Salmonella Saintpaul, Salmonella Infantisの薬剤耐性株の分子遺伝学的解析

誌名誌名 愛知県衛生研究所報

ISSNISSN 05157803

巻/号巻/号 55

掲載ページ掲載ページ p. 1-8

発行年月発行年月 2005年3月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

愛知衛所報 No.55，2005

愛知衛所報 No.55，1-8，2005

調査 研究

Salmonella Saintpaul、SalmonellaInfantisの薬剤耐性株の分子遺伝学的解析

秦 虞美、青木和夫町、鈴木匡弘、松本昌門、高橋正夫、柴 賢司

キI春日井保健所(現在の所属:尾張事務所)

要約

薬剤耐性を示す SalmonellaSaintpaul 4株およびSalmonellaInfantis 9株について保有する薬

剤耐性関連遺伝子を調べた。Saintpaulの 2株と Infantisの 6株にクラス 1インテグロンが認

められた。インテグロンにはストレプ卜マイシン耐性遺伝子が含まれており、 Saintpaulでは 2

株とも aaι42，Infantisでは全株から aadA1が認められた。また、 Saintpaulのインテグロン

にはトリメトプリム耐性遺伝子(品企XI./)も見出された。 テ トラサイクリン耐性遺伝子は

Saintpaulでは tetD、tetA、Infantisでは tetAが検出された。カナマイシン耐性遺伝子は共通

して apι41が見出された。

キーワード:S. Saintpaul、S.Infantis、薬剤耐性、 クラス 1インテグロン

序文

食中毒の主な原因菌であるサルモネラの薬

剤耐性状況を把握することは、臨床的にも公

衆衛生上も重要である。当所では 2002-3年に

愛知県内で分離されたサルモネラ菌 104株の

薬剤耐性について調査を実施し、 その結果を

web上で公開している 1)0 Saintpaulは我

が国では 1999年以降に特に多く分離される

ようになったサルモネラ血清型である 。

我々はこれまでに、愛知県で 1999年以降分

離された S.Saintpaul株のほとんどが同年

以降に新たに生じたクローン由来であること

を明らかにしてきた 2)。 薬剤耐性に関して

は、愛知県内の患者、保菌者由来の菌株 80

株 (1981-2002年)を調査した結果では耐性

株は 2株のみであった 2)。 ところがその後の

調査により、下水から見出された s.Saintpaul株に多剤耐性株が見出された。 我

が国ではこれまでに S.Saintpaulの多剤耐性

株の報告は全くなされていない。その理由の

ーっとして、従来は分離率の低い血清型であ

ったためと考えられるが、近年は分離率の高

い血清型であるため、薬剤j耐性の拡散が懸念

される。本研究では、これらの薬剤耐性株に

ついて耐性の機序を明らかにするために、分

子遺伝学的解析を実施した。 また、前述の調

査 (2002・3年に愛知県で分離されたサルモネ

ラ 104株の調査)では検出された血清型のう

ちInfantisの薬剤耐性率が最も高く (9114株

-64.3%)、多剤耐性株 (6/9株)も見出され

ている 1)0 Infantisは従来から毎年高い分離

率を示す血清型であり、病原性も強し、重要な

菌種であることから、 Infantisについてもそ

の薬剤耐性の機序について解析を加えた。

細菌における薬剤耐性の獲得には、 トランス

ポゾン、インテグロン、プラスミド、ファー

ジ等による薬剤耐性遺伝子の水平、垂直の拡

散によってもたらされるルートが存在してい

る 3)。いくつかの薬剤耐性遺伝子は転写発現

活性をもたないカセットとして存在するが、

インテグロンはこれらのカセ ット遺伝子を組

み込むのに必要なインテグラーゼと遺伝子を

発現させるのに必要なプロモーター配列を有

する因子である。いろいろな種類の薬剤耐性

遺伝子カセットを組み込んだインテグロンが

トラスポゾンに組み込まれ、このトランスポ

ゾンがプラスミド、ファージに転移して、多

剤耐性を拡散させていくと考えられている。

インテグロンはいくつかのクラスがあるが、

その中でクラス 1インテグロンが最も解析が

進んでいる 4)5)。 多くのサルモネラにおいて

もクラス 1インテグロンに担われた薬剤耐性

遺伝子の存在が報告されている即日)。本研究

では多剤耐性の伝播に重要な役割をもっクラ

ス 1インテグロンに注目し、インテグロンお

よび関連する各種薬剤耐性遺伝子について解

析を加えた。

愛知衛所報 No.55，2005

材料と方法

1. 菌株

S. Saintpaul :春日井市内の 4カ所の浄化槽

水、小牧市、尾張旭市、豊明市内の 3カ所の

浄化槽水、および稲沢市内の河川水の計 8カ

