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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

ROTEIROS PARA AULAS PRTICAS

BIOQUMICA FISIOLGICA FARMCIA (BQA 5110) 2011-02

Professores da Disciplina: Ftima Regina Mena Barreto Silva (responsvel disciplina) Profa. Andreza Fabro de Bem Prof. Nelson Horcio Gabilan Daiane Engle Bolsista REUNI doutorado Ana Paula Zanatta Bolsista REUNI doutorado Marisa Frederico Estgio de Docncia - Doutoranda Marina Pereira Monitora

2 REGRAS BSICAS DE SEGURANA PARA A EXECUO EXPERIMENTOS NO LABORATRIO DE AULAS PRTICAS DE

1) Leia cada experincia antes de vir ao laboratrio, de modo a familiarizar-se com o procedimento da experincia e as precaues de segurana. 2) Siga sempre as instrues do professor ou do monitor e no brinque no laboratrio. 3) Amarre cabelos longos e evite usar sandlias no laboratrio. 4) No beba, no coma, no mastigue chicletes ou aplique cosmticos no laboratrio. 5) No tente alcanar nada sobre uma chama; sempre ao redor. Apague o bico de Bunsen se no estiver usando-o. 6) Apague todos os bicos de Bunsen e qualquer outra chama antes de usar substncias inflamveis como o lcool. 7) Quando for testar o odor de substncias siga as instrues no procedimento. Segure o frasco longe de voc e abane com a mo um pouco do vapor em sua direo. 8) Saiba onde est o extintor de incndio, as pias e todas as portas do laboratrio. Esteja certo de como usar o extintor de incndio. 9) Mantenha seu local de trabalho limpo, e no coloque os materiais nas extremidades do balco. 10) Leia sempre duas vezes o rtulo de um reagente qumico antes de us-lo. Tenha certeza que o nome e a concentrao do reagente esto corretos. 11) Trocar as pipetas contaminar os reagentes. Em caso de dvida, lave as pipetas, seque-as com papel toalha e as coloque de volta no frasco. 12) Use sempre guarda-p, de algodo com mangas compridas.

13) Trabalhando com reaes perigosas, explosivas, txicas, ou cuja periculosidade voc no est bem certo, use a capela e verifique se h extintor por perto. 14) Realize os trabalhos de risco dentro de capelas ou locais bem ventilados.

15) Se algum reagente atingir os olhos, abrir bem as plpebras e lavar com bastante gua. Atingindo outras partes do corpo, retirar a roupa impregnada e lavar a pele com bastante gua. 16) Para emergncias use o servio 24 h do Centro de Informaes Toxicolgicas (CIT) do HU RAMAL 1520.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Disciplina: Bioqumica Fisiolgica BQA 5110

Relatrio de Aulas Prticas(Modelo Sugerido) 1) Ttulo: Componentes do grupo: Turma: Data do Experimento: 2) Objetivos: 3) Fundamento: 5) Resultados: 6) Discusso e Concluses: 7) Referncias Bibliogrficas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 01 (P1): Determinao de colesterol em alimentos 1. Objetivo Determinar o colesterol total em amostras de alimentos, com reao de ponto final. 2. Fundamento Os steres de colesterol so hidrolisados pela colesterol esterase (CHE) a colesterol livre e cidos graxos.O colesterol livre oxidado pelo colesterol oxidase (CHOD) a colest-4-en-ona e perxido de hidrognio. Na presena de peroxidase (POD) e perxido de hidrognio o fenol e a 4-aminoantipirina so oxidados formando a antipirilquinonimina que tem absortividade mxima em 500 nm. A intensidade da cor vermelha na reao final diretamente proporcional concentrao do colesterol na amostra. O colesterol total determinado de acordo com as seguintes reaes: Colesterol steres de colesterol Esterase Colesterol Colesterol + O2 Oxidase Peroxidase 2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4H2O A intensidade da cor vermelha formada diretamente proporcional concentrao de colesterol na amostra 3. Amostras: Se utilizada amostras de produto alimentcio, a gema do ovo. 3.1 Preparo das amostras: Colest-4-en-ona + H2O2 Colesterol + cidos graxos

5 a) Gema de ovo: extrair com butanol (1:1 - p/v), vortex 30 segundos, centrifugar a 10000 rpm por 3 minutos. 4. Reagentes: 4.1 Reagente de cor (RC): Armazenar entre 2 8 C. Contm tampo 50 mmol/L pH 7,0, colato sdico 0,5 mmol/L, azida sdica 1,5 mmol/L, fenol 24 mmol/L, colesterol esterase > 250 U/L, colesterol oxidase > 150 U/L, peroxidase > 1000 U/L, e 4aminoantipirina 0,5 mmol/L. 4.2 Padro - 200 mg/dL: Armazenar entre 2 30 C. Aps o manuseio, sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporao. Contm Colesterol 200 mg/dL. 5. Procedimento Experimental: Deixar os reagentes atingirem a temperatura ambiente ou a do banho-maria antes da utilizao. 5.1 Protocolo: Identificar 4 tubos de ensaio com "Branco", "Padro" , "Gema (2) e pipetar: Branco (B) Padro Gema RC Abs. Misturar bem. Colocar em banho-maria 37 C durante 5 minutos ou em temperatura ambiente por 10 minutos. Ler as absorbncias em 500 nm ou filtro verde (490 a 510), acertando o zero com branco. A cor estvel por 60 minutos. 6. Resultados Clculos Realizar os clculos atravs da seguinte formula: Colesterol (mg/dl) = Abs. do teste x 200 x FD Abs. do padro 2.0 Padro (P) 0.02 2.0 Amostra (A) 0.02 2.0

