Roterio 4-5 -Testes Bioquimicos

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DE ALIMENTOS

TA- 918 Microbiologia e Fermentações

PRÁTICA N 4/5:CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

INTRODUÇÃO

Após o isolamento em cultura pura, os micro-organismos podem ser identificados no laboratório.

Milhares de espécies bacterianas já foram isoladas e suas características descritas no “Manual de

Bergey”, uma referência em qualquer estudo taxonômico de bacteriologia.

A identificação de bactérias pode ser realizada de diversas maneiras, através da observação

das características morfológicas, como dimensão, forma, arranjo e estrutura das células; culturais, que

referem-se à aparência macroscópica em diferentes meios de cultura; fisiológicas, relacionadas com a

capacidade dos microrganismos em sintetizar enzimas intra ou extracelulares, de assimilar diferentes

substratos ou gerar produtos metabólicos específicos e genéticas, por meio da identificação de regiões

especificas do genoma da célula (16S).

O metabolismo celular compreende transformações dos nutrientes por reações químicas

organizadas, catalisadas por enzimas. As enzimas são a expressão do potencial genético da célula e a

avaliação da presença de um conjunto definido de enzimas pode auxiliar na identificação dos

microrganismos. Enzimas microbianas podem ser intra ou extracelulares. Enzimas extracelulares ou

ligadas à parede exercem sua atividade catalítica fora da célula. Algumas transformam substratos de

elevado peso molecular em compostos menos, para serem transportados através da membrana e

metabolizados no interior da célula. Enzimas intracelulares são responsáveis pela síntese das

estruturas celulares e pela produção de energia.

O metabolismo gera produtos que são excretados pela bactéria no meio de cultura, e a

presença ou ausência desses produtos também pode ser utilizada na sua identificação.

Numa rotina de identificação, os resultados de vários testes são comparados aos de espécies

descritas no “Manual de Bergey”.

Objetivo : Identificar as reações características dos testes bioquímicos.

PRINCÍPIOS DOS TESTES BIOQUÍMICOS

TESTE PRINCÍPIO

Teste Vogues-Proskauer (VP)

Este teste é utilizado para determinar a habilidade de alguns organismos produzirem um composto neutro, a acetoína (acetilmetilcarbinol), a partir da fermentação da glicose. A detecção da acetoína constitui a base da reação VP. Em presença de oxigênio, acetoína forma diacetil que, ao reagir com KOH, forma um complexo de cor róseo-avermelhada.

Teste do Vermelho de Metila (VM)

Algumas bactérias fermentam a glicose com produção dos ácidos fórmico, acético, lático, succínico e outros produtos. Esses ácidos promovem uma diminuição nos valores de pH do meio, em torno 4,3. Essas diferenças metabólicas podem ser evidenciadas pela adição de uma solução de vermelho de metila (indicador de pH) ao meio onde foi cultivado o microrganismo de interesse.

Teste de Citrato Simmons

A assimilação do citrato indica a presença de citrato permease, que transporta o citrato para o interior da célula. Do metabolismo do citrato é produzido piruvato e Co2. Este último, ao reagir com o sódio presente no meio, forma carbonato de sódio, elevando o pH. O meio Agar Citrato de Simmons (pH 7,3 – verde) possui citrato de sódio como única fonte de carbono e azul de bromotimo como indicador de pH. Assim a utilização do citrato como fonte única de carbono, resulta na alcalinização do meio.

Teste de Indol A ação de triptofanases bacterianas sobre o aminoácido triptofano, presente em peptonas, gera um produto volátil denominado indol. A presença do indol pode ser detectada pela adição do reativo de Kovacs, após crescimento da cultura, resultando na formação de uma coloração vermelha na superfície do meio. A ausência da coloração vermelha indica que o triptofano não foi hidrolisado.

Teste TSI Determinar a habilidade de 1 organismo para utilizar 1 carboidrato específico incorporado em 1 meio basal de crescimento, com ou sem a produção de gás, juntamente com a possível produção de H2S.

Teste da Catalase A detecção da produção da enzima catalase pela bactéria se dá através de observação do desprendimento de bolhas (O2) quando água oxigenada é adicionada à cultura.

Teste de Oxidação-Fermentação

Determinar o metabolismo oxidativo ou fermentativo de um carboidrato ou a sua não utilização. Alguns microrganismos produzem ácido somente quando crescem aerobicamente.

Hidrólise do Amido Bactérias que utilizam o amido como fonte de carbono produzem amilase, enzima extracelular capaz de hidrolisar o amido. Adicionando, após o crescimento, solução saturada de iodo (Lugol) sobre o meio de cultura, o iodo reage com o amido, formando um complexo de cor azul. Assim o teste permite determinar a habilidade de produção de amilase pelo microrganismo.

1) Determinação das características bioquímicas dos micro-organismos.

Observe que alguns ensaios deverão ser iniciados hoje e somente finalizados na

próxima aula.

Trazer o roteiro na próxima aula para a finalização dos testes bioquímicos!

1.1 Teste da Catalase

S. aureus

Material 1 alça para a inoculação, 1 lâmina e água oxigenada 3%.

Procedimento Com 1 alça, transferir um inóculo da cultura de 24 h para 1 lâmina. Adicione 1

gota de água oxigenada 3%.

