Estructura  de  membrana,  superficie  celular  y  transporte  de  moléculas  

 

Membranas  celulares:  

Funciones  de  la  membrana  plasmática:  -­‐  Define    la  Identidad  Celular  -­‐  Rodea  y  define  los  límites  de  la  célula  -­‐  Mantiene  la  composición  del  citosol,  que  es  diferente  a  la  del  medio  extracelular,  regulando  el  transporte  de  iones  y  moléculas.  -­‐  A  través  de  sus  proteínas  de  transmembrana  comunica  el  ambiente  externo  con  el  interno  y  esto  repercute  en  las  funciones  y  destino  celulares:  proliferación,  diferenciación,  apoptosis,  migración,  etc.    Funciones  de  las  membranas  internas:  -­‐  Definen  a  los  diferentes  organelos  subcelulares:  núcleo,  retículo  endoplásmico,  Aparato  de  Golgi,  lisosomas,  sistema  endosomal,  peroxisomas,  mitocondrias,  vesículas  de  tráfico  intracelular.    Bicapa  Lipídica:  -­‐  Modelo  de  Bicapa  fue  propuesto  en  1925  por  Gortnery  Grendel  y  en  1935  Davson  y    Danielli,  mediante  estrategias  bioquímicas  sugieren  la  existencia  de  proteínas  a  ambos  lados  de  la  bicapa.  Posterior  a  la  Microscopía  electrónica  se  dilucida  su  estructura.  -­‐Bicapa  de  5  nm  de  espesor.  -­‐  Está  compuesta  por  proteínas  y  lípidos.  Las  proteínas  de  membrana  constituyen  el  30%  de  las  proteínas  totales  de  una  célula  animal.  La  masa  de  la  membrana  está  constituida  de  un  50  %  de  lípidos  -­‐  Los  principales  lípidos  que  componen  la  membrana  son  los  fosfolípidos,  que  incluyen  a  los  fosfoglicéridos  y  a  la  esfingomielina,  el  colesterol  y  los  glicolípidos.    -­‐  Modelo  de  Mosaico  fluido:  Modelo  propuesto  por  Singery  Nicholson(1972).  Considera  que  la  membrana  es  como  un  mosaico  en  el  que  la  bicapa  lipídica  es  la  red,  con  proteínas  embebidas  en  ella.  Tanto  las  proteína  scomo  los  lípidos  pueden  interaccionar  y  desplazarse  lateralmente  dotando  a  la  bicapa  de  fluidez  e  impermeabilidad  a  moléculas  muy  polares.  Grosor  de  la  membrana  es  de  5  nm  

     

 

 

 

 

 

-­‐  Bicapa  compuesta  por  proteínas  y  lípidos  -­‐  No  hay  triglicéridos  en  la  membrana  plasmática  -­‐  Glicolípidos:  importantes  para  la  membrana  de  las  neuronas  mielínicas  -­‐  Esfingomielina:  Lípido  que  interacciona  muy  bien  con  el  colesterol  -­‐  RE:  ocurre  la  síntesis  del  colesterol,  aunque  él  tiene  poco  colesterol  en  sí,  ya  que  una  vez  que  se  forma,  se  libera  de  inmediato  -­‐  Membrana  plasmática  es  la  que  más  colesterol  tiene.  

 

Fosfolípidos:  -­‐  Tienen  2  cadenas  de  ácidos  grasos:  uno  saturado  y  otro  insaturado  (tiene  un  doble  enlace  en  conformación  cis),  el  cual  le  da  mayor  flexibilidad  a  la  cadena  -­‐  Hay  un  enlace  fosfodiéster  -­‐  5  tipos  de  fosfolípidos:      Fosfatidil  etanolamida      Fosfatidil  serina:  Está  generalmente  hacia  adentro  de  la  célula,  rol  importante  cuando  funciona          como  mensajero.  Cuando  la  célula  hará  apoptosis,  la  fosfatilserina  se  expone  hacia  afuera  para        informarle  de  su  estado  a  las  células  vecinas.      Fosfatidil  colina:  Fosfolípido  más  abundante  de  la  membrana  plasmática      Esfingomielina      Esfingosina:  Tiene  un  alcohol  y  un  grupo  amino.  Es  la  base  de  la  esfingomielina  

-­‐  Flippasas:  Con  un  gasto  energético,  translocan  el  Fosfolípido  hacia  la  cara  interna.  Son  proteínas  de  membrana  (insertas  o  periféricas)  

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Proteínas  glicosiladas  y  lípidos  unidos  a  azúcares,  están  expuestos  hacia  el  exterior  de  la  célula.  -­‐  La  estructura  de  la  bicapa  tiende  a  cerrarse  sobre  sí  misma,  formando  un  compartimiento      

 

 

 

 

 

 

-­‐  Los  lípidos  espontáneamente  forman  micelas  o  bipacas,  dependiendo  de  su  forma  -­‐  Los  lípidos  presentan  movilidad  en  la  bicapa:  rotación,  flexión,  y  flip  flop      

 

 

   

 

Características  de  la  bicapa  lipídica: 1.  La  Fluidez  de  la  Bicapa  depende  de  su  composición  y  de  la  temperatura:  La  temperatura  de  Transición  de  Fase  (paso  de  estado  gel  a  fluído)  depende  del  largo  de  las  cadenas  hidrocarbonadas  y  de  la  presencia  de  dobles  enlaces.   -­‐  A  mayor  número  de  dobles  enlaces,  menos  compacta  es  la  bicapa  y  así,  se    mantiene  el  estado  fluído  a  bajas  T°.  -­‐  La  fluidez  de  la  bicapa  depende  de  su  composición,  cuando  el  dominio  está  muy  ordenado  o  compacto  hay  menor  fluidez,  si  se  agregan  dobles  enlaces  en  las  cadenas  de  fosfolípidos,  se  hará  más  desordenado  y  con  mayor  fluidez.  

 

Colesterol:    -­‐  El  colesterol  es  un  esterol,  constituido  por  un  anillo  rígido  y  un  grupo  polar  (hidroxilo)  y  una  corta  cadena  no  polar.  -­‐    contenido  de  colesterol  de  la  Membrana  Plasmática  es  el  más  alto,  y  puede  constituir  el  20-­‐25  %  de  los  lípidos  totales.  

El  colesterol  modula  las  propiedades  de  las  bicapas  lipídicas:  -­‐Aumenta  el  empaquetamiento  de  los  de  lípidos  en  la  bicapa,  pero  no  disminuye  la  fluidez  de  la  membrana.  -­‐  Aumenta  las  propiedades  de  barrera  de  de  permeabilidad  de  la  membrana:  su  grupo  OH  interacciona  con  las  cabezas  polares  de  los  fosfolípidos  y  su  anillo  rígido  y  plano  interacciona  e  inmoviliza  parcialmente  las  regiones  de  cadenas  hidrocarbonadas  más  cercanas  a  las  cabezas  polares.  Esto  lleva  a  que  la  membrana  sea  menos  deformable  y  menos  permeable  a  moléculas  pequeñas  solubles  en  agua.  -­‐A  las  altas  concentraciones,  en  que  se  encuentra  en  la  membrana  plasmática,  el  colesterol  

también  impide  la  cristalización  de  la  de  la  membrana,  al  impedir  que  las  cadenas  hidrocarbonadas  se  acerquen  demasiado.    

 

 

 

 

 

Efectos  del  colesterol  en  la  organización  lipídica  de  la  membrana  plasmática:  -­‐  Aunque  de  alguna  forma  “ordena”  la  membrana  y  controla  la  permeabilidad  (al  llenar  espacios),  al  mismo  tiempo  la  membrana  se  mantiene  en  estado  de  líquido  y  fluido.  -­‐  Colesterol  interactúa  con  glicoesfingolípidos  y  ciertas  proteínas  en  la  hemicapa  externa  de  la  membrana  plasmática.  Estos  “micro  dominios”  se  pueden  aislar  bioquímicamente  por  sus  propiedades  de  “insolubilidad  en  detergentes  no  iónicos  a  4  °C,  denominados  “balsas  lipídicas”,    que  corresponderían  a  dominios  de  membrana,  ricos  en  colesterol  y  esfingomielina,  donde  se  concentra  la  maquinaria  de  señalización  celular.      Balsas  lipídicas:  -­‐  Las  Balsas  lipídicas  (Lipid  rafts)  están  constituidas  principalmente  por  colesterol  y  glicoesfingolípidos.  

-­‐Estas  zonas  de  membrana  tienen  mayor  espesor  que  el  resto  de  la  membrana.    -­‐Dominios  de  membrana:  zonas  de  la  membrana  con  características  especiales,  en  función  de  las  proteínas  que  se  ubican  en  ellos.  -­‐  Ciertas  proteínas  se  enriquecen  en  estos  dominios  al  tener  más  afinidad  por  los  lípidos  y  tener  tendencia  a  agregarse  y/o  formar  complejos:  Proteínas  que  se  asocian  a  estos  dominios:    -­‐Ancladas  a  la  membrana  por  un  tallo  lipídico,  de  fosfatidil  inositol.  -­‐Proteínas  de  transmembrana,  con  mayor  afinidad  por  los  lípidos  de  las  balsas.    Funciones:  Concentrar  maquinaria  de  señalización  celular;  Participan  en  la  generación  de  asimetría  de  la  membrana  plasmática  en  células  con  fenotipo  polarizado.  Rutas  de  internalización  al  intracelular,  algunas  utilizadas  por  Virus  (HIV,  SV40)  y  Toxinas  (Cólera,  Shiga)  para  entrar  a  la  célula.    -­‐  Aislamiento  de  balsas  lipídicas  desde  gradientes  de  sacarosa:  Western  Blot,  técnica  para  ver  qué  células  se  asocian  a  cada  dominio,  la  muestra  se  transfiere  por  un  gel  de  poliacrilamida.  Se  usa  un  anticuerpo  para  detectar  la  proteína  o  receptor,  se  obtendrá  un  bandeo.  -­‐  Las  Balsas  se  definen  bioquímicamente  como  Membranas  resistentes  a  detergente  sno-­‐iónicos  a  4  °C  y  que  “flotan”  en  una  gradiente  de  densidad  (por  ejemplo  de  sacarosa). En  estos  dominios  se  concentran,  por  ejemplo,  proteínas  con  funciones  de  señalización.  (Ejemplo  Receptor  de  ApoE  y  su  Ligando  Reelina  en  neuronas)  

-­‐  Colesterol  se  inserta    entre  los  fosfolípidos,  interactuando  su  OH  con  las  cabezas  polares  del  fosfolípido,  hace  que  la  membrana  sea  más  impermeable  a  moléculas  polares,  impide  que  se  forme  un  gel  -­‐   También   interactúa   con   los   glicoesfingolípidos   que   se   exponen  hacia  afuera.  

La  membrana  plasmática  es  asimétrica   _    La  propiedad  de  asimetría  es  importante  funcionalmente  -­‐  Hemicapa  interna:  Se  encuentran  Fosfatidil  serina  FS  (carga  neta  negativa,  marca  células  apoptóticas)  ,  Fosfatidil  etanolamina  (FE),  Fosfatidil  inositol  (señalización)  -­‐  Hemicapa  externa:  Fosfatidil  colina  y  esfingomielina.  Glicolípidos(en  azul).    -­‐  La  asimetría  se  produce  en  la  Membrana  Plasmática  por  acción  de  enzimas  con  actividad  de  Flipasas,  y  con  gasto  de  ATP,  mueven  FS  y  FE  desde  la  cara  extracelular  hacia  el  interior,  generando  la  asimetría  de  composición  y  carga  de  la  membrana  plasmática.  -­‐  Señal  de  célula  en  Apoptosis:  Se  expone  FS  al  extracelular  y  esto  hace  que  la  célula  sea  eliminada  por  macrófagos  mediante  fagocitosis    -­‐  Fosfatidil  inositol:  Hay  enzimas  fosfatidil  inositol  quinasas,  que  le  agregan  fosfatos  a  los  lípidos  en  diferentes  posiciones,  generando  distintos  tipos  de  fosfaditil  inositol.  El  tipo  4,5  fosfatidil  inositol  se  encuentra  en  la  membrana  y  es  importante  en  la  señalización  de  todos  los  sistemas.                      Glicolípidos:    -­‐  se  encuentran  en  la  hemicapa  externa  de  la  Membrana  Plasmática.    -­‐  En  células  animales  se  derivan  de  la  esfingosina,  como  la  esfingomielina.    -­‐  Se  asocian  entre  si  y  además  están  enriquecidas  en  las  Balsas  Lipídicas.    -­‐  La  adición  de  moléculas  de  azúcar,  ocurre  durante  su  biosíntesis  en  el  lúmen  del  Aparato  de  Golgi.    -­‐  Constituyen  alrededor  del  5%  de  lípidos  de  la  monocapa  externa.    Funciones:  (de  la  membrana  plasmática  al  poseer  glicolípidos)  1.  Protección  celular  de  condiciones  extremas  del  medio  externo  (pH,  sales  biliares,  enzimas  degradativas)  2.  En  Sistema  Nervioso,  los  gangliósidos  son  abundantes  y  modifican  las  propiedades  eléctricas  de  la  membrana  3.  Son  señales  de  reconocimiento  celular  4.  Algunos  glicolípidos  pueden  ser  receptores  de  toxinas  (ejemplo  la  toxina  del  cólera)  *Glicolípidos  y  glicoproteínas  se  exponen  hacia  el  medio  extracelular  

 

Proteínas  de  membrana  -­‐  Son  anfipáticas,  con  regiones  hidrofóbicas  e  hidrofílicas  

-­‐  Las  proteínas  periféricas  se  pueden  disociar    si  existe  un  cambio  drástico  de  pH,  las  integrales  no  -­‐  Reacción  de  palmitoilación:  es  un  tipo  de  asociación  covalente  con  lípidos  que  permite  que  la  proteína  se  una  de  manera  más  fuerte  con  la  membrana  -­‐  Otras  proteínas  se  anclan  a  la  membrana  por  medio  de  un  tallo  de  glicofosfatidil  inositol  (proteína  es  cortada  por  una  peptidasa  y  se  le  agrega  el  glicofosfatidil  inositol  que  la  ancla  a  la  membrana  exponiéndose  hacia  afuera)  -­‐En  la  mayor  parte  de  las  proteínas  de  transmembrana,  la  cadena  que  cruza  la  bicapa  lo  hace  en  una  conformación  de  Alfa-­‐helicoidal,  en  la  cual  los  enlaces  peptídicos  forman  puentes  de  hidrogeno  entre  sí,  de  manera  de  estabilizarse  en  un  ambiente  hidrofóbico.  -­‐La  cadena  de  transmembrana  puede  ser  única,  o  existir  varias  cadenas  (4,  7,  12  por  ejemplo)  que  crucen  la  membrana.  -­‐Los  aminoácidos  característicos  de  una  alfa-­‐hélice  contienen  grupos  funcionales  no  polares.    -­‐El  largo  necesario  y  suficiente  de  la  alfa-­‐hélice  que  cruza  la  membrana  es  de  20  a  30  aminoácidos.  

-­‐  Acuaporina:  canal  de  agua  constituido  por  4  subunidades,  cada  una  con  una  alfa-­‐hélice  -­‐  Algunas  proteínas  de  membrana  (mitocondrial,  cloroplastos  o  presentes  en  bacterias)  forman  estructuras  de  Barril,  con  hojas  Beta.  Forman  las  llamadas  “Porinas”.  -­‐La  mayor  parte  de  las  proteínas  de  membrana  en  células  eucariones  son  glicosiladas.  -­‐  Las  Glicoproteínas,  forman  junto  con  los  glicolípidos  y  los  proteoglicanes,  el  llamado  “glicocalix”,  en  la  superficie  celular,  que  cumple  funciones  de  protección  ante  daño  mecánico  o  químico.    Características  de  las  proteínas  de  membrana:  Solubilización  -­‐Las  proteínas  de  de  membrana  pueden  ser  solubilizadas  y      purificadas  con  detergentes  suaves,  y  mantener  su  actividad    -­‐  A  bajas  concentraciones  de  detergente  están  como  monómeros,  a  mayores  cantidades  forman  micelas  -­‐  CMC:  concentración  micelar  crítica  (se  debe  buscar  en  condiciones  fisiológicas  de  T°,  pH,  etc.)          

Características  de  las  proteínas  de  membrana:  Difusión  Experimentos  que  probaron  que  las  proteínas  de  la  membrana  pueden  difundir  o  moverse  alrededor  de  ella:  1.  Se  fusionaron  2  células  (una  de  un  ratón  y  otra  de  un  humano),se  forma  un  heterocarión,  se  agregaron  anticuerpos  y  se  observó  al  microscopio  y  se  vio  que  las  proteínas  marcadas  con  los  anticuerpos  habían  cambiado  de  lugar.  2.  Marcación  con  fluorescencia  de  las  proteínas  de  membrana    También  existe  una  difusión  limitada  de  las  proteínas  de  membrana:  

1. Mantención  del  fenotipo  polarizado  à  en  la  cara  basolateral  hay  proteínas  de  homeostasis  y  de  interacción  célula-­‐célula  /  en  la  cara  apical  hay  proteínas  de  transporte  

2. Difusión  limitada  también  se  asocia  a  la  presencia  de  un  citoesqueleto  cortical  que  genera  movimientos  restringidos  de  las  proteínas  de  la  membrana  plasmática.  

   

 

 

 

 

Transporte  de  moléculas  pequeñas  a  través  de  la  membrana    

-­‐  La  bicapa  lipídica  tiene  una  permeabilidad  relativa  a  diferentes  solutos  -­‐  Gradiente  electroquímico:  Combinación  del  potencial  de  membrana  y  la  diferencia  de  concentración  de  solutos  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Las  cargas  negativas  dentro  de  las  células  son  mayores.  

Canales  y  transportadores:  Componentes  proteicos  que  ayudan  al  transporte  de  solutos  y  iones  a  través  de  la  membrana  plasmática  -­‐  Los  canales  transportan  más  rápidamente  (menor  afinidad  por  el  soluto)  y  siempre  participan  en  difusión  facilitada  o  transporte  pasivo  (a  favor  de  la  gradiente  electroquímica)  -­‐  Los  transportadores  mediante  cambios  conformacionales  transportan  solutos  a  favor  o  en  contra  del  gradiente  electroquímico.    Tipos  de  transporte:    

 

 

 

 

 

Modelo  simple  de  transporte  pasivo,  mediado  por  transportador:  

 

Diferencias  cinéticas  entre  transporte  pasivo  facilitado  y  difusión  simple:  

 

 

 

 

 

 

Fuentes  de  energía  en  el  transporte  activo  

 

 

-­‐  El  transportador  se  mueve  espontánea  y  reversiblemente  entre  el  estado  A  y  B.    -­‐  El  sentido  del  transporte  dependerá  de  la  disponibilidad  del  soluto  por  el  cual  presenta  afinidad.  

-­‐  Simple:  No  saturable,  la  velocidad  del  transporte  es  directamente  proporcional    a  la  concentración  del  soluto.    -­‐  Facilitada:  Es  saturable  (número  finito  de  sitios  de  unión)  y  refleja  la  Vmáx  de  transporte,  la  cual  depende  de  la  rapidez  del  cambio  conformacional.  Km  refleja  la  afinidad  del  transportador  por  el  soluto.  

