1

Állati sejtek- hosszú ideig élı, ritkán, vagy egyáltalán nem osztódó sejtek, pl: neuronok

- rövid ideig élı sejtek pl. bélhámsejtek

Proliferáció – differenciáció – sejthalál: nerózis, vagy apoptózis

Sejtciklus- olyan események sorozata, mely a sejt duplikálódásához vezet, minden eukariótában hasonlóan történik

- szabályozásának zavara tumorképzıdéshez vezet – kikerül a sejt a kontroll alól

Az idegrendszerben is vannak ıssejtek és osztódó sejtek, kis számban, de a legtöbb neuron differenciált, nem osztódik, csak elpusztul

A kötıszöveti fibroblasztok tipikusan nem osztódó sejtek, de aktiválva újra beléphetnek a sejtciklusba.

Tanulmányozás: elszarusodó laphám – bır példáján

- alsó, bazális réteg: osztódóképes epitheliális ıssejtek – az alkalmanként osztódó sejtbıl az egyik utódsejt stem sejt marad, a másik gyorsan osztódó sejtté alakul – az összes réteg sejtjeit ezek állítják elı, melyek a felszín felé haladva differenciálódnak, majd elhalnak

Sejtbiológia - állati sejtek

Biológia MSc

A sejtciklus fázisaiA sejtciklus lényege: 2 db, a szülıi sejttel teljesen azonos utódsejt létrehozása

- M fázis – mitózis és citokinezis: a tulajdonképpeni sejtosztódás – két egyenértékő utódsejt létrehozása

- interfázis: a sejtosztódások közötti intervallum. 3 szakasza:

- G1 (first gap) fázis: mitózis és a DNS replikáció közötti szakasz

- S (synthetic) fázis: DNS replikáció

- G2 (second gap) fázis: DNS replikáció és a mitózisba való belépés közötti szakasz

- G0 fázis: többsejtőek differenciált sejtjei nem osztódnak tovább, G0 fázisba lépnek

Ellenırzı pontok, checkpoint: olyan pontok, ahol a külsı hatások szabályozni tudják a sejtciklus egyes szakaszaiba való át- vagy belépést, illetve az apoptótikus folyamatok beindulását.

2

Ellenırzı pontok, checkpointBiokémiai szabályzó körök, melyek detektálják a környezetbıl érkezı jeleket, illetve a sejtciklus során keletkezı hibákat és gátolják a sejtciklus további lépéseit. 4 fı ellenırzıpont van:

1) restrikciós pont: a G1 fázisban – a sejt életfolyamataira, és az ıt körülvevı extracelluláris mátrixxal való kapcsolatokra érzékeny: ha a sejt nem kap megfelelı növekedést serkentı stimulust a környezetébıl, nem lép tovább a G1 fázisból, apoptotizálhat.

2) a DNS károsodást ellenırzı pont jelen van a G1, S, és a G2 fázisokban is – gátolják a sejtciklusban valótovábblépést, és/vagy apoptózist indukálnak

3) DNS replikációs ellenırzı pont a nem replikálódott DNS-eket, vagy a replikáció során megrekedt replikációs villákat érzékeli – sok tekintetben hasonló a DNS károsodást ellenırzı ponthoz, de stabilizálva a replikáció során megrekedt replikációs villákat, elısegítheti azok kijavítását (repair-ban való részvétel).

4) osztódási orsó összeszerelését ellenırzı pont, vagy metafázis checkpoint: a mitózis alatt késlelteti a kromoszómaszegregációt minaddig, míg minden egyes kromoszóma hozzá nem kapcsolódik az osztódási orsókhoz.

A G1, S, és G2 fázis ellenırzıpontjai ugyanazt a stratégiát követik.

A DNS károsodást érzékelık detektálják (ataxia-telangiectasia mutated (ATM), ataxia-telangiectasia és Rad9 related (ATR))

– transzducereket: ált. protein kinázokat (Chk1 és Chk2), esetleg transzkripciós faktorokat (p53) aktiválnak – gátolják a sejtciklusban való továbblépést a ciklin-dependens kinázok gátlásán keresztül + egyéb hatások (pl. apoptózis)

A sejtciklus szabályozásaSchizosaccharomyces pombe hasadóélesztı sejtosztódásának tanulmányozása - cell division cycle-2+ (cdc2+) gén felismerése, ez szükséges a G1 → S és a G2 → M átlépéshez. A gén egy 34 kF proteinkinázt, a p34cdc2- kódol.

Minden eukariótában – emberben több, mint 10 kölönbözı p34cdc2-homológ protein kináz – néhány vesz részt a sejtciklus szabályozásában – reguláló alegységük a ciklin – ciklin-dependens kinázok (Cdk)

- p34cdc2 - Cdk1: G2 → M átmenet szabályozása állati sejtekben

- Cdk2: G1 → S és G2 → M átmenet

- Cdk4 és Cdk6: restrikciós pontokon való átmenet szabályozása

- Cdk7: más Cdk-k aktiválása, részt vesz továbbá az RNs transkripcióban, a sérült DNS javításában

- más Cdk: transzkripciós szabályzás, neuron difefrenciálódás, más Cdk-k helyettesítése

Ciklinek:

- kötıdésük szükséges a Cdk-k katalitikus aktivitásához

- 35 kD - 130 kD proteinek, hasonló struktúra: 5-5 α-hélixbıl álló 2 szimmetrikus domén – az egyik a ciklin-box

- emberben 16 ciklin

3

Ciklin-dependens kinázok aktivitásának szabályozása- szigorúan szabályzott

- rövid N-terminális, hosszú C-terminális közti hasadékban: aktív hely

- 4 aktiváló mechanizmus:

• ciklin kötés – konformációváltozás, T hurok elmozdulás és foszforiláció – enzimaktivitás stimulálása

• ATP-kötıhely közeli aminósav oldalláncok foszforilálása – gátló proteinek bekötıdése – enzimaktivitás gátlás

• ciklin kötés csak részleges aktiválás, Cdk-aktiváló kináz (CAK): teljes aktiválás, foszforilálja a Cdk2-cyclin A T hurkot (foszforilálható treonin oldalláncról kapta a nevét). Gerincesekben CAK: Cdk7-cyclin H

•Cdk1 és Cdk2 a ciklinen kívül a C-terminális doménjükön kötnek egy kis Cdc kináz alegységet is (Cks) – növeli a szubsztrát felismerés, és a Cdk-ciklin-Cks kináz által történı szubsztrát foszforilálás hatékonyságát. A Cks proteinekfontos szerepet játszanak ezen kívül a ciklin B és a Cdk gátló p27Kip1 lebontásában

- 2 inaktiváló mechanizmus

• G2: Myt1, Wee1 protein kinázok Cdk1-hez kötıdnek, befolyásolják az ATP kötést és hidrolízist – gátló foszforilálás(reverz hatás: Cdc25 foszfatázok)

• Cdk kis inhibitoros alegység: ciklin-dependens kináz inhibitor (CKI – Cdk-ciklin A inaktiválás), Cdk4 inhibitor (INK4 -Cdk4/6-ciklin D komplex gátlás - ATP-kötıhely zavarásával) család kötése. A Cdk inhibitoros fehérjék sejtciklus szabályzó szerepe fontos a G1 és G0 fázisban

G0 fázis- a többsejtő elılények legtöbb sejtje egy bizonyos feladat elvégzésére specializálódik, speciális szöveti struktúrát alkot és tovább nem osztódik – „kilép a sejtciklusból, G0 fázisba lép – nem nyugvó állapot, csak nem osztódik.

