Rola stresu retikulum endoplazmatycznego w patogenezie … · 2014-11-14 · odgrywających ważną rolę w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni takich jak stres oksydacyjny,

Rozprawa habilitacyjna dr Anna Nogalska

1

AUTOREFERAT

Imię i nazwisko:

dr n. med Anna Nogalska

Katedra i Zakład Biochemii

Gdański Uniwersytet Medyczny

ul. Dębinki 1

80-211 Gdańsk

Posiadane dyplomy/stopnie naukowe:

2003 r. – stopień doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej uzyskany w

Katedrze i Zakładzie Biochemii Gdańskiej Akademii Medycznej na podstawie

pracy pt. „Zależne od wieku zmiany ekspresji genów kodujących leptynę i

syntazę kwasów tłuszczowych w tkance tłuszczowej szczurów”,

promotor: prof. dr hab. Julian Świerczyński.

1996 r. – tytuł magistra biologii specjalizacja biologia molekularna uzyskany w Katedrze

Mikrobiologii Uniwersytetu Gdańskiego.

Dotychczasowe zatrudnienie:

od 1996 r. - Asystent w Katedrze i Zakładzie Biochemii Akademii Medycznej w

Gdańsku/Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego; od lutego 2004 r. na bezpłatnym urlopie

naukowym.

02. 2004 - 04.2014 - Research Associate, Neuromuscular Center, Department of

Neurology, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornia, USA

od 05. 2014 r. - Research Laboratory Specialist, Department of Stem Cell Biology and

Regenerative Medicine, University of Southern California, Los Angeles, Kalifornia, USA

1. WYKAZ PUBLIKACJI STANOWIĄCYCH OSIĄGNIĘCIE NAUKOWE, O

KTÓRYM MOWA W ART. 16 UST. 2 USTAWY

A) Tytuł osiągnięcia naukowego:

„Rola stresu retikulum endoplazmatycznego w patogenezie

wtrętowego zapalenia mięśni.”

B) Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego:

1. Askanas V, Engel WK, Nogalska A. Inclusion body myositis: a degenerative muscle disease

associated with intra-muscle fiber multi-protein aggregates, proteasome inhibition,


2

endoplasmic reticulum stress and decreased lysosomal degradation. Brain Pathol 19:493–

506, 2009.

(IF: 5.903; MNiSW: 32; cytowania: 56)

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na pisaniu i redakcji tekstu, opracowaniu i

przygotowaniu Tabeli 1. Mój udział procentowy szacuję na 30%.

2. Nogalska A, Engel WK, McFerrin J, Kokame K, Komano H, Askanas V. Homocysteine-

induced endoplasmic reticulum protein (Herp) is up-regulated in sporadic inclusion-body

myositis and in endoplasmic reticulum stress-induced cultured human muscle fibers. J

Neurochem, 96:1491-9, 2006.


Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i

wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem hodowli włókien mięśniowych prowadzonych przez J.

McFerrin), analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji

manuskryptu i redakcji tekstu.

Mój udział procentowy szacuję na 70%.

3. Nogalska A, Wojcik S, Engel WK, McFerrin J, Askanas V. Endoplasmic reticulum stress

induces myostatin precursor protein and NF-kappaB in cultured human muscle fibers:

relevance to inclusion body myositis. Exp Neurol, 204:610-8, 2007.



wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem Western blotów miostatyny i kaspazy-3 wykonanych

przez S. Wójcika oraz hodowli włókien mięśniowych prowadzonych przez J. McFerrin),

analizie statystycznej i interpretacji wyników badań, napisaniu wstępnej wersji manuskryptu

i redakcji tekstu.


4. Nogalska A, D’Agostino C, Engel WK, Davies KJ, Askanas V. Decreased SIRT1

deacetylase activity in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurobiol Aging.

31:1637-1648, 2010



wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem części Western blotów acetylowanych białek p65, p53

i H4 wykonanych przez C. D’Agostino), analizie statystycznej i interpretacji wyników badań,

napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu.


3


5. Nogalska A, Engel WK, Askanas V. Increased BACE1 mRNA and non-coding BACE1-

antisense transcript in sporadic inclusion body myositis muscle fibers – possibly caused by

endoplasmic reticulum stress. Neurosci Lett, 47(3):140-143, 2010.



wykonaniu wszystkich doświadczeń, analizie statystycznej i interpretacji wyników badań,

napisaniu wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu.


6. Nogalska A, D’Agostino C, Terracciano C, Engel WK, Askanas V. Impaired autophagy

in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers and in endoplasmic reticulum stress-

provoked cultured human muscle fibers. Am J Pathol. 177(3):1377-1387, 2010.



wykonaniu doświadczeń (z wyjątkiem części Western blotów wykonanych przez C.

D’Agostino oraz części Western blotów kinazy pS70 wykonanych przez przez C.

Terracciano), interpretacji wyników badań, analizie statystycznej wyników, napisaniu

wstępnej wersji manuskryptu i redakcji tekstu.


Sumaryczny IF publikacji tworzących osiągnięcie naukowe 28.507, punktacja MNiSzW:

160;

Łączna liczba cytowań: 162

C) Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem

ich ewentualnego wykorzystania.

Wtrętowe zapalenie mięśni (WZM)(ang. sporadic inclusion-body myositis, s-IBM) jest

najczęstszym zwyrodnieniowym schorzeniem mięśni szkieletowych występującym u osób po

50-tym roku życia (Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). Choroba

postępuje powoli, ale systematycznie i zazwyczaj w ciągu 10 lat od diagnozy pacjent przestaje

chodzić (Weihl and Pestronk, 2010). Obraz kliniczny obejmuje osłabienie i atrofię mięśni

czworogłowego uda i pośladkowego wielkiego, oraz zginaczy głębokich palców oraz

grzbietowych stopy (Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). W obrazie


4

histopatologicznym biopsji mięśniowej charakterystyczne dla wtrętowego zapalenia mięśni są

naciek zapalny z CD8-pozytywnymi limfocytami T, a także, wewnątrz włókien mięśniowych,

obecność wakuoli oraz białkowych złogów o charakterze amyloidu (Ryc. 1) (Askanas et al.,

2012b; Dalakas, 2012; Dimachkie and Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006; Weihl and

Pestronk, 2010). Te wielobiałkowe wtręty zawierają między innymi białko prekursora β-

amyloidu (AβPP)/β-amyloid, hiperfosforylowane białko tau (p-tau) czy α-synukleinę - białka

charakterystyczne dla chorób degeneracyjnych mózgu takich jak choroba Alzheimera czy

Parkinsona (Askanas et al., 2012b; Iqbal et al., 2010; LaFerla, 2010; Selkoe, 2011; Weihl and

Pestronk, 2010). Na poziomie molekularnym wyróżnić można dwa rodzaje wtrętów: blaszki

(ang. plaques) zawierające głównie β-amyloid i szereg innych białek wiążących się doń, oraz

złogi włókienkowate (ang. squiggles) zbudowane przede wszystkim z fosforylowanego białka

tau, które łaczy się w helikalne podwójne filamenty, dodatkowo zawierające białko

sekwestosom 1/p62 i szereg innych (Askanas and Engel, 2006; Askanas and Engel, 2007;

Askanas et al., 2012a).

Ryc. 1. Charakterystyczne cechy biopsji mięśniowej we wtrętowym zapaleniu mięśni. A) włókna mięśniowe z wakuolami

(barwienie trójbarwne zmodyfikowaną metodą Gomoriego), B) zapalny naciek komórek jednojądrzastych pomiędzy włóknami

mięśniowymi (barwienie trójbarwne zmodyfikowaną metodą Gomoriego), C) różowe wtręty amyloidu (barwienie fioletem

krystalicznym), D) parzyste helikalnie skręcone włókienka (ang. paired helical filaments, PHFs) zawierające fosforylowane

białko tau (immnohistochemiczne barwienie z zastosowaniem przeciwciał rozpoznajacych białko p62, integralny składnik

PHFs).