1.  Utilizar  la  energía  libre  liberada  por  transporte  de  un  soluto,   a   favor   de   gradiente,   para   cotransportar   otro  soluto,  en  contra  de  su  gradiente  electroquímica.  Si  el  transporte   es   en   el   mismo   sentido   se   habla   de   Co  transportador   (ejemplo   Transportador   de  Na+/Fosfato).   Si   es   sentido   contrario:   Intercambiador  (ejemplo,  Intercambiador  de  Na  +/H+,  NHE+/NHE).  2.   Para   mover   uno   o   más   solutos   en   contra   de   su  gradiente,   se   puede   utilizar   la   energía   de   la   hidrólisis  de   ATP   (Bombas).   Ejemplos,   Protón   ATPasa,   Na   +/K+  ATPasa.    3.   Bombas   activadas   por   luz   (presentes   en   ciertas  

Ejemplo:  Transporte  de  glucosa  facilitado  por  la  gradiente  de  Na+  

 

La  unión  de  ambos  sustratos  es  cooperativa  .  La  unión  del  Na+  en  el  extracelular  estimula  la  unión,  de  la  glucosa  al  transportador  ,  con  mayor  afinidad.  Esto  permite  transportar  glucosa  en  contra  de  la  gradiente  de  concentración.  También  se  utiliza  este  sistema  en  el  transporte  de  aminoácidos.  Estos  mecanismos  de  transporte,  mediados  por  la  gradiente  de  Na+  operan  en  la  membrana  plasmática.  La  diferencia  de  concentración  del  Na+  depende  de  la  actividad  de  la  Na+/K+  ATPasa(Bomba).        Los  transportadores  en  la  Membrana  plasmática  regulan  el  pH  citosólico    

  Uso  de  la  gradiente  de  Na+  para  bombear  H+  (generados  intracelularmente  o  que  entran  desde  afuera):  1.-­‐Intercambiador  de  Na+/H+  (NHE)varias  formas  (NHE1-­‐8).    2.-­‐Intercambiador  de  Cl-­‐/HCO3-­‐,  acoplado  a  la  entrada  de  Na+  y  salida  de  H+  (NaHCO3entra-­‐HCL  sale).    Intercambiador  de  Cl-­‐/HCO3-­‐independiente  de  Na+:    La  actividad  se  regula  por  el  pH  intracelular.    –Al  alcalinizarse  el  citosol,  y  sale  HCO3  a  favor  de  su  gradiente  de  concentración.  Ejemplo:  Banda  3,  en  la  membrana  del  glóbulo  rojo  (facilita  salida  de  CO2,  como  HCO3-­‐  al  pasar  la  sangre  por  los  capilares  pulmonares).    También  regulan  pH  pero  no  son  transportadores:  Bombas  de  H+:  Funcionan  gastando  ATP  para  transportar  H+  en  contra  de  su  gradiente.  Se  localizan  preferentemente  en  organelos  intracelulares  (acidifican  el  contenido  luminal).  

-­‐ El  transporte  transcelular  de  solutos  está  determinado  por  la  existencia  de  epitelios  polarizados,  con  asimetría  en  la  distribución  de  transportadores  y  canales.    

 

Transporte  activo  mediado  por  bombas  acopladas  a  la  hidrólisis  de  ATP    

 

 

 

Tipo  P:  Se  autofosforilanen  el  proceso  de  transporte.  Mantienen  gradientes  iónicos  en  la  membrana  celular  (especialmente  de  Na+,  H+,  K+  y  Ca2+)  Tipo  F:  Compuestas  de  varias  subunidades.  Sintetizan  ATP  utilizando  la  gradiente  de  H+  que  se  genera  en  la  membrana  plasmática  en  bacterias,  membrana  interna  de  mitocondrias,  y  cloroplastos.  También  se  llaman  “ATP  sintetasas”  (Relacionadas  estructuralmente  las  ATPasa  stipo  V,  que  bombean  H+  y  gastan  ATP)    Transportadores  ABC:  Tienen  12  segmentos  de  transmembrana.  Bombean  distintas  moléculas,  pequeñas.  Funcionan  como  canales  y  transportadores,  por  cada  transportador  ABC  se  hidrolizan  2  ATP.    -­‐  Bombas  transportan  en  contra  de  la  gradiente  de  concentración  -­‐  Iones  siempre  están  hidratados  

Ejemplos  de  bombas  tipo  P,  que  utilizan  ATP  y  se  fosforilan  Bomba  de  Calcio  del  Retículo  Sarcoplásmico  à  Función:  mantener  la  concentración  de  Calcio  citosólico    10-­‐7M,    bombea  Ca+2  al  lumen  del  Retículo  Sarcoplasmático  posterior  a  la  contracción  muscular.  Constituye  el  90%  de  las  proteínas  de  membrana  del  Retículo.    

Bomba Na+/K+ con actividad ATPasa -­‐  Mantiene  las  diferencias  de  concentración  de  K+  (10  a  30  veces  más  en  el  intracelular)  y  Na+  (10  veces  más  en  el  extracelular)  con  un  gasto  de  energía  que  constituye  1/3  del  total  celular  -­‐  Normalmente  en  la  célula  hay  más  sodio  afuera  y  más  potasio  dentro,  esta  bomba  hace  que  salgan  3  Na+  y  entren  2  K+  (generando  una  diferencia  de  potencial  negativo  dentro  de  la  célula)  -­‐  Es  electrogénica,  aportando  el  10%  del  potencial  de  membrana  (saca  3  Na+  y  entran  2  K+)  -­‐  Contribuye  a  mantener  la  osmolaridad  celular  ,  al  mantener  alta  concentración  de  Na+  y  Cl-­‐  afuera  de  la  célula  e  impedir  una  mayor  entrada  de  agua  por  los  canales  (acuaporinas)  *Ouabaína  à  es  un  inhibidor  de  la  bomba    

 

 

 

   

Transportadores  ABC:  (ATP  binding  casette)  -­‐  Transportadores  formados  por  2  dominios  hidrofóbicos  cada  uno  con:  6  segmentos  de  transmembrana,  1  dominio  de  unión  a  ATP  por  el  lado  citosólico,  hidrolizan  1ATP  en  el  proceso  de  transporte  de  moléculas.    *  Papel  del  Transportador  ABCA1  en  la  generación  de  lipoproteínas  de  alta  densidad  HDL  à  Mutaciones  en  el  gen  abca1,  causan  la  Enfermedad  de  Tangier  ,  (autosómica  recesiva)  caracterizada  por:  -­‐  Deficiencia  de  HDL  -­‐  Acumulación  de  colesterol  en  macrófagos  tisulares  -­‐  Arteriosclerosis    CFTR:  Proteína  ABC  con  función  de  canal  iónico,  es  un  regulador  de  transmembrana  de  la  fibrosis  quística,  cuando  muta  se  produce  la  enfermedad  -­‐  Glicoproteína  de  1480  aa  y  12  segmentos  de  transmembrana  La  fosforilación  regulada  del  dominio  “R”,  que  no  está  en  otras  proteínas  ABC,  determina  la  apertura  del  canal  de  Cl-­‐.      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐Fibrosis   quística:   Enfermedad  hereditaria   autosómica   recesiva,   en  donde  se  afecta  el  gen  CFTR,  se  deben  tener   ambas   copias   del   gen   mutado  -­‐  La  mayoría  de  las  mutaciones  produce  proteínas  truncas  no  funcionales  o  que  no   llegan   a   la   membrana.    

Canales  y  Propiedades  Eléctricas  

Las  proteínas  de  canal,  a  diferencia  de  los  transportadores,  forman  poros  abiertos  que  permiten  el  paso  de  moléculas  pequeñas  y  de  carga  apropiada  a  través  de  la  membrana  lipídica.  Las  porinas  son  canales  mucho  mas  grandes  que,  a  diferencia  de  la  estructura  en  α-­‐hélice  que  adoptan  los  canales,  se  conformará  en  un  barril  β-­‐plegada  que  será  menos  permeable  y  regulado  que  los  canales.  

Canales  iónicos:  son  aquellos  que  intervienen  en  el  tránsito  de  iones  a  través  de  las  membranas  de  todas  las  células.  Algunas  propiedades  muy  importantes  para  su  función  es  que  1)  el  transporte  a  través  de  estos  canales  es  extremadamente  rápido,  2)  son  altamente  selectivos  debido  a  su  estrecho  poro  y  3)  la  mayoría  de  estos  canales  no  se  encuentran  permanentemente  abiertos.  No  necesariamente  se  encuentran  abiertos  durante  todo  el  tiempo  que  exista  un  estímulo.  

 

Tipos  de  activación  de  canales  iónicos  

Activación  por  ligando    

Corresponde  a  una  señal  química  que  puede  provenir  del  medio  intracelular  o  extracelular,  y  que  produce  un  cambio  de  conformación  al  canal,  accediendo  a  su  apertura.  

 

El  receptor  nicotínico  de  la  acetilcolina  es  el  canal  activado  por  ligando  más  conocido  y  estudiado.  Está  compuesto  por  5  subunidades  y  puede  responder  con  la  nicotina  y  la  acetilcolina.  

 La  diferencia  con  la  nicotina  es,  que  ésta  puede  ser  administrada  a  voluntad  por  el  sistema  nervioso.  En  cambio,  la  nicotina  es  difícil  de  excretar  y,  por  lo  tanto,  permanece  mucho  tiempo  en  la  sangre,  mantiene  abierto  el  canal  por  más  tiempo  del  normal.  Debido  a  esto,  se  ve  alterado  el  “circuito  normal  del  placer”  que  posteriormente  generará  adicción    

Activación  mecánica    

Estos  tipos  de  canales  necesitan  de  una  señal  mecánica  para  activarse,  que  generalmente  es  estrés.    

El  ejemplo  más  claro  es  un  canal    iónico  que  se  encuentra  en  el  sistema  auditivo.  Las  esterocilias,  corresponden  a  prolongaciones  en  la  cóclea  que  en  ausencia  de  sonido  está  en  reposo.  Ante  el  estímulo  del  sonido,  las  membranas  se  comienzan  a  mover  y  se  abren  los  canales  para  el  flujo  de  iones,  que  desencadenarán  una  respuesta.  

 

Activación  Dependiente  del  voltaje    

Este  tipo  consiste  en  la  apertura  de  canales  en  respuesta  a  variaciones  en  el  potencial  eléctrico  a  través  de  la  membrana  plasmática.  

Hacia  ambos  lados  de  la  membrana  existen  cargas,  siendo  el  medio  extracelular  más  positivo  y  el  intracelular  más  negativo.  Cuando  esta  diferencia  de  carga  cambia,  la  proteína  actúa  como  un  sensor  de  voltaje,  pues  posee  aminoácidos  cargados  de  cierta  forma  que  detectan  el  voltaje  de  la  membrana  según  las  leyes  de  atracción  y  repulsión  por  afinidad  de  cargas.  

 

Estructuralmente,  puede  corresponder  a  una  sola  cadena  polipeptídica  que  se  enrolla  sobre  si  misma  y  que  forma  varios  dominios  transmembrana  o  estar  compuestos  por  un  tetrámero  de  varios  polipéptidos.  

 

Los  canales  compuestos  por  una  sola  cadena  polipeltídica,  generalmente  poseen  6  subunidades  en  transmembrana,  

siendo  la  cuarta  la  que  cumplirá  una  función  sensor  de  voltaje.  

 

 

 

Lo  que  determinará  la  selectividad  del  canal  será    

1)  el  tamaño  del  poro,  que  va  disminuyendo  a  medida  que  entramos  en  el  canal  

 2)  las  cargas  en  la  boca  y  pared  del  canal  que  repelerá  a  todo  ion  inadecuado  que  quisiera  ingresar  al  canal.  Por  ejemplo,  el  canal  de  K+  posee  grupos  carbonilo  en  su  pared  que  impedirá  que  el  potasio  se  vea  repelido.  Y  por  último    

3)  su  capa  de  hidratación.  

La  capa  de  hidratación  es  una  propiedad  que  depende  de  la  relación  caga/masa  y,  por  lo  tanto,  para  un  mismo  grupo  de  la  tabla  periódica,  mientras  más  pequeña  sea  la  masa,  el  ion  poseerá  más  capas  de  hidratación.  Perder  esta  capa  es  energéticamente  desfavorable,  por  lo  que  para  cada  canal  específico  existen  iones  que  perderán  estas  capas  de  forma  energéticamente  favorable,  quedando  desnudos  y  listos  para  insertarse  en  el  sitio  de  unión  del  canal.  

La  gradiente  electroquímica  del  ion  provocará  que  sea  imposible  para  él  mantenerse  por  un  largo  tiempo  en  el  canal,  pues  se  verá  presionado  por  las  demás  partículas  que  constantemente  están  entrando  al  canal.  Al  momento  de  salir  del  canal,  vuelve  a  adquirir  las  capas  de  hidratación.  

Para  estudiar  el  potencial  de  membrana  se  utiliza  la  electrofisiología,  que  permite  calcular  la  diferencia  de  voltaje  dentro  y  fuera  de  una  célula  de  interés  mediante  la  inserción  de  microelectrodos.  

 

La  Técnica  del  Patch  –  Clamp  se  utiliza  para  estudiar  canales  iónicos,  y  consiste  en  aplicar  presión  positiva  a  un  cilindro  de  vidrio  (microelectrodo)  a  medida  que  nos  acercamos  a  la  membrana  de  una  célula.  Al  posicionarnos  sobre  la  membra,  se  elimina  la  presión  ejercida  y  se  cambia  por  una  negativa,  de  manera  de  producir  un  sello.  Posteriormente,  se  retira  este  electrodo  con  el  segmento  de  membrana  celular  que  contendrá  los  canales  iónicos  que  se  estudiarán.    

Éstos  canales  podrán  ser  manipulados  y  sometidos  a  condiciones  deseadas  para  descubrir,  por  ejemplo,  la  cantidad  de  corriente  que  pasa  a  través  del  tiempo  y  ser  llevados  a  gráficos  que  muestren  el  paso  de  esta  corriente  para  saber  cuando  se  encuentra  abierto  o  cerrado.  

 

Estado  inactivo  del  canal  

Depende  del  dominio  de  inactivación  del  canal  (partícula  de  inactivación),  que  reconoce  cuando  el  canal  ha  estado  abierto  por  mucho  tiempo.  Consiste  en  un  bloqueo  físico  denominado  “modelo  de  bola  y  cadena”,  donde  la  partícula  se  inserta  en  la  boca  del  canal  para  impedir  que  continúe  el  flujo  de  iones.  

 

Gradiente  electroquímica:    gradiente  eléctrica  +  gradiente  química  

Todas  las  células  son  capaces  de  generar  gradientes  electroquímicas  por  bombas  electrogénicas  (de  transporte  activo,  como  la  bomba  Na+  -­‐  K+  ATPasa)  y  difusión  pasiva  de  

iones  a  través  de  la  membrana.  Cuando  están  en  sentido  opuesto,  como  en  el  canal  de  K+,  actúan  como  fuerzas  opuestas  que  compiten  entre  sí.  Estas  fuerzas  llegarán  a  un  punto  donde  el  movimiento  de  potasio  será  nulo  y  se  alcanzará  un  estado  de  equilibrio  que  se  conoce  como  potencial  de  membrana  en  reposo.  

El  canal  de  K+  se  caracteriza  por  abrirse  con  facilidad,  pero  cerrarse  de  manera  muy  lenta  (estos  canales  se  conocen  como  canal  de  fuga),  por  lo  que  siempre  hay  un  flujo  de  potasio  a  través  de  la  membrana,  a  diferencia  de  los  canales  de  Ca2+,  Na+  y  Cl-­‐.  La  permeabilidad  mucho  mayor  al  K+  hace  que  éste  sea  el  principal  componente  en  la  medición  del  potencial  de  membrana  en  reposo  (diferencial  de  carga  del  ion  potasio  entre  intracelular  y  extracelular).  Es  por  esto  que  al  medir  el  potencial  de  membrana  para  este  ion  se  obtiene  alrededor  de  -­‐75mV,  muy  cercano  a  lo  vivo.    

 

 

 

 

 

 

 

Ecuación  de  Nernst  

Establece  cuantitativamente  la  relación  entre  la  concentración  iónica  y  el  potencial  de  membrana.  Afirma  que  el  potencial  en  equilibrio  de  cualquier  ion  está  dado  por  la  concentración  en  el  extracelular,  respecto  al  intracelular.  

 

También  puede  expresarse  en:    

 

 

 

Ecuación  de  Goldman  

Es  una  modificación  de  la  ecuación  de  Nernst  para  dar  cuenta  de  la  contribución  más  importante  en  el  establecimiento  del  potencial  de  membrana.  

 

El  valor  P  corresponde  a  la  permeabilidad  de  los  iones.  Como  la  permeablidad  del  potasio  es  muy  alta  en  comparación  a  la  del  sodio  y  cloruro  (1:0,04:0,45  respectivamente),  el  potasio  contribuye  mucho  más  al  valor  del  potencial  de  membrana  en  reposo.  

 

La  célula  tiene  la  capacidad  de  cambiar  su  potencial  de  membrana  gracias  a  la  apertura  y  cierre  de  canales.  Un  estímulo  provoca  cambios  en  el  potencial  de  la  membrana:  si  se  hace  más  negativa,  se  dice  que  la  membrana  sufrió  una  hiperpolarización.  En  cambio,  si  el  estímulo  hace  que  el  potencial  de  membrana  se  haga  mas  positivo,  se  habla  de  depolarización.  También,  se  diferencias  los  potenciales  graduados  si  dependen  de  la  intensidad  del  estímulo  para  generar  cambios  de  potencial  o  los  potenciales  independientes  de  la  intensidad  del  estímulo,  que  cuando  alcanzan  el  umbral,  se  desencadenará  la  misma  respuesta  así  y  solo  así.  Se  dice  que  en  este  tipo  de  potenciales,  la  membrana  responde  a  la  ley  del  “todo  o  nada”.  Dentro  de  éste  último,  se  encuentra  el  potencial  de  acción,  que  corresponden  a  señales  eléctricas  conducidas  por  axones.    

 

 

Etapa  de  reposo  canales  de  Na+  cerrados  y  algunos  de  K+  abiertos,  lo  que  genera  una  gradiente  electroquímica  en  una  célula  biológica.    

Depolarización,  permite  la  apertura  de  algunos  canales  de  Na+  en  un  segmento  de  la  membrana.  Si  el  estímulo  es  suficiente  para  alcanzar  el  umbral,  se  pasa  a  una  fase  de  depolarización  donde  se  abren  todos  los  canales  de  Na,  ingresando  a  la  célula  y  cambiando  el  potencial  de  membrana  +30/+40mV.    

Comienzan  a  abrirse  los  canales  de  K+  voltaje  dependientes,  mientras  los  de  sodio  se  inactivan.  Fase  de  repolarización  que  vuelve  a  los  niveles  de  potencial  inicial.    

Producto  de  los  canales  de  fuga  de  K.    se  produce  una  hiperpolarización  a  causa  de  la  salida  masiva  de  K+  ,  hasta  que  se  cierran.    

La  bomba  sodio  –  potasio  ATPasa,  siempre  activa,  restableece  el  potencial  de  reposo.  

El  trozo  de  membrana  depolarizada  provoca  que  el  resto  de  la  membrana  recorra  el  mismo  proceso  descrito  anteriormente.    

 

Hodgkin  y  Huxley  realizaron  experimentos  en  axones  de  calamar  que  los  llevó  a  ganar  el  permio  Nobel  en  1963.  Utilizaron  este  tipo  de  axón  en  particular  debido  a  su  gran  grosor  (1mm)  que  permite  observarlo,  instertarle  electrodos  y  medir  su  variación  del  potencial  de  membrana  durante  la  transmisión  de  un  impulso  nervioso.  Demostraron  que  los  cambios  del  potencial  de  membrana  se  deben  a  la  apertura  y  cierre  de  diferentes  canales  iónicos.  

 

Propagación  del  potencial  de  acción  

 

Existen  dos  tipos  de  fibras  de  neuronas:  mielinizadas  y  no  mielinizadas.  Las  mielinizadas  se  encuentran  fundamentalmente  en  neuronas  motoras.  La  disposición  en  vainas  de  mielina  permite  una  propagación  saltatoria,  ya  que,  gracias  a  ella  la  fibra  consta  de  zonas  aisladas  por  las  vainas  y  zonas  con  canales  iónicos  concentrados  que  permite  la  conducción  saltatoria,  exclusivamente  entre  los  nodos  de  Ranvier  (zonas  entre  vainas  de  mielina  que  poseen  canales  iónicos).  Esta  propiedad  otorga  a  las  fibras  a  que  la  señal  eléctrica  que  se  mueve  se  mantenga  constante  y  protegida  gracias  a  las  vainas  de  mielina.  Diferente  es  en  el  caso  de  axones  desnudos,  como  en  el  del  calamar,  que  gradualmente  va  disminuyendo  la  intensidad  del  impulso  eléctrico.  

La  llegada  de  los  potenciales  de  acción  a  los  terminales  de  la  mayoría  de  las  neuronas  señala  la  liberación  de  neurotransmisores,  que  son  exocitados  en  vesículas  desde  la  neurona  presináptica  y  se  unen  a  receptores  en  la  membrana  de  las  neuronas  postsinápticas,  donde  inducen  la  apertura  de  los  canales  iónicos  regulados  por  voltaje.  Esta  señal  puede  ser  excitatoria  (como  el  flujo  de  sodio)  o  inhibitoria  (como  es  el  flujo  de  ion  cloruro  hacia  el  intracelular,  o  potasio  hacia  el  extracelular).  Una  neurona  recibe  millones  de  sinapsis  al  día.  

