RNA 干扰技术

董莹 董翠玲 陈崇波

2006 年诺贝尔生理学或医学奖：美国斯坦福大学 Andrew Z． Fire美国马萨诸塞大学 Craig C．Mello ，以表彰他们发现了 RNAi 现象

什么是 RNAi ？

一、 RNAi 的发现二、 RNAi 的分子机制三、 RNAi 的生物学功能与意义四、 RNAi 试验方法

一、 RNAi 的发现

WT Plant with a pigment transgene

Post Transcriptional Gene Silencing in Petunia

RNAi 的发现

1995 年， Guo S 等试图阻断秀丽线虫（ C.elegans）中的par-1 基因的表达

设计： 反义 RNA 特异性地阻断 par-1 基因的表达 正义 RNA 以期观察到基因表达的增强 结果 : 二者都同样地切断了 par-1 基因的表达途径。这是与传统

上对反义 RNA 技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释

直到 1998 年 2 月， Fire A 和 Mello C 才首次揭开这个悬疑之谜。

他们将体外转录得到的单链 RNA 纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链 RNA 却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。

他们证实， Guo S 博士遇到的正义 RNA 抑制基因表达的现象，以及过去的反义 RNA 技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得 RNA 中污染了微量双链 RNA 而引起。

该小组将这一现象称为 RNA 干扰（简称 RNAi ）。

RNAi概念 RNA 干扰 (RNAi) 是指 dsRNA 在

细胞内特异性地诱导与之同源互补的 mRNA 的降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。

RNAi 特点 转录后水平的基因沉默机制 较高的特异性 抑制基因表达具有较高的效率 有浓度、时间双重依赖性 基因表达的效应可以突破细胞界限

二、 RNAi 的分子机制1. 起始阶段 (the initiation phase)2. 效应阶段 (the subsequent effector

phase)

dsRNA 通过外源导入、转基因或者病毒感染等方式进入细胞后，专一性的双链 RNA 内切酶 Dicer 识别 dsRNA ，在 ATP 的参与下逐步把 dsRNA 切割成长约 21～ 23 nt的片段。

Dicer

siRNA 参与形成 RNA 诱导的沉默复合物 (RISC) ， ATP激活的 RISC在双链 siRNA 的反义链指导下，寻找与 siRNA 具有同源序列的内源靶mRNA ，并在距离 siRNA3’端 12 个碱基的位置切割靶mRNA ，导致转录后基因沉默。

三、 RNAi 的生物学功能与意义

RNAi 的生物学功能抵抗病毒入侵 抑制转座子活动，保护基因组

的完整性调控基因表达清除畸变的 RNA 参与基因组重排

RNAi 的生物学意义

1. 研究功能基因组学的新工具2. 研究信号传导通路的新途径3. 研究发育过程中起作用的基因4. 开展基因治疗的新策略

四、 RNAi 试验方法

1.筛选 RNAi探针2. 制备 siRNAsiRNA 化学合成、体外转录 、用 RNaseⅢ消化长片断双

链 RNA 、 siRNA 表达载体、 siRNA 表达框架3.3. 导入细胞导入细胞 电穿孔法、磷酸钙共沉淀、 DEAE一葡聚糖、 阳离子脂质体试剂4.RNAi4.RNAi 转染效率转染效率 荧光蛋白 (如GFP) 或荧光素酶等报告基因与其共

表达法

Abstract ： In vitro, RNAi is an almost-standar

d method to knockdown any target gene. In viv

o, its effcient delivery and specificity to the tar

get gene challenge its therapeutic application.

Now, many efforts have made to enhance siR

NA delivery and target organ specificity.

In vitro several transfection reagents allow the d

elivery of siRNAs in mammalian cells in the presen

ce or absence of serum

In vivo require the development of more sophisti

cated formulations and/or the identification of opti

mal modes of administration

Therapeutic siRNA molecules

Cancer : Target molecules usually represent genes that have been shown previously to be relevant or rate-limiting for tumor growth

Antiviral treatment : novel RNAi-based approaches to battle viral infections rely on the specific siRNA-mediated knockdown of virus-specific genes

This studies provide valuable insights into the delivery and efficacy of for the induction of RNAi.

Clinical trials ALN-RSV01: target the human RSV after viral infection, wh

ich is the first example of an antivirus siRNA-based therapeutic in a phase clinical study. Ⅰ

Sirna-027: To treat AMD, after 24-month phase II study, It has already used for recruiting patients with AMD.

Cand5: which is now named Bevasiranib,was the first siRNA to enter both phase I and II clinical trials.

Strategies for in vivo siRNA delivery

The advantages of the direct application of siRNAs:

the lower probability on specific side effects

the safety of siRNA delivery is based on nonviral transfe

r strategies

siRNAs can not integrate into the genome

Successful siRNA based gene targeting relies on several preconditions:

Protect the instable siRNA molecules

Efficient cellular uptake and intracellular release into

the cytoplasm

The absence of intracellular immune responses

The formulation of siRNAs in carrier systems ：

Liposomal formulations

Nanoparticles

polyethylenimine (PEI)

It can be considered as examples of nonviral envelopes that protect siRNAs, thus increasing serum stability, reducing renal excretion and mediating siRNA uptake into the cells through endocytosis

nanoparticles with positively charged macromolecules. Based on electrostatic interactions, complexes are formed with atelocollagen chitosan or PEI

PEI/siRNA complexes are good for enhancing tissue specificity and in vivo biocompatibility, reducing immunogenicity and toxicity and increasing siRNA delivery

Conclusion and outlook

A very efficient and specific method for the knockdown

The success of siRNAs will depend on their efficient and

safe in vivo delivery

siRNAs for gene knockdown will be their “double specif

icity”, optimal siRNA sequences and increased target org

an specificity

Thank you for your attention！