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RESUMEN EJECUTIVO

En el Ecuador, las leguminosas (importantes fuentes de proteína) son generalmente cultivadas en

suelos pobres especialmente en nitrógeno, lo cual constituye un factor crítico de sus bajos

rendimientos. Para incrementar estos, una alternativa es el aprovechamiento de la fijación biológica

de nitrógeno al asociarse simbióticamente con microorganismos del suelo, concretamente con la

bacteria del genero Rhizobium. Este proyecto se inició solicitando a centros internacionales de investigación microbiológica, cepas

de la bacteria. Paralelamente se procedió al aislamiento de cepas nativas provenientes de suelos

ecuatorianos, para formar un banco germoplásmico del microsimbionte de los cultivos de fréjol,

arveja, alfalfa, soya y maní. A continuación se realizó la caracterización fenotípica y genética de la

bacteria asociada a los cultivos de fréjol y maní, por cuanto son leguminosas cuyos centros de

origen se encuentran en la región de Latinoamérica, siendo que en el caso del fréjol, uno de sus

centros de origen es precisamente el Ecuador. Esto permite suponer que la diversidad genética de la

bacteria en el Ecuador es amplia, lo que podría originar una especificidad simbiótica entre el

microorganismo y la planta. La caracterización de las cepas de fréjol fue complementada con un

estudio de compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo. Posteriormente, el proyecto llevó a cabo el estudio de la estimación del potencial de fijación de

nitrógeno de las cepas de cada una de las leguminosas, bajo condiciones de invernadero y de

campo. En fréjol, se estudió también la competitividad de las mejores cepas por nodulación, para

conocer la cepa más competitiva y poder usarla como inoculante.

En una segunda fase, se recolectaron turbas y otros materiales (soportes): turba de Chimborazo,

turba de Lloa, turba de Alaska, capa rosa, ceniza, zeolita, y un sustrato a base de vaina seca molida

de fréjol mezclado con compost, para ser evaluados como potenciales portadores de Rhizobium en la elaboración de inoculantes. Los soportes fueron sometidos a un análisis físico, químico y

biológico, y evaluados en su capacidad de mantener viable a la bacteria por lo menos durante cuatro

meses.

La investigación de campo fue de carácter participativa conjuntamente con los agricultores quienes

desempeñaron un rol importante en la difusión de los resultados, con un efecto multiplicador. La

difusión sobre la tecnología de los inoculantes y el uso del producto generado por el proyecto fue

reforzada a través de medios como trípticos, días de campo, talleres, y programas de radio. Estos

últimos, en colaboración directa con miembros de la Fundación GAIA, quienes forman parte del

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proyecto Comminandes, el mismo que tiene por objetivo generar tecnologías ambientalmente

amigables como el compost enriquecido con inoculantes microbianos, a fin de mejorar los

rendimientos de cultivos y la fertilidad de los suelos de la región Interandina.

Paralelamente al proceso de investigación, el proyecto ha ido implementando un laboratorio de

Microbiología de Suelos en el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina,

del INIAP, con equipos, reactivo y material necesarios para el manejo de la bacteria y la

elaboración de inoculantes.

Como resultados, el estudio de caracterización de cepas de fréjol y de maní, demuestra la alta

heterogeneidad de la bacteria en suelos Ecuatorianos. El estudio de la compatibilidad genética entre

la bacteria y el cultivo de fréjol, encontró que la diversidad genética de la bacteria es mayor cuando

se asocia a cultivares “locales”. Esto implica que existe cierta especificidad entre los simbiontes y

por lo tanto se recomienda elaborar inoculantes con cepas aisladas de suelos pertenecientes a

regiones donde la variedad de leguminosa es predominante. Este mismo comportamiento de

especificidad simbiótica podría existir en la asociación maní­Bradyrhizobium, pero en este caso, se requiere de estudios complementarios para un mejor entendimiento de este fenómeno.

El proyecto seleccionó cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno. En fréjol las cepas UMR

1478 y UMR 1481, en maní: ECUM­P8­6, ECUM­L102, en arveja ECUA –I1, ECUA­Z2, en

alfalfa UMR 6008, TAL 380, y en soya: CIAT 151, UMR 6001, ECUS­001, ECUS1­SJ. Este banco

germoplásmico de la bacteria se encuentra almacenado en el laboratorio y bajo condiciones de

liofilización.

En cuanto a la competitividad de cepas asociadas al fréjol, el estudio logró conseguir antisueros de

calidad y en suficiente cantidad para las cepas estudiadas, permitiendo tener un stock suficiente de

antisueros para futuros estudios serológicos de Rhizobium. El INIAP dispone de un stock de turba de Chimborazo, que después de un análisis físico, químico y

biológico, se la identificó como un buen portador de Rhizobium, al compararla con otros siete materiales catalogados como potenciales portadores.

La difusión de los resultados del proyecto ha permitido que el número de agricultores que usan

inoculantes, incremente, comprobado mediante diagnósticos realizados en las Provincias del Cañar

(comunidad Virgen de la Nube) y de Pichincha (Chaupiloma­Tabacundo). La difusión también se

ha realizado a través de eventos nacionales e internacionales.

Sobre la base de los resultados de la investigación se recomienda: 1) complementar el estudio de

caracterización de cepas de maní, 2) una evaluación de campo de cepas representativas de cada uno

de los grupos obtenidos en el análisis genético de RFLP de las cepas de maní, 3) la evaluación en

experimentos demostrativos, y en varios sitios de una misma región, de varias cepas para

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compararlas con las cepas “nativas”, 4) realizar un estudio sobre la respuesta de la inoculación al

fósforo, sus niveles, y formas de aplicación. El fósforo es un elemento esencial en el proceso de la

fijación del nitrógeno, y en los suelos andinos (Andisoles), éste elemento es adsorbido por las

partículas del suelo, dificultando la absorción por el cultivo, 5) mayor difusión de la tecnología en

otras regiones donde el proyecto no tuvo mayor presencia, especialmente en la Costa Ecuatoriana,

donde la implementación de un laboratorio para la elaboración de inoculantes es recomendable, ya

que los agricultores de la región necesitan proveerse fácil y constantemente de los inoculantes, al

momento preciso de la siembra.

La interacción directa con centros internacionales de investigación agrícola, permitió la

capacitación de personal del proyecto, especialmente en técnicas moleculares, como la

caracterización genética de “Bradyrhizobium” asociada al cultivo de maní. La capacitación incluyó cursos teórico práctico relacionados con Microbiología de Suelos, y visitas de investigadores

internacionales, permitiendo una estrecha interacción principalmente en el intercambio de

información científica. Los resultados del proyecto además han sido fundamentales como

antecedentes de propuestas de proyectos aprobadas por entidades como FUNDACYT.

Este proyecto sin duda, contribuirá con una agricultura de bajos insumos, caracterizada por la

reducción de la dependencia de los fertilizantes químicos, los cuales son costosos y representan

fuentes de contaminación de los recursos suelo y agua.

2. IDENTIFICACIÓN DEL PROYECTO

Código: PROMSA IQ­CV­081

Titulo: “Selección de cepas de Rhizobium adaptadas a condiciones de campo, y su uso como

inoculantes de leguminosas de la Sierra y Costa Ecuatoriana”.

Duración: Agosto del 2001 al 31 de Diciembre del 2003.

Institución base: INIAP. Estación Santa Catalina.

Instituciones colaboradoras nacionales: Universidad Central, IASA.

Instituciones colaboradoras internacionales: Universidad de Minnesota, CIAT, Universidad de la

Plata.

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Investigadores: Dr. Gustavo Bernal, Ing. Alfonso Suárez, Ing. Diego Campaña, Ing. Mauricio

Jerez, Lic. Cristina Salvador, Dr. Peter Graham, Dr. Mario Aguilar.

Tema del proyecto: Microbiología de Suelos.

Rubro pr incipal: Arveja, fréjol, alfalfa, soya, maní.

Tipo de institución ejecutora: Centro de Investigación Agropecuaria.