 

 

Terminación  de  la  señal  química  

Existen  transportadores  que  toman  el  neurotransmisor  y  lo  vuelven  a  la  neurona  presináptica,  para  su  reutilización.    

El  uso  de  dorgas  afecta  la  comunicación,  pues  actúan  sobre  transportadores  que  afectan  la  fisiología  del  circuito  del  placer,  del  circuito  dopaminérgico  y  serotoninérgico)  

Ejemplos:    

• Cocaína  y  anfetaminas  bloquean  el  transportador  de  dopamina  (asociado  al  placer)  • Éxtasis  bloquea  el  transportador  de  serotonina  (asociado  a  la  conducta)  

 

 

 

 

si  

                                                                                                             Transducción  de  señales  1  

-­‐    Vías  de  comunicación  son  esenciales  para  regular  la  función  celular  a  nivel  sistémico  -­‐    En  el  organismo  hay  104  células  que  deben  comunicarse  entre  sí  para  coordinar  funciones.  -­‐  Diferenciación  à  por  medio  de  señales  las  células  pueden  cambiar  su  fenotipo  -­‐  Como  respuesta  a  una  señal,  cada  célula  dependiendo  de  su  diferenciación,  tiene  efecto  distinto.  -­‐  Un  receptor  tendrá  gran  afinidad  por  su  ligando  mientras  sea  capaz  de  captarlo  a  bajas  concentraciones  y  emitir  una  respuesta  ante  esa  señal.  -­‐  La  mayor  parte  de  la  comunicación  celular  se  debe  a  moléculas  extracelulares  que  están  en  muy  bajas  concentraciones    <10  -­‐8como:  proteínas,  péptidos  pequeños,  aminoácidos,  esteroides,  retinoides,  derivados  de  ácidos  grasos,  gases  en  solución.  

 

 

 

 

 

 

 

   Existen  2  tipos  de  receptores:  1.  Receptores  de  superficie  celular:  Son,  generalmente,  proteínas  de  transmembrana,  y  unen  ligandos  hidrofílicos  2.  Receptores  intracelulares:  pueden  ser  citoplasmáticos  o  nucleares.  Los  ligando  son  moléculas  hidrofóbicas  o  lipofílicos,  como  hormonas  esteroidales,  algunas  proteínas,  sales  biliares,  vitamina  D,  etc)    

 

   

 

 

 

 

-­‐   Proteínas   intracelulares   serán   las   mediadores  entre   el   estímulo   extracelular   (ligando)   y   las  proteínas   efectoras   que   finalmente   generarán  una   respuesta   a   nivel   celular.  -­‐   Los   sistemas   de   comunicación   entre   células  tienen   como   objetivo:   emitir   y   recibir   señales,  diferenciación   celular,   control   de   proliferación,  comportamiento   colaborativo   y   coordinado.    -­‐   Dependiendo   de   la   proteína   efectora   final   se  producirán   diferentes   respuestas   (a   nivel  metabólico,   expresión   genética,   etc.)  -­‐   Las   respuestas   están   compartimentarizadas  dentro  de  la  célula.  

Señalización  de  corto  y  largo  alcance:    -­‐  La  distancia  entre  célula  señalizadora  y  respondedora,  determinan  la  velocidad  de  respuesta.    

1.  Contacto  dependiente  o  interacción  célula-­‐célula:  Común  en  el  sistema  inmune,  ocurre  entre  linfocito  T    y  una  célula  presentadora  de  antígenos  por  medio  de  su  MHC.    Una  célula  expone  un  ligando  a  una  célula  blanco  que  responderá.  2.  Paracrina:  La  célula  secreta  una  molécula  y  ésta  tendrá  efecto  sobre  sus  células  vecinas.  Cuando  la  secreción  es  de  tipo  autocrina,  la  molécula  secretada  autoregulará  a  la  misma  célula  que  la  generó.    3.  Sinapsis:  Potencial  de  acción  viaja  por  el  axón  de  una  neurona,  se  abren  canales  de  Ca+2  y  se  liberan  vesículas  con  el  neurotransmisor.  Son  respuestas  rápidas,  precisas  y  controladas  por  enzimas  que  degradan  neurotransmisores  para  cesar  la  respuesta.  Los  receptores  son  de  menor  afinidad.  La  remoción  de  la  señal  se  hace  por  hidrólisis  o  transportadores.  La  concentración  en  el  espacio  sináptico  es  muy  alta.  10-­‐4  

4.  Vía  hormonal  o  endocrina:  Respuestas  más  bien  lentas,  desde  que  se  secreta  la  hormona  hasta  que  llega  a  la  célula  blanco.  En  este  caso  los  receptores  son  específicos  y  de  alta  afinidad.  Concentración  de  señales  10-­‐8  (pocos).  Un  ejemplo  son  las  hormonas  que  se  producen  en  la  hipófisis  y  tienen  un  efecto  a  nivel  periférico.  Una  célula  puede  responderá  más  de  una  hormona  y  lo  hará  de  acuerdo  al  repertorio  de  proteínas  intracelulares  que  posea.    

 

 

 

 

 

 

 

 

Relación  entre  velocidad,  tipo  de  respuesta  y  la  naturaleza  de  la  respuesta  celular  

-­‐  Señales  Rápidas  (seg,  min):  No  involucran  cambios  en  expresión  génica.  Pueden  ser  cambios  en  la  concentración  de  calcio,  fosforilación  de  proteínas.  No  hay  cambios  en  genes.  Efectos:  Cambios  metabólicos,  cambios  en  la  forma  celular,  secreción,  migración  celular.  -­‐  Señales  Lentas:  Efectos  en  proliferación,  diferenciación.  Cambios  en  Expresión  Génica.  Se  sintetiza  un  nuevo  repertorio  de  proteínas  que  la  hace  diferenciarse  y  expresar  otro  fenotipo.  También  puede  hacer  apoptosis.    

 

 

f  

 

 

 

 

Diferentes  efectos  de  la  acetilcolina,  dependiendo  del  tipo  celular  en  el  que  actúa:  1.  En  corazón:  Tiene  un  receptor  metabotrópico  (muscarínico  en  este  caso),  se  abren  canales  de  K+    

y  éste  sale  de  la  célula,  produciendo  una  hiperpolarización,  lo  que  genera  la  relajación  de  la  célula  cardíaca  y  disminuye  la  frecuencia  cardíaca.  2.    En  músculo  esquelético:  Se  une  a  receptor  ionotrópico  o  nicotpinico  en  este  caso  (es  un  canal)  el  cual  se  abre  y  permite  la  entrada  de  Na+  ,  de  despolariza  la  membrana  y  se  contrae  el  músculo  esquelético.                                3.  En  glándulas  salivales:  Se  une  a  receptor  muscarínico  en  la  glándula  salival,  que  abre  canales  de  Na+  se  despolariza  la  membrana  y  produce  secreción  de  gránulos  que  generan  amilasa.    Sub-­‐tipos  de  receptores  de  superficie  1.  Ionotrópicos:  Es  un  canal,  poro  físico.  Ej:  receptor  de  IP3  (se  abren  canales  de  Ca  en  RE),  Ach  2.  Metabotrópicos:  Acoplados  a  proteína  G  3.  Catalíticos:  Tienen  actividad  quinasa  propia  o  están  acoplados  a  una  actividad  catalítica  (JAK)  

 Morfógenos    -­‐  La  identidad  final  de  algunas  células,  durante  el  desarrollo,  depende  de  su  posición  en  gradientes  de  morfógenos.  -­‐  Algunos  morfógenos:  Shh,  wnts,  BMPs,  FGFs  -­‐  Hay  ligandos  que  dependiendo  de  su  concentración,  generan  respuestas  distintas.  Si  el  ligando  está  cerca  de  su  fuente  de  producción,  la  concentración  es  alta.  Esto  es  lo  que  se  conoce  como  variación  por  posición  en  una  gradiente  de  concentración  de  la  señal.  -­‐  La  concentración  relativa  de  un  ligando,  define  su  respuesta.    -­‐  Actúan  de  manera  importante  durante  el  desarrollo  embrionario,  pero  en  adultos  también  están  presentes  en  nichos  troncales,  como  en  cerebro  e  hígado.  -­‐  Están  involucrados  en  respuestas  de  diferenciación  y  proliferación,  por  lo  que,  cuando  morfógenos  mutan,  se  asocian  a  ciertos  tipos  de  cáncer.  -­‐  La  notocorda  activa  la  placa  del  piso,  genera  Shh,  el  cual    va  cambiando  sus  concentraciones  y  generando  distitnos  tipos  celulares  (glía,  motoneuronas,  etc)      

-­‐  Un  mismo  tipo  de  célula  puede  recibir  distintas  señales,  y  las  distintas   combinaciones  provocan   cambios  distintos  en  ella   (supervivencia,   proliferación,   desarrollo,   apoptosis).  Esto   es   muy   común   en   células   epiteliales.    -­‐  Una  misma  señal  puede  producir  diferentes  respuestas  en  las   distintas   células,   esto   depende   del   repertorio   de  proteínas  intracelulares  que  ella  posea  y  del  receptor.  Esto  ocurre  en  el  caso  de  la  acetilcolina  (Ach  como  ligando).  

 

Señalización  por  gas:  Ligandos  solubles  -­‐  Óxido  nítrico  (NO)  à  NO  se  produce  por  desaminación  de  la  arginina  por  la  Oxido  Nítrico  Sintasa  (NOS)  siendo  la  enzima  eNOS  la  endotelial,  nNOS  la  muscular  y  neuronal  (constitutiva)  y  la  iNOS  inducible  (presente  en  macrófagos).    -­‐  NO  activa  en  algunas  células  a  la  guanilato  ciclasa,  que  induce  síntesis  de  GMPc  y  relajación  del  músculo  liso,  que  en  los  vasos  sanguíneos  implica  Vasodilatación.    -­‐  NO  es  de  corto  alcance,  vida  media  muy  corta  5-­‐10  sec.    -­‐  GMPc  se  degrada  rápidamente  por  la  GMP  Fosfodiasterasa  (blanco  del  Viagra  y  sus  derivados).        

 

 

 

 

 

Ligandos  liposolubles  que  activan  receptores  nucleares:  -­‐  Algunos  de  estos  ligandos  son:  Vitamina  D,  ácido  retinoico,  testosterona,  progesterona,  estradiol,  tiroxina  (T3-­‐T4),  cortisol.  -­‐  Los  receptores  de  estos  ligando,  tiene  en  común  un  dominio  o  zona  de  unión  al  DNA,  cuando  los  receptores  se  unen  a  su  ligando,  exponen  este  dominio  de  unión  y  regulan  la  transcripción.  Esquema  de  activación  de  estos  receptores:    1.  Cuando  está  inactivo,  está  unido  a  proteínas  inhibitorias  (co-­‐  represores)  2.  Cuando  llega  el  ligando,  el  receptor  cambia  su  conformación  y  suelta  al  co-­‐represor    y  se  une  a  un  co-­‐  activador  (aumenta  eficiencia  de  la  transcripción).  A  veces  la  unión  de  un  ligando  genera  una  señal  de  translocación  nuclear    (pasa  de  citoplasma  a  núcleo).    Si  el  sistema  funciona  como  represor  de  transcripción,  el  ligando  determina  unión  de  co-­‐  represores.    

 

 

 

   

 

 

 

 

Tipos  de  receptores  para  ligando  extracelulares:  Están  en  la  superficie  celular  (membrana)  1.  Canales  iónicos:  Funcionan  a  favor  de  la  gradiente  de  concentración      

 

 2.  Receptores  acoplados  a  poteína  G:  Hay  más  de  800  tipos.  Son  heptahelicoidales  (con  7  dominios  de  transmembrana,  receptor  atraviesa  la  membrana  7  veces).  Cuando  llega  el  ligando,  se  activa  el  receptor  y  la  proteína  G  cercana  a  él.  Se  desencadena  la  respuesta.  *  Proteína  G  actúa  sobre  un  efector  como  la  Adenilato  ciclasa,  que  formara    AMPc  a  partir  de  ATP  (lo  cicla),  y  éste  AMPc  actuará  como  segundo  mensajero  para  desatar  una  serie  de  respuestas  a  nivel  celular,  una  de  ellas  es  activar  a  la  PKA.    Proteína  G  unida  a  GDP  (inactiva)  y  a  GTP  (activa)  

 

 

     3.  Receptores  acoplados  a  enzima:  Algunos  tienen  actividad  quinasa  propia  y  otros  están  acoplados  a  la  actividad  quinasa  de  otra  proteína.  Dimerizan,  se  autofosforilan    y  eventualmente  fosforilan  a  otras  proteínas.  

 

 

 

 

 

Proteínas  de  andamio:  Proteínas  capaces  de  interactuar  con  varias  proteínas  que  actúan  para  una  señalización.  Permiten  compartimentarizar  la  respuesta  y  que  ocurra  la  cascada  de  señalización,  en  donde  se  amplifica  la  señal,  se  producen  segundos  mensajeros,  etc.      

 

 

 

Fosfatidilinositol  en  la  señalización  Receptor  GPCR:  Receptor  ubicado  en  la  membrana  celular,  es  heptahelicoidal  y  está  asociado  a  una  proteína  Gq  trimérica  (tiene  3  subunidades,  alfa,  beta  y  gamma).  Cuando  llega  el  ligando  al  receptor  GPCR,  se  activa  la  proteína  Gq  y  la  subunidad  alfa  (antes  unida  a  GDP,  se  activa  ya  que  el  receptor  GPCR  intercambia  el  GDP  por  GTP),  la  subunidad  alfa  activa  a  la  fosfolipasa  C  -­‐  En  este  caso  el  mismo  receptor  GPCR  actúa  como  GEF  (intercambia  GDP  por  GTP  y  activa  a  la  proteína  Gq)  -­‐  El  complejo  beta-­‐gamma  también  puede  interactuar  con  distintos  efectores  y  activarlos.  -­‐  La  fosfolipasa  C  activa,  rompe  el  4,5  fosfoinositol  bifosfato  en  diacilglicerol  (DAG)  e  IP3.  -­‐  IP3  actúa  sobre  el  RE  haciendo  que  salga  Ca+2,  este  calcio  se  une  al  DAG  activando  a  la  PKC  la  cual  comienza  a  fosforilar  -­‐  DAG  e  IP3  actúan  como  segundos  mensajeros  

 

 

 

 

 

 

 

   -­‐  La  proteína  quinasa  IP3  quinasa,  agrega  grupos  fosfato  en  posición  3  a  los  inositoles,  siento  el  4,5  fosfoinositolbifosfato  (está  en  la  membrana)  el  blanco  de  la  fosfolipasa  C.  

   

¿Cómo  hacer  que  no  se  acumule  el  calcio  en  el  citoplasma?  1.  Hacer  entrar  el  calcio  por  medio  de  bombas  de  vuelta  al  retículo  (Transporte  activo)  2.  Hidrolizar  el  IP3    a  IP2  o  pasarlo  a  IP4  3.  El  calcio  se  puede  unir  a  proteínas  para  disminuir  su  concentración  libre  en  el  citoplasma    

Proteínas  G  Proteína  Gs  à  Adenilado  ciclasa  à  AMPc  à  activa  a  PKA  Proteína  Gq  à  Fosfolipasa  C  à  DAG  e  IP3  à  activa  a  PKC  -­‐  Pueden  ser  monoméricas  o  trímericas  (subunidades  alfa,  beta  y  gamma)  -­‐  Unidas  a  GDP  están  inactivas,  y  a  GTP  están  activas  -­‐  Hay  señales  que  se  activan  por  fosforilación  y  otras  que  se  activan  por  hidrólisis  de  nucleótidos,  este  último  es  el  caso  de  activación  de  las  proteínas  G  (acá  no  hay  fosforilaciones)  

   

 

 

 

 

 

 

Receptor  GPCR  y  Adenilato  ciclasa:  -­‐  GPCR    es  un  receptor  acoplado  a  proteína  G,  en  el  caso  anterior  era  Gq,  pero  también  puede  estar  acoplado  a  proteína  Gs,  en  este  caso  se  activará  a  la  adenilato  ciclasa,  la  cual  ciclará  el  ATP  para  formar  AMPc,  el  cual  actuará  como  segundo  mensajero  y  activará  a  la  PKA.  -­‐  La  adenilato  ciclasa  es  una  proteína  de  membrana  con  su  lado  catalítico  hacia  el  citoplasma  -­‐  Toxina  del  Cólera:  mantiene  a  Gs  activa  todo  el  tiempo  y  a  la  célula  con  elevados  niveles  de    AMPc.  Se  inactiva  la  fosfodiesterasa  (que  degradaba  los  segundos  mensajeros).    -­‐  El  AMPc  es  de  corta  vida  porque  es  hidrolizado  por  la  AMPc  Fosfodiasterasa.      Funciones  del  AMPc:  -­‐Activación  de  Proteína  Quinasa  A  (PKA)  -­‐Activación  de  canales  iónicos  de  membrana  -­‐Activación  del  GEF  de  Rap1,  que  activa  integrinas  y  adhesión  celular.  -­‐  Un  ejemplo  de  ligando  que  desencadena  la  respuesta  de  la  adenilato  ciclasa  y  producción  de  AMPc  es  la  serotonina  (neurotransmisor).  

GEF:  Intercambia  GDP  por  GTP,  activando  a  la  proteína  G    GAP:  Se  asocia  a  la  proteína  G  monomérica  y  actúa  como  cofactor  para  que  la  proteína  G  cumpla  su  rol  de  GTP  asa,  rompe  GTP  en  GDP,  se  inactiva  la  proteína  G  

¿Cómo  funciona  la  regulación  por  AMPc?  

 

Efector  de  Calcio:  CaMK  -­‐  Calcio  activa  la  calmodulina  que  une  Ca2+  que  luego  activa  a  una  kinasa.    -­‐  Ca2+actúa  como  2do  mensajero.    -­‐  La  calmodulina  sólo  se  activa  cuando  se  le  une  el  calcio.  

¿Cómo  termina  la  señalización?  -­‐  Por  medio  de  mecanismos  de  desensibilización  de  GPCR,  estos  mecanismos  requieren  de  la  fosforilación  de  GPCR  por  PKA,  PKC  o  GRKs  1.  Inactivación:  El  receptor  al  estar  fosforilado,  ya  no  interactúa  con  la  proteína  G  2.  Secuestro  del  receptor:  Receptor  al  no  poder  interactuar  con  la  proteína  G,  se  une  a  otras  proteínas  llamadas  arrestinas,  generan  la  internalización  temporal  del  receptor  (se  desfosforila  y  recicla).  3.  Regulación  negativa:  Internalización  del  receptor,  se  ubiquitina,  y  degrada  en  el  lisosoma.    

 

 

Concentración  de  AMPc  Sin  estímulo:  5  x  10-­‐8M  Post-­‐estímulo:  10-­‐6  

PKA:  serina/  treonina  quinasa    -­‐  AMPc  se  une  a  las  subunidades  regulatorias  de  la  PKA    PKA:  Fosforila  CREB  (factor  de  transcripción)  importantes  en  procesos  de  memoria  y  aprendizaje.      Hay  neuronas  olfatorias  que  funcionan  con  AMPc:  -­‐  Activan  GPCRs  con  Golf  que  activa  a  Adenilato  ciclasa.  AMPc  activa  a  canal  de  Na+  que  permite  entrada  de  Na+  y  despolarización  de  la  membrana  neuronal.  -­‐  Hay  aprox.  350  GPCR  para  detectar  grupos  de  odorantes.  Cada  neurona  produce  un  solo  tipo  de  receptor.  

 

 

 

Señalización  por  mecanismos  de  proteólisis  

-­‐  Involucra  proteasas  extra  e  intracelulares    Vía  Notch:    -­‐  Es  una  vía  irreversible  -­‐  Hay  una  célula  central  que  se  especializa  en  neurona,  dentro  de  un  conjunto  de  células    epiteliales  precursores.  La  célula  central  expresa  un  Ligando  de  membrana  (Delta)  que  le  informa  a  las  células  adyacentes  (que  expresan  Notch,  el  receptor)  que  no  se  pueden  diferenciar  a  neuronas.      -­‐  En  mamíferos,  Notch  funciona  en  muchos  sistemas  especificando  el  destino  celular,  tanto  durante  el  desarrollo  embrionario  como  en  etapa  adulta  (en  células  troncales):                        Diferenciación                        Sobrevida/apoptosis                        Ciclo  celular  y  en  relación  con  nichos  de  células  troncales  -­‐  Si  la  vía  Notch  llega  a  mutar,  se  produce  crecimiento  descontrolado  de  células  troncales  y  eso  lleva  a  cáncer.    

