Monika Gos Zakład Genetyki Medycznej Instytut Matki i Dziecka, Warszawa „Patologia molekularna wybranych chorób genetycznie uwarunkowanych”, IBB, 28.11.2016

ROLA RODZICIELSKIEGO PIĘTNA GENOMOWEGO W ETIOPATOGENEZIE CHORÓB GENETYCZNIE UWARUNKOWANYCH.

Jak to jest?

http://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/chapter1.aspx

I. II.

czynniki zewnętrzne

ORGANIZM

określona odpowiedź na warunki środowiskowe

1942 – Conrad Waddington – EPIGENETYKA regulacja różnicowania komórek bez zmian w sekwencji DNA

Epigenetyka – mechanizm adaptacyjny?

1944 – klęska głodu

Holandia

kobiety

I trymestr ciąży

kobiety

III trymestr ciąży

prawidłowa masa urodzeniowa;

otyłość i choroby układu krążenia

obniżona masa urodzeniowa;

nadciśnienie i insulinooporność

ekspresja genów odpowiedzialnych za

metabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych

adaptacja do warunków środowiska

warunki stresowe wzrost ryzyka rozwoju depresji i nerwicy

ZMIANY EPIGENETYCZNE SĄ SZYBSZE NIŻ MUTACJE DNA

MECHANIZMY REGULACJI EPIGENETYCZNEJ

metylacja: (wyspy CpG, zahamowanie

ekspresji)

modyfikacje białek histonowych:

acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja (efekt zależny od miejsca i

charakteru modyfikacji)

struktura chromatyny:

gęstość upakowania chromatyny (eu- i

heterochromathna – nieaktywna transkrypcyjnie)

struktury przestrzenne tworzone przez chromatynę

(pętle - TAD) oddziaływanie z kompleksami

białkowymi

niekodujące cząsteczki RNA: małe (<200pz, mikroRNA, snRNA i snoRNA)

i duże (>200pz, lncRNA)

Metylacja DNA

Metylotransferazy DNA

DNMT1 – metylacja DNA hemimetylowanego

DNMT3 – metylacja de novo

Donor grupy metylowej: SAM

Metylacja DNA

METYLACJA = REPRESJA TRANSKRYPCJI

Po zapłodnieniu poziom metylacji w komórkach gwałtownie maleje. Dopiero po kilku dniach rozpoczyna się proces ponownego wzorstu poziomu metylacji, co wiąże

się ograniczaniem potencjału do różnicowania kolejnych komórek potomnych.

W komórkach linii płciowej wzór piętna genomowego jest usuwany, a następnie po mejozie, ponownie odtwarzany, zgodnie z wzorem specyficznym dla płci.

Zmiany poziomu metylacji

Nie wszystkie komórki mają taki sam wzór metylacji…

Wzór metylacji zmienia się w trakcie rozwoju organizmu. Związane jest to m.in. z procesem różnicowania się komórek.

Tylko nieliczne komórki zachowują właściwości komórek macierzystych (Oct4).

Modyfikacje histonów

Nature Structural & Molecular Biology 14, 1017 - 1024 (2007)

Modyfikacje histonów

ACETYLACJA => aktywacja

DEACETYLACJA => represja

UBIKWITYNACJA => aktywacja, mejoza

METYLACJA => aktywacja, represja

FOSFORYLACJA => mitoza, apoptoza,

aktywacja, naprawa DNA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=helpepi&part=epi_sci_bkgrd

H3 Grupa Rola

R2 Me aktywacja

T3 P mitoza

K4 Ac aktywacja

K4 Me aktywacja

R8 Me represja

K9 Ac aktywacja

K9 Me represja

S10 P mitoza

S11 P mitoza

K14 Ac aktywacja

R17 Me aktywacja

K18 Ac aktywacja

K23 Ac aktywacja

R26 Me aktywacja

K27 Ac aktywacja

K27 Me represja

S28 P mitoza

K36 Me aktywacja

K56 Ac aktywacja

K79 Me aktywacja

H4 Grupa Rola

S1 P mitoza

R3 Me aktywacja

R3 Me represja

K5 Ac aktywacja

K8 Ac aktywacja

K12 Ac aktywacja

K16 Ac aktywacja

K20 Me represja

K91 Ac aktywacja

Aktywacja ekspresji genu otwarta struktura chromatyny niemetylowane cytozyny acetylowane histony (HAT)