- nem feltétlenül végleges )órák, hetek, élethosszig) bizonyos hatásokra visszaléphetnek a sejtciklusba – szigorúan szabályozott folyamatok, a kontrollálatlan szaporodás

tumorképzıdéshez vezet

- a szövetekben mind az osztódások helye, mind az üteme

behatárolt – általában csak az eolpusztult sejtek pótlása;

szöveti sérüléskor megemelkedhet az osztódási ráta

G0 fázisba való belépés- differenciálódást indító külsı hatásokra pl.: TGF-β – szerint/treonin kináz receptor – Smad transzkripciós faktor aktiválás – fokozza az Ink4 családba tartozó Cdk inhibitor p15Ink4b expresszióját – Cdk4-ciklin D és Cdk6-ciklin D komplex specifikus gátlása, ill a Cdk4-ciklin D-hez kötıdı CKI osztályba tartozó gátló peptideket leszorítva a kötésbıl lehetıvé válik azok Cdk2-ciklin E komplexhez való kötıdése, ami további sejtciklus-gátlást eredményez

Kontakt gátlás: ha túl sok a szomszédos sejt, egészséges sejtek TGF-β-t termelnek, ami CKI inhibitor p27Kip1 peptidenkeresztül felfüggeszti a sejtek sejtciklusát.

Harántcsíkolt izomban: MyoD transzkripciós faktor az izomdifferenciálódás fı szabályzója

- közvetlen környezeti hatások: pl mitogének hiánya – apoptózishoz, vagy G0 fázisba lépéshez vezet

- túl sokszor osztódott sejt (fıleg sejttenyészetben), illetve kedvezıtlen környezet – „öregedési folyamat”

4

G0 fázisból való kilépés- külsı hatás: sérülés, vagy sejtpótlás (turnover)

- tanulmányozás: sejttenyészeteken, pl.: fibroblaszt tenyészet – szérummentes tápoldatban: G0 fázis, szérum jelenlétében: gyors visszalépés a sejtciklusba – szövetsérülés modellje: a sérült sejtek közvetlen érintkeznek szérummal. Aktiválás hatására 3 expressziós hullám – aktivációs kapu – G1 fázisba való visszalépés szabályzó (restrikciós) pontja:

az 1. több, mint „korai" gén átíródása miatt látható, úgymint: transzkripciós faktorok (Jun, fos, myc, cink ujj család) –számos a sejt növekedésében és osztódásában fontos gén átíródását szabályozzák; szöveti újrarendezıdést indítófaktorok, citokinek (növekedési faktorok), extracelluláris mátrix komponensek (fibronektin), plazmamembrán receptorok(integrinek), citoszkeletális proteinek (aktin, tropomiozin, vimentin); angiogenezist, gyulladásos folyamatokat, véralvadást aktiváló anyagok – ezek elısegítik a fibroblasztok sérült területek felé vándorlását, a szövetkárosodás kijavítómechanizmusok beindulását.

a 2. hullám a késıkorai gének átíródása, ami a sejtciklus S fázisába való lépést biztosítja

a 3. hullám a késıi gének expressziója: S fázisába való belépés után, a sejt növekedéséhez, osztódásához szükséges proteinek, pl. ciklin D

A 2. és 3. hullám az 1. fázisban átíródó géntermékek jelenlétét feltételezi.

A tumorképzıdésA daganatokban genetikailag módosult sejtklónok olyan sejtek populációit hozzák létre, amelyekre a kontrollálatlan növekedés jellemzı. A sejtek nem töltik be eredeti funkciójukat, végül halálhoz vezethetnek

Bár a rákos megbetegedések aránya magas, az egyedben végbemenı sejtosztódások számához képest sejtszinten alacsonynak mondható. Oka: több genetikai módosulásnak kell általában egyszerre jelen lennie, hogy az egészséges sejt – daganatos sejt transzformáció végbemenjen, mivel a sejtciklus folyamatai olyan szigorúan szabályozottak. Több daganattípusban pont a szabályzó mechanizmus sérülése, vagy hiánya mutatható ki.

Majdnem minden daganattípusnál a sejtosztódás zavara a G1 fázisban végbemenı szabályzó folyamatok zavarával hozható összefüggésbe.

Kontakt gátlás: megfigyelhetı sejttenyészetekben: monolayert képzı sejtek, ha elérik a konfluenciát – kadherinek –osztódás gátlás

A daganatos sejtek gyakran elvesztik ezt a kontrollt (mutáció, vagy daganatkeltı vírusok: papillomavírusok, adenovírusok, SV40 géntermékei miatt) és addig nınek, amíg van táplálék

Daganatos sejtekKét géncsalád aktivitásában van általában abnormalitás:

- onkogének: sejtnövekedést és – osztódást szabályozó géntermékek, több, mint 100, állandó mitogén stimulációt utánozó hatás – szabályozatlan sejtosztódás. Pl.: Ras – MAP/ERK kináz kaszkád – ciklin D túltermelés, a humán daganatok 15%-ánál kimutatták a mutációját. A Ras nem megfelelı aktiválódása miatt a sejt azt hiszi, hogy állandómitogén stimulus éri – állandó proliferáció. A restrikciós pont szabályozásában szereplı proteinek (E2F1, cyclin D (az emlıkarcinómák 50%-ában overexpresszált ), Cdk4) hiperaktivitása

- tumor szuppresszor gének (Rb, p16): géntermékeik gátolják az onkogéneket

Rb: restrikciós pont gátlása, mitogén stimulációig (defektes gén – gyerekben: retinoblasztóma, felnıttben: oszteoszarkóma) p16 gén mutációja gyakori daganatos sejtekben

5

İssejtek- embriogenezis során a megtermékenyített petesejt elsı osztódásaival a szervezet összes testi sejtjévé differenciálódni képes embrionális ıssejtek csoportja jön létre - az embrió különbözı szöveteit, szerveit hozzák létre. A sejtek egy másik csoportja az embrió táplálására, védelmére specializálódott egyéb szövetek kialakulásáért felel.

- az embrionális ıssejtek pluripotensek: számos osztódás, differenciálódás után - bármely testi sejt kialakítására képesek

- legtöbb kifejlett szövettípusban találhatók, ún. szöveti, vagy „felnıtt” ıssejtek (adult stem cell) – sejtpótlás, regeneráció

- ıssejt: megtartja osztódóképességét; szimmetrikus és aszimetrikus sejtosztódás

- a „felnıtt” ıssejtek osztódhatnak folyamatosan, pl.: epitheliális ıssejtek (bır, gyomor-bél traktus), vérképzı ıssejtek, növények merisztéma sejtjei; ill. lehetnek nyugvó állapotban, csak sérüléskor aktiválódnak, pl.: máj, vázizom, IR - nem aktiválódnak

Történeti háttér:

1981 - egér embrionális ıssejt deriválás

1998 - humán embrionális ıssejt (be nem ültetett in vitro megtermékenyített petesejtekbıl származó embriókból).

2006 - "újraprogramozott ıssejtek": specializált felnıtt egyedbıl származó testi sejtekbıl genetikai módosítással ıssejtek elıállítása: indukált pluripotens ıssejtek (IPSC).

Az ıssejtek két fı csoportja

- embrionális ıssejtek: korai embrionális fejlıdési stádiumban levı morula, vagy 4-5 napos blasztociszta (hólyagcsíra) belsı sejttömegébıl, az epiblasztból származó sejtekbıl továbbtenyésztett sejtek. Az összes sejttípus létrehozására képesek.

Kísérletekhez: egér, vagy humán embrionális ıssejteket használnak

- felnıtt egyedbıl származó ("adult") ıssejtek: differenciálatlan sejtek, melyek adott differenciált szövetekben fordulnak elı, aktiválódva osztódnak, önmagukhoz hasonló ıssejteket és progenitor sejteket képeznek, melyek az adott szövetben/szervben található sejttípusok irányába képesek differenciálódni, nem képesek a test bármely sejttípusát létrehozni. Viszonylag kis számban, helyenként fordulnak elı a kifejlett szervezetben. Gyakran nehéz ıket elkülöníteni, ill. azonosítani - alkalmazásuk nehézkes.

Pl.: csontvelı, vér, szaruhártya, retina, agy, vázizom, máj, bır, gyomor-bél traktus, pankreász, köldökvér ıssejtjei.

Lehetnek:

- szomatikus, vagy testi sejteket létrehozó

- ivari sejteket létrehozó

6

Az ıssejtek differenciálódási potenciálja

1. totipotens ıssejteket: az összes (embrionális és extraembrionális) szövet és szerv létrehozására képes. Pl.: megtermékenyített petesejtet.

