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ÁREA DE MEDIO AMBIENTE Y DESARROLLO SOSTENIBLE
TÍTULO DEL PROYECTO FINAL
Evaluación ecotoxicológica en aguas y sedimentos de la reserva San Rafael
y su zona de amortiguamiento mediante bioensayos con Daphnia magna y
Lactuca sativa
Tesis para optar al grado de:
Máster en Gestión y Auditorías Ambientales
Presentado por:
Tomás López Arias
PYMAMGA933867
Director:
Erik Simoes
ASUNCIÓN, PARAGUAY
2016
AGRADECIMIENTOS
Al Laboratorio de Mutagénesis Ambiental, y a los directivos de la Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Asunción, por
autorizar la realización del trabajo en sus instalaciones.
A los Doctores Alberto Esquivel y Salvador Peris por otorgarme la beca en
el marco del Proyecto 11-CAP2-1434: Cátedra UNESCO “Educación para el
Desarrollo Sostenible”: Fortalecimiento de líneas de investigación locales en el
área de biodiversidad y de la vinculación con la sociedad.
A los directivos y guadabosques de la organización PRO COSARA, por el
incansable apoyo durante el periodo de muestreo.
A los Estudiantes de la Carrera de Biología que colaboraron con la
realización de los ensayos en el Laboratorio.
A mi familia, por el apoyo permanente.
i
COMPROMISO DE AUTOR
Yo, Tomás López Arias, con célula de identidad 3.409.974 y alumno del
programa académico Máster en Gestión y Auditorías Ambientales declaro
que:
El contenido del presente documento es un reflejo de mi trabajo personal y
manifiesto que ante cualquier notificación de plagio, copia o falta a la fuente
original, soy responsable directo legal, económico y administrativo sin
afectar al Director del trabajo, a la Universidad y a cuantas instituciones
hayan colaborado en dicho trabajo, asumiendo las consecuencias derivadas
de tales prácticas.
Firma:
ii
RESUMEN
Ensayos ecotoxicológicos con organismos indicadores son utilizados para
determinar si existen niveles de toxicidad en ecosistemas donde el uso de
agroquímicos es frecuente. Se realizó un estudio en un área de especial interés
para la conservación del Bosque Atlántico, la Reserva para Parque Nacional San
Rafael (Itapúa, Paraguay), se evaluaron los efectos ecotoxicológicos de la
actividad agrícola en arroyos de la Reserva y zonas de amortiguamiento,
mediante ensayos de toxicidad aguda, toxicidad crónica, determinación de
plaguicidas y parámetros fisicoquímicos determinantes de calidad de los sistemas
acuáticos. Se realizaron siete campañas entre los años 2012 y 2013, tomando
muestras de agua y sedimentos en 5 arroyos, de los cuales dos son nacientes en
zonas de bosque nativo de la Reserva (muestras control), y 3 en agroecosistemas
de la zona de amortiguamiento. Se realizaron test de toxicidad aguda por
inhibición del movimiento y ensayos crónicos con Daphnia magna, además
ensayos de toxicidad aguda con Lactuca sativa, por inhibición del crecimiento
radicular. No se registró toxicidad aguda en D. magna, tanto en el agua como en
los sedimentos, pero se observó una reducción en la fecundidad de los individuos
expuestos a las muestras de los agroecosistemas, evidenciándose efectos tóxicos
crónicos sobre su tasa de reproducción. No se observaron indicios importantes de
fitotoxicidad en los resultados con L. sativa. A través de una cromotagrafía líquida
de alta perfomance (HPLC), se evaluó la presencia de dos biocidas mayormente
utilizados en los cultivos de soja y trigo, Cipermetrina y Clorpirifos, obteniéndose
resultados negativos. Parámetros fisicoquímicos (Nitratos, Sulfatos, pH, oxígeno
disuelto, dureza y DBO5), indican que las aguas analizadas están en buenas
condiciones, categorizados dentro de Clase I según la resolución N° 222/02 de la
SEAM. Sin embargo, se detectan incrementos principalmente en los niveles de
nutrientes Nitratos y Fósforo total, al comparar los controles con aguas de
agroecosistemas.
Palabras clave: Ecotoxicidad; Daphnia magna; Lactuca sativa; Plaguicidas
iii
INDICE
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... xi
MARCO TEÓRICO
CAPÍTULO 1: LOS CULTIVOS DE SOJA Y DE TRIGO EN EL PARAGUAY ....... 2
CAPÍTULO 2: LOS PLAGUICIDAS ASOCIADOS A LOS CULTIVOS DE
SOJA Y TRIGO ....................................................................................................... 9
CAPÍTULO 3: EVALUACIÓN DE RIESGOS ECOTOXICOLÓGICOS ................. 17
CAPÍTULO 4: LA RESERVA PARA PARQUE NACIONAL SAN RAFAEL ......... 21
MARCO EMPÍRICO
CAPÍTULO 5: DISEÑO METODOLÓGICO .......................................................... 26
5.1. Introducción ............................................................................................. 26
5.2. Variables ................................................................................................... 28
5.3. Muestra ..................................................................................................... 29
5.3.1. Localización del área de estudio ..................................................... 29
5.3.2. Identificación de las Muestras ......................................................... 29
5.3.3. Periodo de toma de muestras .......................................................... 32
5.4. Instrumentos de Medición y técnicas..................................................... 32
5.5. Procedimientos ........................................................................................ 32
5.5.1. Mantenimiento y selección de los organismos de prueba ............ 32
5.5.2. Procesamiento de las muestras. Preparación de elutriados de
los sedimentos ............................................................................................ 33
5.5.3. Toxicidad de plaguicidas en D. magna y L. sativa ......................... 34
5.5.4. Parámetros fisicoquímicos de calidad de aguas ........................... 35
5.5.5. Determinación de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina
en muestras de agua .................................................................................. 35
5.5.6. Bioensayos de toxicidad aguda con D. magna .............................. 36
5.5.7. Bioensayos de toxicidad crónica en Lactuca sativa ..................... 37
5.5.8. Bioensayos de toxicidad crónica en D. magna .............................. 40
5.6. Hipótesis de trabajo ................................................................................. 40
CAPÍTULO 6: RESULTADOS .............................................................................. 41
iv
6.1. Toxicidades agudas de los ingredientes activos clorpirifos
y cipermetrina, y de una formulación comercial de glifosato, utilizadas
en el manejo de los cultivos de soja ............................................................. 41
6.2. Parámetros fisicoquímicos DBO5, sulfato, nitrato, fósforo
total, dureza, pH oxígeno disuelto en muestras de aguas de los arroyos
de la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento ........................... 45
6.3. Determinaciones de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina
en muestras de agua de los arroyos de la Reserva para Parque
Nacional San Rafael y su zona de amortiguamiento ................................... 46
6.4. Toxicidad aguda en muestras de agua y sedimentos de
arroyos ubicados en la Reserva San Rafael y su zona de
amortiguamiento ............................................................................................. 47
6.5. Toxicidad crónica en muestras aguas de arroyos ubicados en
la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento ................................ 55
CAPÍTULO 7: DISCUSIÓN ................................................................................... 63
7.1. Toxicidades agudas de los ingredientes activos .................................. 63
7.2. Determinaciones de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina
en muestras de agua de los arroyos de la Reserva para Parque
Nacional San Rafael y su zona de amortiguamiento ................................... 65
7.3. Parámetros fisicoquímicos DBO5, sulfato, nitrato, dureza, pH
oxígeno disuelto en muestras de aguas de los arroyos de la Reserva
San Rafael y su zona de amortiguamiento ................................................... 67
7.4. Toxicidad aguda en muestras de agua y sedimentos de
arroyos ubicados en la Reserva San Rafael y su zona de
amortiguamiento ............................................................................................. 72
7.4.1. Bioensayos agudos con D. magna .................................................. 72
7.4.2. Bioensayos con L. sativa ................................................................. 73
7.5. Toxicidad crónica en muestras aguas de arroyos ubicados en
la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento ................................ 73
CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES GENERALES ................................................... 76
CAPÍTULO 9: RECOMENDACIONES .................................................................. 78
v
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 79
ANEXOS
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 4.1: Comparación entre las especies registradas en San Rafael y
las estimadas para el Paraguay ............................................................................ 24
Tabla 5.1: Resumen de las condiciones de prueba para la realización del
ensayo agudo con D. magna................................................................................. 36
Tabla 5.2: Resumen de las condiciones de prueba para la realización del
ensayo agudo con L. sativa ................................................................................... 38
Tabla 6.1: Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del Clorpirifos en
D. magna ............................................................................................................... 42
Tabla 6.2: Resultado de los ensayos de toxicidad aguda de la cipermetrina en
D. magna ............................................................................................................... 42
Tabla 6.3: Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del glifosato
de formulación comercial en D. magna ................................................................. 43
Tabla 6.4: Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del glifosato
de formulación comercial en L. sativa ................................................................... 44
Tabla 6.5: Valores de los parámetros fisicoquímicos analizados durante los
siete muestreos ..................................................................................................... 45
Tabla 6.6: Concentraciones de plaguicidas en los puntos de estudio, durante
el tercer y el séptimo muestreo ............................................................................. 47
Tabla 6.7: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y en sedimentos del primer muestreo ................................ 47
Tabla 6.8: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del segundo muestreo .................................. 48
Tabla 6.9: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del tercer muestreo ...................................... 49
Tabla 6.10: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del cuarto muestreo ..................................... 49
Tabla 6.11: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del quinto muestreo ...................................... 50
Tabla 6.12: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
vii
las muestras de agua y sedimentos del sexto muestreo ....................................... 50
Tabla 6.13: Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del séptimo muestreo ................................... 51
Tabla 6.14: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
primer muestreo .................................................................................................... 52
Tabla 6.15: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
segundo muestreo ................................................................................................. 52
Tabla 6.16: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
tercer muestreo ..................................................................................................... 53
Tabla 6.17: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
cuarto muestreo .................................................................................................... 53
Tabla 6.18: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
quinto muestreo ..................................................................................................... 54
Tabla 6.19: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
sexto muestreo. ..................................................................................................... 54
Tabla 6.20: Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L.
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del
séptimo muestreo .................................................................................................. 55
Tabla 6.21: Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna realizadas a las muestras de agua del segundo
muestreo. .............................................................................................................. 55
Tabla 6.22. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del tercer muestreo ....................... 56
Tabla 6.23: Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del cuarto muestreo. ..................... 58
viii
Tabla 6.24: Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del quinto muestreo ....................... 59
Tabla 6.25: Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del sexto muestreo ........................ 60
Tabla 6.26: Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del séptimo muestreo .................... 61
Tabla 7.1: LCx 24 horas e intervalos de confianza al 95 % para D. magna para
los herbicidas clorpirifos y cipermetrina obtenidos con el log-probit ...................... 64
Tabla 7.2: LCx 120 horas para L. sativa para el formulado de Glifosato
obtenidos con el log-probit .................................................................................... 65
Tabla 7.3: Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos
analizados durante los siete muestreos ................................................................ 68
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1: Uso de la tierra en la triple frontera (Argentina, Brasil y Paraguay) ...... 3
Figura 1.2: Evolución de la superficie de cultivo de soja en el Paraguay ............... 4
Figura 1.3: Distribución estimada de Soja según superficies cultivadas en el
2013 ........................................................................................................................ 4
Figura 1.4: Evolución del trigo y la soja en Paraguay ............................................. 6
Figura 1.5: Principales zonas de cultivo de trigo en la región Oriental
del Paraguay ........................................................................................................... 7
Figura 2.1: Cipermetrina ....................................................................................... 10
Figura 2.2: Clorpirifos ........................................................................................... 11
Figura 2.3: Glifosato ............................................................................................. 14
Figura 3.1: Metodología propuesta para estimar la concentración de plaguicidas
y los efectos sobre organismos modelos .............................................................. 18
Figura 4.1: Ubicación del área de estudio ............................................................ 23
Figura 5.1: Vista general de la Ubicación de las zonas de muestreo ................... 30
Figura 5.2: Imagen satelital y fotografía en P1 ..................................................... 30
Figura 5.3: Imagen satelital y fotografía en P2 ..................................................... 30
Figura 5.4: Imagen satelital y fotografía en P3 ..................................................... 31
Figura 5.5: Imagen satelital y fotografía en P4 ..................................................... 31
Figura 5.6: Imagen satelital y fotografía en P5 ..................................................... 31
Figura 5.7: Mantenimiento de lotes parentales de D. magna ............................... 33
Figura 5.8: Preparación de elutriados de sedimentos .......................................... 34
Figura 5.9: Procedimiento de prueba del ensayo agudo en D. magna ................. 37
Figura 5.10: Procedimiento del ensayo agudo en L. sativa .................................. 39
Figura 6.1: Rectas de regresión para el modelo log-probit sobre D. magna para
la cipermetrina, clorpirifos y glifosato .................................................................... 44
Figura 6.2: Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de D. magna
expuestos a las muestras de agua del segundo muestreo ................................... 56
Figura 6.3: Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de los
individuos expuestos a las muestras de agua del tercer muestreo ....................... 57
x
Figura 6.4: Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de los
individuos expuestos a las muestras de agua del cuarto muestreo ...................... 58
Figura 6.5: Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto del quinto muestreo .............................. 60
Figura 6.6: Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto de la sexta campaña de muestreo ....... 61
Figura 6.7: Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto del séptimo muestreo ........................... 62
Figura 7.1: Gráfico Box-Plot de los parámetros fisicoquímicos durante el
periodo de estudio ................................................................................................. 70
Figura 7.2: Gráfico Box-Plot del parámetro fisicoquímico dureza ......................... 71
xi
INTRODUCCIÓN
La agricultura se ha convertido en la base para el desarrollo económico del
Paraguay. Esta aporta el 16% del PIB, y según los pronósticos a mediano y largo
plazo seguirá el incremento de las tierras cultivadas, debido a la demanda
mundial de alimentos (MAG, 2012). Este modelo de desarrollo, trae consigo el uso
de extensas superficie de terreno, incluyendo bosques, pastizales, humedales,
entre otros ecosistemas terrestres. Además la agricultura actual conlleva el uso de
grandes cantidades de plaguicidas; estimaciones indican que en el año 2010 en el
Paraguay se importaron 114.376 T, a esto se suma la débil gestión de
plaguicidas, muchas de las cuales presentan características ecotoxicológicas, que
pueden ocasionar daños al ambiente.
En el presente estudio se evalúa el impacto ecotoxicológico de aguas de
arroyos de zonas de cultivos agrícolas (agroecosistemas) de la zona aledaña a la
Reserva para Parque Nacional San Rafael, en muestras colectadas de sitios
ubicados en el Departamento de Itapuá. El Departamento de Itapuá, está ubicado
en la zona sur-este de la Región Oriental del Paraguay. Limita al norte con los
Departamentos de Caazapá y Alto Paraná, al este y al sur con la República
Argentina y al oeste con el Departamento de Misiones. Posee un clima tropical a
moderado. El Departamento presenta seis ordenes de suelos, estos son los
Ultisoles (72,52%), los Entisoles (16,66%), los Oxisoles (6,26%), Alfisoles
(3,75%), Inceptisoles (1,60%), y tierras misceláneas (0,21%). Actualmente el
56,65 % del Departamento Itapúa (936.067 has), se destina al cultivo agrícola
mecanizado, esta ha tenido un modelo de desarrollo agrícola de corto plazo, sin
una planificación con consecuencias negativas en los que concierne a sus
recursos naturales. El remanente boscoso se encuentra hacia el norte del
Departamento, principalmente en la zona correspondiente a la Reserva San
Rafael, estimaciones indican que el área boscosa abarca 149.860 ha,
correspondiente al 9,07 % de la superficie total. (Rojas Ozuna, Rolón Paredes y
Galeano S., 2014)
En el Paraguay, no se disponen de datos de evaluación del impacto de
agroquímicos sobre la biodiversidad, siendo probable que se estén presentando
impactos negativos sobre los ecosistemas. En este sentido este estudio estará
xii
aportando información de relevancia: científica, al disponer de datos de la
presencia, y los impactos a nivel ecotoxicológico; y social, pues esta información
permitirá concienciar sobre los efectos del mal uso de los plaguicidas. Por otro
lado, en el trabajo se muestra la utilidad metodológica de los parámetros
ecotoxicológicos estandarizados, su fácil utilización y las ventajas que aportan su
implementación.
El presente proyecto contribuye a obtener información valiosa sobre el
principio activo de los agroquímicos y sus dosis utilizadas, y estimar el riesgo de
toxicidad a la que se expone la fauna silvestre, en una de las áreas más ricas en
biodiversidad del Paraguay.
El escenario de uso extensivo de los agroquímicos hacen necesario
conocer los riesgos que implican el uso de los mismos sobre organismos no
blanco, así como determinar el destino ambiental de estos compuestos en aguas
y suelos. Actualmente este tipo de evaluación se enmarca dentro de la ciencia en
un área de estudio denominada Ecotoxicología.
Para el desarrollo del proyecto se plantearon los siguientes objetivos:
Objetivo General
Evaluar los efectos ecotoxicológicos de la actividad agrícola en arroyos de
la Reserva para Parque Nacional San Rafael, y zonas de amortiguamiento,
mediante ensayos de toxicidad aguda, toxicidad crónica, y parámetros
fisicoquímicos determinantes de calidad de los sistemas acuáticos
Objetivos Específicos
- Determinar la toxicidad aguda en muestras de agua y sedimentos de
arroyos ubicados en la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento.
- Determinar la toxicidad crónica en muestras aguas de arroyos ubicados
en la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento.
