INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN

PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA

“Respuesta inmune y expresión de genes en el

camarón blanco (Litopenaeus vannamei) inducida por inmunoestimulantes microbianos”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

JESÚS TOMÁS MORENO HERRERA

GUASAVE, SINALOA; MÉXICO DICIEMBRE 2012

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Acuacultura del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), Unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado económicamente a través del proyecto SIP multidiciplinario_(Con número de registro_20120575_).El alumno/a_Jesús Tomás Moreno Herrera___fue apoyado con una beca CONACYT con clave 369358. El autor agradece el apoyo económico brindado por el Instituto Politécnico Nacional como becario del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) y por el apoyo económico brindado atraves de la beca tesis del programa de becas institucionales de posgrado. Un agradecimiento al Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología por el apoyo otorgado para la terminación de la presente tesis.

I

DEDICATORIA

A mis padres Emelia y Antonio, por haberme educado y soportado mis errores, por

apoyarme en todo momento, por sus consejos, por su ejemplo de perseverancia y

constancia, por sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una

persona de bien, y me han enseñado a ser quien soy, pero más que nada, por su

amor incondicional.

A mis hermanos, Magda, Marta, Claudia, Emelia, Toño, Mony y Cami, gracias por

haber fomentado en mí el deseo de superación y el anhelo de triunfo en la vida, y

porque siempre me han apoyado incondicionalmente.

A todos, espero no defraudarlos y contar siempre con su valioso apoyo, sincero e

incondicional.

II

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por acompañarme todos los días. A mi familia, que me dio todo el apoyo para seguir adelante con este nuevo reto que decidí tomar. Al Dr. Antonio Luna González yal Dr. Ángel Isidro Campa Córdova gracias por darme la oportunidad y la confianza de trabajar con ellos, y por compartirme su conocimiento para la realizar este trabajo. A mis tutores, Dra. Norma Elena Leyva López, Dr. Héctor Abelardo González Ocampo, Dr. Javier Orduña Rojas † yal M.C. Jesús Arturo Fierro Coronado por sus comentarios, observaciones que ayudaron a mejorar este trabajo, y por el tiempo invertido en ello. Al equipo de trabajo que colaboró de alguna forma en el trabajo de laboratorio y campo: Arturo Fierro “el sho”, gracias compa; Ely Sara, Polanco, Dani. Al Biol. Adolfo Ramírez por el aporte de organismos. A mis compañeros y amigos de generación, John, Chelis, Pedro, Joaco, Lalo, Styl, Miguel, Alfredo, José, Samuel, Jorge, Porfi †, Magnolia, Sheila, Rocio, Liz, Fátima, Eli, Irene; y mis otros amigos, Abraham, Viri, Carmen, Judith, Dámaris, Jaz, Sara, Ana y Violeta; por hacer que el viaje fuera más corto y placentero y este plagado de buenos momentos. A todos los investigadores y profesores que participaron en mi formación académica. Gracias por su conocimiento impartido. A Dorín, Don Roberto, Ricardo y Celestino por su amistad y apoyo en la parte administrativa. A todas aquellas personas que de momento se me escapa mencionar, pero que de alguna manera colaboraron en la realización del presente trabajo. ¡Muchas gracias a todos!

III

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL ................................................................................................................. III

ABREVIATURAS .................................................................................................................... V

GLOSARIO ............................................................................................................................ VII

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... X

LISTA DE TABLAS ............................................................................................................... XI

RESUMEN ............................................................................................................................. XII

ABSTRACT ........................................................................................................................... XIII

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES .............................................................................................................. 16

3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................ 19

4. HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 20

5. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 20

5.1. Objetivos específicos ........................................................................................... 20

6. METODOLOGIA ................................................................................................................ 21

6.1. Adición de las BAL y levaduras al alimento ................................................... 21

6.2. Obtención de animales y su aclimatación ......................................................... 21

6.3. Extracción de ADN para la determinación de WSSV ...................................... 21

6.4. PCR para WSSV ........................................................................................................ 22

6.5. Bioensayo ................................................................................................................... 23

6.5.1. Obtención de hemolinfa ................................................................................ 23

6.5.2. Extracción de ARN y RT-PCR semicuantitativa ..................................... 24

6.5.3. Secuenciación de genes del sistema inmune ........................................ 26

6.5.4. Determinación de la concentración de proteína ....................................... 26

6.5.5. Conteo y separación de hemocitos ........................................................... 26

6.5.6. Medición de fenoloxidasa (plasma) y profenoloxidasa (SLH) ............ 27

6.5.7. Cuantificación del anión superóxido intracelular .................................... 27

6.5.8. Actividad de la peroxidasa .............................................................................. 28

6.5.9. Tasa de crecimiento específico ..................................................................... 28

6.5.10. Análisis estadístico de los resultados ..................................................... 28

7. RESULTADOS ................................................................................................................ 29

7.1. Supervivencia y tasa de crecimiento específico .............................................. 29

7.2. Conteo total de hemocitos (CTH) ......................................................................... 29

IV

7.3. Determinación de proteína .................................................................................. 30

7.4. Peroxidasa total de plasma y SLH .................................................................... 31

7.5. Anión superóxido en SLH .................................................................................... 32

7.6. proFO, FO, FO total ............................................................................................... 32

7.7. Análisis de la expresión de genes del sistema inmune ................................. 33

7.8. Parámetros fisicoquímicos (temperatura, oxígeno disuelto, pH, salinidad) ............................................................................................................................................... 35

7.9. Calidad de agua (nitritos, nitratos y amonio) .................................................... 35

8. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 36

9. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 41

10. REFERENCIAS ................................................................................................................ 42

V

ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico

ARN Ácido ribonucleico

ANDEVA Análisis de varianza

BAL Bacterias ácido lácticas

°C Grado centígrado

CTH Conteo total de hemocitos

d Día

DE Desviación estándar

DNTPs Desoxinucleótidos trifosfato

EE Error estándar

EDTA Etilendiaminotetraacetato

FO Fenoloxidasa

FO tot Fenoloxidasa total

GADPH Glicerladehído-3-fosfato deshidrogenasa

g/kg Gramo por kilogramo

H2O Agua

h Hora

Kb Kilobase

L Litro

L-Dopa L-dihidroxifenilalanina

M Marcador de peso molecular

min Minutos

mm Milímetro

mM Milimolar

mL Mililitro

mg/L Miligramo por litro

µL Microlitros

NH4 Amonio

NO2 Nitrito

NO3 Nitrato

VI

OD Oxígeno disuelto

pb Pares de bases

PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de

polimerasa)

pH Potencial de iones de hidrogeno

proFO Profenoloxidasa

‰ Partes por mil (salinidad)

% Porcentaje

spp Especies

SLH Sobrenadante lisado de hemocitos

TCE Tasa de crecimiento especifica

U Unidades

UFC Unidades formadoras de colonias

UFC/mL Unidades formadoras de colonias por mililitro

VII

GLOSARIO

Acuicultura: Conjunto de técnicas y actividades cuyo objetivo es la cría en cautiverio

de organismos acuáticos (peces, moluscos, crustáceos, reptiles o algas) en agua

cuyo mayor o menor carácter intensivo depende del grado de intervención del

hombre en los ciclos biológicos de los organismos en cuestión.

Antibiótico: [Gr. anti, contra + bios, vida]: un compuesto orgánico, inhibidor o tóxico

para otras especies, por lo general bacterias, que es formado y secretado

naturalmente por un organismo.

Bacteria: Organismo unicelular procariota, que se presenta en varias formas

(esférica, bastón o espiral). Algunas bacterias provocan enfermedades, pero muchas

son benéficas.

Bacteria ácido láctica: Grupo de bacterias que fermentan carbohidratos dando

ácido láctico como producto principal. Se les emplea en la fabricación de yogur,

quesos, leche fermentada y embutidos.

Camaronicultura: Es el cultivo de las diferentes especies de camarones que se

lleva a cabo en aéreas costeras.

Electroforesis: Técnica de separación de sustancias, basada en su desplazamiento

en un campo eléctrico debido a su carga neta. Se utiliza con frecuencia para separar

mezclas de iones, proteínas o ácidos nucleicos.

Enfermedad: Término amplio que se utiliza para designar el daño de células

suficiente para causar disfunción en el organismo. Una enfermedad pude ser

causada por (1) defectos genéticos reflejados en una normal estructura y función

celular, (2) desbalance nutricional que priva a las células de nutrientes esenciales, (3)

agentes químicos o físicos que lesionan las células o (4) agentes infecciosos que

dañan las células por su acción fisiológica o presencia física.

Enzima: Biomolécula que cataliza una reacción química específica,

fundamentalmente una proteína.

Fagocitosis: Capacidad de algunas células de destruir las bacterias o agentes

nocivos para el organismo.

VIII

Gen: En biología molecular, segmento de DNA o RNA que normalmente contiene

una región promotora, una región que se transcribe y una región con una señal de

terminación de lectura.

Hemocito: Célula de la hemolinfa de los invertebrados.

Hemolinfa: Liquido circulatorio de los artrópodos, moluscos, etc. Análogo de a

sangre de invertebrados. Su composición varía mucho de una especie a otra. Puede

ser de diferentes colores o incluso incolora; los pigmentos pueden proceder de la

alimentación o de los procesos metabólicos y no tienen ninguna función biológica, ya

que en el transporte de gases es independiente del aparato circulatorio.

Levadura: Son hongos unicelulares, usualmente de forma ovalada, con estados

vegetativos que se reproducen predominantemente por gemación o fisión, dando por

resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas pueden ser dimórficas o

bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones ambientales apropiadas.

Patógeno: Cualquier organismo que puede causar enfermedades o iniciar un

proceso patológico.

PCR (Siglas del Inglés Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la

Polimerasa): Metodología utilizada para producir múltiples copias de fragmento d

DNA molde, anillamiento con oligonucleótidos específicos y extensión de los mismos

por medio de una DNA polimerasa termotolerante.

Prebiótico: Ingredientes alimentarios no digeribles que promueven la salud del

huésped al estimular selectivamente el crecimiento y la actividad de una bacteria

benéfica o un grupo de ellas en el tracto digestivo.

Primer: Cadena pequeña de polinucleótidos que sirve de indicadora en la síntesis

química de una molécula de ácidos nucleicos (iniciador o cebador).

Probiótico: Se considera alimento probiótico aquel que contiene microorganismos

vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el intestino y ejercen

importantes efectos fisiológicos, se define como un suplemento microbiano formado

por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son adicionados

con el propósito de manipular las poblaciones bacterianas presentes en los sistemas

de producción.

IX

Síndrome: Combinación de síntomas que dan como resultado un solo efecto que

constituye una entidad clínica diferente.

Virus: Agente infeccioso acelular, con una organización muy simple, formada por un

complejo de proteína, la cápside y un solo tipo de ácido nucleico (DNA o RNA),

carece de metabolismo independiente y sólo se puede replicar en una célula

hospedera.

X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tasa de crecimiento específico del camarón blanco durante el bioensayo. ................................................................................................................. 29

Figura 2. Conteo total de hemocitos del bioensayo. ................................................. 30

Figura 3. Actividad peroxidasa total del plasma y SLH del bioensayo. ..................... 31

Figura 4. Resultados del análisis de anión superóxido ............................................. 32

Figura 5. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei. ................... 34

XI

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Genes del sistema inmune estudiados(Wang et al., 2007) ......................... 25

Tabla 2. Determinación de la proteína de plasma y de SLH del bioensayo .............. 31

Tabla 3. Profenoloxidasa (ProFO), Fenoloxidasa (FO) y Fenoloxidasa Total (FOtotal) ...................................................................................................... 33

Tabla 4. Parámetros fisicoquímicos del bioensayo. .................................................. 35

Tabla 5. Calidad del agua del bioensayo .................................................................. 35

XII

RESUMEN

En este trabajo se evaluó el efecto inmunoestimulante de bacterias ácido

lácticas y levaduras muertas por calor en Litopenaeus vannamei, cultivado en el

laboratorio. La mezcla inmunoestimulante (MI) en polvo se adicionó en el alimento.