所から分離された S.Saintpaul株 8株 (2001

年)を調査して得られた薬剤耐性株 2株 (#4，

#5一春日井市内の分離株)、および、 2002

年に調査した愛知県内の患者、保菌者由来 E

Saintpaul 80株 (1981-2002年) のうちの 2

株の薬剤耐性株 2)の計 4株について解析した。

S. Infantis : 2002-3年に愛知県内の患者、保

菌者より分離された 14株のうち、薬剤耐性の

認められた 9株を供試した。

2. 薬剤耐性

薬剤耐性は感受性ディスク法 (KBディスク、

栄研化学)により調べた。調査薬剤はアンピ

シリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、

クロラムフェニコーノレ、テトラサイクリン

フォスフオマイシン、セファロリジン、ナリ

ジクス酸、ノルフロキサシンの 9剤である。

3. 薬剤耐性遺伝子の解析

薬剤耐性関連遺伝子は、特異的プライマーを

用いた PCRにより検出を試みた。用いたプラ

イマーの一覧を表 1に示した。表 1に示した

インテグロン関連遺伝子、ストレプトマイシ

ン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テ

トラサイクリン耐性遺伝子の他に、テトラサ

イクリン耐性遺伝子の tetB，tetG， tetE， tetC

8)， クロラムフェニコール耐性遺伝子の fJo，

cmlA， catAl 7)等の検出を試みた。

PCR反応は TakaraExTaqを用い、 950C，5

分変性の後、 950

C，30秒、 540

C，30秒、 720

C、

45秒のサイクルを 30回、最後に 720C、2分

の条件で増幅した。インテグロンについては

extenslOnを 720

C、3分で行なった。

-2-

変知l衛所幸11 No.55， 2005

表 1. 薬剤耐性関連遺伝子 と検出用プライマー

Gene Size(bp) Primer Sequence 5'・3' Reference

Integron Variable 5'CS GGCATCCAAGCAGCAAGC 7

3'CS AAGCAGACTTGACCTGAT

Integrase 558 InllF GCCTTGCTGTTCTTCTAC 7

IntlB GATGCCTGCTTGTTCTAC

qacEsI 250 qacEsl F A TCGCAA T AGTTGGCGAA 7

qacE.J1B CAAGCTTTTG仁CCATGAAG

sulJ 436 sulJF CTTCGATGAGAGCCGGCG 7

sulJB GCAAGGCGGAAACCCGCG

aadAl 526 aadA1F GTGGATGGCGGCCTGAAG 7

。。ι41R A TTGCCCAGTCGGCAGCG

ααdA2 381 。。ι42F TGTTGGTTACTGTGGCCGT 8

。adA2R GCTGCGAGTTCCATAGCTT

αrpMl 489 。rphA1F TTA TGCCTCTTCCGACCA T 8

aphA1R GAGAAAACTCACCGAGGC

tetA 210 tetAF GCTACATCCTGCTTGCCTT 8

tetAR CATAGATCGCCGTGAAGA

telD 787 tetDF AAACCATTACGGCATTCTG 8

tetDR GACCGGATACACCATCCA

4. インテグロンの解析 (M討を用いた。 LB培地にて一晩振とう培

5'CS/3'CSプライマーによって増幅された 養した供受菌の CSH-2A0.2 mlおよび供与

PCR産物は pGEM-T(Promega)にクローニ 菌 0.1mlをLBlmlに加え、 37t、6時間

ングし、 IRdye-terminator 法にて LICORの 培養した培養液を、ナリジクス酸 50llg/ml

シーケンサーIR2にて塩基配列を調べた。 と 25llg/mlのテトラサイクリン、ストレプ

5. プラスミドの解析 トマイシン、カナマイシン、クロラムフェニ

プラスミドは、アノレカリ融解した菌体からフ コールをそれぞれ含む4種類の選択培地に各

エノール ・クロロホルム(1:1)にて抽出した 9}。 100pl播き、 370Cにて 一晩培養して、

プラスミドの伝達実験は E coli CSH-2A transconjugantsを選択した。

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'愛 知 liifllj l!lí)il~ NO.55.2005

表 2. クラス 1インテグロンおよび薬剤耐性遺伝子の検出

Serotype Strain Resistance patter5'/3'CS (kb: Intl quaE_¥ 1 su/l aadAl aadA2 tetA tetD aphAl