   

 

 

 

 

 

 1.  Durante  su  biosíntesis  en  el  Golgi:  receptor  queda  con  2  subunidades  y  de  esa  forma  se  expone  en  la  membrana  2.  Cuando  receptor  se  encuentra  con  el  ligando  Delta  actúa  una  alfa-­‐secretasa,  haciendo  que  se  exponga  el  fragmento  carboxilo-­‐terminal  del  receptor  Notch  3.  Este  fragmento  C-­‐terminal  es  el  sustrato  para  la  gamma-­‐secretasa,  la  cual  vuelve  a  cortar  el  receptor,  se  separa  el  ectodominio  del  dominio  intramembrana,  este  último  (la  parte  soluble)  viaja  hacia  el  interior  de  la  célula  hacia  el  núcleo  y  regula  la  expresión  de  genes.    -­‐  La  etapa  que  puede  regularizarse  es  la  interacción  con  Delta  y  el  2do  corte  proteolítico  -­‐  Gamma  secretasa:  Clave  en  producción  del  péptido  que  genera  enfermedad  de  Alzheimer.  Se  intentó  sacar  el  gen  de  esta  enzima  en  ratones  Knockout  pero  el  resultado  fue  letal  en  el  organismo  ya  que  se  bloqueaba  la  vía  Notch.  -­‐  La  vía  Notch  participa  en  la  organogénesis,  desarrollo  del  sistema  vascular,  sistema  hematopoyético  e  inmune,  sistema  muscular  esquelético,  mucosa  intestinal,  entre  muchos  otros.  

-­‐  Existe  una  célula  central  que  expresa  el  ligando  Delta  (se  diferenciará  a  neurona)  y  muchas  células  alrededor  que  expresan  el  receptor  Notch.  -­‐  Mientras  el  ligando  Delta  no  se  una  al  receptor  Notch  la  vía  está  apagada.  -­‐  Cuando  el  ligando  Delta  es  reconocido  por  el  receptor  Notch,  se  produce  la  proteólisis  del  receptor  Notch,  el  cual  se  encuentra  sólo  una  vez  en  la  membrana  y  subre  3  proteólisis  durante  toda  su  vida:    

 

Vía  Wnt  canónica:  Se  regula  proteólisis  de  la  β-­‐catenina  -­‐  Receptores:  Frizzled  y  LRP  (co-­‐receptor)  Ausencia  de  ligando  wnt  à  Complejo  de  destrucción  está  activo,  GSK-­‐3  (forma  parte  del  complejo),  fosforila  a  β-­‐catenina,  se  ubiquitina  y  degrada  en  el  proteosoma  Presencia  de  ligando  wnt  à  Ligando  se  une  al  co-­‐receptor,  el  cual  se  fosforila  haciendo  que  se  inactive  el  complejo  de  destrucción  (se  desensambla)  y  se  orienta  hacia  la  membrama  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Esta  vía  sirve  para  la  diferenciación,  organogénesis  y  proliferación.    -­‐  Cuando  hay  recambio  celular  con  células  troncales,  está  presente  esta  vía.  En  general,  mutaciones  en  esta  vía  se  asocian  a  cáncer.  -­‐  Tipos  de  ligandos  Wnt:  Familia  formada  por  colesterol  y  lípidos,  es  un  tipo  de  morfógeno  que  puede  viajar  en  vesículas.  -­‐  Mutación  en  la  proteína  de  andamio  APC  que  regula  el  complejo  de  destrucción  de  beta  Catenina,  está  mutado  en  el  80%  de  los  tumores  de  colon.  -­‐  Wnt  controla  la  proliferación  de  las  células  troncales.  -­‐  La  perdida  de  la  exposición  al  ligando  promueve  que  salgan  del  nicho  y  dejen  de  proliferar.    -­‐  En  todos  los  nichos  troncales  se  concentran  y  funcionan  todo  el  tiempo  los  ligandos  Wnt.              

 Vía  Hh  (hedgehog)  -­‐  Hay  un  receptor  Patched  que  une  el  ligando  Hh  y  otro  receptor  intracelular  que  está  inactivado  por  Patched  llamado  Smoothened    Ausencia  de  Ligando  Hh:  Proteía  Gli  se  fosforila,  se  ubiquitina  y  degrada.  Sus  fragmentos  actúan  como  supresores  de  genes                                          Presencia  de  Ligando    Hh:  Receptor  Patched  deja  de  inhibir  a  Smoothened,  pues  se  internaliza  y  degrada  en  lisosomas.  Smoothened  se  fosforila  y  activa  y  ahora    impide  que  se  fosforile  Gli.  Ésta  entra  al  núcleo  y  transcribe.      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Vía  Hh  no  ocurre  en  cualquier  parte  de  la  célula,  sino  que  en  una  estructura  llamada  Cilio  Primario,  sitio  único  que  concentra  la  maquinaria  de  señalización.  

-­‐  Tanto  Shh  como  Wnt  tienen  en  común:  en  ausencia  de  ligando,  hay  un  factor  de  transcripción  que  se  degrada  y  la  vía  está  inactiva.  Mutaciones  en  estas  vías  generan  cáncer:  

-­‐  Hh:  carcinoma  células  basales,  fibrosarcoma.        -­‐  Wnt:  cáncer  colorectal,  hepatoblastoma.  

 Célula  Troncal: - Las  células  hijas  pueden  ser  pluripotenciales  o  comprometerse  a  un  fenotipo  diferenciado -­‐  Características:  1.  No  está  ni  diferenciada  ni  comprometida.  2.  Se  puede  dividir  sin  límite,  condicionada  por  las  condiciones  del  nicho  3.  Cuando  se  divide,  cada  hija  puede  permanecer  como  célula  Troncal  o  comprometerse  a  un  linaje.  -­‐  Se  encuentran  en  la  médula  ósea,  hipocampo  (cerebro),  pelo,  piel      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

I.    Receptores  con  actividad  serina/treonina  quinasa  

TGFβr  (receptor)    1.  Al  unirse  el  ligando  TGFβ  el  receptor  forma  un  dímero.  *En  realidad,  el  receptor  es  un  tetrámero,  formado  por  2  subunidades  tipo  I  y  2  subunidades  tipo  II,  pero  para  simplificar  se  habla  de  dímero.  El  dominio  ser/tre  quinasa  de  la  subunidad  tipo  II  del  receptor  fosforila  a  la  cola  citoplasmática  de  la  subunidad  tipo  I.  2.  El  dominio  quinasa  de  la  subunidad  tipo  I  fosforila  a  R-­‐Smad  (Smad  2  o  3),  la  cual  abre  su  estructura,  lo  que  le  permite  formar  un  dìmero  con  Smad  4  (le  permite  entrar  al  núcleo)  3.  El  complejo  R-­‐Smad/Smad4  ahora  es  capaz  de  entrar  al  núcleo,  donde  interactúa  con  el  ADN  y  regula  la  transcripción  génica.  Tanto  R-­‐smad  como  Smad  4  poseen  dominios  hp  (hairpin)  que  le  permiten  interactuar  con  el  ADN.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Hay  muchos  variantes  de    receptores  tipo  I  y  II,  los  que  al  dimerizar  forman  distintas  combinaciones,  para  interactuar  con  diferentes  tipos  de  R-­‐Smad.    -­‐  La  Smad4  o  co-­‐Smad  siempre  es  la  misma.  -­‐  La  subunidad  tipo  I  del  receptor  posee  especificidad  para  la  R-­‐Smad  que  va  a  fosforilar.  -­‐  La  subunidad  tipo  II  del  receptor  posee  especificidad  por  el  ligando.  -­‐  Generalmente  el  complejo  R-­‐Smad/Smad4  es  un  trímero,  compuesto  por  2(R-­‐Smad)  y  1  (Smad4).  

 

R-­‐Smad  y  Smad  4  poseen  2  dominios  globulares  MH1  y  MH2.  -­‐  En  MH1  está  el  dominio  hp,  el  cual  permite  la  unión  con  el  ADN.  -­‐  “Basic  Pocket”:  Permite  interacción  con  otras  Smad  o  consigo  misma  y  replegarse.  -­‐  En  la  cadena  de  unión  de  ambos  dominios  existen  sitios  quinasa  que  pueden  ser  fosforilados.  -­‐  Hydrophobic  corridor:  Presente  en  R-­‐smad.  Permite  asociación  con  co-­‐factores  y  proteínas  en  el  núcleo  para  regular  la  transcripción  génica.  

 

 

 

 

 La  señalización  Smad  puede  ser  inhibida  dentro  y  fuera  de  la  célula  Extracelular:  Se  secretan  proteínas  específicas  que  capturan  al  morfógeno  (ligando)  e  impiden  que  este  interactúe  con  su  receptor,  lo  que  va  a  impedir  la  cadena  de  señalización  por  vía  Smad.      Intracelular:  I-­‐Smad  participa  en  la  inhibición  de  la  cadena  Smad,  lo  que  puede  ocurrir  en  diferentes  niveles  en  la  cadena  de  señalización  Smad.    1er  nivel:  I-­‐Smad  compite  con  R-­‐Smad  para  unirse  a  la  cola  citoplasmática  de  la  subunidad  tipo  I  del  receptor.  2do  nivel:  I-­‐Smad  se  asocia  a  “Smurfs”  (ubiquitin-­‐ligasas)  que  se  unen  al  receptor  y  lo  ubiquitinan  para  que  sea  degradado.  Ubiquitinan  al  receptor  1,  pero  como  está  unido  al  2,  todo  el  complejo  se  degrada.  3er  nivel:  I-­‐Smad  compite  con  R-­‐Smad  y  se  une  a  co-­‐Smad  (Smad4).  Se  forma  complejo      I-­‐Smad/co-­‐Smad,  que  puede  entrar  al  núcleo  e  inhibir  la  unión  de  otro  complejo  R-­‐Smad/co-­‐Smad  por  competencia.  *Un  R-­‐Smad  fosforilado  no  unido  a  co-­‐Smad  no  puede  entrar  al  núcleo.  4to  nivel:  I-­‐Smad/co-­‐Smad  entra  al  núcleo  e  impide  unión  del  ADN  con  complejo  R-­‐Smad/co-­‐Smad.  *La  expresión  de  algunos  I-­‐Smad  es  regulada  por  los  propios  R-­‐Smad.  (sistema  se  autoregula)  *En  todos  los  niveles  de  regulación  existen  fosfatasas  que  desfosforilan  e  inactivan  el  sistema.  *  I-­‐smad  no  se  puede  unir  al  DNA  pues  no  posee  el  dominio  hp      

 

 

 

II.  Receptores  asociados  a  una  Tirosina  Quinasa  (JAK)  -­‐  Estos  receptores  son  homodímeros,  formados  por  2  subunidades  idénticas  que  interactúan  al  unirse  el  ligando.  La  unión  del  ligando  puede  ser  de  2  formas:  a)  El  ligando  posee  2  dominios  iguales  que  interactúan  con  ambas  subunidades  del  receptor.  b)  El  ligando  posee  2  dominios  de  interacción  distintos,  y  cada  uno  interactúa  con  una  parte  diferente  de  las  subunidades  del  receptor  (esto  puede  “cruzarse”,  porque  recordemos  que  las  subunidades  del  dímero  son  iguales).  -­‐  JAK  quinasa:  Actividad  tirosina  quinasa,  está  asociada  íntimamente  a  cada  subunidad  del  receptor  

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

Ruta  de  señalización    1.  Cuando  llega  el  ligando  (citocina  como  la  GH),  receptor  dimeriza,  las  JAK  se  autofosforilan  de  forma  cruzada  (JAK  de  una  subunidad  fosforila  a  la  de  la  otra  subunidad).    2.  JAK  fosforilada  fosforila  ahora  las  colas  citoplasmáticas  de  las  subunidades  del  receptor  y  deja  tirosinas  fosforiladas  en  las  cosas  que  sirven  como  sitios  anclaje  para  las  STATs,  las  cuales  reconocen  la  stirosinas  fosforiladas  gracias  a  su  dominio  SH2.  3.  STAT  fosforiladas  se  sueltan  de  la  cola  e  interactúa  con  otras  STATs  y  como  dímeros  entran  al  núcleo  y  regulan  la  transcripción  (regulan  metabolismo,  crecimiento,  diferenciación    y  proliferación).  *La  señalización  puede  ser  a  través  de  otras  moléculas  pero  lo  más  común  es  la  vía  STAT  *  La  familia  de  las  STAT  participa  principalmente  en  el  sistema  inmune  

III.  Receptores  con  actividad  Tirosina  quinasa  -­‐  Estos  receptores  poseen  dominios  (1  o  2)  en  su  cola  citoplasmática  con  actividad  Tirosina  quinasa.    -­‐  Estos  dominios  son  sitios  de  anclaje  para  proteínas  señalizadoras  con  dominios  SH2.    -­‐  Este  sistema  debe  estar  regulado  porque  una  sobreexpresión  gatilla  tumores.  Se  encuentran  como  monómeros  al  estar  inactivos,  y  al  unirse  su  ligando  dimerizan  y  se  activan.  -­‐  Al  acercarse  ambos  monómeros  del  receptor  se  fosforilan.  Al  ser  uno  de  los  monómeros  del  receptor  un  “dominante  negativo”  debido  a  alguna  mutación  o  falla  en  la  subunidad,  las  colas  citoplasmáticas  del  receptor  con  los  dominios  quinasa  no  se  fosforilan  y  no  cumplen  su  función,  inhibiéndose  la  señalización  -­‐  Los  dominios  tirosina  quinasa  de  la  cola  citoplasmática  al  estar  fosforilados  sirven  de  unión  para  proteínas  con  dominio  SH2  (que  identifican  a  la  tirosina  fosforilada),  los  que  son  específicos  pues  también  reconocen  al  contexto  de  aminoácidos  cercano  a  la  tirosina  fosforilada.  -­‐  El  dominio  SH3  de  estas  proteínas  actúa  como  sitio  de  unión  para  otras  proteínas.  -­‐  El  El  dominio  SH2  es  como  un  “enchufe”.  Es  pequeño  y  compacto,  puede  estar  presente  en  muchas  proteínas.  Posee  un  bolsillo  que  identifica  a  la  fosfo-­‐tirosina  y  otro  bolsillo  que  reconoce  el  contexto  aminoacídico  de  la  fosfo-­‐tirosina.    

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Regulación  de  la  actividad  de  RAS  

RAS:  Proteína  G  monomérica  que  participa  en  la  señalización  de  receptores  Tirosina  quinasa.  GEF:  Es  un  intercambiador  GDP/GTP.  Saca  el  GDP  de  RAS,  y  al  haber  una  mayor  concentración  de  GTP  en  la  célula,  éste  llega  al  sitio  donde  estaba  antes  el  GDP.  GAP:  Activa  función  GTPasa  de  RAS,  lo  que  ocasiona  la  hidrólisis  del  GTP  y  la  inactivación  de  la  RAS.    

                                                                                                                                                                               *RAS:  Activan  rutas  de  las  MAP  quinasas.                                                                                                                                                                                  *Rho:  Activan  cambios  en  el  citoesqueleto.  

 

   

Activación  de  RAS  por  un  receptor  Tirosina  quinasa  activado  

 

 

 

 

 

 

 

Colapso  del  cono  de  crecimiento  mediado  por  GTPasas  de  la  familia  Rho:    Cuando  un  axón  está  en  crecimiento,  debe  existir  una  señal  para  que  el  crecimiento  se  detenga  cuando  llegue  a  la  célula  blanco  para  la  sinapsis.  1.  La  célula  con  la  que  va  a  hacer  sinapsis  posee  el  ligando  ephrin  A1,  el  cual  interactúa  con  su  receptor  EphA4  ubicado  en  la  porción  terminal  del  axón,  el  cual  dimeriza  y  se  activa  fosforilándose  en  una  Tirosina.  2.  Una  enzima  Tirosina-­‐quinasa  con  dominio  SH2    se  une  al  dominio  fosforilado  del  receptor,  al  cual  también  se  une  Rho-­‐GEF  (pero  no  por  dominio  SH2,  por  otra  interacción).  La  enzima  Tirosina-­‐quinasa  fosforila  a  Rho-­‐GEF,  el  cual  se  activa.  3.  Rho-­‐GEF  saca  un  GDP  de  RhoA  inactiva,  a  la  cual  se  une  ahora  un  GTP  y  activa  a  RhoA,  lo  que  genera  una  contracción  en  filamentos  de  miosina  y  actina,  lo  que  detiene  el  crecimiento  del  axón.  

 

El   receptor   al   unir   a   su   ligando,   se  fosforila  y  se  activa,  uniéndose  a  él  una   proteína   adaptadora   (Drk   o  Grb2),   la   cual   se   asocia   a   un   RAS-­‐GEF   (Sos),   el   cual   saca   el   GDP   de  una  RAS  para  que  se  le  una  un  GTP  y  se  active.    

Ruta  MAP  quinasa  (serina/treonina  quinasas)  activada  por  RAS:  1.  Una  RAS  (ojo:  RAS  no  es  quinasa)  al  estar  activa  (unida  a  GTP)  activa  a  MAPKKK  (Raf)  2.  MAPKKK  activada  fosforila  a  MAPKK  (Mek)  ,  activándola.  3.  MAPKK  activada  fosforila  a  MAPK  (Erk)  ,    activándola.  4.  MAPK  activada  fosforila  diversas  proteínas  que  funcionan  como  factores  de  transcripción,  por  ejemplo  a  c-­‐fos,  el  cual  interactúa  con  cjun,  que  unidos  se  unen  a  una  zona  del  ADN  llamado  AP1.  

Las  especificaciones  temporales  en  la  activación  de  ERK  permiten  que  las  mismas  señales  lleven  a  proliferación  o  diferenciación.  Dos  receptores  que  gatillan  a  través  de  una  misma  ruta  una  señalización  pueden  dar  origen  a  resultados  distintos.  

 Ruta  de  señalización  de    PI3-­‐k  

-­‐La  IP3-­‐K  agrega  un  grupo  fosfato  al  Carbono  n°3  del  anillo  del  fosfatidilinositol.  Se  obtienen  diferentes  tipos  de  inositoles  dependiendo  de  las  fosforilaciones  previas  que  poseían.  -­‐  PI3  (3,4,5  fosfoinositoltrifosfato)    está  en  la  membrana  y  al  estar  fosforilado  se  activa  como  sitio  de  anclaje  para  distintas  proteínas  con  dominios  PH  (como  la  PDK1  o  Akt).  -­‐  Mutaciones  en  esta  vía  puede  producir  cáncer  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Receptores  ErbB:  Poseen  un  dominio  Tirosina-­‐quinasa  en  su  cola  citoplasmática.  Se  fosforilan  y  activan  en  presencia  de  ligando.  -­‐  Generalmente  cuando  ErbB  ya  se  unió  a  su  ligando,  para  apagar  la  señalización,  se  endocitan,  ubiquitinan  y  degradan  en  el  proteosoma.  Dependiendo  de  las  concentraciones  del  ligando  éste  se  puede  reciclar  y  ser  devuelto  a  la  membrana.  O  pueden  ser  cortados  por  proteasas,    con  lo  cual  sus  colas  citoplasmáticas  entran  al  núcleo  actuando  como  factores  de  transcripción.  -­‐  Si  la  señalización  vía  ErbB  nunca  se  apaga,  ras  siempre  estará  activa,  activando  a  MAP-­‐K  y  al  final  habrá  mucha  proliferación  (cáncer).  ErbB1:  EGFR  ErbB2:  No  posee  ligando  conocido,  se  cree  que  está  asociado  a  un  tipo  de  cáncer.  ErbB3:  Su  dominio  Tirosina-­‐k  es  incapaz  de  fosforilar  ErbB4  -­‐  Todos  estos  tipos  de  ErbB  forman  dímeros  al  unirse  al  ligando  que  pueden  ser  hetero  u  homodímeros.    -­‐  La  gran  mayoría  de  los  ligandos  de  ErbB  son  sintetizados  como  ligandos  unidos  a  la  membrana.  