6 Linearidade: O resultado da medio linear at 500 mg/dL. Quando for obtido um valor igual ou maior que 500 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medio e multiplicar o resultado pelo fator de diluio. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 150 e 300 mg/dL. 7. Referncia bibliogrfica Alain CA, Poon LS, Cahn CSG, Richmond W, Fu PC. Clin Chem 1974;20:470.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 02 (P2): Determinao de triglicerdeos em alimentos 1. Objetivo: Determinar o nvel de triglicerdeos em amostras de alimentos, com reao de ponto final. 2. Fundamento: Os triglicerdeos so hidrolisados pela lipase lipoproteica e o glicerol liberado fosforilado pela glicerolquinase formando glicerol fosfato, que oxidado dihidroxiacetona e perxido de hidrognio por ao da glicerol-3-fosfato oxidase. Na presena de peroxidase (POD) o perxido de hidrognio, o 4-Clorofenol e a 4aminoantipirina so oxidados formando a quinonimina que tem colorao rosa e absortividade mxima em 500 nm. Os triglicrideos so determinados de acordo com as seguintes reaes: Lipase lipoproteca Triglicrides Glicerol + ATP Mg+2

Glicerol + cidos Graxos Glicerolquinase Glicerol-3-Fosfato + ADP Glicerol-3-fosfato Oxidase

Glicerol-3-Fosfato + O2

Dihidroxiacetona + H2O2 Peroxidase

7 2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinonimina + 4 H2O

A intensidade da cor vermelha formada diretamente proporcional concentrao dos triglicrides na amostra.

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3. Amostras: Sero utilizadas amostra de produto alimentcio como leite integral. 3.1 Preparo das amostras: a) Amostras de leite integral: diluir com dimetilsulfxido DMSO (1:6 v/v), homogenizar em vortex. 4. Reagentes: 4.1 Reagente de cor (RC): Armazenar entre 2 8 C. Contm tampo pH 7,5, p-clorofenol 5 mmol/L, azida sdica 0,1g/dl, lpase lipoprotica>20.000U/L, glicerol-3-fosfato oxidase>30.000U/L, glicerol quinase>8.000U/L, peroxidase>10.000U/L, 4-aminoantipirina 5mmol/L, ATP 3mmol/L e cloreto de magnsio 5mmol/L. 4.2 Padro - 200 mg/dL: Armazenar entre 2 30 C. Aps o manuseio, sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporao. Contm Triglicerdeos 200 mg/dL. 5. Procedimento Experimental: Deixar os reagentes atingirem a temperatura ambiente ou a do banho-maria antes da utilizao. 5.1 Protocolo: Identificar 4 tubos de ensaio com "Branco", "Padro" , "Leite integral" e pipetar: Branco (B) Padro L. Integral RC Abs. Misturar bem. Colocar em banho-maria 37 C durante 5 minutos ou em temperatura ambiente por 10 minutos. Ler as absorbncias em 500 nm ou filtro verde (490 a 510), acertando o zero com branco. A cor estvel por 60 minutos. 6. Resultados Clculos Realizar os clculos atravs da seguinte frmula: 2.0 Padro (P) 0.02 2.0 Amostra (A) 0.02 2.0

9 Triglicerdeos (mg/dl) = Abs. do teste x 210 x FD Abs. do padro Linearidade: A reao linear at 1100 mg/dL. Para valores maiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L, realizar nova determinao e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 100 e 250 mg/dL. 7. Referncia bibliogrfica Bucolo G, David H. Clin Chem 1973; 19:475.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 03 (P3): Determinao de protenas totais em alimentos pelo mtodo de Biureto 1. Introduo As protenas so, juntamente com os cidos nuclicos, as macromolculas mais estudadas em bioqumica. Este fato facilmente explicvel se levarmos em conta a diversidade das funes desempenhadas por protenas. Por outro lado, o conhecimento de vrios fenmenos biolgicos como a ao enzimtica, a resposta imunolgica, a ao hormonal, entre outros, exige que se possa estudar as propriedades fsicas, qumicas e biolgicas das protenas envolvidas nesses processos. Isso, via de regra, depende da obteno das protenas em estado de pureza, conservando ao mximo o estado nativo caracterstico que lhes assegura a capacidade de atuar com elevado grau de especificidade e eficincia nos processos metablicos da clula. O isolamento das protenas sempre seguido pela quantificao destas protenas para que se possa ter uma idia do grau de pureza ou mesmo uma base para o clculo da atividade biolgica. Existe uma variedade de mtodos para a determinao da quantidade de protenas presente numa soluo, mesmo quando a soluo contm outras macromolculas contaminantes, como o DNA ou RNA. A Tabela 1 resume os principais procedimentos disponveis para ensaio de protenas. A deciso de qual procedimento empregar depende da natureza da protena a ser ensaiada, do grau de sensibilidade do mtodo e da facilidade e rapidez do mtodo. Neste mtodo, ns utilizaremos uma das tcnicas mais comuns para a determinao de protenas, o mtodo de biureto descrito abaixo: Tabela 1. Mtodos para determinao de protenas totais em uma amostra desconhecida. Procedimento Ensaio do Biureto Anlise de Kjeldahl Mtodo de Lowry Observaes Baseado na formao de complexos de solues lcalis entre amnia e cobre. Requer digesto cida total e determinao do NH3 liberado. Baseado no contedo de tirosina e triptofano. Sensibilidade ( g/ mL) 1000 10.000 1 100 10 - 200

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Mtodo de Warburg Christian

Mtodo de Waddell

Ensaio de Bradford

Turbidez

ndex refratrio

Baseado na absoro relativa a 280 e 260nm de protenas e cidos nuclicos, respectivamente. Baseado no final de absoro abaixo de 230nm o qual primariamente atribuvel a ligao peptdica. Baseado na adsoro pelas protenas do corante Coomassie Brilliant Blue. Baseado na absorbncia da protena precipitada. No diferencia entre protenas e cidos nuclicos. Baseado na mudana da refrao da luz da protena em soluo. Depende do tampo, dos sais e da temperatura.