Saintpaul #4 SM.TC.KM.CP + (1.9) + + + + + +

#5 SM，TC.KM，CP + (1.9) + + + + + +

94-158 SM，TC +(3，1.1) + +

0-162 TC + (1.1) +

Infantis 2-3 SM，TC.KM，NA +

2-13 SM.TC.KM + (1) + + + + + +

. 2-117 SM.TC + (1) + + + + +

2-153 SM.TC.KM +(1) + + + + + +

2-171 SM.TC + (1) + + + + +

3-3 TC.KM.NA + (1) + + + + + +

3-78 SM.TC.KM.NA + (1) + + +

3-79 SM，TC，KM，NA +(1) + +

3-185 SM.TC + (1) + + + + +

SM:ストレプトマイシン、 TM:テトラサイクリン、 KM カナマイシン、 CP クロラムフェニコール、 NA ナリジクス酸

結果

1. 薬剤耐性株の耐性パターン耐性薬剤は表

2に示した。S.Saintpaul 4株、 S.Infantis 9

株の全 13株のうち、テトラサイクリン耐性は

全株に、ストレプトマイシン耐性は 11株に、

カナマイシン耐性は 8株に認められた。s.Saintpaul株についてみると、下水由来の#4

と#5は共に、ストレプトマイシン、テトラサ

イクリン、クロラムフェニコーノレ、カナマイ

シンの 4剤に耐性を示した。 一方、ヒト由

来の S.Saintpaul 2株はそれぞれ、ストレ

プトマイシンの単剤耐性、およびストレプ卜

マイシン、テトラサイクリンの 2剤耐性を示

した。 一方 S.Infantisでは、9株中 6株が 3

剤以上の耐性を示し、うち 5株はストレプト

マイシン、テトラサイクリン、カナマイシン

を含めた 3剤以上に耐性を示した。

2. 薬剤耐性遺伝子

クラス 1インテグロン クラス 1インテグロ

ンの共通領域に位置するプライマーによる

PCRで、ampliconが検出された菌株、およ

び amplicon のサイズを表 2 に示した。

Saintpaulでは下水由来株 2株で共通して 1.9

kbの ampliconが得られた。Infantisでは 9

株のうち 8株で共通して 1kb の ampliconが

得られた。

クラス 1インテグロンのインテグラーゼ遺伝

子である Int.よ クラス 1インテグロンに付随

して存在する 4級アンモニウム塩耐性遺伝子

quagそれにサルファ剤耐性遺伝子 sull等

も、 5'CS/3'CSの ampliconが検出された 12

株のうち 8株の菌株で検出された。 したがっ

て、これら 8株の菌株についてはクラス 1イ

ンテグロンを保有していると判断された。

一方、 Saintpaulのヒ卜由来株全 2 株と

Infantisの2株 (2/9)ではこれらの遺伝子は検

出できなかったことから、 5'CS/3'CSの増

幅産物は非特異的なバンドである可能性も考

えられた。

-4-

愛知11:m!JfHl No.55，2005

qacEふ sulJ

→一今

d，~aa22

図 1. S. Saintpaulの下水由来株に見出されたインテグロ ンの構造

ストレフトマイシン耐性遺伝子 Saintpaul

でス トレ プ トマイシン耐性を示した 3株

(3/4) とも aadA2を保有していた。これに

対し Infantisでは、耐性を示した 8株 (8/9)