Se realizó un bioensayo de 26 días en tinas de plástico con 80 L de agua de mar

filtrada, aireación constante y 10 organismos por tina. La alimentación se realizó dos

veces al día, la limpieza diariamente y la determinación de parámetros fisicoquímicos

cada 3 días. La calidad del agua y el registro del peso de los organismos se

realizaron al inicio y al final del bioensayo. Se determinó la tasa de crecimiento

específico y los tratamientos se realizaron por triplicado: I) dieta control

(Camaronina); II) MI en alimento, diario; III) MI en alimento, cada 3 días; IV) MI en

alimento, cada 6 días. Los camarones estaban libres de WSSV, la supervivencia se

determinó diariamente. Para el estudio del sistema inmune se extrajo la hemolinfa, se

hizo un conteo total de hemocitos, se determinó bioquímicamente la concentración

de anión superóxido,la actividad de la fenoloxidasa (FO) y peroxidasa. Los resultados

se analizaron con un ANDEVA y una prueba Tukey, se estudió la expresión

semicuantitativa de 6 genes del sistema inmune, utilizando la técnica de RT-PCR.

Los resultados se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis, no hubo aumento

significativo en el crecimiento y la supervivencia, el conteo total de hemocitos, la

concentración de la proteína, la concentración del anión superóxido y en la actividad

de la enzima peroxidasa. La actividad de la FO (plasma) en el tratamiento IV fue

significativamente mayor que en los tratamientos I, II y III. La FO del SLH (proFO) en

el tratamiento IV fue significativamente mayor que en los tratamientos I y III. La FO

total se comportó de la misma manera que en la FO del SLH. La secuencia de los

productos amplificados coincidió con la reportada en el banco de genes. La MI

provocó una sobreexpresión significativa de los genes que codifican para la

profenoloxidasa (tratamiento IV), la lisozima (tratamiento III) y la transglutaminasa

(tratamiento II) con respecto a los animales no tratados (control).

XIII

ABSTRACT

This study evaluated the immunostimulant effect of lactic acid bacteria and yeasts

(dead by heat) in L. vannamei, cultured in the laboratory. The immunostimulant

powder (MI) was added in the feed. Bioassay (26 d) was performed in plastic tanks

with 80 L of filtered sea water, constant aeration and 10 organisms per tank. Feeding

was performed twice daily. Daily cleaning and determination of physicochemical

parameters were done every 3 days. The quality of water and the recording of the

weight of the organisms were performed at the beginning and at the end of the

bioassay. The specific growth rate was determined. Triplicate treatments: I) control

diet (Camaronina) II) MI in feed, daily; III) MI in feed every three days; IV) MI in feed

every 6 days. The shrimp were WSSV free. Survival was determined daily. For the

study of the immune system, hemolymph was extracted total hemocyte count was

done, andthe superoxide anion concentration, phenoloxidase (FO) and peroxidase

activity were determined. The results were analyzed with ANOVA and Tukey test. The

expression six immune system genes, using the technique of RT-PCRwas studied.

The results of gene expression were analyzed with the Kruskal-Wallis test. There

were no significant diferences in the growth and survival, the total hemocyte count,

the protein concentration, the concentration of superoxide anion, and the activity of

the enzyme peroxidase. The FO activity (plasma) in the treatment IV was significantly

higher than in treatments I, II and III. The FO activity in HLS in treatment IV was

significantly higher than in treatments I and III. The total FO activity was as in HLS.

The sequence of the amplified products coincided with those reported in the Gene

Bank. The MI caused a significant overexpression of the genes coding for the

prophenoloxidase (IV treatment), lysozyme (treatment III) and transglutaminase

(Treatment II) with respect to the untreated animals (control).

1

1. INTRODUCCIÓN

La salud de las especies acuáticas está influenciada por la llamada triada

epidemiológica, la cual se refiere a interacciones entre el medio ambiente, los

patógenos y el huésped. En los sistemas de producción del camarón blanco

(Litopenaeus vannamei), muchos patógenos potenciales, tales como las bacterias,

hongos y virus, co-existen con el camarón sin causar un impacto negativo en la

producción, debido a un equilibrio en los factores de la triada. Sin embargo, cualquier

alteración en alguno de ellos, como estrés en el organismo, deterioro del ambiente o

mutaciones de las cepas patógenas, pueden desencadenar enfermedades agudas,

que provocan pérdidas significativas en la industria(Flegel y Pasharawipas, 1998;

Moriarty, 1999; Capy et al., 2000; Spann et al., 2000; Vidal et al., 2001).Los

probióticos, suplementos microbianos formados por un cultivo simple o mixto de

microorganismos seleccionados, han demostrado en la acuacultura, que son

capaces de mejorar el crecimiento, supervivencia, capacidad inmune y tasa de

conversión alimenticia de los organismos, así como también, mejorar la calidad de

agua de cultivo. Por ello, actualmente representan una estrategia ampliamente

aceptada para la mejora de los sistemas de cultivo (Balcázar, 2002).

Probióticos

La palabra probiótico fue propuesta en 1974 por Parker, deriva del griego que

significa "para la vida" y contrasta con la palabra antibiótico, la cual significa "contra

la vida" (Aguirre, 1992).

En los 70´s un probiótico se definía como “un microorganismo que se utiliza

como suplemento en la alimentación animal, para aumentar el crecimiento y reducir

el estrés”. Hoy en día, en acuacultura, el término probiótico se define como un

suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos

seleccionados que son adicionados con el propósito de manipular las poblaciones

bacterianas presentes en los sistemas de producción (Balcázar, 2002). Esta

definición incluye cultivos microbianos, células y metabolitos microbianos (productos

directos del cultivo microbiano) (Aguirre, 1992).

2

Hoy en día el término probiótico, está más asociado al género Lactobacillus en

la salud humana y sus mecanismos generales de acción son los siguientes

(Balcázar, 2002; Amores et al., 2004):

Competencia por sitios de fijación con bacterias patógenas (exclusión

competitiva);

Mejoramiento de la nutrición por el suministro de nutrientes esenciales;

Incremento de la digestión por el suministro de enzimas esenciales;

Eliminación directa de materia orgánica disuelta mediada por la bacteria;

Producción de sustancias que inhiben el crecimiento de patógenos

oportunistas;

Producción de sustancias inmunoestimulantes.

Entre los microorganismos comúnmente empleados como probióticos en

acuacultura se encuentran las bacterias ácido lácticas, los bacilos, los vibrios y las

levaduras (Kumar et al., 2006).

Bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas (BAL) son el grupo bacteriano de mayor

importancia. Estos microorganismos, especialmente el género Lactobacillus, son los

responsables de la producción de ácido láctico durante la fermentación, provocando

así una disminución del pH. Las BAL se desarrollan rápidamente durante el proceso

fermentativo y se replican desde 103-104 UFC/g hasta 108-109 UFC/g al final de la

fermentación, manteniéndose en estos niveles al final de la maduración (Hugas et al.,

1993).

Con respecto a su taxonomía, las BAL forman un grupo natural de bacterias

Gram positivas, anaerobias aerotolerantes, normalmente no móviles, que no forman

esporas, ni producen catalasa, aunque algunas cepas presentan una pseudo-

catalasa, con morfología de coco, coco-bacilo ó bacilo, que fermentan carbohidratos

para formar principalmente ácido láctico, con un contenido de G+C inferior a 55

mol%, por lo cual pertenecen a la subdivisión Clostridrium de las eubacterias Gram

positivas.

3

Taxonómicamente forman un grupo bastante heterogéneo, los géneros

incluidos son Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Streptococcus,

Enterococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Weissella, Oenococcus, Pediococcus y

Tetragenococcus (Vandamme et al., 1996).

Las BAL se encuentran normalmente en alimentos fermentados tales como

carne, vegetales, frutas, bebidas y productos lácticos, y también en los tractos

respiratorio, intestinal y genital de humanos y animales, en aguas fecales y en

materia vegetal. Las BAL tienen una gran importancia en alimentación y tecnología

alimentaria, sobretodo por su capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos

patógenos por lo cual han mostrado un impacto positivo en la salud humana y

animal.

Además del ácido láctico y acético, las BAL son capaces de producir y

excretar otras sustancias, aunque en cantidades muy inferiores. Entre éstas

destacan el ácido fórmico, ácidos grasos libres, amonio, etanol, peróxido de

hidrógeno, diacetilo, acetoína, 2,3-butanodiol, acetaldehído, benzoato, enzimas

bacteriolíticas, bacteriocinas y antibióticos, además de diversas sustancias

inhibidoras que no están completamente identificadas (Gilliland, 1986; Klaenhammer,

1988; Daeschel, 1989; Lindgren y Dobrogosz, 1990; Piard y Desmazeud, 1991,1992;

Vandenbergh, 1993). Algunas de estas sustancias tienen actividad antagonista

contra diversos microorganismos patógenos y deteriorantes de alimentos. La

inhibición del crecimiento de microorganismos indeseables se produce por

eliminación competitiva de los sustratos esenciales, acumulación de D-aminoácidos,

disminución del potencial redox, congregación, etc. No obstante la antibiosis podría

inhibir a otras cepas de BAL deseables (Houle et al., 1989).

Los mecanismos de acción de las BAL, son los siguientes:

Cambio en la flora bacteriana y reducción de poblaciones de organismos

patógenos.

Producción de ácido láctico, con lo que se reduce el pH en el sistema

digestivo del animal.

Adhesión o colonización por los microorganismos seleccionados a nivel de

sistema digestivo del animal.

4

Prevención por los microorganismos de la síntesis de toxinas.

En algunos casos producción de antibióticos.

Levaduras

Las levaduras, son hongos unicelulares, usualmente de forma ovalada, con

estados vegetativos que se reproducen predominantemente por gemación o fisión,

dando por resultado un crecimiento unicelular, aunque algunas pueden ser

dimórficas o bifásicas y crecer como micelio bajo condiciones ambientales

apropiadas. Este grupo de microorganismos está incluido taxonómicamente en la

División Eumycota y dadas sus características de reproducción sexual, se pueden

ubicar en tres subdivisiones: Ascomycotina, que comprende a levaduras que pueden

formar esporas contenidas dentro de una asca; Basidiomycotina, en donde los

representantes forman esporas externas localizadas sobre basidios o esterigmas y;

Deuteromicotina en donde se incluyen todas aquellas levaduras para las que no ha

sido posible demostrar que presentan una fase sexual en su ciclo de vida (Ochoa y

Vázquez-Juárez, 2004). Las levaduras registran una amplia distribución en un

variado tipo de hábitats tanto terrestres como acuáticos, ya que pueden encontrarse

asociadas a la flora y fauna acuática de los océanos, siendo parte constitutiva de la

población microbiana marina. Por lo anterior se les consideran “Levaduras Marinas”,

cuya reproducción y crecimiento ocurren preferentemente en el mar, o en

condiciones óptimas a las concentraciones normales de sales en el mar, entre 2.4-

4% de NaCl. También hay algunas levaduras que son capaces de distribuirse en

ambientes salinos no marinos y son altamente halofílicas o halotolerantes (Ochoa y

Vázquez-Juárez, 2004).

