UNIVERSIDAD NACIONAL DE AGRICULTURA DEPARTAMENTO DE PRODUCCION VEGETAL

SINTESES DEL LABORATORIO DE FITOPATOLOGIA

PRACTICA 1- ESTERILIZACIÓN Y MEDIDAS ASÉPTICAS

METODOS DE ESTERILIZACION

1- METODOS FISICOS

A- CALOR SECO: Consiste en la exposición al calor ya sea por medio de Horno a una T°165°C

por 90 minutos, también se esterilizan en el mechero objetos metálicos como pinzas y bisturís,

se introducen en una solución de OH al 95% y luego se flamea.

B- CALOR HUMEDO: Este método emplea la utilización de autoclaves u ollas de presión los

cuales someten a esterilización por medio de presión 15 PSI (Libras/Pulg.²) a 121°C de T°.

2- METODOS QUIMICOS

A- ESTERILIZACIÓN CON ÉTER ETÍLICO: La materia seca es tratada con éter etílico, el disolvente

es evaporado a una temperatura inferior a 30°C. Toda la manipulación debe hacerse bajo una

cámara de aspiración ventilada.

B- BAÑO SULFOCRÓMICO: Es el método tradicional de limpieza de la cristalería, La mezcla se

compone de: Agua1000 ml, Dicromato de potasio 100 gr, Ácido sulfúrico concentrado 500 ml.

C- GASEOSOS Y NO GASEOSOS: Utilización productos clorados, yodados y alcoholes.

3- METODOS MECANICOS: Esterilización por filtración es cuando un constituyente es

termolábil (sensible al calor) en solución, puede ser esterilizado por pasaje de la solución a

través de un filtro en ester de celulosa cuyos poros tienen un diámetro de 0.22 micras. Este

tipo de filtración se utiliza especialmente cuando se desea preservar las proteínas que tienen

la propiedad de desnaturalizarse (termolábil).

4-ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES ULTRA VIOLETA: Los rayos ultra violeta (UV) son letales

para los organismos, por lo que se pueden utilizar lámparas UV para esterilizar medios, pero

como estos rayos tienen poca penetración a través de vidrios o de un espesor grande de

medio, solo son útiles en trabajos especiales.

CAMARAS ASEPTICAS: Las modernas cuentan con aire forzado y filtrado tipo cortina para

evitar la entrada de microorganismos, malos olores y agentes contaminantes con el propósito

de disminuir las contaminaciones de los medios de cultivo y el cultivo de agentes

fitopatógenos en el laboratorio.

PRACTICA 2- MEDIOS DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO DE HONGOS Y BACTERIAS

MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivos son mezclas de sustancias nutritivas que se utilizan para el aislamiento, determinación, desarrollo, reproducción y diagnóstico de aquellos organismos productores de enfermedades en las plantas, que se comportan como parásitos facultativos. CARACTERISTICAS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Nutrientes: en el medio de cultivo, deberán estar presentes elementos nutricionales tales como fuentes de carbono, nitrógenos, macro elementos (P, K, Mg, Ca), micro elementos (Fe, Zn Mn, Cu, Mo), vitaminas, etc. Humedad: Deberá proporcionarse una humedad relativa favorable a los fitopatógenos que se desee cultivar, generalmente requieren de 50% o más. Temperatura: Los valores óptimos de éstas son muy variables para cada especie, pero la mayoría de ellos pueden crecer en un rango de 10 a 25º C. Este es un factor determinante para el desarrollo y reproducción. pH: También