50 2000

10 -100

0 20

500 1500

10.000 1000.000

2. Objetivo: Determinar as protenas totais em alimentos atravs do mtodo colorimtrico pela reao do biureto. 3. Fundamento: Os ons cobre (reagente de biureto) reagem em meio alcalino com as ligaes peptdicas das protenas sricas produzindo uma cor prpura, que tem absorbncia mxima em 545 nm, o que proporcional concentrao das protenas na amostra. 4. Amostra: Ser utilizada amostra de clara de ovo 4.1 Preparo das amostras: 1- Clara de ovo: diluir a clara de ovo em salina (1:10 v/v), homogeneizar manualmente. 5. Reagentes: - Biureto (soluo estoque) Conservar entre 15 25C. Reagente custico, portanto, no pipetar com a boca. - Padro ____ g/dL Estvel entre 15 25C.

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6. Procedimento Experimental: Branco (B) Padro (ul) Clara (ul) Biureto de uso (ul) Abs Agitar e deixar em temperatura ambiente durante 10 minutos. Determinar as absorbncias do teste e padro em 545 nm ou filtro verde (510 a 560), acertando o zero com o branco. A cor estvel por 3 horas. 7. Resultados CP = Concentrao do Padro = ____g/dL CA = Concentrao da Amostra (protenas totais) Protenas Totais (g/dL)= absorbncia do teste x CP x FD Absorbncia do padro Linearidade: O resultado da medida linear at 12 g/dL. Para valores maiores diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%) e repetir a medio. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. 8. Referncia Bibliogrfica Burtis CA, Ashwood ER. Tietz. Textbook of Clinical Chemistry, 2. Edio, WB Saunders Company:Philadelphia, 1986, 695-700. 2000 Padro (P) 40 2000 Amostra (A) 40 2000

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 04 (P4): Caracterizao de carboidratos na urina 1. Introduo: 1.1 Carboidratos na urina: principais distrbios no metabolismo de carboidratos Em condies fisiolgicas normais, os acares presentes no filtrado glomerular so reabsorvidos nos tbulos renais, determinando uma ausncia quase total de carboidratos na urina. Entretanto, algumas condies patolgicas podem levar ao aparecimento de acares em quantidades aumentadas na urina excretada. Ocorre que quando a concentrao plasmtica de acar exceder o limiar renal (limiar de reabsoro), parte desse acar no poder ser reabsorvida e conseqentemente ser eliminada na urina. Uma srie de doenas, distrbios do metabolismo dos carboidratos inatos ou adquiridos, como primariamente o Diabetes mellitus, depois a Galactosemia, Frutosemia e tambm algumas doenas de armazenamento de glicognio (glicogenoses) podem determinar o acmulo de um determinado acar no plasma. Glicose na urina: a anlise da glicosria um ensaio bioqumico realizado, em princpio, para a deteco e controle do Diabetes. Quando as concentraes sangneas de glicose ultrapassam o limiar renal ( > 160 - 180 mg/dL), a glicose comea a ser excretada na urina. Tambm pode ocorrer glicosria e perda de carboidratos na urina em doenas renais que afetem a capacidade de reabsoro tubular (Glicosria renal). Galactose na urina: quando ocorre, geralmente tem fundo gentico e pode ser por deficincia de galactosidase, de galactose-1-fosfato uridiltransferase ou galactoquinase. Estas enzimas esto envolvidas no processo de metabolizao da galactose, onde catlises enzimticas levam, em seu final, converso da galactose em glicose. A deficincia de uma, ou mais destas enzimas leva ao distrbio metablico conhecido como Galactosemia, no qual h hipergalactosemia e consequentemente, galactosria. Acumula-se galactose 1P e galactitol nos tecidos, podendo causar leses hepticas, renais, retardo mental, catarata, entre outros. Frutose na urina: Em princpio, pode ocorrer frutosria devido ausncia de frutocinase, sendo esta uma condio benigna e assintomtica. Outra causa de frutosria a Frutosemia ou intolerncia hereditria frutose, uma doena metablica de difcil diagnstico. Trata-se da ausncia da enzima frutose-1-fosfato aldolase, uma herana autossmica recessiva, que ocorre no cromossomo 9q22.3. A aldolase uma enzima da via glicoltica/glicognica que existe nas formas A, B e C, sendo que a aldolase B tem como principal substrato a frutose-1-fosfato e encontrada nos tecidos glicognicos do

14 fgado, rim e mucosa intestinal. A ingesto de quantidades superiores quantidade mnima de frutose ou sacarose (acar comum), a qual convertida em frutose no organismo, acarreta severa hipoglicemia acompanhada de sudorese, tremores involuntrios, confuso mental, nusea, vmito, dores abdominais, ictercia e, algumas vezes, convulses e coma. Podem ocorrer leses renais e hepticas e deteriorao mental quando a pessoa continua a consumir alimentos contendo frutose. 1.2 Acar Redutor

A glicose e alguns outros acares so capazes de reduzir ons frrico (Fe3+) ou cprico (Cu2+). Ao grupo de acares dotados desta propriedade d-se o nome de acares redutores. Ex. monossacardeos como glicose, frutose, galactose, gliceraldedo; dissacardeos como lactose, maltose, entre outros. A propriedade redutora tomada por base numa srie de reaes (ex. reao de Fehling, Benedict, etc) que so utilizadas em ensaios para detectar a presena de acares redutores em solues. Por muitos anos, estes ensaios foram utilizados para detectar e medir os nveis elevados de glicose no sangue e urina para o diagnstico e monitoramento do diabetes mellitus, embora hoje existam mtodos mais sensveis que empregam uma enzima (glicose oxidase). A propriedade redutora pode ser reconhecida em acares cuja frmula linear apresente o oxignio do carbono anomrico no ligado a qualquer outra estrutura ou grupamento.