Patogeneza wtrętowego zapalenia mięśni jest złożona i wieloczynnikowa, a pierwotna

przyczyna wywołująca proces chorobowy wciąż pozostaje nieznana. Dwa mechanizmy

odgrywają kluczową rolę, a są to degeneracja włókien mięśniowych oraz proces zapalny

(Askanas and Engel, 2011; Askanas et al., 2012b; Dalakas, 2008). Jakkolwiek odpowiedź

immunologiczna przyczynia się do postępującego osłabienia mięśni, leczenie chorych na


5

WZM kortykosteroidami i plazmaferezą nie przynosi poprawy (Dalakas, 2011; Dimachkie and

Barohn, 2013; Engel and Askanas, 2006). Coraz więcej wyników badań sugeruje, że główną

przyczyną degeneracji włókien mięśniowych we WZM jest patologiczne gromadzenie się

wewnątrz włókien mięśniowych, w formie złogów, białka prekursora β-amyloidu (AβPP)/β-

amyloidu oraz innych białek wskutek: a) zwiększonej transkrypcji, b) zaburzeń modyfikacji

post-tranlacyjnych i c) zaburzeń procesów degradacji tychże białek, czemu sprzyja klimat

starzenia się mięśni. Zidentyfikowano szereg wewnątrzkomórkowych procesów

odgrywających ważną rolę w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni takich jak stres

oksydacyjny, obniżenie aktywności protesomów, stres retikulum endoplazmatycznego i

obniżenie aktywności lizosomów (Askanas et al., 2012a; Lloyd, 2010). Szczegółowy opis

zwyrodnieniowego aspektu wtrętowego zapalenia mięśni, białek wchodzących w skład

cytoplazmatycznych wtrętów oraz postulowanych mechanizmów ich powstawania

opublikowaliśmy w Brain Pathology (2009) (praca nr 1).

Retikulum endoplazmatyczne pełni, między innymi, istotną rolę w procesie nadawania

prawidłowej konformacji nowosyntetyzowanym białkom (Roussel et al., 2013). Szereg białek

opiekuńczych zlokalizowanych w świetle retikulum endoplazmatycznego czuwa nad

prawidłowym przebiegiem tego procesu (Mori, 2000; Walter and Ron, 2011). Wiele różnych

czynników zaburzających homeostazę retikulum endoplazmatycznego może prowadzić do

nagromadzenia się niezwiniętych lub nieprawidłowo pofałdowanych białek w jego świetle, co

wywołuje stres retikulum endoplazmatycznego (stres ER)(ang. endoplasmic reticulum stress)

(Mori, 2000; Roussel et al., 2013; Zhang and Kaufman, 2008). W reakcji na ten stres, jako

mechanizm samoobrony, komórka uruchamia system odpowiedzi na obecność

niesfałdowanych białek (UPR)(ang. unfolded protein response). Jego zadaniem jest

zapobieganie dalszemu gromadzeniu się nieprawidłowo sfałdowanych białek w retikulum

endoplazmatycznym, a w razie niepowodzenia doprowadzenie do apoptozy komórki (Mori,

2000; Roussel et al., 2013; Zhang and Kaufman, 2008).

Herp, białko retikulum endoplazmatycznego indukowane homocysteiną (ang. homocysteine-

induced endoplasmic reticulum protein), zlokalizowane w błonie retikulum

endoplazmatycznego, pod wpływem stresu ER ulega najintensywniejszej ekspresji ze


6

wszystkich białek odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka (Kokame et al., 2000;

Yamamoto et al., 2004). Odgrywa ono istotną rolę w degradacji białek związanych z ER (ang.

ER-associated degradation, ERAD), utrzymywaniu homeostazy wapniowej i regulacji

apoptozy (Chan et al., 2004; Hori et al., 2004; Yamamoto et al., 2004). W pracy opublikowanej

w Journal of Neurochemistry (2006)(praca nr 2) wykazaliśmy, że w porównaniu do osób

kontrolnych we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM ilość mRNA i białka Herp jest

znacząco zwiększona. W cytoplazmie 70-80% zwakuolizowanych włókien mięśniowych

WZM białko Herp gromadziło się w formie wtrętów różnej wielkości, gdzie

współwystępowało z ubikwityną, AβPP/β-amyloidem, GRP78 oraz podjednostką β2

proteasomu. Podobnych Herp-pozytywnych inkluzji nie wykryliśmy w biopsjach pacjentów

zdrowych czy cierpiących na inne choroby nerwowo-mięśniowe. Wyniki te wskazują na

istotną rolę stresu ER i aktywacji szlaków odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka we

WZM.

W badaniach nad molekularnymi mechanizmami patogenetycznymi wtrętowego zapalenia

mięśni niezastąpione są hodowle ludzkich włókien mięśniowych poddawane traktowaniu

związkami chemicznymi indukującymi odpowiednie szlaki sygnalizacyjne. W opisywanej

pracy użyliśmy epoksymicynę – inhibitor aktywności proteosomów (Meng et al., 1999) oraz

tunikamycynę lub tapsigarginę - dwa znane induktory stresu ER (Back et al., 2005; Lee, 2005)

tworząc nowy eksperymentalny model WZM. Eksperymentalnie wywołany stres ER

indukował ekspresję Herp, o czym świadczy wzrost ilości białka oraz mRNA Herp, podczas

gdy zahamowanie aktywności proteasomów skutkowało wzrostem ilości białka bez

jednoczesnych zmian ilości mRNA Herp. W hodowlach traktowanych epoksymicyną

zaobserwowaliśmy ponadto powstawanie ubikwitynowanych Herp-pozytywnych złogów.

Przedstawione wyniki sugerują, że obserwowany we wtrętowym zapaleniu mięśni wzrost Herp

może być następstwem stresu ER oraz obniżonej aktywności proteasomów, podkreślając

znaczenie tych mechanizmów w patogenezie WZM.

Miostatyna, należąca do nadrodziny transformujących czynników wzrostu β (ang.

transforming growth factor, TGF-β) jest negatywnym regulatorem masy mięśniowej

(Gonzalez-Cadavid and Bhasin, 2004; Joulia-Ekaza and Cabello, 2006). Myszy z naturalną

mutacją w genie kodującym miostatynę, myszy transgeniczne w wyciszoną ekspresją tego


7

genu lub nadprodukujące białka hamujące działanie miostatyny charakteryzują się zwiększoną

masą mięśniową (Gonzalez-Cadavid and Bhasin, 2004). Dlatego też miostatyna jest kuszącym

celem w poszukiwaniu skutecznych terapii wielu chorób nerwo-mięśniowych. We włóknach

mięśniowych pacjentów z WZM zaobserwowano wzrost ilości białka prekursora oraz dimeru

miostatyny, ich gromadzenie się w postaci złogów wspólnie z AβPP/Aβ i postulowano, że te

białka wiążąc się ze sobą mogą napędzać wzajemną agregację i tworzenie struktur

amyloidowych typu β-harmonijki (Wojcik et al., 2005). W pracy opublikowanej w

Experimental Neurology (2007)(praca nr 3) zastosowaliśmy opisany powyżej model WZM z

indukowanym stresem ER i pokazaliśmy, że tunikamycyna i tapsigargina wywołują stres ER i

indukują odpowiedź na nieprawidłowo złożone białka w hodowlach ludzkich włókien

mięśniowych, potwierdzając użyteczność tego modelu w badaniach potencjalnych

mechanizmów patogenezy WZM. Następnie wykazaliśmy jako pierwsi, że stres ER zwiększa

ekspresję prekursora miostatyny i jego mRNA. Wyjaśniliśmy też, że mechanizm działania

obejmuje indukowaną stresem ER aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κB, i jest

odmienny od mechanizmu zależnej od stresu ER indukcji Herp and GRP78, typowych białek

odpowiedzi na nieprawidłowo złożone białka (UPR). Ponadto wykazaliśmy zwiększone

wiązanie NF-κB do DNA w biopsjach pacjentów z WZM i postulowaliśmy, że stres ER może

być jedną z przyczyn aktywacji NF-κB, który w konsekwencji może indukować ekspresję

miostatyny i prowadzić do atrofii włókien mięśniowych. Nasze wyniki wskazują na nowe cele

terapeutyczne we WZM i możliwe, że także innych chorobach nerwo-mięśniowych.