Se ha demostrado que algunas especies de levaduras poseen mecanismos

que les permite colonizar el intestino de peces y eventualmente incrementar su

población (Andlid, 1995). Otros estudios más detallados han definido el mecanismo

de colonización de la levadura al animal hospedante, el cual parece estar mediado

por la participación de adhesinas específicas y la hidrofobicidad típica de este tipo de

células. Actualmente, hay un modelo que propone que las células tienen capacidad

para cambiar rápidamente la hidrofobicidad de superficie celular de hidrofóbico a

5

hidrofílico, en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, lo que les confiere

capacidad de crecer con componentes de la mucosa como única fuente de energía y

establecer una relación estrecha a través del reconocimiento específico de ciertos

componentes de la mucosa. Así, es posible explicar el hecho de que una nueva

especie del género Rhodotorula haya sido aislada del gusano Lamellibrachia sp., el

cual fue recolectado a una profundidad de 1,156 m en la Bahía de Sagami, Japón

(Nakayama et al., 2001).

Dos aspectos han motivado la consideración del uso de levaduras como

probióticos en acuacultura: primero, es el difundido y probado efecto benéfico de

levaduras en diversos modelos que incluyen al hombre. Segundo, es la demostración

de la presencia de levaduras con una alta capacidad de colonización, en el tracto

digestivo de peces. La levadura Saccharomyces boulardii es ampliamente utilizada

en varios países de Europa en el tratamiento de enteritis infecciosa aguda, en

desórdenes producidos por el uso de antibióticos y colitis asociadas a infecciones por

Clostridium difficile. El género Candida sp. se utiliza en el cultivo a gran escala de

rotíferos. Diversos mecanismos del efecto benéfico han sido descritos y se sugiere

que la expresión de enzimas intestinales es favorecida por poliaminas secretadas por

el organismo (Ochoa y Vázquez-Juárez, 2004).

Sistema inmune del camarón

Teniendo en cuenta que el reto más grande que enfrenta la camaronicultura

son los problemas virales, es importante el estudio del sistema inmune del camarón

(Arala-Chávez y Sequeira, 2000).

En los camarones, los mecanismos celulares y humorales (inmunidad innata o

no específica) contribuyen a la defensa del organismo, limitando invasiones

microbianas y virales que son eliminadas de la hemolinfa y tejidos (Söderhäll y

Cerenius, 1992; Vázquez et al., 1998; Bachère, 2000).

La función del sistema inmune es mantener la individualidad biológica del

organismo, por ello, su principal actividad es diferenciar y eliminar todo material

extraño de sus tejidos (Vargas et al., 1996).

6

Según Bachère (2002), la respuesta inmune de los crustáceos puede ser

divida en varias fases:

1) Etapa inmediata e inducible, correspondiente al reconocimiento de lo “no

propio”, gracias a factores presentes en la hemolinfa que poseen una alta

especificidad de reconocimiento (Destoumieux et al. 1997; Vázquez et al.,

1998).

2) Etapa de defensa celular y síntesis de efectores.

3) Etapa humoral y de recuperación celular.

En particular, los crustáceos decápodos poseen un sistema circulatorio abierto

mediante el cual son distribuidos los nutrientes, oxígeno, hormonas y células que

viajan a través de la hemolinfa. La hemolinfa es un análogo de la sangre y la linfa de

los vertebrados. La hemolinfa baña los tejidos, denominándose hemocele a los sitios

donde circula. La hemolinfa presenta un color azul verdoso a causa de la

hemocianina, la cual es una proteína involucrada en la respiración abundante en la

hemolinfa de todos los crustáceos.

La respuesta celular del sistema inmune del camarón

Varios tipos de células están involucradas en la eliminación de partículas

extrañas que llegan al hemocele de los crustáceos (Johnson, 1987):

a) Los podocitos o nefrocitos, los cuales están localizados en branquias y en el

celosoma de la glándula antenal, y están especializados en la pinocitosis de

proteínas y posiblemente virus.

b) Las células fagocíticas de reserva se presentan en el corazón de los peneidos,

estas células son derivadas del tejido hematopoyético y están involucradas en

filtrar otras sustancias, sin embargo, no existe evidencia de que estén

relacionadas con la fagocitosis de bacterias o virus.

c) Los fagocitos fijos, también derivados del tejido hematopoyético están ubicados

en los espacios hemales del hepatopáncreas donde secuestran gran cantidad

de partículas.

d) El órgano linfoide es considerado una parte integral del sistema circulatorio de

los camarones peneidos, se asume que funciona como filtro de la hemolinfa,

7

por lo que tendría gran importancia en la eliminación y captura de partículas

virales (Van de Braak et al., 2002).

En el órgano linfoide de los camarones se forman los esferoides, los cuales se

observan como una masa multicelular que origina una desorganización de los

túbulos normales, carecen de un lumen central y presentan vacuolas

citoplasmáticas o algún tipo de inclusiones (Anggraeni y Owens, 2000); se ha

sugerido que estos esferoides son originados por los hemocitos y también

constituyen un mecanismo para secuestrar virus (Anggraeni y Owens, 2000;

Van de Braak et al., 2002).

e) Existen evidencias de esferoides ectópicos en algunas especies de peneidos.

Los esferoides del órgano linfoide y los esferoides ectópicos están compuestos

del mismo tipo de células fagocíticas las cuales pueden proliferar in situ o

migrar a los sitios en respuesta a una infección viral (Hasson et al.,1999).

Esferoides ectópicos fueron reportados en algunos apéndices que

normalmente contienen glándulas tegumentales (Hasson et al.,1999).

f) Las glándulas tegumentales han sido encontradas en asociación con la

superficie cuticular, su distribución y número varía de una especie a otra,

además estarían implicadas en muchas funciones que incluyen el

endurecimiento de la cutícula, formación de epicutículas, apareamiento,

osmorregulación, defensa contra predadores y ayudan en la alimentación

mediante la formación del mucus (Talbot y Demers, 1993).

g) Los hemocitos, células circulantes en la hemolinfa, son las células fagocíticas

más abundantes, se han considerado análogos a los leucocitos de mamíferos

debido a las funciones que realizan en el mecanismo de defensa como parte

de la respuesta inmune innata, participando en el reconocimiento, destrucción

de partículas extrañas y agentes infecciosos (Raa, 1996). Estas células llevan

a cabo reacciones inmunes como fagocitosis, encapsulación, nodulación,

citotoxicidad (Söderhäll y Cerenius, 1992). Además, los hemocitos participan

en la coagulación de la hemolinfa ya que constituyen la fracción celular de la

misma.

8

Se han descrito tres tipos de hemocitos, utilizado criterios morfológicos,

antigénicos y funcionales (Rodríguez, 1996; Johansson et al., 2000):

Hemocitos hialinos, los cuales no poseen gránulos, tienen capacidad

fagocítica e intervienen en la coagulación (Raa, 1996).

Hemocitos semigranulosos, los cuales poseen abundantes gránulos,

intervienen en la fagocitosis, encapsulación y en la liberación del sistema

profenoloxidasa (proFO)encargado y responsable de la melanización.

Además, sintetizan y liberan las peneidinas, que son péptidos antimicrobianos

(Dextoumieux et al., 2000).

Hemocitos granulosos, los cuales están cargados de gránulos. Estos

hemocitos almacenan las enzimas que constituyen el sistema proFO en los

crustáceos a un nivel más elevado que el de los hemocitos semigranulosos

(Smith y Söderhäll, 1983). Al igual que los hemocitos semigranulosos

sintetizan y almacenan las peneidinas (Destoumieux et al., 2000) e intervienen

en el mecanismo de encapsulación.

Respecto a las infecciones virales de peneidos, se han reportado las

siguientes respuestas celulares:

Fagocitosis de virus (Söderhall et al., 1996), la cual es considerada la primera

línea de defensa en invertebrados (Bayne, 1990).

Encapsulación (Momoyama et al., 1994).

Melanización (Hasson et al., 1999a; Wang et al., 1999).

Nodulación (Söderhall y Cerenius, 1992; Durand et al., 1997).

Formación de esferoides del órgano linfoide (EOL) (Anggraeni y Owens,

2000).

Fagocitosis

Es el mecanismo de defensa celular más común entre todos los animales

incluyendo a los invertebrados (Söderhäll y Cerenius, 1992; Vargas-Albores, 1995;

Le Moullac et al., 1997). La eliminación de material particulado en los crustáceos la

9

realizan dos tipos de células: los hemocitos libres y los fagocitos fijos, los cuales se

localizan en los senos hemales del hepatopáncreas en la mayoría de los decápodos.

Johnson (1987) menciona que la fagocitosis es la eliminación de materiales extraños

del hemocele de crustáceos decápodos, donde se ven involucradas varias clases de

células. Las proteínas y pequeños virus son eliminados por los podocitos, los cuales

son células especializadas en llevar a cabo picnocitosis, y que están ubicadas en las

branquias y en la glándula antenal (Rodríguez, 1996). La fagocitosis junto con otros

mecanismos humorales constituye la primera línea de defensa inmunológica cuando

una partícula atraviesa la primera barrera de defensa que constituye la cutícula

(Söderhäll y Cerenius, 1992).

La fagocitosis consiste de los siguientes pasos: quimiotaxis, adherencia,

ingestión, destrucción del patógeno y expulsión del material de desecho por

exocitosis. Las células fagocíticas destruyen a los organismos englobados mediante

dos mecanismos de defensa, el aerobio y el anaerobio. El mecanismo aerobio está

ligado al estallido respiratorio, empleando NADPH o NADH como donador de

electrones, durante este mecanismo se reduce un electrón del oxígeno para formarse

el radical superóxido (O2-), el cual es convertido a peróxido de hidrógeno

espontáneamente o por acción de la superóxido dismutasa (SOD), produciéndose

una nueva molécula de oxígeno. El mecanismo anaerobio es atribuido a la acción de

enzimas microbicidas, como lisozimas y moléculas como péptidos antimicrobianos

(Nappi y Ottaviani, 2000).

Encapsulación

Es un tipo de respuesta multicelular para eliminar partículas extrañas que no

pueden ser destruidas por los mecanismos humorales (Vázquez et al., 1998). Este

mecanismo actúa cuando una partícula es demasiado grande para ser fagocitada.

Muchos hemocitos cubren a la partícula grande formando capas alrededor de ella, y

las cápsulas son fuertemente melanizadas (Söderhäll y Cerenius, 1992).

En crustáceos, se ha observado que los hemocitos semigranulares son los

responsables de reconocer las moléculas o partículas extrañas encapsulándolas

mediante una proteína que funciona como opsonina, y que actúa en conjunto con la

10

activación del sistema profenoloxidasa. Esta proteína es multifuncional debido a que

además de ser un promotor de encapsulación puede actuar como un factor de

adhesión y un factor de degranulación para células semigranulares y granulares

(Söderhäll y Cerenius, 1992).

Melanización

Es una manifestación común en los invertebrados, cuyo proceso comprende

una serie de reacciones enzimáticas en cascada conocido como sistema

profenoloxidasa (proFO) (Vázquez et al., 1998; Perdomo-Morales et al., 2007).El

sistema proFO de los camarones se encuentra en el interior de los gránulos de los

hemocitos granulosos y semigranulosos. Este sistema puede ser activado en forma

natural por estimulación de componentes microbianos, como los β-glucanos de

hongos, los peptidoglucanos (PG) y los lipopolisacáridos (LPS) bacterianos (Vargas-

Albores, 1995). Una vez liberado el contenido granular por degranulación, la proFO

es activada a fenoloxidasa (FO).