Zahamowanie ekspresji genu „zamknięta” struktura chromatyny metylowane cytozyny (DNMT) deacetylacja histonów (HDAC)

Modyfikacje a ekspresja genów

Regulacja epigenetyczna

mechanizm nie jest związany ze zmianą sekwencji DNA wzór piętna genomowego musi być utrzymany w tracie podziałów komórkowych i

różnicowania się komórek wzór piętna musi zostać rozpoznany przez aparat transkrypcyjny, tak aby doszło do

ekspresji genu z odpowiedniego allelu jest potencjalnie odwracalne (odwracalność jest warunkiem koniecznym do

ustalenia wzoru piętna genomowego specyficznego dla płci) może mieć charakter losowy (inaktywacja chromosomu X), jak również zależeć od

pochodzenia rodzicielskiego

Zaburzenia lub zmiana regulacji epigenetycznej efekt fenotypowy

Defekty epigenetyczne w ciągu życia a choroby cywilizacyjne

Wraz z wiekiem poza kumulacją mutacji punktowych w organizmie zachodzą także zmiany epigenetyczne

NOWOTWORY

INNE CHOROBY CYWILIZACYJNE

Genetyczno-epigenetyczny model powstawania chorób kompleksowych

1. rozwój choroby zależy od podłoża genetycznego oraz działania czynników epigenetycznych

2. czynnik epigenetyczny (DNA, chromatyna) może być modyfikowany przez czynniki środowiskowe

3. również warianty sekwencji genów odpowiedzialnych za regulację ekpresji genów mogą wpływać na powyższe zmiany

4. Starzenie się proces utraty plastyczności fenotypowej w czasie

cukrzyca, choroby serca, nabyta NI

Epigenetyka a nowotwory

Aktywacja protoonkogenu poprzez zniesienie metylacji

RAF, c-MYC, c-FOS, c-H-RAS

i inne

Inaktywacja supresora nowotworowego poprzez metylację

GSTP1, RB1, APC, CDH1

i inne

Uszkodzenia epigenotypu

CHOROBY EPIGENETYCZNE

nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne

PLoS One. 2012; 7(5): e36708

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

1. choroby dziedziczące się w sposób mendlowski – najczęściej autosomalny (80%) dominujący (wyjątek: 71% chorób związanych z usuwaniem znaczników epigenetycznych – chromosom X); AR – 14% vs. 80% dla IEM

2. białka – składniki kompleksów wielobiałkowych zmiana poziomu/aktywności zaburzenie działania całego kompleksu

3. choroby wieloukładowe, o szerszym spektrum objawów klinicznych niż inne jednostki chorobowe; różna ekspresja fenotypowa trudny do identyfikacji defekt molekularny przed erą sekwencjonowania następnej generacji (NGS)

4. efekt fenotypowy – zmienny, nie dotyczy wszystkich komórek organizmu, a jedynie określonej frakcji komórek, dla których prawidłowego funkcjonowania konieczna jest właściwa aktywność regulatora epigenetycznego konieczność identyfikacji „target genes”

5. efekt fenotypowy – może zależeć także od poza epigenetycznych funkcji białka (np. HDAC8 – zespół Cornelia de Lange – koezynopatia – NIPBL)

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

44 jednostki chorobowe objawy kliniczne: 1. niepełnosprawność intelektualna (prawidłowa regulacja epigentyczna niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania układu nerwowego) 2. zaburzenia wzrastania – niskorosłość lub gigantyzm 3. wady kończyn (nieprawidłowa budowa paznokcia ↔ brachydaktylia) 4. zaburzenia immunologiczne

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

PRZYCZYNA CHOROBY

zaburzenia równowagi stanów transkrypcyjnych chromatyny (aktywny ↔ nieaktywny)

zaburzenia regulacji genów docelowych

Zespół Kabuki (NGS) 1. niskorosłość 2. małogłowie 3. dysmorfia (uszy, ptoza, brwi) 4. wrodzona wada serca (ASD, VSD, koarktacja aorty) 5. niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju psychoruchowego 6. drgawki padaczkowe / hypotonia 7. problemy z karmieniem 8. skolioza, nieprawidłowości w budowie kręgów, nadruchliwość stawów 9. wnętrostwo / wady budowy nerek 10. opuszki płodowe palców 11. CAL, hirsutyzm