2. pluripotens ıssejteket: csökkent potenciával rendelkezı ıssejt, mely nem képes extraembrionális szövetlétrehozására, de mind 3 csíralemez kialakítására és ivarsejtek képzésére is alkalmas. Pl: embrionális ıssejt.

3. multipotens ıssejteket: csökkent potenciával rendelkezı ıssejt, nem képes ivarsejt létrehozására, de bármely mássejttípus kifejlıdhet belıle. Ilyenek a szervezet szöveti ıssejtjei.

4. unipotens ıssejteket: csak 1 sejttípust képes elıállítani, de képes a megújulásra, ami megkülönbözteti a nem ıssejttesti sejtektıl (izom-ıssejtek)

Indukált pluripotens ıssejtek (iPSC)

- genetikailag újraprogramozott, dedifferenciálódó kifejlett sejtek,

- embrionális ıssejthez hasonló állapot – ıssejtmarkereket expresszálnak, embriogenezis korai szakaszában különbözıembrió-részeket hoznak létre, mindhárom csíralemez sejtjeit képesek osztódásaikkal elıállítani

- de nem tudni, mennyire identikusak ESC-el

Hasznosítás: gyógyszerfejlesztés, betegségek modellezése; ?transzplantáció?

„reprogramming”: vírusok által a sejtbe juttatott újraprogramozó faktorok – daganatos elfajulás veszélye

Kutatás-fejlesztés: nem vírus eredető célbajuttatás

Hematopoetikus ıssejtek- a csontvelı ıssejtjeinek felfedezése: sugérzéssal elölt csontvelejő egérbe (anémia, vérzés, gyulladás) egészséges egér csontvelejét injekciózva vérsejtképzést figyeltek meg.

A transzplantált csontvelı prekurzor sejtjei osztódó sejtek kolóniáit hozták létre, melyek osztódva a vér összes sejtes elemévé differenciálódtak

- csontvelıben nagyon kevés pluripotens hematopoetikus ıssejt van, a legtöbb G0 fázisban – alacsony metabolizmus, nyugalmi állapot – élettartam meghosszabbítás – stimulálásra: aszimmetrikus osztódás: pluripotens ıssejt + elkötelezett ıssejtek: kolóniaformáló sejtek

- elkötelezett ıssejtek: kolóniaformáló sejtek – kolóniák létrehozása – valamely sejttípus (vvt, vérlemezke, granulociták, limfociták) létrehozásáért elkötelezett vonal – sejtfelszíni antitestek segítségével elkülöníthetık – transzplantálás

- nagy számú, különbözı típusú és funkciójú vérsejt létrehozása: emberben másodpercenként 1 millió

- a hemopoezis minden lépését, a proliferációt és a differenciálódást is citokinek (eritropoetin) és növekedési faktorok (Wnt, Notch, FGF: fibroblaszt növekedési faktor, IGF: inzuliszerő növekedési faktor) szabályozzák

Eritropoetin – kinázzal kapcsolt receptor – citoplazmatikus transzkripciós faktorok aktiválása – proliferáció és differenciálódás szabályozása

A „felnıtt” ıssejtek (adult stem cell)- szimmetrikus és aszimmetrikus osztódás, attól függıen, hogy mire van szükség

- speciális környezetre (stem cell niche) van szüksége, hogy fenntartsa ıssejt státuszát – szöveti sejtek és extracelluláris mátrix biztosítja. A niche sejt kihorgonyozza az ıssejtet, és biztosítja számára a szükséges sejtfelszínt, a sejtciklusát szabályzó jeltviteli mechanizmusokban szereplı proteineket. Egyes faktorok serkentik, mások gátolják az osztódást. A csontvelıben oszteoblaszt és endothél sejtek töltik be ezt a funkciót.

7

Vázizom ıssejtek- kis számú ıssejt a óriás sokmagvú izomrostok és a bazális membrán között helyezkednek el.

- sérüléskor a nyugvó állapotban levı szatellitasejtek osztódni kezdenek – regeneráció

- proliferációt és differenciálódást serkentı jelek receptor tirozin-kinázok - MAP kináz útvonal

- gátló jelek miosztatinon (TGF-β család) keresztül – gátlása izomtömeg növekedést indukál.

- az izom számos regenerációra képes, mert az ıssejt populáció regeneráció alatt megújítja magát, és/vagy a vér által a csontvelıbıl, egyéb szövetekbıl idekerülı ıssejtek

İssejtek az idegrendszerben (neural stem cell)IR – kicsi regenerációs képeség,

- a kamrák körül egyes agyterületek tartalmaznak ıssejteket – kevés számú osztódásra képesek

Merisztéma ıssejtek- aszimmetrikus osztódás

- gyökér- és hajtáscsúcsban

Daganat ıssejtek- proliferáló sejtek forrása – magyarázat arra, hogy a gyorsan osztódó daganatsejteket könnyő elpusztítani, daganatot mégsem lehet eliminálni a ritkábban osztódó daganat ıssejtek miatt

Epidermális ıssejtek- bır: állandóan megújuló szerv, nagy regenerációs kapacitással

- multipotenciális és elkötelezett sejtek is részt vesznek a sejtpótlásban és a regenerációban: epidermis bazális részén –osztódó sejtek rétege – aszimmetikus sejtosztódás – bazális membrán felé nézı sejt marad ıssejt, a kifelé nézı sejt többszörös osztódás után több lépcsıben differenciálódik – a bır különbözı rétegeit hozza létre

- multipotenciális ıssejtek a szörtüszık körül figyelhetık meg – a szörtüszı sejtjeit hozzák létre

- mint a többi „felnıtt” ıssejt, relative nyugalmi állapotban van, csak a növekedési és difefrenciáló faktorok, illetve a környezet hatásai aktiválják

Az ıssejtek gyakorlati felhasználásaEtikai gát

- gyógyítás: egyedi terápia, génterápia, sérült szövetek, szervek pótlása, betegségek pl.: Parkinson, Alzheimer-kór, diabetes, szívizomelhalással járó kórképek, tumorok, gerincvelıi sérülések, sclerosis multiplex.

- biotechnológiai ipar ígéretes területe a „tissue engineering”, a szövetek és szervek elıállítása ıssejtekbıl. Célja olyan szövetek elıállítása, melyek segítségével szívbillentyők, ízületek, porckorongok hozhatók létre, hogy aztán beültetve átvegyék a beteg szövetek, szervek funkcióját.

- szerepük lehet a génterápiában: ıssejtben a hibás gének egészségesre való lecserélése – autológ transzplantáció: „javított” ıssejtek beültetése.

- hatékonyabb felhasználása érdekében: új módszerek az ıssejtek mesterséges szaporíthatóságára

- screening: új gyógyszerek, hatóanyagok hatásvizsgálata.

- alapkutatás:

- differenciálódás,

- adott irányokba való elkötelezettség,

- modellrendszerek kialakítása:

- rákos sejtek burjánzása - egészséges sejtek osztódása

- regeneráció, sejthalál,

- születési rendellenességek hátterében álló folyamatok

8

A gyógyászatban alkalmazott ıssejt-források

Három terápiában alkalmazott szöveti ıssejt-forrás a csontvelı, a perifériás vér és a köldökzsinórvér.

- csontvelı: fıként vérképzı ıssejteket tartalmaz: vörösvértestek, fehérvérsejtek, vérlemezkék képzésére képes. A csontvelıi ıssejtek nyerése altatásban vagy gyakrabban spinális érzéstelenítésben, a hátsó csípıtövisekbıl, esetleg a szegycsontból történik.

- perifériás vér: nagy dózisú, kolóniastimuláló-faktor (CSF) elıkezelés hatására a csontvelıbıl nagy mennyiségőıssejt és elkötelezett elıdsejt (progenitor sejt) kerül a perifériás vérbe. A transzplantációra alkalmas ıssejtek győjtése a kezelést követıen a keringı vérbıl történik.

