SEKANS TEKNİKLERİ

GENOMİK-PROTEOMİK

Ders Sorumlusu: Doç.Dr. Hatice MERGEN

Hazırlayan: Levent ZORBEK

Ankara,2006

DNA Dizi Analizi için geliştirilen birbirinden farklı ikiyöntem bulunmaktadır. Bu iki yöntem;

1- Maxam ve Gilbert’in kimyasal kırılma yöntemi (Maxam et al.,1977).

2- Sanger-Coulson’un zincir sonlanma yöntemi. (Sanger et al.,1977).

a-) Manuel (Radyoaktif İşaretleme) Dizi Analizi

b-) Otomatik (Fluoresan İşaretleme) Dizi Analizi

Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi

DNA dizi analizinde en sık kullanılan yöntem Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanmayöntemidir (Sanger et al., 1977). Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. Bu yöntemde dizisi saptanacak olanDNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarakkullanılır. DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenaz enzimlerindenbirisi kullanılabilir.

Yöntemin temeli DNA polimerazın dNTP’ lerin(deoksiribonükleozit trifosfat) yanısıra deoksiribozun3’ pozisyonunda OH grubu taşımayan ddNTP’ leri de (dideoksiribonükleozit trifosfat) substrat olarakkullanabilmesine dayanır. Sentezlenen DNA’ ya birddNTP’ nin katılması 3’ pozisyonunda OH grubuolmadığı için sentezi durdurur.

dATP ddATP

Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımıhazırlanır. Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dNTP’ lerin dördü ve az miktarda ddNTP’ lerden biriniiçerir. Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyondafarklı bir ddNTP bulunur. Reaksiyonların her birinde çok azmiktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincirsentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmentimeydana gelir (Klug et al., 2000).

Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP’ nin tipine göre okunur (Klug et al., 2000).

Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar

Primerler

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlere yani primerlere ihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nın genomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimeraz enzimi için uygun 3’ ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynıolabileceği gibi farklı primerler de kullanılabilir.

Gen bölgesinin elde edilmesinde kullanılan primer çifti dizi analizi yapılacak bölgenin daha dışından seçilip dizi analizi reaksiyonunda kullanılan primer ise bu primerlerin arasında ve dizinin analizi yapılacak bölgesine daha yakın olmalıdır. Sekanslama reaksiyonunda tek bir primer kullanılır ve böylece reaksiyon yönü tayin edilmiş olur (Sambrook et al., 1989).

Kalıp DNA

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase ChainReaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özengösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterincetemizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonunaaktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonunhassasiyetini bozacaktır (Sambrook et al., 1989).

Enzimler

Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipdeDNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. Bu enzimlerinortak özellikleri özgül ve hassas olmalarıdır.

E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I

İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyükdezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarakçoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzunokumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisienzimin homopolimerik bölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olanbölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır (Sambrook et al., 1989).

Reverse Transcriptase

Reverse transcriptase enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerikbölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenow fragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır (Sambrook et al., 1989).

Sequenase Enzimleri

Sequenase enzimleri T7 bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. İnhibeedilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir (Sambrook et al., 1989).

Taq DNA Polimeraz

Özellikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcağa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür. Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir (Sambrook et al., 1989).

Manuel DNA Dizi Analizi

Sekans reaksiyonu kullanılarak zincir sonlandırma metoduuygulanır (Sanger et al., 1977). Örnekler %6’lık denatüreedici poliakrilamid jelde ayrıştırılarak, otoradyografi ilegörüntülenir. Çalışılan gen amplifiye edildikten sonra enzimatik ön muamele yapılır. Bu amaçla hidrolitik enzimler (alkalin fosfataz ve ekzonükleaz I ) kullanılır. Ekzonükleaz I ortamdaki tek zincirli DNA iplikciklerini, alkalin fosfataz ise dNTP’leri uzaklaştırarak, dizi reaksiyonu için kullanılacak amplifikasyon ürününün temizlenmesini sağlar. İşlem tamamlandıktan sonra enzimleri inaktive etmek için, örnek karışımı 80 0C’da 15' bekletilir.