KMT2D (MLL2) H3K4me3 aktywny

KDM6A H3K27me3 nieaktywny

↓ ekspresji genów docelowych (1/3 – homologi genów Polycomb i Trithorax – odpowiedź na działanie

czynników zewnętrznych, rytm dobowy, szlak mTOR)

Choroby MECP2-zależne

X-linked, Xq28

MECP2 – białko wiążące się do metylowanych sekwencji CpG

poza domeną wiążącą metylowane DNA (MBD), białko posiada domenę TRD, odpowiedzialną za oddziaływanie z pozostałymi białkami kompleksu hamującego transkrypcję (białka HDAC, metylotransferazy histonowe, inne białka odpowiedzialne za tworzenie heterochromatyny)

mutacje: delecje i m. nonsens w MBD i TRD związane są z objawami neurologicznymi

gen regulowany przez MECP2 – BDNF – czynnik odpowiedzialny za rozwój układu nerwowego (zapobiega apoptozie), różnicowanie komórek progenitorowych oraz procesy pamięci i uczenia się

MECP2

↓ miR-30a/d, miR-381, miR-495 - ↓ BDNF Mecp2 brain knockout – miR-29 i miR-146 (komórki nerwowe i glejowe)

BDNF miR-212, miR-132 ↓ MECP2

Choroby związane z MECP2

Zespół Retta

• głównie dziewczynki (1/10-15 tys.)

• regres rozwoju po okresie

prawidłowego rozwoju

• utrata nabytych umiejętności

posługiwania się rękoma

• regres mowy

• zaburzenia chodu

• stereotypie

• pourodzeniowa mikrocefalia

• zaburzenia oddychania

• chłopcy: encefalopatia

niemowlęca

Zespół duplikacji MECP2

• głównie chłopcy

• NI – ciężka - głęboka

• wczesnodziecięca hypotonia

• opóźniony rozwój motoryczny

• narastająca spastyczność

• predyspozycja do infekcji (75%)

• Napady padaczkowe (50%)

• cechy dysmorfii - dyskretne

• kobiety: nielosowa inaktywacja

chromosomu X

(całkowita lub znaczna)

Zespół ATR-X Zespół Rubinstein-

Taybiego Zespół Coffina-Lowry’ego

ATRX (Xq13.3) CREBBP (16p13.3) RSK2 (Xq22.3)

członek rodziny SWI/SNF;

represja transkrypcji; zmiany

w konformacji chromatyny

CREB binding protein, HAT,

acetylacja H3, oddziaływuje z

regulatorami cyklu

komórkowego c-FOS,

c-JUN

aktywacja białek CREB na

drodze fosforylacji;

fosforylacja histonów (H3S10)

NI głęboka, opóźnienie rozwoju

mowy, drgawki, hypotonia,

dysmorfia; zaburzenia rozwoju

kory mózgowej

NI (umiarkowana do głębokiej),

zaburzenia rozwoju mowy i

poznawczego, impulsywność,

zaburzenia koncentracji, otyłość,

dysmorfia twarzy, spowolnienie

wzrostu, niskorosłość, wady

szkieletu

NI (głęboka u chłopców),

opóźnienie rozwoju mowy,

małogłowie, wady serca,

dysmorfia twarzy, zaburzenia

budowy szkieletu

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS)

Częstość występowania: 1/4000 mężczyzn, 1/8000 kobiet

Częstość nosicielstwa: 1/800 mężczyzn, 1/250 kobiet

Cechy kliniczne (chłopcy z pełną mutacją):

1. opóźniony rozwój mowy i psychoruchowy

2. NI (IQ 30-50)

3. specyficzne cechy dysmorfii

4. zaburzenia psychologiczne (autyzm, ADHD, nadreaktywność)

5. makroorchidyzm

http://medgen.genetics.utah.edu/photographs/pages/fragile_x.htm

Piętnowanie genomowe (GI)

Piętnowanie genomowe, rodzicielskie piętno genomowe

monoalleliczna ekspresja genu zależna od jego rodzicielskiego pochodzenia

46,XX 46,XY

R! ORGANIZM DIPLOIDALNY

każdy gen w dwóch kopiach (zazwyczaj eksprymowany z obu)

HAPLOINSUFICJENCJA (monosomie, 45,X, zespół Marfana)

Rodzicielskie piętno genomowe

– skąd wiemy, że w ogóle istnieje?