- köldökzsinórvér: fájdalom – és kockázatmentes, közvetlenül az újszülött születését követıen a méhlepényben és a köldökzsinórban visszamaradt vér levétele, ami egyébként a szülés után orvosi hulladékként megsemmisítésre kerül, amennyiben nem rendelkeznek az abból kinyerhetı ıssejtek megırzésérıl. A köldökzsinórvérbıl az ıssejtek kiválaszthatók és életképesen megırizhetık, késıbbiekben bármikor felhasználhatók esetleges betegségek kezelése céljából. Azonban a magzati ıssejtek közvetlen befecskendezése után valamilyen jelre van szükség ahhoz, hogy éppen a megfelelı típusú sejtekké differenciálódjanak, és ne például tumorsejtekké

A köldökzsinórvér-ıssejteket emberben elıször a csontvelı-elégtelenségben szenvedık kezelésére használták, mivel a köldökzsinórvér-ıssejtek könnyen alakulnak át csontvelıi sejtekké.

Az ıssejtek jelenlegi gyakorlati alkalmazása:

- elınyösebb a korábban szokásos, más emberbıl származó csontvelıvel végzett transzplantációknál. A köldökzsinórvér-ıssejtek ilyen célú hasznosítása is ritkábban okoz kilökıdést. Másrészt az eddigi tapasztalatok szerint a köldökzsinórvér-ıssejtek ilyen célú alkalmazása hatékonyabb a felnıttek csontvelı beültetésénél.

Az ıssejteket a károsodott területre juttatva képesek arra, hogy a károsodott szöveteket regenerálja. A csontvelırosszindulatú daganatos betegségeiben alkalmas a betegek kezelésére. Az olyan rosszindulatú daganatos betegségekben, amelyek sugárterápiát és/vagy citosztatikus (kemoterápia) kezelést igényelnek, a vérképzıszervek sejtjeinek is erısen károsodnak, a károsodott sejtek az ıssejtekbıl származó csontvelı beültetésével pótolhatók.

Megfelelı vizsgálati objektum kiválasztása- közös eredet miatt a sejtmőködés tanulmányozásához bármely szervezetbıl származó sejt használható, pl: osztódás, kromoszómaszerkezet, mutáció vizsgálata – (élesztı) gombák

- speciális folyamatok, tulajdonságok vizsgálata – specializálódott sejtek, pl: kontraktilis fehérjék vizsgálata – izomsejtek, ostormozgás tanulmámyozása – Chlamydomonas fajok

- „általánosabban használt”, jobban „feltérképezett” vizsgálati objektum – több ismeret, genetikai térkép, feltérképezett genom, ismert fiziológia, bevált vizsgálati módszerek

organizmus genom méret és

ploidás genom

szekvencia gének száma

homológ rekombináció

meiotikus rekombináció

biokémia

Gram-negatív baktérium, Escherichia coli

4.6 Mb, haploid + 4288 + - kiváló

penészgomba Dictyostelium discoideum

34 Mb, haploid + 12,000 + - kiváló

sarjadzó élesztı Saccharomyces cerevisiae

12.1 Mb, haploid + 6604 + + jó

hasadó élesztı Schizosaccharomyces pombe

14 Mb, haploid + 4900 + + jó

Nematoda Caenorhabditis elegans

97 Mb, diploid + 18,266 nehéz + szegényes

Drosophila melanogaster 180 Mb, diploid + 13,338 nehéz + szegényes

lúdfő Arabidopsis thaliana

100 Mb, diploid + 25,706 - + szegényes

Mus musculus 3000 Mb, diploid + 25,000 + + jó

Homo sapiens 3000 Mb, diploid + 25,000 + sejttenyészet

+ jó

Genetikai modellszervezetek

9

Modellszervezet

- az ideális: teljesen szekvenált genom, ismert módszerek a tanulmányozásra és a manipulálásra, pl gén lecserélése homológ rekombinációval

- a haploid szervezetek jól használhatók a mitótikus osztódás, és a mutációk vizsgálatára, a diploid életszakasszal is rendelkezık a meiozis, ill. a meiotikus rekombináció tanulmányozása, öröklıdés – sarjadzó és hasadó élesztık jómodellszervezetek ezekre a genetikai vizsgálatokra – sejtbiológiai alapkutatások – DE: egysejtő, speciális életciklussal –nem jó modellje a többsejtő élılények szövetei, szervei számára

- többsejtő szervek szövetek mőködését modellezı szervezetek: gyümölcslégy, Nematoda férgek, egér, emberi sejtek tenyészetei. Fejlıdésbiológiai, szövettani vizsgálatok: Drosophila, Nematoda

- gerinces modell: egér, patkány, pl. idegrendszeri kutatások; emlıs, humán sejttenyészetek - fiziológia

- Arabidopsis: növénybiológiai vizsgálati objektum: kis genom, gyors reprodukciós ciklus, genetikai vizsgálatok

- modellezni kívánt szervezet (általában humán) ↔ modell: elınyök ↔ hátrányok, mihez kell, élettartam

humán

más állat: emlıs más gerinces gerinctelen

izolált szerv, szövet, sejt

(tenyészetben) fenntartott szerv, szövet, differenciált sejt

primer tenyészet: fibroblaszt, érendotélsejt, (valamilyen nyugvó, szöveti ıssejtbıl, vagy újraprogramozott szöveti sejtbıl)

sejtvonal

Sejtizolálásszeparálással, pl. vérbıl

mechanikailag

enzimatikus emésztéssel: valamilyen proteolitikus enzimmel (kollagenáz, tripszin – extracelluláris mátrix bontása)

kis szövetdarabok tápoldatba helyezése – a tenyészetben növeszthetı sejtek „kivándorolnak” a tápoldatba

Az izolált sejteket primer sejteknek nevezzük – primer tenyészetek: kivéve a tumoros eredetőeket, általában limitált életidejőek, heterogén megjelenés, a sejtek csak meghatározott számú osztódásra képesek, azután differenciálódás, és/vagy öregedés – sejthalál

Az immortalizált sejtvonalak korlátlan számú sejtosztódásra képesek, DE változnak: pl. mutációk

Sejtvonalak sejtjeinek általános jellemzıi

- kisebbek, lekerekítettek, nem tapadnak ki annyira, nagyobb a sejtmag/citoplazma arány

- gyors növekedés, aneuploid kromoszómaszám

- igénytelenebben: tápoldat és kiatapadás nem olyan fontos, szívesen nı szuszpenzióban

- nagyobb sejtsőrőség, denzitás

- fenotípusosan eltérnek a donortól

- nem expresszálnak szövetspecifikus fehérjéket

10

Sejt szortírozás

microbead

preplating

Primer tenyészetbıl sejtvonal kialakítása

- „tiszta” tenyészet létrehozása: sorozatos preplating”

- sorozatos passzálásokkal klónok kialakításával, majd a klónok továbbpasszálásával – spontán transzformáció

- akár embrionális szövetbıl, akár kifejlett egyedbıl indítható

- transzgén onkogének segítségével – nem szükséges, mert az elıbbi jól mőködik

- elınyök:

tömegtermelés

differenciálódás megakadályozása, proliferáció

ha szükséges könnyen differenciáltatható

proliferációs, és differenciálódási markerek

anyagok hatásvizsgálata a proliferáció/differenciálódás folyamataira

kereskedelmi forgalomban levı izom eredető sejtvonalak

11

Sejttenyészetek formái- kitapadva növı kultúrák: megfelelı felszínt igényelnek, gyakran extracelluláris mátrix proteinekkel bevonva: tenyészedény, mikrokarrier, 3D környezet – adhéziós szignál kell a növekedéshez, differenciálódáshoz. A 3D tenyészet közel áll a szöveti szervezıdéshez, de nehéz fenntartani, pl diffúziós korlátok miatt

- szuszpenziós kultúrák

Átmenet, pl. nagyobb mennyiség elıállítása miatt

- mikrokarrier technika

gömböcskék

porózus mikrokarrier

Sejtek eltávolítása: kelálás (EDTA), proteolitikus enzimek (tripszin), hipotóniás kezelés, hımérséklet, szonikálás

- 3D háló, vagy rács struktúra

Sejttípusoka) megjelenés szerint:

- epithélsejt-szerő: kitapadva nı, „kockakıszerő” megjelenés, alakja sokszög

- limfoblaszt-szerő: nem tapad ki, szuszpenzió, lekerekedett

- fibroblaszt-szerő: kitapadva nı, elnyúlt, bipoláris alak

A sejttenyészetek fenntartásaSzöveti sejtek, utánozni kell a szöveti környezetet:

hımérséklet,

páratartalom,

gázok,

intersticiális folyadék – fiziológiás sóoldat

pH

táplálék, sejt építıkövei

speciális kiegészítık: vitaminok, ásványi anyagok, hormonok, növekedési fakorok

+ kiegészítés: gyakran emlıs (FBS, FCS, HS) vérszérum

- emlıs sejtek: 37°C, 5% CO2 – szigorúan szabályzott: CO2 inkubátor; pH, ionösszetétel, sók, glükóz, aminósavak, növekedési faktorok – tápoldat: függ a tenyészettıl, általánosan használt GMEM, EMEM,DMEM, sterilen elkészített, tárolás 4°C

Védelem a fertızések ellen: sterilitás, antifungális szerek (amfotericin B), antibiotikumok (penicillin, streptomicin)

- tápoldat csere: a sejtek metabolizmusuk során savanyítják a közeget

- passzálás: szuszpenziós kultúráknál egyszerő, letapadva növıknél: általában tripszin-EDTA kezelés – felváló sejtek szétosztása; ált. 80-90% konfluenciánál

- lefagyasztás

12

A sejtek lefagyasztása- tartalék

- mosás PBS-el, Tripszin-EDTA – sejtek tápoldatban való felvétele – centrifugálás – tápoldat + 10% DMSO-ba (DMSO: jégkristályok képzıdése ellen véd + sejtmembrán rigiditását is csökkenti) való felvétel fagyasztáshoz – cryo-csı – -80 °C– folyékony nitrogén

Kiolvasztás- felolvasztás: 37 °C vízfürdı – (centrifugálás) – reszuszpendálás tápoldatban (általában magas szérumkoncentráció -20% FBS - mellett) – kitapadás ellenırzése 24 óra elteltével – oldatcsere, 20% FBS-el kiegészített tápoldat, míg a tenyészet be nem indul

Gyakran használt sejtvonalakHumán MCF-7 emlıtumor

HL 60 leukémia

HEK-293 embrionális vese

HeLa Henrietta Lacks méhnyakrák

Fıemlıs Vero afrikai zöldmajom veseepithélsejt

Cos-7 afrikai zöldmajom vese

Egyéb: CHO – (kínai) hörcsög ovárium, sf9, sf21 rovarsejtek

Sejtek életképességének ellenırzéseSejtszám meghatározása

- tenyészetet reprezentáló minta vizsgálata – következtetés a teljes tenyészet állapotára

A) direkt meghatározás

1) sejtszámolás mikroszkóp alatt – hemocitométer

rácsozott terület: 3 X 3 X 0,1mm = 0,9 mm3

3 részre osztott: 1 X 1 X 0,1mm = 0,1 mm3

- a szélsı négyzetek: 4X4 négyzetre vannak továbbosztva:

0,25 X 0,25 X 0,1mm = 0.00625 mm3

- a középsı, kettıs vonalakkal határolt négyzetek 25 nagy négyzetre vannak

osztva - oldalhossza 0,2 mm, területe 0,2 X 0,2 X 0,1 mm = 0,004 mm3.

A kettıs vonalakkal határolt négyzetek sarkainál található kis négyzetek

oldalhossza - 0,05 mm, térfogata 0,05 X 0,05 X 0,1 mm = 0,00025 mm3

- tripánkékes festés: élı sejt membránja nem permeábilis a festékre, csak az elpusztult sejtek festıdnek meg

Az élı sejtek arányának meghatározésa: sejtszámolással:

élı sejtek aránya % = a meg nem festıdött sejtek száma X100összsejtszám

- használható sejtmagszámlálásra is

2) elektromos/mőszeres számlálás: áramlási, vagy flow citometer – sejttörmelék is, denzitometria

3) biomassza monitorozás: 4 platina elektróda – alacsony rádiófrekvenciával – intakt mb felveszi az elektromos töltéseket, apró kapacitások – kapacitásmérés – sejtdenzitás (bioreaktorokban)

4) metabolikus aktivitás mérés: NADH UV fényben fluoreszkál

5) képalkotó eljárással történı meghatározás: számítógéphez kapcsolt CCD kamera - mikroszkóp

13

B) indirekt meghatározás1) minta protein tartalmának meghatározása: kolorimetriásan. Pl. Bradford assay – gyors, érzékeny, pontos, megbízható: sejtlizátum + Coomassie blue – szín 10 perc múlva – koloriméter, vagy spektrofotométer – standard proteinnel valóösszehasonlítás

biomassza

enzimaktivitás

2) minta DNS tartalmának meghatározása: DNS-hez kötıdı floureszcens festékkel, pl. Hoechst 33258, DAPI

3) tápoldat glükóz-tartalmának (fogyásának) meghatározása, vagy laktát-termelés, ill O2-fogyasztás mérése. pl.: glükóz-oxidáz assay (glükóz-oxidáz, peroxidáz, és festék – o-dianizidin hidroklorid – szines termék – kolorimetriás mérés), hexokináz assay (hexokináz, glükóz-6-foszfát deidrogenáz – NADH képzıdés)

Proliferáció – sejtpusztulás nyomonkövetése1) festék felvétel: tripánkék, eritrozin B, nigrozin, fluoreszcein diacetát

2) tertrazólium assay: a celluláris oxidatív metabolizmust méri a tetrazólium festék MTT segítségével: NAD(P)H-dependens dehidrogenáz enzim hatására színes termék

3) kolónia formálás nyomonkövetése: a legpontosabb, alacsony koncentrációban szélesztve a sejteket egy sejt – egy kolónia, a kolóniák méretének növekedése jellemzi az adott sejt proliferációjának mértékét

4) LDH meghatározás: a sejt életképességének csökkenése – sejtmembrán integritásának romlása – sejtalkotómakromolekulák kijutása a sejtbıl – a tápoldat enzimaktivitásának mérése, pl. LDH: pirovát jelenlétében történı NADH oxidáció mérése spektrofotometriásan

5) intracelluláris energia változás: AMP – ADP – ATP szint mérése – kromatográfiása, vagy a luciferin-luciferáz enzim rendszerrel lumineszcenciaméréssel. ATP szint csökkenése: sejtfunkciók romlása

6) protein szintézis ráta: radioaktívan jelzett aminosavakkal

Apoptózis mérése1) áramlás citometria

2) DNS gélelektroforézis: kis DNS fragmentek detektálása

3) fluoreszcens mikroszkópia: akridin narancs + propidium-jodid: az akridin-narancs membránpermeábilis, DNS-hez kapcsolódik, emisszió: zöld, a propidium-jodid csak a sérült sejtmembránon jut át, nukleinsavakkal kapcsolódik – piros –kettıs festıdés, kör alakú, kondenz kromatin állomány – nekrotikus sejt

4) annexin V-FITC: az apoptotikus sejtek elvesztik foszfolipid membrán aszimmetriájukat – foszfatidil-szerin a sejtfelszínre kerül, annexin V-FITC konjugátum erısen kötıdik a foszfatidil-szerinhez

5) TUNEL (TdT-mediált dUTP Nick End Labeling): DNS fragmentek 3’OH végének jelölése biotin-konjugáltnukleotidokkal. A reakciót az exogén deoxinukleotidil terminális treanszferáz (TdT) katalizálja

6) rodamin (zöld) felvétel – funkcionálisan aktív mitokondriumok, propidium-jodid festés

7) kaszpáz-3 aktivitás mérése: apoptotikus marker cisztein-proteáz – monoklonális antitesttel való jelölés, fluoreszcens mikroszkópia

„Cross-contamination” – keresztfertızés- sejtvonalak „összekeverednek”

- sejtvonalak tisztaságának megırzése, ellenırzése:

régen: sejtmorfológia mikroszkópos ellenırzése

ma: kariotipizálás

fajspecifikus antigén imunfluoreszcencia

izoenzim analízis

DNS „fingerprint”: restrikciós fragment hossz polimorfizmuson alapul, változó számú ismétlıdı egységek összehasonlítása

PCR-alapú vizsgálatok: hipervariábilis DNS szekvenciák, (single) nukleotid polimorfizmus

- sejtbankok

14

Sterilitás fenntartása

- steril oldatok, steril környezet

- steril fülke: lamináris, v horizontális és vertikális box. A legnagyobb biztonságú a vertikális, „biology safety” fülke – a kifúvott levegı HEPA filter szőrt.

