 0 1.3 0Ceratoneis sp.Characium sp. 0 2.5 0 0Chloroccal indet. 0.7 3.7 11.3 16.7 0.3 0.5 1.1 0.3Chroococcal indet. 6.3 0.5 5.3 5.1 1.3 0 0 1.5Cianoficea 2.9 7.8 1.7 9.1Cocconeis pediculus 0.3 1.7 0 2.9 0.1 0.1 0.1 0.2 0.6 0.5 0.4 0.5Cocconeis placentula 0.9 3.4 0 2.1Cymbella caespitosa 2.1 1.3 2.3 2.8Cymbella sinuata 0.3 0.0 0.1 0.0Cymbella minuta 0.1 0.2 0.3 0.6Fragilaria capucina 7.7 7.8 0 1.8 1.3 0.9 2.0 2.2 17.6 27.4 2.9 31.7Fragilaria construens 0.5 0.1 0.0 0.6 0 0.2 0 1.1Gongrosira incGomphonema acuminatum 0.1 0.1 0.1 0.2Gomphonema constrictum 0.5 0.1 0.2 0.8 0.2 0 0.1 0.1Melosira varians 0.1 0.5 0.3 0.9 0 0.4 0 0.2Nitzschia sp 0.2 0.1 0.2 0.1Navicula cryptocephala 0.0 0.1 0.6 0.5 0.2Oedogonium sp 5.5 0.1 1.9 0 0Phormidium sp. 0 0 0 0 0.1Scenedesmus sp 0 0 0.8 0 0.2 0.0 0.0 1.0 1.1 3.1 0 1.1Stauroneis phoenicenteron 0 0 0.2 0Stigeoclonium tenue (c.basal) 0.5 29.7 8.6 66.5 1.2 4.8 2.7 7.5 11.2 11.1 9.4Stigeoclonium tenue (filame.) 16.2 0 0.7 0 0.3 0.0 0.1 1.7 8.7 1.5 0.1Synedra ulna 60.6 19.6 82.4 5.9 0.0 0.2 1.1 4.1 1 3.7 0.1Ulothrix zonata 3 7 0 0 2.5 0 0 0
Tabla 2.Porcentaje del nú-mero de células delas diferentes es-pecies al finalizarcada experimento.
Capítulo 3 46
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3
velocidad cm s-1 1 1 15 15 1 20 30 50 20 20 30 30
cobre ug L 0 15 0 15 15 15 15 15 0 30 0 30
Achnanthes lanceolata 5.3 9.2 -5.5 1.7 -4.14 3.32 -0.12 -3.93 13.24 12.38 4.54 -0.66
Achnanthes minutissima 16.2 0.6 -2.9 -16.7 57.99 53.88 41.81 14.91 -19.4 -3.92 -36.8 -6.91
Amphipleura pellucida -0.04 0 -0.2 -0.01 0 -0.06 -0.14 -0.07
Amphora sp. -0.14 -0.18 -0.42 -0.3
Aphanothece sp. 0 0 1.7 0
Ceratoneis sp. -0.48 -0.06 -0.55 -0.24
Characium sp. 2.5 0 0 0
Chloroccal indet. -3.33 3.04 10.73 15.98
Chroococcal indet. -1.7 5 6 4 -1.97 0.42 -0.06 -1.04
Cianoficea -3.09 -7.84 -19.6 -14.5
Cocconeis pediculus 0.7 3.4 -0.1 -0.5 -0.49 -0.99 -1.46 -0.97 -0.52 -0.19 0.03 -1.81
Cocconeis placentula 2.3 -0.3 -0.5 -2.1
Cymbella caespitosa 1.57 0.66 1.91 2.5 0.06 -0.56 -0.2 0.54
Cymbella sinuata 0.31 -0.17 -0.29 -0.42
Cymbella minuta
Fragilaria capucina -8.7 -40.6 -18.2 -32.6 -7.62 -49.7 -0.53 -0.15 0 -9.93 0 0
Fragilaria construens 0.33 -0.25 -0.54 -0.24 14.23 1.45 24.63 15.06
Gongrosira inc 0 -0.9 -1.1 0 -0.16 0.03 0.07 0.06
Gomphonema acuminatum -1.29 -0.46 -0.05 -0.36
Gomphonema constrictum -0.2 0.23 -0.38 0.16 0.02 0 0.24 0.76
Melosira varians 0.16 -0.03 0.14 -0.46 0.16 -0.49 0 -0.03
Nitzschia sp -0.19 0.34 0.23 -0.04
Navicula cryptocephala -0.1 -1.48 0.27 0.2
Oedogonium sp -0.23 0 -0.12 0
Phormidium sp. 0 0 -1.3 0
Scenedesmus sp -0.2 0 1 0 -2.63 -0.43 0 0 0.11 0 1.94 0
Stauroneis phoenicenteron 1.13 0 3.11 1.52
Stigeoclonium tenue (c.basal) 9.2 60.3 -37.3 -8 -31.5 2.19 -21.7 -4.06 -2.8 -0.03 0 -0.07
Stigeoclonium tenue (filame.) -16 -10.5 0.9 29.8 0.13 -1.76 -1.63 -0.02 -9.73 1.89 -0.69 -7.6
Synedra ulna -7.2 -23.8 58.9 27.6 -5.9 -1.56 -7.72 -8.14 1.42 0.42 8.49 -0.6
Ulothrix zonata -2.4 -2.5 -1.5 -3.2 1.89 2.49 -2.49 -0.17
tes que las pedunculadas y las filamentosas, auna mezcla de metales pesados (Medley andClements, 1998). Este hecho sugiere la existen-cia de una cierta relación entre el tipo de creci-miento y la tolerancia específica al tóxico, quepuede considerarse en función de la proximi-dad relativa de cada forma vital a la capa límite.Nuestros resultados, aunque no contradicen estapredicción, indican que el inverso no es correc-to. Esto es, los tóxicos no favorecen la domi-nancia de ciertas formas de crecimiento, al me-nos a corto plazo.