W pracy opublikowanej w Neurobiology of Aging (2010)(praca nr 4) poszukując przyczyn

zwiększonej aktywacji NF-κB we wtrętowym zapaleniu mięśni zbadaliśmy ekspresję SIRT1,

białka należącego do rodziny NAD+-zależnych deacetylaz histonów/białek (Haigis and

Guarente, 2006; Michan and Sinclair, 2007). Znanym substratem SIRT1 jest NF-κB, którego

acetylacja/obniżona deacetylacja powoduje zwiększenie aktywności (Yeung et al., 2004). W tej

publikacji wykazaliśmy, że we WZM ilość mRNA i białka SIRT1 jest zwiększona, ale

jednocześnie aktywność enzymatyczna deacetylazy jest obniżona. Konsekwentnie

zaobserwowaliśmy wzrost acetylowanych białek: histonu 4, podjednostki p65 czynnika

transkrypcyjnego NF-κB oraz białka p53, głównych substratów SIRT1 (Vaquero et al., 2007;

Vaziri et al., 2001; Yeung et al., 2004). Chociaż SIRT1 jest białkiem przede wszystkim


8

wykrywanym w jądrach komórkowych (Haigis and Guarente, 2006; Michan and Sinclair,

2007), w biopsjach pacjentów z WZM ilość białka SIRT1 w ekstraktach jądrowych była niższa

w porównaniu z kontrolami, a w cytozolu wykryliśmy SIRT1-pozytywne wtręty, które często

zlokalizowane były w pobliżu jąder komórkowych. Możliwe jest, że uwięzienie SIRT1 w

cytoplazmatycznych wtrętach uniemożliwia jej transport do jąder komórkowych i odpowiada

za obniżoną aktywność enzymatyczną SIRT1. W celu wyjaśnienia czy indukowana stresem ER

aktywacja NF-κB może zależeć od aktywności SIRT1 zastosowaliśmy eksperymentalny

model WZM z wywołanym tunikamycyną stresem ER. Okazało się, że stress ER prowadził do

wzrostu ilości mRNA i białka SIRT1, obniżenia aktywności enzymatycznej deacetylazy i w

konsekwencji wzmożonej acetylacji podjednostki p65 NF-κB (wzrostu aktywności NF-κB).

Wyniki te pokazują, że eksperymentalnie wywołany stres ER prowadzi do zaburzeń SIRT1

podobnych do tych zachodzących w biopsjach pacjentów z WZM. Nieprawidłowe

funkcjonowanie SIRT1 może mieć poważne reperkusje. Aktywacja NF-κB poprzez

upośledzenie zależnej od SIRT1 deacetylacji może wywoływać proces zapalny oraz

podwyższać miostatynę i prowadzić do atrofii włókien mięśniowych. Ponieważ opisywano, że

w różnych modelach eksperymentalnych SIRT1 ma też działąnie ochronne przed

toksycznością β-amyloidu (Qin et al., 2006), możliwym jest, że obniżona aktywność tego

enzymu może częściowo przyczyniać się do opisywanych we WZM zaburzeń przemian β-

amyloidu oraz jego prekursora. Nasze wyniki sugerują, że znane aktywatory SIRT1 (np.

resveratrol, polifenol, którego naturalnym źródłem są winogrona, czarne jagody czy czerwone

wino (Cucciolla et al., 2007)), mogłyby znaleźć zastosowanie w leczeniu chorych z wtrętowym

zapaleniem mięśni.

BACE1 jest śródbłonową proteazą aspartylową pełniącą między innymi rolę β-sekretazy w

amyloidogennej proteolizie białka prekursora β-amyloidu (Stockley and O'Neill, 2008). We

wtrętowym zapaleniu mięśni opisano zwiększenie ilości białka BACE1 oraz jego akumulację

w złogach zawierających również białko prekursora β-amyloidu/β-amyloid (Vattemi et al.,

2001; Vattemi et al., 2003; Wojcik et al., 2007). Na podstawie tych badań zaproponowano rolę

BACE1 w inicjacji procesu powstawania toksycznego β-amyloidu we WZM. Podobnie

wykazano, że ilość białka BACE1 była zwiększona w hodowlach ludzkich włókien

mięśniowych z wywołanym stresem ER (Wojcik et al., 2007). Moja praca opublikowana w


9

Neuroscience Letters (2010)(praca nr 5) sugeruje mechanizm mogący odpowiadać za opisane

zmiany ekspresji BACE1. BACE1 jest enzymem ograniczającym szlaku amyloidogennej

proteolizy białka prekursora β-amyloidu (Stockley and O'Neill, 2008). Jednym z czynników

regulujących ekspresję BACE1 jest odkryty niedawno długi niekodujący antysensowny

transkrypt BACE1 (BACE1-AS), komplementarny do mRNA BACE1 (Faghihi et al., 2008).

Wykazano, że wzrost ilości transkryptu BACE1-AS powoduje wzrost ilości mRNA i białka

BACE1 (Faghihi et al., 2008). W naszej pracy przedstawiliśmy wzrost mRNA BACE1 oraz

transkrypu BACE1-AS w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni w porównaniu

z biopsjami pobranymi od osób kontrolnych. Ponadto, po raz pierwszy udokumentowaliśmy,

że stres ER wywołuje wzrost transkryptu BACE1-AS i prowadzi do zwiększenia ilość mRNA

BACE1 w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych. Wyniki te wskazują, że BACE1-AS,

podwyższony wskutek stresu ER, może być przyczyną obserwowanego we WZM wzrostu

ilości mRNA i białka BACE1 i prowadzić do wzmożonej produkcji β-amyloidu. Obniżanie

BACE1, poprzez celowane obniżenie transkryptu BACE1-AS lub redukcję stresu ER może w

przyszłości znaleźć zastosowanie w leczeniu pacjentów cierpiących na WZM.

Mimo, że obecność autofagicznych wakuoli we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM

jest oczywista (Carpenter et al., 1978; Engel and Askanas, 2006; Kumamoto et al., 2004;

Tsuruta et al., 2001), mechanizmy prowadzące do ich powstawania nie są znane. W pracy

opublikowanej w American Journal of Pathology (2010)(praca nr 6) podjęliśmy próbę ich

wyjaśnienia. Autofagia, to proces degradacji uszkodzonych lub niepotrzebnych składników

struktur komórkowych, makrocząsteczek i organelli, z zaangażowaniem układu endosomalno-

lizosomalnego (Martinez-Vicente and Cuervo, 2007; Nixon, 2007; Shacka et al., 2008). W

makroautofagii materiał komórkowy przeznaczony do degradacji dostarczany jest do

lizosomów przy udziale autofagosomów (Martinez-Vicente and Cuervo, 2007; Nixon, 2007;

Shacka et al., 2008). Główną rolę w regulacji makroautofagii odgrywa kinaza ssaczy gen

rapamycyny (ang. mammalian target of rapamycin, mTOR), a najlepszym markerem ilości

autofagosomów i autofagolizosomów w komórkach jest białko LC3-II, powstające wskutek

konwersji białka LC3 z rozpuszczalnej postaci LC3-I do lipofilnej formy LC3-II

wbudowywanej w błony nowopowstających autofagosomów (Klionsky et al., 2012; Nixon,

2007; Shacka et al., 2008). W opisywanej pracy wykazaliśmy, że we włóknach mięśniowych


10

pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni zachodzi zwiększone formowanie i dojrzewanie

autofagosomów, ponieważ w porównaniu do kontroli zaobserwowaliśmy w nich wzrost ilości

LC3-II oraz obniżenie zależnej od mTOR fosforylacji kinazy p70S6. Ponadto jako pierwsi

opisaliśmy, że pomimo wzrostu ilości białka katepsyn B i D, głównych proteaz lizosomalnych,

ich aktywność enzymatyczna była znacząco niższa niż u kontroli. Wyniki te wskazują na

niewydolność procesu autofagii we WZM. Dla porównania użyliśmy biopsje pacjentów z

zapaleniem wielomięśniowym (ZWM) (ang. polymyositis), inną miopatią zapalną, i

wykazaliśmy, że w ZWM ilość białka LC3-II była również zwiększona, ale aktywność

katepsyny D była porównywalna do kontroli, a katepsyny B była znacząco podwyższona.

Nasze badania morfologiczne wykazały, że białko LC3 we włóknach mięśniowych pacjentów

z WZM gromadziło się w cytoplazmie w formie dużych agregatów, często w pobliżu wakuoli,

podczas gdy w biopsjach z ZWM formowało drobne złogi w niewielkiej ilości włókien. W

transportowaniu ubikwitynowanych białek przeznaczonych do degradacji uczestniczy białko

sekwestosom 1/p62, które ma zdolność wiązania LC3-II (Bjorkoy et al., 2005; Komatsu et al.,

2007). We włóknach mięśniowych WZM, chociaż białka te były zlokalizowane blisko siebie,

nie kolokalizowały ściśle i nie wiązały się ze sobą, wskazując na możliwe upośledzenie

procesu dostarczania białek do autofagosomów. Nasze wyniki wskazują na aktywację

makroautofagii we WZM, jednakże wskutek upośledzenia aktywności lizosomów wydajność

procesu degradacji białek jest wyraźnie obniżona, co może być przyczyną powstawania

wakuoli oraz aggregatów białkowych we włóknach mięśniowych.