- Determinar la concentración de parámetros fisicoquímicos DBO5, sulfato,
fósforo total, nitrato, dureza, pH oxígeno disuelto, y así como los plaguicidas
xiii
clorpirifos y cipermetrina en muestras de aguas de los arroyos de la Reserva San
Rafael y su zona de amortiguamiento.
- Determinar las toxicidades agudas de los ingredientes activos clorpirifos y
cipermetrina, y de una formulación comercial de Glifosato, utilizadas en el manejo
de los cultivos de soja.
- Comparar la variación de la toxicidad y la concentración de los
parámetros fisicoquímicos de los sistemas acuáticos ubicados dentro de la
Reserva, con los ubicados en los agroecosistemas.
1
MARCO TEÓRICO
2
CAPÍTULO 1: LOS CULTIVOS DE SOJA Y DE TRIGO EN EL PARAGUAY
El Paraguay es actualmente el sexto productor de soja a nivel mundial
detrás de USA, Brasil, Argentina, China e India (IICA, 2014). Su cultivo se
practica desde hace aproximadamente 30 años. La introducción y expansión de
la soja se produjo como consecuencia del fomento del Plan Nacional del Trigo
que el gobierno paraguayo implementó a partir del año 1967, con objeto de
autoabastecerse y sustituir importaciones del trigo, convirtiéndose en nuestros
días en el principal cultivo de exportación.
Soja
Según Tsuchiya (2003), la producción de soja en el Paraguay atraviesa
cinco etapas cronológicas. El inicio de la producción sojera (1), se extiende
entre los años 1921-1930, durante este periodo se produce su introducción al
Paraguay en el año 1921, por parte del Dr. Pedro Ciancio, este prestó su
atención al valor nutritivo de la soja mientras realizaba sus estudios en Italia. La
siguiente etapa (2), es la de la producción de soja para consumo humano
(1931-1960), en la que los inmigrantes japoneses cultivaron la soja en forma
colectiva en la Ciudad de la Colmena. El mismo autor reporta que en el año
1946 la soja fue cultivada por 478 familias de agricultores, abarcando una
superficie de 222 ha. La tercera etapa (3), se caracteriza por la producción de
soja en forma manual y/o a tracción animal, así como el inicio de la
exportación, que se da entre los años 1961-1970; los productores de las
colonias japonesas reportan la primera exportación de soja en 1961, con 257 T
del grano, hacia Japón. Según el mismo autor, la siguiente etapa (4) abarca el
periodo de tiempo comprendido entre 1970-1980, y se destaca por la
producción de soja para la exportación a gran escala y la introducción de
maquinarias. Esto fue impulsado por la introducción de tractores en el año 1970
y las cosechadoras en 1973; el elevado precio del producto permitió el gran
interés por la leguminosa. Finalmente la quinta etapa se extiende a partir de los
años 80, hasta el presente, la misma se caracteriza por la siembra con
3
maquinarias y tecnología de avanzada, pasando de 1.000.000 t en 1980, a
4.000.000 de t en el año 2003.
Actualmente la principal zona productora de soja en el Paraguay es la
región oriental, que ve dinamizada en su economía por el sector de la soja,
representando el 35 % de la producción agrícola nacional y alrededor del 40 %
de las exportaciones agrícolas totales (incluyendo granos, harina, tortas y
aceites de soja), así mismo concentra la mayor producción de soja en dos
departamentos, Alto Paraná (Figura 1.1 y Figura 1.3) e Itapúa, produciendo
ambos el 70% del total del país (Tsuchiya, 2003).
Figura 1.1. Uso de la tierra en la triple frontera (Argentina, Brasil y Paraguay).
a) panorama en 1973. b) Lo mismo panorama en el 2003. Fuente: CCI (2009).
Según el Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura
(IICA, 2014), el área bajo siembra de soja ha crecido sostenidamente, las
estimaciones en el año 1996 indicaban que contaba con 939.652 ha. El cultivo
ha atravesado por una etapa de crecimiento exponencial a partir de la década
de los 80 (Figura 1.2). En las últimas zafras se observa que el incremento del
área de siembra sigue en aumento, no obstante el año agrícola 2011/12 fue
afectado por la sequía, lo que trajo como consecuencia la disminución de la
producción de ese periodo. La zafra 2012/2013 registró una superficie de de
3.076.833ha cultivadas con una producción de 9.089.000 toneladas, 109 %
4
superior al año anterior. Los departamentos de Alto Paraná (732.973 ha.),
Itapúa (559.528 ha.), Canindeyú (442.763 ha.) y Caaguazú (253.747
ha.),fueron los de mayor participación en cuanto a superficie de siembra de
soja en el Paraguay (MAG, 2013).
Figura 1.2. Evolución de la superficie de cultivo de soja en el Paraguay.
Elaboración propia. Fuente:Tsuchiya (2003).
Figura 1.3: Distribución estimada de Soja según superficies cultivadas en el
2013. Fuente: INBIO (2014).
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
3,00E+06
3,50E+06
1932 1942 1952 1962 1972 1982 1992 2002 2012
Su
perf
icie
(H
a.)
Tiempo (año)
5
En Paraguay se cuentan con 14 eventos biotecnológicos aprobados a la
fecha, de los cuales tres son utilizados en soja, 8 en maíz, y los restantes 3 se
encuentran en variedades de algodón. Desde la aprobación del primer evento
de soja genéticamente modificada (GM) resistente a herbicidas en el 2004, se
ha producido una expansión tal que el 97% de la producción es del tipo GM.
Datos del año 2010 indican que de 2,9 millones de hectáreas, 2,8 millones de
correspondieron a soja transgénica. Estos datos ubican a Paraguay en el
puesto número 7 de los países agrobiotecnológicos, por detrás de USA, Brasil,
Argentina, India, Canadá y China (MAG, 2010).
El control químico en la soja GM, generalmente requiere del uso
obligado del herbicida glifosato, y otros insecticidas asociados como la
cipermetrina, el organosfosforado clorpirifos, y en menos medida del
organoclorado endosulfan. Este último fue prohibido por el Servicio Nacional de
Calidad y Sanidad Vegetal y de Semillas (SENAVE) mediante Nº 635/10 del 2
de noviembre de 2010. (SENAVE, 2010)
Trigo
Otro cultivo muy extendido en el Departamento de Itapúa, y en la zona
donde se llevó a cabo el presente estudio, es el trigo. Este cereal está muy
relacionado en los sistemas de siembra directa con cultivo rotativo de la soja,
junto al girasol y el maíz. Inicialmente el cultivo de soja se inició porque se
adaptaba bien en rotación con el trigo. Sin embargo la oelaginosa se ha
impuesto al cereal por su excelente rendimiento y los precios internacionales
que resultan atractivos para los productores. Como resultado de esto,
actualmente el trigo solo ocupa una sexta parte de la superficie sembrada de
soja, pese a que el consumo interno de la soja es menor al 10% de la
producción.(Kohli, Pedretti y de Viedma, 2011)
6
Figura 1.4: Evolución del trigo y la soja en Paraguay. Fuente: Kohli, Pedretti, y
de Viedma (2011, p. 473)
El cultivo de trigo en el Paraguay se extendió considerablemente a partir
del establecimiento de las Misiones Jesuíticas en el siglo XVII, donde al inicio
de la colonia, el cereal era llevado a Ciudades como Buenos Aires y Santa Fe;
no obstante a finales del siglo XVIII, se dio inicio a un descenso en la
producción nacional, desapareciendo completamente su cultivo después de la
guerra de la triple alianza. En años siguientes, el gobierno paraguayo realizó
periódicamente ingentes esfuerzos para difundir el cultivo de trigo, pese a ello
recién en 1943 con la creación del Instituto Agronómico Nacional (IAN) y el
Servicio Técnico Interamericano de Cooperación Agrícola (STICA) se iniciaron
los trabajo en forma continua e institucionalizada, hasta llegar al
autoabastecimiento en 1986, gracias a la adopción de tecnologías como el uso
de fertilizantes, control químico con fungicidas siembra en épocas
oportunas(López, 2010).
Según Ruíz Díaz (2007), desde el año 1968 hasta 1971 se registró un
aumento sostenido de la superficie cultivada y de su producción (Figura 1.4 y
Figura 1.5), todo esto surgió como respuesta del apoyo crediticio y técnico
brindado por el estado a los productores de trigo. En año 1972 se redujeron
drásticamente la superficie, el rendimiento y la producción debido al uso de
variedades con poca resistencia a enfermedades, alcanzando una disminución
7
del 70%. A partir de 1976, se realizaron campañas de protección y se llegaron
producir un rendimiento promedio de 1 ton/ha. Las mejoras en la producción
permitieron el autoabastecimiento en 1986, y posibilitó las primeras
exportaciones a Brasil en 1989
Figura 1.5: Principales zonas de cultivo de trigo en la región Oriental del
Paraguay. Fuente: Kohli et al. (2011, p. 472).
La producción de trigo se concentra en las regiones del este y del
sudeste del país, especialmente a lo largo de la cuenca del río Paraná entre los
paralelos 23 º S y 27 º S y 54 º W y 56 º W (Figura 1.5). La mayor parte de la
cosecha se siembra en tierra relativamente plana o ligeramente a un poco más
de 200 metros sobre el nivel del mar. Según el tipo de suelo, temperatura y
precipitaciones, la región oriental del Paraguay se divide en tres regiones para
el cultivo de trigo. El cultivo es desarrollado principalmente por agricultores que
cubre superficies entre 50 y 500 ha. Los Departamentos de Itapúa y Alto
Paraná, presentan las mayores áreas de cultivo con una producción del 80%
del trigo nacional. En los últimos años, la expansión del cultivo de soja hacia
territorios más cálidos, ha creado condiciones más apropiadas para su
8
expansión hacia el norte de la región oriental (Región III), que corresponden a
los Departamentos de Amambay y Canindeyú; en San Pedro y Caaguazú
(Región II), y el sur del país, en el Departamento de Misiones (Región I) (Kohli
et al., 2011).
Debido a los problemas ocasionados por la aparición de enfermedades
del cereal, se han establecido estrechos lazos con el sector de los
agroquímicos, así el tipo de plaguicida utilizado en los cultivos ha evolucionado
en el tiempo; en los años 1970s se recomendaba la utilización del herbicida 2-4
D, para cuidado de las malezas; Dixon, Azodrin y Dimetoato para el control de
plagas chupadoras y los insecticidas de contacto como el Sevin y el Folidol
para las hormigas cortadoras. En los años 80, empiezan a aparecer fungicidas
como el Bayletón, el Impact y el Sportak, en la década siguiente Tilt
(Syngenta), Folicur (Bayer) y Duett (Basf). Hacia el los años 2005, se utilizaban
insecticidas como monocrotofos, metamidofos, piretroides. Más actualmente se
mencionan otros plaguicidas como el metosulfurom (herbicida), estrobilurinas y
triazoles (fungicidas) (Boggino, 2007). Se han realizado prolongados estudios
de la eficacia de los fungicidas Mancozeb, Tebuconazeb, Metconazole y
Epoxiconazole, han arrojado resultado muy heterogeneos para la roya de la
hoja, los de las manchas foliares, y la fusariosis (Viedma, Morel y Amarilla,
2007).Por otro lado, la tendencia actual es la aplicación de fertilizantes NPK,
con altas concentraciones de fósforo (10-30-10; 4-30-10, son las principales
formulaciones) (Boggino, 2007).
9
CAPÍTULO 2: LOS PLAGUICIDAS ASOCIADOS A LOS CULTIVOS DE
SOJA Y TRIGO
Las plagas, sean de las características que fueran, siempre se han
constituido y desde la antigüedad, en un importante problema a combatir para a
la producción mundial de alimentos. Aunque los plaguicidas vienen a paliar en
parte esta gran problemática, ni son la panacea, ni se emplean correctamente
en todas las situaciones, constituyéndose así en posibles agentes
contaminantes tanto para los operarios como para el ambiente. (Cabrera, del
Rio Muñoz, Morales, Alvarez Martín y Torrecilla, 2005).
Los cultivos de soja, trigo, maíz, girasol, y otros rubros agrícolas son los
más utilizados en los sistemas de siembra directa y en forma rotativa realizados
en la zona de Itapúa (MAG, 2010); zona en la que se ubica el área de estudio
del presente trabajo. Se seleccionan los plaguicidas Cipermetrina, clorpirifos y
glifosato por ser los más utilizados en los cultivos con OGMs (Organismos
genéticamente modificados).
Cipermetrina
Este compuesto denominado ((R,S)-alfa-ciano-3-fenoxibenzil (1RS)-
cis,trans-3-(2,2 diclorovinil) 2,2- dimetilciclopropano -carboxilato/ CAS 52315-
07-8) es un plaguicida sintético de la familia de los piretroides, tiene como base
estructural el piretro, sustancia extraída de las flores de crisantemo. Presenta
ocho isómeros, tiene un peso molecular de 416,31 y una fórmula empírica
C22H19Cl2NO3 (Figura 2.1 A). Según las principales bases de datos disponibles
sobre plaguicidas, la cipermetrina de grado técnico es un líquido viscoso de
color amarillo-marrón, con muy baja solubilidad en agua (<0,01 mg/l, a 20ºC)
pero soluble en solventes orgánicos. Posee una presión de vapor (1,9 x 10 -7
Pa), un log Kow de 5,5 y Koc 57.889ml.g-1 (WHO, 1989; PPDB, 2014)
La cipermetrina es un insecticida que tiene la aprobación para su uso en
la Unión Europea. Tiene una baja solubilidad en agua y no es volátil. Mientras
que sus propiedades químicas sugieren que no debería filtrarse a las aguas
subterráneas, se ha encontrado contaminando algunas masas de agua
10
subterránea. Es moderadamente persistente en suelos, pero ese degrada
moderadamente rápido en sistemas de agua bajo condiciones de luz. Es
moderadamente tóxico para los mamíferos y su cierta preocupación en cuanto
a su potencial de bioacumulación. Si bien es un irritante, no se han identificado
graves problemas de salud humana. Es muy tóxico para la mayoría de las
especies acuáticas, en peces se determinados valores de LC50 96-h en el rango
de 0,4-2,8 μg.L-1, en invertebrados acuáticos se dan rangos entre LC50 0,01-5
μg.L-1; es moderadamente tóxico para las lombrices de tierra, en ensayos con
100 mg.Kg-1 por 14 días no se registraron gusanos muertos (WHO, 1989); no
presenta riesgo para las aves (PPDB, 2014b).
La cipermetrina, al igual que los demás piretroides del tipo II presenta un
grupo CN en posición alfa. Son conocidos por alterar la función de los nervios
centrales de los insectos, como consecuencia de la modificación de los canales
de sodio (Figura 2.1. B) dependientes de voltaje, que produce un aumento
prolongado de su permeabilidad, resultando en una transmisión continua del
impulso nervioso, por no existir una despolarización definitiva (Soderlund et al.,
2002).
Figura 2.1. Cipermetrina. a) Estructura molecular de la cipermetrina (PPDB,
2014b). b) Sitio de unión de los piretroides en canales receptores nerviosos.
Fuente: Casida y Durkin (2013).
La cipermetrina es uno de los insecticidas más utilizados en la práctica
de la siembra directa, y es el plaguicida que generalmente acompaña al
glifosato en los cultivos de soja y maíz GM, además de utilizarse en los cultivos
de cereales (Peruzzo et al., 2003); generalmente se pulveriza dos veces
durante el periodo de crecimiento de la soja, y la aplicación con avionetas suele
ser la más extendida, para evitar el daño causado por los vehículos terrestres
11
(Mugni, Demetrio, Marino, Ronco y Bonetto, 2010).Posterior a su aplicación a
los cultivos, pueden ser encontrados residuos en suelos, aguas superficiales y
sedimentos; no obstante la degradación biológica es rápida por lo que los
residuos permanecen por escaso tiempo en el ambiente, en el suelo pueden
persistir hasta por 4 semanas, y en el agua hasta 50 días. (Demetrio, 2012)
Clorpirifos
El clorpirifos (O,O-dietil O-(3,5,6-tricloro-2-piridil) fosforotioato/CAS
2921-88-2) es un plaguicida organofosforado clasificado como Clase II,
moderadamente tóxico (USEPA, 2002). Tiene un peso molecular de 350,6 y
una fórmula empírica C9H11Cl3NO5 PS. Respecto a las propiedades físicas del
clorpirifos, se presenta en forma de cristales blancos granulares, con ligero olor
a Mercaptano. Su punto de ebullición es igual a 160 °C. Su punto de fusión se
encuentra entre los 41 y 42 °C. Su densidad relativa es igual a 1.398 a 43.5 °C.
Su solubilidad en agua es igual a 0.4 mg/L a 23 °C. Es soluble en acetona,
benceno, cloroformo, metanol, disulfuro de carbono, dietil éter, xileno e iso-
octanol. (INECC, 2004)
Figura 2.2. Clorpirifos. Estructura molecular del clorpirifos. Fuente: PPDB
(2014b).