Em soluo, a forma mais estvel da glicose e de outros acares a cclica. Como resultado deste processo de ciclizao, a molcula do acar forma um anel hemiacetal ou hemicetal. O grupo aldedo ou cetona reage com um grupo lcool do acar, resultando na formao de um carbono anomrico no C1 de uma aldose ou no C2 de uma Cetose. de extrema importncia a deteco correta e precoce destes acares na urina de pacientes com suspeita de doena relacionada ao metabolismo de carboidratos. 1.3 Corpos cetnicos na urina Nos humanos, quando as clulas precisam de energia, estando a glicose no devidamente disponvel aos tecidos, os cidos graxos das reservas adiposas comeam a ser mobilizados e distribudos s clulas, onde sero convertidos em acetil-CoA atravs

15 da -oxidao nas mitocndrias. Nos humanos e na maioria dos mamferos, a inanio e/ou o jejum prolongado levam o fgado a comear converter acetil-CoA em corpos cetnicos. Os corpos cetnicos (solveis em gua) so basicamente 3 substncias: acetona (produzida em menor quantidade e exalada), acetoacetato e D--hidrxibutirato. Eles so combustveis alternativos, que so exportados do fgado para tecidos extrahepticos como msculo esqueltico e cardaco e crtex renal. O crebro, que preferencialmente usa glicose como combustvel, pode se adaptar ao uso de acetoacetato ou D--hidroxibutirato sob condies de inanio, quando a glicose no est disponvel. A produo e exportao de corpos cetnicos do fgado para tecidos extrahepticos permite a continuidade da oxidao dos cidos graxos no fgado, quando a acetil-CoA no est sendo oxidada pelo ciclo do cido ctrico.

O jejum prolongado e o diabetes mellitus no tratado levam a superproduo de corpos cetnicos, com vrias complicaes associadas. Durante o jejum prolongado, a gliconeognese esgota os nveis de intermedirios do ciclo de Krebs, desviando a acetilCoA para a produo de corpos cetnicos. No diabetes no tratado, quando os nveis de insulina so insuficientes, os tecidos extrahepticos no conseguem captar glicose do sangue eficientemente, assim no podem utiliz-la como combustvel e nem mesmo para sua converso em gordura. Nestas condies, os nveis de manonil-CoA caem (substncia de partida para a biossntese de cidos graxos), alivia-se a inibio da carnitina aciltransferase I e os cidos graxos entram nas mitocndrias para serem degradados acetil-CoA que no passa pelo ciclo do cido ctrico porque seus intermedirios esto sendo utilizados como substratos para a gliconeognese. A acumulao resultante de acetil-CoA acelera a formao de corpos cetnicos alm da capacidade de oxidao dos tecidos extrahepticos. Os nveis aumentados de acetoacetato e D--hidrxibutirato diminuem o pH do sangue, causando acidose. A extrema acidose pode levar ao coma e em alguns casos morte. Os corpos cetnicos no sangue e na urina de diabticos no tratados podem alcanar nveis extraordinrios uma concentrao sangunea de 90mg/100mL (nvel normal = 3mg/100mL) e a excreo urinria 5.000 mg/24h (taxa normal 125 mg/24h). Esta condio chamada Cetose. Indivduos sob dieta de baixssimas calorias tambm utilizam as gorduras armazenadas no tecido adiposo como a principal fonte de energia, eles tambm apresentam nveis aumentados de corpos cetnicos no sangue e urina. Estes nveis podem ser monitorados para evitar os riscos de acidose e Cetose (cetoacidsose). 2. Objetivo: Detectar na urina a presena de quantidades anormais de carboidratos e corpos cetnicos que podero ser indicativos da ocorrncia de distrbios no metabolismo de carboidratos.

16 3. Fundamentos: 3.1 Teste de Benedict Pesquisa acares redutores. Baseia-se na reao do on cprico presente no reativo de Benedict (complexado com citrato de sdio) que reduzido a xido cuproso por acares redutores que so oxidados, formando um precipitado de xido cuproso, cuja colorao varia do esverdeado, passando pelo amarelo, at o vermelho tijolo. Apesar de qualquer agente redutor positivar a reao, geralmente os carboidratos so os principais agentes redutores encontrados na urina. O carboidrato redutor mais comum na urina a glicose, porm outros acares (frutose, galactose, lactose, etc) tambm positivam a reao. 3.2 Determinao de Corpos Cetnicos Pesquisa de corpos cetnicos. Os corpos cetnicos normalmente no aparecem na urina em quantidades mensurveis, porm quando o uso de carboidratos como principal fonte de energia fica comprometido e os estoques de gorduras so ento metabolizados para fornecer energia, pode-se detectar corpos cetnicos na urina. As provas para cetonria so muito teis para o acompanhamento e a monitorao do diabetes mellitus. As propores de corpos cetnicos nas amostras so mais ou menos constantes: 78% de cido -hidroxibutrico, 20% cido acetoacetato e 2% acetona. Os corpos cetnicos presentes na urina reagem com o nitroprussiato de sdio em meio alcalino (Reativo de Rothera), produzindo um composto de cor roxa a prpura. 4. Amostras Sero utilizadas amostras de urinas de dois indivduos (X e Y). 5. Reagentes 5.1 Reativo de Benedict .100 g/L de carbonato de sdio anidro .200 g/L de citrato de sdio .125 g/L de tiocianato de potssio .18 g/L de sulfato de cobre .0,25 g/L de ferrocianeto de potssio 5.2 Reativo de Rothera . Nitroprussiato de Sdio 1,0 g . Sulfato de Amnio 100 g