La enzima activadora es una serina-proteasa de tipo tripsina llamada enzima

activadora de la profenoloxidasa (EaproFO) ó proteína activadora de la

profenoloxidasa (ppA) (Vargas y Yepiz, 1998). La fenoloxidasa es la enzima

responsable de la melanización observada en crustáceos e insectos (Söderhäll y

Cerenius, 1992). La FO promueve la oxidación de fenoles en quinonas las cuales se

polimerizan de manera no enzimática formando depósitos insolubles de melanina.

La melanina es un pigmento pardo-negro, con propiedades biológicas capaces

de inhibir la actividad de enzimas bacterianas y fúngicas (Smith y Söderhäll, 1983).

Puede ser observada como manchas obscuras en el caparazón de los camarones

(Homblad y Söderhäll, 1999). A la melanina se le han atribuido propiedades

microbicidas, durante la generación de quinonas se producen otros agentes

microbicidas importantes, como el anión superóxido y los radicales hidroxilo (Nappi et

al., 1995; Vargas-Albores et al., 1998).

Además de su participación en la melanización, el sistema proFO también está

involucrado en algunas reacciones celulares de defensa como fagocitosis,

11

nodulación, encapsulación, adhesión y locomoción de hemocitos (Vargas-Albores,

1995).

La activación del sistema proFO, medido como actividad de la fenoloxidasa

(FO), ha sido usada para medir la inmunoestimulación en camarones (Sung et al.,

1994; Sung et al., 1996). Cabe mencionar que en el camarón, tanto la enzima proPO

y la EaproPO se encuentran en forma inactiva en los gránulos de los hemocitos

(Vargas-Albores, 1995).

Nodulación

Cuando el huésped es invadido por un gran número de microorganismos, en

exceso y no pueden ser removidos por fagocitosis, se lleva a cabo la formación de

nódulos. Este es un mecanismo muy eficiente para la eliminación de partículas

extrañas en invertebrados, incluyendo a los crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992).

En los nódulos las partículas extrañas son aprisionadas por varias capas de

hemocitos, formando pequeñas cápsulas desde las cuales ciertos hemocitos se

desprenden y se infiltran en la masa bacteriana e intentan fagocitarla. Estos forman

nódulos en el que las partículas extrañas son atrapadas por varias capas de

hemocitos con la consiguiente activación del sistema profenoloxidasa cuando el

nódulo es melanizado. Durante este proceso, las partículas extrañas son removidas

rápidamente de la circulación hemolinfática, alojándose en branquias y entre los

túbulos hepatopancreáticos (Söderhäll y Cerenius, 1992).

Coagulación

La coagulación de la hemolinfa es una respuesta de defensa muy importante

en los crustáceos, ya que es un proceso en el cual los crustáceos rápidamente sellan

sus heridas del exoesqueleto previniendo la pérdida de la hemolinfa y evitando el

ingreso de partículas extrañas al organismo (Söderhäll y Cerenius, 1992; Song y

Huang, 1999; Montaño-Pérez et al., 1999).

La hemolinfa coagula mediante una cascada enzimática en la que intervienen

enzimas proteolíticas que finalmente hidrolizan una proteína llamada coagulógeno. El

coagulógeno es transformado a coagulina y posteriormente se polimeriza para

12

conformar el coágulo (Montaño-Pérez et al., 1999). La proteína de la coagulación es

un dímero plasmático cuyo monómero tiene aproximadamente 200 kDa, en peneidos

se llama proteína coaguladora (PC) y se encuentra en el plasma. La polimerización

de PC se lleva a cabo mediante la acción de la enzima transglutaminasa (TGasa) en

presencia de calcio. La TGasa se encuentra en el interior de las células hialinas y se

libera al plasma por daño tisular o como una repuesta inmediata de los hemocitos

ante la presencia de lipopolisacáridos LPS y β-1,3-glucanos (Martín et al., 1991; Yeh

et al., 1998; Montaño-Pérez et al., 1999).

La respuesta humoral del sistema inmune del camarón

La respuesta humoral es un mecanismo capaz de inhibir el crecimiento

bacteriano en plasma, de inhibir la actividad enzimática y de liberar sustancias

causantes de lisis celular, aglutininas y precipitinas (Bachére et al., 2000). Tales

sustancias son:

Péptidos antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos son proteínas que actúan como antibióticos

endógenos y son considerados como unos de los principales elementos de la

inmunidad innata (Destoumieux et al.,2000). En particular, en muchos estudios se

han caracterizado péptidos antimicrobianos que matan o inhiben el crecimiento de

microorganismos (Destoumieux et al., 2000). Hasta la fecha, se han descrito una

amplia variedad de péptidos antimicrobianos, los cuales se han clasificado

basándose en sus secuencias de aminoácidos, en sus estructuras secundarias y sus

similitudes funcionales (Bulet et al., 1999).

Los péptidos antimicrobianos son producidos en células fagocíticas de

vertebrados, invertebrados y tunicados. El modo de acción de los péptidos

antimicrobianos en la mayoría de los casos es perforar las membranas microbianas,

mientras que otros péptidos interrumpen la biosíntesis de membrana, finalizando en

una muerte celular (Destoumieux et al. 2000).

En camarón blanco (L. vannamei), se han caracterizado tres péptidos

antimicrobianos clasificados como peneidinas (Destoumieux et al., 1997). Se ha

13

comprobado que las células hialinas pueden secretar penaeidinas al plasma tal y

como lo hacen las células del cuerpo graso en insectos (Meister et al., 1997). Al

demostrar que los hemocitos son el origen de producción y almacenamiento de estos

péptidos, se sugiere que su presencia en el plasma de camarón es el resultado de su

secreción o liberación al degranular los hemocitos. Esto sucede como respuesta al

estrés o resultado de una estimulación (Bachére et al., 2000).

Las peneidinas son activas contra hongos y bacterias Gram positivas

(Destoumieux et al., 1997; Wang et al., 1999) y además actúan como opsoninas

contra bacterias Gram negativas (Muñoz et al., 2002). Las peneidinas son

mayormente sintetizadas en los hemocitos, donde ellas son continuamente

procesadas y almacenadas; y en tal caso almacenadas dentro de los gránulos

citoplasmáticos (Destoumieux et al., 2000).

Enzimas hidrolíticas

Dentro de los hemocitos, existen diversas enzimas hidrolíticas con actividad

de proteasas, glucosidasas, fosfatasas, lipasas y esterasas indicativas de la

presencia de lisosomas (López et al., 1997; Peraza-Gómez et al., 2011; Flores-

Miranda et al., 2011).

Las enzimas lisosomales participan en la muerte y degradación de

microorganismos y partículas dentro y fuera de los hemocitos (Carajaraville et al.,

1995) ya que en algunos casos son liberadas de la célula al plasma u otros tejidos

donde modifican la conformación molecular de la superficie celular de

microorganismos patógenos, favoreciendo el reconocimiento y fagocitosis (Cheng,

1983). A su vez las enzimas lisosomales participan en la fagocitosis matando y

degradando partículas fagocitadas y en algunos casos degradan partículas invasoras

(Cheng, 1992).

Lisozima

Es una enzima lisosomal presente en todos los organismos vivos, asociada

con el sistema de defensa y con el sistema digestivo, donde tiene como principal

función la degradación de bacterias (Viana y Raa, 1992). Ya que actúa contra los

agentes infecciosos, principalmente atacando a los mucopolisacáridos presentes en

14

la pared celular de bacterias Gram negativas (Lie et al., 1989), algunas otras

lisozimas presentan actividad esterasa o quitinasa (Viana y Raa, 1992).

Lectinas

Son proteínas no enzimáticas o glicoproteínas de amplia distribución, con la

capacidad de reconocer en forma específica una gran variedad de carbohidratos. Las

lectinas de invertebrados son consideradas como moléculas de reconocimiento

primitivas (Nappi y Ottaviani, 2000). Ya que pueden reconocer a algunos

microorganismos, como bacterias Gram negativas , debido a que poseen en su

pared celular carbohidratos; también las lectinas pueden inducir la aglutinación de

estos microorganismos e igualmente pueden dirigir otros procesos celulares como la

fagocitosis (Bayne, 1990).

Las lectinas también presentan propiedades de opsonisación lo que permite a

los hemocitos fagocitar algunos microorganismos que son reconocidos (Vasta, 1999).

Se ha observado que algunas lectinas endógenas de invertebrados promueven la

activación del sistema proFO (Ratcliffe et al., 1991)

Se ha identificado la presencia de lectinas en la hemolinfa de varios

crustáceos tanto en la membrana de los hemocitos como en las de gránulos

citoplasmáticos, con características estructurales y especificidad idéntica a la de las

lectinas séricas, por lo que se cree que las lectinas son sintetizadas por los

hemocitos y posteriormente liberadas al hemocele (Sierra et al., 1999).

Peroxidasa

La actividad de la peroxidasa, presente en crustáceos (Sritunyalucksana et al.,

2001) se asocia con una molécula de adhesión llamada peroxinectina. La

peroxinectina actúa como una opsonina, como un factor que promueve la

desgranulación y la encapsulación, asi como actividad de peroxidasa y de adhesión

celular. El aislamiento a partir de hemocitos de una superóxido dismutasa intracelular

(SOD) en asociación con peroxinectina sugiere que la peroxinectina puede producir

ácido hipohálico a partir del peróxido de hidrógeno (producido por la SOD) y, como

15

consecuencia,puede funcionar como un sistema eficiente de ataque microbicida

contra microorganismos patógenos invasores (Sritunyalucksana et al., 2001).

Radical anión superóxido

Cuando una partícula extraña logra pasar al interior de un organismo y es

reconocida por sus células de defensa, esta partícula es fagocitada. El anión

superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis en los hemocitos teniendo

efectos oxidantes bactericidas (Muñóz et al., 2000).

Genes relacionados con la respuesta inmune

La expresión de genes relacionados con el sistema inmune en el camarón

blanco como profenoloxidasa (proFe), transglutaminasa (TG), crustina (CR),

peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SD)] en L. vannamei,

proporciona información importante sobre la activación del sistema inmune y su

modulación siendo una guía para la toma de muestras en tejidos u órganos (Wang et

al., 2007).

16

2. ANTECEDENTES

En los camarones peneidos, se han realizado importantes estudios sobre el uso

de probióticos en los cultivos larvarios, de juveniles y adultos.

En el año 2005, Ramírez-Toro realizó uno de los estudios más completos sobre

la actividad probiótica de BAL en larvas y juveniles de L. vannamei. En su ensayo de

crecimiento de larvas, demostró que el alimento adicionado con BAL posee una

ligera ventaja con respecto al alimento solo. Realizó también un ensayo de inhibición

de 14 patógenos, con BAL y diferentes antibióticos, demostrando que las BAL

pueden competir fácilmente con el uso de antibióticos en la acuacultura. Observó

también que las BAL pueden colonizar el tracto digestivo y el hepatopáncreas de los

organismos tratados, a partir del 5to día de tratamiento. Al igual que los ejemplos

anteriores, demostró que la sobrevivencia de larvas alimentadas con BAL, después

de un desafío con Vibrio harveyi, es mucho más alta (80%) que en el control (40%).

Finalmente, realizó un desafío de juveniles positivos para WSSV, con Vibrio

alginolyticus, para medir algunos parámetros del sistema inmune, y encontró que en

los organismos alimentados con BAL, no se presentaba sintomatología de vibriosis ni

mancha blanca, mientras que en los organismos del control se presentaron los

signos gruesos de ambas enfermedades (expansión de cromatóforos en branquias,

urópodos, telson, anténulas, necrosis localizada y puntos blancos en el cefalotórax).