Interpretação

dos resultados

(+): borbulhamento imediato (-): sem presença de

bolha

1.2 Teste de hidrólise do amido

Bacillus cereus

Materiais Placa com meio de amido, lugol.

Procedimento Inocule por estria no centro da placa contendo meio de amido.

Incube por 24-48 hrs. Após esse tempo acrescente lugol na placa.

interpretação dos resultados (+): formação de halo

transparente ao redor da cultura.

(-): não formação de halo.

1.3 Teste de Oxidação-Fermentação

Pseudomonas fluorescens

Escherichia coli

Material 1 agulha de , 4 tubos contendo meio OF e ágar 2%

Procedimento Inocular em picada os tubos com de meio OF (oxidação-fermentação) com as

culturas de P. fluorescens e E. coli, sendo dois tubos para cada cultura.

Um tubo de cada cultura deverá ser vedada com ágar 2% ou vaspar e os outros

dois tubos permanecerá apenas com tampa. Incube a de 35C/48h.

Interpretação

dos resultados

Metabolismo

Tubo aberto Tubo fechado

oxidativo (O)

Amarelo

verde/roxo

fermentativo (F)-anaerogênico

Amarelo amarelo

fermentativo (F)-aerogênico amarelo com gás amarelo com gás

oxidativo ou fermentativo (OF) amarelo ou amarelo c/gás amarelo c/ gás

Inerte verde / azul / roxo verde/ roxo

1.4 Teste de Indol – (caldo triptona 1%)

Escherichia coli/Enterobacter aerogenes

Material 1 alça de inoculação e 1 tubo com Caldo triptona 1% (Indol)

Procedimento Transferir uma alçada do inoculo, para o tubo com Caldo Triptona 1% e incubar nas

temperaturas de 35C/24 h. Adicionar 0,2 a 0,3 mL do Reagente de Kovacs para

cada 4,0 a 5,0 mL de cultura em Caldo Triptona e agitar levemente. Observar.

interpretação

dos

resultados

(+):desenvolvimento de 1 anel vermelho-

violeta na superfície do meio de cultura

(teste +)

(-):anel permanece amarelado, cor do

reagente de Kovacs (teste -)

1.5.Teste do Vermelho de Metila (VM)


Material 1 alça de inoculação e 1 tubo com meio MR VM

Procedimento Inocule uma alçada da cultura em meio MR VM e incube a temperatura de 35C/

24-48 h. Adicione cerca de 5 gotas de solução alcoólica de vermelho de metila

10% ao tubo de ensaio.

Interpretação

dos resultados

(+): coloração vermelha do meio (-): coloração amarela

1.6 Teste Voges-Proskauer (VP)


Material 1 alça de inoculação e 1 tubo com meio MR VP

Procedimento Inocule uma alçada da cultura em meio MR VP e incube a temperatura de 35C/

24-48 h. Adicione ao tubo de ensaio 1ml do reagente A (-naftol 5% (p/v)) e 0,4 ml

do reagente B (KOH 40% (p/v)), nesta ordem. Agite levemente o tubo e deixe em

repouso por meia hora.

Interpretação

dos

resultados

(+): desenvolvimento de uma cor

vermelha ou rósea no meio de cultura

(-): permanência do meio na cor do

reagente (amarela ou âmbar ou ligeiramente

esverdeada)

1.7 Teste de Citrato Simmons


Material 1 alça de inoculação e 1 tubo com meio citrato

Procedimento Transferir uma alçada do inóculo sobre a superfície do tubo inclinado de ágar citrato

de Simmons e incubar a na temperatura de 35C/ 48 h.

Interpretação

dos

resultados

(+): alteração da cor do meio de verde para

azul crescimento com viragem alcalina

(-): sem crescimento e sem

alteração da cor do meio (verde)

1.8 Teste de crescimento em Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI)


Material 1 agulha de inoculação e 1 tubo com TSI

Procedimento Inocular por picada até o fundo e estrias na superfície do meio TSI. Incubar nas

temperaturas de crescimento/24 h, com as tampas afrouxadas, e observar as

características de crescimento.

Interpretação

dos

resultados

(+): rampa alcalina (vermelho) e fundo ácido (amarelo), c/ ou s/ H2S Samonella

sp.

rampa e fundo ácidos (amarelo), s/ H2S E. coli, Enterobacter aerogenes

alcalinização do meio (vermelho) P. fluorescens

2. Crescimento em EBM ( Agar eosina azul de metileno)


Material 1 alça de inoculação, uma placa de EMB.

Procedimento Fazer estrias da cultura (esgotamento) em Agar EMB. Incube a de 35C/48h.

Interpretação dos resultados

E. coli - Colônias pequenas brilhantes verde metálico. E. aerogenes - Colônias grandes, cor rosa escuro.

TESTES Escherichia coli Enterobacter aerogenes Salmonella sp

Gram Bastonete, G negativo Bastonete, G negativo Bastonete, G negativo

Indol + - -

VM + - +

VP - + -

Citrato - + +

EMB Colônias pequenas brilhantes verde metálico

Colônias grandes, cor rosa escuro

Colônias pequenas transparentes

Documents

Roterio 4-5 -Testes Bioquimicos