W celu zidentyfikowania mechanizmów, które mogą odgrywać rolę w obniżaniu wydajności

lizosomów, w omawianej pracy zastosowaliśmy hodowle ludzkich włókien mięśniowych z

eksperymentalnie wywołanym stresem ER lub zahamowaną aktywnością proteasomów. Dla

porównania użyliśmy też hodowle traktowane chlorokiną lub bafilomycyną, znanymi

inhibitorami lizosomów podwyższającmi lizosomalne pH (Shacka et al., 2006). Zahamowanie

aktywności lizosomów w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych powodowało wzrost

ilości LC3-II oraz obniżało ilość fosforylowanej kinazy p70S6. Podobny efekt

zaobserwowaliśmy w obu modelach eksperymentalnych. Zgodnie z mechanizmem działania, w

hodowlach traktowanych chlorokiną czy bafilomycyną, aktywność enzymatyczna katepsyny

D i B była zahamowana. Obniżenie aktywności katepsyny D i B wykazaliśmy także w

hodowlach z wywołanym stresem ER, podczas gdy inhibitor aktywności proteasomów nie


11

miał wpływu na aktywność katepsyny D. Analiza morfologiczna za pomocą mikroskopii

świetlnej i elektronowej hodowli z wywołanym stresem ER wykazała charakterystyczne dla

hodowli z zahamowaną aktywnością lizosomów zmiany w postaci wakuoli wypelnionych

niezdegradowanym materiałem pochodzenia lizosomalnego. Ponadto opisaliśmy wyraźne

obniżenie ilości białka VMA21 w naszym eksperymentalnym modelu stresu ER w porównaniu

do hodowli kontrolnych. Ponieważ białko to pełni istotną rolę w składaniu V-ATPazy

odpowiedzialnej za utrzymanie pH w lizosomach (Ramachandran et al., 2013),

zaproponowaliśmy, że niedobór VMA21 indukowany stresem ER może być przyczyną

obniżenia aktywności enzymów lizosomalnych. Praca niniejsza stanowi istotny wkład w

wyjaśnienie mechanizmów biorących udział w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni.

Strategie terapeutyczne ukierunkowane na odblokowanie niewydolnych procesów degradacji

białek mogą być nadzieją dla pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni.

W pracach stanowiących osiągnięcie naukowe wykazałam wraz z zespołem:

a) Nieprawidłowości ekspresji białka Herp w biopsjach pacjentów z WZM, oraz stosując

modele eksperymentalne wskazaliśmy stres ER oraz zahamowanie aktywności

proteasomów jako potencjalne mechanizmy indukujące te zmiany;

b) Stres ER jako mechanizm indukujący ekspresję miostatyny w hodowlach ludzkich

włókien mięśniowych prawdopodobnie poprzez zależną od stresu ER aktywację czynnika

transkrypcyjnego NF-κB;

c) Obniżoną aktywność SIRT1 w biopsjach pacjentów z WZM oraz w hodowlach ludzkich

włókien mięśniowych z wywołanym stresem ER i zaproponowaliśmy, że może ona

odpowiadać za nadmierną aktywację NF-κB.

d) Stres ER jako czynnik wywołujący wzrost transkryptu BACE1-AS oraz mRNA BACE1

w hodowlach ludzkich włókien mięśniowych, oraz wzrost mRNA BACE1 oraz

transkrypu BACE1-AS w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni.

e) Upośledzenie procesu autofagii w biopsjach pacjentów z WZM, wskutek obniżenia

aktywności lizosomalnych proteaz katepsyny D i B, a także udokumentowaliśmy

zachodzenie podobnych nieprawidlowości tego procesu w hodowlach z wywołanym

stresem ER.


12

Podumowując przedstawione powyżej wyniki, otrzymane z biopsji mięśniowych pacjentów

cierpiących na wtrętowe zapalenie mięśni oraz z hodowli ludzkich włókien mięśniowych

można stwierdzić, że stres ER, oprócz indukowania UPR jako mechanizmu obronnego, może

też prowadzić do zaburzeń szeregu procesów wewnątrzkomórkowych i przez to odgrywać

istotną rolę w patogenezie WZM (Ryc. 2). Zrozumienie konsekwencji stresu ER we włóknach

mięśniowych może przyczynić się do opracowania nowych strategii terapeutycznych w

leczeniu wtrętowego zapalenia mięśni.

Ryc. 2 Proponowane skutki stresu ER w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni

Piśmiennictwo:

Askanas, V., Engel, W. K., 2006. Inclusion-body myositis: a myodegenerative conformational disorder associated with Abeta,

protein misfolding, and proteasome inhibition. Neurology. 66, S39-48.

Askanas, V., Engel, W. K., 2007. Inclusion-body myositis, a multifactorial muscle disease associated with aging: current

concepts of pathogenesis. Curr Opin Rheumatol. 19, 550-9.

Askanas, V., Engel, W. K., 2011. Sporadic inclusion-body myositis: Conformational multifactorial ageing-related degenerative

muscle disease associated with proteasomal and lysosomal inhibition, endoplasmic reticulum stress, and

accumulation of amyloid-beta42 oligomers and phosphorylated tau. Presse Med. 40, e219-35.

Askanas, V., et al., Pathogenesis of sporadic inclusion-body myositis; role of ageing and muscle-fibre degeneration, and

accumulation of the same proteins as in Alzheimer and Parkinson brains. In: V. Askanas, W. K. Engel, (Eds.),

Muscle Ageing, Inclusion-Body Myositis and Myopathies Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 2012a, pp. 111-145.

Askanas, V., et al., 2012b. Pathogenic considerations in sporadic inclusion-body myositis, a degenerative muscle disease

associated with aging and abnormalities of myoproteostasis. J Neuropathol Exp Neurol. 71, 680-93.

Back, S. H., et al., 2005. ER stress signaling by regulated splicing: IRE1/HAC1/XBP1. Methods. 35, 395-416.

Bjorkoy, G., et al., 2005. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on

huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171, 603-14.

Carpenter, S., et al., 1978. Inclusion body myositis: a distinct variety of idiopathic inflammatory myopathy. Neurology. 28, 8-

17.

Chan, S. L., et al., 2004. Herp stabilizes neuronal Ca2+ homeostasis and mitochondrial function during endoplasmic reticulum

stress. J Biol Chem. 279, 28733-43.

Cucciolla, V., et al., 2007. Resveratrol: from basic science to the clinic. Cell Cycle. 6, 2495-510.

Dalakas, M. C., 2008. Interplay between inflammation and degeneration: using inclusion body myositis to study

"neuroinflammation". Ann Neurol. 64, 1-3.

Dalakas, M. C., 2011. Review: An update on inflammatory and autoimmune myopathies. Neuropathol Appl Neurobiol. 37,

226-42.

Dalakas, M. C., Inflammatory and autoimmune features of inclusion-body myositis. In: V. Askanas, W. K. Engel, (Eds.),

Muscle aging, inclusion-body myositis and myopathies. Wiley-Blackwell, Oxford, UK, 2012, pp. 146-158.

Dimachkie, M. M., Barohn, R. J., 2013. Inclusion body myositis. Curr Neurol Neurosci Rep. 13, 321.


13

Engel, W. K., Askanas, V., 2006. Inclusion-body myositis: clinical, diagnostic, and pathologic aspects. Neurology. 66, S20-9.

Faghihi, M. A., et al., 2008. Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer's disease and drives rapid feed-forward

regulation of beta-secretase. Nat Med. 14, 723-30.

Gonzalez-Cadavid, N. F., Bhasin, S., 2004. Role of myostatin in metabolism. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 7, 451-7.

Haigis, M. C., Guarente, L. P., 2006. Mammalian sirtuins--emerging roles in physiology, aging, and calorie restriction. Genes

Dev. 20, 2913-21.

Hori, O., et al., 2004. Role of Herp in the endoplasmic reticulum stress response. Genes Cells. 9, 457-69.

Iqbal, K., et al., 2010. Alzheimer's disease neurofibrillary degeneration: pivotal and multifactorial. Biochem Soc Trans. 38,

962-6.

Joulia-Ekaza, D., Cabello, G., 2006. Myostatin regulation of muscle development: Molecular basis, natural mutations,

physiopathological aspects. Exp Cell Res. 312, 2401-2414.

Klionsky, D. J., et al., 2012. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8, 445-

544.

Kokame, K., et al., 2000. Herp, a new ubiquitin-like membrane protein induced by endoplasmic reticulum stress. J Biol Chem.

275, 32846-53.

Komatsu, M., et al., 2007. Homeostatic levels of p62 control cytoplasmic inclusion body formation in autophagy-deficient

mice. Cell. 131, 1149-63.

Kumamoto, T., et al., 2004. Expression of lysosome-related proteins and genes in the skeletal muscles of inclusion body

myositis. Acta Neuropathol. 107, 59-65.

LaFerla, F. M., 2010. Pathways linking Abeta and tau pathologies. Biochem Soc Trans. 38, 993-5.

Lee, A. S., 2005. The ER chaperone and signaling regulator GRP78/BiP as a monitor of endoplasmic reticulum stress.