Así mismo, observó que el número de hemocitos después de la infección, era mayor

en las larvas alimentadas con BAL, y el tiempo de coagulación de la hemolinfa en los

organismos del control, fue de 274 s, casi el triple que en los organismos del

tratamiento con BAL (88 s). Midió también las UFC/mL de V. alginolyticus en la

hemolinfa, registrando un mayor número en el control que en el tratamiento con BAL.

Wang et al., (2006) estudiaron la expresión del gen que codifica para la

profenoloxidasa en los tejidos de L. vannamei por qPCR e hibridación in situ. Su

análisis reveló que la profenoloxidasa es constitutiva principalmente en hemocitos del

camarón. Sus transcripciones se encontraron en los hemocitos, las branquias, el

corazón, órgano linfoide, estómago, intestino medio, el ciego del intestino medio

anterior y ganglionares. La expresión más baja fue encontrada en hepatopáncreas,

17

músculo y epidermis cuticular. Los resultados de las hibridaciones in situ mostraron

que las branquias, el corazón, el músculo, el tejido hematopoyético y hepatopáncreas

infiltrados por hemocitos presentaron signos positivos.

Wang et al., (2007) analizaron por RT-PCR convencional y PCR en tiempo real

(qPCR) e hibridación in situ las expresiones en tejidos de nueve genes relacionados

con el sistema inmune, en L. vannamei: la proteína de unión a β-glucanos (HDL-

BGBP), proteína de unión a lipopolisacáridos (LGBP), hemocianina, profenoloxidasa

(pFO), transglutaminasa (TGasa), crustina, penaeidinas (PEN), superóxido

dismutasa (cMnSOD) y la lisozima. Las transcripciones de los nueve genes fueron

detectados en todos los tejidos con los niveles de expresión diferencial al ser

examinados por RT-PCR y qPCR.

Rodríguez et al., (2007) probaron combinaciones de una cepa probiótica de V.

alginolyticus, y β-1,3/1,6-glucanos en Penaeus vannamei, retado con el virus de la

mancha blanca. En su investigación encontraron que la aplicación del probiótico en el

agua, durante la larvicultura (antes del estadio zoea II), y la posterior adición de los β-

1,3/1,6-glucanos, en el alimento, desde el estadio zoea II en adelante, aumentaba la

sobrevivencia de los organismos retados con WSSV. Así mismo, observaron que

después de la infección con el virus, los organismos sobrevivientes mostraban una

resistencia al mismo, una fuerte actividad antibacteriana, un aumento en el número

de hemocitos totales, y la carencia de lesiones típicas de la enfermedad de la

mancha blanca. También observaron que si se adicionan β-1,3/1,6-glucanos en la

dieta, por lo menos 15 d antes de la infección con el virus, los organismos aumentan

el nivel de proteína en plasma, la generación de O2 y el número total de hemocitos.

Burge et al., (2007) cuantificaron la expresión del gen de la lisozima, una

proteína antibacteriana producida por hemocitos de camarón, dentro de los tejidos de

L. vannamei en respuesta a un desafío con un patógeno. Los resultados sugirieron

que la lisozima se expresa en la mayoría de los hemocitos en circulación y en los

tejidos periféricos.

Partida-Arangure (2009) observó que la adición de la mezcla probada por

Peraza-Gómez (2008) en el alimento (vivos y muertos por calor), en L. vannamei,

18

causa inmunoestimulación por incremento significativo en el número total de

hemocitos.

Shockey et al., (2009) hicieron demostraron que los antimicrobianos como la

crustina en camaron blanco in vivo presentan una respuesta a la exposición a las

bacterias y hongos.

Wang et al., (2010) utilizaron PCR en tiempo real para monitorear

simultáneamente las respuestas de 12 genes de sistema inmune innato en L.

vannamei después del desafío con Vibrio harveyi, observando una regulación de la

mayoría de los genes analizados.

Flores-Miranda et al., (2011) observaron que la adición de la mezcla probada

por Peraza-Gómez et al., (2008) en el alimento, en L. vannamei, causa

inmunoestimulación en L. vannamei retado con Vibrio sinaloensis. Observaron un

incremento significativo en el número total de hemocitos cuando se alimentaron

diariamente, pero no así cuando se alimenta cada tres y seis días. Sin embargo, la

supervivencia fue significativamente mayor respecto al control cuando se alimentaron

cada 3 días. Además, demostraron la actividad de 9 enzimas hidrolíticas en el

plasma y 6 en el sobrenadante de lisado de hemocitos.

Peraza-Gómez et al., (2011) evaluaron el efecto de una mezcla de tres plantas

medicinales, dos de ellas comerciales (VPH® y HSV®), junto con albahaca morada

silvestre, y una mezcla probiótica (BAL y una levadura) contra el virus de la mancha

blanca, en L. vannamei. Los autores observaron que la adición de la mezcla

probiótica en el alimento, aumentaba la sobrevivencia de los organismos ante el

virus, y disminuía la prevalencia de organismos infectados con WSSVV. En los

camarones sobrevivientes, tratados con bacterias, aumentó el número total de

hemocitos y dos enzimas lisosomales.

19

3. JUSTIFICACIÓN

Las enfermedades en acuicultura provocan anualmente pérdidas millonarias,

por lo que la prevención y control acaparan la mayor atención. Gran parte de las

enfermedades son causadas por virus y bacterias. Por ejemplo, el virus de la mancha

blanca (WSSV) ha registrado graves pérdidas en casi todas las áreas de cultivo de

camarón en América. Por lo anterior, se han tratado de desarrollar técnicas

amigables con el ambiente, que le permitan al camarón convivir con los patógenos

sin ser afectados, o bien, técnicas que minimicen las pérdidas, una vez detectado el

virus en un cultivo.

Una buena opción, son los probióticos, que ya han mostrado buenos

resultados contra estos virus, especialmente contra el virus de la mancha blanca

(WSSV) cuando se usan como inmunoestimulantes. La inmunoestimulación se

proyecta como una alternativa de prevención a los agentes virales, ya que existen

evidencias publicadas que señalan el efecto protector de los β-glucanos y

péptidoglicanos contra este virus.

20

4. HIPÓTESIS

Las bacterias ácido lácticas y levaduras, adicionadas al alimento, provocan

una inmunoestimulación y un cambio en la expresión de genes en camarón blanco

(L. vannamei).

5. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto de bacterias ácido lácticas y levaduras en el sistema inmune

y la expresión de genes de L. vannamei.

5.1. Objetivos específicos

Determinar el efecto del alimento adicionado con microorganismos, y

administrado con diferente frecuencia, en cuatro parámetros bioquímicos del

sistema inmune de L. vannamei.

Determinar el efecto del alimento adicionado con microorganismos, y

administrado con diferente frecuencia, en la expresión de genes del sistema

inmune de L. vannamei.

21

6. METODOLOGIA

6.1. Adición de las BAL y levaduras al alimento

Se usó una mezcla inmunoestimulante (MI) compuesta por 4 bacterias

ácido lácticas (Lta2, Lta6, Lta8 y Lta10) y 1 levadura (Lt6), previamente utilizada

por Partida-Aranguré (2009) y Peraza-Gómez et al. (2011), la concentración de la

mezcla utilizada fue de 8.5 mg/kg de alimento. Los aislados (Apún-Molina et al.,

2009) se conservan en el Departamento de Acuacultura CIIDIR-IPN (Unidad

Sinaloa).Los microorganismos se cultivaron en MRS, se obtuvo el pellet por

centrifugación, se secaron a 74 °C, por 4 h, y se trituraron en un mortero. La

mezcla bacteriana en polvo se adicionó al alimento balanceado (Camaronina®,

Purina, 35%) molido previamente en una licuadora. La mezcla se rehidrató, se hizo

el pellet de nuevo en un molino de carne y se secó con un ventilador. Se preparó

alimento sin microorganismos para el tratamiento control. El alimento se preparó

para 27 d y se guardó a -20 °C.

6.2. Obtención de animales y su aclimatación

Se trajeron camarones de la granja Acuícola Cuate Machado (Guasave,

Sinaloa) a las instalaciones del Departamento de Acuacultura del CIIDIR-IPN, Unidad

Sinaloa. Para la aclimatación y posterior cultivo, se utilizaron tinas ovaladas de

plástico con una capacidad de 120 L, llenadas con 80 L de agua de mar filtrada (20

µm). En cada una de las tinas se colocaron 10 organismos. Se aclimataron los

organismos durante 5 d en el sistema de cultivo, y se alimentaron dos veces al día

(09:00 y 17:00) con Camaronina® (Purina), a razón del 5% de la masa corporal. Se

hizo un análisis de mancha blanca a 12 camarones para saber si estaban libres de

WSSV.

6.3.Extracción de ADN para la determinación de WSSV

Para la extracción de ADN se utilizó una lamela branquial por organismo, la

cual se colocó en 400 L del reactivo DNAzol MRC® (Invitrogen), se maceró con un

pistilo y se dejó incubar por 30 min. Posteriormente, se centrifugó a 13,000 x g

22

durante 10 min. Se recuperaron 300 L del sobrenadante, al cual se añadieron 400

L de etanol absoluto frío. La mezcla se dejó reposar por 15 min, agitando

periódicamente. A continuación se centrifugó a 9,000 x g durante 5 min y se desechó

el sobrenadante. La pastilla se resuspendió en 1 mL de etanol al 70% frío y se

centrifugó a 9,000 x g durante 5 min. Se decantó el sobrenadante y se extrajo con

una pipeta el líquido restante. Se colocó la muestra en un termoblock a 55 °C hasta

secar y se agregaron 30 L de agua ultrapura a 55 °C. Finalmente, se agitó la

muestra en un agitador vortex, se centrifugó a 9,000 x g durante 30 s y se almacenó

a -20 °C.

6.4. PCR para WSSV

La detección final de WSSV en los organismos se realizó mediante una

PCR sencilla y una PCR anidada. Los oligonucleótidos utilizados en la PCR sencilla

fueron: WSSV1:5’-ATC ATG GCT GCT TCA CAG AC-3’ y WSSV2:5’-GGC TGG AGA

GGA CAA GAC AT-3’. Los oligonucleótidos utilizados en la PCR anidada fueron:

WSSV1 in (sentido) 5’-TCT TCA TCA GAT GCT ACT GC 3’ y WSSV2 in

(contrasentido) 5’-TAA CGC TAT CCA GTA TCA CG 3’. (Kimura et al., 1996). Los

dos pares de oligonucleótidos amplifican un fragmento de 982 pb y 570 pb,

respectivamente. La mezcla de reacción se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 mL e

incluyó18.75 µL de H2O; 2.5 µL de búfer de reacción 10X (Bioline); 1.0 µL de

MgCl2(50 mM; Bioline); 0.5 µL de dNTPs (100 µM; Bioline); 0.5 µL de cada oligo (10

mM cada uno; Sigma-Genosys); 0.25 µL de Taq polimerasa (5 U/µL; Bioline) y 1 µL

de DNA total para un volumen total de 25 µL. La amplificación se realizó en un

termociclador Biometra (Tpersonal) usando el siguiente programa: desnaturalización

inicial a 95 °C por 4 min, 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 55 °C 2 min a 72 °C y una

extensión final a 72 °C, por 4 min. Los fragmentos amplificados se visualizaron

(incluido un marcador de peso molecular de 1 kb) en un gel de agarosa al 1%, teñido

con bromuro de etidio, bajo luz UV. En la PCR anidada se redujo a 45 s el tiempo de

polimerización a 72 °C.