- inkubátor, termosztát: rovarsejttenyészet: 25-30 °C , emlıssejtek: 37 °C, CO2 2-10% + 95% levegı – szöveti sejtek igényei + a bikarbonát puffer tápoldat pH-jának szabályozása miatt, 99% relatív páratartalom

- tápoldatok, sejttenyésztésehez használt oldatok tartása 4 °C-on (hőtı, vagy hőtıszoba)

- enzimek, szérumok, tápoldat összetevık: -20 °C

- egyszer használatos tenyészedények: mőanyag flaskák (T25, T75), és petri-csészék

- egyszer használatos és/vagy sterilezhetı eszközök: autokláv – mőanyag eszközök, hılégsterilizátor – üveg és fém eszközök

- steril szőrık az oldatok elkészítéséhez

Sejttenyészetek manipulálása

A tenyészet sejtjei addig nınek, míg van tápanyag és/vagy hely.

A gyors növekedés problémája

• a tápanyagok elfogynak a tápoldatból

• megnı az apoptotikus/nekrotikus (elpusztult) sejtek száma

• a közvetlen sejt-sejt kapcsolat kontakt gátlást okoz: sejtciklus nyugalmi G0 fázisába lépnek a sejtek, öregedés • a sejt-

sejt kapcsolat differenciálódást indíthat el

Manipulálás: tápoldat változtatása, passzálás, transzfekció: idegen DND bejuttatása – fehérjetermék expressziója, vagy

siRNS technika, vagy géncsendesítés: egyes gének átíródásának szabályozása. Sejtvonalak kialakítása

Transzfekciós technikák

„Mechanikai”:

- lipid mediált lipofekció

- elektroporáció

- mikroinjektálás

- kalcium-foszfát precipitáció: plazmid a kalciumfoszfáttal precipitálódik, a sejtek endocitózissal internalizálják:

tranziens jellegő transzfekciós módszer: az idegen DNS gazdaseejt genomjába integrálódása nem biztosított

- DEAE (dimethylaminoethyl)-dextran: kationos polimer, negatívan töltött DNS „lefedése” – endocitózis

Vírus által közvetített:

- adenovírus infekció

- retrovírus infekció

15

Vírus – vektor által közvetített – transzfekció

- primer sejtek általában ellenállnak a transzfekcióknak, kivéve a rekombináns vírus transzdukciót - adenoviralis éslentiviralis vectorok – sejttenyészetek immortalizálása, sejtvonalak kialakítása

1) Recombináns adenovírus vektorok

- a leghatásosabb transzfekciós rendszer

- az összes humán sejttípuson használható közel 100%-os hatásfokkal, kivéve a vér sejtes elemei, melyeken nem található adenovírus recepor

- az adenoviralis vektorok nem integrálódnak a sejt genomjába – tranziens expresszió

- a vektor a célsejtben széthullik, vagy sejtosztódáskor „felszívódik” – az expressziós szint függ az expresszióidıtartamától, és a sejtosztódás mértékétıl

2) Recombináns retrovírus vektorok

- csak az aktívan osztódó sejteken alkalmazható, mert – sejtosztódás során a sejtmagmembrán szétesik, így a vírus DNS képes a gazdasejt DNS-éhez hozzáférni, beépülni a genomba – permanens, stabil expresszió.

- korlátozott a használhatósága, kicsi a hatékonysága, különösen a ritkábban osztódó sejttípusoknál

3) Recombináns lentivírus vektorok

- újabb, mind az osztódó, mind a nem osztódó sejteken alkalmazható, mert a lentivírusok aktívan képesek átjutni a sejtmagmemránon

- beintegrálódik a gazdasejt genomjába, in vivo és in vitro is alkalmazható

- hátránya: a beinzertálható génszakasz mérete limitált, kicsi: maximum 5.0 kb, de a transzfekció hatékonysága 3.0kb felett signifikánsan csökken

Adenovírus protokoll

- adenovírus amplifikáció: gazdasejtben való felszaporítás

megfelelı sejttípus felszaporítása, kb. 60-70% konfluenciáig

adenovírus hozzáadása - inkubálás: akár 4-6 nap, míg a sejtek felválnak

további vírusszaporításhoz – két lépcsı – párhuzamosan indított sejttenyészethez – vírus izolálás nélkül az elsı

tenyészetbıl származó vírusokkal való továbbfertızés

vírus izolálás: az összegyőjtött minta ismételt fagyasztása-felengedése, centrifugálás (2000 g, 10 perc)

felülúszó - in vitro transzfekció, vagy tárolás 4°C néhány hétig, ill. –70°C

Az adenovírus vektorok stabilan eltartható 4°C-on, vagy szobahımérsékleten (~25°C), a lentivírus és retrovírus vektorok kevésbé. Életképességet segíti, ha –70°C-on történı tároláskor 5% glicerolos mintát készítünk

- adenovírus transzfekció:

in vitro (sejttenyészet) felszaporított vírus: felülúszó, vagy tisztított adenovírus, in vivo csak tisztított vektor használható:

sejt, sejttöredék, FBS, tápoldat -mentes

célsejt tenyésztése: kb. 70% konfluenciaszint - vektor hozzáadása a tenyészethez, 1 óra inkubálás - mosás

48-72 óra múlva a transzdukció vizsgálható, pl.: Western blot, qPCR, szines (fluoreszcens) reporter gén alkalmazásával

(fluoreszcens) mikroszkóppal

Lentivírus és retrovírus protokoll

- infekcióhoz általában valamilyen „segédanyag” használatos, pl.: a sejtmembrán felszíni töltéseit elfedı polikation (pl. Polybrene) – növeli a sejtmembrán és a víruskapszid kapcsolódási lehetıségét – nagy koncentrációban és/vagy hosszan alkalmazva toxikus lehet

- ismételt transzfekció, hosszú 6-8 órás inkubálás lentivírus esetében, 24 órás inkubálás retrovírus esetében

-72 óra elteltével passzálás, szelekció (rezisztencia alapján, pl.: Puromycin)

- a túlélı sejtekbıl klónok

- szelekciót követı 10-15 nap: az optimális klónok kiválasztása - sejtvonalak indítása

16

Sejttenyészetek felhasználása- „tömeggyártás”

- fehérjetermékek elıállítása – biotechnológia: rekombináns DNS technológiával enzimek, hormonok, monoklonálisantitestek, interleukinok, limfokinek, rákellenes szerek elıállítása

- vannak amelyek elıállíthatók baktériumtenyészetekben is, de a komplex, glikozilált proteinek eukarióta sejtekben valóelıállítást igényelnek pl: eritropoetin – állati sejttenyészetek

Probléma: drága – egyéb utak: géntranszfer rovarsejtekbe, magasabbrendő növényekbe

- szövettenyészet és szövetmérnökség: humán mesenchimális ıssejtek elıállítása, lefagyasztása

- vakcinák, oltóanyagok elıállítása: himlı, gyermekparalízis, mumpsz, rubeola, kanyaró elleni védıoltások + influenza

- gyógyszerfejlesztés

- sejttoxicitás vizsgálat

- rákkutatás

- génterápia

Fehérjeexpressziós rendszerek1) prokerióta expressziós rendszer

- baktérium

2) eukarióta expressziós rendszer

- élesztı

- rovarsejt-bakulovírus expressziós rendszer

- emlıs sejtek

tranziens

stabil

indukálható

Baktérium és élesztı expressziós rendszerekgyakran bakteriális fehérje fúziós fehérjéjeként termeltetik

Elınyei: ipari méretekben is egyszerően és olcsón használható, ismert genom, egyszerő technikák

Hátrányai: poszt-transzlációs módosítás eltérısége miatt nem vagy csak kevéssé használhatóak humánban az elıállított termékek, tisztítás, patogén szennyezés

Rovarsejt-bakulovirus rendszer Elınyei

- biztonságos: a bakulovírusok gazdaszervezet-specifikusak, gerincesekre, növényekre veszélytelenek. Általában csak egy gazdaszervezetet (faj) betegítenek meg – más rovarokra sem jelentenek veszélyt. Mivel a rovaresejtek önmagukban nem veszélyesek, és a transzfektálásuk során használt bakulovíus sem – alacsony biztonság.