Methods. 35, 373-81.

Lloyd, T. E., 2010. Novel therapeutic approaches for inclusion body myositis. Curr Opin Rheumatol. 22, 658-64.

Martinez-Vicente, M., Cuervo, A. M., 2007. Autophagy and neurodegeneration: when the cleaning crew goes on strike. Lancet

Neurol. 6, 352-61.

Meng, L., et al., 1999. Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity.

Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 10403-8.

Michan, S., Sinclair, D., 2007. Sirtuins in mammals: insights into their biological function. Biochem J. 404, 1-13.

Mori, K., 2000. Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Cell. 101, 451-4.

Nixon, R. A., 2007. Autophagy, amyloidogenesis and Alzheimer disease. J Cell Sci. 120, 4081-91.

Qin, W., et al., 2006. Neuronal SIRT1 activation as a novel mechanism underlying the prevention of Alzheimer disease

amyloid neuropathology by calorie restriction. J Biol Chem. 281, 21745-54.

Ramachandran, N., et al., 2013. VMA21 deficiency prevents vacuolar ATPase assembly and causes autophagic vacuolar

myopathy. Acta Neuropathol. 125, 439-57.

Roussel, B. D., et al., 2013. Endoplasmic reticulum dysfunction in neurological disease. Lancet Neurol. 12, 105-18.

Selkoe, D. J., 2011. Resolving controversies on the path to Alzheimer's therapeutics. Nat Med. 17, 1060-5.

Shacka, J. J., et al., 2006. Bafilomycin A1 inhibits chloroquine-induced death of cerebellar granule neurons. Mol Pharmacol.

69, 1125-36.

Shacka, J. J., et al., 2008. The autophagy-lysosomal degradation pathway: role in neurodegenerative disease and therapy. Front

Biosci. 13, 718-36.

Stockley, J. H., O'Neill, C., 2008. Understanding BACE1: essential protease for amyloid-beta production in Alzheimer's

disease. Cell Mol Life Sci. 65, 3265-89.

Tsuruta, Y., et al., 2001. Expression of the lysosome-associated membrane proteins in myopathies with rimmed vacuoles. Acta

Neuropathol. 101, 579-84.

Vaquero, A., et al., 2007. NAD+-dependent deacetylation of H4 lysine 16 by class III HDACs. Oncogene. 26, 5505-20.

Vattemi, G., et al., 2001. Presence of BACE1 and BACE2 in muscle fibres of patients with sporadic inclusion-body myositis.

Lancet. 358, 1962-4.

Vattemi, G., et al., 2003. BACE1 and BACE2 in pathologic and normal human muscle. Exp Neurol. 179, 150-8.

Vaziri, H., et al., 2001. hSIR2(SIRT1) functions as an NAD-dependent p53 deacetylase. Cell. 107, 149-59.

Walter, P., Ron, D., 2011. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-

6.

Weihl, C. C., Pestronk, A., 2010. Sporadic inclusion body myositis: possible pathogenesis inferred from biomarkers. Curr

Opin Neurol. 23, 482-8.

Wojcik, S., et al., 2005. Myostatin is increased and complexes with amyloid-beta within sporadic inclusion-body myositis

muscle fibers. Acta Neuropathol. 110, 173-7.

Wojcik, S., et al., 2007. NOGO is increased and binds to BACE1 in sporadic inclusion-body myositis and in A beta PP-

overexpressing cultured human muscle fibers. Acta Neuropathol. 114, 517-26.

Yamamoto, K., et al., 2004. Differential contributions of ATF6 and XBP1 to the activation of endoplasmic reticulum stress-

responsive cis-acting elements ERSE, UPRE and ERSE-II. J Biochem 136, 343-50.

Yeung, F., et al., 2004. Modulation of NF-kappaB-dependent transcription and cell survival by the SIRT1 deacetylase. EMBO

J. 23, 2369-80.

Zhang, K., Kaufman, R. J., 2008. From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature. 454, 455-62


14

2. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADAWCZYCH

1. Nogalska A, D’Agostino C, Engel WK, Askanas V. Sodium phenylbutyrate reverses

lysosomal dysfunction and decreases amyloid-β42 in an in vitro-model of inclusion-body

myositis. Neurobiol Dis. 65:93-101, 2014.

2. Cacciottolo M, Nogalska A, D’Agostino C, Engel WK, Askanas V. Dysferlin is a newly

identified binding partner of AβPP and it co-aggregates with amyloid-β42 within sporadic

inclusion-body myositis (s-IBM) muscle fibers. Acta Neuropathol. 126(5):781-3, 2013.

3. Cacciottolo M, Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Chaperone-mediated

autophagy components are upregulated in sporadic inclusion-body myositis muscle fibres.

Neuropathol Appl Neurobiol. 39:750-761, 2013.

4. Klingstedt T, Blechschmidt C*, Nogalska A*, Prokop S, Hggqvist B, Danielsson O, Engel

WK, Askanas V, Heppner FL, Nilsson KPR. Luminescent Conjugated Oligothiophenes for

Sensitive Fluorescent Assignment of Protein Inclusion Bodies. ChemBioChem 14(5):607-

16, 2013 *równorzędne autorki

5. Klionsky DJ,…Nogalska A, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for

monitoring autophagy. Autophagy 8(4):445-544, 2012.

6. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Activation of the γ-secretase complex

and presence of γ-secretase-activating protein may contribute to Aβ42 production in

sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurobiol Dis. 48(1):141-9, 2012.

7. Askanas V, Engel WK, Nogalska A. Pathogenic considerations in sporadic inclusion-body

myositis, a degenerative muscle disease associated with aging and abnormalities of

myoproteostasis. J Neuropathol. Exp. Neurol. 71(8):680-93, 2012.

8. D'Agostino C, Nogalska A, Cacciottolo M, Engel WK, Askanas V. Abnormalities of

NBR1, a novel autophagy-associated protein, in muscle fibers of sporadic inclusion-body

myositis. Acta Neuropathol. 122(5):627-36, 2011.

9. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Askanas V. Novel demonstration of

conformationally modified tau in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Neurosci

Lett. 503(3):229-33, 2011.

10. D'Agostino C, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. In sporadic inclusion body myositis

muscle fibres TDP-43-positive inclusions are less frequent and robust than p62 inclusions,


15

and are not associated with paired helical filaments. Neuropathol Appl Neurobiol.

37(3):315-320, 2011.

11. Nogalska A, D'Agostino C, Engel WK, Klein WL, Askanas V. Novel demonstration of

amyloid-β oligomers in sporadic inclusion-body myositis muscle fibers. Acta Neuropathol.

120(5):661-666, 2010.

12. Terracciano C, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. In AbetaPP-overexpressing cultured

human muscle fibers proteasome inhibition enhances phosphorylation of AbetaPP751 and

GSK3beta activation: effects mitigated by lithium and apparently relevant to sporadic

inclusion-body myositis. J Neurochem. 112(2):389-396, 2010.

13. Nogalska A, Terracciano C, D’Agostino C, Engel WK, Askanas V. p62/SQSTM1 is

increased and prominently accumulated in inclusions of sporadic inclusion-body myositis

muscle fibers, and can help differentiating it from.polymyositis and dermatomyositis. Acta

Neuropathol 118(3):403-413, 2009

14. Vattemi G, Nogalska A, Engel WK, D’Agostino C, Checler F, Askanas V. Amyloid-β42 is

preferentially accumulated in muscle biopsies of patients with sporadic inclusion-body

myositis. Acta Neuropathol 117(5):569-74, 2009.

15. Nogalska A, Stelmanska E, Sledzinski T, Swierczynski J. Surgical removal of perirenal

and epididymal adipose tissue decreases serum leptin concentration and increases lipogenic

enzymes activities in remnant adipose tissue of old rats. Gerontology 55:224-228, 2009.

16. Terracciano C, Nogalska A, Engel WK, Wojcik S, Askanas V. In inclusion-body myositis

muscle fibers Parkinson-associated DJ-1 is increased and oxidized. Free Radical. Biol.

Med, 45:773-779, 2008.

17. Wojcik S, Nogalska A, Engel WK, Askanas V. Myostatin and its precursor protein are

increased in the skeletal muscle of patients with Type-II muscle fiber atrophy. Folia

Morphol, 67:8-14, 2008.

18. Szolkiewicz M, Chmielewski M, Nogalska A, Stelmanska E, Swierczynski J, Rutkowski

B. The potential role of sterol regulatory element binding protein transcription factors in

renal injury: J Ren Nutr, 17:62-5, 2007.