Primer tutunma reaksiyonu

Temizlenmiş amplifikasyon ürünü üzerine primer ilaveedilir. Karışım 100 0C’ da inkübe edildikten sonra, öncebuzlu su içinde, sonra buzda bekletilir. Örneğin bu şekildekademeli olarak soğutulması, kalıp katlanmasını veprimerlerin kendi aralarında eşleşmesini önler.

İşaretleme reaksiyonu

İşaretleme reaksiyonu için dört farklı tüp hazırlanır. Her bir tüp dört çeşit dNTP’nin yanısıra bir ddNTP içerir. Bu aşamada kullanılan DNA polimeraz T7 bakteriofaj DNA polimerazının modifiye formudur. Bu enzim 3‘5' ekzonükleaz aktivitesi içermez. Enzimin polimerizasyonhızı çok yüksek olup, DNA zincirine ddNTP takabilme özelliğine de sahiptir. Reaksiyon karışımı 5' odasıcaklığında bekletilir. İşaretleme aşamasında kullanılan işaretleme çözeltisi üç farklı dNTP içerir. Dördüncü tipdNTP, karışıma ilave edilen radyoaktif işaretli dNTP’dir.

Sonlandırma reaksiyonu

Zincir sonlanması 3'OH grubu bulunmayan nükleotitanaloglarının (ddNTP) zincire takılması ile sağlanır. Dört farklı sonlandırma çözeltisinin her biri 80µl eşit dNTP (A; C; G; T) ve 8µl tek bir bazın ddNTP’ sini içerir. Sonlandırma içinhazırlanan tüplerin her birine sonlandırma çözeltisi reaksiyonkarışımından ilave edilir. Tüplere formamid içeren durdurmaçözeltisi eklenerek reaksiyon durdurulur. Bu örnekler jeleyüklemeden önce denatüre edilir.

Reaksiyon Ürünlerinin Elektroforezi

Örneklerin görüntülenmesi için ürünler denatüre edici poliakrilamid jel elektroforezine tabi tutulurlar. Jelhazırlandıktan ve polimerizasyon işlemi tamamlandıktansonra ortamda kalan üre temizlenir. Elektroforez tamponuolarak 1X TBE kullanılır. Sisteme 70 watt, 1800 volt ve 50mA elektrik akımı verilerek 15-30’ ön elektroforez uygulanır. Bu uygulama tamlandıktan sonra yapılan DNA Dizi Analizireaksiyonları jele yüklenerek 2.5-3 saat yürütme yapılır.

Reaksiyon Ürünlerinin Otoradyografisi

Elektroforez bitiminde jel, asetik asit – metanol karışımındabekletilir, Whatmann 1MM kromatografi kağıdı üzerinealınarak jel kurutucuda kurutulur. Kuruma sonrası X-ışınınaduyarlı filmle kaplanır. 1-2 gün boyu oda sıcaklığındakaranlık odada tutularak otoradyografisi alınır.

Otomatik DNA Dizi Analizi

Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitliyöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika temelli yöntemlerdir.

İşaretleme Reaksiyonu

Otomatik Dizi Analizi ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kitikullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ileberaber, floresan boyalı ddNTP’ler ile Taq DNA Polimerazenzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. “Big Dye Ready Reaction Mix” olarak adlandırılan bu karışımasadece primer ve temizlenmiş kalıp DNA eklenir ve PCR başlatılır.