23

6.5. Bioensayo

El bioensayo duró 25 días, se utilizaron diez camarones por tina con peso

promedio de 9.96±3.18g.Se utilizaron cuatro tratamientos por triplicado: I) Control

negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5mg/kg de alimento),diario; III)

Camaronina® + MI (8.5mg/kg de alimento), cada tres días;IV) Camaronina® + MI

(8.5mg/kg de alimento),cada seis días. La limpieza del sistema de cultivo se realizó

cada 3 días, eliminando la materia particulada del fondo por sifoneo. El volumen de

agua perdido en la limpieza, se recuperó inmediatamente. Los parámetros

fisicoquímicos: temperatura, oxígeno, salinidad y pH se midieron cada 3 días en cada

una de las tinas. Al inicio y final del bioensayo, se determinó la cantidad de nitritos,

nitratos y amonio presentes en el agua de las tinas experimentales, y en el reservorio

utilizado para los recambios de agua(Strickland y Parsons, 1972). Al final del

bioensayo, se registró la supervivencia y la prevalencia de camarones infectados

(vivos y muertos) con WSSV, mediante PCR.

6.5.1. Obtención de hemolinfa

Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune, la actividad de

la fenoloxidasa y la peroxidasa y la concentración del anión superóxido intracelular,

se extrajo la hemolinfa de los camarones cultivados con jeringas para insulina (27G x

13 mm) de la parte ventral del camarón, justo en la zona del segundo par de

pleópodos. La jeringa se cargó con una solución isotónica para camarón y EDTA

como anticoagulante (SIC- EDTA, Na2) (NaCl 450 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM +

EDTA, Na2 10 mM, pH 7.3, 850 mOsm/kg), previamente enfriada a 4 °C (Vargas-

Albores et al., 1993), en una proporción 2:1 (2 volúmenes de SIC-EDTA por cada

volumen extraído de hemolinfa). Inmediatamente después de ser extraída la muestra

de hemolinfa, ésta se colocó en tubos Eppendorf® de 1.5 mL. Para el conteo de

hemocitos se extrajo la hemolinfa de dos camarones por tina (6 por tratamiento) en

SIC-EDTA enfriada. Cincuenta µL de hemolinfa se mezclaron con 150 µL (1:3) de

una solución de formol al 6%. El conteo se hizo individualmente en una cámara

Neubauer.

24

Para el estudio bioquímico (FO y peroxidasa) del sistema inmune se utilizó la

hemolinfa de dos camarones por tina (seis por tratamiento). Se separaron los

hemocitos del plasma centrifugando a 800 x g, por 6 min, a 4 °C. El plasma se

almacenó a -80 °C y el paquete celular se lavó con 1 mL de SIC frío. La muestra

lavada se centrifugó a 800 x g, por 6 min, a 4 °C y el sobrenadante se desechó. Al

paquete celular se adicionaron 300 µL de búfer de cacodilatos 10 mM (pH 7) y se

centrifugó a 14 000 x g, por 10 min, a 4 °C, recuperándose el sobrenadante del lisado

de hemocitos (SLH), el cual se guardó a -80 °C. Para la determinación bioquímica del

anión superóxido intracelular se utilizaron dos camarones por tina (seis por

tratamiento). Las células se separaron del plasma y se lavaron (como arriba) y se

resuspendieron en un búfer especial como se explica más adelante.

Para determinar la expresión de los genes del sistema inmune, se extrajo la

hemolinfa de tres camarones por tina (réplica) y se hizo un pool. La hemolinfa se

centrifugó a 800 x g, por 6 min, a 4 °C. El plasma se eliminó y el paquete celular

(pool de los tres camarones) se lavó con 1 mL de SIC frío. Al paquete celular se

adicionaron 1.5 mL de Trizol enfriado en hielo y se almacenó a -80 °C.

6.5.2. Extracción de ARN y RT-PCR semicuantitativa

Se utilizaron los hemocitos guardados a -80 °Cen TrizolMRC®. El ARN total

fue extraído de acuerdo al protocolo del fabricante (Invitrogen®) y guardado a -80 °C

hasta su uso en la RT-PCR. La concentración y pureza del ARN se determinó

midiendo la absorbancia a 260/280 nm en un Nanofotómetro (Nanodrop 8000,

Thermo Scientific®).

Se usó la transcriptasa reversa M-ML(Invitrogen®) para sintetizar la primera

hebra (ADNc) con el primer oligo dT20 a partir de 1µg de ARN total a 37 °C, por 50

min. El ADNc resultante en búfer TE 1x se almacenó a -20 °C para su uso en las

reacciones de PCR.La concentración del ARN y el ADNc se determinó midiendo la

absorbancia a 260/280 nm en un Nanofotómetro (Nanodrop® 8000).

Los genes(Tabla 1) profenoloxidasa (proFO), transglutaminasa (TG), crustina

(CR), peneidina 3a (PEN), lisozima (LIZ) y superóxido dismutasa (SOD) fueron

amplificados del ADNc de hemocitos (Wang et al.,2007). El gen de la -actina fue

25

usado como control en todas las reacciones de amplificación. Como el gen de la beta

actina es constitutivo se usó para normalizar la expresión de los genes de estudio. La

tabla que se inserta muestra los primers que se utilizaron en este trabajo. Se

utilizaron 100 ng de ADNc para la PCR en una reacción con volumen de 25 µL. La

amplificación se realizó en un termociclador Biometra (Whatmann®), con las

siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C por 5 min, seguido por 40

ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, 60°C por 1min,anillado (temperatura

variable para cada gen) y extensión a 72 °C por 1 min 30 s y una elongación final a

72 °C, por 5 min. Los productos de la PCR (25 µL) fueron visualizados en un gel de

agarosa al 1.0%, teñido con bromuro de etidio, usando un sistema de

fotodocumentación (BioRad). La cuantificación del ARNm se realizó empleando el

programa de análisis de imágenes IMAGE J® (http://rsb. info.nih.gov/ij/) que nos

permitió comparar la intensidad de la banda correspondiente al producto amplificado

de los genes de estudio con el testigo -actina, calculando la razón gen de estudio/-

actina (por triplicado).

Tabla1. Genes del sistema inmune estudiados(Wang et al., 2007).

Efectores del sistema

inmune

Secuencia del oligo (5’-3’)

Producto

(pb) -actina Sentido Contrasentido

GTGTGACGACGAAGTAGCC TGGTCGTGAAGGTGTAACCA

605

Profenoloxidasa Sentido Contrasentido

GGAATTGTTTTACTACATGCATCAGC GGAACAAGTCATCCACGAGCTT

563

Transglutaminasa Sentido Contrasentido

CAACCTGGAGGTTCACAAGC CAAAGCTCTYGGKAAATACG

535

Crustina Sentido Contrasentido

ATTCTGTGCGGCCTCTTTAC ATCGGTCGTTCTTCAGATGG

539

Peneidina 3a Sentido Contrasentido

AGCCTCACCTGCAGAGACCA AATCAGGATCRCAGKCTCTTCAC

378

Lisozima Sentido Contrasentido

TTCGGGAAGTGCGAATTCG AATGGAAACCCTTGGTGAC

475

Superóxido dismutasa Sentido Contrasentido

GAGAAGAAGTTGGCTGAGCT ATGTTGGGTCCAGAAGATGG

467

26

6.5.3. Secuenciación de genes del sistema inmune

Los productos amplificados de los genes[crustina (CR), peneidina 3a (PEN),

lisozima (LIZ), transglutaminasa (TGasa), profenoloxidasa (proFO) y superóxido

dismutasa (SOD)] fueron limpiados con el kit Wizard® SV Geland PCR Clean-Up

System(Invitrogen®). La cuantificación se realizó con el kit Quant-iT™ dsDNA HS Kit

(Invitrogen®). Los productos ya limpios se mandaron a secuenciar al CINVESTAV

Irapuato.

6.5.4. Determinación de la concentración de proteína

La concentración de proteína se determinó de acuerdo al método descrito por

Bradford (1976), utilizando albúmina de suero bovino para construir una curva

estándar. Como muestra se utilizó sobrenadante lisado de hemocitos y plasma.

6.5.5. Conteo y separación de hemocitos

El conteo de los hemocitos se realizó utilizando una cámara de Neubauer con

una retícula de 0.01 mm. Para el conteo se tomaron 50 µL de hemolinfa y se

diluyeron (1:5, v/v) en una solución de formol al 4%. A partir de esta dilución se

realizaron 2 conteos en el microscopio. Para separar los hemocitos del plasma y

medir la fenoloxidasa, la hemolinfa se centrifugó a 3,000 x g, por 3 min a 4C. El

plasma se guardó a 4C y el paquete celular se lavó con 1 mL de SIC frío. La

muestra lavada se centrifugó a 3,000 x g, por 3 min, a 4C y el sobrenadante se

desechó. Al paquete celular se adicionaron 600 µL de cacodilato de sodio (10 mM,

pH 7) enfriado en hielo y se centrifugó a 15,000 x g durante 5 min a 4C, para

romper las células y obtener el contenido celular, es decir, el sobrenadante del lisado

de hemocitos ó SLH. El SLH y el plasma se mantuvieron en hielo (4C) para los

análisis de profenoloxidasa (proFO) y fenoloxidasa (FO) y posteriormente se

congelaron a -70C para la determinación de enzimas hidrolíticas y proteína.

27

6.5.6. Medición de fenoloxidasa (plasma) y profenoloxidasa (SLH)

La medición de la proFO y la FO se realizó con la técnica descrita por

Hernández-López et al. (1996). La actividad de la FO presente en el plasma se midió

espectrofotométricamente por la formación de dopacromo a partir de L-

dihidroxifenilalanina (L-Dopa). A 50 µL de muestra, se le adicionaron 50 µL de búfer

de cacodilato 10 mM, pH 7 y 50 µL de L-Dopa(3 mg/mL en agua destilada). Se

incubó durante 10 min a temperatura ambiente (aprox. 25°C), posteriormente se le

adicionaron 800 µL de búfer de cacodilato y se determinó la absorbancia a 492 nm

en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific®). En

todos los ensayos se utilizó cacodilato como control negativo. La proFO se determinó

activándola previamente con tripsina(0.1 mg/mL) en agua destilada) para convertirla

en FO. La actividad de la FO se midió como se describió previamente. La actividad

enzimática se expresó como unidades, donde una unidad representa el cambio en la

absorbancia por minuto por miligramo de proteína (U/min/mg de proteína). La

cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:

La actividad total se expresó como el cambio en la absorbancia a 492nm. La

cantidad de proFO disponible en la muestra se calculó de la siguiente forma:

FO + FO activada con tripsina = FO total

FO total - FO = proFO

6.5.7. Cuantificación del anión superóxido intracelular

El anión superóxido se cuantificó mediante la metodología de Song y Hsieh

(1994). Se tomaron 100 µL de hemolinfa de cada grupo y se centrifugaron a 800 x g,

por 5 min. Posteriormente, se descartó el sobrenadante y los hemocitos se lavaron

tres veces con Búfer SIC-EDTA y se tiñeron con 100 µL de una solución NBT (0.3%)

durante 30 min a 37 °C. La reacción de tinción se finalizó mediante la eliminación de

la solución NBT por centrifugación y la adición de 100 µL de metanol absoluto.

Después de tres lavados con metanol al 70% los hemocitos se secaron al aire

durante 30 min y luego se añadieron 120 µL de KOH más 140 µL de DMSO para

disolver el formazán citoplasmático. La densidad óptica del formazán disuelto se leyó

28

a 630 nm en un espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys® 2 para comparar los

efectos de los diferentes tratamientos en la generación del anión.