 

 

 

 

 

 

 

Transactivación  de  EGFR:  El  receptor  es  activado  indirectamente,  para  lo  cual  se  necesitan  proteínas  de  tipo  ADAM,  las  cuales  cortan  una  proteína  unida  a  membrana  y  la  dejan  en  forma  soluble.  Las  ADAM  pueden  cortar  ligandos  unidos  a  la  membrana  o  receptores.  -­‐  Proteína  G  activada  activa  a  las  ADAM,  las  cuales  cortan  al  pro-­‐ligando  unido  a  la  membrana  el  cual  se  suelta  y  actúa  como  ligando  de  otro  receptor,  activándolo.  -­‐  Al  cortarse  un  receptor,  su  ectodominio  puede  unirse  al  ligando  inhibiéndolo,  pues  el  ligando  no  podrá  unirse  a  un  receptor  transmembrana  capaz  de  iniciar  una  señal.  

 

                           ADAM    

 

 

EGFR  y  cáncer  

-­‐  Las  rutas  de  señalización  pueden  activar  las  vías  MAP-­‐K  e  IP3-­‐K,  las  cuales  promueven  5  de  las  6  características    que  tiene  las  células  tumorales  (sobre  todo  proliferación)  -­‐  Terapias:  Inhibir  por  medio  de  un  anticuerpo  al  receptor,  y  así  el  ligando  no  se  puede  unir                                          Inhibir  la  actividad  tirosina  quinasa  de  estos  receptores,  inhibiendo  la  respuesta  final.  

 

 

 

 

 

 

 

   

                                                                                                                     Las  vías  se  cruzan  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ruta  exocítica  I:  RE  y  Golgi  

Ruta  exocíticaà  Procesamiento  de  proteínas  en  RE  y  Golgi  y  exportación  por  vesículas  al  exterior  Ruta  endocítica  à  Captar  proteínas  extracelulares  en  la  membrana,  endosoma  

 

 

   

 

 

 

 

-­‐  RE  à  síntesis  proteica  -­‐  Golgi  à  Procesamiento  de  proteínas  *Dirección  anterograda  en  rojo  y  retrograda  en  azul  

Retículo  Endoplasmático  -­‐  Es  una  red  que  se  encuentra  en  prácticamente  toda  la  célula  -­‐  Es  un  organelo  membranoso  y  se  observan  poliribosomas  en  la  membrana  del  RE  -­‐  Tiene  contacto  con  la  membrana  nuclear  y  responde  ante  las  proteínas  mal  plegadas  -­‐  Hay  células  en  donde  hay  más  RER  o  REL.  Por  ejemplo,  en  las  células  plasmáticas,  como  linfocitos  B  que  participa  en  la  producción  de  anticuerpos,  células  pancreáticas  que  producen  muchas  enzimas  proteolíticas).  -­‐  Los  ribosomas  que  se  encuentran  libres  en  el  citoplasma  son  iguales  a  aquellos  que  se  asocian  al  RE  formando  el  RER.  Su  mensajero  determina  si  estará  libre  o  en  el  RER  (asociado  a  su  membrana)  -­‐  REL  à  participa  en  la  detoxificación  de  drogas,  muy  presente  en  el  hígado  -­‐  Albúmina  se  secreta  en  el  hígado    Técnicas  de  fraccionamiento  subcelular:  Sirve  para  aislar  organelos  y  caracterizarlos.  RE  puede  aislarse  por  medio  de  centrifugación,  se  generan  diferentes  gradientes.  Las  vesículas  se  someten  a  centrifugación  al  equilibrio,  donde  se  separan  las  lisas  de  las  rugosas  por  densidad.  No  se  deben  usar  jabones  que  rompen  la  membrana.    

   

 

 

Funciones  del  RE:  -­‐  Síntesis  de  lípidos:  fosfolípidos  y  colestetol  (Sintetiza  colesterol  pero  no  se  observa  en  el  RE,  pues  se  libera  rápidamente)  -­‐  Síntesis  de  hormonas  esteroidales  y  sales  biliares.  Reacciones  de  detoxificación  de  compuestos  liposolubles  (citocromo  P450)  (funciones  célula-­‐dependiente)  -­‐  Secreción  y  recaptura  de  calcio  -­‐  Síntesis  de  proteínas  de  secreción  y  de  membrana.    Glicosilación  de  proteínas  -­‐  Activación  de  la  respuesta  a  “proteínas  mal  plegadas”  -­‐  Exporte  de  proteínas  en  la  ruta  secretoria,  en  transportadores  vesiculares.  à  Proteínas  que  son  sintetizadas  salen  por  vesículas  de  secreción  (zonas  específicas  o  dominios  en  el  RE)  hacia  el  Golgi  para  sufrir  sus  modificaciones.    Síntesis  de  proteínas:    

 

 

 

 

 

 

1.  Reconoce  el  péptido  señal,  y  se  une  a  la  subunidad  mayor  del  ribosoma  2.    Une  GTP  (P54:  Subunidad  del  SRP  que  une  GTP,  tiene  residuos  de  metionina)  3.  Detiene  momentáneamente  la  traduccional  unirse  al  polipéptido  naciente  vía  P54,  hasta  que  lleva  el  péptido  junto  al  ribosoma  y  su  RNAm  hasta  la  membrana  del  RE,  donde  estará  el  receptor  SRP,  el  cual  tiene  GTP,  por  lo  tanto  hay  un  gasto  energético  para  que  ocurran  los  cambios  conformacionales.  Polipéptido  es  reconocido,  SRP  se  suelta  y  el  péptido  queda  asociado  al  poro.  Cuando  SRP  se  suelta  puede  funcionar  en  otra  ronda.  

Péptido  señal:  secuencia  hidrofóbica  del  péptido  que  cuando  es  reconocida  por  el  receptor  del  SRP  en  el  RE,  se  abre  el  poro  y  entra  la  cadena  polipeptídica.  -­‐  Luego  el  péptido  señal  es  cortado  por  una  peptidasa  señal.  -­‐  En  el  RE  hay  un  receptor  para  el  SRP  -­‐  El  translocón  o  poro  es  un  complejo  formado  por  varias  proteínas.  -­‐  Cuando  entra  el  péptido  al  RE,  comienza  a  sufrir  modificaciones  post-­‐traduccionales,  como  glicosilaciones.  

 

-­‐   Sub-­‐unidad   mayor   y   menor   (reconoce   el   RNAm)  -­‐   Actividad   catalítica   (actúa   como   ribozima)  -­‐   Pool   común   de   ribosomas,   hay   asociados   a   la    membrana   del   RE   y   otros   libres   en   el   citoplasma    SRP:   Partícula   robonucleoproteíca   (tiene  un  RNA  de  300    nucleótidos   y   6   proteínas)   que   reconoce   la   secuencia    “péptido   señal”   en   la   cadena   polipeptídica   del   péptido  que  se  está  traduciendo  hay  hidrólisis  de  GTP,  se  abre  un  poro   en   el   RE   (translocón)   y   de   esa   forma   la   cadena  polipeptídica   se   va   insertando   en   el   lumen   del   RE.    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  El  péptido  señal  junto  al  SRP  llevan  al  ribosoma  a  la  membrana  del  RER  -­‐  SRP  unido  a  GDP  está  inactivo,  cuando  se  une  a  GTP  se  activa  y  es  capaz  de  interactuar  con  su  receptor.  -­‐  Existe  un  requerimiento  energético  para  la  entrada  del  péptido  en  el  translocón.    -­‐  Hidrólisis  de  GTP  también  permite  la  salida  de  SRP  y  la  entrada  del  péptido  al  poro  del  RE.  El  mismo  SRP  tiene  la  actividad  GTPasa  (hidrólisis  de  GTP).  El  receptor  de  SRP  también  tiene  esta  actividad  GTPasa.  -­‐  Continúa  la  síntesis  del  polipéptido  cuando  ya  entró  por  el  poro,  ocurre  el  corte  del  péptido  señal  por  una  peptidasa  señal,  y  también  ocurren  modificaciones  como  glicosilaciones.  El  orden  de  estos  procesos  es  relativo,  pero  la  glicosilación  es  una  modificación  temprana.  -­‐  Péptido  maduro  no  posee  péptido  señal  -­‐  Cuando  el  péptido  señal  es  cortado,  éste  tiene  una  vida  media  muy  corta  y  se  degrada  rápidamente.  

 

 

 

 

 

 

   

 Poro  o  translocón:  Está  compuesto  por  varias  subunidades  de  proteínas  sec61.  Normalmente  está  cerrado  (tapón),  que  impide  la  salida  de  iones  y  del  péptido  cuando  se  corta  el  péptido  señal.  La  apertura  del  poro  depende  de  la  entrada  del  péptido  y  de  la  hidrólisis  de  GTP.  -­‐  El  complejo  de  sec61  forma  la  unidad  básica  del  translocón  que  está  cerrado  o  abierto  dependiendo  de  la  síntesis  de  polipéptido.          

 

 

 

   

-­‐  A  medida  que  se  sigue  traduciendo,  el  péptido  va  entrando  al  poro,  es  co-­‐traduccional  -­‐  Membrana  de  RE  protege  al  péptido  de  la  acción  de  protesas  que  podrían  cortarlos.    -­‐  Las  membranas  del  retículo  tienen  actividad  peptidasa  (por  esta  razón  se  obtienen  péptidos  más  pequeños.  Al  incubar  esto  se  deben  acoplar  todas  las  partes  simultáneamente).    Dos  características  importantes  del  RE:  1.  Ambiente  dentro  del  RE  es  muy  oxidante  (aa  que  se  pueden  oxidar,  como  la  cisteína,  que  formará  puentes  disulfuro  al  oxidarse)  2.  También  hay  mucho  calcio  adentro  del  RE,  sirve  para  el  plegamiento  de  la  proteína.      

 

 

 

 

 

 

 

Proteína  de  membrana  Tipo  1:  -­‐  Tienen  su  grupo  N-­‐terminal  hacia  el  lumen  de  RE  y  el  C-­‐terminal  hacia  el  citosol  -­‐  Cuando  la  proteína  sale  del  RE  y  se  posiciona  en  su  destino  final  (en  la  membrana  citoplasmática)  se  revierten  los  grupos,  es  decir,  el  N-­‐terminal  mira  hacia  el  espacio  extracelular  y  el  C-­‐terminal  hacia  el  citosol.    -­‐  Tienen  un  solo  dominio  de  transmembrana  -­‐  Tienen  una  secuencia  Stop  Tranfer,  es  una  señal  para  que  la  proteína  se  libere  del  poro,  pero  sigue  asociada  a  la  membrana.  -­‐  Péptido  señal  (en  rojo)  es  una  secuencia  hidrofóbica    

 

 

 

 

 

 

   

-­‐  Existe  una  variación  de  proteína  Tipo  1,  en  donde  no  hay  secuencia  péptido  señal,porque  éste  es  interno  y  no  se  asocia  al  amino-­‐terminal.  En  este  caso  la  secuencia  hidrofóbica  tiene  cargas.  

 

 

 

 

   

 

 

 

 

Proteína  tipo  2:  En  este  caso  el  N-­‐terminal  esta  mirando  hacia  el  citosol  y  el  C-­‐terminal  hacia  el  lumen  del  RE,  cuando  la  proteína  madura  y  se  va  hacia  la  membrana  citoplasmática,  el  N-­‐terminal  mira  el  citosol  y  el  C-­‐terminal  el  espacio  extracelular.  También  tienen  solo  un  dominio  de  transmembrana.    

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  A  veces,  la  entrada  al  RE  es  post-­‐traduccional,  implica  un  gasto  de  energía      Resumen:    1.  En  ribosomas  unidos  a  la  membrana  del  RE  se  sintetizan  proteínas  de  secreción,  enzimas  y  proteínas  del  RE,  aparato  de  Golgi  y  lisosomas.  La  síntesis  comienza  con  los  ribosomas  libres.      2.  El  péptido  señal  está  compuesto  por  aminoácidos  de  carácter  hidrofóbico,  reconocido  por  la  partícula  de  reconocimiento  del  péptido  señal  (SRP),  la  que  a  su  vez  es  reconocida  por  un  receptor  en  la  membrana  del  RER.      3.  Generalmente  el  péptido  señal  se  localiza  hacia  el  extremo  amino-­‐terminal  de  la  proteína  y  se  reconoce  por  sec61.  Una  vez  insertado  en  la  membrana  es    cortado  por  la  peptidasa  señal  y        degradado.  También  existen  PS  internos.    4.  El  SRP  dirige  tanto  la  unión  del  ribosoma  a  la  membrana  y  permite  la  inserción  de  la  proteína  naciente  al  canal  de  transmembrana.  La  hidrólisis  de  GTP  por  la  subunidad  P54  del  SRP  y  la  subunidades  del  SRP-­‐R  son  requeridas  para  el  proceso  de  salida  del  SRP  de  la  membrana,  solo  cuando  el  polipeptido  está  siendo  translocado.      5.  Las  proteínas  cruzan  la  membrana  del  RER  en  un  estado  desplegado  a    través  del  canal  proteico,  el  translocón,  un  complejo  multiproteico  compuesto  por  el    complejo  sec61.    6.  En  células  de  mamífero  las  proteínas  de  membrana  mínimas  requeridas    para  la  translocación  son  el  receptor  de  SRP  y  el  complejo  sec61.      

Modificaciones  Post-­‐traduccionales  y  Control  de  calidad  en  RER    -­‐  Las  Proteínas  neosintetizadas  de  membrana  y  luminales  del  RER  experimentan  una  serie  de  modificaciones  antes  de  alcanzar  su  destinación  final:    1.  Formación  de  Puentes  disúlfuro  2.  Plegamiento  correcto  3.  Incorporación  y  procesamiento  de  azúcares  (carbohidratos).  4.  Cortes  proteolíticos  específicos.    5.  Ensamblaje  de  complejos  multiméricos.  6.  Degradación  de  proteínas  mal  plegadas  (UPR)    

Glicosilaciones  :  Modificaciones  que  sufren  las  proteínas  y  que  son  importantes  en  su  plegamiento  y  en  su  función.  Chaperonas:  Proteínas  que  tienen  2  cisteínas,  y  una  de  ellas  está  hidrolizada.  Por  medio  de  ataques  nucleofílicos  ayuda  a  que  las  proteínas  se  plieguen  hasta  alcanzar  su  grado  más  estable.  Esto  ocurre  simultáneamente  mientras  se  van  agregando  los  azúcares.    Modificación  post-­‐traduccional:  N-­‐glicosilaciones  -­‐  Función  de  las  glicosilaciones  en  el  RE:  plegamiento  de  proteínas  y  sistema  de  control  de  calidad  -­‐  Hay  una  secuencia  (presencia  de  asparragina  -­‐  x-­‐  serina/treonina).  Ese  tripéptido  es  señal  de  que  la  proteína  sea  glicosilada.  -­‐  X  puede  ser  cualquier  aminoácido  excepto  prolina  -­‐  El  grupo  amino  de  la  asparragina  se  glicosila  -­‐  Cumple  un  rol  importante  en  el  plegamiento  de  la  proteína  -­‐  Todas  las  proteínas  que  salen  del  RE  pasan  por  un  control  de  calidad,  donde  las  proteínas  mal  plegadas  no  lo  pasan.  -­‐  El  dolicol  es  un  lípido  de  la  monocapa  interna  de  la  membrana  del  retículo  endoplasmático.  Su  función  es  transportar  oligosacáridos  N-­‐ligados  hasta  una  proteína  que  haya  sido  sintetizada  en  el  retículo  endoplasmático.  -­‐  Este  precursor,  llamado  Dolicol,  unido  a  2  fosfatos,  es  capaz  de  transferir  el  core  de  azúcares  (  9  manosas,  3  glucosas  y  2  acetil  )a  la  cadena  polipeptídica.  Este  proceso  catalizado  por  la  oligosacariltransferasa.  -­‐  En  este  proceso  ayudan  chaperonas,  las  cuales  son  leptinas  (reconocen  azúcares)  y  además  unen  calcio,  ayudando  al  plegamiento.  -­‐  Hay  2  chaperonas:  Calnexina  y  calreticulina.  Participan  en  el  plegamiento  de  las  proteínas,  mediante  el  reconocimiento  de  los  azúcares.  Hay  glicosidasas  que  quitan  2  glucosas  a  la  proteína,  la  glucosa  que  queda  es  reconocida  por  estas  chaperonas  leptinas.  -­‐  Glicosidasa  quita  2  residuos  de  glucosa  -­‐  Manosidasa  quita  1  residuo  de  manosa        

 

 

 

 

 

 

 

 

   

-­‐  La  glucosa  residual  en  el  centro  es  mantenida  hasta  que  se  alcance  el  plegamiento  adecuado  -­‐  Al  salir  del  RE,  el  centro  de  azúcares  ha  perdido  las  3  glucosas,  y  una  manosa,  es  decir,  cuando  la  proteína  sale  del  RE  mediante  vesículas  hacia  el  Golgi,  lo  hace  con  2  N-­‐acetilglucosamina  y  8  residuos  de  manosa.  Esto  constituye  una  proteína  bien  plegada  que  pasaría  el  control  de  calidad.  -­‐  Si  la  proteína  no  se  pliega  correctamente  es  una  señal  de  estrés,  que  si  no  se  repara  lleva  a  apoptosis.    

Modificación  post-­‐traduccional:  Anclaje  de  proteínas  a  un  tallo  de  GPI  -­‐  Una  proteína  puede  ser  sintetizada  como  una  proteína  de  membrana.  Existe  una  enzima  que  corta  a  la  proteína  y  lo  que  queda  en  el  lumen  del  RE  se  une  al  glicofosfatidilinositol.  -­‐  En  este  caso  la  misma  enzima  que  cortó  la  proteína,  será  la  que  la  une  al  GPI  -­‐  El  tallo,  es  una  parte  del  GPI  que  es  reconocida  por  la  enzima  para  que  corte  y  que  sirve  de  puente  de  anclaje  del  GPI  con  la  proteína.    

 

 

 

 

 

 

 

Vía  retrógrada  de  Cis  Golgi  a  RE:  Recuperación  de  proteínas  residentes  de  RE  -­‐  A  veces  las  chaperonas  salen  junto  con  sus  proteínas  hacia  el  Golgi,  para  que  regresen  al  RE,ellas  tienen  una  secuencia  en  su  C-­‐terminal  de  4  aminoácidos  que  es  reconocida  por  un  receptor  KDEL  ubicado  en  la  membrana  de  la  cisterna  cis  del  Aparato  de  Golgi,  cuando  el  receptor  reconoce  esta  secuencia,  las  chaperonas  regresan  al  RE.    Resumen:  

-­‐  El  ambiente  oxidante  del  RER  favorece  la  oxidación  de  los  grupos  SH  de  las  cisteínas  a  enlaces  S-­‐S,  mientras  que  esta  reacción  no  está  favorecida  en  el  citosol.  De  esto  se  desprende  que  los  puentes  S-­‐S  son  comunes  en  proteínas  secretorias  y  en  los  ectodominios  de  proteínas  de  membrana,  y  están  ausentes  en  proteínas  citosólicas.    

-­‐  La  enzima  PDI,  localizada  en  el  lumen  del  RE  cataliza  el  reordenamiento  de  los  S-­‐S,  acelerando  el  plegamiento  de  proteínas  de  secreción  y  de  membrana  en  el  RER.    

-­‐  El  Plegamiento  de  proteínas  en  el  RER  está  facilitada  por  otras  proteínas  chaperonas  como  BIP  y    lectinas  como  calnexina  y  calrreticulina.    

-­‐  La  glicosilación  de  proteínas  comienza  en  el  RE,  por  el  reconocimiento  de  la  secuencia  Asn-­‐X-­‐Ser/Thr.  El  centro  se  transloca  en  el  lumen  del  RE.      -­‐  En  el  RE  la  glicosilación  cumple  un  papel  clave  en  el  plegamiento  proteico.  -­‐  Solo  las  proteínas  plegadas  correctamente  y  con  el  centro  de  azúcares  procesado,  serán  transportadas  fuera  del  RE  hacia  el  Aparato  de  Golgi.  

-­‐  El  ensamblaje  de  subunidades  para  formar  proteínas  multiméricas    ocurre  en  el  RER.  

-­‐  Algunas  proteínas  del  RE  se  retienen  por  la  presencia  de  una  secuencia  KDEL  en  el  carboxilo  terminal  que  es  reconocido  por  el  receptor  de  KDEL,  que  cicla  entre  las  zona  cis  del  aparato  de  Golgi  y  el  RE.  