Su presión de vapor es igual a 2.02x10-5 mm Hg a 25 °C; la constante
de la ley de Henry es igual a 2.9x10-6 atm-m3/mol a 20 °C. Posee una log Kow
de 4,30 y una log Koc de 3,70 ml.g-1. Se descompone al calentarse a
aproximadamente 160°C, produciendo gases tóxicos y corrosivos que incluyen
al cloruro de hidrógeno, fosgeno, óxidos de fósforo, de nitrógeno y de azufre:
12
Reacciona con bases fuertes, ácidos y aminas. (PPDB, 2014a;Torres-
Rodríguez, Bernal-Vera, y Castaño-Ramírez, 2012; USEPA, 2002)
Demetrio (2012), indica que las formulaciones de clorpirifos son
utilizadas como insecticida acaricida, y nematicida que actúa por contacto,
ingestión y/o inhalación sobre los organismos. El principal modo de acción es la
inhibición de la actividad de la acetilcolinesterasa, una enzima implicada en las
sinapsis nerviosas y en la neurotransmisión muscular, produciendo efectos
neurotóxicos. La acetilcolina, al no ser degradada, se acumula en exceso en
las sinapsis causando hiperactividad, lo cual provoca espasmos musculares
incontrolables, y dependiendo de la dosis, resulta en parálisis, insuficiencia
respiratoria y muerte (Barron y Woodburn, 1995). Existen distintos formulados
comerciales con sustancias coadyuvantes que acompañan el ingrediente
activo, aumentando su solubilidad y la penetración a la cutícula de artrópodos.
Se utiliza antes de la floración del cultivo o cuando se empiezan a ver los
daños, la aplicación puede ser terrestre o aérea.
En lo referente al comportamiento ambiental el clorpirifos se caracteriza
por su baja solubilidad en el agua y la tendencia a asociarse más con la fase
orgánica que con la acuosa. Es absorbido al suelo y no percola fácilmente, se
degrada con lentitud por la acción microbiana al 3,5,6-tricloropiridin-2-ol (TCP),
que es menos tóxico que su antecesor (Barron y Woodburn, 1995). Este
metabolito es medianamente soluble, volátil, persistente y móvil en el suelo. Es
moderadamente persistente en suelo. Su vida media en los sistemas terrestres
varía usualmente entre 60 y 120 días, pero puede abarcar un intervalo de 2
semanas hasta 1 año dependiendo del tipo de suelo, el clima y otras
condiciones. Su permanencia disminuye a pH básico, pero se incrementa en
condiciones anaerobias. La volatilización es su principal ruta de disipación en el
agua (vida media de 3.5 a 20 días), seguida de la fotólisis en la superficie y la
hidrólisis a altas temperaturas y pH básico. Su potencial de bioacumulación en
organismos acuáticos puede variar de moderado a muy alto. Este plaguicida y
sus metabolitos se acumulan en las plantas, pudiendo ser detectados en los
cultivos 10 a 14 días después de su aplicación (INECC, 2004).
El principal proceso de transformación en agua sería por hidrólisis y la
misma aumenta considerablemente a pH alcalinos. Estudios muestran
13
concentraciones de clorpirifos en un rango de 73 a 700 mg.L-1 en cuerpos de
agua adyacentes a cultivos de América del Norte (Moore et al., 2002; USEPA,
2002; Mazanti et al., 2003, en Demetrio, 2012). Marino y Ronco (2005)
detectaron concentraciones de clorpirifos en arroyos adyacentes a cultivos de
soja pampeanos con un promedio de 1,7 x 10-3 mg.L-1 posterior a eventos de
lluvia. La mayor concentración medida es en la misma zona durante un período
de escorrentía posterior a lluvias (Jergentz et al., 2005, citado en Demetrio,
2012), detectando 0,45 x 10 mg.L-1 y para el mismo evento el máximo de 225,8
mg.kg-1 en material particulado.
El Clorpirifos etil constituye un grave riesgo para la vida silvestre. La
sensibilidad de las especies varía considerablemente entre reino y filos. En
general, los microorganismos y las plantas acuáticas y terrestres son tolerantes
a la exposición al clorpirifos (Barron y Woodburn, 1995) Es extremadamente
tóxico para peces. En invertebrados acuáticos, la DL50 24 hs es de 0,0037 mg.L-1
para Daphnia magna (Guilhermino, Diamantino, Silva y Soares, 2000). En la
descendencia de animales expuestos produce malformaciones y disminución
de la sobrevivencia, crecimiento, reproducción y producción de biomasa. Las
poblaciones de larvas de artrópodos y moluscos son especialmente afectadas.
En las aves la severidad de sus efectos tóxicos varía de moderada a
extremadamente alta. En varias especies de pájaros se han descrito efectos
adversos tales como: diarrea, letargo, debilidad en las alas, descoordinación
muscular, temblores, parálisis, falta de alimentación, pérdida de peso en crías y
adultos, disminución del número y peso de los huevos, reducción de la
sobrevivencia de la descendencia y adelgazamiento del cascarón. En
ecosistemas acuáticos reduce la diversidad y abundancia de especies. Es
tóxico para abejas y algunas especies de plantas como la lechuga. La toxicidad
de este compuesto se incrementa al aumentar la temperatura. Las especies
pequeñas son más susceptibles a este plaguicida (INECC, 2004).
Glifosato
El glifosato es un herbicida órgano-fosforado, de amplio espectro, no
selectivo. Es una sustancia sintética del grupo de la fosfoenolglicina. Su
14
estructura química: C3H8NO5P (N-(phosphonomethyl)glycine IUPAC) (Figura
2.3.A) , con masa molecular: 168 g/mol, CAS nro: 1071-83-6 (INECC, 2004). Es
un compuesto derivado del aminoácido glicina, con ácido fosfórico unido al
radical amino. El glifosato es un ácido pero comúnmente es utilizado en forma
de sal, más comúnmente como sal de isopropilamina. El compuesto recibe
diferentes nombres según esté asociado a otros compuestos (nombre-[CAS]):
glyphosate-diammonium[69254-40-6], glyphosate-dimethylammonium [34494-
04-7], glyphosateisopropylammonium[38641-94-0], glyphosate-
monoammonium [40465-66-5], glyphosate-potassium [70901-20-1], glyphosate-
sesquisodium [70393-85-0], glyphosate-trimesium [81591-81-3] Entre las
formulaciones más frecuentes, los ingredientes básicos son la sal
isopropilamina (IPA) del glifosato + un surfactante + agua. La formulación más
extendida es el Roundup®, la que contiene 480 g.L-1 de la sal IPA (CONICET,
2009).
Figura 2.3. Glifosato. a) estructura molecular (Tomado de PPDB, 2014b). b)
mecanismo de acción en OGM resistente al glifosato. Fuente: Monsanto
(2007).
La solubilidad del herbicida en agua a 20oC es 10.500 mg l-1, el punto de
fusión es de 189,5 oC. En condiciones aerobias la degradación en suelos tiene
como DT50: 12 días; a diferencia de 49 días en el laboratorio a 20oC.
El glifosato ejerce su acción herbicida a través de la inhibición de una
enzima, enolpiruvil shikimato-fosfato-sintetasa (EPSPS), enzima responsable
de la formación de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano
15
(Fig. 9 B), impidiendo así que las plantas elaboren tres aminoácidos aromáticos
esenciales para su crecimiento y supervivencia . Considerando las propiedades
del producto, y que este es absorbido por las hojas y no por las raíces. Se
puede aplicar a las hojas, inyectarse a troncos y tallos, o asperjarse a tocones
como herbicida forestal (Guarnizo Salazar, 2010).
Los datos ecotoxicológicos del glifosato, indican que la toxicidad aguda
(DL50) en mamíferos (Rata) por vía oral es > 2000 mg.kg-1, en aves > 2000
mg.kg-1, en el pez (Oncorhynchus mykiss) 38 mg L-1 DL50 (96 horas). En
invertebrados la toxicidad es moderada, así en D. magna la toxicidad es de 40
mg L-1 DL50 48 hs; en abejas mielíferas (Oral) el efecto agudo a las 48 horas es
de 100 µg abeja-1, y en lombrices (Eisenia foetida) la LC50 a los 14 días > 480
mg.kg-1. En organismos fotosintéticos por su parte, la toxicidad en plantas
acuáticas (Lemna gibba) medida a los 7 día fue de 12 mg.L-1, en plantas
terrestres como en Lactuca sativa la DL50 por inhibición de la elongación
radicular es de 9,9 mg.L-1 de glifosato (Martin y Ronco, 2006). En algas
(Scenedesmus quadricauda) la EC50 es de 4,4 mg.L-1 (Lallana, et al. 2013;
PPDB, 2014b)
Considerando el modo absorción por parte de la planta, “aunque el
glifosato no se aplica directamente a los suelos, una concentración significativa
del compuesto puede llegar al suelo”. No obstante, en el informe de Evaluación
de la Información Científica Vinculada al Glifosato en su Incidencia sobre la
Salud Humana y el (2009), elaborado por el Consejo Científico Interdisciplinario
(CCI) de la República Argentina, se recaba de manera extensa las propiedades
y los riesgos que implican el uso del glifosato. El documento concluye entre
otros puntos que: “la contaminación de las corrientes subterráneas con
glifosato es poco probable excepto en el caso de un derrame apreciable o de
otra liberación accidental o descontrolada. Puede encontrarse en aguas
superficiales cuando se aplica cerca de los cuerpos de agua, por efecto de la
deriva o a través de la escorrentía. Estudios en otros países indican que la
persistencia del herbicida en el suelo puede llegar a ser inferior a los 6 meses”
(CONICET, 2009).
Tras la aplicación del glifosato en forma de spray, sedimenta por acción
de la gravedad, posteriormente llega y se adsorbe fuertemente a los suelos, en
16
los cuales permanece en las capas superiores debido a su bajo potencial de
lixiviación. En el follaje de las plantas y en la hojarasca su persistencia es
menor. En los cuerpos de agua se disipa rápidamente debido a su adsorción y
posible biodegradación. El sedimento es el principal sitio de almacenamiento
de este plaguicida, donde se incrementan los niveles tras su aplicación, aunque
declinan significativamente en pocos meses. No se bioconcentra en los
organismos acuáticos ni se biomagnifica a lo largo de la cadena trófica (INECC,
2004 ; WHO, 1994).
La ruta que seguiría el glifosato, una vez llegado el suelo es el propuesto
en CONICET, (2009, p.18) :
• La formación de complejos con iones de Ca2+ y Mg2+ presentes en el
agua.
• La adsorción en sedimentos o partículas suspendidas en el agua y el
suelo.
• El ingreso en el metabolismo de las plantas.
• Su biodegradación por micro-organismos.
• El arrastre por escorrentía y la contaminación de fuentes de agua
superficiales.
El principal proceso que regula su movilidad del glifosato es la retención.
Posee una alta afinidad a ser retenido por las partículas del suelo, aunque,
existen antecedentes que muestran pérdidas por lixiviación a través de vías de
flujo preferencial cuando las precipitaciones ocurren inmediatamente después
de la pulverización sobre suelos húmedos. Dichas condiciones son aquellas
representativas de la recarga del acuífero. (AEGA, 2009 citado en CONICET,
2009).
El principal mecanismo de degradación del glifosato en el suelo, es el
bacteriano, su metabolito el ácido aminometil-fosfónico (AMPA) y dióxido de
carbono (CONICET, 2009). El AMPA también es tóxico y algo más móvil en el
suelo, pero se degradará con facilidad, quedando pequeñas cantidades para la
lixiviación.
17
CAPÍTULO 3: EVALUACIÓN DE RIESGOS ECOTOXICOLÓGICOS
Los ecosistemas están compuestos por grupos de todo tipo de
organismos que funcionan conjuntamente e interaccionan con el ambiente
físico. A su vez, el conjunto de ecosistemas constituye el entorno. El ciclo y el
flujo de materiales mantienen una conexión variable dentro de los sistemas
ecológicos, de modo que las alteraciones de un elemento pueden plasmarse en
otro elemento aparentemente distinto. En general, los ecosistemas están en un
estado de comunicación constante, lo cual facilita los efectos a gran escala de
la contaminación. En este sentido la ecotoxicología abarca todos los aspectos
de los sistemas terrestres y acuáticos que permiten identificar los efectos
ejercidos por la exposición a un contaminante sobre la biota (Klaassen y
Watkins, 2005).
La ecotoxicología es el estudio científico del destino de las sustancias
tóxicas y de sus efectos sobre un ecosistema, y se basa en investigaciones
científicas que emplean tanto prueba sobre el terreno como métodos de
laboratorio.
Las evaluaciones ecotoxicológicas son un instrumento de monitoreo y
control cada vez más necesario, esto debido al incremento de la contaminación
ambiental, que se refleja en el empleo de cantidades o concentraciones de
polutantes. Capó M. 2002 (pág. 148) menciona que la evaluación de riesgo en
el medio ambiente consiste en: a) determinar la cantidad de los agentes
nocivos del medio ambiente, y b) comparar los resultados obtenidos con los
límites máximos de exposición adoptados. Además, la primera actividad exige
distintos tipos de mediciones y análisis:
- Medición de los niveles de riesgos tales como el ruido y la radiación.
- Medición de factores ambientales tales como la temperatura, la
humedad y los desplazamientos del aire.
- Medición de las concentraciones de contaminantes transportados por el
aire.
- Recogida de muestras de aire para su ulterior análisis en el laboratorio.
18
En relación al segundo punto, la comparación de los resultados
obtenidos, requiere de dos etapas:
- La evaluación de la exposición, se inicia con la identificación de los
riesgos mediante la observación cuidadosa de los procesos industriales,
laborales, las materias primas utilizadas, los subproductos, los posibles riesgos,
los vertidos, las practicas de trabajo, etc. Seguidamente, a esta primera fase se
deben prepara una estrategia de muestreo en la que se dé prioridad a los
riesgos más significativos y obtener muestras representativas. En el caso del
estudio de los agentes con efectos crónicos acumulados, conviene efectuar un
muestreo a largo plazo (Capó M, 2002), esto es aplicable cuando se tiene
como objetivos la evaluación de los efectos de plaguicidas en el ambiente.
Figura 3.1. Metodología propuesta para estimar la concentración de
plaguicidas y los efectos sobre organismos modelos. Fuente: WHO (1994b).
- La evaluación de la toxicidad, en este punto es necesario determinar
la naturaleza de la población de la prueba. Idealmente los organismos
utilizados deben ser genéticamente idénticos, y libres de agentes patógenos.
19
Deben conservarse en condiciones estériles en un ambiente constante e
iluminado con luz artificial, con fotoperiodo similar al natural.
Para la determinación de los niveles de toxicidad aguda y crónica de las
aguas actualmente se disponen de una serie de pruebas con diversos
organismos modelos. Estos ensayos están concebidos para determinar los
efectos inmediatos y tardíos de la exposición química sobre una serie de
criterios de valoración, como la supervivencia, la reproducción, y las respuestas
bioquímicas y fisiológicas (ibid).
Las especies del género Daphnia son las más utilizadas como
organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia
distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la
comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la
reproducción partenogenética, y el corto ciclo de vida con la producción de un
alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de
toxicidad, de carácter universal. (Castillo et al., 2004). Los ensayos de toxicidad
con Daphnia magna permiten determinar la letalidad potencial de sustancias
químicas puras (Guilhermino et al., 2000), aguas residuales domésticas e
industriales (Baral, Engelken, Stephens, Farris, y Hannigan, 2006), lixiviados,
aguas superficiales o subterráneas, agua potable y agua de poro de
sedimentos, entre otros. (Castillo, et al. 2004; Rodriguez, Martinez-Madrid, y
Cid, 2006; Wernersson y Dave, 1997 ). En las pruebas de toxicidad con D.
magna, se utilizan neonatos menores de 24 h de edad, que son expuestos a
los tratamientos, por un periodo de 48 h (test agudo) hasta 21 días (test
crónico).
Para estimar los efectos sobre la comunidad vegetal, se disponen de
organismos modelos como Lactuca sativa, Allium cepa, Lemna sp. entre otros .
L. sativa se utiliza para realizar bioensayos de toxicidad aguda, de 120 horas
de exposición, lo que permite evaluar los posibles efectos fitotóxicos de las
aguas, sedimentos e inclusive de sustancias puras y mezclas, en el proceso de
germinación de las semillas y en el desarrollo de las plántulas. Se establece
como punto final para la evaluación de los posibles efectos tóxicos, la inhibición
de la prolongación del crecimiento de la radícula. (Castillo et al., 2004). ). El
20
segundo es utilizado para evaluar el efecto genotóxico, mediante el Allium test,
por la sensibilidad a los componentes del agua y de los sedimentos (Fiskesjo,
1985).
La evaluación de riesgo ecológico es un proceso de asignación de
magnitudes y probabilidades a los efectos adversos de actividades antrópicas y
catástrofes naturales recurre tanto a métodos predictivos para la evaluación de
la exposición, como de los efectos de sustancias tóxicas a distintos niveles de
organización y escala trófica.
Castillo et al. (2004), mencionan lo siguiente:
Históricamente, los efectos han venido siendo estudiados en el
nivel de los organismos, de las poblaciones y de los ecosistemas. Dado
que en la mayoría de los casos no es posible la eliminación de la
toxicidad, las agencias u organismos de protección ambiental deben
definir la proporción de mortalidad o la reducción del crecimiento
tolerable de las especies expuestas. Sin embargo, los ensayos de
toxicidad y los modelos de extrapolación no son suficientes para encarar
este tipo de problemas. Ante esta situación plantean la siguiente
interrogante: ¿qué significa la muerte de un organismo en la escala de
las poblaciones? Probablemente nada, dado que puede ser
reemplazado a corto plazo, y además está programado, como condición
de todo ser vivo, para que esto suceda. El problema de interés está
relacionado con la evaluación de los efectos sobre la abundancia,
producción y persistencia de las poblaciones y los ecosistemas.