Las diferencias entre la mayor parte deparámetros valorados son mayores entre velo-cidades mínimas y medias (1 y 15 cm s-1 res-pectivamente) que entre medias y altas (20 y 30cm s-1). A pesar de que las diferencias entre loscontroles no fueron significativas a estas velo-cidades, la similitud del efecto del cobre entre20 y 30 cm s-1, sugiere la existencia de un um-bral a velocidades intermedias para la interacciónentre velocidad y la toxicidad del cobre. Es po-sible que de 15 cm s-1 en adelante, los incre-mentos sucesivos de velocidad no se traduzcanen un incremento similar de la toxicidad, hasta
Tabla 3.Diferencia entre elporcentaje del nú-mero de células decada especie entreel día 0 y el 7 encada experimento.
47 Cobre y velocidad
llegar a ser indetectable.El efecto que el incremento de la velocidad tie-ne sobre la toxicidad de los metales puede ba-sarse en la progresiva reducción en el grosor dela subcapa viscosa de la capa límite (Stevenson,1996) y el incremento del flujo de solutos (me-tales) asociado. Este mecanismo puede ser si-milar al descrito para la disponibilidad denutrientes, así como para el flujo de sustanciasde desecho de los organismos (Biggs et al.,1998), donde el incremento de la velocidad delagua tiene un efecto positivo sobre el metabo-lismo de los organismos. Cuando la sustanciaque vea amplificada su difusión por un incre-mento de la velocidad del agua sea tóxica parael organismo, tendrá consecuencias negativas,incrementando su toxicidad. Los gradientes deoxígeno disuelto y pH, dentro del biofilm y re-
lacionados con la actividad fotosintética, pue-den ser mayores a bajas velocidades. El pH enaguas alcalinas puede incrementarse como con-secuencia de la fotosíntesis. A un pH menor de6, las concentraciones de las especies más tóxi-cas de cobre (cobre libre, Cu2+ e hidróxido decobre, CuOH+) incrementan en un orden demagnitud por cada 0.5 unidades de pH que sebaje (Stumm and Morgan, 1981). La mayorbiodisponibilidad de estas formas puede ser elresultado de la interacción entre procesos bio-lógicos (actividad fotosintética) y la velocidaddel agua.
Será necesario estudiar si este tipo de efectopuede extenderse también a otros de metalespesados y al resto de tóxicos. Experimentos si-milares, realizados con la atrazina (en este mis-
Tabla 4.Resultados de lasANOVAS realiza-das con los porcen-tajes del número decélulas de cada espe-cie. Se indican lasespecies cuyoscontajes fueronsignificativamentediferentes (p<0.05)entre tratamientos.Acrónimos utiliza-dos: Acla( A c h n a n t h e slanceolata); Acmi( A c h n a n t h e sminutissima); Am(Amphipleura sp);Cia (cianofícea);Coc (Cocconeisplacentula); Cymb(Cymbella sp.); Frac( F r a g i l a r i acapucina); Fran( F r a g i l a r i aconstruens); Gom( G o m p h o n e m aconstrictum); Nit(Nitzschia sp.);Scen (Scenedesmussp.); Stig(Stigeoclonium te-nue); Syn (Synedraulna).