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3. CUADRO DE CONTENIDO DEL INFORME

Justificación del proyecto .................................................................................................................. 6

Objetivos de la investigación .............................................................................................................. 10

Actividades desarrolladas .................................................................................................................... 11

Resultados obtenidos ........................................................................................................................... 30

Discusión de los resultados ................................................................................................................. 50

Situación inicial del grupo meta .......................................................................................................... 54

Estimación de efectos e impactos ........................................................................................................ 54

Producto del proyecto .......................................................................................................................... 56

Logros adicionales ............................................................................................................................... 58

Limitaciones en el desarrollo del proyecto .......................................................................................... 59

Conclusiones y recomendaciones ........................................................................................................ 60

Lecciones aprendidas .......................................................................................................................... 62

Bibliografía .......................................................................................................................................... 63

Anexos ................................................................................................................................................. 68

Fecha y firma del investigador principal ............................................................................................. 81

TABLA DE CONTENIDO CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS

Cuadro 1. ......................................................................................................................................... 27

Cuadro 8.1 ....................................................................................................................................... 31

Figura 8.1 ........................................................................................................................................ 32

Figura 8.2 ........................................................................................................................................ 33

Figura 8.3 ........................................................................................................................................ 34

Figura 8.2 y Cuadro 8.2 .................................................................................................................. 35

Cuadro 8.3 ....................................................................................................................................... 36

Cuadro 8.4 y Cuadro 8.5 ................................................................................................................. 37

Fig. 8.5 ............................................................................................................................................ 39

Fig. 8.6 ............................................................................................................................................ 40

Cuadro 8.6 ....................................................................................................................................... 41, 42, 43

Cuadro 8.7 ....................................................................................................................................... 43, 44

Cuadro 8.8 y Cuadro 8.9 ................................................................................................................. 45

Cuadro 8.10 ..................................................................................................................................... 47

Cuadro 8.11 y Figura 8.7 ................................................................................................................ 48

Figura 8.7 ........................................................................................................................................ 49

ANEXOS, Cuadro 1 ....................................................................................................................... 67

Cuadro 2, Cuadro 3 y Cuadro 4 ...................................................................................................... 68

Cuadro 5 y Cuadro 6 ....................................................................................................................... 69

Cuadro 7 y Cuadro 8 ....................................................................................................................... 70

Cuadro 9 y Cuadro 10...................................................................................................................... 71

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4. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO

El Ecuador ha experimentado un considerable incremento de su población con la mayor

concentración en áreas urbanas, con 7'196.000 habitantes versus 4'741.000 del área rural. Para el

año 2020 se estima que la población urbana aumentará a 12'269.000 mientras que la población

rural será de 4'635.000 habitantes (FAO, 1999). Esto implica que la producción de alimentos en el

Ecuador debe duplicarse para el año 2020, por lo que sin duda, el mayor reto será el de producir de

manera sustentable, cantidades de alimentos nutricionales y disponibles para la mayoría de la

población. Se estima que el 90% de las familias pobres del Ecuador carece de una adecuada

alimentación (UNICEF, 1999), y que el consumo de proteína en el país alcanza niveles de 50 ­ 85

g proteína/día, mientras que el de calorías varia entre 1800 a 2500/día con valores inferiores

asociados con las regiones más pobres. Bajo este contexto, las leguminosas como el fréjol, arveja,

soya, maní, etc., juegan un papel de relevancia en la seguridad alimenticia, como fuentes de

proteínas y calorías para la población ecuatoriana, mientras que otras leguminosas como la alfalfa

son pastos importantes en la producción pecuaria (carne y leche) de vastas zonas del país.

Las leguminosas en la región interandina son sembradas especialmente por el pequeño y mediano

agricultor en suelos bajos en contenido de nutrientes especialmente nitrógeno (INIAP, 1994) y

algunos micro­nutrientes. La mayoría de los suelos de la Sierra son además susceptibles a niveles

de erosión hídrica que en las partes altas estos son de magnitud considerable. La alfalfa, aunque

es sembrada en terrenos de menor inclinación y aptos para la producción pecuaria, sin embargo

sufre también de deficiencias nutricionales debido a las características de los suelos donde se la

cultiva, lo cual afecta directamente su rendimiento y consecuentemente el rendimiento animal.

Los suelos del litoral Ecuatoriano presentan también problemas nutricionales como por ejemplo en

regiones de las Provincias de Los Ríos y Manabí. Las constantes lluvias a las que son expuestos en

determinada época del año son la causa principal de la deficiencia de nitrógeno y otros elementos,

los cuales son lavados o lixiviados, disminuyendo considerablemente la fertilidad de los suelos. La

disminuida fertilidad viene a constituir un factor fundamental de los bajos rendimientos de las

leguminosas tanto en la Sierra como en la Costa Ecuatoriana, afectando la economía de los

agricultores. Para incrementar los rendimientos de las leguminosas, existen dos maneras de hacerlo:

1) Aumentando el uso de fertilizantes químicos nitrogenados. Lamentablemente, estos son causa de

la deterioración del suelo y del agua, contaminándolos y perjudicando la calidad y el uso de estos

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recursos. Por otro lado, los costos elevados en el Ecuador de los fertilizantes nitrogenados, los

requerimientos altos de energía para su producción, o simplemente la dificultad de transportarlos a

las fincas de los pequeños agricultores, limitan el uso en la producción agrícola.

2) Aprovechando la fijación biológica de nitrógeno por parte de las leguminosas al asociarse

simbióticamente con las bacterias del género Rhizobium (rizobios). Estos organismos del suelo,

responsables del 80% de la fijación biológica del nitrógeno, tienen la capacidad de convivir

simbióticamente con la leguminosa en los nódulos radiculares, los cuales son órganos especiales de

las raíces, en los que tiene lugar el proceso biológico de la fijación del nitrógeno atmosférico. Las

leguminosas, dependiendo del cultivo y la variedad, y de los rizobios, son capaces de fijar hasta

300­400 kg N/ha (Brockwell and Bottomley, 1995). Sin embargo, en áreas nuevas, las

leguminosas a ser sembradas requieren de la inoculación con Rhizobium específico y eficiente, que permita lograr incrementos significativos en sus rendimientos.

Identificado el problema de la deficiencia nutricional (especialmente N) de algunos suelos agrícolas

ecuatorianos, el INIAP a través de la Unidad de Microbiología del Departamento de Protección

Vegetal de la Estación Santa Catalina, inició hace aproximadamente 15 años, investigación en

fijación biológica de nitrógeno (FBN) en colaboración con la Facultad de Agronomía de la

Universidad Central. Las actividades comprendieron recolecciones de cepas (razas) a nivel

nacional, y evaluaciones de la capacidad fijadora en los cultivos de arveja, chocho, haba y fréjol.

Los estudios en su mayoría fueron llevados a cabo bajo condiciones de invernadero y en algunos

casos se probaron combinaciones de cepas y leguminosas. Adicionalmente, se recolectaron turbas

dentro del Callejón Interandino (Estévez y Constante 1993), seleccionándose algunas como

acarreadores potenciales de los rizobios.

Posteriormente, la Unidad responsable del proyecto llevó a cabo investigación colaborativa con

instituciones nacionales e internacionales. Así por ejemplo con el NifTAL de Hawai se evaluó el

medio selectivo BJSM (Bradyrhizobium japonicum selective medium) para verificar la calidad de inoculantes de Bradyrhizobium para soya. Los resultados mostraron que la mayoría de los

inoculantes evaluados y comercializados en el mercado ecuatoriano son de calidad extremadamente

baja, con poblaciones máximas de 1 x 10 2 bacterias/g de inoculante (Bernal y Estévez, 1994),

cuando el nivel permitido en países con sistemas de control de calidad (ej. Canadá) es de 10 8 ­ 10 9

bacterias/g de inoculante, o de 10 3 , 10 4 y 10 5 rizobios/semilla pequeña, intermedia y grande,

respectivamente (www.rhizobium.umn.edu). Además, algunos inoculantes evaluados mostraron

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niveles altos de contaminación (con hongos y otras bacterias) que afectan la sobrevivencia de los

rizobios en la turba (portador de la bacteria) y por lo tanto la validez del inoculante como una

alternativa de fertilización nitrogenada. Estos datos, indudablemente han sido causa para que los

agricultores, y algunos técnicos e investigadores agrícolas, hayan dado poco valor a la práctica de

la inoculación.

Con la experiencia e información acumulada en el INIAP, el grupo de microbiólogos de la Unidad

Responsable del Proyecto, a través del proyecto colaborativo CRSP (Universidad de Minnesota –

INIAP), inició en 1995 la producción a nivel experimental, del inoculante Rhizoiniap, para fréjol

arbustivo cultivado principalmente por pequeños y medianos agricultores de Carchi e Imbabura,

regiones donde el proyecto CRSP ha tenido sus mayores impactos. El inoculante ha sido elaborado

casi en su totalidad utilizando turba importada.