- a baculovírusok genetikailag hordoznak minden szükséges információt – nem szükséges más

- könnyő a fehérjetermelést beállítani, ellenırizni: sok, különféle géntermék nagy mennyiségben való elıállítása. A rekombináns fehérjék nagy része vízoldékony – könnyő elkülönítés, tisztítás

- nagy pontosságú: emlıssejtekhez hasonló poszt-transzlációs módosítás

- a használt sejtek, sejtvonalak könnyen tartható szuszpenziós tenyészetben: bioreaktorokban történı termelés

Hátrányai: viszonylag drága, specifikusabb körőlmények

Emlıs sejttenyészet, transzgénikus állatElıny: jobb minıségő termék

Hátrány: drága, ipari elıállítás nehézkes, vagy lehetetlen, tisztítás, patogenitás

17

Transzgén állat- vagy egy másik szervezetbıl számazó a saját genomjába beépült idegen DNS szakaszt hordoz

- vagy a genom egyes szakaszai delécióval, vagy mutációval módosítottak

- azért lettek létrehozva, hogy az adott genetikai változést szervezet szintjén lehessen vizsgálni, illetve az adott gén, vagy génszakasz egyedfejlıdésre kifejtett hatása tanulmányozható

-elsı transzgén egér:1980

- funkció fokozás, illetve csökkenés, vagy funkcióvesztés

- 3 technika:

1) mikroinjektálás: DNS bejuttatása közvetlenül egy sejt sejtmagjába spec esete: megtermékenyített petesejt pronukleuszába injektálás – (ál)terhes egér oviductusába juttatás – egyedfejlıdés. Elıny: természetes kromoszómajavítás mechanizmusával tökéletesebb beépülés, gyakran több kópiában egymás mellé fej-vég állásban; egy sejtbe bejuttatott DNS szakasz a szervezet összes testi sejtjében meg fog jelenni, különösen az ivarsejtekbe. Ha az egyedfejlıdés késıbbi szakaszában történik meg a mikroinjektálás – mozaikos megjelenés – nyomon követhetı, hogy mely sejtbıl, vagy sejtpulációból milyen szövetek, sejtek fejlıdnek

2) korai embrionális szakaszban rekombináns retrovírussal történı infekció. Elıny: 1 kópia, meghatározott helyre, hátrány: nem egyforma a transzfekció az összes sejten, alacsony hatékonyság, kis DNS fragmentek klónozhatók a retrovirális vektorba

3) embrionális ıssejtek használatával: izolálás, transzformálás, korai blasztociszta állapotba való bejuttatása – kimérák elıállítása – fenotípusos kiválogatás. Használható: irányított kromoszóma változtatások, pl.: specifikus gén mutációja. Hátrány: nehéz és költséges technika

Gén-targetálás: génszakasz mutációja – pluripotens embrionális ıssejtbe történı transzfektálás – homológ rekombináció– blasztocisztába való beültetés – anyaállatban embriogenezis - kiméra, pl.: pontmutációk, null (knockout - KO) mutáció): génszakasz és/vagy a génszakasz expressziója hiányzik. Sokszor a homozigóta nem életképes – heterozigóták fenntartása – gyakran ezek nem „betegek”, fenotípusos jelleg nem jelenik meg, valószínőleg egyéb aktiválódó gének, külsı hatások „kompenzálnak”

Az integráció helye is fontos

- „csendes”, heterokromatikus régióba beépült génszakasz expressziója alacsony.

Probléma kiküszöbölése: több egérvonalból kiválogatva a „legjobbat”

- az endogén fehérjék expressziója ne sérüljön, vagy csökkenjen – fenotípus! Probléma kiküszöbölése: több egérvonal összehasonlítása fenotípusosan

Egérvonalak továbbszaporítása

Probléma: hibrid egértörzsnél az egyes egyedek nem lesznek identikusak – genetikai variabilitás. Megoldás: beltenyésztett egértörzsek kialakítása – hatékonyság alacsony

Leggyakrabban használt beltenyésztett egértörzsek: C57BL/6, DBA/2, CBA/Ca, BALB/c

Egyéb transzgén állatok

- patkány

18

Használatuk:

transzgén állatok növények létrehozása: GMO, illetve betegségek tanulmányozása, biofarmakonok (inzulin, növekedési hormon) elıállítása – alacsony hatékonyság (haszonállatoknál: kecske, birka, szarvasmarha, kevesebb, mint 5%) –transzgén állatok kifejlesztése hosszadalmas, drága, de még így is olcsóbb és

veszélytelenebb, mint sejtekben elıállítani. Farmakon általában tejben

Veszély: új zoonózisok, prionok

Klónozás Somatic cell nuclear transfer

Túlélı szelet technika- elsısorban idegsejtek, idegelemek vizsgálatára: projekciók megtartása

- általában embrióban, pre- vagy posztnatal állatból: könnyebb preparálás (jégen)

- agaróz gélbe ágyazás

- vibratómmal vékony szeletek (jégen): 200-300 µm

- megfelelı szelet kiválasztása, tenyésztıedénybe, polikarbonát membrán felszín, szérumtartalmú tápoldatban tartás inkubátorban 1-2 órát, agaróz eltávolítása, majd szérummentes tápoldatban továbbtartás 3-4 napig

Hibridóma technikaA monoklonális antitesteket leggyakrabban hibridómák segítségévek állítják elı.

A módszer lényege, hogy a megfelelı antitestet termelı plazmasejtet fúzionálják egy mielóma (limfoid tumor) sejttel, és a keletkezı sejt optimális esetben egyesíti a plazmasejt antitest termelı tulajdonságát a daganatsejt korlátlanszaporodóképességével.

Az egyesítés (fúzió) vegyszerekkel vagy elektromos térben történik.

A hibridóma elıállítása során a plazmasejtek forrását képezı állatot immunizálják az antigénnel, s a lépébıl kinyertsejteket fúzionálják mielóma sejtekkel. Így rengeteg hibridóma vonalat nyernek, melyek közül az antigénhez megfelelıhelyen és nagy affinitással kötıdı antitestet termelıt ki kell választani és tovább szaporítani.

Ko-kultúra

- idegsejt, (izomsejt) tenyészet

- coating: poly-D-lizin, laminin, zselatin

- tápláló(támasztó) sejtek tenyésztése: sejtvonal, vagy izolált fibroblaszt, ill.glia primer tenyészet

- tenyészteni kívánt sejtek preparálása, szélesztése a tápláló sejtrétegre

- tápoldat:általában szérum jelenlétében, növekedési faktorokkal kiegészítve

- általában rövid életidı, nem passzálható

3D technika- átmenet a klasszikus in vitro és in vivo technikák között

- utánozza a szöveti struktúrát:

sejtdenzitás

polaritás

sejt-sejt, sejt-mátrix kapcsolatok

bazális membrán (összetevık)

- tumorigenezis vizsgálata: egészséges epithél, carcinoma morfogenezis - oncogének, onkoproteinek, növekedési faktorok meghatározása, proliferáció, differenciálódás, túlélés, apiko-bazális polaritás, programmozott sejthalál

- „real-time imaging, részletes struktúr analízis (konfokális mikroszkópia)

- belsı és külsı paraméterek hatásvizsgálata

19

Organotípiás szövettenyésztés

- izolált szervbıl vékony metszetek, szeletek készítése – porózus anyagon (pl. fémrács, grid) a levegı-tápoldat határfelületen tartás

- sejt gömböcskék „spheroid” – (több 100 µm átmérı) – differenciálódás, szöveti struktúra

- függıcsepp „hanging drop”, vagy keverıfalú „rotating-wall” tenyészet. A sejtek a gravitáció miatt cluster-ekbe

tömörülnek

- polarizált epitél sejttenyészet porózus membránon monollayerben

- 3D polarizált tenyészet: mestersége extracelluláris mátrix

- mesterséges bır: primer fibroblaszt tenyészet biológiailag lebomló hálóra szélesztve - néhány hét múlva keratinociták

- mikrokarrier anyagok: dextrán, zselatin, glikózaminoglikán, vagy más polimerbıl golyócskák

- agaróz hordozó: a sejt – ECM-gél ebbe ágyazódik

- üvegkapillárisban, egy csepp folyékony agarózba ágyazott vizsgálati objektum skála: 1 mm.