en este caso, los valores óptimos son muy variables, pero en general los hongos fitopatógenos se desarrollan y reproducen mejor en pH ligeramente ácido, mientras que las bacteria en uno alcalino. Luz: Este factor afecta en algunos casos la reproducción de los fitopatógenos, pero en general no influye. Asepsia: Los medios de cultivo deben esterilizarse y mantenerse a salvo de cualquier Contaminación. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo pueden ordenarse de acuerdo a su composición o a su Consistencia, quedando de la siguiente manera: 1.- COMPOSICIÓN 1.1. Medios sintéticos: Son aquellos medios de cultivo en los que se conoce exactamente la composición de cada uno de sus componentes, por ejemplo: AgarÇ Czapek. 1.2. Medios complejos o semisintéticos: En estos la composición de uno de los componentes no se conoce de manera exacta, o bien se componen de sustancias naturales y sustancias sintéticas, por ejemplo: harina de maíz-agar. 1.3. Medios de cultivos naturales: Se forman a partir de material vegetal natural, por ejemplo: tejidos vegetales, frutos, vainas, tubérculos, raíces, etc. 2. CONSISTENCIA 2.1 Medios sólidos. Contienen esencialmente agar. (2-3 %) gelatina (10-15 %) albumina etc., materiales que al enfriarse quedan completamente sólidos. Muy empleados para el aislamiento y la reproducción de hongos y bacterias. 2.2 Medios semisólidos. Contienen bajas proporciones de agar y gelatina, mezclados o separados; al enfriarse permanecen en estado coloidal. Se emplean para mantener cultivos por largo tiempo. 2.3 Medios líquidos: Son preparados sin agar, gelatina u otras sustancias solidificantes, por lo que permanecen líquidos aún al enfriarse, se emplean cuando se necesita incrementar el inóculo de hongos o bacterias. 3. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO: Los más utilizados en nuestro laboratorio son:

3.1.- PDA (papa-dextrosa-agar) Para el aislamiento de Hongos y Bacterias 3.2.- AN (agar nutritivo) Para el aislamiento Bacterias 3.3.- AA (agua-agar) Para el aislamiento de Hongos 4. Preparación de un medio de cultivo 4.1 Dosificar: Esta parte consiste en pesar en una balanza los gramos necesarios para la cantidad de platos Petri a utilizar a razón de 20 ml/plato, en PDA; 39 grs. /Lt, en AN, 28 grs. /Lt, en AA, 20 grs. /Lt 4.2 Mezclar: La preparación de la mezcla consiste en depositar los gramos totales a utilizar del medio de cultivo en la mitad del agua destilada a utilizar para efectos de mezcla y posteriormente ser cocinada en el plato caliente o “Hot plate”. 4.3 Cocinado: En el plato caliente se calibra la T° de 500°C y las RPM de 325, el proceso consiste llevar la solución a un proceso de ebullición, por lo que al llegar a la tercera ebullición se le practican dos pruebas, una de grumos que consiste en mover la solución del matraz y verificar si en sus paredes no se observen grumos y la otra prueba es la de transparencia, la cual consiste observar la apariencia transparente de la solución y no con turbidez. 4.4 Autoclavado: Consiste en someter a esterilización el medio de cultivo, el cual esteriliza por

medio de una presión 15 PSI (Libras/Pulg.²) a 121 ° C de T °.

4.5 Vaciado en los platos Petri: Se realiza en la cámara de flujo laminar, con todas las medidas de higiene y limpieza.

PRACTICA 3- DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES Y METODOS DE COLECTA Los síntomas son las manifestaciones visibles de la enfermedad, los signos consisten de las estructuras del cuerpo del patógeno. Los síntomas se agrupan en tres grandes categorías:

TIPOS DE SINTOMAS

Necróticos: Los principales síntomas son necrosis, pudriciones secas ó húmedas, tizones, manchas foliares, antracnosis, cánceres, gomosis, damping off, entre otros. Hipoplásticos: (Enanismos) Los principales síntomas son clorosis, enanismo, mosaico, roseteado, albinismo, entre otros. Hiperplásticos: (Gigantismos) Síntomas comunes son enrollamiento de hojas, agallas, cánceres, entre otros. PASOS PARA DIAGNOSTICAR

Hongos

Bacterias

Virus Nematodos CONSERVACION DE MUESTRAS Muestras secas: En éste caso debe colocarse entre hojas de papel filtro o papel periódico. Muestras frescas: Utilice Cámara húmeda solo en caso de Hongos y demás microorganismos refrigerar a 4°C. Muestras en líquido: Para la conservación de muestras en medio líquido puede usarse: Alcohol etílico al 60% O Formol al 4% y para efectos pedagógicos la solución de Henoff.