19. Wojcik S, Nogalska A, McFerrin J, Engel WK, Oledzka G, Askanas V. Myostatin

precursor protein is increased and associates with amyloid-b precursor protein in inclusion-

body myositis culture model. Neuropathol Appl Neurobiol, 33:238-42, 2007.


16

20. Sledzinski T, Nogalska A, Hebanowska A, Klimek J, Swierczynski J. Gender- and age-

related changes in 6-phosphogluconate dehydrogenase gene expression in white adipose

tissue of rats (Rattus norvegicus) are not related to serum testosterone concentration. Comp

Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 144:70-6, 2006.

21. Nogalska A, Sucajtys-Szulc E, Swierczynski J. Leptin decreases lipogenic enzyme gene

expression through modification of SREBP-1c gene expression in white adipose tissue of

aging rats. Metabolism, 54:1041-7, 2005.

22. Korczynska J, Stelmanska E, Nogalska A, Szolkiewicz M, Goyke E, Swierczynski J,

Rutkowski B. Upregulation of lipogenic enzymes genes expression in white adipose tissue

of rats with chronic renal failure is associated with higher level of sterol regulatory element

binding protein-1. Metabolism, 53:1060-5, 2004.

23. Nogalska A, Swierczynski J. Potential role of high serum leptin concentration in age-

related decrease of fatty acid synthase gene expression in rat white adipose tissue. Exp

Gerontol, 39:147-50, 2004.

24. Pankiewicz A, Sledzinski T, Nogalska A, Swierczynski J. Tissue specific, sex and age-

related differences in the 6-phosphogluconate dehydrogenase gene expression. Int J

Biochem Cell Biol. 35:235-45, 2003.

25. Nogalska A, Pankiewicz A, Goyke E, Swierczynski J. The age-related inverse relationship

between ob and lipogenic enzymes genes expression in rat white adipose tissue. Exp

Gerontol. 38:415-22, 2003.

26. Nogalska A, Swierczynski J. The age-related differences in obese and fatty acid synthase

gene expression in white adipose tissue of rat. Biochim Biophys Acta. 1533:73-80, 2001.

Powyższe moje prace, nie wchodzące w skład osiągnięcia naukowego z pkt 1, można podzielić

na następujące grupy tematyczne:

a) Rola autofagii w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni

b) Diagnostyczne markery wtrętowego zapalenia mięśni

c) Zaburzenia metabolizmu białka prekursora β-amyloidu/ β-amyloidu we wtrętowym

zapaleniu mięśni i ich konsekwencje

d) Rola miostatyny w atrofii włókien mięśniowych

e) Zmiany ekspresji genów kodujących leptynę i enzymy lipogenne w tkankach szczurów.


17

Rola autofagii w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni

Moje badania ostatnich kilku lat skierowane są na poznanie roli zaburzeń autofagii w

patogenezie WZM. Przemyślenia i rozważania dotyczące zaburzeń mioproteostazy we

wtrętowym zapaleniu mięśni w oparciu o uzyskane w naszym laboratorium wyniki oraz o

eksperymentalne modele WZM, a także proponowane strategie terapeutyczne opisane zostały

w pracy poglądowej, której jestem współautorem. Ponadto, brałam udział w badaniach

mających na celu scharakteryzowanie we wtrętowym zapaleniu mięśni zaburzeń drugiego,

obok p62, receptora wiążącego białka przeznaczone do degradacji - zwanego NBR1 (ang.

neighbour of the BRCA1 gene) (Johansen and Lamark, 2011; Lamark et al., 2009). Podobnie

jak p62 białko to ma zdolność wiązania LC3-II i pełni rolę transportera ubikwitynowanych

białek do proteasomów lub autofagosomów (Kirkin et al., 2009). Wykazaliśmy zwiększoną

ekspresję NBR1 oraz jego obecność w cytoplazmatycznych złogach zawierających również

białka p62 i LC3. W przeciwieństwie do p62, białko NBR1 wiązało LC3, zaproponowaliśmy

więc, że NBR1 może ulegać nadekspresji we wtrętowym zapaleniu mięśni, żeby

zrekompensować brak wiązania pomiędzy białkami LC3 i p62. Uczestniczyłam też czynnie w

projekcie dotyczącym funcjonowania autofagii zależnej od czaperonów (CMA, ang.

chaperone-mediated autophagy) we wtrętowym zapaleniu mięśni. CMA to mechanizm

dostarczania białek przeznaczonych do degradacji, a zawierających w swoim łańcuchu

pięcioaminokwasowy motyw KFERQ, do lizosomów za pomocą białek LAMP2a i Hsc70

(Cuervo, 2010; Dice, 1990; Kaushik and Cuervo, 2012). Jako pierwsi opisaliśmy zwiększenie

LAMP2a i Hsc70 we włóknach mięśniowych w biopsjach pacjentów z WZM. Ponadto

wykazaliśmy wzajemne wiązanie tych białek do siebie oraz do α-synukleiny, najlepiej

poznanego substratu CMA (Kaushik and Cuervo, 2012; Li et al., 2011). Wyniki nasze

wskazują na próbę aktywacji autofagii zależnej od czaperonów, aby najprawdopodobniej

usprawnić usuwanie między innymi nieprawidłowo zwiniętych białek z cytozolu. Jednakże w

świetle naszych wcześniej uzyskanych wyników opisujących obniżenie aktywności lizosomów

we WZM wydaje się, że proces ten nie jest skuteczny. (prace 2.3, 2.7, 2.8)

Moja najnowsza praca z tego cyklu tematycznego opisuje bardzo ważne z punktu

widzenia terapeutycznego wyniki. Pokazaliśmy w niej wpływ 4-fenylomaślanu sodu (NaPB),

który ma właściwości chemicznych czaperonów (Cuadrado-Tejedor et al., 2011; Iannitti and

Palmieri, 2011, Papp and Csermely, 2006), na hodowle ludzkich włókien mięśniowych z


18

farmakologicznie wywołanym obniżeniem aktywności lizosomów. NaPB odwracał wszystkie

szkodliwe efekty zahamowania aktywności lizosomów: obniżał poziom białek LC3-II, p62 i

NBR1, zmniejszał ilość autofagosomów i wakuoli. Ponadto w hodowlach traktowanych NaPB

aktywność γ-sekretazy, enzymu odpowiedzialnego za produkcję β-amyloidu (De Strooper,

2010), była obniżona, co korelowało z mniejszą ilością β-amyloidu 42 oraz jego oligomerów w

tych hodowlach. Nasze wyniki wskazują, że NaPB może znaleźć zastosowanie w leczeniu

pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni. (praca 2.1)

Ze względu na posiadane doświadczenie w temacie autofagii zostałam zaproszona wraz

z innymi ekspertami w tej dziedzinie do współautorstwa pracy zawierającej szczegółowe

wytyczne dotyczące eksperymentalnego studiowania mechanizmów autofagii. (praca 2.5)

Diagnostyczne markery wtrętowego zapalenia mięśni

Bardzo ważnym naszym odkryciem, zyskującym coraz większe uznanie w diagnostyce

wtrętowego zapalenia mięśni, okazało się wykazanie obecności p62, białka uczestniczącego w

kierowaniu przeznaczonych do degradacji białek do proteasomów lub autofagosomów

(Bjorkoy et al., 2005; Seibenhener et al., 2004), w złogach zawierających fosforylowane

białko tau. Proste immnohistochemiczne barwienie umożliwia specyficzną detekcję p62-

pozytywnych inkluzji w biopsjach pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni i ułatwia

postawienie diagnozy poprzez odróżniennie WZM od innych miopatii zapalnych: zapalenia

wielomięśniowego i zapalenia skórno-mięśniowego. Użyteczność i wyższość p62 jako

biomarkera wtrętowego zapalenia mięśni potwierdziliśmy w kolejnej pracy, porównując ilość

wykrywanych na danym przekroju biopsji mięśniowej p62-pozytywnych wtrętów z

częstotliwością wykrywania wtrętów zawierających białko TDP-43, inny proponowany marker

WZM. We współpracy z Uniwersytetem w Linkoping ze Szwecji przebadaliśmy też

użyteczność nowych związków tzw. luminescencyjnych sprzężonych oligotiofenów (LCOs,

ang. luminescent conjugated oligothiophenes) (Klingstedt and Nilsson, 2011) do wykrywania

białkowych złogów we wtrętowym zapaleniu mięśni. Wykazaliśmy, że pFTAA,

pentameryczny LCO, rozpoznawał agregaty białkowe zawierające białko p62, a ponadto z

dużą czułością uwidaczniał nawet drobne złogi białkowe, niemożliwe do wykrycia

tradycyjnymi metodami np. barwieniem czerwienią Kongo. (prace 2.4, 2.10, 2.13)