Nowotwory embrionalne

Zaśniad groniasty

2n od ojca – polispermia

Potworniak jajnika

2n od matki – włączenie II CK

Rodzicielskie piętno genomowe

mechanizm zapobiegający partenogenezie

Inżynieria genetyczna

zarodki mysie

partenogenetyczne (tylko materiał matczyny)

androgenetyczne (tylko materiał ojcowski)

NIEPRAWIDŁOWY ROZWÓJ ZARODKOWY

Disomia jednorodzicielska

matczyna (mUPD)

7 i 11 – zespół Silvera-Russella

14 – hipotonia, niska postawa ciała, małe dłonie i stopy, zaburzenie rozwoju, otyłość, hiperfagia

15 – zespół Pradera-Williego

20 – zaburzenia wzrostu, nadaktywność

ojcowska (pUPD)

6 – przejściowa cukrzyca noworodkowa

11 – zespół Beckwitha-Wiedemann’a

14 – znaczne opóźnienie wzrostu, osobliwe ukształtowanie czaszki i twarzy, deformacje klatki piersiowej, anomalie ścianki brzucha oraz opóźnienie umysłowe i ruchowe

15 – zespół Angelmana

20 – rzekoma niedoczynność przytarczyc

Geny piętnowane (ok. 150) są odpowiedzialne za:

-rozwój mowy - kształtowanie kontaktów

międzyludzkich - inne fenotypy związane z

zachowaniem

1. organizacja klastrowa 2. eskpresja z allela mat. lub ojc. 3. w obrębie klastra – również geny

dla ncRNA 4. centra regulatorowe 5. piętno może być nałożone na

chromosomie mat. lub ojc.

Dziedziczenie epigenetyczne

I prawo Mendla (prawo czystości gamet) Każda gameta wytwarzana przez organizm posiada tylko jeden allel z danej pary alleli genu. Wynika z tego, że każda komórka płciowa musi zawierać po jednym genie z każdej pary alleli.

II prawo Mendla (prawo niezależnej segregacji cech) geny należące do jednej pary alleli są dziedziczone niezależnie od genów należących do drugiej pary alleli, w związku z czym w drugim pokoleniu potomnym (F2) obserwuje się rozszczepienie fenotypów w stosunku 9:3:3:1

Czy dziedziczenie związane z piętnowaniem genomowym jest wyjątkiem od praw Mendla?

Nie, gdyż cechy dziedziczy się w sposób mendlowski, jedynie jej ekspresja

fenotypowa jest zależna od pochodzenia rodzicielskiego genu….

Piętno genomowe (GI)

46,XX

46,XY

R!

R!

DEFEKTY PIĘTNA GENOMOWEGO – bardzo rzadkie, niemożliwe do naprawienia po zapłodnieniu

(epimutacja pierwotna lub epimutacja wtórna – cis, trans)

R!

46,XX

problemy z usunięciem piętna

R!

46,XX

problemy z nałożeniem piętna

gen eksprymowany z allela pochodzenia matczynego

gen eksprymowany z allela pochodzenia ojcowskiego

46,XX - matka

46,XY - ojciec

CHOROBA EPIGENETYCZNA

CHOROBA EPIGENETYCZNA

brak efektu fenotypowego mężczyzna może przekazać

defekt potomstwu

brak efektu fenotypowego kobieta może przekazać

defekt potomstwu

EFEKT: aktywacja allelu, który powinien być wyciszony wyciszenie allelu, który powinien być aktywny

NIEPRAWIDŁOWA DAWKA EKSPRESJI GENU

ekspresja obu kopii albo brak ekspresji zaburzenia wzrostu i rozwoju organizmu

Dziedziczenie w chorobach epigenetycznych

Defekty GI – mechanizmy powstawania

R! R!