21
CAPÍTULO 4: LA RESERVA PARA PARQUE NACIONAL SAN RAFAEL
La Reserva para Parque Nacional San Rafael (Figura 4.1), forma parte
del Bosque Atlántico del Alto Paraná (BAAPA) o Mata Atlántica, y gran parte de
su fauna y flora se corresponde a esta ecorregión. El Bosque Atlántico se
extiende desde el sudeste de Brasil, el noreste de Argentina y el este de
Paraguay es ampliamente reconocido como un punto de acceso para la
biodiversidad conservación porque de su alto niveles de diversidad y
endemismos, junto con la hecho de que es una de las más amenazadas
ecorregiones del mundo (Myers, Mittermeier, Mittermeier, Fonseca y Kent,
2000).
El Bosque Atlántico es una de las 25 áreas más reconocidas del mundo
como un “Hotspot” de biodiversidad, donde la vegetación original ha sido
reducida en más del 70%, y albergando actualmente a más del 60% de las
especies terrestres del planeta. Estas áreas críticas ocupan menos del 2% de
la superficie terrestre (Cartes, 2005).
El Paraguay mantiene todavía una relativa gran extensión de
remanentes de BAAPA (aproximadamente unas 1.152.332 ha), esto constituiría
apenas el 13,4% de la extensión original del BAAPA en nuestros país (Di Bitteti
et al., 2003). Por otro lado, el Paraguay presentaba hasta hace muy poco
tiempo, una de las mayores tasas de desmonte entre los países americanos
(Altstatt et al., 2003, citado por Di Bitteti et al., 2003). Sin embargo, la situación
pudo ser contenida, hasta cierto punto, como resultado del destacable esfuerzo
realizado por gestores ambientales de los sectores privado y público, que llevó
a la promulgación y puesta en marcha de la Ley Nº 2524/04 “De prohibición en
la Región Oriental de las actividades de transformación y conversión de
superficies con cobertura de bosques” (también conocida como “Ley de
Deforestación Cero”), por la que se prohibía la conversión de los bosques de la
Región Oriental por dos años. En el año 2006, fue promulgada una nueva Ley,
la 3139/06, en donde quedó establecida la prórroga de la misma prohibición
hasta el año 2008 (De Egea y Balbuena, 2011).
El Bosque Atlántico del Alto Paraná es considerado como un centro de
endemismos. Unas 85 especies de peces, 7 de anfibios, 1 de reptiles, 80 de
22
aves y 11 de mamíferos son estrictamente endémicas de esta ecorregión. A su
vez, muchas más especies de vertebrados, con tendencias poblacionales en
descenso, muestran actualmente una distribución restringida exclusivamente a
los remanentes de Bosque Atlántico. En cuanto al grupo de las plantas, el
conocimiento de la cantidad de especies endémicas se ve dificultado por la
falta de un registro detallado de las mismas, ya que la información sobre el
tema se encuentra muy dispersa (Fragano y Clay, citado por Cartes, 2005). Sin
embargo, se pueden citar al menos 136 especies de plantas de distribución
restringida al país, y muchas de ellas se encuentran particularmente
circunscritas al BAAPA (Barreto et al. 2004, citado por De Egea y Balbuena,
2011).
Según De Egea y Balbuena (2011), en el año 1990, luego de estudios
preliminares de la biodiversidad del sitio; la cordillera y el cerro San Rafael
fueron reconocidos por el Centro de Datos para la Conservación como “Área
Prioritaria para la Conservación de la Región Oriental del Paraguay”, por
albergar a especies de fauna y flora consideradas endémicas del Bosque
Atlántico del Alto Paraná. Dos años más tarde, por Decreto Nº 13.680/92, el
Estado declara al área de la cordillera y cerro San Rafael como “Reserva para
Parque Nacional San Rafael”
La cordillera San Rafael comprende el último complejo de serranías que
se proyectan de norte a sur en la Región Oriental del Paraguay. Este complejo
conformado por Amambay, San Joaquín, Caaguazú, Yvyturuzú y San Rafael
(de Norte a Sur) conforma una serie de lomadas y cerros de manera más o
menos continua, delimitada las cuencas de los ríos Paraná y Paraguay. Estas
zonas históricamente representaron bosques altos sobre suelos arcillosos
(cuenca del Rio Paraná) y suelos arenosos (cuenca del Rio Paraguay),
conformando un continuum que en la Región Oriental alcanzaban unos 80.000
km2 de extensión. Originalmente se definió un área aproximada de 90.000
hectáreas, como una de las áreas prioritarias definidas abarcando unos ocho
municipios de los departamentos de Caazapá e Itapuá con punto central en las
coordenadas 26°25´S y 55°40´W (Cártes et al., 2005).
23
Figura 4.1. Ubicación del área de estudio. Fuente: Esquivel M. et al. (2007)
En este contexto el Parque Nacional San Rafael (26°25´S, 55°40´W) se
encuentra en la cuenca superior del rio Tebicuary, abarcando los
departamentos de Itapuá y Caazapá. Incluyendo 748 kilómetros cuadrados que
abarcan la Mata Atlántica y el Ecosistema de Praderas mesopotámicas, con
elevaciones entre 100-500 m. Las precipitaciones caen durante todo el año, la
lluvia con un promedio anual de 2.100 mm, y es mayor entre Octubre y febrero.
La temperatura es variable con el período más caluroso siendo octubre a abril
(promedio 23.8 °C) y el más frío de mayo a septiembre (media 17º C).
(Esquivel M. et al., 2007)
En lo referente a la biodiversidad, según estudios recabados por De
Egea Juvinel y Balbuena (2011) se disponen de las siguientes cantidades de
especies por grupos taxonómicos (Tabla 4.1)
24
Tabla 4.1 Comparación entre las especies registradas en San Rafael y las
estimadas para el Paraguay.
Grupo taxonómico
Total de especies
registradas en San
Rafael hasta la fecha
(SEAM 2002)
Total de especies
estimadas para el
Paraguay (ENAPRENA
1995; SEAM 2003)
Plantas 322 13.000
Invertebrados 650 100.000
Peces 52 200-250
Anfibios 33 46-76
Reptiles 27 100-150
Aves 399 707
Mamíferos 61 167-175
Fuente: De Egea y Balbuena (2011, pág. 11).
En lo referente a los recursos hídricos en San Rafael se presentan
numerosos arroyos y ríos, en ciertos puntos de su recorrido, además de
desniveles naturales bruscos e importantes, generalmente con pendientes
mayores al 60%. De acuerdo a la mayor o menor altura del desnivel, se pueden
formar, respectivamente, los denominados saltos de agua o rápidos, en donde
la corriente aumenta su aceleración y su oxigenación. En estos sitios, por las
características del entorno se crea un microclima donde se desarrollan
especies de plantas adaptadas a estas condiciones. Dos de saltos de agua se
destacan por su particular belleza, el salto Takuapi (también denominado salto
Poty) y el Salto Tembey (De Egea y Balbuena, 2011).
25
MARCO EMPÍRICO
26
CAPÍTULO 5: DISEÑO METODOLÓGICO
5.1. Introducción
Para la determinación de los niveles de toxicidad de las aguas
actualmente se disponen de una serie en ensayos con diversos organismos
modelos, representantes de bacterias, algas, invertebrados, vertebrados y de
plantas. Para el presente trabajo se seleccionaron dos organismos modelos,
que mediante ensayos ecotoxicológicos estandarizados, permiten corroborar
de manera representativa, los posibles efectos tóxicos, sobre la comunidad
zooplanctónica y de la comunidad vegetal de los contaminantes presentes en
las muestras. Los organismos seleccionados fueron Daphnia magna y Lactuca
sativa. Se aplicaron los test de toxicidad aguda, y crónica sugeridas por la red
Water Tox, la UESPA (U.S. Environmental Protection Agency) y la OECD
(Organization for Economic Cooperation and Development). Estos organismos
fueron seleccionados en base a criterios, tales como, la disponibilidad,
representatividad y facilidad de cultivo.
Las especies del género Daphnia son las más utilizadas como
organismos de prueba o de referencia en pruebas de toxicidad. La amplia
distribución geográfica, el importante papel que cumplen al interior de la
comunidad zooplanctónica, la facilidad de cultivo en el laboratorio, la
reproducción partenogenética, y el corto ciclo de vida con la producción de un
alto número de crías, han hecho de este grupo un ideal para la evaluación de
toxicidad, de carácter universal. (Castillo et al. 2004). El género Daphnia se
ubica dentro del Orden cladócera, de la Clase Branchiopoda, perteneciente al
Phylum Arthropoda. Es un invertebrado celomado y protostomado y de simetría
bilateral. Presenta órganos verdaderos, con antenas bien desarrolladas que las
utilizan para la natación. Son consumidores secundarios mediante la filtración
de microalgas (Ruppert y Barnes, 1995). Los ensayos de toxicidad con Daphnia
magna permiten determinar la letalidad potencial de sustancias químicas puras,
aguas residuales domésticas e industriales, lixiviados, aguas superficiales o
subterráneas, agua potable y agua de poro de sedimentos, entre otros. En las
pruebas de toxicidad con D. magna, se utilizan neonatos menores de 24 h de
27
edad, que son expuestos a la muestra o compuesto a probar, por un periodo de
48 h, al término del cual se cuantifica el número de organismos muertos. Con
estos resultados se establece la proporción o porcentaje de mortalidad
producida., y es posible determinar la concentración letal 50 (CL50).
Como representante de la comunidad vegetal, se seleccionó a Lactuca
sativa D. C (lechuga). Si bien L. sativa no es un representante de los
ecosistemas acuáticos. Es ampliamente aceptado su uso como biomonitor
considerando la sensibilidad y la capacidad de reproducir los efectos nocivos
sobre las plantas presentes en zonas cercanas a causes hídricos
contaminados (Castillo et al. 2004). L. sativa pertenecen la familia Asteraceae,
y a la Clase Magnolipsida, del Reino Plantae. Son plantas anuales o bienales
de porte erecto y hasta 1 m de altura. Sus hojas basales son arrepolladas, y las
caulinares son sésiles y arrocetadas, se reproducen de forma sexual por
semillas y son de distribución cosmopolita. En L. sativa durante la germinación
y los primeros días de desarrollo de la planta ocurren varios procesos
fisiológicos en los que la presencia de sustancias tóxicas pueden interferir y
alterar el desarrollo normal de la planta, siendo esta etapa de gran sensibilidad
a los agentes externo, como son los contaminantes. Muchas de las reacciones
bioquímicas que ocurren en esta etapa son comunes a la mayoría de las
semillas, por lo que las respuestas positivas o negativas pueden generalizarse
a otros vegetales (Ibíd) Este biosensor se utilizó para realizar un bioensayo de
toxicidad aguda, de 120 horas de exposición, lo que permite evaluar los
posibles efectos fitotóxicos de las aguas, sedimentos e inclusive de sustancias
puras y mezclas, en el proceso de germinación de las semillas y en el
desarrollo de las plántulas durante los primeros cinco días del crecimiento. Se
estableció como punto final para la evaluación de los posibles efectos tóxicos,
la inhibición de la prolongación del crecimiento de la radícula. (Castillo, 2004;
Dutka et al., 1989)
La sensibilidad de los biosensores utilizados fueron determinados en el
laboratorio, mediante ensayos con Cipermetrina y Clorpirifos en D. magna, y
para el herbicida Glifosato, se ensayaron tanto en D. magna, como en L. sativa.
Los parámetros determinantes de calidad de agua seleccionados fueron:
Nitratos, fósforo total, Sulfatos, pH, oxígeno disuelto, dureza y D.B.O5. Se
28
evaluó la presencia de dos de los biocidas mayormente utilizado en los cultivos
de soja y trigo, Cipermetrina y Clorpirifos a través de una cromatografía líquida
de alta performance (HPLC).
5.2. Variables
Variables independientes
- Datos de la muestra: fecha (variable nominal) y datos geográficos
(Variable nominal).
- Concentración de plaguicidas (variables discretas): glifosato, clorpirifos
y cipermetrina medidas en mg.L-1 o g.L-1
- Datos fisicoquímicos de las muestras (Variables discretas): pH (UpH),
oxígeno disuelto, dureza, sulfato, nitrato, fósforo total.
Variables dependientes
- Toxicidad aguda en Daphnia magna y Lactuca sativa: DL50 y CE50
(Variables discretas):
- Toxicidad crónica medida como número de individuos en 21 días de
ensayo en D. magna.
Constantes o de control
Número de organismos utilizados en los ensayos agudos y crónicos con
D. magna (10 neonatos por réplica en ensayos agudos, y 1 por réplica en los
crónicos tratamientos) tiempo de duración de los ensayos (24 y 48 horas para
los ensayos agudos y 21 días para los ensayos crónicos). Número de semillas
utilizados en el ensayo con L. sativa (20 semillas por réplica) y tiempo de
duración (120 horas); y los parámetros fisicoquímicos requeridos durante el
mantenimiento de los organismos (pH, dureza, temperatura y oxígeno disuelto).
29
5.3. Muestra
5.3.1. Localización del área de estudio
El Área de reserva para Parque Nacional San Rafael (26º25’S, 55º40’O)
se encuentra en la cuenca alta del Río Tebicuary, sobre la Cordillera de San
Rafael, entre los departamentos de Itapúa y Caazapá, Paraguay (Figura 4.1).
Abarca un área de 74.800 ha en el cual se desarrollan dos ecorregiones
importantes, el Bosque Atlántico de Alto Paraná y los Pastizales de la
Mesopotamia.) Las muestras de agua y de los sedimentos, fueron tomadas en
cinco puntos de la reserva, en el área a cargo de la Fundación Pro Cosara, y
zonas periféricas a la misma (figura 5.1)
La ubicación geográfica de los cinco puntos de muestreo se resume
como sigue:
Punto 1 (P1): 26°36'59.30"S, 55°39'58.70"O; Arroyo de sendero
Chachi. Ubicada en la reserva, en zona boscosa.
Punto 2 (P2): 26°37'11.10"S, 55°35'12.60"O; Arroyo Pirapó. Zona de
cultivos agrícolas.
Punto 3 (P3): 26°34'47.10"S, 55°37'2.70"O; Arroyo Taguató. Zona de
cultivos agrícolas.
Punto 4 (P4): 26°38'3.50"S, 55°39'44.60"O; Laguna artificial en Pro
Cosara
Punto 5 (P5): 26°39'56.10"S, 55°43'08.26"O; Arroyo Perlita. Zona de
cultivos agrícolas.
5.3.2. Identificación de las Muestras
Las muestras fueron etiquetadas y denominadas según el tipo de
matriz (agua o sedimento) y el punto de muestreo, como sigue:
Muestras de Sedimentos: SP1, SP2, SP3, SP4, SP5
30
Muestras de Agua: AP1, AP2, AP3, AP4, AP5
Figura 5.1. Vista general de la Ubicación de las zonas de muestreo.
Figura 5.2. a) Imagen satelital. b) fotografía en P1.
Figura 5.3. a) Imagen satelital. b) fotografía en P2.
31
Figura 5.4. a) Imagen satelital. b) Fotografía en P3.
Figura 5.5. a) Imagen satelital. b) Fotografía en P4.
Figura 5.6. a) Imagen satelital. b) Fotografía en P5.
32
5.3.3 Periodo de toma de muestras
En total se realizaron 7 muestreos distribuidos entre finales de 2012 y de
2013. Las fechas de muestreo se indican a continuación:
- Primer muestreo: 01/10/2012
- Segundo muestreo: 17/11/2012
- Tercer muestreo: 17/12/2012
- Cuarto muestreo: 31/01/2013
- Quinto muestreo: 18/04/2013
- Sexto muestreo: 08/09/2013
- Sétimo muestreo: 12/10/2013
5.4. Instrumentos de Medición y técnicas
Recogida traslado de muestras
Las muestras de agua fueron colectadas y mantenidas hasta su estudio
según criterios establecidos en APHA (1998). Para los ensayos toxicológicos y
para la determinación de los parámetros fisicoquímicos las aguas fueron
almacenadas en envases de polipropileno de 5 L de capacidad, a excepción de
las utilizadas para la determinación de fosforo total y las destinadas para la
determinación de plaguicidas, para las que se utilizaron frascos de vidrio color
ámbar de 200 ml, y 1 L de capacidad respectivamente. Los sedimentos se
recogieron en bolsas plásticas de 1L. En todos los casos, inmediatamente a la
toma de las muestras, estas fueron depositadas en conservadoras a 4° C.
5.5. Procedimientos
5.5.1. Mantenimiento y selección de los organismos de prueba
Cultivo de D. magna
33
Los individuos utilizados fueron originalmente obtenidos del Centro de
Investigación del Medio Ambiente (CIMA) de la Universidad Nacional de la
Plata, Argentina. Los cultivos se mantienen en el Laboratorio de Mutagénesis
Ambiental (Figura 5.7), a base de agua dura reconstituida (APHA, 1998),
alimentadas con la microalga Chlorella sp. La microalga, a su vez se mantiene
en medio de cultivo con fertilizante foliar NPK (20:20:20). Las condiciones
fueron las siguientes: fotoperiodo de luz/oscuridad de 16/8 horas, temperatura
de 20 °C, ph 7-8, y una dureza de 160-180 mg CaCO3/L (NMX, 2010; Castillo
et al. 2004).
La evaluación de la sensibilidad de los organismos de prueba, se realizó
periódicamente mediante el ensayo agudo con el tóxico de referencia
dicromato de potasio, y la comparación de la DL50 con la carta control del
Laboratorio. Los límites DL502DS, corresponden al intervalo de concentración
aceptable, para validar los resultados de los ensayos, según lo propuesto por
Castillo et al. (2004).