 

 UPR:  Respuesta  a  proteínas  mal  plegadas  -­‐  Permite  eliminar  proteínas  mla  plegadas  y  así  evitar  que  la  célula  muera.  IRE1  :  Proteína  de  membrana  en  el  RE  que  censa  lo  que  ocurre  en  el  lumen,  tiene  actividad  quinasa  intrínseca,  se  autofosforila,  dimeriza  y  posee  actividad  endonucleasa,  que  cortará  en  lugares  específicos  sobre  el  RNAm  inmaduro,  ocurre  splicing  y  el  RNA  al  madurar  genera  un  factor  de  transcripción  (XBP1,  gen  o  proteína  regulatoria)que  entrará  al  núcleo  y  activará  genes  que  generen  chaperonas.  De  esta  forma,  ellas  ayudarán  a  plegar  las  proteínas  mal  plegadas,  y  las  que  ya  no  sean  capaces  de  plegar,  son  ubiquitinizadas  y  degradadas  en  el  proteosoma.    -­‐  Hipoxia,  baja  en  glucosa,  drogas,  etc.  Pueden  generan  condiciones  que  llevan  a  producir  proteínas  mal  plegadas.  

PERK:  Quinasa  que  se  fosforila  y  forma  un  dímero  o  más.  Detiene  la  traducción  de  proteínas,  se  da  cuenta  que  están  saliendo  mal  plegadas  y  detiene  el  proceso,  mientras  intenta  solucionarlo.    AFT6:  Aumenta  la  expresión  de  genes  que  se  traducen  en  chaperonas,  las  cuales  ayudarán  al  plegamiento  de  las  proteínas.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Inductores  químicos  de  la  UPR    Tunicamicina:  Inhibe  la  formación  del  núcleo  central  de  glicosilación  de  las  proteínas  en  el  RE  y  por  lo  tanto  afecta  el  plegamiento  de  las  proteínas    Tapsigargina:  Induce  la  liberación  de  Ca2+  desde  el  lúmen  del  RE  al  citoplasma  afectando  la  función  de  chaperonas,  como  Calnexina  y  Calreticulina  y  RAP  que  requieren  de  Calcio  para  unir  a  los  polipéptidos.    Ditiotreitol  (DTT):  agente  reductor  que  impide  la  formación  de  puentes  S-­‐S  y  por  lo  tanto  afecta  el  plegamiento  de  proteínas  y  el  ambiente  redox  luminal.      Inicio  de  la  UPR    -­‐  La  proteína  chaperona  BIP/Grp78  se  asocia  a  receptores  de  UPR  en  la  membrana  del  RE  y  los  mantiene  inactivos  (a  PERK;  IRE  y  ATF6).  -­‐  Si  se  induce  la  UPR  por  algún  estímulo  y  se  acumulan  proteínas  mal  plegadas.  Chaperonas  como  Bip/grp78  se  suelta  de  los  receptores  para  asistir  el  plegamiento  y  esto  gatilla  la  activación  de  estos  y  el  comienzo  de  la  UPR.      

Funciones  de  la  UPR  -­‐  Las  fases  iniciales  de  la  activación  de  la  UPR  tiene  dos  papeles  claves:    1.  Atenuación  de  la  traducción  y  detención  del  ciclo  celular  por  el  receptor    PERK    que  se  autofosforila,  oligomeriza  y  activa.  Esto  ocurre  dentro  de  minutos  a  horas  del  inicio  de  UPR  y  evita  sobrecarga  de  Proteínas  en  el  lumen  del  RE.    2.  Aumento  de  la  producción  de  proteínas  que  participan  en  el  plegamiento,  como  chaperonas  (Bip/Grp78).  En  esta  etapa  participan:    -­‐  IRE  1:  con  actividad  quinasa,  que  se  autofosforila  y  homodimeriza.  El  dominio  activado  funciona  como  endonuclasa  y  activa  XBP1,  que  como  factor  de  transcripción  activa  promotores  de  genes  de  respuesta  a  UPR  (Ejemplo  de  chaperonas).  -­‐  ATF6,  factor  de  transcripción  que  al  disociarse  de  Bip,  se  transloca  al  aparato  de  Golgi,  donde  se  proteolisa  y  activa,  translocándose  al  núcleo  y  activando  expresión  génica.    OBJETIVO:  Respuesta  Adaptativa  para  remover  proteínas  mal  plegadas  y  acumuladas,  previniendo  un  estrés  adicional  al  que  causó  la  respuesta  inicial  y  restablecer  lo  antes  posible  la  función  de  RE.    Si  esto  no  se  logra,  se  induce  Apoptosis  (Muerte  celular  programada).    

-­‐  Proteínas  mal  plegadas  o  subunidades  no  ensambladas  se  retienen  selectivamente  en  el  RER  ya  sea  como  agregados  o  porque  están  unidos  a  chaperonas.    -­‐  Las  proteínas  mal  ensambladas  son  a  menudo  devueltas  al  citosol  y  son  luego  degradadas  por  el  proteosoma  previa  ubiquitinación.    -­‐  La  acumulación  de  proteínas  mal  plegadas  en  el  lumen  del  RE  induce  la  UPR.    UPR  tiene  función  de  sobrevida  celular,  pero  si  se  prolonga  lleva  a  la  Apoptosis.      Aparato  de  Golgi  -­‐  Proteínas  salen  del  RE  y  se  van  al  Golgi  vía  vesículas  secretorias  -­‐  Golgi  cumple  un  rol  central  en  la  célula  -­‐  Tiene  varias  cisternas,  las  cuales  se  dividen  por  sus  funciones  en:          Cisterna  Cis:  En  contacto  directo  con  las  vesículas    desde  el  RE,  es  la  que  recibe  la  carga.        Cisterna  Medial        Cisterna  Trans                    

 -­‐  Aquellas  proteínas  lisosomales,  cuyo  destino  final  es  ir  a  los  lisosomas,  sufren  una  modificación  en  donde  un  residuo  de  manosa  es  fosforilado  y  esto  es  una  marca  que  indica  que  su  destino  final  es  el  lisosoma.  -­‐  Las  vesículas  se  fusionan  con  la  cisterna  Cis  y  las  proteínas  comienzan  a  sufrir  modificaciones.  Hay  procesamiento  de  azúcares  (remoción  de  manosas)  -­‐  Recordar  que  en  RE  las  proteínas  perdieron  1  manosa  y  3  glucosas.  En  la  cisterna  Cis  pierden  3  manosas  más  y  se  incorpora  1  N-­‐acetilglucosamina.  -­‐  Para  saber  en  qué  cisterna  se  encuentran  las  proteínas,  se  usa  Endoglicosidasa  H  (endo  H),  que  rompe  enlace  entre  dos  N-­‐acetilglucosamina.  Solo  cuando  la  Glicoproteína  tiene  la  estructura  alta  en  manosa  (5)  y  por  lo  tanto  deja  a  la  proteína  sin  N-­‐glicosilación.    -­‐  Cuando  la  proteína  aún  es  suceptible  a  endo  H  (aún  puede  ser  cortada  por  ella),  significa  que  aún  no  pasa  a  la  cisterna  medial.  -­‐  También  se  sintetizan  proteoglicanos                                          -­‐  Luego  cuando  pasa  a  la  cisterna  medial,  pierde  2  manosas  más  y  a  nivel  más  trans  se  agregan  azúcares  más  complejos  como  Galactosa  y  ác.Siálico  (Ác.  N.acetilneuraminico)  .  Estos  azúcares  están  conjugados  con  nucleóticos  (como  UDP).  En  la  zona  trans  hay  transportadores  especiales  que  permiten  la  entrada  de  estos  azúcares  con  nucleótidos.  -­‐  La  compartamentalización  del  procesamientode  los  oligosacáridos,  está  dada  por  la  presencia  de    los  transportadores  de  nucleótidos-­‐azúcar  de  las  glucosiltransferasas  en  las  distintas  cisternas  del  Golgi.  -­‐  En  la  cisterna  trans  también  ocurren  sulfataciones  -­‐  A  nivel  más  Trans  ocurre  la  segregación  de  proteínas,  donde  se  van  a  vesículas  para  irse  a  los  distintos  destinos  en  la  célula.  Vesículas  transportan  las  proteínas  modificadas  a  las  diferentes  partes.      

Funciones  del  Aparato  de  Golgi:      1.  O-­‐glicosilación      

 

 

 

 

 

2.  Síntesis  de  proteoglicanes  3.  Procesamiento  proteolítico:  Existen  endoproteasas  (enzimas  proteolíticas)  dentro  del  Golgi,  como  las  furinas,  que  cortan  2  aminoácidos  positivos.  Son  distintas  modificaciones  y  procesamiento  de  proteínas.    4.  Modificación  de  enzimas  lisosomales  y  segregación  en  su  transporte:  Proteínas  lisosomales,  sufren  una  modificación  en  donde  un  residuo  de  manosa  es  fosforilado  (manosa  6  fosfato)  y  esto  es  una  marca  que  indica  que  su  destino  final  es  el  lisosoma.  5.  Segregación  de  proteínas  de  acuerdo  a  su  destino  final:  Proceso  que  ocurre  en  el  Trans  Golgi.  En  donde  las  proteínas  se  separan  para  dirijirse  a  su  destino  final,  dependiendo  si  son  enzimas  lisosomales,  secretorias,  regulatorias,  etc.  

 

 

 

 

 

 

 

                 Segregación  proteica  

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                   Proteasa  del  Golgi  

 

Las   N-­‐glicosilaciones  ocurren  en  el  RE  y    las  O-­‐glicosilaciones  en  el  Golgi  -­‐   Se   diferencia   en   que   la  O-­‐glicosilación   es   la   N-­‐acetilgalactosamina   la  que   se  une  a   la   Treonina  por  enlace  covalente.  

Ruta  exocítica  II:  Rutas  de  transporte  en  vías  secretorias  

 

-­‐  Normalmente  los  flujos  son  bidireccionales,  continuos,  regulados  y  se  mantiene  la  integridad  del  organelo.  Proteínas  (residentes)  vuelven  a  su  organelo  de  origen.  Esto  permite  recuperar  las  proteínas  residentes  y  en  el  fondo  evita  la  desaparición  del  organelo.  -­‐  Ruta  exocítica  à  Vesícula  se  fusiona  con  la  membrana  plasmática  y  se  libera  su  contenido  -­‐  Ruta  endocítica  à  Partículas  desde  el  espacio  extracelular  entran  a  la  célula  y  se  forma  una                                                                              vesícula  con  el  contenido  desde  el  extracelular.  -­‐  Esto  no  ocurre  en  forma  espontánea,  es  decir,  no  está  favorecido  termodinámicamente,  se  necesitan  muchas  proteínas  que  ayudan  a  formar  la  yema.      

 

 

   

-­‐  Vesículas  que  recorren  una  mayor  distancia,  requieren  de  proteínas  motoras  asociadas  al  citoesqueleto.  Esto  ocurre  en  el  caso  de  la  neurona,  en  donde  la  vesícula  debe  recorren  un  largo  trayecto  desde  el  Golgi  hasta  la  punta  del  axón,  donde  es  liberado.  -­‐  Las  vesículas  se  forman  y  se  fusionan  con  el  organelo  blanco.  También  existe  un  flujo  retrogrado,  donde  las  proteínas  residentes  regresan  a  su  organelo  de  origen.    Proteínas  de  cubierta:  Proteínas  que  cubren  a  la  vesícula  que  se  va  a  transportar,  son  capaces  de  deformar  la  membrana  para  que  se  forme  la  vesícula  y  participan  en  la  concentración  de  cargas.  -­‐  COP  I:  Cubierta  de  las  vesículas  que  se  originan  en  el  Golgi  durante  el  flujo  retrogrado  y  también  anterogrado  entre  las  cisternas.  -­‐  COP  II:  Cubierta  de  las  vesículas  que  se  originan  en  el  RE  hacia  el  Golgi    

 

 

 

 

   

 Clatrina:    -­‐  Es  una  proteína  formada  por  tres  cadenas  pesadas  y  tres  cadenas  ligeras  que  forman  una  estructura  llamada  triskelio.  -­‐  Las  cadenas  pesadas  interactúan  con  las  proteínas  adaptadoras  y  con  las  cadenas  livianas.  -­‐  Forma  una  red  fibrosa  constituida  por  12  pentágonos  y  8  hexágonos.  36  triskelios  -­‐  Su  función  principal  es  recubrir  las  vesículas  en  el  proceso  de  transporte  entre  membranas  -­‐  Los  triskelios  unidos  a  la  membrana  conforman  una  caja  poliédrica  que  provoca  la  invaginación  de  la  membrana  -­‐  La  clatrina  se  encuentra  alrededor  de  las  vesículas  que  transportan  proteínas  TM,  ligadas  a  la  glicosilfosfatidilinositol(GPI)  y  secretadas  des  del  golgi  hasta  la  membrana  plasmática.    -­‐  Es  importante  en  la  formación  de  vesículas  y  en  el  flujo  retrogrado  de  los  gránulos  de  secreción  inmaduros  de  vuelta  al  Golgi.  También  es  importante  en  la  endocitosis.  -­‐  Funciona  como  un  entramado  proteico  que  no  se  relaciona  directamente  con  las  membranas,  sino  que  hay  proteínas  adaptadoras  que  la  asocian  a  ellas.    Clatrina  y  Transporte  entre  membranas  -­‐  Los  trisqueliones  unidos  a  la  membrana  provocan  la  invaginación  de  esta  membrana  dando  lugar  a  vesículas.  Cuando  se  produce  la  gemación  de  una  vesícula,  la  clatrina  se  desprende  de  su  unión  a  la  membrana.  Una  vez  la  vesícula  está  libre  de  clatrina,  ésta  se  acopla  a  los  late  endosomas,  los  precursores  inmediatos  de  los  lisosomas,  fusionándose  las  membranas  de  ambos.    Relación  entre  la  clatrina  y  la  endocitosis  -­‐  La  endocitosis  es  un  mecanismo  de  la  célula  que  permite  introducir  material  extracelular  dentro  de  la  célula.  Mediante  este  proceso,  las  vesículas  recubiertas  de  clatrina  actúan  para  incorporar  diferentes  moléculas  como  por  ejemplo  LDL.  A  partir  de  la  invaginación  de  una  porción  de  la  membrana  plasmática  son  transportadas  hasta  las  destinaciones  intracelulares.            

   

 

 

COP  I  y  II:  Tienen  capacidad  de  proteínas  adaptadoras,  que  reconocen  las  cargas  para  la  segregación.  -­‐  Una  vez  que  se  forma  la  vesícula  se  pierde  la  cubierta  -­‐  Recordar  que  por  la  difererencias  de  pH,  el  receptor  de  KDEL  reconoce  a  la  chaperona  en  el  Golgi  y  no  antes.  -­‐  A  medida  que  se  avanza  en  sentido  anterogrado,  se  van  acidificando  los  organelos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  En  el  dominio  citoplasmático  de  KDEL  de  la  chaperona,  hay  señales  para  que  se  unan  a  COPII  y  así  viajen  juntas  al  Golgi  (la  chaperona,  junto  a  la  vesícula  y  la  proteína  en  su  interior).    Compartimiento  intermedio  tubular  o  VTCs:  Zona  de  transición  ubicada  entre  el  RE  y  Golgi,  esta  zona  se  fusiona  con  la  cara  Cis  del  Golgi.  Este  compartimiento  recibe  las  vesículas  que  estaban  cubiertas  con  COPII.  -­‐  Alimentado  por  vesículas  anterógradas  desde  RE    y    lugar  de  salida  de  vesículas  retrógradas  con  Cop  I    -­‐  Ruta  anterograda  es  dependiente  de  microtúbulos.  Cuando  se  usan  drogas  como  el  nocodazol  ,  cambia  la  dinámica  de  los  microtúbulos,  con  lo  cual  se  afecta  la  vía  anterograda  desde  el  RE  al  Golgi.  -­‐  Cuando  las  proteínas  llegan  a  la  cara  cis-­‐medial  del  Golgi,  la  manosidasa  saca  manosas.  Comienzan  las  modificaciones  a  medida  que  avancen  por  el  Golgi.    Modelos  propuestos  de  transporte  a  través  del  Golgi  a)  Modelo  de  transporte  vesicular:  Hay  flujo  anterogrado  y  retrogrado  de  vesículas  b)  Modelo  de  maduración  de  cisternas:  Hay  proteínas  muy  grandes  que  no  entran  en  vesículas,  por  lo  que  se  dice  que  se  transportan  por  medio  de  túbulos  y  se  cree  que  las  cisternas  se  van  convirtiendo  de  cis  a  medial  a  trans.  La  cisterna  misma  va  cambiando  su  composición.  Es  una  vía  más  bien  retrograda.  La  formación  de  túbulos  requiere  de  proteínas  ubicadas  en  la  cara  trans.      

 

 

 

 

Rutas  de  transporte  Golgi-­‐endosomas  y  membrana  plasmática  

-­‐  La  segregación  de  proteínas  ocurre  en  la  cara  trans  del  Golgi,  capacidad  de  generar  vesículas  con  distintos  destinos  (lisosomas,  secreción  constitutiva  o  secreción  regulada)  -­‐  Existen  proteínas  que  forman  lisosomas  y  otras  que  forman  gránulos  de  secreción,  estas  últimas  actúan  ante  una  señal  externa,  se  asocian  a  un  aumento  del  Ca+2  y  liberan  sus  gránulos  de  secreción.    Receptor  de  manosa  6  fosfato:  Proteína  de  membrana  que  tiene  en  su  dominio  luminal  un  bolsillo  que  reconoce  a  la  manosa  6  fosfato.  Su  dominio  C-­‐terminal  mira  al  citoplasma  y  se  asocia  a  proteínas  adaptadoras  que  a  su  vez  se  asocian  a  la  clatrina.  -­‐  Los  gránulos  se  producen  desde  el  Golgi  y  por  medio  de  un  ligando  u  hormona  extracelular,  se  produce  una  cascada  de  señalización,  aumenta  el  calcio  y  esto  hace  que  la  proteína  libere  sus  gránulos.  -­‐  La  maduración  de  los  gránulos  es  un  proceso  intrínseco.  La  señal  extracelulares  induce  que  este  gránulo  ya  maduro  se  fusione  con  la  membrana  y  se  liberen.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

   Páncreas  exocrino:  Se  producen  vesículas  secretorias  con  enzimas  digestivas.  

Formación  de  vesículas  de  secreción:  Exocitosis  regulada  

 

 

Gránulos  con  insulina:  Las  células  Beta  del  páncreas  presentan  gránulos  con  insulina.  Estos  gránulos  inmaduros  están  cubiertos  por  clatrina,  cuando  ya  está  maduro  se  observa  un  gránulo  más  concentrado  y  sin  la  cubierta  de  clatrina  -­‐  La  ventaja  de  que  los  gránulos  estén  concentrados  es  que,  en  presencia  de  ligando,  se  liberará  una  gran  cantidad  de  proteínas.  Es  un  sistema  eficiente.  -­‐  Insulina  se  sintetiza  como  un  precursor,  que  luego  formará  insulina  madura.  Para  madurar  sufre  de  modificaciones  como  proteólisis  que  ocurren  en  el  Golgi  (TGN,  Trans  Golgi  network)  -­‐  Este  proceso  es  estimulado  por  glucosa,  la  cual  hace  glicólisis  y  aumenta  el  ATP  en  la  celula  (cambia  la  razón  ADP/ATP).  Se  bloquea  la  salida  de  potasio,  despolarizándose  la  membrana,  lo  cual  estimula  la  entrada  de  calcio.  Esta  entrada  de  calcio  permite  que  las  vesículas  cargadas  de  insulina  se  fusionen  con  la  membrana  y  excreten  su  contenido.  -­‐  Para  que  se  concentre  el  contenido  una  de  las  cosas  que  se  puede  hacer  es  aumentar  la  acidez.  -­‐  Hay  un  canal  de  cloruro  que  esta  inhibido  con  ADP,  con  la  entrada  de  ATP  se  activa,  y  ocurre  la  entrada  de  cloruro  a  la  célula,  aumentando  la  acidez.  -­‐  Esta  señal  de  glucosa,  en  el  fondo,  sirve  para  la  maduración  y  la  secreción  de  los  gránulos.                                                                                                                                  Secreción  regulada  de  insulina                Secreción  de  histamina:  Aparte  de  secretar  proteínas  en  estos  gránulos,  también  se  pueden  secretar  aminas,  como  la  histamina,  la  cual  se  asocia  a  proteoglicanos  para  concentrarse.  Es  otro  tipo  de  secreción  regulada.      

-­‐A  veces  las  mismas  proteínas  tienen  la  capacidad  de  autoagregarse  y  se  van  concentrando  -­‐  Por  otro  lado,  el  gránulo  va  perdiendo  membrana  en  el  flujo  retrogrado  (desde  el  gránulo  al  Golgi)  -­‐También  el  lumen  se  va  acidificando,  esto  favorece  la  agregación.    