17 6. Procedimento Experimental 6.1 Teste de Benedict Reativo de Benedict Urina X Urina Y Tubo 1 2,0 mL 4 gotas -Tubo 2 2,0 mL -4 gotas

Homegenizar e colocar em banho-maria fervente por 5 minutos. Deixar esfriar, observar e descrever os resultados. Este teste semiquantitativo, a cor do precipitado indica: .Soluo azul lmpido: negativo .Precipitado esverdeado: mais de 80 mg (glicose)/L .Precipitado amarelo: cerca de 10 g/L .Precipitado vermelho tijolo: cerca de 20 g/L 6.2 Corpos cetnicos Saturar 2mL (1mL) de urina com reativo de Rothera (g). Inclinar o tubo e deixar escorrer pelas paredes do tubo 4 gotas de amonaco concentrado. l 7. Resultados No quadro abaixo, preencha indicando se os testes resultaram em reao positiva ou negativa para carboidratos e corpos cetnicos nas duas amostras de urina utilizadas. Urina X Y 8. Referncia Bibliogrfica BALCELLS, A. La Clnica y el Laboratorio, Editorial Marin S/A, Barcelona, 1974. GOMES V.M.V. ; GOUVEIA C.V.G Bioqumica Clnica, UFP 1975 LEHNINGER, Albert L; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger principles of biochemistry. 5th. ed. New York: W. H. Freeman, [2008]. xxix, 1158, [100]p. ISBN 9780716771081 SELVA I. El laboratrio en la clnica, Ed. Mdica - Panamericana, Buenos Aires, 1975. VILLELA, G. G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Tcnicas e Experimentos de Bioqumica, Guanabara Koogan, 1973. Benedict Rothera

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 05 (P5): Determinao da Glicemia Introduo Quando o sistema de controle da glicemia escapa da regulao neuro-hormonal desencadeia-se uma hiper ou hipoglicemia. A situao mais comum sem dvida a hiperglicemia, podemos nos defrontar ento, com o diabetes melito. Esta doena caracteriza-se principalmente por sinais de polidipsia, poliria, polifagia e hiperglicemia. A hiperglicemia deve-se ao excesso de glicose no sangue por consequncia da no-entrada de glicose nos tecidos perifricos devido a anormalidades na atividade insulnica. Isto pode ser por uma srie de fatores. As dosagens usuais para o diagnstico do Diabetes Melito e para outras doenas do metabolismo dos glicdios so: a) dosagem da taxa sangunea de glicose ou GLICEMIA; b) teste de tolerncia glicose ou hiperglicemia provocada por via oral (HGPO) e c) glicosria. Os glbulos vermelhos possuem todas as enzimas da gliclise e portanto em contato com o plasma podem destruir 40% da glicose em 3h e 60% em 5h. A dosagem deve ser rpida e em presena de um inibidor da gliclise como o fluoreto de sdio, separar rapidamente os glbulos vermelhos do plasma e conservar o plasma a 4C (dosar em no mximo 1h). O sangue deve ser agitado suavemente (evitar quebra dos glbulos vermelhos e hemlise), distribuir bem o anticoagulante e o inibidor de gliclise em todo o volume do sangue. A concentrao demasiada de inibidores (fluoretos) interfere na dosagem da glicose, em particular, nos mtodos que utilizam a glicoseoxidase. O mtodo automtico mais empregado utiliza como reativo a glicose-oxidase preparada a partir de certas bactrias. Esta enzima oxida a glicose a c. glicnico com liberao de gua oxigenada a qual de fcil dosagem. A primeira parte enzimtica da reao muito especfica. As dosagens automticas evitam a interferncia dos produtos das reaes sofridas pela gua oxigenada (o perxido destrudo pela hemoglobina, pelo glutation e pelos hipoglicemiantes orais como a tolbutamida). Objetivos Dosar a glicose em sangue proveniente de ratos controles alimentados, jejum de 24h e diabticos. Fundamentos

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Teste Glicose-Oxidase (GOD-ANA) A glicose oxidase (GOD-B-D-Glicose: oxignio-1-oxidorredutase) catalisa a oxidao da glicose:GOD

Glicose + O2 + H2O cido glicnico + H2O2 O perxido de hidrognio formado reage com o 4-aminoantipirina e fenol, sob ao catalisadora da peroxidase (POD-Doador: hidrognio-perxido oxidorredutase), atravs de uma reao oxidativa de acoplamento formando uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor proporcional concentrao da glicose na amostra.POD

2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol Antipirilquinonomina + 4 H2O Mtodos REAGENTES 1. Enzimas Conservar entre 2 8C. 2. Tampo: Conservar entre 2 8C. Irritante. No pipetar com a boca. Contm azida sdica 0.05 g/dL. 3. Padro 100 mg/dL Estvel entre 15 25C. Aps o manuseio sugere-se armazenar bem vedado, entre 2 e 8C, para evitar evaporao. O estabilizador do padro pode precipitar-se em baixas temperaturas, fato que no interfere na qualidade. 4. Preparo do reagente de cor Adiciona-se o contedo de um frasco (n 2 100 mL) a 400 mL de gua destilada e misturar. Estvel por 12 meses entre 2 8C. 5. Reagente de cor Dissolver o contedo de um frasco de enzimas (n 1) em 250 mL de tampo de uso. Estvel por 2 meses em frasco de vidro mbar entre 2 8 C. O reagente de cor contm: Tampo 100 mmol/L; pH 7,4 glicose-oxidase > 20.000 U/L; peroxidase > 668 U/L; 4-aminoantipirina 133 mol/L; fenol 10 mmol/L, preservativos, estabilizadores e ativadores. 6. Amostra Plasma ou soro. 7. Procedimentos