Figura 5.7. Mantenimiento de lotes parentales de D. magna Laboratorio de
Mutagénesis Ambiental de la FACEN. Fuente: imagen propia
5.5.2. Procesamiento de las muestras. Preparación de elutriados de
los sedimentos
Previo a cada bioensayo se realizaron extracciones acuosas de los
sedimentos. Se prepararon elutriados de los sedimentos de cada punto,
manteniendo una proporción 1:4 de sedimento y agua (Ramirez Romero y
Mendoza Cantú, 1998). Para el efecto se midió 500 g de cada sedimento, para
luego transferirlos a envases de vidrio, de 7 L de capacidad, al que se le
34
agregó 2 L de agua de cultivo (agua dura reconstituida, APHA, 1998) a cada
envase. La mezcla se agitó durante 30 minutos, y posteriormente se dejó
decantar la suspensión en un refrigerador a 4 ° C, durante 24 horas. Una vez
transcurrido el tiempo se filtró el sobrenadante, utilizando el líquido del filtrado
para los respectivos ensayos (Figura 5.8).
Figura 5.8. Preparación de elutriados de sedimentos en el Laboratorio de
Mutagénesis Ambiental de la FACEN. (a) refrigeración, filtración (b) del
elutriado. Fuente: propia.
5.5.3. Toxicidad de plaguicidas en D. magna y L. sativa
Se testearon en forma aguda con Daphnia magna los plaguicidas
cipermetrina, clorpirifos y glifosato de formulación comercial. Se siguieron los
delineamientos propuestos por la OECD (1998). Los ensayos se realizaron
aplicando el diseño DBCA n×3, trabajando con diferentes concentraciones
tanto del clorpirifos, cipermetrina y glifosato; como medio de dilución de los
plaguicidas se utilizó agua dura reconstituida (cipermetrina y glifosato), y agua
dura más metanol (clorpirifos); se trabajaron con diferentes concentraciones
(tratamientos), y dos controles, cada una con 3 réplicas de 10 neonatos del
cladócero. Los estudios se extendieron por 24 horas, y al final se registraron los
individuos muertos para cada tratamiento, previo al conteo los envases se
agitaban suavemente por 10 segundos y posteriormente se realizaban el
conteo de los organismos inmóviles o muertos por cada réplica. Se estimó la
dosis letal 50 (DL50) mediante el método Probit. Solo se aceptaron los
resultados si la supervivencia en el control negativo era superior al 90 %, y si la
35
DL50 con el dicromato se encuentra entre 2.5 a 0.3 mg.L-1 (NMX-AA-087-SCFI-
2010)
Por otro lado, se realizó la prueba de toxicidad aguda por inhibición del
crecimiento radicular en Lactuca sativa, frente al glifosato de formulación
comercial, obtenida de un comercio local. Las semillas fueron expuestas a 5
concentraciones diferentes (entre 100 mg.L-1 y 0.01 mg.L-1), y dos controles,
todo por duplicado. Al trascurrir las 120 horas del ensayo, se procedió a la
medición de la variable respuesta, que consistió en el porcentaje de inhibición
del crecimiento radicular de los plantines, para posteriormente estimar la DL50
por el método Probit (Dutka et al. 1989).
5.5.4. Parámetros fisicoquímicos de calidad de aguas
La determinaciones de los parámetros fisicoquímocos se realizaron en el
Laboratorio de Calidad de Agua, de la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, aplicando Los criterios mencionados en el Standar Methods for the
examination of wáter and wast-wasters (APHA,1998); se midieron la DBO5 (SM,
5210 B), dureza total (SM, 2340 C), nitrato (reducción con cinc), fósforo total
(SM, 4500-P E), sulfato (turbidimétrico), pH (SM, 4500-H B) y Oxígeno disuelto
(electrométrico- SM, 4500-O G).
5.5.5. Determinación de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina en
muestras de agua
Para la determinación de los biocidas Cipermetrina y Clorpirifos, se
utilizó un equipo de cromotagrafía líquida de alta perfomance (HPLC) de la
marca Shimadzu, con detector UV, visible modelo SPD-M20/M10AVI (ver
anexo 3). El equipo cuenta con una bomba isocrática para fase móvil (LC-
20AT), un horno para columnas (CTO-20A), un detector UV/Visible (SPD-20A)
y un inyector automático (SIL-20A). El sistema es controlado a través del
software LC solution versión 2.2. Se trabajó bajo las siguientes condiciones
cromatográficas:
36
Fase móvil: Agua destilada y acetonitrilo
Flujo: 1 mL/min
Columna: C18 (250 nm.4.6 mm. 5µm)
Volumen de inyección: 20 µL
Temperatura: Ambiental
Detector: 235 nm
Tiempo de corrida: 11,4 minutos para el clorpirifos y entre 14-15 minutos
para los tres isómeros de la cipermetrina.
La determinación de los plaguicidas se realizó en dos oportunidades, a
las muestras de agua tomadas durante el tercer y a las del séptimo muestreo
respectivamente.
5.5.6. Bioensayos de toxicidad aguda con D. magna
Los ensayos se realizaron aplicando el diseño DBCA 7×3 (OECD 1998),
con dos controles y cinco concentraciones de las muestras de agua y elutriados
de sedimento de cada punto: 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 % y 6,25 %
(tratamientos), las diluciones fueron preparadas con agua dura reconstituida
(APHA, 1998), por triplicado, cada una con 30 ml de la muestra y 10 neonatos
menores a 24 horas de nacidas (Tabla 5.1, Figura 5.9). Se utilizaron los
mismos criterios de aceptación seguidos en los ensayos agudos con los
plaguicidas. (NMX-AA-087-SCFI-2010).
Tabla 5.1. Resumen de las condiciones de prueba para la realización del
ensayo agudo con D. magna.
Variable Especificación
1. Tipo de prueba Estático
2. Duración de la prueba 24 horas
3. Temperatura 20 2 ° C
37
4. Tamaño de la cámara de prueba 30 ml
5. Número de réplicas 3
6. Número de organismo por réplica 10
7.Número de organismos por concentración 30
8. Aireación Forzada 24 horas antes del
ensayo
10. Agua de dilución Agua dura reconstituida
11. Criterios de toxicidad Mortalidad (CL50)*
12 Criterios de aceptabilidad de la prueba Sobrevivencia de los controles
negativos 90%
* CL50 : Concentración o dilución que provoca un efecto agudo, mortalidad, en
un 50% de la población muestreada utilizada en el bioensayo.
Figura 5.9. Procedimiento de prueba del ensayo agudo en D. magna. Fuente:
Castillo et al., (2004, pág. 61)
5.5.7. Bioensayos de toxicidad aguda con Lactuca sativa
38
La fitotoxicidad de las aguas fue determinada mediante ensayos con
Lactuca sativa (Dutka et al., 1989). Se trabajó con un control negativo, y cuatro
concentraciones diferentes por cada muestra, y un factor de dilución de 0,5; a
partir de la muestra se prepararon soluciones al 50 %, 25 % y 12.5 % (% v/v).
Se utilizaron cápsulas de Petri de plástico descartables estériles, con papel
filtro Qualy, de 14 micras de poro y 12.5 cm de diámetro. Se colocaron con
ayuda de una pinza, 20 semillas por placa (Tabla 5.2, Figura 5.10). Cada
preparado fue embebido con 4 ml de del tratamiento, envueltas en bolsas
plásticas, a fin de evitar la pérdida de humedad, a su vez estas fueron
colocadas en cajas cerradas para evitar el contacto con la luz (Castillo et al.
2004) Posteriormente se incubaron los preparados en una estufa LAB-LINE,
modelo AMBI-HI-LO, a 20 ± 2 °C, a oscuridad total, por un periodo de 120
horas.
El porcentaje de inhibición de la prolongación de la raíz (IP) se estimó
mediante la siguiente ecuación:
Donde: IP negativa: Tóxica (inhibición de la prolongación de la raíz).
IP positiva: Se considera estimulación del crecimiento.
IP = 0: No tóxica.
El criterio de aceptación de los resultados fue la germinación en los
controles negativos 90%.
Tabla 5.2. Resumen de las condiciones de prueba para la realización del
ensayo agudo con L. sativa.
Variable Especificación
1. Tipo de prueba Estático
2. Duración de la prueba 120 horas
3. Temperatura 20 2 ° C
39
4. Condiciones de incubación Oscuridad
5. Tamaño de la cámara de prueba 4 ml
6. Número de réplicas 3
7. Número de semillas por réplica 20
8.Número de semillas por
concentración
60
9. Aireación Ninguna
10. Agua de dilución Agua dura reconstituida
11. Criterios de toxicidad Efectos subletales, % de inhibición del
crecimiento de la raíz (CE50)* y % de
germinación.
12 Criterios de aceptabilidad de la
prueba
Germinación en los controles negativos
90%
* CE : Concentración efectiva que provoca un efecto sobre tasa de crecimiento
de la raíz en un 50% de la población expuesta, durante el periodo de duración
del ensayo.
Figura 5.10. Procedimiento del ensayo agudo en L. sativa. Fuente: Castillo et
al. (2004, pág. 75).
40
5.5.8. Bioensayos de toxicidad crónica en D. magna
Para los ensayos crónicos se empleo un diseño semi-estático, las
pruebas se realizaron acorde a la guía propuesta por la (OECD, 1998) . Se
utilizaron 10 neonatos menores a 24 horas de nacidas (uno por recipiente) para
el control y para cada muestra de agua. A cada recipiente se le adicionó 100
mL de la muestra en cada caso. Se evaluaron los efectos sobre la
supervivencia y reproducción por 21 días. Durante el periodo de estudio, los
individuos fueron alimentados con Chlorella sp. cada dos días y el recambió de
agua se realizó dos veces por semana. Se contabilizaban y retiraban los
neonatos cada 3 días, durante el tiempo de duración del test.
El criterio de validación de los resultados fue en lo referente a las
condiciones biológica: la supervivencia ( 80%) y número promedio de
neonatos 60 en los controles negativos, no producción de epifias; y respecto
a las variables ambientales, variación del pH en una unidad y concentración de
OD >60% (Liu et al., 2012; OECD, 1998). Los resultados biológicos fueron
expresados como promedios S.D, y se analizaron estadísticamente usando el
análisis de varianza (ANOVA de una vía) para determinar las diferencias
significativas entre el control y los distintos tratamientos, seguido de la
comparación múltiple de Dunnett, que fue realizado empleando el software
SPSS 11.0. Se consideró un nivel de probabilidad menor a 0,05 como
significativo.
5.6. Hipótesis de trabajo
Los cultivos mecanizados de soja, trigo, maíz entre otros, recurren a al
uso de fertilizantes, y al control químico mediante plaguicidas, que son
transportados hasta los arroyos ubicados en las zonas de amortiguamiento de
la Reserva para Parque Nacional San Rafael, contaminando y constituyéndose
en un factor de riesgo ecotoxicológico para organismos acuáticos no blanco.
41
CAPÍTULO 6: RESULTADOS
6.1. Toxicidades agudas de los ingredientes activos clorpirifos y
cipermetrina, y de una formulación comercial de glifosato, utilizadas en
el manejo de los cultivos de soja
Los tests agudos en D. magna fueron ensayados dentro de los
siguientes rangos de concentraciones medidas: 0,0001-0,1 mg.L-1 para el
clorpirifos, 0,0005-0,02 mg.L-1 para la cipermetrina, y entre 1-100 mg.L-1 para el
glifosato formulado. Este último también fue evaluado con L. sativa entre 0,01-
100 mg.L-1. Las concentraciones de los plaguicidas no fueron verificadas
analíticamente.
Para D. magna, los ensayos con el dicromato de potasio, establecieron
que la sensibilidad del organismo permaneció dentro de márgenes aceptables,
según mencionado por Castillo et al. (2004). Por su parte, para L. sativa, se
realizó un ensayo de sensibilidad al lote de semillas utilizadas, con una
solución de sulfato de cobre. La carta control para ambos organismos se
presenta en el Anexo 1.
Los resultados de las pruebas de toxicidad en D. magna se presentan
en las tablas 6.1 a la 6.3. La validez de cada ensayo agudo con los plaguicidas,
se corroboró con dos tratamientos controles; el control positivo se evaluó con
una concentración única de Dicromato de potasio a 2 mg.L-1, en todos los
casos arrojaron como resultado mortalidad del 100% de los neonatos a las 24
horas, en cada uno de los ensayos tanto con la cipermetrina, el clorpirifos y el
glifosato formulado. Este valor se encuentra dentro de los límites que
establecen normas como la NMX (2010), que recomiendan aceptar los valores
de DL50 entre 0,6 mg.L-1 y 2,1 mg.L-1 de Dicromato. Por su parte en el control
negativo a base de agua dura reconstituida, en todos los ensayos no produjo
inmovilidad en los organismos, con un 100% de supervivencia al final del
bioensayo, así estas dos pruebas realizadas en simultaneo con los ensayos de
los plaguicidas, validaron los tests agudos.
42
Tabla 6.1. Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del Clorpirifos en D.
magna
Tratamiento Clorp.
(mg.L-1)
N° de
sujetos a
Número de individuos
muertos por réplica
Prom
edio
Mortalid
ad (%) R1 R2 R3
1 0,01 10 10 10 10 10 100,00
2 0,006 10 10 10 9 9,67 96,67
3 0,005 10 10 10 5 8,33 83,33
4 0,004 10 8 9 3 6,67 66,67
5 0,0025 10 4 5 4 4,33 43,33
6 0,001 10 3 3 2 2,67 26,67
Blanco b 0 10 0 0 0 0 0,00
Control
negativo c 0 10 0 0 0 0 0
Control
positivo d 2 10 10 10 10 10,00 100,00
a10 neonatos por cada réplica. C Agua dura b agua dura +metanol. c Dicromato
de potasio a 2 mg.L-1
Tabla 6.2. Resultado de los ensayos de toxicidad aguda de la cipermetrina en
D. magna.
Tratamiento Ciper.
(mg.L-1)
N° de
sujetos a
Número de individuos
muertos por réplica Prome
dio
Mortalidad
(%) R1 R2 R3
1 0,0200 10 10 10 10 10,00 100,0
2 0,0125 10 9 9 10 9,33 93,3
3 0,0063 10 8 7 8 7,67 76,7
4 0,0031 10 5 4 5 4,67 46,7
5 0,0010 10 1 2 1 1,33 13,3
6 0,0005 10 0 0 0 0,00 0,0
43
Control
negativob 0 10 0 0 0 0 0,00
Control
positivo c 2 10 10 10 10 10,00 100,00
a10 neonatos por cada réplica. b agua dura c Dicromato de potasio a 2 mg.L-1
Tabla 6.3. Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del glifosato de
formulación comercial en D. magna
Tratamiento Glif.
(mg.L-1
)
N° de
sujetos a
Número de individuos
muertos por réplica
Promed
io
Mortalidad
(%) R1 R2 R3
1 100 10 10 9 9 9,33 93,30
2 50 10 5 6 5 5,33 53,30
3 25 10 3 4 3 3,33 33,30
4 12,5 10 1 1 0 0,66 6,60
5 6,25 10 0 0 0 0 0,00
6 1 10 0 0 0 0 0,00
Control
negativo b 0 10 0 0 0 0 0,00
Control
positivo c 2 10 10 10 10 10,00 100,00
a10 neonatos por cada réplica. b agua dura reconstituida c Dicromato de potasio
a 2 mg.L-1
Al graficar la relación entre el Probit calculado con el log10 de la
concentración de cada compuesto (Figura 6.1), se aprecia que existe una
relación lineal, entre ambas variables, así como la diferencia de toxicidad de los
plaguicidas y quedando en el siguiente orden:
clorpirifos>cipermetrina>glifosato.
44
Figura 6.1. Rectas de regresión para el modelo log-probit sobre D. magna para
la cipermetrina, clorpirifo y glifosato.
Se evaluó la sensibilidad de L. sativa frente plaguicida glifosato,
herbicida de amplio uso en la zona de estudio. Los resultados obtenidos en el
ensayo se presentan en la tabla 6.4.
Tabla 6.4. Resultado de los ensayos de toxicidad aguda del glifosato de
formulación comercial en L. sativa
Tratamiento Glifosato
(mg.L-1)
Número de
semillas por
réplica
Longitud
promedio de las
raíces(cm)
% de
inhibición
(IP)
1 0,01 20 1,91 -2,35
2 0,10 20 1,85 -5,54
3 1,00 20 1,8 -7,7
4 10 20 1,61 -17,4
5 100 20 0,55 -72
Control
negativo 0 a 20 1,96 0
a agua dura reconstituida.
0
2
4
6
8
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3
pro
bit
log conentración
Cipermetrina Clorpirifos Glifosato
45
6.2. Parámetros fisicoquímicos DBO5, sulfato, nitrato, fósforo total,
dureza, pH oxígeno disuelto en muestras de aguas de los arroyos de la
Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento
Los resultados de los análisis fisicoquímicos aguas determinados
durante los siete muestreos, se presentan in extenso en tabla 6.5. Los informes
proveídos por el Laboratorio de Agua de la FACEN, se pueden consultar en el
Anexo 2.
Tabla 6.5. Valores de los parámetros fisicoquímicos analizados durante los
siete muestreos.