のうち 7株が、 aadA2ではなく aaι41のみ

を保有しており、血清型により 耐性遺伝子に

速いが認められた。これらの耐性遺伝子はク

ラス 1インテグロン内のカセット遺伝子とし

て検出されることが多いとされている心。 実

際今回の我々の検討でも、インテグロンの

ampliconをtemplateとして aadA1、aadA2

の PCRを実施したところ、いずれの遺伝子

も検出することができた。このことから、こ

れらの菌株でも aadA1、aaι42がクラス 1イ

ンテグロンに担われていることが示された。

トリメトプリム耐性遺伝子 :Saintaul株 #4，

#5のインテグロンのシーケンスにより、

aadA2の上流に dhρXII(AF335108)が見出

された。図 1にシークエンスにより 明らかと

なった#4，#5のインテグロンの構造を示した。

テトラサイクリン耐性遺伝子 Saintpaulで

は 4株全株がテトラサイクリン耐性を示した

が、うち 3株が tetDを、 1株が tetAを保有

していた。Infantisでは 9株すべてが耐性を

示し、うち 8株が tetAを保有していた。1株

については検出を試みた 6種類のテ卜ラサイ

クリン耐性遺伝子 (tetA，B， G，D，E， G )のいず

れもが検出されなかった。

カナマイシン耐性遺伝子:Saintpaulでは 2

株が耐性であり、いずれも aph1を保有して

いた。Infantisでは 6株が耐性を示し、うち

5株が同様に aph1を保有していた。残り 1

株については、 aadD等 10)その他のカナマイ

シン耐性遺伝子を保有し、耐性を示している

ことも考えられる。

クロラムフェニコール耐性遺伝子・クロラム

フェニコール耐性は下水由来の Saintpaul2

株のみに認められた。クロラムフェニコール

耐性についてはサノレモネラ等グラム陰性菌に

多く見出される catA1，catB2， !Jo， cmlA遺伝

子の検出を試みたが、いずれも検出されなか

った。

3. プラスミドの伝達実験

薬剤耐性株はいずれもプラスミドを保有して

いた。 Infantisのプラスミドと薬剤耐性の

関連は従来から指摘されているため 11)、今回

は Saintpaulについてのみ、プラスミドの伝

達実験を実施し、解析を加えた。下水由来株

(#4，#5)は春日井市内のそれぞれ飲食庖、マ

ンションの浄化槽で採取された菌株ではある

が、同一サイズ(約 100kb)のプラスミドを

保有しており、耐性薬剤も同一であったこと

から、同じ薬剤耐性プラスミドを保有してい

る可能性が高いと考えられた。両菌株は伝達

-5-

実験の結果、4種類の耐性薬剤のすべての選

択培地に transconjugantのコロニーが出現

し、 それぞれ同一サイズのプラスミドを保有

していた。 このことから 4種の薬剤耐性遺

伝子はプラスミド上に存在していることが示

された。 また、プラスミドを templateとし

たPCRにおいてもインテグロンが検出され、

インテグロンもプラスミ ド上に存在すること

が示された。これに対し、 ヒト由来株 (94・158，

0・162)についてはいずれの株のプラスミド伝

達実験においても transconJugantは得られ

なかった。

まとめと考察

1.下水由来の SSaintpaul 2株はテトラサ

イクリ ン、 カナマイ シン、ス トレプ トマイ シ

ン、クロラムフェニコールの 4剤 (4/9)に耐

性を示し、保有するプラスミ ド上に 4剤の耐

性遺伝子が存在す?るこ とが示された。これら

2株からはいずれもテトラサイクリン耐性遺

伝子の tetD，カナマイ シン耐性の aphl遺伝

子が検出された。 ストレプトマイシン耐性

はクラス 1インテグロン内にある aadA2遺

伝子に担われていた。インテグロンのシーク

エンスを解析した結果、 aaι42と共にトリメ

トプリム耐性遺伝子である dhかXIIが見出さ

れた。なお、クロラムフェニコール耐性遺伝

子については同定できていない。

2. ヒ卜由来の SInfantisでは、 9株の薬剤

耐性菌のうち 6株がクラス 1インテグロンを

保有し、イ ンテグロンに担われたス トレプ ト

マイシン耐性遺伝子 aadlが認められた。テ

トラサイクリ ン耐性遺伝子としては 8株に

tetAが検出された。 SSaintpaulでも認め

られたカナマイ シン耐性遺伝子 aphlは 5株

に検出された。

愛知1街所総 No.55，2005

今回検討を加えたサルモネラの薬剤耐性株

の多くがクラス 1インテグロンを保有してい

た。クラス 1インテグロンは耐性遺伝子のカ

セットを複数取り込むことができるため、多

剤耐性を伝播する原因となる。今回解析した

菌株ではストレプ卜マイシン耐性、 トリメ ト

プリム耐性がカセ ット遺伝子と して検出され

たが、多剤耐性を媒介する可能性のあるクラ

ス 1インテグロンが高い割合で検出 された こ

とから、多剤耐性株の出現には今後も警戒し

ていく必要がある と思われる。

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2002.

-7-

愛知術所報 No.55，2005

Molecular characterization of drug-resistant isolates of Salmonella

Saintpaul and Salmonella Infantis

Mami Hata， Kazuo Aoki *， Masahiro Suzuki， Masakado Matsumoto， Masao Takahashi，

Kenji Sakae

* Kasugai Hea1th Center

Using 13 isolates of Salmonella serovars Saintpaul (2 isolated from environments and 2

from humans) and Infantis (9 isolated from humans) isolated in Aichi Prefecture， we studied

antibiotic (streptomycin， 】mnamycin， tetracycline， and chloramphenicon resistance

determinants and examined the presence of class 1 integron.

Two multidrug-resistant S. Saintpaul strains were isolated from sewerage in Kasugai

City. Both strains carried a class 1 integron harboring aadA2 (encoding

streptomycin-resistance) and dh丘Xll(encoding trimethoprime-resistance) gene cassettes，

adhl (encoding kanamycin resistance)， and tetD (encoding tetracycline resistance) genes

located in the plasmid. Two clinical isolates of S. Saintpaul had the genes of tetD or aadA2

and te凶 (encodingtetracycline resistance).

Among 9 clinical isolates of S. Infantis， the resistance genes of aadAl (encoding

streptomycin-resistance) and tetA were detected in 8 isolates. Six isolates of them carried

class 1 integrons containing aadAl gene cassette. The gene of adhl was detected in 5

isolates of S. Infantis.

-8-