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Preparar o tubo teste (amostra) em duplicatas. Pipetar conforme abaixo: Soro normal (mL) Branco (mL) Tubo 1 Tubo 2 Padro 0.02 Soro Diabtico (mL) 0.02 Padro (mL) 0.02 Reagente de Cor 2.0 2.0 2.0 2.0

8. Aps pipetar, misturar vigorosamente e colocar em banho-maria a 37 C durante 15 min. Determinar as absorbncias do teste e padro em 505 nm, acertando o zero com o branco. A cor estvel por 60 min. Resultados Clculos: mg/dL = Absorbncia do teste/ Absorbncia do padro x 100 Ex.: Abs. Padro = 0,363 Abs. Teste = 0,392

Glicose = 0,392 x 100 = 108 (mg/dL) 0,363

Linearidade A reao linear at 400 mg/dL. Quando a absorbncia do teste for maior que 0.8, diluir o produto corado e o branco, com gua destilada, fazer nova leitura e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. Junto ao relatrio apresente a seguinte discusso: 1) Em quais condies podem ser elevados os nveis de glicose no sangue? 2) Diferencie e d as causas da hipoglicemia do jejum e hipoglicemia ps-prandial. D os valores de referncia da glicose no plasma de hum

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 06 (P6): Determinao de ferro em amostras de alimentos 1. Introduo O ferro essencial maioria dos organismos vivos, pois participa de numerosos processos vitais, desde os processos oxidativos celulares ao transporte de oxignio para os tecidos. A homeostasia do ferro regulada principalmente pela absoro e no pela excreo. O ferro transportado no sangue por uma protena chamada transferrina e armazenado no tecido, ligado a uma protena chamada ferritina. O contedo TOTAL de ferro no organismo de 4 a 5 gramas, sendo que aproximadamente 3 gramas esto contidos dentro das hemcias totais (60%-70% do total), integrado a hemoglobina. Nestas condies, ao se fazer a determinao do ferro no sangue, est se realizando praticamente a determinao da taxa de hemoglobina (Hb). De fato, conhecendo-se a quantidade de ferro, pode-se calcular a taxa de Hb do sangue, j que se sabe que cada 100g de Hb contm 0,34g de ferro. Assim de se esperar que o teor de ferro no sangue varie com o contedo de Hb. Por isso, nas anemias, a quantidade de ferro total do sangue estar abaixo do normal. Por outro lado, sendo a quantidade de ferro no hemoglobnico do sangue de apenas 1% de ferro total (Fe++ plasmtico, ligado a globulinas) toma-se o ferro total como sendo unicamente ferro da hemoglobina. A necessidade de ferro na dieta humana varia em diferentes idades e em circunstncias diversas (crescimento, sntese de hemoglobina, substituio devido a perda de ferro na urina, fezes, suor, menstruao, gestao e lactao). As melhores fontes de ferro so fgado, corao, rim, bao, gema de ovo, trigo integral, peixes, ostras, mariscos, nozes, figos, feijo, aspargo, espinafre, melado, aveia, etc. Porm, nem todo o ferro dos alimentos torna-se disponvel ao organismo. Na maior parte dos alimentos o ferro ocorre na forma frrica (Fe3+), seja como hidrxido frrico ou como composto orgnico frrico. Em meio cido (cido clordrico gstrico) estes compostos so desdobrados em ons frricos livres e, as substncias redutoras (grupos SH, por ex. cistena) e cido ascrbico convertem o on frrico na forma reduzida (ferroso - Fe2+). Dessa forma o ferro mais solvel e mais facilmente absorvido. A absoro de ferro ocorre principalmente no duodeno. 2. Objetivo: Determinar o teor de ferro em amostra (s) de alimento(s).

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3. Fundamento: Em meio cido, o ferro presente na amostra se dissocia em on frrico (Fe3+). O ferro presente na amostra analisada reage com o cromazurol B e o brometo de hexadeciltrimetilamonio formando um complexo colorido, que medido fotometricamente em 625 nm. 4. Amostra Sero utilizadas amostras de gema de ovo. 4.1 Preparo da amostra: a) Gema ovo: Desproteinizao com TCA

(ver fator de diluio com o

professor). Filtrar. Utilizar o sobrenadante.5. Reagentes Encontram-se prontos para uso [kit para determinao de ferro por metodologia colorimtrica direta - Analisa]. 5.1 Padro____ g/dL- soluo aquosa contendo ferro [concentrao indicada no rtulo do frasco]. 5.2 Reagente de cor: contm cromazurol B 0,2 mmol/L; brometo de hexadeciltrimetilamonio 2 mmol/L; tampo acetato 100 mmol/L, pH 4,8. 6. Procedimento Experimental: 1 - Permitir que reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente; 2 - Pipetar em diferentes tubos de ensaio, como est descrito a seguir: Branco Amostra gema ( L) Padro ( L) gua deionizada ( L) Reagente de Cor ( L) Abs 75 1500 Padro (P) 75 1500 Amostra (Gema) 75 1500

3 - Homogeneizar bem e incubar por 10 minutos temperatura ambiente; 4 - Determinar as absorbncias do padro e da amostra em 625 nm, acertando o zero com o branco. A cor formada estvel por 2 horas.