Nie tylko zaburzenia GI w trakcie

gametogenezy mają taki efekt…

Defekty molekularne zaburzające rodzicielskie piętno genomowe delecje regionów zawierających piętnowane geny (w tym translokacje

niezrównoważone) duplikacje regionów piętnowanych (disomie jednorodzicielskie, translokacje

zrównoważone) mutacje punktowe w piętnowanych genach defekty w samym procesie piętnowania, wynikające z: - obecności zmian w centrach regulatorowych (IC), również o charakterze delecji - obecności zmian w genach odpowiedzialnych za ustanowienie piętna

Mozaikowość – defekt piętna genomowego powstający już po zapłodnieniu; obecny w części komórek somatycznych

Mechanizm genetyczny Ryzyko

Delecja <1%

UPD <1%

Defekt imprintingu i mutacja ≤50%

Defekt imprintingu bez mutacji <1%

Translokacja zrównoważona powstała de novo <1%

Odziedziczona translokacja zrównoważona. 25%

Ryzyko genetyczne

Rodzicielskie piętno genomowe

PWS/AS UPD14

SRS BWS/SRS

GNAS

TNDM

Choroba Częstość

występowania ID (%)

Region

chromosomowy

Zespół Pradera-Williego 1/10000 - 1/25000 ≈1 15q11-q13

Zespół Angelmana 1/12000 - 1/20000 ≈4 15q11-q13

Zespół Beckwitha-Wiedemanna 1/15000 ≈60 11p15.5

Zespół Russell-Silver 1/3000 - 1/100000 ≈50 11p15.5,

7p11.2-p13

Przemijająca cukrzyca

noworodkowa typu I 1/400000 ≈30 6q24

Pseudohypoparatyroidyzm Ib ? >90 20q13.11

UPD(14)mat

(zespół Temple) ? ? 14q32

UPD(14)pat

(zespół Kagami-Ogata) ? ? 14q32

Typowe choroby epigenetyczne

Zespół Pradera-Williego

objawy kliniczne: - hipotonia - trudności w karmieniu - nadmierne łaknienie - otyłość - zaburzenia funkcji poznawczych (NI) - specyficzny fenotyp behawioralny - hypogonadyzm - niskorosłość, małe dłonie i stopy - subtelna dysmorfia twarzoczaszki - zez - skolioza

Zespół Angelmana

Kryteria główne (4/4) - znaczne opóźnienie rozwoju - zaburzenia chodu / równowagi - opóźnienie rozwoju mowy - specyficzny fenotyp behawioralny Kryteria dodatkowe (3/6) - małogłowie pourodzeniowe - napady padaczkowe - nieprawidłowy wzór EEG - zaburzenia snu - zainteresowanie wodą / błyskaniem - ślinotok

Choroby epigenetyczne

„La Monstrua „ Juan Carreño de Miranda (1616-1685); Milan, Prada Museum

Eugenia Martinez Vallejo from Carol 2nd royal court

A boy with a puppet Giovanni Francesco Caroto

AS PWS

delecja mat 15q11-q13 delecja pat 15q11-q13

patUPD matUPD

epimutacja IC (brak piętna) epimutacja IC (piętno ++)

mutacja UBE3A delecja SNORD116

Geny kluczowe dla patogenezy PWS i AS

HBII-85/SNORD116

delecja hyperfagia, otyłość,

trudności w uczeniu się,

hypogonadyzm

snoRNA – ncRNA, jąderkowe

Ekspresja w trakcie różnicowania

komórek nerwowych, oraz w

dojrzałych neuronach kory i

podwzgórza

UBE3A

Mutacje AS (6 pts)

E6AP ligaza ubikwityna - białko

Imprinting specyficzny tkankowo

AS model mysi - Ube3a (m-/p+) –

napady padczkowe, nieprawidłowe

działanie przekaźnictwa

dopaminergicznego (L-DOPA)

Zespół Pradera-Willi’ego Zespół Angelmana

Zespół Beckwitha-Wiedemanna

Kryteria główne:

• przepuklina pępkowa

• makroglosja (przerost języka)

• makrosomia (>97th)