Los miembros de las UVTT (Unidades de Validación y Transferencia de Tecnología) del INIAP,

han sido los responsables de validar el inoculante en parcelas demostrativas y conjuntamente con

agricultores de ambas provincias. Se han reportado resultados positivos en el rendimiento de

algunas variedades de fréjol, siendo una de las razones precisamente la respuesta a la inoculación

con Rhizoiniap. Entre las variedades se encuentra la variedad JeMa, la cual fue introducida por el proyecto CRSP y entregada al agricultor por el Programa Nacional de Leguminosas (PRONALEG).

El incremento en rendimiento (70 kg/ha) debido a la inoculación en fréjol, reportado por pequeños

agricultores del Carchi, constituyo un importante precedente para iniciar esta investigación con el

fin de seleccionar cepas nativas y no nativas, genéticamente estables y adaptadas a condiciones

adversas de campo, que presenten respuesta a la inoculación. En este proyecto, se considero la

evaluación de cultivares de cada leguminosa, aptos en fijación bajo condiciones de campo, y la

búsqueda de materiales apropiados como portador de la bacteria y la evaluación de la esterilización

de los portadores. Posteriormente a la investigación, se ha institucionalizado un sistema de control

de calidad para la producción de inoculantes. Todos estos aspectos señalados son vitales como

componentes integrales de estrategias en el cultivo de las leguminosas, que optimicen su efectiva

nodulación, fijación de nitrógeno, y mayor rendimiento.

Existen estudios en el exterior que han demostrado muy claramente incrementos significativos en

rendimiento como resultado de la inoculación con Rhizobium. Así por ejemplo, en varias regiones frejoleras del Brasil se ha reportado incrementos de hasta 900 kg/ha (Hungria y Vargas, 2000). En

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soya cultivada en el Estado de Wisconsin (Estados Unidos) se ha logrado incrementos de hasta

1060 kg/ha (Oplinger, 1998), en alfalfa sembrada en Texas 445 kg/ha (Evers, 1996), y en maní 170

kg/ha como media de 30 experimentos ejecutados por siete universidades norteamericanas

(www.histick.com).

Esta propuesta de investigación en el Ecuador incluyó las siguientes leguminosas: maní y soya en la

Costa, fréjol, arveja y alfalfa en la Sierra. La demanda de esta investigación se justificó

principalmente por los siguientes aspectos: a) las leguminosas: fréjol, maní, soya y arveja son de

gran importancia nutricional para consumo humano, en tanto que la alfalfa es para la producción

pecuaria. Estos cultivos tienen su relevancia económica para agricultores de la Sierra y Costa

Ecuatoriana. En esta última región, la leguminosa hortícola (ej. fréjol) están desarrollándose de una

manera considerable con fuerte inclinación hacia la agroindustria, y con la apertura del área de la

Península un mayor impulso de estos cultivos es evidente (Suárez 1999, comunicación personal).

b) Estas leguminosas constituyen rubros significativos tanto por la superficie cosechada, así como

su distribución geográfica. Por ejemplo, el fréjol seco cuya superficie cosechada es de 61.520

ha/año (FAO, 1999) abarca casi todas las provincias de la Sierra, y últimamente algunas provincias

de la Costa. El cultivo de la soya abarca 55.000 ha, especialmente en las Provincias de Los Ríos,

Manabí y Guayas.

c) A pesar de la importancia de estas leguminosas, los rendimientos siguen siendo bajos. Así por

ejemplo, se estima que para fréjol, a nivel nacional y de pequeños agricultores, el rendimiento es de

673,3 kg/ha en grano seco y de 1500 kg/ha en vaina (FAO, 1999). Otro ejemplo es la a soya, la cual

alcanza un rendimiento aproximado de 2 t/ha.

d) El uso del fertilizante nitrogenado, representa para la mayoría de los agricultores, un insumo muy

costoso en el mercado local, repercutiendo directamente en la baja productividad agrícola de estos

cultivos.

e) En el país, los estudios relacionados con el tema no han considerado aspectos integrales que

permitan desarrollar un programa continuo de selección de cepas genéticamente estables y

adaptadas a condiciones de campo. Tomando en cuenta un criterio “holístico”, se podría producir de

manera constante y racional inoculantes que garanticen el incremento de los rendimientos de las

principales leguminosas. Además, el proyecto consideró rubros nuevos e importantes como el maní.

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f) Esta investigación constituye un complemento a los trabajos llevados a cabo por el PRONALEG

del INIAP, en el mejoramiento de rubros prioritarios para consumo humano y animal. Se trata de

incrementar los rendimientos de las leguminosas a través del aprovechamiento biológico de

nitrógeno, y como consecuencia también el de los cultivos asociados o subsecuentes, especialmente

en condiciones del pequeño y mediano agricultor. Con relación a la alfalfa, gran parte del nitrógeno

fijado por la planta, es retornado al ecosistema donde se convierte en disponible en la rotación con

cereales. Sin duda, ésta alternativa biológica de fertilización constituye un componente clave de la

agricultura sostenible y de los sistemas de manejo de suelos, contribuyendo con la protección del

medio ambiente y con el equilibrio del ecosistema.

Los beneficiarios del proyecto son directamente los agricultores principalmente de la Sierra y Costa

quienes disponen de cepas altamente fijadoras de N. Otros beneficiarios son los Centros de

Investigación y Universidades del Ecuador y algunos institutos internacionales, así como también

las empresas agrícolas comercializadoras de productos agropecuarios.

5. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN.

Objetivos generales

a) Contribuir con el incremento del rendimiento de importantes leguminosas de consumo humano y

animal a través de la selección de cepas de Rhizobium eficientes en fijación de nitrógeno y estables bajo condiciones de campo.

b) Contribuir con la conservación de los recursos naturales (suelo, agua) a través del uso de

leguminosas como componentes esenciales en el mejoramiento de la fertilidad de los suelos,

propiciando la disminución de fertilizantes nitrogenados.

Objetivos específicos (Investigación a desarrollarse)

1) Incrementar el banco germoplásmico de Rhizobium para leguminosas nativas y no nativas del

Ecuador, debidamente caracterizado (fenotípica y genéticamente).

2) Evaluar bajo condiciones de invernadero y campo, el potencial simbiótico (efectividad e

infectividad) de las cepas de Rhizobium, en cada leguminosa.

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3) Evaluar y seleccionar turbas y otros materiales como soporte de Rhizobium.

4) Evaluar la esterilización de los portadores.

5) Difundir los resultados obtenidos.

6) Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos por el INIAP.

6. ACTIVIDADES DESARROLLADAS.

Objetivo 1.

1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas

1b .Almacenamiento de las cepas.

Objetivo 2.

2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo de fréjol.

2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero.

2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo.

2 d. Estudio de la competitividad de las cepas por nodulación, en el cultivo de fréjol.

Objetivo 3.

3 a. Recolección de turbas

3 b. Análisis físico, químico y biológico.

3 c. Interacción rizobio­turba (portador)

3 d. Evaluación de materiales alternativos

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Objetivo 4.

4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.

Objetivo 5.

5.1 Difundir los resultados y el uso de los productos generados por el proyecto.

Objetivo 6.

6.1 Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos.

7. DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES.

Actividad 1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas.

A través de solicitudes realizadas por el INIAP al Departamento de Microbiología de Suelos de la

Universidad de Minnesota, al Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), a la

Universidad de la Plata (Argentina) y otros centros internacionales de investigación en fijación

biológica del nitrógeno, se lograron incrementar el material genético de cepas de Rhizobium

pertenecientes a leguminosas no nativas del Ecuador. Entre estas están las de soya, alfalfa, y arveja,

cultivos que no son originarios de la Zona Andina. Para el caso del fréjol, y del maní, se realizó

recolecciones de suelos y de la leguminosa en varias regiones del país, para luego proceder al

aislamiento de las cepas asociadas con la leguminosa.

Es necesario enfatizar que en el cultivo haba pallar (Costa), en un inicio incluido en el proyecto para

la correspondiente selección de cepas de su microsimbionte Rhizobium, no se llevó a cabo ningún estudio por razones de presupuesto. Esta decisión fue informada verbalmente en Reunión de Grupo

de Referencia, al anterior Oficial de Proyectos del NRI (Dr. Francisco Muñoz), quien no objetó la

misma.

Para el aislamiento y purificación de la bacteria desde los nódulos radiculares de todas las demás

leguminosas involucradas en el estudio, se siguió la metodología de rutina utilizada por el INIAP.