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Linearidade: A reao linear at 500 g/dL. Para valores maiores diluir a amostra, realizar nova determinao e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio. 7. Resultados Clculos - Concentrao de Ferro na amostra Concentrao do Padro (CP) = _____ g/dL Concentrao da amostra = CA Lembrem-se: CA = AbsA x CP AbsP CA = Abs A x g/dL x FD Abs Padro g/dL) CA = [ ] g/dL (concentrao de ferro na amostra em

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 07 (P7): Determinao quantitativa de cido ascrbico 1. Introduo Embora desde 1790 se sabia que as frutas ctricas contm um fator que previne o escorbuto, este fator s foi isolado e identificado como vitamina C em 1933. O cido ascrbico est presente em todos os tecidos de animais e plantas superiores. necessrio que ele esteja presente na dieta de seres humanos e de mais alguns outros vertebrados. A maioria dos animais, e provavelmente todas as plantas, podem sintetizar o cido ascrbico a partir de glicose. 2. Fundamentos O mtodo baseia-se no poder redutor do cido ascrbico, propriedade devida ao grupo dienol que faz parte de sua estrutura. O 2,6-diclorofenolindofenol (2,6 DCFIF) um corante fortemente azul no estado oxidado. Ao ser reduzido (no caso pelo c. ascrbico), torna-se incolor. O cido ascrbico, por sua vez, oxidado a c. dehidroascrbico. Por isso, quando todo o cido ascrbico for oxidado, o primeiro excesso do corante ficar na soluo, conferindo-lhe uma colorao rosada (em meio cido o 2,6-diclorofenolindofenol tem essa cor). A reao de oxi-reduo a seguinte:

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3. Objetivos Determinar a concentrao de cido ascrbico em frutos ctricos, sucos naturais e industrializados. 4. Reagentes 4.1 Extrator e estabilizador (do c. dehidroascrbico): Sol. cido actico a 5% v/v. 4.2 Oxidante: Sol. 2,6-Diclorofenolindofenol. Dissolver 42mg de bicarbonato de sdio e 52mg de 2,6-diclorofenolindofenol em 50mL de gua destilada. Agitar, vigorosamente, e quando o corante estiver dissolvido, completar o volume at 200mL de gua destilada. Filtrar em papel pregueado para garrafa de cor mbar, que dever ser arrolhada e guardada do abrigo da luz em refrigerador. 4.2 Padro: Sol. cido ascrbico 100 mg/100 ml (1mg/1mL) Pesar 100mg de cido ascrbico, purssimo, e transferir atravs de funil de vidro com auxlio de soluo de cido actico a 5% para um balo volumtrico de 100mL. Completar o volume com a mesma soluo. 5 Procedimento experimental 5.1 Padronizao da soluo corante a) Encher uma bureta de 25mL com sol. 2,6-Diclorofenolindofenol. b) Transferir duas pores de 5mL cada uma de soluo de cido actico a 5% para 2 erlenmeyer, adicionar 2mL de soluo padro a cada um (2mg de cido ascrbico). c) Titular rapidamente com soluo de 2,6-diclorofenolindofenol contida na bureta at obter uma colorao rosada leve, porm, bem distinta que persista no mnimo por 5

26 minutos. Fazer isto com os dois frascos. Os resultados no devem diferir entre si por mais de 0,1 a 0,2 mL. d) Calcular e expressar a concentrao da soluo de 2,6-diclorofenolindofenol em termos de mg de c. ascrbico equivalente a 1mL de corante. Esse ser o ttulo da soluo de 2,6-diclorofenolindofenol. Exemplo: Suponhamos que se gaste nas titulaes: 1.................14,7 mL 2................. 14,9 mL Considerando que em 2mL de soluo de c. ascrbico 100 mg% temos 2mg do mesmo, ento: 14,9mL de indofenol oxidam 2,0 mg de c. Ascrbico 1,0mL de indofenol oxidar X= 0,135mg, ou seja, o ttulo da soluo de indofenol igual a 0,135 mg/mL de corante. 5.2 Preparao da amostra a) Pesar o(s) fruto(s) a serem usados antes de iniciar o prximo passo. b) Cortar um fruto e espremer diretamente sobre um papel de filtro em funil de vidro. c) Quando houver recolhido, em frasco limpo, aproximadamente 15mL, medir 10 ou 15mL de suco com pipeta volumtrica e transferir para um frasco limpo. d) Adicionar um volume idntico de soluo de cido actico a 5% usando a mesma pipeta. Homogeneizar bem. 5.3 Determinao de cido ascrbico na amostra a) Usando pipeta volumtrica, transferir duas pores de 5mL cada uma para dois frascos ou copos diferentes. b) Titular cada uma das pores com soluo de 2,6-diclorofenolindofenol tal como foi feito para a soluo de cido ascrbico. c) Expressar a concentrao de cido ascrbico em termos de mg/100mL de suco.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA DISCIPLINA DE BIOQUMICA FISIOLGICA BQA 5110 Aula Prtica 08 (P8): Determinao de carboidratos redutores no mel 1. Introduo O mel um lquido doce, viscoso, cristalizvel, obtido pelas abelhas a partir do nctar secretado pelas plantas. O nctar transformado em mel pela inverso da maior parte da sacarose frutose e glicose e pela remoo do excesso da umidade. A composio do mel varia de acordo com a fonte natural, as condies ambientais relativas ao grau de amadurecimento quando extrado, mtodos usados no processamento e condies de estocagem. Assim, os principais constituintes do mel so: gua, frutose, glicose, sacarose, dextrina, etc. outras substncias ocorrem em pequenas quantidades como: plen, leos essenciais, pigmentos, enzimas, ceras, hormnios de plantas, maltose, lcool-acares, protenas, clcio, fsforo, ferro, sdio, potssio e vitaminas. Como se pode constatar, o mel constitudo por uma ampla e variada gama de elementos, dos quais nos ateremos a determinar os componentes qualitativamente mais significativos, ou seja, os carboidratos redutores. 2. Objetivo Determinar as concentraes de carboidratos redutores presentes em amostra de mel. 3. Fundamento Os carboidratos que possuem grupos aldedos ou cetol livres ou potencialmente livres apresentam a propriedade de reduzir os ons de certos metais como cobre, bismuto, ferro, prata e mercrio, especialmente em solues alcalinas. Alguns dos mtodos mais amplamente usados para avaliao qumica de carboidratos redutores baseiam-se nessa propriedade. O cobre, sob forma de ons cpricos, usado preferencialmente, devido facilidade de leitura pelo mtodo fotomtrico. Quando o hidrxido cprico (azul e insolvel) suspenso em meio alcalino e aquecido, converte-se em xido cprico (preto e insolvel):