Exp1 dia 0 0 0 0 7 7 7
cu 0 15 0 15 0 15 0
dia cu vel 1 1 15 15 1 1 15
0 0 1
0 15 1 Coc Frac
0 0 15
0 15 15 StigSyn
7 0 1 Coc FracSyn
Stig Frac
7 15 1 Acla Frac Acmi Stig Frac AcmiSyn
7 0 15 Acmi Coc FracSyn
Syn StigSyn
FracSyn
Syn Acla
7 15 15 Acla Frac Stig Stig Coc Stig Coc Frac Stig StigSyn
Stig Acla Coc StigSyn
Exp2 dia 0 0 0 0 7 7 7
cu 15 15 15 15 15 15 15
Dia cu vel 1 20 30 50 1 20 30
0 15 1
0 15 20 Scen Gom FracStig
0 15 30 Scen Gom Frac
0 15 50 ScenCia Nit Acmi Frac Nit Nit
7 15 1 Scen Gom StigAcmi
Frac Acmi Cia Coc Acmi Cia Coc Acmi
7 15 20 Scen Gom StigAcmi
Frac Acmi Coc Acmi Gom Acmi NitFran Coc
Acla
7 15 30 Scen Gom StigAcmi
Frac Acmi Cia Coc Acmi Cia Acmi FranCoc
7 15 50 Scen Gom StigAcmi
Frac Acmi Coc Acmi Nit
Exp3 dia 0 0 0 0 7 7 7
cu 0 30 0 30 0 30 0
dia cu vel 20 20 30 30 20 20 30
0 0 20
0 30 20 Am
0 0 30 Cymb Gom Gom
0 30 30 Coc Coc Gom Coc
7 0 20 Acla Acmi Am Acla Cymb Coc
7 30 20 AcmiFrac
Acmi Frac Gom Acmi Frac Coc
7 0 30 Am Acla Gom Coc Frac
7 30 30 Frac Fran Am Frac Fran Gom Frac Fran Coc Fran Fran Frac Fran
Capítulo 3 48
mo capítulo), han demostrado que la velocidadno tiene el mismo efecto que sobre el cobre. Laatrazina provocó un descenso similar en la con-centración de clorofila-a y en la incorporaciónde carbono, tanto a velocidades bajas como amedias. Aunque estos resultados no seangeneralizables a otros tóxicos, nuestros resulta-dos con el cobre sugieren que los estudiosecotoxicológicos a nivel de comunidad debenconsiderar la influencia de factores físicos comola velocidad del agua, con el objetivo de mejo-rar su realismo y fiabilidad.
Finalmente, parece que las interacciones entrefactores fisicos, como la velocidad del agua ylos tóxicos pueden ser moduladas por la respues-ta específica de los organismos. Las especiesdifieren en su sensibilidad frente al cobre.Medley y Clements (1988) observaron cómo lascomunidades algales obtenidas a lo largo de ungradiente respondieron de un modo diferente alexponerlas a una mezcla de metales pesados. Porotra parte, los organismos son capaces de adap-tarse y convertirse en tolerantes a las nuevascondiciones. Blanck y Dahl suponen que la res-puesta de la comunidad frente a un tóxico serála exclusión de los individuos y especies mássensibles (Blanck and Dahl, 1996), favorecien-do de este modo el incremento de la toleranciade la comunidad. Nosotros observamos esta ten-dencia en la comunidad, que tras siete días deexposición a 15 mg L-1 de cobre, presenta unaEC
10 mayor tras la exposición, siendo mayor la
tolerancia a 15 cm s-1 que a 1 cm s-1.
En consecuencia, la modificación del efectotóxico de los metales pesados provocada por elincremento de la velocidad, implica que estefactor debe ser parte de las hipótesis de trabajoa la hora de valorar el efecto de la entrada detóxicos en los sistemas fluviales. Los resulta-dos aquí expuestos sugieren que el impacto deestos tóxicos puede ser mayor en ríos de aguasrápidas que en los de aguas lentas. Por otra par-te, la variación estacional del caudal de un pun-to concreto del río, puede tener consecuenciasen la velocidad del agua que se traduzcan enuna modificación de la respuesta de las algasante exposiciones a tóxicos. En los ríos de zo-nas bajas, varios mecanismos contribuyen aminimizar el efecto de los metales pesados, par-ticularmente cuando aparecen en bajas concen-traciones. Las partes bajas de los ríos recibengeneralmente mayores cargas de nutrientes que
las partes bajas, que generan una mayor biomasa(Sabater and Sabater, 1992), la biomasa tieneun aparente efecto protector de los organismosante los tóxicos (Admiraal et al., 1999). En ríosde media montaña, la combinación de velocida-des altas y bajas biomasas puede incrementar elefecto tóxico de los metales pesados sobre lascomunidades algales de perifiton. Para mejorarla fiabilidad de los futuros estudiosecotoxicológicos de los metales pesados, en ríos,deberán tenerse en cuenta no sólo la composi-ción de la comunidad (Foster, 1982b), la carac-terización de la exposición (Norton et al., 1996)y la tolerancia al tóxico (Blanck and Dahl, 1996),sino también el papel modulador de los factoresambientales, como la velocidad del agua o laluz (Guasch and Sabater, 1998).
Como colofón, podríamos sugerir una línea detrabajo para próximos experimentos, basándo-nos en la siguiente hipótesis: si la incorporaciónde nutrientes puede compensar el efecto de unaconcentración de cobre determinada, en una ve-locidad determinada, podríamos pensar, a priorique para cada concentración de cobre y comu-nidad habrá una velocidad óptima, en que la dis-ponibilidad de nutrientes compense la toxicidaddel cobre. Por encima y por debajo de esa velo-cidad el crecimiento de la comunidad sería me-nor. Se podrían diseñar, por tanto, experimen-tos en los cuales el objetivo sea encontrar quevelocidad resulta la óptima para el crecimientode la comunidad, en presencia de una concen-tración de cobre determinada, y luego, podríanestudiarse qué factores son los que hacen de esavelocidad la óptima.