Verifique la presencia de signo (esporas o micelio), generalmente los

hongos son los responsables del 48% de las enfermedades el síntoma

principal que causa es el necrótico ósea; necrosis, pudriciones secas ó

húmedas, tizones, manchas foliares, antracnosis, cánceres, gomosis,

damping off, entre otros

Verifique la presencia de signo (exudados bacteriales), En general, los diferentes síntomas pueden agruparse en 6 síndromes: manchas foliares cloróticas o en frutos; chancros y marchitamiento de plantas leñosas; marchitamiento en plantas herbáceas; hiperplasias y proliferación; roñas o costras; y podredumbres blandas.

La presencia de clorosis generalizada (MOSAICOS), Enanismos y roseteado en las hojas jóvenes son los síntomas comunes. Se detectan mediante pruebas Serológicas y análisis moleculares como PCR (Reaccion de en cadena de la polimerasa).

En el caso de nematodos se aprecia un marchitamiento y amarillamiento generalizado y en las raíces la presencia de agallas característicos del genero Meloidogyne sp.

PRACTICA 4- AISLAMIENTO, MONTAJE, OBSERVACION Y REPRODUCCION DE HONGOS FITOPATOGENOS CON FINES DE DIAGNOSTICO.

Montaje de Hongos para efectos de observación: Este proceso se realiza para efectos de observación de las estructuras (esporas, hifas, conidios y micelio), consiste en cosechar las esporas presentes en hojas y fruto, con la ayuda de tape transparente el cual se ubica en el porta objetos al que posteriormente se le agrega una gota de agua y se cubre con el cubreobjetos luego se observa en el microscopio en el objetivo de 4x, 10x y 20x.

AISLAMIENTO DE HONGOS

Realice cortes del material vegetal enfermo, en trocitos de más o menos 5 mm. Los cortes deberán

hacerse cerca de los márgenes de las lesiones de forma tal que contengan tejido sano y enfermo

Después sumérjalos en un plato petri conteniendo NaClO (hipoclorito de Sodio) al 0.5-1 % durante

1 minuto aproximadamente.

El tejido vegetal se esteriliza superficialmente de la siguiente manera: 1 minutos en agua esteril,

Finalmente transfiera de 4 trocitos de tejido desinfectado a un plato petri conteniendo medio de

cultivo PDA, colocándolos en forma equidistante. Y por último sellar y rotular. Por lo que entre 24-

48 Horas se puede observar su crecimiento.

PRACTICA 5-AISLAMIENTO, OBSERVACIÓN Y DIAGNOSTICO

DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

En esta práctica solo se hacen tres actividades: Estriado Bacterial en medio de cultivo AN (Agar Nutriente), Test de Flujo y Microcorrida

Microcorrida: Se utiliza en el caso de manchas foliares. Un pequeño corte de la zona de avance

de la mancha foliar es colocado en un portaobjeto se le agrega una gota de agua y es observado

bajo microscopio. El flujo bacteriano se observa como una pequeña nube descargándose desde

el tejido vegetal.

Test de Flujo: Se utiliza en el caso de bacterias vasculares. Un trozo del tallo supuestamente

atacado por alguna bacteria vascular es cortado y se coloca suspendido en un vaso de agua. En

este caso las bacterias fluyen (se descargan) hacia al agua. Se observa a simple vista.