• BigDye Terminatör

AA

CCGG

TT

DNA Polymerase, dNTP’s and DyeDeoxyterminators

ACCGTA

ACCGT

ACCG

ACC

ACA

TT

AA

AACC

CC

GG

TT

Bağlanma Uzama Ürünler

Fluorescent Dyes Used in 4-Color Detection

Fluorescent Dyes Used in 4Fluorescent Dyes Used in 4--Color Color DetectionDetection

JOE (Green)FAM (Blue)

ROX (Red)TAMRA (Yellow)

Amplifikasyon Koşulları

1 amplifikasyon tüpü (20 µl) için reaksiyon karışımı

Kalıp DNA 8.0 µlBig Dye Ready Reaction Mix 8.0 µlPrimer (3.2pmol / µl) 1.0 µl Distile su 3.0 µl

PCR Programı

96 0C ‘ 10’’50 0C‘ 5’’60 0C‘ 4’’40C’ 10’ 1 döngü;

24 döngü;

Örneklerin Hazırlanması

Örnek hazırlama sırasında amplifikasyon ürünü izopropanolçöktürmesi ile PCR artıklarından temizlenir. Bu aşamaözellikle reaksiyona girmemiş floresan boyalı ddNTP’ lerinuzaklaştırılması açısından da çok önemlidir. İşlem uygunşekilde yapılamazsa kontaminant boyalar lazer tarafındanokunacak ve analizin hassasiyetini bozacaktır.

Örneğin Cihaza Yüklenmesi ve Elektroforezin Başlatılması

Örnekler izopropanol ile temizlenip alkol tamamen uzaklaştırıldıktan sonra işaretleme reaksiyonu ürünleriformamid veya TSR içinde çözülür. Örnekler denatüreedildikten sonra buz içinde şoklanarak cihaza yüklenir ve elektroforez başlatılır. Yürütme işlemi 15 kV gerilim ve 50 oC sıcaklıkta gerçekleştirilir.

Fluorescent Emission Spectra for ABI DyesFluorescent Emission Spectra for ABI DyesFluorescent Emission Spectra for ABI Dyes

ABI 310 Filter Set FABI 310 Filter Set F

520 540 560 580 600 620 640WAVELENGTH (nm)

100

80

60

40

20

0

5-FAM JOE NED ROX

Laser excitation(488, 514.5 nm)Laser excitation(488, 514.5 nm)

Nor

mal

ized

Flu

ores

cent

In

tens

ity

Matrix File Table from an ABI 310Matrix File Table from an ABI 310Matrix File Table from an ABI 310

1.00001.0000

These values are used by the GeneScan® Analysis Software to separate the various dye colors from one another. The letters B, G, Y, and R represent the dye colors Blue, Green, Yellow, and Red, respectively.

Sonuçların Değerlendirilmesi

Elektoroforez işlemi tamamlandıktan sonra bilgisayar anamenüsünden “Sequence Analysis” programı açılır ve yürütülen örnek burada analiz edilir. Analiz sonrası örnekisminin bulunduğu alan fare yardımıyla çift tıklandığındaörneğimizin baz dizisi yeni bir ekran üzerinde renkli piklerhalinde görünür. Her bir pik bir DNA fragmentine karşılıkgelir. Piklerin rengi ise söz konusu DNA fragmentinin son bazı olan ddNTP’ li bazın rengidir. Her bir pik üzerinde o pikin son bazının ilk harfi renkli olarak yazılıdır. Eğeristenirse baz dizisi metin olarak da alınabilir ya da her ikisonuç yazdırıcı vasıtasıyla kağıda aktarılabilir.

Otomatik Dizi Analizi Cihazları

1- Jel Sistemli Cihazlar (ABI Prism 370, 373, 377)

2- Kapiler Sistemli Cihazlar (ABI Prism 310, 3100, 3700)

ABI Prism 377

ABI Prism 377

Labeled DNA fragments (PCR products)

Sample Detection

CCD Panel

ColorSeparation

Ar+ LASER (488 nm)LASER(488 nm)