Campañas de
muestreo
Parámetros fisicoquímicos
Muestra pH
(UpH)
Nitrato
(mgN/L)
Fósforo
total
(mg/L)
Sulfato
(mg/L)
Dureza
(mgCaCO3/L)
O.D
(mgO2/L)
D.B.O.5
(mgO2/L)
AP1
1° 6,49 0,031 0,037 1,27 21,4 9,4 2
2° 6,6 0,17 0,053 2,98 20,2 7,5 2,2
3° 6,74 0,162 0,068 1,87 22,2 6,3 0,4
4° 6,83 0,176 0,062 1,77 21,82 6,8 --
5° 6,71 0,246 0,026 2,22 16,32 7,9 4,8
6° 6,74 0,242 0,046 1,92 20,68 8,2 1,2
7° 6,69 0,227 0,047 0,3 23,76 8,3 0,4
AP2
1° 7,56 0,105 0,042 0,69 22,4 10,1 1,6
2° 7,7 1,39 0,04 1,42 21,2 8,3 2,2
3° 7,74 0,644 0,058 1,1 20,2 7,7 0,4
4° 7,62 0,762 0,037 0,3 22,33 7,9 --
5° 7,46 1,14 0,032 1,6 18,36 9,5 3,3
6° 7,42 0,94 0,032 2,21 20,68 9,9 1,2
7° 7,38 1,008 0,025 0,3 26,73 8,4 0,8
AP3 1° 7,37 0,034 0,022 0,47 36,7 9,8 1,6
46
2° 7,3 1,33 0,04 1,46 26,3 7,8 2,2
3° 7,38 0,525 0,045 0,3 24,2 7 0,4
4° 7,48 0,686 0,045 0,3 29,94 7,4 --
5° 7,47 1,08 0,026 1,9 20,4 9,5 3,3
6° 7,18 0,61 0,027 1,79 25,61 9,5 0,9
7° 7,36 0,754 0,02 0,3 35,64 8,4 0,4
AP4
1° 7,59 0,010 0,029 1,29 20,9 10,1 2,9
2° 7,5 0,024 0,053 1,93 19,2 8,8 7,4
3° 8,1 1,03 0,048 3,19 51 7,2 0,8
4° 7,38 0,016 0,059 1,22 20,81 7,9 --
5° 7,07 0,192 0,026 1,94 15,3 8,8 4,2
6° 7,08 0,409 0,063 1,77 16,74 9 2,7
7° 7,58 0,037 0,03 1,42 21,78 8,5 2,2
AP5
2° 7,5 1,59 0,032 3,58 56,6 8,1 2,4
3° 7,48 0,035 0,043 1,89 20,2 6,6 2,4
4° 8,64 1,09 0,071 1,23 57,35 6,2 --
5° 7,91 2,74 0,033 2,59 40,8 9,4 3
6° 7,68 1,28 0,037 1,12 51,22 10,1 1,2
7° 7,78 1,61 0,041 0,59 62,37 8,4 0,4
6.3 Determinaciones de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina en
muestras de agua de los arroyos de la Reserva para Parque Nacional
San Rafael y su zona de amortiguamiento
Se realizaron dos análisis para la determinación de los plaguicidas
cipermetrina y clorpirifos, en muestras de agua de los cinco puntos estudiados.
El monitoreo se puedo realizar solamente en dos campañas de muestreo. En
ninguna de las muestras se presentaron cantidades detectables de los
biocidas. El tercer muestreo se realizó en una época de sequía en la zona de
estudio, no obstante durante el séptimo muestreo se sucedieron lluvias
47
dispersas en el área de estudio. Los resultados de los ensayos se muestran en
la tabla 6.6.
Tabla 6.6. Concentraciones de plaguicidas en los puntos de estudio, durante el
tercer y el séptimo muestreo.
Tercer muestreo Séptimo muestreo
Muestra Cipermetrina Clorpirifos Cipermetrina Clorpirifos
AP1 n.d n.d n.d n.d
AP2 n.d n.d n.d n.d
AP3 n.d n.d n.d n.d
AP4 n.d n.d n.d n.d
AP5 n.d n.d n.d n.d
n.d: No detectado
6.4 Toxicidad aguda en muestras de agua y sedimentos de arroyos
ubicados en la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento
Durante el periodo de estudio comprendido entre los meses octubre de
2012 y octubre de 2013, se colectaron 35 muestras de aguas y sedimentos en
el área de estudio. Los ensayos agudos se testearon con D. magna y L. sativa,
para ambas matrices. Los ensayos con D. magna arrojaron resultados que se
presentan en tablas 6.7 a la 6.13.
Toxicidad aguda en D. magna
Tabla 6.7. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna
en las muestras de agua y en sedimentos del primer muestreo.
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
48
*CL50 ** N.D: no detectada
No se evidenció efectos tóxicos agudos, sobre la supervivencia en
Daphnia magna, en las muestras de aguas del primer muestreo analizadas
mediante los bioensayos (Tabla 6.7). Tanto las aguas como los elutriados de
los sedimentos (relación 1:4) resultaron inocuas para el biosensor utilizado.
Tabla 6.8. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en las
muestras de agua y sedimentos del segundo muestreo.
*CL50
** N.D: no detectada
Las muestras obtenidas durante el segundo muestreo no presentaron
efectos tóxicos agudos importantes, sobre la supervivencia en Daphnia magna,
en las muestras analizadas mediante los bioensayos (Tabla 6.8). Tanto las
aguas como los elutriados de los sedimentos resultaron escasamente tóxicas
para el biosensor utilizado. Solamente las muestras AP3 y la AP5, mostraron
una CL10 al 100% de la muestra. Los ensayos se validaron con los controles, el
negativo, en agua dura reconstituida no presentó ningún neonato muerto tras
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 3,3 0 0 0 0 0 0 0
100 % 3.3 3,3 10 0 10 0 3.3 3.3 3.3 6.6
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
49
las 48 horas; y el positivo con dicromato de potasio, 2 mg.L-1 arrojo una
mortalidad de 100 %.
Tabla 6.9. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en las
muestras de agua y sedimentos del tercer muestreo
*CL50
** N.D: no detectada
Los ensayos agudos en Daphnia magna, no mostraron indicios de
toxicidad en las muestras analizadas durante el tercer muestreo (Tabla 6.9)
mediante los bioensayos. Tanto las aguas como los elutriados de los
sedimentos (relación 1:4) resultaron escasamente tóxicas para el biosensor
utilizado.
Tabla 6.10. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del cuarto muestreo.
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 0 0 0 0 3,3 0 0 0 0 0
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0
50
*CL50
** N.D: no detectada
Durante el cuarto muestreo, solo se detecto una DL10, en la muestra
AP5, en las demás, tanto en sedimentos como en agua, no se presentaron
efectos tóxicos agudos (Tabla 6.10).
Tabla 6.11. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del quinto muestreo
*CL50
** N.D: no detectada
El análisis de las muestras de agua y sedimento del quinto muestreo, no
arrojó evidencia importante de toxicidad, a excepción de AP3 y AP5 que
presentaron una DL10 en cada caso (Tabla 6.11). Similares resultados se
obtuvieron tras el sexto muestreo (Tabla 6.12)
Tabla 6.12. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del sexto muestreo
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 0 0 10 0 10 0 0 0 0 0
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
51
*CL50
** N.D: no detectada
Tabla 6.13. Resultados de los ensayos de toxicidad aguda con D. magna en
las muestras de agua y sedimentos del séptimo muestreo.
*CL50
** N.D: no detectada
El análisis de las muestras de agua del último muestre arrojan indicios
de leves niveles de toxicidad por la mortalidad en AP1, AP3, AP4 y AP5, con
valores número de organismos muertos que fueron entre un 13 y 26 %
respectivamente (tabla 6.13)
Toxicidad aguda en L. sativa
Los resultados de los ensayos agudos testeados con L. sativa se
presentan en las tablas 6.14 a la 6.20. Se muestran los valores
correspondientes a la Inhibición del crecimiento radicular (IP), expresada en %.
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 0 20 13 0 10 0 0 0 0 0
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
Mortalidad (%) en agua Mortalidad(%) en elutriados de
sedimentos
Concentraciones AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
12.5 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
25 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
50 % 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
100 % 13 0 16 26 20 0 0 0 0 3
Toxicidad * N.D** N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
52
Tabla 6.14. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con Lactuca
sativa, expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del primer
muestreo.
Concentraciones a
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % -3.32 1.47 -1.47 -5.53 5.16 0.15 2.18 -12.1 -4.68 -0.028
50 % 4.42 4.79 2.92 11.8 -1.84 -6.0 0.31 0.31 11.25 -4.06
100 % 10.92 -1.84 3.32 9.59 0.36 0.31 -5.62 -1.87 -0.08 -8.43
Toxicidad (IP) b N.D
c N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
Al comparar el crecimiento relativo, de las raicillas de L. sativa, en las
muestras de agua y las de sedimentos, no se observan indicativos importantes
de fitotoxicidad durante el primer muestreo (Tabla 6.14). En general las IP,
indican que se produjo un incremento del crecimiento de las raíces, respecto al
control. En los casos en los que se aprecia una IP negativa, estas en ningún
caso superan los 10%, y no son significativas respectos al control, por lo que
no permiten estimar la CE50.
Tabla 6.15. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del segundo
muestreo
Concentraciones a
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % -0.4 4.72 -1.47 -7.7 -1.71 10 -2 10 6 6
50 % 3 2.5 2.92 -5.5 4.29 10 4 16 15 -0.4
100 % -1.28 17 3.32 -5.51 -2.5 12 10 28 16 13
Toxicidad (IP) b N.D
c N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
Durante la segunda campaña de muestreo, los resultados no arrojaron
niveles de toxicidad importantes, tanto para las muestras de agua como las
ensayadas con los elutriados de los sedimentos (Tabla 6.15). En ambos casos,
inhibición de la prolongación de la raíz (IP), fue en su mayor parte positiva,
53
indicando un incremento del crecimiento radical en los tratamientos, con
respecto al control negativo en donde las semillas de L. sativa, eran expuestas
solamente agua dura reconstituida.
Tabla 6.16. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del tercer muestreo
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
Concentraciones a AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % 2.9 0 -7.4 2.6 4.23 5.5 21.7 8.6 1.24 5.59
50 % 4.5 7.81 10 -3.58 7.49 -3.5 6.8 15 9.3 10
100 % 9.44 10 4.23 -12 12.3 0 18 24 17 0
Toxicidad (IP) b N.D
c N.D N.D N.D N.D N.D
c N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
Los tests agudos en L. sativa, realizadas a las matrices de agua y
sedimento de los cinco puntos de estudio analizados durante el tercer muestreo
(Tabla 6.16), arrojaron valores positivos de IP. El incremento en el crecimiento
de la raíz puede atribuirse a la presencia de nutrientes, en las muestras de los
agroecosistemas, respecto al grupo control.
Tabla 6.17. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del cuarto
muestreo.
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
Concentraciones a AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % 6.5 4 5.6 2.6 13.9 1.1 7.5 6.2 1.5 3.7
50 % -2 8.72 2.1 1.3 5.1 0.7 10.3 5.8 10 5.6
100 % 0 16 7.36 5.78 14.32 2 12 9.6 14 -2.1
Toxicidad (IP) b N.D
c N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
Durante la cuarta y la quinta campaña de muestreo, los resultados no
arrojaron niveles de toxicidad importantes, tanto para las muestras de agua
como en la de los elutriados de los sedimentos. En ambos casos, inhibición de
54
la prolongación de la raíz (IP), fue en su mayor parte positiva, indicando un
incremento del crecimiento radical en los tratamientos, con respecto al control
negativo en donde las semillas, eran expuestas solamente agua dura
reconstituida. El incremento en el crecimiento de la raíz puede atribuirse a la
presencia de nutrientes, en las muestras de los agroecosistemas, respecto al
grupo control.
Tabla 6.18.Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del quinto muestreo.
IP en tratamiento con muestras de
agua IP en tratamiento con elutriados
Concentraciones
a AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % -3.53 -5.3 -4.15 -0.88 4.86 -7.3 -7.7 -2.86 -8.1 -9.1
50 % 2.6 -5.4 -3.23 6.19 1.76 -8.9 -5.5 -11.4 -10.02 -9.8
100 % 3.53 -5.7 -4.86 1.76 5.76 -10 -10.24 -14.75 -11 -9.5
Toxicidad (IP) b N.Dc N.D N.D N.D N.D N.D
c N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
Tabla 6.19. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del sexto muestreo.
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
Concentraciones
a AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % 8,1 -2,93 -1,45 0,52 -3,91 7,42 -2,38 1,19 18,16 14,02
50 % 10,3 7,14 -5,46 4,78 -5,22 10,31 6,11 11,39 6,86 10,84
100 % 3,64 10,17 -8,39 5,15 -0,26 6,4 -1,72 6,87 12,26 -2,11
Toxicidad (IP) b N.Dc N.D N.D N.D N.D N.D
c N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
En las dos últimas campañas de muestreo (6ta y 7ma), los resultados no
arrojaron niveles de toxicidad importantes, tanto para las muestras de agua
como las ensayadas con los elutriados de los sedimentos (Tablas 6.19 y 6.20),
analizadas con L. sativa.
55
Tabla 6.20. Valores correspondientes a IP en los tratamientos con L. sativa,
expuestos a las aguas y a los elutriados de los sedimentos del séptimo
muestreo.
IP en tratamiento con muestras de agua IP en tratamiento con elutriados
Concentraciones a AP1 AP2 AP3 AP4 AP5 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
25 % 25,66 15,07 13,96 13,27 -3,6 22,35 9,52 -8,73 -2,64 4,97
50 % 25,92 26,4 20,46 28,22 13 -0,79 -19 1,77 2,56 -16,9
100 % 8,9 14,7 15,32 3,94 12,9 -11,7 -15,5 0,46 -5,75 -13,9
Toxicidad (IP) b N.Dc N.D N.D N.D N.D N.D
c N.D N.D N.D N.D
a muestra diluida en agua dura. b CE50. cN.D: no detectada
6.5. Toxicidad crónica en muestras aguas de arroyos ubicados en la
Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento
Los ensayos agudos con D. magna se realizaron a partir del segundo
muestreo. Se siguió el criterio de aceptabilidad de los resultados basada en la
supervivencia de los individuos control (> 80%) y la reproducción (> 60
neonatos por hembra al final del test) (Liu et al., 2012). Los resultados son
presentados en las tablas N° 6.21 a la 6.26.
Tabla 6.21. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna realizadas a las muestras de agua del segundo muestreo.
Tratamientos N Media Desviación
típica
Error
típico
Intervalo de confianza para la media al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 9 66,11 14,4 4,82 54,99 77,23
AP1 8 56,00 8,8 3,13 48,59 63,41
AP2 7 45,43* 8,1 3,08 37,88 52,98
AP3 8 53,75 10,2 3,63 45,17 62,33
AP4 9 85,89 17,8 5,95 72,18 99,60
AP5 10 27,70* 9,1 2,89 21,17 34,23
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett)
56
Figura 6.2. Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de D. magna
expuestos a las muestras de agua del segundo muestreo.
El ensayo de toxicidad crónica a las muestras de agua del segundo
muestreo, arrojó resultados, que se resumen en la tabla 6.21. Los individuos
del grupo control, en promedio, presentaron una tasa de fecundidad de 66
14,4 individuos por cada hembra adulta, y una tasa de supervivencia de 90%,
al finalizar la prueba. El orden de fecundidad de los individuos expuestos a las
muestras de los diferentes sitios queda como sigue: AP4>AP1>AP3>AP2>AP5.
El agua del sitio AP4 (Laguna PROCOSARA), presentó la mayor tasa
reproductiva, con un promedio de 85,817 individuos, al final de la prueba,
superior inclusive a la del grupo control. En lo referente a la toxicidad crónica,
AP2 (Arroyo Pirapó) y el sitio AP5 (Arroyo Perlita), los resultados indican
diferencias significativas respecto al control en cuanto a las condiciones menos
favorables para el desarrollo microcrustaceo, con una fecundidades promedio
de 45,4 8, y 279 individuos al final del ensayo para AP2 y AP5
respectivamente
Tabla 6.22. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del tercer muestreo.
Tratamientos N Media Desviación
típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 10 68,30 11,48 3,63 60,09 76,51
57
AP1 9 78,11 11,56 3,85 69,23 87,00
AP2 10 75,90 5,70 1,80 71,82 79,98
AP3 8 73,63 6,89 2,43 67,87 79,38
AP4 9 64,44 8,68 2,89 57,78 71,11
AP5 10 65,50 18,95 5,99 51,95 79,05
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett)
Figura 6.3. Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de agua del tercer muestreo.
Los test crónicos realizados durante la tercera campaña se presentan en
la tabla N° 6.22. En promedio, los individuos del grupo control presentaron una
tasa de fecundidad de 68,3 11,4 individuos por cada hembra adulta, y una
tasa de supervivencia de 100%, al finalizar la prueba. El orden de fecundidad
de los individuos expuestos a las muestras de los diferentes sitios queda como
sigue: AP1>AP2>AP3>AP5>AP4. El agua del sitio AP1 (Arroyo Chachi),
presentó la mayor tasa reproductiva, con un promedio de 7811 individuos, al
final de la prueba, superior inclusive a la del grupo control. Este resultado se
puede entender considerando que la misma representaría a aguas con escaso
efecto antrópico, por su ubicación dentro de la reserva, a uno 900 metros
dentro del bosque. En lo referente a la toxicidad crónica, no se encontraron
diferencias significativas respecto al grupo control, por lo que en esta ocasión
58
no se pudo demostrar efectos crónicos sobre la tasa de supervivencia de
Daphnia magna.
Tabla 6.23. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del cuarto muestreo.
Tratamientos N Media Desviación
típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 10 77,20 5,94 1,88 72,95 81,45
AP1 8 78,88 2,75 0,97 76,58 81,17
AP2 10 82,80 10,70 3,38 75,15 90,45
AP3 10 78,70 4,08 1,29 75,78 81,62
AP4 9 81,22 8,57 2,86 74,63 87,81
AP5 10 82,00 8,97 2,84 75,58 88,42
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett
Figura 6.4. Diagrama de cajas de la fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de agua del cuarto muestreo.