19

Zaburzenia metabolizmu białka prekursora β-amyloidu/ β-amyloidu we wtrętowym zapaleniu

mięśni i ich konsekwencje

Pomimo, iż przyczyna wtrętowego zapalenia mięśni nie jest jednoznacznie ustalona,

wyniki badań z zastosowaniem myszy transgenicznych oraz hodowli ludzkich włókien

mięśniowych z wywołanymi WZM-podobnymi zmianami wskazują, że gromadzenie się

wewnątrz włókien mięśniowych złogów zbudowanych z białka prekursora β-amyloidu (AβPP)

oraz powstającego w wyniku jego proteolizy β-amyloidu (Aβ) odgrywa bardzo ważną rolę w

patogenezie WZM (Askanas et al., 1997; Askanas et al., 1996; Fukuchi et al., 1998; Jin et al.,

1998; Kitazawa et al., 2006; Kitazawa et al., 2008; Terracciano et al., 2010). W wyniku

proteolitycznego cięcia AβPP przez β- i γ- sekretazy powstają różnej długości cząsteczki Aβ

różniące się właściwościami (De Strooper, 2010). Aβ42 zbudowany z 42 aminokwasów, jest

najbardziej toksyczny, łatwo też oligomeryzuje i tworzy włókna (De Strooper, 2010). Uważa

się, że niskocząsteczkowe oligomery i protofibryle Aβ są najbardziej toksyczne (De Strooper,

2010; El-Agnaf et al., 2000; LaFerla et al., 2007). Badania, w których brałam udział wykazały,

że dominującą we WZM formą β-amyloidu jest Aβ42, oraz że wykrywane Aβ42-pozytywne

złogi mają charakter amyloidu. Kontynuując te badania jako pierwsi wykazaliśmy obecność

niskocząsteczkowych oligomerów Aβ (dimerów, trimerów oraz tetramerów) w biopsjach

pacjentów z WZM. Mają one właściwości ligandów będących pochodnymi Aβ (ang. ADDLs,

Aβ-derived diffusible ligands)(Klein et al., 2004; Lambert et al., 1998). Ostatnio pokazaliśmy,

że dysferlina, białko zlokalizowane w plazmalemmie włókien mięśniowych (Barthélémy et al.,

2011), we wtrętowym zapaleniu mięśni zamiast w błonie zlokalizowana jest w

cytoplazmatycznych złogach zawierających Aβ42 i fizycznie oddziaływuje z AβPP.

Zbadaliśmy też ekspresję i aktywność γ-sekretazy we WZM i wykazaliśmy, że poszczególne

białka kompleksu γ-sekretazy (presenilina-1, nikastryna oraz białko PEN-2) są

nadprodukowane we WZM, jak również aktywność enzymatyczna kompleksu jest

podwyższona w porównaniu do kontroli. Odkryliśmy też, że białko GSAP (ang. γ-secretase

activating protein), które jak wykazano selektywnie zwiększa produkcję Aβ oddziaływując na

AβPP i kompleks γ-sekretazy (He et al., 2010), jest podwyższone we WZM. Wyniki badań, w

których brałam udział świadczą też o obecności foforylowanego AβPP we włóknach pacjentów

z wtrętowym zapaleniem mięśni. Sugerowano, że fosforylacja AβPP zwiększa jego proteolizę

przez β- i γ- sekretazy (Lee et al., 2003; Vingtdeux et al., 2005). Przedstawiliśmy również, że


20

kinaza syntazy glikogenowej-3β (GSK-3β), odgrywająca rolę w fosforylowaniu białka tau oraz

AβPP (Anderton et al., 2001; Aplin et al., 1996), jest aktywowana we WZM. Dodatkowo w

opisywanych pracach wykazaliśmy na modelach WZM otrzymanych poprzez traktowanie

hodowli ludzkich włókien mięśniowych inhibitorami aktywności lizosomów lub proteasomów,

że upośledzenie autofagii prowadzi do wzrostu ilości oligomerów Aβ. Ponadto, w modelu tym

dominującą formą był Aβ42. Także ilość fosforylowanego AβPP była podwyższona w tych

hodowlach i zaobserwowaliśmy w nich jednocześnie podwyższenie aktywności γ-sekretazy.

Wyniki uzyskane na hodowlach ludzkich włókien mięśniowych z indukowaną nadprodukcją

AβPP i jednocześnie z zahamowaną aktywnością proteasomów pokazały wzrost

fosforylowanego AβPP oraz aktywację GSK-3β. Jednocześnie podanie chlorku litu hamowało

aktywność GSK-3β i w rezultacie obniżało ilość fosforylowanego AβPP, całkowitego AβPP

oraz oligomerów Aβ. Wyniki te stanowią dodatkowe dowody na ważną rolę AβPP i Aβ-

oligomerów w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni. (prace 2.2, 2.6, 2.11, 2.12, 2.14)

W patogenezie choroby Alzheimera uważa się, że gromadzenie Aβ poprzedza i

wywołuje patologiczne zmiany białka tau (Selkoe et al., 2012). Przypuszcza się, że podobny

mechanizm zachodzi także we wtrętowym zapaleniu mięśni, gdzie obecność helikalnych

podwójnych filamentów zbudowanych z ufosforylowanego białka tau jest dobrze

udokumentowana (Askanas et al., 1994; Mirabella et al., 1996). Niedawno w biopsjach

pacjentów z wtrętowym zapaleniem mięśni wykazaliśmy konformacyjne zmiany białka tau

obejmujące zmiany strukturalne wewnątrz łańcucha polipeptydowego, ułatwiające formowanie

tau w helikalne podwójne filamenty. (praca 2.9)

Wspólną cechą wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera i

Parkinsona, są stres oksydacyjny i zaburzenia struktury i funkcjonowania mitochondriów

(Selfridge et al., 2013). Podobne zaburzenia opisano również we wtrętowym zapaleniu mięśni.

Brałam udział w badaniach nad białkiem DJ-1, które w warunkach stresu oksydacyjnego pełni

ważną rolę przeciwutleniacza (Canet-Aviles et al., 2004; Taira et al., 2004). Opisaliśmy, że we

włóknach mięśniowych pacjentów z WZM ekspresja DJ-1 jest zwiększona oraz, że białko to

występuje w mitochondriach. Ponadto wykazaliśmy, że we WZM białko DJ-1 jest

karbonylowane, co świadczyć może o jego uszkodzeniu oksydacyjnym. Zaproponowaliśmy, że

DJ-1 pełni funkcję ochronną przed skutkami stresu oksydacyjnego we WZM. (praca 2.16)


21

Rola miostatyny w atrofii włókien mięśniowych

Wykazano, że ilość miostatyny, inhibitora wzrostu masy mięśniowej, jest podwyższona

we włóknach mięśniowych pacjentów z WZM (Wojcik et al., 2005). Uczestniczyłam w

badaniach mających wyjaśnić mechanizm tych zaburzeń. Okazało się, że nadekspresja AβPP w

hodowlach ludzkich włókien mięśniowych wywołuje wzrost prekursora miostatyny, podczas

gdy zahamowanie aktywności proteasomów nie miało takiego efektu. Wykazaliśmy także, że

miostatyna i AβPP fizycznie oddziaływują ze sobą w tym modelu eksperymentalnym.

Przeanalizowaliśmy także ekspresję miostatyny w biopsjach mięśniowych z obrazem

selektywnej atrofii włókien mięśniowych typu II. W biopsjach tych barwienie

immunofluorescencyjne z użyciem specyficznych przeciwciał skierowanych przeciw

miostatynie wykazało podwyższony sygnał specyficznie we włóknach typu II. Ponadto, ilość

białka miostatyny w homogenatach z tych biopsji była zwiększona, natomiast ilość mRNA

miostatyny była podobna jak u kontroli. W świetle tych wyników, wydaje się, że miostatyna

odgrywa ważną rolę w kaskadzie patogenetycznej prowadzącej do atrofii włókien

mięśniowych typu II. Interwencje terapeutyczne ukierunkowane na obniżenie miostatyny mogą

znaleźć zastosowanie w leczeniu nie tylko wtrętowego zapalenia mięśni, ale również innych

chorób związanych z zanikiem mięśni. (prace 2.17, 2.19)

Zmiany ekspresji genów kodujących leptynę i enzymy lipogenne w tkankach szczurów.