Para esto, se utilizó el medio de cultivo a base de levadura, manitol, agar (LMA) con el indicador

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rojo congo (10 ml/L). Los aislamientos bacterianos fueron incubados a 26ºC durante 10 días, y

además fueron sembrados en medio conteniendo púrpura de bromocresol (10 ml/L) como indicador

de contaminación.

La conservación de las cepas bacterianas se realizó en tubos conteniendo medio de cultivo LMA

inclinado, y tubos liofilizados. En el primer caso las cepas fueron sembradas en el medio inclinado

contenido en tubos de vidrio con tapa rosca, incubados en estufa durante 5­7 días a 26 0 C, para

luego ser almacenados a 4 0 C.

Para la liofilización, los aislamientos puros se hicieron crecer en cajas Petri con LMA. Para esto, se

preparó una solución de peptona al 20%, y otra de sucrosa al 10%, para luego ser esterilizado por

separado (15 minutos a 121 0 C). Las soluciones estériles fueron mezcladas para luego vestirse sobre

la caja Petri y frotar la superficie del medio con la ayuda de un asa de platino, hasta formar una

suspensión bacteriana homogénea. Se tomaron alícuotas de 200 µl de la suspensión bacteriana en

tubos eppendorf (1.5 ml de capacidad) previamente esterilizados, y sellados cada uno con algodón

estéril.

Las bacterias fueron liofilizadas por 24 horas a ­54ºC utilizando un liofilizador (marca Labconco), y

luego de lo cual fueron cerrados y almacenados en refrigeración (4 o C). Como procedimiento

complementario, se realizó recolección de suelos en regiones donde la leguminosa es predominante.

Las cepas fueron aisladas a través de la prueba de infección (Somasegaran y Hoben, 1994) usando

la leguminosa correspondiente (como planta huésped) a cada región de donde el suelo fue

recolectado. Se inoculó a cada hospedero, diluciones sucesivas del correspondiente suelo para

posteriormente proceder al aislamiento de la bacteria a partir de los nódulos formados en las raíces

de la planta.

Caracter ización de las cepas.

Caracter ización fenotípica

La caracterización fenotípica se realizó únicamente con el germoplasma de Rhizobium asociado con los cultivos de fréjol y de maní, por cuanto son simbiontes de cultivos cuyos centros de origen están

en América del Sur, lo que hace suponer la existencia de una gran diversidad de la bacteria en

suelos Ecuatorianos, por lo que se justifica la caracterización de la bacteria simbionte, en ambos

cultivos. En cuanto al germoplasma de Rhizobium asociado con arveja, alfalfa, y soya, éste fue ya

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estudiado y documentado en trabajos previos realizados por la Facultad de Ciencias Agrícolas de la

Universidad Central del Ecuador, en colaboración con el INIAP. La caracterización de las cepas

asociadas al cultivo de fréjol se realizó en el Laboratorio de Microbiología de Suelos de la

Universidad de Minnesota, cuya descripción no se menciona en éste informe, ya que la misma se

encuentra detallada en el artículo de Bernal y Graham (2001). En cuanto a la caracterización de las

cepas asociadas al maní, ésta se realizó en el Laboratorio del Departamento de Protección Vegetal

de la Estación Experimental Santa Catalina –INIAP, siguiendo la metodología de Amarger et al.,

(1997). Se utilizaron noventa y tres aislamientos recolectados en las provincias de Manabí y Loja.

Además, se utilizaron cepas bien caracterizadas, fenotípica y genéticamente, como estándares o

controles.

Para la inoculación en los distintos medio de cultivo se utilizaron suspensiones fisiológicas frescas

de los aislamientos conteniendo 10 5 cel/ml; para lo cual, una colonia aislada fue transferida a medio

levadura manitol (LM), luego incubada por 26 0 C (12 días) hasta lograr una concentración de

10 9 cel/ml. Por dilución en agua estéril se llevó a una concentración final de 10 5 cel/ml. La

concentración de células fue determinada utilizando la metodología de Mac Farland sugerida por

Somasegaran y Hoben (1994).

A partir de las suspensiones bacterianas (10 5 cel/ml), se tomaron 50 µl y depositados dentro de un

alvéolo de un plato de ELISA. Con la ayuda de un inoculador multipunto de 48 descargas, los

aislamientos fueron transferidos sobre la superficie de cada uno de los distintos medios de cultivo.

Tiempo de crecimiento

Los aislamientos fueron sombrados en medio LMA. Se determinó dos rangos de crecimiento: 3 ­5

días para rizobios de crecimiento rápido, y de 7­12 días para rizobios de crecimiento lento. Los

aislamiento se incubaron a 26 0 C, y las lecturas se hicieron a los 5 y 12 días, respectivamente.

Morfología de las colonias

Las colonias formadas en los medios de cultivo fueron clasificadas en tres categorías: acuosas

translúcidas, acuosas blancas opacas, y cremosas opacas.

Acidificación o alcalinización del medio LMA

Los microsimbiontes de maní fueron sembrados en medio LMA conteniendo azul de bromotimol

(0.25 g/100ml). Las cajas de Petri fueron incubadas a 26 0 C determinándose la acidificación (color

amarillo) o alcalinización (color azul) producido por los microorganismos.

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Utilización de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno

Se siguió el método descrito por Bernal y Graham (2001). Se utilizaron soluciones de fuentes de

carbono y nitrógeno incluidos sorbosa, tartrato, D­glucoronic, eritritol, dulcitol, citrato, lactato,

glicina, triptófano, tirosina, cada una usada en una concentración final de 1g∙L ­1 en un medio basal.

El crecimiento de los microorganismos fue determinado a los 7 días de incubación.

Resistencia a antibióticos

Los aislamientos fueron probados en su capacidad de resistir a los antibióticos: estreptomicina,

espectinomicina, kanamicina, ácido nalidíxico, contenidos en medio TYA (triptona, levadura, agar).

Toler ancia a metales pesados

Se probó la tolerancia a: AlCl3.6H2O (500 ug/ml), Pb (CH3COO)2 (500 ug/ml), CuCl2.2H2O (100

ug/ml), y ZnCl2 (100 ug/ml), contenidos en medio TYA. La presencia o ausencia de crecimiento de

los aislamientos fue determinado luego de ser incubados a 26 0 C durante 10 días.

Toler ancia a pH del medio

Los aislamientos fueron probados en su capacidad de crecer en medio TYA a pH 4.5; 5.0; y 8.5. El

crecimiento fue determinado luego de incubar los cultivos a 26 0 C durante 7 días.

Toler ancia a concentr aciones de NaCl

Se siguió el método descrito por Bernal y Graham (2001). Se probó el crecimiento de las cepas a

concentraciones de 0.5%; 1.0%; 2.0% NaCl en medio TYA. Las cajas fueron incubadas a 26 0 C

durante 7 días.

Las fuentes de carbono y nitrógeno, así como los antibióticos, metales pesados y cloruro de sodio

fueron esterilizados por filtración, utilizando filtros Acrodisc 13 (GelmanSciences) de 0.2 µm, para

luego ser añadidos a los distintos medios estériles.

Análisis estadístico

La presencia (1), o ausencia (0), de crecimiento de las cepas en los diferentes medios de cultivo, se

registró en una matriz de datos binarios en el programa NTEDIT del paquete estadístico NTSYS­pc

versión 2,0 (Applied Biostatistics Inc, 1998).

16

La similitud entre cepas fue calculada de la matriz de datos binarios, entre pares de cepas, utilizando

la opción SIMQUAL, mediante el coeficiente de Simple Match Coeffient (SMC). Sobre la matriz

obtenida se aplicó la técnica de “cluster analysis” empleando el método de agrupamiento UPGMA

(Media Aritmética No Ponderada; Sneath & Sokal, 1973) mediante la opción SAHN

CLUSTERING del paquete NTSYS. Finalmente, mediante la opción TREE DISPLAY fueron

visualizados los agrupamientos o relaciones entre cepas, generándose el dendograma (fenograma)

mostrando las relaciones fenotípicas.

Caracter ización genética.

Por la razón anotada en la caracterización fenotípica, solo las cepas asociadas a los cultivos de fréjol

y maní, fueron caracterizadas genéticamente. Para esto, se seleccionaron cepas representativas de

cada grupo del dendograma generado en el análisis fenotípico. Las cepas de fréjol se caracterizaron

en el Departamento de Microbiología de Suelos de la Universidad de Minnesota (Bernal y Graham,

2001), y las cepas de maní se caracterizaron en el Instituto de Bioquímica y Biología Molecular

(IBBM) de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad de La Plata – Argentina. A

continuación se detalla únicamente la metodología utilizada en la caracterización genética de las

cepas de maní (Aguilar M. comunicación personal), ya que la descripción de la metodología para la

caracterización de las cepas asociadas al fréjol, se encuentra detallada en el artículo de Bernal y

Graham (2001).