- GFP tagged aktin expresszált, kollagén I gél 3 napos 3D tenyészet, sejtmag piros, skála: 20 µm. ECM: extracellulárismátrix;

MDCK, Madin–Darby canine kidney;

SPIM, single plane illumination microscopy.

Immortalizált sejtvonalak kialakítása- primer sejttenyészet sejtjei elıre meghatározott, kis számú osztódásra képesek – függ fajtól, a sejt típusától, tenyésztés körülményeitıl – nem osztódó stádiumba kerülnek a sejtek – nem osztódó, öregedı tenyészet: jellemzı sejtalak (általában megnagyobbodott sejtek, több sejtmag), génexpressziós mintázat (tumor szuppresszor proteinek: p53, RB, p16aktivációja), metabolizmus (megnövekedett lizoszóma biogenezis, endogén β-galaktozidáz overexpresszió)

- meghatározott számú osztódás – limitált sejtszám – rövid életidı – új tenyészetek indítása

- immortalizált sejtek, vagy sejtvonalak: nagyszámú osztódás, nagy sejttömeg. Elvárás: primer sejtekhez hasonlógenotípus, fenotípus

- használható technikák:

• vírus génszakasz beépítése a genomba, pl.: simian (majom) virus 40 (SV40) T antigén: a legegyszerőbb, leghatékonyabb módja az immortalizációnak

• telomeráz reverz transzkriptáz (TERT) protein expresszió: azokon a sejteken hatásos, amelyekben fontos szerepe van a telomer hossznak (pl. human). A TERT protein a testi sejtekben inaktív állapotban van jelen, a vírus növeli az expresszió szintjét, ami elısegíti a megfelelı telomerhossz fenntartását – megelızi a tenyészet öregedését. Elıny: általában megmarad a primer sejtre jellemzı stabil genotípus, jellemzı fenotípusos markerek. Néhány sejttípusban azonban ezzel ellentétes folyamat: sejthalál pl.: epitélsejtekben. Megoldás: hTERT katalitikus alegységének és p53, vagy RB siRNS-nek a ko-expressziója:

• Ras, vagy Myc overexpressziója egyes sejttípusokban hatásos sejtimmortalizációs mechanizmus

• általában a vírusgének inaktiválják a megfertızött sejt tumor szuppresszor génjeit (p53, Rb, stb) – közvetlen immortalizáló hatás

20

A primer sejtek osztódási mintázat alapján két fı típusa:

1) 20-50 passzálást megélı sejtek: blaszt sejttípusok, pl.: fibroblastok, retinoblasztok

2) kevesebb, mint 10 passzálást tőrı, illetve nem passzálható tenyészetek: epithélsejtek

1) 20-50 passzálást megélı sejtek: hTERT vagy SV40 T antigén

2) SV40 T antigén, vagy a Rb, p53 siRNA és hTERT koexpressziója, illetve SV40 T antigén és hTERT koexpressziója a nehezen immortalizálható primer sejteknél használható, pl.: epitél sejtek cells. Az epitélsejtek esetében az epithelialisnövekedési faktor (EGF) használható: 10-20 passzálással meghosszabbítja a sejttenyészetek életidejét

Elıny: nem szükséges a szelektálás, mivel a technika önmaga „kiválogatja” az ostódó sejteket (túlnövik a nem osztódókat, illetve a nem immortalizált sejtek elpusztulnak

Citotoxicitás assay-kDirekt kontakt módszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet, friss oldatcsere + vizsgálandó anyag

- inkubálás: 24 óra, 37 °C

- mosás, fixálás, festés – elı sejtek arányának megállapítása

Agar diffúziós módszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet, oldatcsere 2% agar oldatra, vitális festékkel

- az agar megszilárdulása után a vizsgálandó anyagot az agar felszínére helyezzük

- inkubálás: 24 óra, 37 °C

- az élı sejtek festıdnek csak meg

Oldószer módszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet,

- vizsgálandó anyag oldása fiziológiás sóoldatba, vagy szérummentes tápoldatba

- inkubálás: 48 óra, 37 °C

- hisztokémia, vagy vitális festés

21

Sejtek vizsgálata- molekuláris biológiai módszerekkel

PCR, qPCR

Western blot

enzimaktivitás

- elektrofiziológiás módszerekkel

patch clamp

voltage clamp

- képalkotó eljárások – mikroszkópi technikák

fénymikroszkóp: átesı fény, festések

polarizációs mikroszkóp

fáziskontraszt mikroszkóp

elektronmikroszkóp

fluoreszcens mikroszkóp

konfokális (fluoreszcens) mikroszkóp

Upright fénymikroszkóp: a kondenzor lencse a vizsgálati objektumra fókuszálja a fényt, az objektív lencse összegyőjti az objektumról visszaverıdı fényt, az okulár lencséje felnagyítja a képet és a szembe, vagy a kamerába vetíti a sugarakat.

Inverz fénymikroszkóp.

Fluorescens mikroszkóp: az objektív lencse kondenzor is egyben, a gerjesztı fényt a vizsgálati objektumra fókuszálja –a fluoreszcens festékmolekulákgerjesztıdnek – emittált fényt ugyanaz az objektív lencse győjti össze: egy fényútba helyezett dichroikus tükör osztja a fényt, elkülönítve a gerjesztı és a kibocsátott fényt, filterek segítségével csak egy bizonyos hullámhosszú fény jut a detektorhoz.

Elektronmikroszkóp: elektromágneses lencsék helyettesítik a fénymikroszkópok üveglencséit.

Fluoreszcens mikroszkópia

- akár egy fluoreszcens festékmolekulát is érzékel

- élı és fixált sejtek, szövetek

- immunfluoreszcencia

- lipid, protein, nukleinsav is jelölhetı, ion- membránpotenciál-szenzitív festékek

- autofluoreszcencia: GFP

Konfokális mikroszkópia

- a lézerfény csak egy keskeny rése (pinhole) keresztül, x, y, z dimenziókban pontosan fókuszálva éri el a vizsgálati objektumot, majd jut vissza a detektorba

- leképezés pontról-pontra

- különbözı (z) síkokban történı leképezés után 3D rekonstrukció

22

Elektronmikroszkóp

- nagy felbontóképesség: elvileg 0,3 nm alatt, de az elektronnyaláb károsítja a vizsgált objektumot – speciális preparálás

Preparáló technikák:

- régen: fixálás, mőanyagba ágyazás, mikrotómos szeletelés, nehézfém ionokkal való festés – felbontás: 3 nm –krioelektronmikroszkópia: speciális vizsgálati objektumoknál, pl: fehérjeszerkezet vizsgálatoknál: gyors fagyasztás, amorf, nem kristályos jégbe ágyazás (bakteriorodopszin, aquaporin, tubulin szerkezet) – 2D-ban, számítógépes módszerekkel 3D struktúra kiszámítható

-fagyasztva töréses eljárás: fixálás nélkül

Pásztázó elektronmikroszkóp:

vastagabb vizsgálati objektumokhoz,

képalkotás pontról pontra „letapogatja” a felszínt