Fluorescence ABI Prism spectrograph

Capillary or Gel Lane

Size Separation

Detection region

ABI 310 PRISM

KapillerKapiller ElektroforezElektroforez

High Voltage

(+)anode

(-)cathode

CapillaryDetector

STANDARD OPERATIONSTANDARD OPERATIONSTANDARD OPERATION

CAPILLARY FILLPRE-ELECTROPHORESISWATER WASH OF CAPILLARYSAMPLE INJECTIONWATER WASH OF CAPILLARYELECTROPHORESISDETECTION

CAPILLARY FILLCAPILLARY FILLPREPRE--ELECTROPHORESISELECTROPHORESISWATER WASH OF CAPILLARYWATER WASH OF CAPILLARYSAMPLE INJECTIONSAMPLE INJECTIONWATER WASH OF CAPILLARYWATER WASH OF CAPILLARYELECTROPHORESISELECTROPHORESISDETECTIONDETECTION

Electrokinetic Injection Process

ElectrokineticElectrokinetic Injection Injection ProcessProcess

Q is the amount of sample injected

r is the radius of the capillary

cs is the sample concentration

E is the electric field applied

t is the injection time

λs is the sample conductivity

λb is the buffer conductivity

µep is the mobility of the sample molecules

µeo is the electroosmotic mobilityRose et al (1988) Anal. Chem. 60: 642-648

Q =λs

πr2cs(µep + µeo)EtλbCapillary

Sample Tube

DNA-

-

DNA

-

-

Electrode

ABI Prism 310 Genetic Analyzer

capillary

Syringe with polymer solution

Autosamplertray

Outlet buffer

Injection cathode

Inlet buffer

Stepper MotorStepper Motor

LaserAnode

Heat Plate

Pump Block

ABI Prism 310 Genetik Analizör Cihazı’na ait elektrot

ve kapiler

Enjeksiyon

Elektrodu Kapiler

Örnek Tepsisi

ABI Prism 3100

Cihazın İç Yapısı

Long Read Long Read BigDyeBigDye™™ Terminator v 3.0, 80 cm Capillary Array 3100 Terminator v 3.0, 80 cm Capillary Array 3100 Genetic AnalyzerGenetic Analyzer