28 OH Cu OH Hidrxido cprico xido cprico OH CuO + H2O

Na presena de substncias redutoras como aldedos e carboidratos, no entanto, o hidrxido cprico reduzido at o estado de oxido cuproso (amarelo e vermelho); tambm insolvel: OH 2 x Cu O OH Hidrxido cprico xido cuproso agente redutor OH -

CuO-2 + 2H2O +

O uso de uma suspenso de hidrxido metlico insolvel, como reagente quantitativo, tem evidentes desvantagens prticas. Mas certos compostos orgnicos, especialmente aqueles contendo um ou mais grupos OH (alcolicos) na estrutura molecular reagem, em meio alcalino, com os hidrxidos metlicos para formar complexos solveis que, apesar de serem relativamente pouco ionizados, dissociam o bastante para fornecer ons do metal em quantidades suficientes para que as reaes de oxi-reduo possam ocorrer. A formao de tais complexos a base da maioria dos reagentes para detectar e determinar carboidratos redutores. A quantidade de xido cuproso formado essencialmente proporcional quantidade de carboidrato redutor existente na soluo em anlise desde que se sigam rigorosamente as especificaes e procedimentos recomendados. Neste mtodo a quantidade de xido cuproso formado por reduo das solues cupro-alcalinas avaliado por meio de tcnicas fotocolorimtricas, que medem a intensidade da cor azul (azul de molibdnio), uma mistura complexa de xidos de molibdnio, que se forma quando se trata o xido cuproso com reagentes molibdicos. 4. Procedimento Experimental 4.1 Solues a) Soluo estoque de glicose: 1g/100 ml em soluo saturada de cido benzico Dessecar glicose p.a sobre pentxido de fsforo ou cloreto de clcio anidro, em dessecador a vcuo. Preparar uma soluo saturada de cido benzico, dissolvendo aproximadamente 2g em 1L de gua, com ajuda de calor. Pesar exatamente 1g de glicose dessecada e dissolver at 100ml com soluo saturada de cido benzico em balo volumtrico.

29 b) Soluo padro de glicose (100 g/ml): Transferir 1ml da soluo de glicose 1g% por meio de uma pipeta volumtrica, para um balo volumtrico de 100ml e completar o volume com soluo saturada de cido benzico. c) Soluo alcalina: Dissolver em 800ml de gua 200g de sulfato de sdio anidro, 25g de tartarato de sdio e potssio, 25g de carbonato de sdio anidro e 20g de bicarbonato de sdio. Completar o volume para 1000ml em balo volumtrico. Conservar a temperatura no inferior a 20 C. d) Soluo cprica: Dissolver 15g de sulfato de cobre cristalizado em cerca de 90ml de gua destilada, adicionar uma gota de cido sulfrico concentrado e completar o volume para 10ml de balo volumtrico. e) Soluo cupro-alcalina: preparada imediatamente antes de usar, a partir das solues descritas a seguir nas propores: sol. alcalina 24 volumes; sol. cprica 01 volume f) Soluo molbdica (cido fosfomolbdico): Dissolver 66g de molibdato de sdio, isento de amnia e 5g de tungstato de sdio em cerca de 300ml de gua. Adicionar 125ml de cido fosfrico concentrado (85%) e completar para 500ml de gua destilada. Guardar em frasco escuro, com tampa de vidro. 4.2 Protocolo experimental a) Padres: Pipetar, para tubos de ensaio limpo e secos devidamente marcados, 0,25; 0,50; 0,75 e 1ml de soluo padro de glicose 100 g/ml; completar o volume para 1ml com gua destilada. Preparar o tubo branco pipetando 1ml de gua destilada. b) Amostra: a amostra dever ser diluda com gua destilada 1:6000 * Observar a diluio da amostra

30 Branco (B) Padro Amostra (Dil______) gua destilada 1,0mL 0,5 mL Amostra 0,5 mL P1 0,25mL 0,75mL P2 0,50mL 0,50mL P3 0,75mL 0,25mL P4 1,0mL -

Sol. Cupro1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL alcalina c) Adicionar a todos os tubos (padres, amostras e branco) 1ml de soluo cuproalcalina. Colocam-se todos, depois de bem homogeneizados, em banho de gua fervente e deixar entre 15 minutos. Esperar esfriar. d) Adicionar 1ml de reativo molbdico a todos. Dilui-se o contedo de cada tubo com 5ml de gua destilada (ou mais se as cores forem intensas). Fazer leitura da absorbncia entre 530 a 550nm utilizando o tubo que foi preparado com gua destilada como branco.

Reativo Molbdico gua destilada 5. Resultados

1,0mL 5,0mL

1,0mL 5,0mL

1,0mL 5,0mL

1,0mL 5,0mL

1,0mL 5,0mL

1,0mL 5,0mL

5.1 Absorbncias obtidas: P1 P2 P3 P4

Amostra Abs

5.2 Clculos 1. Lanar os dados obtidos com as leituras das solues padres em um papel milimetrado e traar uma curva de calibrao. A partir desta curva determinar as concentraes das amostras em anlise por interpolao direta. 2. Calcular a concentrao de carboidratos redutores totais na amostra de mel em g/100g de mel.

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