                                                                                       Biogénesis  de  Lisosomas  y  Sistema  endosomal  I      Zona  Cis  à  Maquinaria  que  reconoce  enzimas  que  serán  lisosomales  -­‐  Enzima  N-­‐acetilglucosamina  fosfotransferasa  (le  da  especificidad  al  proceso)  y  reconoce  un  parche  proteico  en  la  proteína    que  será  lisosomal.  Agrega  un  grupo  fosfato  con  un  grupo  N-­‐acetilglucosamina  en  la  posición  6  de  la  manosa.  -­‐  Luego  la  enzima  N-­‐acetilglicosidasa  quita  el  grupo  N-­‐acetilglucosamina  -­‐  Cuando  esta  proteína  lisosomal  llega  a  la  zona  trans,  es  reconocida  por  el  receptor  de  manosa  6  fosfato  (proteína  de  membrana  tipo  1).  Se  libera  la  cubierta  y  la  vesícula  se  fusiona  con  el  endosoma  (donde  el  pH  es  más  ácido),  esto  ayuda  a  disociar  la  enzima  lisosomal  del  receptor.    -­‐  A  la  proteína  lisosomal  se  le  elimina  el  grupo  fosfato  una  vez  que  llegó  al  endosoma,  y  de  esa  forma  ésta  no  puede  volver.  -­‐  Hay  vesículas  que  transportan  el  receptor  de  manosa  6  fosfato  de  regreso  al  Golgi  desde  el  endosoma.  Estás  vesículas  tienen  una  cubierta  llamada  retrómero.  

 

-­‐  Este  endosoma  va  a  originar  al  lisosoma,  ya  que  parte  de  su  membrana  se  va  concentrando  y  además  va  concentrando  su  contenido,  originando  el  lisosoma  (los  organelos  van  madurando)  -­‐  Endosoma  temprano,  madura  a  endosoma  tardío  y  éste  genera  un  lisosoma  en  donde  hay  un  pH  muy  bajo  y  es  capaz  de  degradar  moléculas  (Endosoma  no  es  capaz  de  hacerlo).    

Lisosomas:  Concentra  funciones  de  degradación  de  la  célula  (sistema  digestivo  celular).  Pueden  degradar  diferentes  compuestos  que  vengas  desde  el  extracelular,  pero  también  elementos  propios  (endofagia),  en  donde  envuelve  a  los  organelos  defectuosos  en  una  membrana  y  los  degrada.      

-­‐  Degrada  macromoléculas  de  todos  los  tipos:  Proteínas,  Acidos  Nucleicos,  Carbohidratos,  Lípidos,  varios  ésteres.  -­‐    Organelos  digestivos:  recambio    -­‐  50  enzimas  hidrolíticas            •  Para  todas  las  clases  de  macromoléculas            •  Productos  de  bajo  PM  pasan  al  citosol            •  Todas  funcionan  con  un  pH  óptimo  ácido(4.6)  Hidrolasas  acidas:  Activas  a  pH  5  (dentro  del                      lisosoma,);  Inactivas  si  se  liberan  al  citosol  (pH  7.2)  -­‐  Bomba  de  H+  para  generar  pH  contra  concentración    -­‐  Membranas  contienen  proteínas  especializadas:  Altamente  acídicas  y  Altamente  glicosiladas  (ambas  características  protege  a  las  enzimas  lisosomales  de  la  hidrólisis)        

 

 

 

 

 

 

 

Sorting  Defectuoso  Causa  Enfermedad  

1.  Enfermedad  de  Células  I:  Defecto  genético  -­‐    No  se  adiciona  M6P  a  hidrolasas  lisosomales  en  fibroblastos  -­‐  Las  enzimas  se  secretan  desde  la  célula,  lisosomas  no  funcionales.  -­‐  Acumulación  de  inclusiones  (I-­‐cell)  

2.  Enfermedad  de  Tay  Sach  -­‐    Enfermedad  de  acumulación  lisosomal,  debido  a  una  mutación  en  la  enzima    B-­‐N-­‐hexosaminidase-­‐A*  -­‐  Acumulación  de  glicolípidos  sin  degradar  dentro  del  lisosoma  -­‐  Encontrado  en  neuronas  del  SNC  

 

 

 

-­‐   Cuando   la   N-­‐acetilglucosamina   fosfotransferasa   está  mutada  y  las  enzimas  lisosomales  no  sufren  su  modificación,  éstas   no   irán   hacia   el   lisosoma,   aunque   sí   pueden   ser  secretadas.  Cuando  esto  falla,  se  crearán  menos  lisosomas  y  ocurrirá   una   acumulación   de   elementos   a   ser   degradados,  generando   diferentes   enfermedades.      -­‐   Cuando   fallan   lipasas,   proteasa,   etc   se   producen   algunas  enfermedades   específicas.    

Fosfatidilinositol:  Es  importante  para  darle  la  identidad  a  las  diferentes  membranas,  para  el  trasnporte  y  su  función.  -­‐  Recluta  la  maquinaria  de  transporte  y  señalización  -­‐  Cada  inositol  tiene  la  capacidad  de  reclutar  diferentes  proteínas.  -­‐  Quinasas  y  fosfatasas  agregan  y  quitan  grupos  fosfatos,  generando  distintos  inositoles  -­‐  El  4,5  es  el  que  está  normalmente  en  la  membrana  citoplasmática  -­‐  El  IP3  es  el  que  está  normalmente  en  las  membranas  de  los  endosomas,  en  donde  es  capaz  de  reclutar  varias  proteínas,  entre  ellas  el  retrómero.  -­‐  Existen  proteínas  adaptadoras  que  se  unen  específicamente  a  los  distintos  inositoles.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ruta  exocítica  III:  Maquinaria  de  transporte  vesicular  

Etapas  en  el  transporte  vesicular  de  proteínas:  1.  Formación  de  la  cubierta:  Reclutamiento  de  proteínas  citosólicas,  selección  de  carga,  deformación  de  membrana,  yemación,  fisión  (liberación  de  la  vesícula).  2.  Liberación  de  cubierta:  hidrólisis  de  GTP  y/o  ATP  3.  Reconocimiento  de  membrana  blanco  y  anclaje  4.  Fusión  de  membranas  

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐  Durante  la  formación  de  la  vesícula  ninguno  de  los  procesos  es  espontáneo    GTPasas:  *Recordar  que  al  inicio  de  la  traducción  (cuando  el  RNAm  unido  a  su  ribosoma  entra  al  RE),  el  SRP  y  su  receptor  SRP  tenían  actividad  GTPasa.  -­‐  También  existen  GTPasas  que  tienen  relación  con  la  formación  de  la  cubierta  y  que  regulan  el  proceso  de  transporte  en  diferentes  etapas.  -­‐  Son  proteínas  que  tienen  una  conformación  diferentes  si  están  unidas  a  GTP  o  GDP,  esto  hace  que  puedan  interactuar  con  efectores  distintos.  -­‐  Cuando  están  unidas  a  GTP  son  capaces  de  reclutar  las  proteínas  de  la  cubierta  para  formar  la  vesícula  que  será  posteriormente  transportada  -­‐  Primero  se  forma  una  yema,  se  rompe  el  cuello  por  una  proteína  específica  llamada  dinamina,  y  así  se  formará  la  vesícula.  -­‐  Una  vez  que  se  forma  la  vesícula,  esto  activa  la  propiedad  GTPasa,  entonces  habrá  hidrólisis  de  GTP  en  GDP,  soltándose  la  cubierta  (la  cual  se  unía  gracias  al  GTP).  La  vesícula  se  libera  rápidamente  al  hidrolizarse  el  GTP.    A  veces,  experimentalmente,  se  asocian  análogos  de  GTP  no  hidrolizables  para  que  la  cubierta  dure  más  tiempo  rodeando  la  vesícula.  -­‐  Clatrina  à  no  es  un  adaptador,  pues  no  es  capaz  de  interactuar  directamente  con  la  membrana,  sino  que  requiere  adicionalmente  de  proteínas  adaptadoras  para  hacerlo.  No  así  COP  I  y  II.  -­‐  GTPasas  pequeñas:  reclutan  cubierta,  modifican  indirectamente  composición  lipídica.  

Favoreciendo  la  fisión,  favorecen  el  proceso  de  segregación  de  la  carga    

 

Proteínas  participantes  en  las  distintas  etapas:  

1.  Proteínasde  Cubierta:  Clatrina,  Adaptadores  (complejosAP1,  AP2,  AP3,  AP4),  GGAs  (en  Golgi),  Retrómero,  Coatómeros  (COP-­‐I,  COP-­‐II)  2.  Receptores  para  la  carga  y  la  cubierta  3.  Proteínas  de  anclaje:  Etapa  de  reconocimiento  4.  SNARES:  fusión  de  membrana  5.  Rabs:  Regulación  del  proceso  a  varios  niveles    Transporte  anterógrado  entre  RE  y  Golgi:  vesículas  con  COPII  y  sar1p  Transporte  retrógrado  entre  Golgi  y  RE:  vesículas  con  COPI  y  ARF  Transporte  entre  cisternas  de  Golgi  :  vesículas  con  COPI  y  ARF  Transporte  entre  Golgi  y  sistema  endosoma/lisosoma:  vesículas  con  clatrina,  ARF/AP1  o  GGAs  Transporte  entre  endosoma  y  aparato  de  Golgi:  Cubierta  “retrómero”  Transporte  entre  Golgi  y  membrana  plasmática:  Menos  caracterizado    COP  I  à  Transporte  de  proteínas  entre  Golgi  y  RE  (Retrógrado)  y  entre  las  cisternas  del  Golgi  (anterogrado)  COP  II  à  Transporte  de  proteínas  de  membrana  y  secreción  entre  RE  al  Golgi    *  Las  vesículas  con  clatrina  son  aquellas  que  salen  desde  el  Golgi  hacia  los  endosomas  y  aquellas  destinadas  a  la  membrana  plasmática  que  son  de  secreción  regulada  *  Las  partículas  con  coatómero  (COP  I  y  II)  son  aquellas  que  están  entre  RE  y  Golgi  y  además  se  cree  que    COP  I  forma  la  cubierta  de  aquellas  vesículas  que  salen  desde  el  Golgi  hacia  la  membrana  plasmática,  pero  con  secreción  constitutiva.    Vesículas  con  COP  II  desde  el  RE  al  VTC:  -­‐  Primero  la  proteína  sar1  (GTP  asa)  debe  activarse,  para  ella  se  usa  la  proteína  GEF  llamada  Sec12  que  se  encuentra  en  la  membrana  del  RE  (es  una  GEF  que  sólo  se  encuentra  en  el  RE,  es  por  esto  que  la  Sar1  sólo  se  activará  en  el  RE).  -­‐  Cuando  Sar1  está  con  GTP  será  capaz  de  reclutar  a  las  primeras  proteínas  que  formarán  la  cubierta    -­‐  Primero  se  recluta  a  Sec23/Sec24,  son  las  primeras  en  asociarse  para  formar  complejo  COP  II,  éstas  son  las  encargadas  de  comenzar  a  concentrar  la  carga.  -­‐  Sec  24  tiene  un  bolsillo  que  es  capaz  de  interactuar  con  la  carga  (proteína  a  ser  transportada)  -­‐  Luego  se  recluta  Ser13/Ser31  que  son  las  que  formarán  la  vesícula  en  sí.  Deforman  la  membrana  y  además  están  asociadas  a  la  actividad  GTPasa  que  se  produce  una  vez  formada  la  vesícula,  gracias  a  esto  se  suelta  la  cubierta.  -­‐  Luego  Sec16  también  se  asocian  al  complejo  -­‐  Las  Snare  se  incorporan  en  las  vesículas  en  formación.  

 

-­‐  El  reclutamiento  de  las  diferentes  proteínas  es  secuencial    -­‐  Se  cree  que  el  fenómeno  de  salida  es  activo,  es  decir,  hay  señales  en  las  proteínas  que  serán  transportadas  que  son  reconocidas  por  el  receptor.  Carga  es  seleccionada  al  expresar  alguna  señal  e  interactúa  con  la  maquinaria  de  formación  de  la  vesícula.  -­‐  Túbulos  derivados  del  RE  son  intermediarios  en  el  proceso  de  transporte  

       

 

 

 

 

 

Algunas  Patologías  asociadas  a  la  ruta  secretoria  dependiente  de  la  maquinaria  de  COP  II    1.  Enfermedad  de  retención  de  quilomicrones(CRD)  y  Enfermedad  de  Anderson:  Poco  frecuentes,  autosómica  recesiva,  caracterizada  por  Diarrea  crónica,  fallas  en  el  desarrollo,  hipocolesterolemia.  Mutaciones  en  gen  sar1b,  que  codifica  para  la  GTPasa  Sar1b  (subtipo  de  Sar1).  Pacientes  retienen  partículas  lipoproteicas  intestinales,  deficiencia  de  vitaminas  liposolubles  (ejemplos,  vitaminas  E  y  A).  Al  estar  mutado  Sar  1,  no  se  reclutarán  las  proteínas  de  la  cubierta  y  por  ende  no  se  formará  la  vesícula.    2.  Defectos  se  asocian  a  mutaciones  o  ausencias  de  componentes  de  COPII  (Sec  23,  24,  13  y  31),  con  acumulación  de  colágeno  II  en  retículo,  defectos  en  la  secreción  de  elementos  de  la  matriz  extracelular  de  fibroblastos  y  condrocitos.  En  el  desarrollo  de  pez  cebra,  se  ven  defectos  en  la  condrogénesis  craneofacial.                            

Vía  retrógrada  Golgi  –  RE  e  intracisternas  del  Golgi,  vesículas  con  COP  I:  -­‐  A  diferencia  de  las  vesículas  COP  II,  en  este  caso  la  cubierta  se  recluta  a  la  membrana  en  bloque  una  vez  activada  la  GTPasa  pequeña  llamada  Arf1…  -­‐  Las  cubiertas  de  estás  vesículas  están  formadas  por  Arf  1(GTPasa),  coatómero  (complejo  de  7  proteínas)  y  proteínas  de  membrana  que  reclutan  el  coatómero.  -­‐  Arf1  es  una  proteína  que  tiene  una  modificación  lipídica  (ác.graso),  está  miristpilada  (por  ácido  mirístico),  esta  modificación  le  permite  interactuar  con  la  membrana  del  Golgi,  pero  de  manera  débil.  -­‐  Hay  una  proteína  GEF  (intercambiador  GDP/GTP),  que  activa  a  la  Arf1  y  hace  que  esta  pueda  interactuar  de  manera  más  fuerte  con  la  membrana  y  así  recluta  a  las  proteínas  de  cubierta  para  formar  COP  I.        

 

 

 

 

 

 

 

Brefeldin  A  (BFA):  Hongo  que  bloquea  a  las  GEF    y  por  ende  no  se  forma  la  vesícula,  pues  siempre  la  GTPasa  (Arf1)  estará  unida  a  GDP,  es  decir,  inactiva  y  no  podrá  reclutar  a  las  proteínas  de  la  cubierta.  

Etapas  en  la  formación  de  vesículas  con  COP  I:    1.  Formación  de  la  cubierta:  Reclutamiento  de  proteínas  citosólicas,  selecciónde  carga,  deformaciónde  membrana,  yemación.  2.  Fisión  (liberación  de  la  vesícula).  3.  Liberación  de  cubierta:  hidrólisis  de  GTP      Transporte  retrógrado  desde  cis  Golgi  al  retículo:  Reciclaje  y  recuperación  de  proteínas  de  retículo  -­‐  Receptor  de  KDEL  en  el  Golgi  reconoce  proteína  chaperona  con  su  señal  KDEL  (señal  de  4  aa:  lys,  Ac.  Asp,  Ac.glu,  leucina,  ubicados  en  el  C-­‐terminal  de  proteínas  residentes)    soluble  en  el  lumen  del  Golgi,  se  une  a  su  receptor  y  esta  unión  es  reconocida  por  la  cubierta  COP  I  y  de  esa  forma  se  devuelve  la  chaperona  regresa.  Sirve  para  proteínas  residentes  luminares  del  RE  como  BIP,  

RAP  y  otras  -­‐  Proteínas  de  membrana  residentes  de  RE  que  reciclan  tienen  secuencia  en  su  dominio  citoplásmico  del  tipo  KKXX  reconocido  por  la  cubierta  COP  I    

Etapas  finales  en  el  transporte  vesicular:  Anclaje  y  fusión    

 

 

 

 

 

 -­‐  Las  proteínas  de  anclaje  dan  la  especificidad.  -­‐  La  fusión  de  membranas  no  es  un  proceso  espontáneo  y  es  asistido  por  proteínas  Snares  Snares:  Proteínas  de  fusión.  Hay  una  V-­‐snare  (vesicular)  y  una  T-­‐snare  (target)  que  está  en  la  membrana  del  organelo  aceptor.  Estos  snares  se  unen  fuertemente,  forman  alfa-­‐hélices  muy  resistentes  y  estables  y  cuando  se  acercan  liberan  energía  que  es  utilizada  para  unir  y  fusionar  las  membranas.  -­‐  Para  soltar  la  interacción  tan  fuerte  entre  T-­‐snare  y  V-­‐snare  se  requiere  de  ATP  (hidrólisis  de  ATP)  y  se  reciclan  (para  unirlos  no  requiere  ATP  pues  el  complejo  por  si  sólo  libera  energía)  

Proteínas  Rab:  Proteínas  que  modulan  el  acercamiento  de  las  snares,  al  interactuar  con  proteínas  de  anclaje.  -­‐  Rab  es  una  GTPasa  que  normalmente  está  inactiva  unida  a  GDP,  ya  que  se  asocia  a  una  proteínas  GPI    (Inhibidor  del  intercambio  de  GDP  por  GTP),  que  la  mantiene  inactiva.  -­‐  Entonces,  para  que  se  active  la  Rab  aparte  de  que  se  active  una  GEF  que  agregue  el  GTP,  se  disociar  la  GPI  del  complejo.  -­‐  Rab  modula  la  eficiencia  del  proceso  en  diferentes  etapas.  -­‐  Si  Rab  siempre  estuviera  unida  a  GTP  se  alteraría  todo  el  tráfico  (se  formarían  organelos  más  grandes)      

 

 

 

 

Funciones  reguladoras  de  las  Rabs,  pueden  ser  directas  o  indirectas  tales  como:  1)  Facilitar  el  proceso  de  yemación  de  vesículas.  2)  Asociación  de  vesículas  al  citoesqueleto  (transporte  de  vesículas).  3)  Reclutar  complejos  de  anclaje  y  facilitar  el  anclaje  de  la  vesícula  a  la  membrana  blanco  (hace  más  específico  el  evento  posterior  de  fusión).    4)  Facilitar  el  apareamiento  de  SNAREs.  

Fusión  homotípica  en  la  formación  de  organelos:  Fusión  de  vesículas  iguales,  con  v-­‐y  t-­‐snares,  que  generan  organelos  como  VTC  (entre  RE  y  Golgi),  endosomas  tempranos.      

 

 

 

 

Rutas  de  transporte  Golgi  -­‐  endosomas  y  Membrana  Plasmática  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Secreción   Constitutiva:   Las   moléculas   se  secretan  en  forma  automática,  la  producción  de   proteínas   es   continua   y   el   producto   se  descarga   apenas   es   elaborado.   Ej   en   la  secreción   de   colageno   por   el   fibroblasto.    Secreción   Regulada:   La   síntesis   en   más   o  menos   continua,   el   producto   secretorio   es  almacenado   en   el   citoplasma   en   gránulos  especiales   cuyas   membranas   poseen  características   particulares   provistas   por   el  golgi   que   hacen   que   nunca   sean   exocitados  en   ausencia   de   un   estimulo   especifico.    Proteínas   lisosomales:   Destinadas   a   los  lisosomas,   se   forma  un  Endosoma  temprano  y   luego   tardío   y   este   último   forma   el  lisosoma.   Vesículas   cubiertas   con   clatrina,  Arf1*  y  AP1  

-­‐  Ruta  Golgi-­‐Endosoma  tardío/lisosoma:  vesículas  cubiertas  con  clatrina    -­‐  Ruta  Endosomas  -­‐Golgi:  Cubierta  “retrómero”    

Complejos  adaptadores:  Son  4  complejos  proteícos  -­‐  AP  1:  Se  asocia  a  vesículas  cubiertas  con  clatrina  desde  el  Golgi  -­‐  AP  2:  Participa  en  endocitosis,  también  son  vesículas  cubiertas  con  clatrina  -­‐AP  3  y  4:  Tienen  funciones  menos  conocidas  

-­‐  AP  1  y  2  tienen  subunidades  pesadas  y  livianas.  Las  pesadas  son  las  que  interactúan  con  la  clatrina,  con  las  proteínas  que  serán  transportadas,  con  los  lípidos  de  la  membrana  y  con  otras  proteínas  -­‐  Son  proteínas  de  andamiaje,  que  modulan  la  interacción  con  otras  proteínas  y  moléculas.  