Aislamiento de ADN genómico de las cepas.

Se utilizó el método de extracción con resina (Walsh et al. 1991). Tres colonias crecidas en medio

LMA, fueron suspendidas en 300 µl de ClNa (1M), dentro de un tubo eppendorf, y homogenizadas por

agitación. Después de incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, se centrifugó a 14000 rpm

por 3 minutos. El sobrenadante fue descartado para luego colocar en el tubo 300 µl de agua bi destilada

estéril. Se procedió a agitar y centrifugar en las mismas condiciones descritas anteriormente. Al pellet

obtenido se le adicionó 150 µl de una suspensión acuosa (6% p/v) de resina (Chelex 100, BIO­RAD)

en agitación, se dejó incubar 20 minutos a 56 0 C, y posteriormente 8 minutos a 99 0 C. Las muestras se

conservaron a ­20 0 C hasta el momento de ser utilizadas.

17

Análisis del genoma bacter iano

a. Condiciones generales de PCR y electroforesis

Todas las amplificaciones se realizaron en un termociclador (Biometra UNO­Thermoblock). Los

productos de amplificación, en alícuotas de 3­5 µl, fueron separadas mediante electroforesis horizontal

en geles de agarosa (0.8­ 2.5 %) conteniendo buffer TBE (tris­boro, EDTA) (0.5X) y bromuro de etidio

(5x10 ­4 mg/ml) y visualizados en un transiluminador de luz ultra violeta (UV). Los geles fueron

preparados en recipientes de electroforesis de 7 x 10 cm o 15 x 10 cm (BIO­RAD), y las fuentes de

poder utilizadas fueron PowerPac 200 y 300 (BIO­RAD) y EC290­50.

b. Digestión de fragmentos amplificados por PCR.

Las digestiones se realizaron a partir de alícuotas de 4 a 10 µl de la mezcla de reacción de PCR

incubadas con endonucleasas de restricción siguiendo las condiciones especificadas por el fabricante

(3 U por reacción). Se incubó toda la noche a 37 0 C (o a 65 0 C), de acuerdo a la temperatura óptima de

la endonucleasa utilizada. Los productos de las digestiones fueron separados por electroforesis en

geles horizontales de agarosa (2.5 %) en buffer TBE 0.5X. La electroforesis fue llevada a cabo a 80 V

durante 3h, en el mismo buffer.

c. Patrones de bandas (fingerprints) de ADN total usando los cebadores (primers) rep (ERIC y

REP).

Para conocer el grado de similitud entre los aislamientos, se realizó el análisis del genoma bacteriano

completo según De Bruijin, citado por Aguilar (2003), mediante el empleo de cebadores (primers) rep:

ERIC y REP. Para ERIC­PCR, se emplearon los cebadores E1 (5’­

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC­3’) y E2 (5’­AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG­3’).

El volumen de reacción fue de 10 µl conteniendo 2.5 µl de las preparaciones con resina, buffer de

polimerasa (10 mM Tris­Cl pH 9: 25 o C), 3 mM MgCl2 , 200 µM de cada dNTP, 1.5 µM de cada

primer y 0.55 U de Taq polimerasa. Las amplificaciones de ADN se llevaron a cabo con el siguiente ciclo de temperaturas:

18

95 0 C ⇒ 5 minutos

94 0 C ⇒ 1 minutos

52 0 C ⇒ 1 minutos X 35 ciclos

65 0 C ⇒ 8 minutos

68 0 C ⇒ 16 minutos

Para REP­PCR se utilizo también la técnica sugerida por De Bruijin (1992). Para esto se empleó los

cebadores Rep­1 (5’–IIIICGICGICATCIGGC­3’) y Rep­2 (5’–ICGICTTATCIGGCCTAC­ 3’). El

volumen de reacción fue de 15 µl, conteniendo la misma mezcla de reacción para ERIC, pero

utilizando 3.2 µl de DNA molde y 1 µM de cada primer. La amplificación se llevó a cabo con el

siguiente ciclo de temperaturas:

95 0 C ⇒ 5 minutos

94 0 C ⇒ 1 minutos

40 0 C ⇒ 1 minutos X 35 ciclos

65 0 C ⇒ 8 minutos

65 0 C ⇒ 16 minutos

Los perfiles (patrones de bandas) obtenidos después de la corrida de electroforesis y visualizados,

fueron analizados para su comparación, utilizando el programa GEL Compare.

d. Análisis por RFLP (Restriction Fragment Lenght Polimorphism) de la región íntergénica 16S­

23S rRNA.

La amplificación de la región íntergénica 16S­23S rRNA se llevó a cabo en cada uno de los

aislamientos utilizando los primers FGPS1490 (16f) y FGPL 132’(23r) cuyas secuencias son 16f

5’TGCGGCTGGATCACCTCCTT3’, 23r 5’CCGGGTTTCCCCATTCGG3’. El primero deriva de

una secuencia conservada en el extremo 3’ del gen 16S rRNA y el segundo deriva del extremo 5’

del gen 23S rRNA próximo a la región intergénica (Laguerre et al. 1996).

Las reacciones comprendieron un volumen final de 25 µl. El contenido de ADN fue de 2.5 µl de las

preparaciones con resina, 10mM Tris­Cl pH 9: 25 o C de buffer polimerasa, 2.5 mM de MgCl2, 200 µM

19

de cada dNTP, 1 µM de cada primer, y 1 U de Taq polimerasa. Las amplificaciones se llevaron a cabo

con el siguiente ciclo de temperaturas:

95 0 C ⇒ 5 minutos

94 0 C ⇒ 1 minutos

55 0 C ⇒ 1 minutos 35 ciclos

72 0 C ⇒ 2 minutos

72 0 C ⇒ 3 minutos

El análisis de RFLP fue de dos grupos de aislamientos obtenidos por diferenciación en el tamaño

del producto de su PCR. Las digestiones se realizaron con las enzimas de restricción Msp1, TAQ I,

Hae III, RsaI, AluI. El volumen de reacción fue de 8 µl conteniendo: producto de PCR 6µl, BSA 0.1

µl, Buffer 10X 1X, Enzima 3 U.

Actividad 1b. Almacenamiento de las cepas.

Para ambos casos, solicitud de cepas, y selección (aislados del suelo o directamente de la

leguminosa), el material germoplásmico fue almacenada apropiadamente a través del proceso de

liofilización (secado en frío y al vacío) de cada cepa, o en glicerol bajo temperatura de –70° C. El

almacenamiento se realizó en el Laboratorio de la Sección de Microbiología del Departamento

Nacional de Protección Vegetal (DNPV) de la Estación Santa Catalina.

Actividad 2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y el cultivo de fréjol.

A través de evidencias arqueológicas, se afirma que el fréjol (Phaseolus vulgaris) tiene su origen tanto en Mesoamérica (México, Guatemala), como en los Andes de América del Sur, y estudios

moleculares realizados en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), identifican al

Ecuador y a la región norte del Perú como un tercer mayor acervo genético del fréjol (Tohme et al.

1995). Se conoce además, que el germoplasma de fréjol de Mesoamérica es genéticamente diferente

al de los Andes (Koinange and Gepts, 1992). Esto se ha comprobado a través de hibridaciones entre

cultivares de ambas regiones, dando como resultado deformaciones y letalidad en la F1. En base a

esto, se asume que a través de la coevolución del cultivo de fréjol y su Rhizobium, ésta bacteria también presenta diferencias en la asociación con hospederos pertenecientes a diferente región.

20

Por lo tanto, para conocer si la nodulación de fréjol por su respectivo Rhizobium es efectivo o inefectivo, lo cual depende de la compatibilidad genética entre ambos simbiontes, se llevó a cabo

una investigación de especificidad por nodulación en jarras Magenta (Vincent, 1970) conteniendo

arena estéril e irrigada con solución nutritiva modificada "Summerfield" (McDermott and Graham,

1990). Las variedades de fréjol común usadas fueron Bolón M6, Bolón Cañicapac y Bolón Mater.