Los ensayos de toxicidad crónica a las muestras de aguas obtenidas
durante el cuarto muestreo, arrojaron resultados que se resumen en la tabla
6.23. Los individuos del grupo control, en promedio, presentaron una tasa de
fecundidad de 775,9 individuos por cada hembra adulta, y una tasa de
supervivencia de 100%, al final de la prueba. El orden de fecundidad de los
59
individuos expuestos a las muestras de los diferentes sitios queda como sigue:
AP2>AP4>AP5>AP3>AP1; no obstante no se presentan diferencias
significativas respecto al control negativo.
Por su parte, durante la quinta campaña se presentaron, descensos en
la fecundidad, con diferencias significativas respecto al control (Tabla 6.24). El
orden de fecundidad de los individuos expuestos a las muestras de los
diferentes sitios queda como sigue: AP1>AP3>AP5>AP2>AP4. El agua del sitio
AP1 (Arroyo Chachi), presentó la mayor tasa reproductiva, con un promedio de
1045,52 individuos, al final de la prueba, que equivale al 90% de la tasa de
fecundidad promedio respecto al grupo control. En lo referente a la toxicidad
crónica, se encontraron diferencias significativas respecto al grupo control (p<
0,05), siendo considerablemente menores las tasas de fecundidad promedio de
los individuos que se fueron cultivados en las aguas provenientes de las zonas
de los agroecosistemas AP2, AP3 y la AP5, obteniéndose diferencias de hasta
un 30% (AP2) con respecto al control negativo.
Tabla 6.24. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del quinto muestreo.
Tratamiento
s N Media
Desviación
típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 10 117,70 6,13 1,94 113,32 122,08
AP1 4 104,75 5,62 2,81 95,81 113,69
AP2 3 82,00 29,10 16,80 9,70 154,30
AP3 8 87,75* 14,13 5,00 75,94 99,56
AP4 7 79,57* 10,08 3,81 70,25 88,89
AP5 6 86,00* 26,78 10,93 57,90 114,10
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett)
60
Figura 6.5. Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto del quinto muestreo.
Los resultados obtenidos tras el sexto muestreo, no se presentaron
evidencias significativas de toxicidad crónica. Los individuos del grupo control,
en promedio, presentaron una tasa de fecundidad de 89,8 7 individuos por
cada hembra adulta durante el sexto muestreo.
Tabla 6.25. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del sexto muestreo.
Tratamien
tos N Media
Desviació
n típica
Error
típico
Intervalo de confianza para la media
al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 10 89,80 7,74 2,45 84,26 95,34
AP1 10 80,30 29,98 9,48 58,86 101,74
AP2 10 77,10 15,18 4,80 66,24 87,96
AP3 10 73,40 15,95 5,04 61,99 84,81
AP4 10 86,00 13,63 4,31 76,25 95,75
AP5 10 73,90 6,57 2,08 69,20 78,60
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett)
61
Figura 6.6. Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto de la sexta campaña de muestreo.
Los tests crónicos realizado tras el séptimo muestreo, arrojó resultados
referentes a la fecundidad de los individuos (tabla 6.26), que ordenan de mayor
a menor como sigue: AP1>AP4>AP5>AP2>AP3. Para esta ocasión el agua del
sitio AP1 (Arroyo Chachi), presentó la mayor tasa reproductiva, con un
promedio de 78,6 individuos, al final de la prueba. En análisis estadístico arrojó
diferencias significativas respecto al grupo control a un nivel de p< 0,05
(Método de Dunnett), para los sitios AP2, AP3 y AP5 (Figura 6.7). Los tres
puntos que mostraron menor tasa reproductiva corresponden a las aguas
procedentes de los agroecosistemas.
Tabla 6.26. Valores medios y principales estadísticos descriptivos del test
crónico en D. magna a las muestras de agua del séptimo muestreo.
Tratamiento
s N Media
Desviación
típica Error típico
Intervalo de confianza para la media al 95%
Límite inferior Límite superior
Control 10 78,60 8,33 2,63 72,64 84,56
AP1 10 75,90 9,53 3,01 69,08 82,72
AP2 9 52,56* 10,45 3,48 44,52 60,59
62
AP3 8 43,25* 11,68 4,13 33,48 53,02
AP4 10 75,00 9,33 2,95 68,32 81,68
AP5 9 52,67* 10,81 3,60 44,36 60,97
Nota: *Las diferencias son significativas para p<0,05 (Método de Dunnett)
Figura 6.7. Toxicidad crónica. Fecundidad promedio de los individuos
expuestos a las muestras de cada punto del séptimo muestreo
63
CAPÍTULO 7: DISCUSIÓN
7.1. Toxicidades agudas de los ingredientes activos
Los bioensayos con L. sativa y D. magna, arrojaron resultados que están
dentro del rango mencionados en otros estudios. En el caso del crorpirifos,
para D. magna, Guilhermino et al. (2000) reportan valores de CL50-24h de
0,344 mg.L-1, en otro estudio Kersting y Van Wijngaarden (1992), menciona un
valor de CL50 de 0,0037 mg.L-1 y de 0,001 mg.L-1 a las 24 y 48 horas
respectivamente. Así mimo, Demetrio (2012), informa valores de CL50-48h de
0,30 g.L-1 para un formulado comercial, y 1,22 g.L-1 para el ingrediente activo
del clorpirifos.
Para la cipermetrina la CL50-24h obtenida en el presente estudio fue de
3,18 g.L-1(Tabla 7.1), similar a lo informado en otros ensayos con D. magna.
Demetrio (2012), reporta valores de toxicidad para este insecticida de piretroide
de 2,81g.L-1 para un formulado comercial, y de 3,73 g.L-1 para el ingrediente
activo tras 48 h de exposición. Se informan valores de 0,0003 mg.L-1 (PPDB,
2014b), 2 g.L-1 (WHO, 1989), y la USEPA (2007) informa valores
comprendidos entre 1-1,56 g.L-1.
La toxicidad aguda del glifosato F, analizado arrojó un valor de CL50
superior a los obtenidos en otros trabajos. En el caso de D. magna, el valor fue
de 39,05 mg.L-1. Demetrio (2012), informa valores de CL50-48 h de 9,34 para el
glifosato F, y de 199,61 mg.l-1 para su ingrediente activo; en el mismo estudio
se indica que la CE50-48 h para el surfactante POEA es de 1,80 mg.L-1. Otros
estudios reportan valores de CL50-48h comprendidos entre 5,3 y 37 mg.L-1
(WHO, 1994b) para formulados comerciales, y de 700 mg.L-1 para el
ingrediente en grado técnico.
64
Tabla 7.1. LCx 24 horas e intervalos de confianza al 95 % para D. magna para
los herbicidas clorpirifos y cipermetrina obtenidos con el log-probit. Se informan
los valores de x2 y tabulados (α=0,05).
CLX Clorpirifos (μg.l-1
) Cipermetrina (μg.l-1
) Glifosato F. (mg.l-1
)
1 0,31 (0,04- 0,70) 0,43 (0,09-0,86) 7,03 (1,48-12,75)
5 0,55 (0,10- 1,04) 0,77 (0,24-1,35) 11,61 (3,77-18,42)
10 0,75 (0,18- 1,28) 1,05 (0,39-1,73) 15,18 (6,14-22,66)
25 1,24 (0,47- 1,87) 1,78 (0,89-2,67) 23,75 (13,31-33,34)
50 2,18 (1,27- 3,01) 3,18 (2,02-4,75) 39,05 (27,20-59,27)
75 3,83 (2,76- 5,97) 5,70 (3,87-9,96) 64,21 (44,96-130,24)
90 6,35 (4,43- 13,89) 9,62 (6,19-21,78) 100,46 (64,54-289,67)
99 15,15 (8,51- 69,73) 23,67 (12,60-92,51) 217,04 (113,34-1216,27)
X2 cal 2,83 0,619 0,796
X2
0,05 tab 9,49 9,49 9,49
En un estudio de la toxicidad aguda del ingrediente activo glifosato como
sal de isopropilamina, y del formulado Roundup (Cuhra, Traavik, y Bøhn, 2013)
realizado con diferentes clones y edades de D. magna, se reportan valores de
CE50-48 h entre 1,4 y 7,2 mg.L-1 para el ingrediente activo, valores entre 3,7-
10,6 mg.L-1 para el Roundup, esto con individuos juveniles. En el trabajo
también se discute la inconsistencia y diferencias extremas en relación a los
resultados de toxicidad del glifosato; algunos como Forbis y Boudreau (1981)
mencionado por Cuhra et al.( 2013) reportan una CE50-48 h de 930 mg.L-1 en
D. magna, otras bases de datos igualmente reportan altos valores (WHO,
1994b; EPA, 1994), y concluyen que las diferencias se deben al tipo de
compuesto utilizado, antes que a la variabilidad clonal de los individuos (Cuhra
et al., 2013)
El glifosato F, presentó una CE50-120 h de 45,95 mg.L-1 en L. sativa.
Otros estudios como los realizado por Lallana et al. (2013), en el que
determinaron la concentración efectiva media de reducción del crecimiento
radical (CE50) de una formulación del herbicida glifosato (formulación líquida
soluble de sal amónica de la N- fosfonometil glicina al 40,5% (eq. ac. glifosato
36,9 % p/v) mediante bioensayo de germinación con semillas de lechuga y de
trigo, reportan valores de 0,01650 L.ha-1 para L. sativa y de 0,02325 L.ha-1 para
Triticum aestivum L.; demostrando que ambas plantas resultan sensibles a
65
distintas dosis del glifosato. Martin y Ronco (2006), estudiaron los efectos de
mezclas de pesticidas en L. sativa, Brasica napus, Allium cepa, Medicago
sativa y Lolium perenne; reportan una CI50 de 9,89 mg.L-1 para L. sativa, siendo
la más sensible, y 1.164 mg.L-1 para M. sativa, que es la menos sensible.
Tabla 7.2. LCx 120 horas para L. sativa para el formulado de Glifosato
obtenidos con el log-probit.
CEX Glifosato F. (mg.L-1)
1 0,02
5 0,20
10 0,66
25 4,91
50 45,96
75 429,96
90 3.216,59
99 102.694,93
X2 cal 0,599
X2 0,05 tab 7,015
7.2. Determinaciones de plaguicidas clorpirifos y cipermetrina en
muestras de agua de los arroyos de la Reserva para Parque Nacional
San Rafael y su zona de amortiguamiento
Para la evaluación del riesgo ambiental por el uso de plaguicidas, se
hace necesario conocer las características del escenario de exposición. Esto
implica determinar la presencia y la concentración de los posibles
contaminantes. En el Paraguay, y más específicamente en el Departamento de
Itapúa, se disponen de escasos registros de estudios de niveles de insecticidas
y herbicidas. Entre los pocos estudios, se cuenta un trabajo realizado entre los
meses de octubre y noviembre de 2009, desarrollado en el marco del Análisis
de agroquímicos en aguas superficiales y subterráneas en la cuenca hídrica del
Arroyo Capiibary, Dpto. Itapúa (Houben, Eisenkölbl, y Larroza, 2010), se
realizaron colectas de tres cuerpos de aguas de zonas agrícolas, antes y
66
después de la siembra. Se analizaron 598 principios activos y metabolitos
incluyendo glifosato, cipermetrina y clorpirifos, en laboratorios de la empresa
SOFIA GmbH de Berlín, Alemania. En el informe reportan que no se
encontraron concentraciones de los 598 analitos buscados, que estén por
encima de los límites de detección, y afirman que las aguas estudiadas están
libres de estos contaminantes. Los mismos autores explican que la ausencia de
agroquímicos en las aguas estudias se debe principalmente al clima, que
favorece la actividad microbiana, ayudando así a la descomposición de los
contaminantes; además la granulometría muy fina del suelo retrasa la
infiltración del agua; a esto se sumaría el elevado contendido de humus y
óxidos de hierro en las capas superiores del suelo, lo que retrasaría su
propagación.
La escasa bibliografía disponible sobre la presencia de agroquímicos en
aguas superficiales que discurren en zonas de cultivos agrícolas; indican la
necesidad de iniciar trabajos de monitoreo en zonas productoras del Paraguay
y de uso intenso de plaguicidas, esto permitirá conocer de manera más integral
los posibles impactos ambientales.
A pesar de que se disponen pocos antecedentes sobre el monitoreo de
plaguicidas en aguas de agroecosistemas paraguayo; es posible encontrar
estudios realizados en la región de la Cuenca del Paraná. Peruzzo, Porta y
Ronco, (2008), reportan niveles de glifosato entre 0,1 y 0,7 mg.L-1 en aguas, y
0,5-5 mg.kg-1 en sedimentos de arroyos asociados a cultivos de soja en la
región norte de la Pampa Argentina. En otro trabajo realizado en la misma
región (Jergentz, Mugni, Bonetto y Schulz, 2005) determinaron la presencia de
plaguicidas utilizados en la producción de soja GM, en muestras de aguas,
sedimentos y en escorrentía de lluvias; encontraron picos de concentración en
aguas de 0.45 mg.L-1 de clorpirifos y de 0.71 mg.L-1 de cipermetrina, además
informan presencia en las aguas y los sedimentos de las escorrentías tras
episodios de lluvias pos aplicación de los productos, reportando niveles de
clorpirifos en concentraciones de 0,28 g.L-1 y 30,3 g.kg-1 en agua y
sedimento respectivamente.
En el presente trabajo no se identificaron los plaguicidas clorpirifos y
cipermetrina en las muestras analizadas. Esto podría deberse a diversos
67
factores, un punto a considerar al respecto es la concentración de las
muestras; proceso que no fue realizado en esta ocasión; otros investigadores
(Carriquiriborde, Diaz, Mugni, Bonetto y Ronco, 2007; Demetrio, 2012; Jergentz
et al., 2005; Mugni et al., 2010) mencionan extracción con solventes orgánicos,
concentración por roto-evaporación, entre otros métodos, y concentrando la
muestra hasta mil veces. Otro aspecto a tener en cuenta es el momento del
muestreo; la posibilidad de determinar la presencia plaguicidas en los cursos
de agua aumenta cuando los muestreos se realizan tras episodios de lluvias o
tormentas que ocurran próximas a la aplicación de los plaguicidas a los cultivos
y que superen la capacidad de infiltración de los suelos, a fin de producir
escorrentías superficiales; por lo que este criterio de selección de muestras se
debería tener en cuenta.
7.3. Parámetros fisicoquímicos DBO5, sulfato, nitrato, dureza, pH
oxígeno disuelto en muestras de aguas de los arroyos de la Reserva
San Rafael y su zona de amortiguamiento
El conocimiento de las características fisicoquímicas de las aguas, es un
requisito importante a fin de determinar si las condiciones son apropiadas para
realizar los ensayos toxicológicos. El principal parámetro a determinarse previo
a los ensayos con D. magna es el oxígeno disuelto, para validar el ensayo este
parámetro debe estar por encima de 2 mg.L-1, antes y durante el
testeo.(Castillo et al., 2004). Paralelamente los datos se compararon con el
padrón nacional de calidad de aguas, establecidas en la Resolución N° 222/02
de la SEAM (SEAM, 2002), esto a fin de determinar si las corrientes hídricas
reunían las características para aguas de su clase.
68
Tabla 7.3. Valores promedios de los parámetros fisicoquímicos analizados
durante los siete muestreos.
AP1 AP2 AP3 AP4 AP5
aRef.-
Res.
N°222
/02
Parámetros μ S.D μ S.D μ S.D μ S.D μ S.D SEAM
Ph (UpH) 6,69 0,11 7,55* 0,14 7,36* 0,10 7,47
* 0,35 7,83* 0,43
6,0 -
9,0
N-Nitrato
(mgN/L) 0,18 0,07 0,86* 0,41 0,75 0,44 0,25 0,38 1,39* 0,88 10
Fósforo total
(mg/L) 0,05 0,01 0,04 0,01 0,03 0,01 0,04 0,02 0,04 0,01 0,05
Sulfato
(mg/L) 1,76 0,83 1,09 0,71 0,93 0,75 1,82 0,67 1,83 1,09 250
Dureza
(mgCaCO3/L) 20,9 2,33 21,7 2,61 28,40 6,02 23,6 12,3 48,0* 15,51 300
O.D (mgO2/L) 7,77 1,03 8,83 0,98 8,49 1,13 8,61 0,91 8,13 1,53 >5
D.B.O.5
(mgO2/L) 1,83 1,64 1,58 1,05 1,47 1,14 3,37 2,26 1,88 1,05 ≤5
Nota: valor promedio (μ ) desviación estándar(S.D). *Las diferencias son significativas
para p<0,05 (Método de Dunnett)
aClase 2. Establecida por la Resolución N° 222/02 de la SEAM- Aguas destinadas: a)
Para abastecimiento doméstico después de los tratamientos convencionales. b) Para
protección de las comunidades acuáticas) Para recreación de contacto primario (esquí
acuático, natación). d) La irrigación de hortalizas que son consumidas crudas, las
frutas que crecen en los suelos y que sean injeridas crudas sin la remoción de la
película. e) La cría natural y/o intensiva (acuicultura), de especies destinadas para la
alimentación humana.
Las determinaciones fisicoquímicas realizadas indican que en la mayoría
de los casos, las aguas pertenecen a la Clase I y la Clase II según los
parámetros de la SEAM; determinaciones que sobrepasan los valores la Clase
I, son: la DBO5; en una ocasión (AP4) los niveles de fósforo orgánico total
durante algunos tres muestreos en AP1 y en una ocasión en AP4 (Tabla 8).