Model 3100

Basecaller-3100POP4_80BC 1.4.b.2

7_11.ab1

2498.13734.1443.567Lane 11

Signal G:304 A:286 T:249 C:197DT3100POP4{BDv3}v1.mob

Points 1570 to 18468 Pk 1 Loc: 1570

Page 1 of 2Tue, Sep 18, 2001 11:29 AMTue, Sep 11, 2001 8:36 AM

Spacing: 16.00{16.00}

Version 3.4.1

CATTCTTTAG10ACGCTTCCTG

20TGCTACCATT

30CTCGGAAATA

40CTGCAAGAAA

50TCATCGATGT

60CCCATG ACGG

70AAAAGAAGAA

80CCTGGTATTG

90CCAAAAAGAT

100AAACTCAGTA

110GATGATATTA

120T

TTATCAAATG130TCAATGCTGG

140GTCCAAAAAA

150ATGATGAAGA

160ACGATTAGCT

170GAAATTTTAT

180CCATAAACAC

190AAGAAAAGCA

200CCACCAAAAT

210TCTATGTTCA

220CTATGTTAAT

230TACAACAAGC

240GT

TTTAGATGA250GTGGATTACC

260ACTGACAGAA

270TAAACCTGAA

280GAAGATCCAG

290TTCCCCAAGA

300AAGAGGCCAA

310GACCCCCACT

320AAGAACGGAC

330TTCCTGGGTC

340CCGTCCTGGC

350TCTCCAGAGA

360GAGAGG

GTGCC370GGCCTCGGCG

380CAGGCCAGCG

390GGAAGACCTT

400GCCAATCCCG

410GTCCAGATCA

420CACTCCGCTT

430CAACCTGCCC

440AAGGAGCGGG

450AGGCCATTCC

460CGGTGGCGAG

470CCTGACCAGC

480CGCTCTCCTC

490CAGCT

TCCTGC500CTGCAGCCCA

510ACCACCGCTC

520AACGAAACGG

530AAGGTGGAGG

540TGGTTTCACC

550AGCAACTCCA

560GTGCCCAGCG

570AGACAGCCCC

580GGCCTCGGTT

590TTTCCCCAGA

600ATGGAGCCGC

610CCGTAGGGCA

620GTGG

GCAGCCC630AGCCAGGACG

640GAAGCGAAAA

650TCGAATTGTT

660TGGGCACTGA

670TGAGGACTCC

680CAGGACAGCT

690CTGATGGAAT

700ACCGTCAGCA

710CCACGCATGA

720CTGGCAGCCT

730GGTGTCTGAT

740CGAAGCCACG

750A

ACGACATCGT760CACCCGGATG

770AAGAACATTG

780AGTGCATTGA

790GCTGGGCCGG

800CACCGCCTCA

810AGCCGTGGTA

820CTTCTCCCCG

830TACCCACAGG

840AACTCACCAC

850ATTGCCTGTC

860CTCTACCTGT

870GCGAG

GTTCTG880CCTCAAGTAC

890GGCCGTAGTC

900TCAAGTGTCT

910TCAGCGTCAT

920TTGACCAGTG

930TGACCTACGA

940CATCCTCCAG

950GCAATGAGAT

960TNCCGCAAGG

970GCCCATCTCT

980TCTTNGAGAT

990GATGGAC

ABI Prism 3700

İİki Yki Yööntemin Kntemin Kııyaslanmasyaslanmasıı

ManuelManuel YYööntemntemMaliyeti dMaliyeti düüşşüükkDaha fazla iDaha fazla işşggüüccüü gerekirgerekirEn fazla 350 En fazla 350 bbçç okunabilirokunabilirİİlk radyoaktif lk radyoaktif dATPdATPzincire eklendikten sonra zincire eklendikten sonra okuma baokuma başşlarlarDaha fazla zaman alDaha fazla zaman alıırr

Otomatik YOtomatik YööntemntemMaliyeti yMaliyeti yüüksekksekDaha az iDaha az işşggüüccüü gerekirgerekir1000 baz 1000 baz ççifti okunabilirifti okunabilirPrimerdenPrimerden hemen sonra hemen sonra okunabilirokunabilir

Daha kDaha kıısa ssa süüre alre alıırr

Otomatik sekansOtomatik sekansıın teorik kapasitesin teorik kapasitesi24 24 kapillerkapiller sekans aletinin kapasitesi 2.7 milyon baz/ysekans aletinin kapasitesi 2.7 milyon baz/yııllTTüüm insan genomu sekansm insan genomu sekansıında bir tek cihaz nda bir tek cihaz kullankullanııllıırsa1000 yrsa1000 yııl gereklil gerekliBu nedenle 96 ve 384 Bu nedenle 96 ve 384 kapillerkapiller sekans aletleri sekans aletleri geligelişştirilmitirilmişştir.tir.SlabSlab jeljel kapillerkapiller sistem= 24 saat/9 ysistem= 24 saat/9 yüürrüütmetme11--6 milyon baz/1 ay/ 1 sekans aleti6 milyon baz/1 ay/ 1 sekans aletiAmershamAmersham MegabaseMegabase 1000 ile 450 000 baz / 1 g1000 ile 450 000 baz / 1 güünnBBüüyyüük genomlar ik genomlar iççin birin birççok ok lablab. . biraradabirarada ççalalışışmakta ve makta ve ggüünde 18 milyon baznde 18 milyon bazıın sekansn sekansıınnıı yapabilmektedir.yapabilmektedir.