Además se incluyó la variedad Puebla 152 de origen Mesoamericano, para la comparación. Cada

variedad fue inoculada con todas sus respectivas cepas consideradas en el estudio. Se usaron suelos

de Cotacachi (norte del Ecuador), Cañicapac, Mangucusana y Mater (sur del Ecuador), y de

Poconichim (México), para contrastar. Las plantas fueron colocadas por cinco semanas en una

cámara de crecimiento (Conviron PGW 36). A las cinco semanas, se evaluó el color

(verde/clorosis), el crecimiento de las plantas, el número más probable (NMP) de rizobios, y la

diversidad genética (usando la prueba Box A1R­PCR). Así se determinó la combinación compatible

leguminosa­cepa de Rhizobium. Esta actividad se llevó a cabo en los laboratorios de Microbiología

de Suelos de la Universidad de Minnesota.

Actividad 2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero

Los experimentos fueron instalados en los invernaderos de la sección de Microbiología (DNPV) de

la Estación Experimental Santa Catalina del INIAP. Para fréjol se utilizó la variedad Bolon M6,

para arveja la variedad Roxana. Las variedades de soya y maní, fueron Vinceña y Caramelo

respectivamente. La actividad para estas dos últimas leguminosas se realizó en los laboratorios e

invernaderos de la Estación Pichilingue del INIAP. En alfalfa, esta actividad fue realizada hace 8

años por el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina, por lo que las cepas

seleccionadas en ese entonces fueron utilizadas directamente en el experimento de campo. Con

relación a los tratamientos, éstos fueron el resultado de la combinación de la variedad por las cepas

de Rhizobium. Se incluyeron tratamientos sin inocular (control absoluto), y con nitrógeno (solución de NOK 0.05% (control fertilizado), utilizados para comparación de las cepas. Todos los ensayos de

invernadero se dispusieron en un diseño de bloques completamente al azar (DCA) con tres

repeticiones. La unidad experimental estuvo constituida por la unión de dos jarras Magenta

autoclavables, superpuestas una sobre la otra y comunicadas por una mecha de algodón. La jarra

superior sirvió de maceta para sembrar una semilla previamente esterilizada y germinada. La jarra

inferior sirvió de recipiente para colocar la solución nutritiva y agua, de acuerdo a los

requerimientos de cada cultivo. Las variables cualitativas y cuantitativas tomadas en consideración

21

para la evaluación de la capacidad simbiótica en invernadero fueron: coloración de la planta,

número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso seco (g/planta). Se

utilizó un diseño completamente al azar y la selección de las cepas se realizó al nivel del 5%. Así

se conoció la efectividad fijadora de nitrógeno de las cepas de cada leguminosa, bajo condiciones

de invernadero.

Manejo del ensayo

Ester ilización y germinación de semillas.

Las semillas fueron esterilizadas superficialmente siguiendo el método sugerido por Vincent (1970).

La semilla fue tratada con etanol (96%) durante tres minutos, hipoclorito de sodio (5%) durante tres

minutos, y lavadas por ocho veces con agua destilada estéril. Posteriormente las semillas fueron

germinadas en placas de Petri conteniendo agar (1.5%) e incubadas a 26ºC durante 3­5 días

dependiendo de la leguminosa.

Siembra e inoculación.

Dos semillas germinadas fueron luego transferidas a jarras Magenta conteniendo turba y piedra

pómez (relación 3:1) estéril. El inoculante bacteriano se preparó a partir de una colonia aislada en

medio de cultivo LMA, y transferida a medio líquido (LM) e incubado a 26ºC. Los cultivos

crecidos conteniendo 10 8 cel/ml se diluyeron a 10 5 cel/ml, y se tomaron 10 ml para ser depositados

(10 6 cel/ml) sobre la corona de la raíz de la semilla germinada, evitando la dispersión del

inoculante. Las macetas fueron colocadas bajo invernadero a una temperatura de 15­24 ºC

(dependiendo de la leguminosa), con una humedad relativa de 45­50%.

Raleo, r iego y tutor eo.

Transcurridos 10 días después de la siembra, se procedió a dejar la planta más vigorosa por unidad

experimental (jarra). El riego se realizó cada vez que el cultivo lo requería, para esto se utilizó agua

destilada estéril y medio Somasegaran­N aplicado en la jarra inferior, para que el agua suba por

capilaridad a la planta. Cuando las plantas tuvieron 15 días (caso maní), éstas fueron sujetadas con

hilo plástico a un soporte de alambre tendido en la parte superior del invernadero.

Actividad 2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo.

22

Como en el ambiente natural (suelo) las raíces de las leguminosas interactúan con los rizobios en

presencia de otros microorganismos y en presencia del nitrógeno del suelo, las cepas previamente

evaluadas en invernadero, fueron probadas bajo condiciones de campo, en diferentes sitios de la

región donde predomina la leguminosa. La metodología seguida fue la recomendada por el CIAT

(1988).

Para fréjol, los experimentos fueron localizados en Tumbaco y Pifo (Provincia de Pichincha)

utilizando las variedades INIAP TOA 412, y la línea promisoria Canario SCC2 (del Programa de

Leguminosas del INIAP).

Los experimentos de arveja se llevaron a cabo en Cañar y Chimborazo, con la variedad Roxana. En

alfalfa, los experimentos se ejecutaron en Chimborazo, utilizando la variedad Abunda Verde. En

este último caso, las pruebas de campo se realizaron en colaboración con voluntarios del Cuerpo de

Paz. En soya, el trabajo de campo tuvo lugar en Los Ríos, usando la variedad Vinceña, y el estudio

de maní se realizó en Loja con las variedades Caramelo e INIAP 380 (del Programa de

Leguminosas, Estación Boliche­INIAP).

Manejo del exper imento

Preparación del suelo

Con la maquinaria adecuada se procedió a preparar el suelo mediante una labor de arada y dos de

rastra para luego surcarla a 0.40­0.60 cm (de acuerdo a cada leguminosa) entre surcos. Se efectuó el

trazado de las parcelas (unidades experimentales) y bloques.

Fer tilización, e inoculación de la semilla.

Antes de la siembra se procedió a fertilizar todas las parcelas con fósforo, potasio, y micronutrientes

de acuerdo al análisis de suelos y requerimientos de cada leguminosa. Se aplicó urea (46%)

únicamente en las unidades experimentales del tratamiento nitrogenado. La semilla fue inoculada al

momento de la siembra usando las cepas en turba. Las dosis fueron de 10 g de inoculante por

kilogramo de semilla (soya, fréjol, maní, arveja), y 50 g por Kg de semilla en alfalfa.

Riego y siembra, y cosecha.

Antes de la siembra se realizó un riego ligero para garantizar el establecimiento de la bacteria y

buen crecimiento de la planta. La siembra se efectuó en forma manual con el sistema de golpes a

23

cada 30 cm de distancia entre plantas. En cada sitio se depositó cuatro semillas para seleccionar 3

plántulas a los 10 días. La cosecha se realizó en forma manual al estado de maduración del cultivo.

Cada tratamiento fue colocado en fundas previamente identificadas. En alfalfa, la siembra de la

semilla inoculada se realizó a “chorro continuo” inmediatamente después de la inoculación, y la

semilla fue cubierta con una ligera capa del suelo.

Factores, tratamientos, diseño exper imental.

Los factores en estudio fueron las variedades y las cepas. Los tratamientos resultaron de la

combinación de los factores en estudio, bajo un diseño experimental de bloques completos al azar

con arreglos factoriales de acuerdo al número de variedades y cepas en cada leguminosa. La unidad

experimental estuvo constituida por parcelas (6­8 m 2 ) de siete surcos conteniendo 16­20 plantas

(dependiendo de la leguminosa). Las parcelas estuvieron separadas por un metro de distancia, y

entre bloques por 2 m. La unidad experimental neta consta de los surcos centrales de cada parcela.

Parámetros analizados.

Las variables a tomarse fueron: a) peso fresco del follaje (g/planta). Cuando el cultivo alcanzó 50%

de la floración se extrajo seis plantas tomadas al azar de los tres surcos centrales realizando un corte

en la base del tallo. b) peso seco del follaje. El mismo material indicado anteriormente fue secado

en una estufa a 70ºC durante 48 horas para luego determinar el peso seco en g/planta, c) peso seco

de nódulos después de ser mantenidos por 48 horas a 60º C, d) porcentaje de nitrógeno total. El

valor de nitrógeno se obtuvo por el método de Kjeldahl en los laboratorios del Departamento de

Suelos de la Estación Santa Catalina, e) rendimiento. Se pesó el número total de granos cosechados

en las plantas hechas un muestreo, y el dato obtenido se expresó en kg/ha.