69
Para los fines estadísticos, los valores que caen bajo la denominación
menor al límite de detección (<), se asume dicho valor como tal para el analito
en cuestión. El análisis estadístico de los resultados (ANOVA de un factor),
permitió determinar que existen diferencias respecto al punto control (AP1). En
relación a la los niveles de pH, a lo largo de las siete campañas de muestreo se
aprecia una diferencia significativa (p<0,05) al comparar el punto AP1 con los
demás sitios (AP2, AP3, AP4 y AP5). API, posee aguas más ácidas (pH
6,690,11) respecto a los demás puntos (Tabla 7.3, Figura 7.1 A). Esta
diferencia puede atribuirse a la presencia de material húmico en el agua,
considerando que el área de muestreo se encuentra en un bosque. Rojas y
Díaz (2014) reportan valores de pH en aguas de pozo de ciudades aledañas:
7,23 (UpH) en Itapúa Poty; 7,55 (UpH) en San Rafael del Paraná y de 6,53
(UpH) en Alto Verá.
Al comparar las concentraciones de Nitrato de las muestras
provenientes de los agroecosistemas AP2 y AP5, las diferencias respectos al
punto control (AP1) fueron significativamente superiores a un nivel de p< 0,05
(Método de Dunnett) al comparar los siete muestreos (Tabla 7.3, Figura 7.1 B).
Las diferencias entre AP1, AP3 y AP4 no fueron significativas. Estas
diferencias en las concentraciones de nitrato se pueden asociar al uso intensivo
de fertilizantes a base de nitratos, que llegaría hasta las aguas de los arroyos
mediante las escorrentías. Rojas y Díaz (2014) reportan valores de N-Nitrato en
aguas de pozo para la Ciudad de Encarnación 0,93 mg.L-1; Hoenau 1,33 mg.L-
1, 0,47 mg.L-1 para Edelira; y San Juan del Paraná 1,76 mg.L-1. Estos datos,
indican que los valores de N-Nitrato de las aguas, son similares, e inclusive
menores a los reportados para aguas de pozos profundos.
70
Figura 7.1. Gráfico Box-Plot de los parámetros fisicoquímicos durante el
periodo de estudio (1-AP1; 2-AP2; 3- AP3, y 4- AP4, 5-AP5) A. pH. B. Nitrato.
C, Sulfato. D, fósforo total.
71
Figura 7.2. Gráfico Box-Plot de los parámetros fisicoquímicos. (1-AP1; 2-AP2;
3- AP3, y 4- AP4, 5-AP5). A, Demanda bioquímica de oxígeno. B, oxígeno. C,
disuelto dureza
El tercer parámetro que mostró diferencias significativas respecto al
punto definido como control (AP1), fue la Dureza medida en AP5 (Tabla 7.3 y
Figura 7.2). No obstante el valor promedio de 4815,51 mgCaCO3.L-1es similar
a las concentraciones reportadas por Rojas y Díaz (2014), para pozos
profundos de las siguientes ciudades aledañas: Edelira 47,63 mgCaCO3.L-1 y
Tomás Romero Pereira 42,2 mgCaCO3.L-1.
Los demás parámetros fisicoquímicos estudiados, no presentaron
valores estadísticamente significativos con respecto al punto AP1
72
7.4. Toxicidad aguda en muestras de agua y sedimentos de arroyos
ubicados en la Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento
7.4.1. Bioensayos agudos con D. magna
Los resultados de los bioensayos con D. magna confirman que no se
presentaron efectos letales importantes sobre el microcrustaceo, solo en
algunos casos puntuales se llegó hasta una CL10 o como máximo a una CL20 al
100% de la concentración, como ser las muestras de agua AP2 y AP3 en el
sexto muestreo. La toxicidad presentada en los elutriados, fue inclusive menor
a las de las aguas. En general, tras las 48 horas de duración de cada ensayo,
se observó un mejor crecimiento en los individuos expuestos a las muestras de
agua y a los elutriados de los sedimentos. Según Sánchez Arguello (2002),
esto puede explicarse por la presencia de materia orgánica que sirve de
alimentos a los neonatos.
En un estudio similar, realizado en agroecositemas relacionados a
cultivo de soja de la región pampeana Argentina, Demetrio (2012) reportó
resultados similares en lo referente a la toxicidad aguda en D. magna e Hidra
attenuata. En el trabajo se monitoreó un tributario del Arroyo el Pescado, no
detectándose efectos agudos importantes superiores a CL10 con los
organismos modelos. Según el mismo autor, los escenarios de exposición a
plaguicidas se presentaría en forma discontinua, a modo de pulsaciones
tóxicas, esto como resultado del arrastre de los contaminantes hasta los
arroyos, causadas por sucesos como: escorrentías superficiales que se
presentan por las lluvias que suceden tras las aplicaciones de los plaguicidas a
los cultivos; además de otras condiciones como ser los procedentes de
derrames, accidentes o mal manejo por parte de los productores.
La baja toxicidad de las muestras procedentes de los agroecosistemas
que rodean a la Reserva San Rafael, podría explicarse a la ausencia de o la
presencia en concentraciones subletales de tóxicos en el agua. Pese a la alta
sensibilidad de D. magna a la presencia de contaminantes, la prueba de
toxicidad de 48 h es especialmente sensible para metales, plaguicidas,
73
compuestos de nitrógeno y disolventes (Martins, Oliva Teles y Vasconcelos,
2007).
7.4.2. Bioensayos con L. sativa
La inhibición del crecimiento radicular es un indicador de toxicidad
utilizado para medir efectos directos sobre el crecimiento y desarrollo de
plantas (Pereira, Saker, Vale y Vasconcelos, 2009). Al igual que en el ensayo
anterior, los test con L. sativa no detectaron efectos que inhiban el crecimiento
radicular de esta planta vascular. Al comparar el crecimiento relativo, de las
raicillas de Lactuca sativa, expuestas a las aguas y los elutriados de
sedimentos, se observa, que en general se produjo un incremento en el
crecimiento respecto al control. Las inhibición (IP) que superen el 5%
solamente se presentaron en el 11% de las muestras de agua, en todos los
caso en agua de los agroecosistemas. Los elutriados de sedimentos
presentaron inhibiciones entre 5-15% en el 28% de las muestras. No obstante
en ninguno de los caso se llegó a una IP de - 50%.
7.5. Toxicidad crónica en muestras aguas de arroyos ubicados en la
Reserva San Rafael y su zona de amortiguamiento
La contaminación de causes hídricos por los plaguicidas es un problema
grave con respecto a la calidad del agua del río, debido a que algunos
organismos de agua dulce son muy sensibles a los plaguicidas. El cladócero D.
magna, mediante ensayos crónicos de 21 días permite reproducir los posibles
efectos sobre el zooplancton. (Sakai, 2002)
Los ensayos crónicos en D. magna, se realizaron a partir de la segunda
campaña en el año 2012. Para los análisis las muestreas de agua, estas no
fueron filtradas para eliminar algas y otras partículas, de forma tal a que se
pueda favorecer los efectos indirectos por exposición a través del alimento y se
puedan ejercer los efectos de ciertos contaminantes. Algunos autores resaltan
el papel de la alimentación de los cladóceros durante el ensayo de
reproducción, las características del agua y el efecto de la filtración,
74
considerando que la respuesta podría ser mayor a esto que los propios efectos
tóxicos del agua (Sánchez Arguello, 2002).
El análisis estadístico de los resultados (ANOVA), puso de manifiesto
diferencias significativas (p<0,05; método de Dunnett) entre el control de
laboratorio y los tratamientos en AP2 y AP5 en el segundo muestreo (Tabla 24
y figura 21); en AP3 y AP5 en el quinto muestreo (Tabla 27 y figura 24), y en
las muestras tomadas de los puntos AP2, AP3 y AP5 del séptimo muestreo
(Tabla 29 y figura 26). En todos los casos en que se encontraron diferencias
medias significativas respecto al control de laboratorio, las muestras de aguas
provenían de los arroyo de los agroecosistemas. El sitio ubicado en una zona
boscosa de la Reserva San Rafael y considerado como punto control de campo
(AP1), no presentó en ninguno caso efectos crónicos medibles sobre D.
magna, ratificando las buenas condiciones del agua de este lugar, que se
encuentra próxima a su naciente.
Los test de reproducción son considerados parámetros muy sensibles a
la presencia de tóxicos a bajas concentraciones (Liu et al. 2012; Villaroel et al
2003; Zalizniak y Nugeoda, 2006). En el presente estudio se corrobora que los
niveles tóxicos, contaminantes u otros compuestos cuyos efectos no son
detectados con el test agudo, son revelados con el test crónico, y que la tasa
de fecundidad es un parámetro útil para el efecto. Así los ensayos agudos
realizados a las aguas de AP2, AP3 y AP5, no detectaron efectos adversos
sobre supervivencia de D. magna a las 48 horas; en tanto que los ensayos
crónicos si evidenciaron efectos desfavorables. Estos resultados respaldan la
necesidad de complementar los ensayos agudos con los crónicos, pues este
último permite corroborar las consecuencias de contaminantes que inclusive
presentan una LOEC (concentración más baja a la cual se observan efectos)
por debajo del límite de detección de algunas sustancias como metales y
compuestos orgánicos en el medio acuático.
El uso de los ensayos ecotoxicológicos para la determinación de efectos
en muestras ambientales es considerado una problemática por ciertos autores
(Sánchez Arguello, 2002). Según Bervoets et al. (1996), las características
fisicoquímicas específicas de cada muestra ambiental de agua, afectan la
biodispenibilidad y la toxicidad de los compuestos químicos presentes en ella,
75
lo que podría ser mayor que los propios efectos tóxicos del agua. No se pudo
asociar el descenso en la fecundidad observada con la presencia de
plaguicidas en las muestras. Por lo tanto, la toxicidad crónica pudo deberse a
los efectos de otros plaguicidas no blanco, a los componentes naturales del
agua o a la combinación de estos.
76
CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES GENERALES
Los bioensayos utilizando invertebrados y plantas vasculares para
determinar los efectos biológicos de la presencia de contaminantes a escala
laboratorio y a campo, son herramientas utilizadas ampliamente en el contexto
de la ecotoxicología. Daphnia magna es un importante representante de los
invertebrados presentes en diversos ecosistemas de agua dulce, y representa
de forma apropiada los efectos sobre diferentes especies y nichos ecológicos.
Lactuca sativa, por su parte, pese a no ser un representante de organismos
acuáticos, es ampliamente recomendado como bioensayo estandarizado para
la evaluación de la polución acuática y la predicción de los efectos sobre
vegetales. Los ensayos agudos, que consideran como medida de punto final la
letalidad (D. magna) y la inhibición del crecimiento radicular (L. sativa)
permitieron evaluar fehacientemente la toxicidad de los plaguicidas.
Los valores de CE50 de la cipermetrina y el clorpirifos obtenidos con D.
magna fueron similares a los reportados por otros estudios; mientras que la
CE50 del glifosato F fue superior, es decir menos tóxica que lo reportado por
otros trabajos. El orden de toxicidad de los plaguicidas frente al cladócero
queda como sigue: clorpirifos>cipermetrina>glifosato. Resultados similares se
obtuvo al evaluar la toxicidad del glifosato F, frente a L. sativa. De esta forma
se puede reforzar la idea de evaluar los efectos ecotoxicológicos de los
plaguicidas, mediante los ingredientes activos, para evitar subestimar efectos.
En el presente estudio se demuestra que los análisis fisicoquímicos
convencionales de aguas arrojan información relevante sobre la mayor
presencia de nutrientes en aguas de los arroyos que circundan por los
agroecosistemas. Esto fue el caso para el nitrógeno en forma de nitrato, cuyo
comportamiento se debería al uso de fertilizantes en las zonas de cultivos.
Los resultados negativos obtenidos mediante la evaluación de la
presencia de plaguicidas en aguas realizados en dos ocasiones, totalizando 10
muestras, de las cuales 6 corresponden a agroecosistemas indican que la
presencia de estos sería más de forma pulsátil u ocasional, y no de forma
permanente.
77
Los bioensayos realizados a las aguas de los arroyos, durante las siete
campañas, en todos los casos, mostraron resultados negativos para las
pruebas de toxicidad aguda en los organismos de prueba. Tanto en D. magna y
L. sativa, no se evidenciaron la presencia de muestras de agua y sedimentos
que puedan afectarlos de forma aguda. Las tasas de mortalidad de Daphnia, o
la inhibición del crecimiento observados en algunos tratamientos de Lactuca, se
encuentran dentro de márgenes tolerables, y difícil de atribuir a la presencia de
contaminantes en el agua o los sedimentos. En general, se observó en los
resultados un estímulo del crecimiento de las raíces de Lactuca.
Se corroboró la sensibilidad del ensayo crónico de 21 días de
exposición con D. magna. Las muestras de agua de los agroecosistemas AP2,
AP3 y AP5 presentaron efectos crónicos determinados mediante la fecundidad
promedio durante el tiempo de estudio. Este tipo de test ecotoxicológico
permite evaluar los efectos indirectos sobre la biocenosis de los ecosistemas
acuáticos que observan en un tiempo determinado tras la exposición,
provocando la reducción de la densidad, la competencia, migración y la
diversidad.
78
CAPÍTULO 9: RECOMENDACIONES
En base a la experiencia adquirida durante la ejecución del presente
trabajo se recomienda atender a los siguientes puntos:
- Ampliar el área de estudio a otros arroyos que atraviesen zonas
agrícolas en la región de Itapuá, e incluir la presencia de otros plaguicidas que
son de uso masivo en los cultivos biotecnológicos.
- Implementar un sistema de monitores permanente de la calidad del
agua de los causes hídricos. Esto permitirá disponer de datos actualizados
sobre los escenarios de exposición y realizar una evaluación de riesgo
ecotoxicológicos con de manera robusta.
- Ampliar el panorama utilizando otros tipos de ensayos, principalmente
los relacionados a la toxicidad crónica, ensayos mono-especies y multi-
especies, que permitan tener una visión más amplia de los riesgos e implicados
al uso de plaguicidas.
- Implementar como complemento el estudio de los sedimentos para la
realización de bioensayos crónicos, ya que la presencia de sustancias tóxicas
en estos representa la contaminación de un periodo de tiempo prolongado y la
concentración de algunos elementos nocivos suele ser mayor.
79
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Retrieved from http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc82.htm
WHO. (1994a). ENVIRONMENTAL HEALTH CRITERIA 159: Glifosato.
Retrieved from http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc159.htm
WHO. (1994b). ENVIRONMENTAL HEALTH CRITERIA 159:GLYPHOSATE.
Retrieved from http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc159.htm
Zalizniak L, Nugegoda D (2006) Effect of sublethal concentrations of
chlorpyrifos on three successive generations of Daphnia carinata.
Ecotoxicol Environ Saf 64:207–214
.
1
ANEXOS
Anexo 1. Ensayos de sensibilidad con los organismos de laboratorio
Carta control del Laboratorio de Daphnia magna
La carta control es la herramienta de registro que brinda los elementos
de juicio para establecer los intervalos aceptables de variación de la respuesta
de los organismos de prueba a un tóxico de referencia, con un margen de
confianza del 95%. Esta carta es el medio de referencia para evidenciar el
control de la sensibilidad de la especie empleada, de la estabilidad de la
respuesta biológica y de la repetibilidad (exactitud) de los resultados obtenidos
(Castillo et al., 2004)
Figura A-1. Carta control de D. magna frente al dicromato de potasio
2
Ensayo agudo con sulfato de cobre al lote de semillas de L. sativa
utilizado en el ensayo.
Los resultados obtenidos al evaluar la respuesta de L. sativa frente al
sulfato de cobre, se presentan en la tabla A-1 del Anexo y en la figura A-2.
Figura A-2. Toxicidad aguda del Sulfato de Cobre en L. sativa. Longitud
promedio de las raíces y efecto de Inhibición del crecimiento radicular (IP).
Tabla A- 1 del anexo. Resultados del análisis estadístico del ensayo
Toxicidad aguda del Sulfato de Cobre en L. sativa.
Ecuación
Lineal
R²
X²
Calculado
X²
Tabulado
CE50
(mg.L-1)
Intervalo de
confianza 95%
(mg.L-1)
Y=1,7056x +
2,4786
0,9448 0.941 5.991 31.707 20.546 - 46.518
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
12,5 25 50 100
IP(%
in
hib
ició
n)
Lo
ng
itu
d (
mm
)
Sulfato de Cobre (mg.L-1 )
Longitud IP
3
ANEXO 2. Resultados de análisis de parámetros fisicoquímicos de calidad
de agua realizada en el Laboratorio de Calidad de Aguas de la FACEN.
Primer muestreo
4
Segundo Muestreo
Tercer muestreo
5
Cuarto muestreo
Quinto muestreo
6
Sexto muestro
Sétimo muestreo
7
8
ANEXO 3. Cromatogramas de la determinación de Clorpirifos y
cipermetrina en muetras de agua de la Tercera campaña de muestreo.
1. Cromatograma con los estándares de Clorpirifos y Cipermetrina
Pico de absorción de CLORPIRIFOS
Pico de absorción de CIPERMETRINA
9
2. Cromatograma de corrida con la muestra del Punto 1
3. Cromatograma de corrida con la muestra del Punto 2
10
4. Cromatograma de corrida con la muestra del Punto 3
5. Cromatograma de corrida con la muestra del Punto 4
11
6. Cromatograma de corrida con la muestra del Punto 5
Cromatógrafo líquido utilizado para la detección de los biocidas