• zagięcia na przednim płacie ucha / dołki na

tylnej części

• powiększenie narządów wewnętrznych

• nowotwory germinalne u dzieci

• hemihyperplazja

• cytomegalia kory nadnerczy

• wady nerek

• pozytywny wywiad rodzinny

• rozszczep podniebienia

Kryteria pomocniczne:

• wielowodzie, powiększone łożysko,

przedwczesny poród

• hypoglicemia noworodkowa

• znamię rumieniowate

• Kardiomegalia/Kardiomiopatia/wady serca

• charakterystyczne cechy dysmorfii twarzy

• rozstęp mięśni prostych brzucha

• przyspieszony wiek kostny

Zespół Silvera-Russella

niskorosłość

hipotrofia wewnątrzmaciczna (asymetryczna)

mała, trójkątna twarz

mikrognacja

wydatne czoło

niebieskawe twardówki w okresie

niemowlęcym

skierowane w dół kąciki ust

wrodzone wady serca

spodziectwo

opóźnienie wieku kostnego

opóźnione zamykanie ciemiączek

klinodaktylia małego palca, hipoplazja

środkowego lub dystalnego paliczka małego

palca, syndaktylia 2. i 3. palca stopy

plamy café au lait

NI

hipoglikemia

niekiedy niedobór hormonu wzrostu

predyspozycja do niektórych nowotworów:

czaszkogardlaka, nasieniaka jądra, guza

Wilmsa, raka wątrobowokomórkowego.

BWS/SRS (11p15.5)

ekspresja z allelu matczynego

ekspresja z allelu ojcowskiego

ekspresja obualleliczna

ekspresja nieustalona

inhibitor kinaz cdk

inhibitor cyklu

komórkowego (S)

insulinopodobny

czynnik wzrostu

pobudzany przez GH

11p15.5 – SRS/BWS

Zespół Silver-Russell

1. epimutacja w IC1- brak metylacji i eskpresji IGF2

2. UPD(11p15)mat

3. duplikacja 11p15 mat

Zespół Beckwitha-Wiedemanna

1. epimutacja w IC1 – 5% - metylacja; ekspresja IGF2 z obu alleli (nowotwory)

2. epimutacja w IC2 - 50% - brak metylacji i ekspresji CDKN1C (gigantyzm)

3. UPD(11p15)pat - 20% (przepuklina pępkowa)

4. mutacje punktowe w CDKN1C - 20% (przerost języka)

MLMD (multilocus DNA methylation defects)

Hypometylacja w obrębie kilku piętnowanych loci (ICR2+GNAS+IGF2R+PEG1 lub TNDM+ICR2+GRB10+PEG1)

białka odpowiedzialne za nałożenie wzoru piętna genomowego???

ZFP57 – białko jądrowe odpowiedzialne za utrzymanie wzoru piętna

w trakcie rozwoju zarodkowego; TNDM i BWS; AR

NLRP2 i NLRP7 – białka cytoplazmatyczne o nieznanej funkcji

NLRP2 – BWS – mutacja typu frameshift (ex.6)

NLRP7 i C6orf221 – AR – dziedziczna forma zaśniadu groniastego

(brak nałożonego piętna matczynego)

Analiza metylacji DNA

Izolacja DNA

PCR po trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację

MS-MLPA

modyfikacja DNA kwaśnym dwusiarczynem sodowym

sekwencjonowanie MS-PCR pyrosekwencjonowanie

analiza metylacji w

SNRPN

nieprawidłowy wzór metylacji

analiza delecji (FISH, MLPA)

delecja w locus 15q11-13

PWS/AS brak delecji

analiza RFLP, mikrosatelity

dziedziczenie oburodzicielskie

defekt piętna genomowego PWS/AS

patUPD AS

matUPD PWS

prawidłowy wzór metylacji

ponowna weryfikacja

kliniczna

wykluczenie PWS/ AS

potwierdzenie AS

analiza UBE3A

potwierdzenie obecności

mutacji AS

analiza UBE3A u rodziców

brak mutacji

???

MAT PAT

Analiza metylacji (MS-PCR lub MS-MLPA)

Analiza delecji (FISH lub MS-MLPA)

Analiza UPD markery mikrosatelitarne dla 15q

Analiza AS-SRO (sekw.) Tylko AS

P1 P3