6.5.8. Actividad de la peroxidasa

Se realizó la extracción de hemolinfa en búfer SIC-EDTA. Se centrifugó la

hemolinfa a 800 x g por 5 minutos (4 °C). Se guardó el plasma en tubos en hielo. Se

lavaron los hemocitos 2 veces con SIC-EDTA (300 µL) y se centrifugaron a 800 x g,

por 5 minutos, a 4 °C. Se tiró el búfer después de cada lavado. Se resuspendieron

los hemocitos en 200 µL del búfer SIC-EDTA y congelaron a -80 °C, por 30 min; se

descongelaron en hielo para hacer el análisis. Se centrifugó la muestra a 17,000 x g,

por 10 min, a 4 °C. Se obtuvo el sobrenadante del lisado de hemocitos (SLH) y se

tiraron los restos celulares. En una celda de sílice se mezclaron64µL de búfer fosfato

de potasio (H2KO4P, 0.1 M, pH 6.0); 64 µL de H2O2 (0.147 M); 128 µL de Pirogallol al

5 % (w/v) y 840 µL de agua destilada. A la mezcla se agregaron 40 µL de plasma o

SLH y se agitó vigorosamente con la misma pipeta. La absorbancia se leyó a 420 nm

después de 20 s en espectrofotómetro Thermo Spectronic Genesys® 2. La actividad

se expresó como las variaciones en absorbancia después de 20 s de reacción.

6.5.9. Tasa de crecimiento específico

La tasa de crecimiento específico (TCE) se calculará de la siguiente manera:

TCE = 100 (LN W2 – LN W1)/T

Donde: W2 es el peso final, W1 el peso inicial y T es el número de días de cultivo.

6.5.10. Análisis estadístico de los resultados

Los datos de crecimiento, conteo de hemocitos, FO, peroxidasa y anión

superóxido se analizaron para determinar si existen diferencias entre tratamientos

(p<0.05). Si existían diferencias entre tratamientos, se realizó una prueba de Tukey

(HSD) para identificar la naturaleza de estas diferencias (p<0.05)(Zar, 1996).Para

analizar la expresión de los genes del sistema inmune se realizó una prueba no

paramétrica de Kruskal-Wallis. Los valores de p<0.05 fueron considerados

significativamente diferentes.

29

7. RESULTADOS

7.1. Supervivencia y tasa de crecimiento específico

La supervivencia en el bioensayo fue del 100% en todos los tratamientos. No

se encontraron diferencias significativas (p>0.05). Respecto a la TCE los resultados

fueron: I) 0.96±0.09 (%/d); II) 1.06±0.10(%/d); III) 1.25±0.35(%/d); IV)

1.21±0.02(%/d).En el tratamiento III donde se alimentaron los camarones con

inmunoestimulantes cada tres días se obtuvo un mejor crecimiento (Fig. 1).

Figura 1.Tasa de crecimiento específico de camarón blanco durante el bioensayo. I)

Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento),

diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)

Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican

como promedio ± DE.

7.2. Conteo total de hemocitos(CTH)

Los resultados del CTH (Fig. 2) muestran que en el tratamiento I (Control) el

número de células fue de 28.49 x 106±17.54 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento II

fue de 34 x 106±16.22 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento III fue de 40.65 x

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

I II III IV

TCE

(%/d

)

TRATAMIENTOS

30

106±19.26 x 106 hemocitos/mL, en el tratamiento IV fue de 39.12 x 106±10.55 x 106

hemocitos/mL. No hubo diferencias significativas pero se observó un mayor número

de hemocitos en los tratamientos con aditivos, especialmente en el tratamiento III

(Fig. 2).

Figura 2. Conteo total de hemocitos del bioensayo.I) Control negativo

(Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), diario; III)

Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV) Camaronina® + MI

(8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican como promedio ± DE.

7.3. Determinación de proteína

La determinación de la proteína se hizo tanto en plasma como en el SLH. El

tratamiento I (Control) presentó concentraciones promedio de 88.642±15.6y

0.527±0.1µg/µL en plasma y SLH, respectivamente. En el Tratamiento II (MI diaria)

fueron de 91.766±9.1 y 0.382±0.05µg/µL en el plasma y SLH, respectivamente. El

tratamiento III (MI c/3dias) presentó concentraciones de 102.013±6.1y

0.431±0.1µg/µL en plasma y SLH, respectivamente. En el tratamiento IV (MI

c/6días)las concentraciones fueron de 87.111±10.5 y 0.359±0.02µg/µL en plasma y

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

I II III IV

He

mo

cito

s (x

10

6)

Tratamientos

31

SLH, respectivamente. No se existieron diferencias significativas entre los

tratamientos, tanto en plasma como en el SLH (Tabla 2).

Tabla 2. Determinación de la proteína de plasma y de SLH del bioensayo. Los

valores se indican como promedio ± E.E.

TRATAMIENTOS PLASMA mg/mL SLH mg/mL

I 88.6 ± 15.6 0.52 ± 0.1

II 91.7 ± 9.1 0.38 ± 0.05

III 102 ± 6.1 0.43 ± 0.1

IV 87.1 ± 10.5 0.35 ± 0.02

7.4. Peroxidasa total de plasma y SLH

Los resultados de la actividad de la peroxidasa (Absorbancia a 420 nm) entre

los diferentes tratamientos se muestran en la figura 3:I)0.040±0.01; II) 0.06±0.02; III)

0.05±0.02; IV) 0.05±0.02.No hubo diferencias significativas entre tratamientos, sin

embargo, los tratamientos con aditivos presentaron una mayor absorbancia (Fig. 3).

Figura 3.Actividad peroxidasa total del plasma y SLH del bioensayo.I) Control

negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), diario; III)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

I II III IV

Ab

sorb

anci

a (4

20

nm

)

Tratamientos

32

Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV4) Camaronina® + MI

(8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican como promedio ± DE.

7.5. Anión superóxido en SLH

Para evaluar la respuesta oxidativa generada en L. vannamei, se determinó la

generación de anión superóxido (Absorbancia a 630 nm).Los resultados de los 4

tratamientos fueron los siguientes: I) 1.10±0.55; II) 1.47±0.63; III) 1.74±0.61; IV)

1.45±0.29. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos (Fig. 4).

Figura 4.Resultados del análisis de anión superóxido de SLH en el

bioensayo.I) Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de

alimento), diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)

Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican

como promedio ± DE.

7.6. proFO, FO, FO total

Los resultados de la actividad de la fenoloxidasa [FO, (U/min/mg de proteína)

× 103] en el plasma mostraron que en el tratamiento IV ésta fue significativamente

mayor en comparación con los tratamientos I, II y III (p=0.0001, p=0.0001, p=0.0001,

respectivamente). Los resultados en el SLH mostraron que en el tratamiento IV la

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

I II III IVEsta

llid

o r

esp

irat

ori

o (

Ab

s. a

63

0)

nm

)

Tratamientos

33

proFO (FO) fue significativamente mayor que en el tratamiento I (p=0.001) y III

(p=0.003). La actividad total de la FO en la hemolinfa de los camarones

experimentales presentó el mismo comportamiento en el SLH (Tabla 3).

Tabla 3.Profenoloxidasa (ProFO), Fenoloxidasa (FO) y Fenoloxidasa Total

(FOtotal) en L. vannamei alimentado con inmunoestimulantes con diferente

frecuencia. Actividad expresada en U/min/mg de proteína. Los valores se indican

como promedio ± DE.

Tratamientos Profenoloxidasa

(SLH)

Fenoloxidasa

(Plasma)

Fenoloxidasa

(Total)

I 37.3±22.0b 0.119±0.03b 37.4±22.03b

II 51.3±26.0ab 0.113±0.02b 51.4±26.01ab

III 38.9±13.2b 0.138±0.03b 39.1±13.22b

IV 63.7±19.9a 0.189±0.03a 63.8±19.90a

Tratamientos: I) Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5

mg/kg de alimento), diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres

días; IV) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días.

7.7. Análisis de la expresión de genes del sistema inmune

Los resultados muestran que los genes crustina, peneidina y superoxido

dismutasa no presentaron diferencias significativas (p>0.05) entre los tratamientos de

acuerdo a la prueba de Kruskal-Wallis. Por otro lado,en el gen de la lisozima se

observó una sobreexpresión significativadel tratamiento III respecto al control

(p=0.02). La expresión del gen de la transglutaminasa fue significativamente mayoren

el tratamiento II respecto al control (p=0.03). Por último,la expresión del gen de la

profenoloxidasa fue significativamente mayoren el tratamiento IV respecto al control

(p=0.01) (Fig. 5).

34

Figura 5. Expresión de los genes del sistema inmune de L. vannamei. I)

Control negativo (Camaronina®); II) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento),

diario; III) Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada tres días; IV)

Camaronina® + MI (8.5 mg/kg de alimento), cada seis días. Los valores se indican

como promedio ± DE.

Las secuencias obtenidas de los seis genes se compararon con las

secuencias nucleotídicas reportadas en el banco genómico (GeneBank) coincidiendo

con las reportadas por Wang et al., (2007).

35

7.8. Parámetros fisicoquímicos (temperatura, oxígeno disuelto, pH, salinidad)

Los parámetros fisicoquímicos del aguase mantuvieron dentro de los

intervalos óptimos (Brock y Main, 1994)para el cultivo del camarón blanco durante los

26 días que duró el experimento(Tabla 4).

Tabla 4.Parámetros fisicoquímicos del bioensayo. Los valores se indican

como promedio ± DE.

Tratamientos

Salinidad

(‰)

O.D

(mg/L)

Temperatura

(°C) pH

I 33.5±1.1 5.6±0.4 26.1±2.4 8.4±0.3

II 34.6±1.8 5.4±0.4 25.9±2.2 8.3±0.3

III 36.3±2.1 6.1±0.3 26.0±2.4 8.4±0.3

IV

Intervalo óptimo*

36.5±1.7

15 - 35

5.8±0.5

4.0 – 10.0

26.2±2.4

23 - 30

8.4±0.2

8.1 – 9.0

* (Brock y Main, 1994).

7.9. Calidad de agua (nitritos, nitratos y amonio)

Durante el cultivo, la concentración promedio de nitritos (0.003-0.04 mg/L) fue

óptima. Los nitratosy amonio estuvieron dentro del intervalo óptimo(Tabla 5).

Tabla 5.Calidad del agua del bioensayo. Los valores se indican como

promedio ± DE.

Tratamientos Nitritos Nitratos Amonio

I 0.04±0.01 0.74±0.14 0.55±0.62

II 0.02±0.01 0.73±0.04 0.73±0.88

III 0.01±0.01 0.63±0.24 0.95±0.25 IV

Intervalo óptimo* 0.02±0.003

<0.5 0.70±0.08 0.4 – 0.8

0.87±0.16 0.1 – 1.0

* (Brock y Main, 1994)

36

8. DISCUSIÓN

Las enfermedades microbianas causan graves problemas en la acuacultura al

nivel mundial (Lo et al., 1997). En el mercado existen varios inmunoestimulantes que

pretenden fortalecer el sistema inmune de L. vannamei para que sea más resistente a

las enfermedades pero existe poco soporte científico sobre su función y la

dosis/frecuencia de aplicación (Sajeevan et al., 2009). Por lo tanto, en este trabajo se

evaluó el efecto inmunoestimulante de una mezcla microbiana compuesta por

bacterias acido lácticas y una levadura adicionadas en el alimento en juveniles de

camarón blanco, L.vannamei, alimentado con diferente frecuencia.