Ten cykl prac, z których część stanowiła podstawę mojej rozprawy doktorskiej,

podejmuje zagadnienie zależnego od wieku zwiększania masy ciała oraz masy tkanki

tłuszczowej u ludzi i zwierząt. Ilość magazynowanej tkanki tłuszczowej zależy od wielu

różnych czynników, wśród których ważną rolę odgrywają: syntaza kwasów tłuszczowych -

kluczowy enzym lipogenny, oraz leptyna - hormon regulujący metabolizm energetyczny

organizmu (Swierczynski, 2006; Swierczynski and Sledzinski, 2012). Białka te wywierają

przeciwstawny wpływ na metabolizm lipidów. Badania przeprowadziliśmy na szczurach w

wieku 1, 2, 3, 6 i 20 miesięcy i wykazaliśmy, że ilość mRNA leptyny w tkance tłuszczowej

oraz stężenie tego hormonu w surowicy krwi rośnie, podczas gdy aktywność syntazy kwasów

tłuszczowych, ilość białka oraz mRNA tego enzymu w tkance tłuszczowej maleje wraz z

wiekiem szczurów. Ponadto ekspresja pozostałych enzymów lipogennych: karboksylazy

acetylo-CoA, ATP-liazy cytrynianowej, enzymu jabłczanowego, dehydrogenaz glukozo-6-


22

fosforanowej i 6-fosfoglukonianowej, oraz szybkość procesu lipogenezy in vivo ulega

znacznemu obniżeniu u starych zwierząt. Na podstawie tych wyników zaobserwowaliśmy, że

zachodzi silna ujemna korelacja między ekspresją genu kodującego leptynę oraz genów

kodujących badane enzymy lipogenne i zaproponowaliśmy, że leptyna odgrywa istotną rolę w

regulacji ekspresji genów kodujących enzymy lipogenne. Potwierdzeniem tej hipotezy były

wyniki naszych kolejnych eksperymentów, które dowiodły, że wzrost stężenia leptyny w

surowicy krwi młodych szczurów, spowodowany podaniem tego hormonu, związany jest z

obniżeniem aktywności enzymów lipogennych, natomiast obniżenie stężenia leptyny w

surowicy krwi starych szczurów, wywołane chirurgicznym usunięciem tkanki tłuszczowej,

związane jest ze wzrostem aktywności syntazy kwasów tłuszczowych. Zaobserwowana

ujemna korelacja między ekspresją genu kodującego leptynę i stężeniem leptyny w surowicy

krwi a ekspresją genów kodujących enzymy lipogenne w tkance tłuszczowej sugeruje, że za

obniżenie aktywności lipogennej tkanki tłuszczowej u starzejących się szczurów może

odpowiadać wzrost stężenia leptyny. (prace 2.15, 2.21, 2.23, 2.25, 2.26)

Poszukując mechanizmu oddziaływania leptyny na geny kodujące enzymy lipogenne

zbadaliśmy mRNA regulatora tych genów - czynnika transkrypcyjnego SREBP-1c (Shimano,

2001). Podobnie jak w przypadku genów kodujących enzymy lipogenne, odkryliśmy istnienie

ujemnej korelacji między ekspresją leptyny a mRNA SREBP-1c w tkance tłuszczowej

młodych i starych szczurów. Wyniki te wskazują, że wzrost ekspresji genu kodującego leptynę

może być odpowiedzialny (przynajmniej częściowo) za obniżenie ekspresji SREBP-1c i w ten

sposób obniżać potencjał lipogenny tkanki tłuszczowej starzejących się szczurów. (praca

2A.21)

Brałam też udział w badaniach, które wykazały związek pomiędzy SREBP-1c a

ekspresją genów kodujących enzymy lipogenne w tkance tłuszczowej szczurów z wywołaną

przewlekłą niewydolnością nerek (PNN). Ilość białka SREBP-1c, zarówno prekursora jak i

aktywnej formy, była zwiększona w tkance tłuszczowej szczurów z PNN i ściśle korelowała ze

zwiększoną ilością mRNA genów kodujących główne enzymy lipogenne. Zaburzenia

metabolizmu lipidów są znanym aspektem niewydolności nerek (Attman et al., 1993). Na

podstawie wyników naszych badań zaproponowaliśmy, że czynniki transkrypcyjne SREBP

odgrywają istotną rolę w postępowaniu procesu chorobowego PNN. (prace 2.18, 2.22)


23

Byłam też zaangażowana w szczegółowe badania ekspresji genu kodującego

dehydrogenazę 6-fosfoglukonianową (6PGDH), jedną z dehydrogenaz szlaku

fosfopentozowego generujących NADPH do procesu lipogenezy. Odkryliśmy, że u szczurów

związane z wiekiem zmiany ekspresji 6PGDH zależą od płci oraz tkanki. W wątrobie młodych

szczurów aktywność 6PGDH była identyczna u samic i samców, ale u samic rosła z wiekiem.

W tkance tłuszczowej oraz korze nerki aktywność enzymatyczna 6PGHD malała wraz z

wiekiem niezależnie od płci, a pozostawała stała w mózgu, sercu i mięśniach szkieletowych.

Zaobserwowane zmiany aktywności enzymatycznej ściśle korelowały z ilością mRNA

6PGDH. Zbadaliśmy też wpływ hormonów płciowych na 6PGDH. Wykazaliśmy, że estradiol

odgrywa istotną rolę w regulacji ekspresji 6PGDH w wątrobie ale nie w tkance tłuszczowej,

natomiast testosteron nie wpływa znacząco na ekspresję 6PGDH. Nasze badania wykazały, że

ekspesja 6PGDH jest regulowana odmiennie w wątrobie i tkance tłuszczowej w zależności od

wieku i płci. (prace 2.20, 2.24)

Piśmiennictwo:

Anderton, B. H., et al., 2001. Sites of phosphorylation in tau and factors affecting their regulation. Biochem Soc Symp. 73-80.

Aplin, A. E., et al., 1996. In vitro phosphorylation of the cytoplasmic domain of the amyloid precursor protein by glycogen

synthase kinase-3beta. J Neurochem. 67, 699-707.

Askanas, V., et al., 1994. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of

Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. Am J Pathol. 144, 177-87.

Askanas, V., et al., 1997. Beta APP gene transfer into cultured human muscle induces inclusion-body myositis aspects.

Neuroreport. 8, 2155-8.

Askanas, V., et al., 1996. Transfer of beta-amyloid precursor protein gene using adenovirus vector causes mitochondrial

abnormalities in cultured normal human muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 1314-9.

Attman, P. O., et al., 1993. Lipoprotein metabolism and renal failure. Am J Kidney Dis. 21, 573-92.

Barthélémy, F., et al., 2011. Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies. Mol Med. 17, 875-882.

Bjorkoy, G., et al., 2005. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on

huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171, 603-14.

Canet-Aviles, R. M., et al., 2004. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven

mitochondrial localization. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 9103-8.

Cuadrado-Tejedor, M., et al., 2011. Defining the mechanism of action of 4-phenylbutyrate to develop a small-molecule-based

therapy for Alzheimer's disease, Curr Med Chem, 18, 5545-5553.

Cuervo, A. M., 2010. Chaperone-mediated autophagy: selectivity pays off. Trends Endocrinol Metab. 21, 142-150.

De Strooper, B., 2010. Proteases and proteolysis in Alzheimer disease: a multifactorial view on the disease process. Physiol

Rev. 90, 465-94.

Dice, J. F., 1990. Peptide sequences that target cytosolic proteins for lysosomal proteolysis. Trends Biochem Sci. 15, 305-9.

El-Agnaf, O. M., et al., 2000. Oligomerization and toxicity of beta-amyloid-42 implicated in Alzheimer's disease. Biochem

Biophys Res Commun. 273, 1003-7.

Fukuchi, K., et al., 1998. Amyloid-beta deposition in skeletal muscle of transgenic mice: possible model of inclusion body

myopathy. Am J Pathol. 153, 1687-93.

He, G., et al., 2010. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467, 95-8.

Iannitti, T. and Palmieri, B. 2011. Clinical and experimental applications of sodium phenylbutyrate, Drugs R D, 11, 227-249.

Jin, L. W., et al., 1998. Transgenic mice over-expressing the C-99 fragment of betaPP with an alpha-secretase site mutation

develop a myopathy similar to human inclusion body myositis. Am J Pathol. 153, 1679-86.

Johansen, T., Lamark, T., 2011. Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins. Autophagy. 7, 279-96.

Kaushik, S., Cuervo, A. M., 2012. Chaperone-mediated autophagy: a unique way to enter the lysosome world. Trends Cell

Biol. 22, 407-417.

Kirkin, V., et al., 2009. A role for NBR1 in autophagosomal degradation of ubiquitinated substrates. Mol Cell. 33, 505-16.


24

Documents

Rola stresu retikulum endoplazmatycznego w patogenezie … · 2014-11-14 · odgrywających ważną rolę w patogenezie wtrętowego zapalenia mięśni takich jak stres oksydacyjny,