Una variedad de cualquier leguminosa puede restringir la nodulación de determinada cepa o sero­

grupos de rizobios, lo cual determina una especificidad entre la planta y el rizobio, repercutiendo en

el proceso simbiótico. Por esta razón, se realizó pruebas de campo en fréjol y maní, que incluyan

diferentes variedades por leguminosa. Así se logró identificar cepas efectivas en fijación biológica

de nitrógeno al hacer simbiosis con variedades utilizadas por el agricultor.

Actividad 2 d. Estudio de la competitividad de las cepas por nodulación en fréjol.

En fréjol se llevó a cabo un estudio de competición de las cepas por nodulación, para conocer la

cepa de mayor agresividad en formar nódulos en la raíz de la planta, y bajo condiciones de campo.

24

La identificación de las cepas se realizó utilizando sueros pertenecientes a las cepas seleccionadas

previamente. Para esto se siguió la metodología sugerida por Somasegaran y Hoben (1994). Como

alternativa pudo haberse utilizado la reacción BOX­PCR de Versalovic et al. (1994), generando

"fingerprints" mediante electroforesis, pero la técnica utilizada en el proyecto fue la de serología,

por cuanto es una técnica más barata y sencilla que la técnica molecular.

Obtención de antígenos

Para la obtención de los antígenos, los cultivos bacterianos se hicieron crecer en LMA a 26ºC. La

pureza se verificó al final del tiempo especificado para el crecimiento (4 días). Se seleccionaron

colonias puras de las cepas y se hicieron crecer en medio líquido, hasta la concentración de 10 8

celulas/ml. La suspensión se distribuyó en pequeños viales estériles en proporciones de 2 ml para

inyecciones. A cada una de las muestras se agregó formol (1ml de solución al 1% para 100 ml de

suspensión) y se conservaron a 4º C.

Obtención de antisueros

Para la obtención de antisueros se usó una aguja de tamaño mediano (graduación 23, 0.5 mm) para

inocular en la gran vena marginal de la oreja de conejos de buen desarrollo. Las suspensiones

bacterianas fueron inoculadas de la siguiente manera: el primer día se inoculó 1 ml de suspensión

bacteriana inerte en forma subcutánea. A los 7 días se repitió el procedimiento y a los 14 días se

inoculó en forma intravenosa 1 ml de suspensión bacteriana viva. Siete días después de la última

inyección se recogió una muestra (2 ml) desde la vena de la oreja. La sangre se pasó a un tubo de

prueba con tapón de rosca estéril. Se dejó coagular la sangre a temperatura ambiente durante dos

horas, y se separó el coagulo introduciendo un aplicador de madera alrededor del mismo. Luego se

refrigeró durante toda la noche. El suero claro se decantó en un tubo de prueba evitando que las

células rojas de la sangre entren al tubo. Se determinó el título de aglutinación de la siguiente

manera: Se pipetearon 0.4 ml de antisuero patrón para pasarlos a un tubo de 16 x 125 mm

conteniendo 9.56 ml de solución salina (0.85%). Se mezclaron bien dando una dilución del

antisuero de 1/25. Se etiquetó el tubo con el número 1, y se utilizaron 10 tubos adicionales con 2.5

ml de solución salina cada uno. Los tubos fueron rotulados del 2 al 11. Usando pipetas nuevas se

prepararon diluciones hasta 1/25000. Los tubos 1 y 2 fueron conservados para usarlos

posteriormente en caso de ser necesario. Las diluciones se probaron con la cepa inoculada

(homóloga). La última dilución que presentó anticuerpos en reacción visible fue la que indicó el

título. Determinado el título, se procedió a sangrar el conejo mediante inyección cardiaca, retirando

lentamente 50 ml. La sangre se colocó en tubos de boca ancha para facilitar la separación del suero.

25

El suero se mantuvo a temperatura ambiente por una hora, y luego a 4ºC por 12 horas para la

coagulación. Por centrifugación (2000 rpm) durante 10 minutos se separó el suero del resto del

coagulo sanguíneo. El suero así obtenido fue preservado con una solución de mertiolato (0.1 ml de

una solución al 1% para cada 10 ml de suero) y bajo refrigeración.

Reconocimiento de antígenos homólogos por inmunodifusión.

Se colocaron 100 ml de una solución salina al 0.85% conteniendo azida de sodio ( 0.075%) en un

matraz Erlenmeyer de 250 ml, se agregaron 0.75 g de agar Noble y se sometió a ebullición en baño

María, para luego ser colocado en placas de Petri, para la solidificación. Se trazó el contorno de la

base de una placa Petri sobre un papel blanco. Se sacó una plantilla de 6 círculos equidistantes de

0.4 cm de diámetro en un patrón hexagonal en el centro del contorno de una placa. Un séptimo

orificio se hizo en el centro del patrón hexagonal y se pintaron los círculos. La placa Petri

(conteniendo agar) se colocó sobre la plantilla. El patrón de los círculos fue visible a través del agar.

Se cortaron los orificios dentro del agar usando un sacabocados de 0.4 cm, eliminando

cuidadosamente los tapones de agar con alfileres o cualquier otro implemento apropiado. Se colocó

una gota de agar fundido para sellar la base del orificio.

Para las reacciones de inmunodifusión, se prepararon las suspensiones de antígeno (1x10 10

células/ml). Las muestras fueron tratadas con calor por una hora a 100 °C, y dos gotas de cada

antígeno se colocaron en sus respectivos orificios. La suspensión estándar de las cepas conocidas

fue colocada en las cavidades superiores e inferiores, mientras que la de las desconocidas fue

colocada en las cuatro cavidades laterales. La cavidad central recibió el antisuero sin dilución. Las

cavidades fueron llenadas cuidadosamente hasta el tope, usando pipetas Pasteur de extremidades

finas y se volvieron a colocar las tapas de las cajas. La base de la placa de difusión fue marcada con

la identidad de cada antígeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente, en un ambiente

saturado de humedad, para luego realizar observaciones después de 24 y 48 horas.

Evaluación de la competencia entre cepas.

Determinación de la población de rhizobios nativos en el suelo.

La determinación de la población de Rhizobium nativo del suelo se realizó siguiendo la metodología sugerida por el CIAT (5). Para esto, se utilizó fundas plásticas de crecimiento conteniendo 20 ml de

solución nutritiva, por cada funda. La semilla de fréjol (variedad Yunguilla) se esterilizó usando

hipoclorito al 5% durante 5 minutos, para luego ser lavadas en agua estéril. Las semillas fueron

26

transferidas a placas con agar para la germinación, y una vez germinadas, fueron transferidas a las

fundas de crecimiento. Para la inoculación del suelo, éste fue diluido hasta 10 ­8 . Se inoculó el suelo

en cada una de las fundas con 4 repeticiones, incluyéndose fundas de crecimiento correspondientes

al testigo o control. A las tres semanas de crecimiento se cosecharon las plantas para proceder al

registro de nódulos, con presencia (+) o ausencia (­). Utilizando las tablas estadísticas de Fisher, se

procedió a calcular la población rhizobiana del suelo.

Pr eparación del inoculante

Para la preparación del inoculante se tomaron colonias puras de las cepas UMR (1899, 1478 y

1481), para sembrarse en medio líquido levadura manitol. Cuando el crecimiento celular en los 3

diferentes medios fue suficiente (10 9 cel/ml), las cepas con una misma concentración celular fueron

mezcladas e inyectadas asépticamente a fundas auto clavadas estériles de polipropileno conteniendo

turba, de acuerdo a los tratamientos previamente establecidos. Los inoculantes fueron incubados a

25ºC durante una semana. La calidad del inoculante se evaluó mediante recuento de células en

placa.

Estudio de campo

El experimento de campo se realizó en un terreno de 500 m 2 localizado en Pifo (Provincia de

Pichincha), con un historial de potrero, sin uso de leguminosas, y deficiente en nitrógeno. El

experimento tuvo un diseño de bloques completos al azar con siete tratamientos y 4 repeticiones,

utilizándose la variedad Yunguilla, tipo arbustiva, precoz y probada en experimentos anteriores de

fijación biológica de nitrógeno. La inoculación de la bacteria se hizo al momento de la siembra de la

semilla. Se utilizaron además dos tratamientos de control: uno sin nitrógeno y sin inocular, y uno

con nitrógeno sin inocular.