Preparación de estriados: Como las bacterias se encuentran por millones en el tejido infectado, se

cortan pedazos del mismo de aproximadamente 1 cm², se desinfectan durante 2 minutos en

hipoclorito de sodio al 0.5% o clorox y luego se lavan con agua destilada estéril por 1-2 minutos.

Posteriormente, en un tubo de ensayo con 5 cc de agua estéril se colocan trocitos de tejido infectado

y se dejan por varios minutos (15 - 20) hasta que las bacterias se difundan en el agua, es decir que

se produzca el exudado bacteriano. Para acelerar este proceso se puede agitar el tubo de ensayo.

Luego con una asa estéril o una pipeta pasteur se transfiere una gota de esa solución inicial al medio

de cultivo puro que se encuentra en el plato petri y seguidamente se distribuye la gota sobre la

superficie del medio, haciendo estrías en forma de zigzag de lado a lado del plato petri. Finalmente,

los platos petri se incuban a temperatura ambiente, más o menos 26C ó en incubadora a 27-30C y

se espera el aparecimiento de las colonias entre 48 y 72 horas después.

PRACTICA 6- IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS

En esta práctica se hacen las pruebas quimicas que son: catalasa, KOH 3% y tincion de gram,

para identificar si son bacterias C

Tinción de Gram. Se refiere al hecho de que algunas células después de ser tratadas con un

colorante conservan un color púrpura (Gram positivas), mientras que otras se tornan de color

rojo (Gram negativas). La prueba de crecimiento en condiciones anaeróbicas es utilizada para

la identificación del género Erwinia.

A. Procedimiento para tinción de Gram rápido

1. Frotar con una asa una colonia de bacterias sobre un porta objeto. Acercar la parte inferior de

este a la flama para secar y fijar las bacterias.

2. Colocar con el cristal violeta y mantener el porta objeto en esta solución (A) por 1 minuto.

3. Lavar con agua corriente durante algunos segundos, absorber el exceso de agua con papel

secante.

4. Añadir la preparación con solución (B) (lugol) por 1 minuto.

5. Lavar con agua.

6. Decolorar con alcohol etílico 95% o acetona (solución C) por algunos segundo (20seg.).

7. Lavar con agua abundante.

8. Colorear con safranina (solución D) durante 10 a 15 segundos.

9. Lavar con agua, dejar secar y observar la lámina al microscopio con el objetivo de 100X

utilizando aceite de inmersión.

Las gram (-) se observan color Rojo y las gram (+) color purpura.

Prueba de KOH. Se basa en la resistencia de la pared celular de las bacterias gram

positivas al tratamiento con una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 3%. Para

realizar esta prueba se coloca una gota de KOH y una pequeña masa bacterial y se mezcla.

Si después de 10 segundos se aprecia una masa viscosa es indicativo de una Gram negativa,

si no se observa la viscosidad es una bacteria Gram positiva (Bustamante, 1993).

Prueba de catalasa. La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias

aeróbicas y facultativas anaeróbicas. El peróxido de hidrógeno es uno de los productos

finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el

microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno

de acuerdo a la siguiente reacción:

2H2O2+O2 2H2O2

Catalasa

PRACTICA 7- AISLAMIENTO Y OBSERVACIÓN DE NEMATODOS FITOPARASITOS

CON FINES DE DIAGNOSTICO

METODOS DE EXTRACCION DE NEMATODOS

EMBUDO DE BAERMANN

TÉCNICA TAMIZADO – CENTRIFUGADO

FIJACION DE NEMATODOS EN PLACAS

Nematodo de Vida Libre: No posee estilete y tiene mayor movilidad

Nematodo Fitoparasito: Tiene estilete y su movilidad es más lenta

Hembra: es más grande que el macho, por lo tanto tiene más órganos y su vista es más oscura

al ser vista al microscopio.

Macho: Es transparente al observarse en el microscopio y es pequeño en comparación al

tamaño de la hembra

ANEXOS FOTOS DE ESPORAS Y BACTERIAS VISTAS AL MICROSCOPIO