En el bioensayo realizado, la supervivencia fue del 100% en los cuatro

tratamientos sin encontrarse diferencias significativas en la tasa de crecimiento

específico entre éstos. Durante el experimento se mantuvieron los parámetros

fisicoquímicos y de calidad del agua dentro de los intervalos propuestos por Brock y

Main (1994) para el cultivo de camarón blanco, por lo que se puede afirmar que el

sistema de cultivo presentó las condiciones adecuadas.

Los hemocitos son responsables de la coagulación, el endurecimiento del

exoesqueleto y la eliminación de materiales extraños (Johansson y Soderhall, 1989;

Song y Hsieh, 1994).Un incremento en el número de hemocitos aumenta la respuesta

inmune de los crustáceos durante los periodos de estrés y los hace más resistentes a

las enfermedades (Truskott y White, 1990; Le Moullac et al., 1998). En este trabajo,

aunque se observó un aumento en el número de hemocitos en los tratamientos con

inmunoestimulantes, especialmente en el tratamiento III (alimentados cada 3 días con

la MI), respecto al control, no hubo diferencias significativas. Por el contrario, Peraza-

Gómez et al. (2011), en L. vannamei, obtuvieron un aumento significativo en el

número total de hemocitos (40.9 x 106 hemocitos/mL) respecto al control (25.0 x 106

hemocitos/mL) cuando administró la misma mezcla de BAL y una levadura pero

adicionadas vivas en el alimento en una concentración de 1 x 106 UFC/g de alimento.

Los autores mencionan que el aumento en el número de hemocitos pudo ser inducido

por componentes de la pared celular de la mezcla inmunoestimulante

(peptidoglucanos de las BAL y β−glucanos de la levadura). Del mismo modo, Bai et

37

al., (2010) encontraron que administrando β-glucanos con diferente frecuencia (2000

mg/kg de alimento) a L. vannamei en cultivo aumentó significativamente el número de

hemocitos respecto al control.

La actividad de la peroxidasa, presente en crustáceos se asocia con una

molécula de adhesión llamada peroxinectina (Sritunyalucksana et al., 2001). La

peroxinectina actúa como una opsonina y como un factor que promueve la

degranulación y encapsulamiento, además de tener actividad de peroxidasa y

adhesión celular. La enzima superóxido dismutasa (SOD) de hemocitos produce

peróxido de hidrógeno el cual puede ser transformado a ácido hipohálico por la

peroxinectina. Este ácido puede funcionar como microbicida contra microorganismos

invasores (Sritunyalucksana et al., 2001). En este estudio, aunque se obtuvo un

aumento en la actividad de la peroxidasa en los tratamientos con inmunoestimulantes,

especialmente en el tratamiento II (alimentados diariamente con la MI), respecto al

control, no hubo diferencias significativas. En Litopenaeus schmitti, la peroxidasa

presente en la hemolinfa es mayor dentro de los hemocitos que en el plasma (Laria et

al., 2003).

El anión superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis en los

hemocitos y tiene actividad bactericida (Muñóz et al., 2000). La molécula es uno de

los parámetros del sistema inmune más utilizados para determinar el estado de salud

de los camarones cultivados. En este trabajo, no se encontraron diferencias

significativas entre tratamientos respecto a la concentración del radical anión

superóxido. Sin embargo, la concentración fue mayor en los tratamientos con la MI,

especialmente en el tratamiento III (alimentados cada tres días). Contrariamente,

Campa-Córdova et al. (2002) inmunoestimularon camarones (L. vannamei) con β-

glucanos y polisacáridos sulfatados. Encontraron que la generación del anión

superóxido aumentó significativamente en los camarones tratados con respecto al

control. Sin embargo, es importante recordar que en este trabajo se utilizaron los

microorganismos completos (BAL y levadura) para inmunoestimular los animales a

diferencia del trabajo mencionado donde utilizaron moléculas aisladas. De la misma

manera, Guertler et al., (2010) encontraron un aumento significativo del anión

superóxido en los hemocitos de los camarones (L. vannamei, L. schmitti y

38

Farfantepenaeus paulensis) tratados con 2 mg/mL de laminarina (β-glucano) respecto

al grupo control.

La enzima SOD cataliza el anión superóxido a peróxido de hidrógeno (Wang et

al., 2010); sin embargo, a nivel de transcripción del ARNm del gen de la SOD no hubo

un aumento significativo entre los organismos alimentados con la MI y el grupo

control. Como el anión superóxido se produce durante el proceso de fagocitosis, los

resultados a nivel bioquímico (concentración del anión superóxido en hemocitos) y

genético indican que no hubo un aumento significativo en la actividad fagocítica de los

hemocitos de L. vannamei alimentado con la MI.

El sistema profenoloxidasa es uno de los mecanismos defensivos más

importantes en crustáceos (Söderhäll y Cerenius, 1992; Sung et al., 1996). En este

trabajo, la actividad de la fenoloxidasa (SLH y Plasma) fue significativamente más alta

en el tratamiento IV (alimentados cada 6 días con la MI) respecto al grupo control. De

manera similar, Suphantharika et al., (2003) reportaron un aumento de la actividad de

la FO en camarones tigre (Penaeus monodon) cuando administraron oralmente β-

glucanos (0.2%, peso/peso). Felix et al., (2004) encontraron que la adición de la

macroalga (Sargassum wightii) en polvo en el alimento funcionó como

inmunoestimulante ya que la actividad de la FO en los animales alimentados con 10

g/kg de alimento fue significativamente mayor que en los animales del grupo control.

En el mismo tenor, la actividad de la FO en camarones blancos (L. vannamei)

alimentados con dietas conteniendo Lactobacillus plantarum vivas (107 y 1010 UFC/kg

de alimento) fue significativamente más alta a las 168 h respecto a los camarones del

grupo control (Chiu et al., 2007). En contraste, Peraza-Gómez et al., (2011), en L.

vannamei, no obtuvieron un aumento significativo en la actividad de la FO en los

organismos tratados respecto al grupo control cuando administraron la misma mezcla

de BAL y una levadura utilizadas en este trabajo pero adicionadas vivas en el

alimento en una concentración de 1 x 106 UFC/g de alimento.

La respuesta inmune innata en invertebrados se dispara cuando los

receptores que reconocen patrones moleculares (RRPM), en el hemocito o solubles

en el plasma, reconocen y se unen específicamente a los patrones moleculares

asociados a patógenos (lipopolisacáridos, β-glucanos, peptidoglucanos, ADN y ARN)

39

(Dalmo y Bøgwald, 2008; Wang et al., 2010). Cuando los hemocitos de los

camarones (L. vannamei) reconocen las moléculas en los microorganismos se

dispara una cascada de proteasas serinas lo que da como resultado la activación del

sistema profenoloxidasa (Wang et al., 2010). En este trabajo se encontró un aumento

significativo en la transcripción del ARNm dela profenoloxidasa en el tratamiento IV

(alimentados con la MI cada 6 días) respecto al grupo control. El aumento en la

expresión del gen significa que los camarones son más resistentes ante el ataque de

un posible patógeno. Es importante recalcar que los resultados a nivel genético

coinciden con los del análisis bioquímico.

Cuando los hemocitos de los camarones (L. vannamei) reconocen las

moléculas en los microorganismos se liberan varias proteínas, incluyendo la

profenoloxidasa, proteinasa serina, peroxinectina, inhibidor de proteinasas y lisozima

(Lin et al., 2010). La lisozima es una enzima hidrolítica lisosomal que pertenece al

sistema de péptidos antimicrobianos y es un componente importante del sistema de

defensa del camarón contra bacterias Gram negativas (Wang et al., 2010). En este

trabajo se hizo el análisis de la actividad de la lisozima en hemocitos dando como

resultado una sobreexpresión significativa del gen en el tratamiento III (alimentados

diariamente con la MI) respecto al control. Burge et al. (2007) hicieron un estudio

para cuantificar la expresión del gen de la lisozima en respuesta a un desafío con

Vibrio campbelli. La lisozima se expresó en la mayoría de los hemocitos en

circulación y en los tejidos.

En este trabajo, el gen de la transglutaminasa presentó una expresión

significativamente mayor en el tratamiento II (alimentados diario con la MI) en

comparación con los camarones del grupo control. La proteína de la coagulación es

un dímero plasmático que se llama proteína coaguladora (CP) y se encuentra en el

plasma en crustáceos decápodos. La polimerización de CP se lleva a cabo mediante

la acción de la enzima transglutaminasa en presencia de calcio. La transglutaminasa

se encuentra en el interior de las células hialinas del camarón y se libera al plasma

por daño tisular o como una repuesta inmediata de los hemocitos ante la presencia

de lipopolisacáridos LPS y β-1,3-glucanos (Martín et al., 1991; Yeh et al., 1998;

Montaño-Pérez et al., 1999). La transglutaminasa está implicada en la coagulación

40

de la sangre y es un mecanismo de defensa entre los invertebrados. Según Fagutao

et al., (2012), el silenciamiento génico de la transglutaminasa hace al camarón más

susceptible a infecciones bacterianas y virales; por tanto, esta enzima es un

componente esencial del sistema inmune del camarón y está implicada en la

regulación de algunos otros genes (crustina y lisozima).

En este estudio, la expresión del gen de la crustina fue igual en todos los

tratamientos, por lo que la MI no tuvo un efecto positivo en los camarones

alimentados. La crustina es un péptido antimicrobiano muy importante en los

crustáceos decápodos. Antony et al., (2010) caracterizaron la crustina en los

hemocitos del camarón tigre gigante (Penaeus monodon) a nivel molecular. Los

autores observaron una expresión diferencial del gen de la crustina en respuesta a la

administración de diversos inmunoestimulantes (levaduras y bacterias). Los

inmunoestimulantes mejoraron la producción de crustina y confieren una protección

significativa del camarón contra la infección de WSSV.

En este estudio, la expresión del gen de la peneidina 3a fue igual en todos los

tratamientos, por lo que la MI no tuvo un efecto positivo en los camarones

alimentados. Las peneidinas son una familia única de péptidos antimicrobianos que

se han encontrado solamente en camarones peneidos. Existen tres subfamilias de

peneidinas (PEN2, PEN3 y PEN4) que son muy efectivas contra bacterias Gram

positivas, pero no contra bacterias Gram negativas (Destoumieux et al., 1999;

Bachere et al., 2004; Gueguen et al., 2006; de Lorgeril et al., 2008).

41

9. CONCLUSIONES

La mezcla inmunoestimulante compuesta por bacterias acido lácticas y una

levadura incrementó significativamente la actividad de la fenoloxidasa en el

camarón blanco (L. vannamei en el estudio realizado a nivel bioquímico y

molecular.

En el análisis bioquímico de la peroxidasa y anión superoxido no se observaron

diferencias significativas entre los organismos tratados con la MI y el control.

Se observó un aumento significativo en la expresión del gen de la lisozima en

el tratamiento donde se alimentó a los camarones cada tres días con la MI

respecto al tratamiento control.

El aumento significativo de la expresión del gen de la transglutaminasa indica

que a nivel bioquímico la coagulación de hemolinfa de los animales

alimentados diariamente con la MI es más rápida que en el control; lo anterior

se debe a que en el tratamiento 2 los camarones fueron inmunoestimulados

continuamente.

La expresión delos genes crustina, peneidina y superoxido dismutasa fue igual

en todos los tratamientos.

Las secuencias obtenidas de los seis genes estudiados coinciden con las

reportadas por Wang et al.(2007) en el GeneBank.

42

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