   

 

 

 

 

 

Adaptadores  monoméricos  GGAs:    -­‐  Entre  Golgi  y  Endosomas  -­‐  Tienen  un  dominio  de  interacción  con  la  cadena  pesada  de  la  clatrina,  interactúa  con  la  Arf1    GTPasa  que  estaba  ubicada  en  el  Golgi  y  reconocen  secuencias  de  aminoácidos  ácidos  de  las  proteínas  que  van  a  transportar  (como  receptores,  un  ejemplo  de  receptor  sería  el  M-­‐6-­‐P)    

   

 

 

 

 

 

Formación  de  vesículas  cubiertas  con  clatrina:    

   

 

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

Dinamina:  Proteína  que  rompe  el  cuello  para  que  se  produzca  la  fisión  y  se  suelte  la  vesícula  de  la  membrana  de  origen  (no  se  requiere  en    COP  II)  -­‐  Corresponde  a  otra  proteína  GTPasa,  al  estar  unida  a  GTP  rompe  el  cuello  y  se  produce  la  fisión  o  rotura  -­‐  Es  importante  en  aquellas  proteínas  que  tienen  mucho  colesterol,  ya  que  en  estos  casos  es  más  difícil  que  se  produzca  la  fisión.  -­‐  Mutantes  de  dinamina  (análogos  de  GTP  no  hidrolizable)  bloquean  la  fisión,  entonces  no  se  produce  la  rotura  y  se  acumulan  muchos  cuellos  

 

 

 

 

 

 

Hay   una   señal   peptídica   (secuencia   de   aminoácidos)   en   el  dominio  citoplasmático  del  receptor  (podría  ser  el  receptor  de  M-­‐6-­‐P)   el   cual   está   unido   a   su   ligando  por   dentro   o   hacia   el  lumen   del   organelo.   Esta   señal   permite   que   el   receptor  interactúe   con   proteínas   adaptadoras   y   éstas   a   su   vez  interactúan  con  la  clatrina,  formándose  la  cubierta.  

Complejo  adaptador  “Retrómero”  que  media  transporte  vesicular  entre  endosoma-­‐TGN    

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-­‐ Si  se  altera  la  dinámica  de  los  microtúbulos  se  afecta  el  transporte  de  vesículas,  tanto  del  RE  al  Golgi,  como  del  Golgi  a  la  Membrana  plasmática  (vía  anterograda)  -­‐  Microtúbulos  son  importantes  durante  todo  el  procesos  de  transporte  vesicular.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

El  retrómero  posee  varias  proteínas  que  reconocen  el  IP3,  el  cual  es  muy  abundante  en  la  membrana  del  Endosoma  temprano.  -­‐  Lípidos  junto  con  proteínas  modulan  y  regulan  la  identidad  de  los  organelos.  

Endocitosis:    Funciones:  1.  Incorporación  de  Nutrientes  2.  Limpieza  3.  Regulación  de  respuestas  activadas  por  ligandos/señalización  4.  Inmunidad  5.  Infección  viral  

¿Cómo  la  célula  internaliza  las  moléculas  y  otras  células?  Existen  3  grandes  tipos  de  endocitosis,  se  diferencian  en  la  maquinaria  que  utilizan  para  la  internalización.  1.  Pinocitosis:  Beber  celular,  es  constitutivo.  Se  internalizan  líquidos  y  partículas  pequeñas  como  neurotransmisores.    Es  la  más  inespecífica,  endocita  fluidos  y  depende  de  las  moléculas  que  existan  en  el  LEC  en  ese  minuto,  es  poco  selectivo.  Se  deforma  la  membrana  y  se  producen  filopodios,  ocurre  la  protrusión  de  la  membrana  (proceso  de  extensión  de  la  membrana)  2.  Fagocitosis:  Es  el  comer  celular.  Se  endocitan  bacterias,  las  cuales  tienen  moléculas  que  son  reconocidas  por  los  receptores.  La  membrana  se  deforma,  cambia  el  citoesqueleto  de  actina  para  generar  proyecciones  y  cambian  los  PI  (se  genera  PI3  por  la  PI3  kinasa,  el  cual  favorece  la  fagocitosis).  Se  produce  un  fagosoma,  el  cual  se  fusiona  posteriormente  con  el  lisosoma  -­‐  Actúan  macrófagos  y  neutrófilos  -­‐  Es  un  proceso  gatillado  por  la  interacción  de  la  partícula  a  fagocitar  y  receptores  en  la  célula.  3.  Endocitosis  mediada  por  receptores:  Cuando  llega  el  ligando,  su  receptor  se  endocita  unido  a  él.  Es  la  forma  más  específica  de  endocitosis.  Se  generan  vesículas  cubiertas  por  clatrina,  dinamina  corta  el  cuello  y  posteriormente  la  vesícula  se  fusiona  con  el  Endosoma  temprano,  para  que  ocurra  la  fusión  debe  haberse  desprendido  la  cubierta  de  clatrina.  

 

 

 

 

 

 

Etapas  en  el  proceso  de  fagocitosis:    

 

 

 

Activación   de   RHO   GTPasas  llevan  a  cambios  locales  en  PIPs  y  polimerización  de  actina.  

Distintas  vías  de  Entrada  a  la  Célula  por  eventos  de  internalización  de  membrana    

 

 

 

 

 

 

 

 Endocitosis  mediada  por  cavéolas:  Las  cavéolas  son  dominios  de  la  membrana  ricos  en  glicoesfingolípidos  y  colesterol  (Balsas  lipídicas).  Además  tienen  una  proteína  llamada  caveolina,  la  cual  es  una  proteína  integral  de  membrana,  no  es  una  cubierta.  Este  tipo  de  endocitosis  siempre  requiere  de  dinamina.  -­‐  Las  vesículas  de  caveolina  son  más  pequeñas  y  después  de  fusionarse  con  el  Endosoma  temprano,  se  recicla.  Las  vesículas  de  caveolina  no  requieren  de  cubierta,  pues  las  cavéolas  al  tener  mucho  colesterol  les  otorgan  rigidez.  

 -­‐  Caveosomas:  Agregados  de  vesículas  con  caveolina,  se  fusionan  con  el  Endosoma  sin  perder  la  caveolina.  -­‐  Hay  endocitosis  clatrina  y  caveolina  independientes  y  pueden  usar  o  no  dinamina  -­‐  Determinados  tipos  de  virus  (SV40  y  respiratorio  sincicial)  se  endocitan  mediante  caveolas.  El  virus  interactúa  con  la  membrana  plasmática,  hay  un  cambio  en  el  citoesqueleto  de  actina  y  se  forma  la  vesícula  con  caveolina.  A  veces  estas  vesículas  se  fusionan  directamente  con  el  RE  generando  muchas  proteínas  virales.  -­‐  Dominantes  negativos  de  caveolina,  donde  la  vesícula  no  se  podrá  formar  (no  habrá  fisión)    

-­‐  Receptores  tienen  la  capacidad  de  moverse  a  través  de  la  membrana,  esto  les  permite  moverse  a  zonas  de  la  membrana  ricas  en  caveolina  y  así  se  produce  la  endocitosis  mediada  por  cavéolas.  -­‐  Patching:  acumulación  de  receptores  en  una  zona  determinada  de  la  membrana  plasmática.  -­‐  Unión  ligando-­‐receptor  se  da  frente  a  condiciones  específicas,  como  pH  -­‐  A  medida  que  se  endocita  una  partícula,  los  compartimientos  por  los  q  pasa  se  van  acidificando.  -­‐  LDL  y  su  receptor  de  LDL  tienen  más  afinidad  a  pH  fisiológico  (7)  à  se  endocita  vía  clatrina  -­‐  En  el  lisosoma  la  interacción  ligando  receptor  casi  no  existe  (pH  es  muy  ácido)  

 

 

3  Vías  endocíticas  mediadas  por  receptores:  caveolina,  clatrina  y  caveolina-­‐clatrina  independientes.  Todas  se  fusionan  en  el  Endosoma  temprano,  este  se  va  al  Endosoma  tardío  y  luego  se  degrada  en  el  lisosoma.  

 

 

Curva   A:   Unión   especifica   e   inespecífica   de   ligando  marcado.  Experimental  .  Curva   C:Ligando   marcado   pero   en   presencia   de   100  veces   de   exceso   de   ligando   sin   marca   saturando   los  receptores   (finitos).   El   ligando  marcado   se   une   a   los  sitios  inespecíficos.  Experimental.    Curva  B:  Resulta  de  la  resta  de  las  curvas  A  de  C.  Todo  el  ensayo  se  hace  a  4  grados.  

 

 

En  la  generación  del  gradiente,  participan:  -­‐Bomba  de  H+  (V-­‐ATPasa)  -­‐NHE3  -­‐Transportador  de  Cl-­‐  

 

Clases  de  endocitosis  

Clase   Ligandos   Generalidades  I   LDL,  insulina,  M6P,  fibronectina,  interferon,     Receptores  reciclan,  pero  no  

unidos  a  su  ligando  II   Transferrina   Receptor  recicla  unido  a  su  

ligando  III   EGF,  NGF,  Glucagón,  Insulina,  GH,  GC,  TSH,  

Interleuquinas.  Receptor  se  degrada  y  no  recicla  

IV   IgA,  IgG,  insulina,  EGF,  fibronectina   Receptor  hace  transcitosis    

Clase  I:  -­‐  Receptor  de  LDL  -­‐  LDL  (ligando)  tiene  componentes  tanto  proteicos  como  lipídicos  -­‐  Cuando  receptor  se  une  a  LDL  se  forma  vesícula  con  clatrina  y  ésta  se  va  a  un  Endosoma  temprano  donde  el  ligando  se  desprende  de  su  receptor.  -­‐  Recepotor  vuelve  a  la  membrana  plasmática  (reciclaje).  Señales  en  la  C-­‐terminal  del  receptor  hacen  que  se  reconozca  por  otras  maquinarias  que  hacen  que  se  recicle.  -­‐  Ligando  sigue  su  ruta  degradativa  hacia  el  lisosoma  -­‐  Cuando  hay  deficiencias  en  receptores  de  LDL  ocurren  hipercolesterolemias.  Mutación  en  el  receptor,  es  una  patología  hereditaria  en  donde  habrá  mucho  nivel  plasmático  de  LDL.  Síntomas:  Santomas  (acúmulos  de  grasa),  arteriosclerosis  (lleva  a  infarto).  Habrá  problemas  en  la  liberación  del  LDL  de  la  sangre.  

   *  Si  se  muta  la  región  para  el  reciclaje,  el  receptor  de  LDL  no  volverá  a  la  membrana,  por  lo  que  habrá  menos  receptores  en  ella  y  el  LDL  se  endocitará  menos  y  se  acumulará.  

 

 

A.  Receptor  de  LDL  se  une  a  su  ligandos  LDL,   se   recubre   de   clatrina   y   se  endocita.    B.   Receptor   mutado   no   es   capaz   de  reclutar   clatrina,   no   se   forma   la  vesícula,   LDL   no   se   endocita   y   se  acumula.  *   Receptor   de   LDL   tiene   su   C-­‐terminal  hacia   el   citoplasma   y   su   N-­‐terminal  hacia  el  LEC.  Tiene  una  región  que  une  el  ligando  y  otra  región  de  reciclaje.  

 

Orden  en  que  ocurren  las  cosas:  ¿Cómo  se  crea  una  vesícula?  1.  Unión  de  ligando:  reclutamiento  de  receptores  2.  Yemación  3.  Fisión  4.  Cubierta  

 

 

 

Clase  II:  -­‐  Receptor  de  Transferrina  -­‐  Receptor  en  la  membrana  une  ferro-­‐transferrina  (Transferrina  unida  a  Fe),    se  forma  la  cubierta  de  clatrina  (mediada  de  adaptadores  AP2)  y  se  endocita.  Cuando  la  vesícula  llega  al  Endosoma  temprano,  el  receptor  no  se  desprende  del  ligando,  el  cual  ahora  es  apotransferrina  (liberó  el  Fe),  entonces  ligando-­‐receptor  se  reciclan  juntos.  Por  medio  del  Endosoma  de  reciclaje  (fragmentos  del  Endosoma  temprano)  -­‐  La  apotransferrina  (sin  unir  Fe)  a  pH  7  no  es  capaz  de  endocitarse  por  su  receptor  como  lo  hace  la  ferro-­‐transferrina.    

   

 

 

Clase  III:  -­‐  Es  la  vía  clásica  o  más  común,  en  donde  actúan  receptores  con  actividad  quinasa  -­‐  Ligando  unido  a  su  receptor  internaliza,  desatan  cascadas  de  señalización  intracelular.  -­‐  Se  degradará  tanto  el  receptor  como  el  ligando  (no  se  reciclan)  

 Clase  IV:  -­‐  Receptores  hacen  transcitosis  -­‐  Para  que  ocurra  la  transcitosis  debe  haber  una  célula  que  tenga  una  polaridad,  es  decir,  dominios  de  membrana    con  componentes  diferentes  a  otro.  -­‐  Ej:  Célula  epitelial  tiene  dominios  que  exponen  diferentes  receptores  dependiendo  si  se  trata  de  la  cara  apical  (rosada)    o  basolateral  (verde)  -­‐  Esta  polaridad  se  mantiene  por  interacciones  célula-­‐célula  como  tight  junctions  

 

-­‐  Transcitosisà  Si  un  receptor  en  la  cara  apical  une  ligando,  se  endocita,  y  la  vesícula  llegará  a  Endosoma  temprano  y  se  libera  el  ligando  en  la  cara  basolateral  de  la  célula.  El  receptor  se  puede  degradar  o  reciclar  nuevamente  hacia  la  cara  apical  de  donde  vino.  -­‐  La  transcitosis  ocurre  en  células  de  membrana  plasmática  asimétrica  y  depende  de  la  endocitosis  -­‐  A  pH  bajos  no  debiera  degradarse  el  receptor  -­‐  Puede  ocurrir  de  cara  apical  a  basolateral  o  al  revés  -­‐  Receptor  de  Ig  à  Madre  entrega  inmunidad  pasiva  o  innata  a  su  hijo,  esta  inmunidad  se  traspasa  por  medio  de  transcitosis.  Madre  entrega  sus  Inmunoglobulinas  desde  la  sangre  a  su  hijo  y  éstos  por  transcitosis  pasan  al  embrión.  -­‐  También  ocurre  transcitosis  en  el  lumen  intestinal  Adaptadores:  Los  adaptadores  reconocen  la  carga  y  ayudan  al  acoplamiento  de  la  cubierta  de  clatrina  AP1:  Adaptador  ubicado  en  Golgi  para  crear  vesículas  con  clatrina  hacia  el  Endosoma  AP2:  Adaptador  ubicado  en  la  membrana  plasmática  para  endocitar  vesículas  cubiertas  de  clatrina.    Señales  de  internalización:  -­‐  Todos  los  receptores  en  su  porción  citoplasmática  o  intracelular  tienen  una  señal  de  internalización  o  de  endocitosis  en  su  cola  C-­‐terminal,  la  cual  tiene  residuos  de  aminoácidos  aromáticos  (tirosina  y  fenilalanina).  Otros  tienen  motivos  de  leucina  o  bileucina  y  otros  tienen  señales  por  mono  o  multiubiquitinación.  -­‐  Estas  señales  reclutan  adpatadores  (AP2)  y  así  se  formará  la  cubierta  de  clatrina  y  se  internaliza  formándose  la  vesícula  con  ayuda  de  la  dinamina.  -­‐  Por  mutaciones  de  los  aminoácidos  de  estas  secuencias  de  internalización,  se  sabe  si  estas  son  o  no  importante  para  la  endocitosis,  -­‐Debe  haber  coincidencias  de  receptores,  PI,  clatrina  y  AP2  para  que  ocurre  la  endocitosis.  -­‐  Receptor  se  une  a  AP2  y  ésta  se  unirá  a  la  clatrina  -­‐  Dab2  y  ARH  son  moléculas  monoméricas  (sin  subunidades)  que  también  pueden  reclutar  la  clatrina  -­‐  Fisión  de  vesículas  cubiertas  con  clatrina  es  dependiente  de  dinamina  y  de  la  hidrólisis  de  GTP            

   -­‐  Para  que  la  vesícula  se  fusione  posteriormente  con  el  Endosoma,  se  debe  desprender  la  cubierta  de  clatrina,  este  proceso  requiere  de  una  proteína  ATPasa  llamada  Hsc70,  la  cual  al  hidrolizar  ATP  logra  que  se  desprenda  la  cubierta  y  así  se  fusione  con  el  Endosoma.  -­‐  Sinaptojanina:  es  una  proteína  que  ayuda  a  que  cambien  los  fastidilinositoles  -­‐  Endosoma  temprano  es  alimentado  por  la  fusión  de  vesículas  endocíticas  sin  cubierta      

 

 

 

 

 

 

Cuerpos  multivesiculares:  -­‐  Endosoma  tardío  tiene  muchas  funciones,  es  más  que  un  paso  previo  a  la  degradación.    -­‐  A  veces  el  Endosoma  tardío  tiene  cuerpos  multivesiculares  (hexosomas)y  se  ha  visto  que  estas  vesículas  tienen  otros  destinos  más  que  la  degradación.  -­‐  Cuando  una  célula  fagocita  a  una  bacteria,  en  el  Endosoma  tardío  habrán  vesículas  con  fragmentos  de  las  bacterias,  estás  vesículas  saldrán  del  Endosoma  y  se  fusionarán  con  otras  células  (Amplificación  del  sistema  inmune).  Esto  explica  que  hayan  células  que,  sin  haberse  expuesto  directamente  a  una  bacteria,  expresen  sus  fragmentos.    -­‐  Lo  mismo  ocurre  en  el  caso  de  los  tumores.  -­‐  Hay  hexosomas  que  se  liberan  por  la  cara  apical  o  basolateral  de  la  célula.  -­‐  En  el  Endosoma  temprano  se  ubiquitinizan  los  receptores,  esta  señal  quedará  adentro  de  la  vesícula  y  es  una  señal  que  indica  que  se  formen  cuerpos  multivesiculares.  Cuando  estos  cuerpos  mutivesiculares  se  fusionen  con  otra  célula  quedarán  en  su  membrana.  

 

 

 

 

 

 

 -­‐  ESCRT:  Maquinaria  para  llevar  una  carga  determinada  a  cuerpos  multivesiculares.  Son  los  responsables  de  su  formación.  Participan  desde  el  reconocimiento  del  receptor  ubiquitinizado  hasta  que  la  vesícula  se  libere  y  se  fusione  con  otra  célula.  

Escrt  0:  Reconoce  Escrt  I  y  II:  comienzan  la  invaginación  Escrt  III:  forma  anillo  en  la  membrana  para  cerrar  la  vesícula              

 

 

 

   

Participación  de  Fosfatidilinositoles  en  rutas  de  tráfico:  PI  4,5  à  Membrana  plasmática  PI3  à  Endosoma  temprano  Cuerpo  mutivesicular  tiene  PI  3,5  y  las  vesículas  en  su  interior  tienen  PI  3  PI4  à  Golgi  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Endosoma  de  señalización:  -­‐  Hay  otro  tipo  de  Endosoma,  llamado  Endosoma  de  señalización,  los  cuales  están  antes  del  Endosoma  temprano.  -­‐  En  estos  Endosomas,  los  receptores  aunque  estén  dentro  de  la  célula  pueden  seguir  señalizando  intracelularmente  (como  EGF  receptor).  Hay  otros  receptores  que  requieren  endocitarse  para  poder  señalizar.  Luego  de  señalizar,  pasarán  a  un  Endosoma  temprano  y  tardío.  -­‐  Hay  receptores  que  se  encuentran  en  las  dendritas  de  las  neuronas  y  que  para  señalizar  requieren  endocitarse  desde  las  dendritas  y  viajar  por  mcirotúbulos  hacia  el  axón  en  donde  van  a  señalizar.  Endosomas  se  mueven  por  medio  de  proteínas  motoras  como  la  dineína.