İnsan genom projesinde kullanılan sekanslama stratejileri

1- BAC temelli sekanslama

2- tüm genom shutgun stratejisi

BAC temelli sekanslama

İnsan genomu yaklaşık 150-200 kb uzunluğundafragmentlere ayrıldı. Bu fragmentler BAC vektörlereklonlanarak insan genomunun BAC kütüphanesioluşturuldu. BAC kütüphanesi yaklaşık 20 000 kadarBAC klonundan oluşmaktaydı. Daha sonra her birBAC klonu insan genomundaki yerinin belirlenmesiamacıyla haritalandı.

Dizi analizi için her bir BAC klonu yaklaşık 2000 bp’likdaha kısa fragmentlere parçalandı. Bu subklonların dizianalizi yapılarak bilgisayarlar kullanılarak birleşme noktalarından faydalanılarak her bir BAC klonunundizisi çıkarıldı. Daha sonra haritalanan BAC klonlarıbirleştirilerek tüm genomun dizisi çıkarıldı.

Tüm Genom Shutgun Stratejisi

Dr. J. Craig VENTER ve arkadaşları tarafından geliştirilenbu yöntem haritalamaya gereksinim duymadığından zamanve işgücü açısından tassarruf sağlamaktadır. Bu yöntemdeönce genom yaklaşık 2000 ve 10000 bp’lik küçük fragmentlereayrılır daha sonra bu fragmentler plazmit vektörlere klonlanarakçoğaltıldıktan sonra dizisi çıkarılır. Bu diziler bir algoritmprogramı ile birleştirilerek genomun dizisi çıkarılır.

Bu teknik basit olarak görünse de insan genomu gibi büyük genomlara uygulandığında kısa bir süre içindemilyonlarca fragmentden elde edilen dizilerin kısıtlı birsürede birleştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca yöntem çok sayıda yüksek kapasitede çalışabilecek sekansırve sekansı çıkarılan dizilerin birleştirilmesi için bilgisayar sistemlerine gereksinim duymaktadır. Venterbu amaçla TIGR’yı (The Institute for Genome Research)kurarak milyonlarca fragmenti biraraya getirmek içinAlgoritm programı geliştirdi.

Bu algoritmayı kullanarak Venter ve arkadaşları 1.8 milyon bp’den oluşan Haemophilus influenza genomunundizisini çıkardılar. Venter ve arkadaşları bu yöntemi insan genomuna uygulamaya karar verdiklerinde bir çok araştırıcı bu yöntemin insan gibi milyonlarca repetatifDNA içeren büyük genomlarda başarılı olmayacağını öne sürmekteydi.

Ocak 1998’de yüksek kapasiteli 3700 cihazlarınınve shutgun sekans algoritmasının geliştirilmesi ileinsan genom projesi hız kazandı. Mayıs 1998’deVenter, 300 adet 3700 ve çok sayıda yüksek kapasitelibilgisayar alarak Celera Genomics şirketini kurdu veİnsan genomunun dizisinin 3 yıl içinde tamamlanacağınıduyurdu. Venter ve arkadaşları 9 ay içinde insan genomunun taslağını çıkarmayı başararak yöntemlerininbaşarılı olduğunu kanıtladılar.

Haziran 2000’de insan genom projesinin tamamlandığıaçıklandı. Ancak açıklanan diziler taslak diziler olupdüzeltilmesi gerekiyordu. İki grup bir arada çalışaraknisan 2003 yılında diziye son şeklini verdiler

Haziran 2000Haziran 2000

Genomun %90Genomun %90’’ıınnıı iiççeriyoreriyorHata oranHata oranıı yaklayaklaşışık 1000 k 1000 bazda 1bazda 1150 000 150 000 gapgap bulunuyorbulunuyorGenomun %28Genomun %28’’i bitii bitişşstandardstandardıına uygun

Nisan 2003Nisan 2003

Genomun %99Genomun %99’’unu iunu iççeriyoreriyorHata oranHata oranıı yaklayaklaşışık 10000 k 10000 bazda 1bazda 1400 400 gapgap bulunuyorbulunuyorGenomun %99Genomun %99’’i bitii bitişşstandardstandardıına uygunna uygun na uygun