27

Cuadro 1. Tratamientos utilizados en el estudio de campo, para la evaluación de la competitividad

entre cepas, asociadas al cultivo de fréjol.

T1 UMR 1899

T2 UMR 1481

T3 UMR 1478

T4 UMR 1899 X UMR 1478

T5 UMR 1899 X UMR 1481

T6 UMR 1478 X UMR 1481

T7 UMR 1899 X UMR 1478 X UMR 1481

T8 Control –N

T9 Control +N

Prácticas cultur ales y manejo del cultivo.

Se prepararon surcos a una distancia de 60 cm. y se dividieron en 36 bloques de 2,40 m x 2,40 m

cada uno. Los bloques fueron marcados claramente con sus respectivos tratamientos, para

posteriormente dar un riego antes de la siembra. Se sembraron tres semillas por golpe, y a distancias

de 30 cm, y sembrándose primeramente los tratamientos no inoculados (­N y +N). A los 15 días de

la siembra se realizó un raleo, dejando una sola planta por cada golpe.

Muestreo.

A la época de la floración, se cosecharon 3 plantas por bloque, para luego proceder a la extracción

de 50 nódulos. Estos fueron sometidos a un análisis de inmunodifusión para identificar las cepas de Rhizobium que habían colonizado y formado nódulos en las plantas de fréjol. Conociendo la capacidad competitiva de las cepas conjuntamente con la capacidad fijadora de nitrógeno, es posible

la elaboración de inoculantes.

Actividad 3 a. Recolección de turbas

Se consideró como base a los estudios de Constante (1993), y de Estévez y Constante (1993),

incluyéndose además otras turbas y materiales que presentaron propiedades que permitieron

considerarlas como acarreadores apropiados de la bacteria. Las turbas recolectadas fueron secadas,

molidas, tamizadas en una malla de 180 µm y posteriormente empacadas en fundas de polietileno

de baja densidad y humedecidas hasta el 50% de su capacidad de absorción.

28

Actividad 3 b. Análisis físico y químico de los soportes.

Se realizó la caracterización física y química de los soportes: 1) turba de Chimborazo, 2) turba de

Lloa, 3) turba de Alaska, 4) capa rosa, 5) ceniza, 6) zeolita, y 7) sustrato a base de vaina seca

molida de fréjol mezclado con compost. Se dio énfasis al tamaño de las partículas y al contenido de

materiales no deseables que dificultan el normal procesamiento de extracción, secado y molienda

del material. También se determinó la capacidad de cada soporte en la retención de humedad para lo

cual se empleó la técnica de rutina usada en el Laboratorio de Suelos de la Estación Santa Catalina.

La caracterización química incluyó: contenido de amonio, nitrato, carbono, potasio intercambiable,

porcentaje de materia orgánica, fósforo, potasio y pH. Para la determinación de pH se prepararon

suspensiones en una relación 2:5 de la muestra en agua destilada y las medidas se registraron con la

ayuda de un pHmetro. El pH de los soportes se ajustó a 6.5­7.0 con CaCO3. Los análisis de P, K,

Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn, B fueron realizados por el método de Olsen modificado a excepción del

boro en donde se uso curcumina.

La determinación de la población microbiana se la realizó únicamente en turbas. Para esto, se

utilizó 50 gramos de turba y colocados en 450 ml de agua destilada estéril, para ser agitado

vigorosamente por 30 minutos. A continuación se procedió a realizar diluciones hasta 10 8 . De las

diluciones 10 3 hasta 10 6 se tomaron 100 ul y colocados en cajas Petri conteniendo medios de

cultivos apropiados para bacterias, hongos y actinomicetes. Los platos Petri fueron incubados a 25­

30ºC por cinco días. Posteriormente se determinó las poblaciones de bacterias, hongos y

actinomicetes.

Actividad 3 c. Interacción rizobio­turba (portador).

Se ha comprobado en experimentos llevados a cabo en otros países, que una cepa puede sobrevivir

bien en una turba y no en otra, u otro sustrato. Se consideró como parámetros, el crecimiento

(células/gramo de turba) y la sobrevivencia de la bacteria en determinados intervalos de tiempo. La

técnica utilizada estuvo basada en el procedimiento descrito por Gómez et al. (1997). Los

portadores (50 g) de cada uno fueron impregnados con 25 ml de suspensión bacteriana, a una

concentración de 10 9 ufc/ ml. El material inoculado se incubó por ocho días a 26 ºC de temperatura.

cada semana se homogenizó removiendo las fundas.

29

Actividad 3 d. Evaluación de materiales alternativos

Los soportes fueron inoculados después de la esterilización al vapor. La preparación del inoculante,

y la enumeración de los rhizobios se realiza siguiendo la metodología descrita por Chao y

Alexander (1984), Graham­Weiss et al. (1987), y la de Kostov y Lynch (1998). El estudio fue

llevado a cabo en el Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina.

Actividad 4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.

Con la colaboración de la Comisión Ecuatoriana de Energía Atómica (CEEA) se está ejecutando un

experimento que permita determinar el efecto de los métodos de esterilización de la turba y otros

soportes, en la sobrevivencia de los rizobios durante el proceso de almacenaje del inoculante. Sé

está evaluando los métodos de esterilización al vapor usando autoclave (15 psi durante 1 hora) y el

de irradiación. La metodología a seguirse fue la sugerida por Date y Roughley (1977). El material

plástico de empaque del inoculante también está siendo evaluado en éste estudio, para saber si el

material afecta o no la sobrevivencia de la bacteria durante el almacenamiento del inoculante.

Actividad 5.1 Difusión de resultados y productos generados por el proyecto.

La difusión de los resultados se ha dado principalmente a través de: 1) días de campo en fincas de

agricultores donde las leguminosas tienen su importancia, 2) trípticos, y 3) seminarios o talleres a

nivel nacional e internacional. Estos se describen en: “Productos del proyecto”. La difusión de los

resultados y productos se ha realizado siguiendo la metodología utilizada por la Fundación GAIA.

Es necesario enfatizar que la difusión se ha realizado conjuntamente con ciertos resultados

correspondientes al Proyecto Comminandes. Así por ejemplo, el uso de inoculantes de Rhizobium y el uso del compostaje en arveja y alfalfa en las Provincias del Cañar, Chimborazo y Pichincha. Se

ha elaborado adicionalmente documentos del proceso y uso del compost en leguminosas

conjuntamente con inoculantes de Rhizobium.

Actividad 6.1 Institucionalizar un sistema de control de calidad de los inoculantes.

Actualmente se apoya la institucionalización de un sistema de control de calidad de los inoculantes

a través del laboratorio destinado a su producción. El sistema de control de calidad está basado en

un programa que considera los siguientes factores:

30

a) Elaboración de antisueros para las cepas inoculantes. El uso de antisueros permite evaluar

periódicamente la pureza de las cepas. Se está usando la técnica serológica (ELISA) para la

identificación de las cepas.

b) Crecimientos de la bacteria en diferentes y apropiados medios de cultivo, y a través de

reacciones de autenticación (ej. tinción gram), y chequeos frecuentes del pH del medio de cultivo.

De esta manera se controla el crecimiento de contaminantes como otras bacterias u hongos, que

generalmente son rápidos en crecimiento generando acidez (pH bajo) del medio.

c) Viabilidad del producto. Antes de colocar en el mercado, la viabilidad del producto está siendo

analizada a través del número de células viables de la cepa específica en inoculante fresco.

d) El producto debidamente procesado y empaquetado lleva fecha de expiración y las

recomendaciones necesarias para el agricultor, con énfasis en el tipo de Rhizobium, su correspondiente leguminosa, la población bacteriana (células/gramo), y dosis de aplicación. El

producto listo para su distribución, es almacenado bajo refrigeración (5° C).

8. RESULTADOS OBTENIDOS.

Actividad 1a. Solicitud, recolección y caracterización de cepas.

El INIAP dispone de un banco germoplásmico de Rhizobium para fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. Este material genético esta listo para la elaboración de inoculantes, y para el intercambio con

instituciones de investigación en fijación biológica de nitrógeno, nacionales e internacionales.

Los resultados de la caracterización genotípica y genética de las cepas asociadas al cultivo de fréjol

se encuentran detallados en la publicación de Bernal y Graham (2001). A continuación se describe

los resultados de la caracterización fenotípica y genética de las cepas asociadas al cultivo del maní.

El dendograma (fig.8.1), muestra la relación fenotípica de los 93 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní. El dendograma generado muestra la presencia de tres grupos bien

diferenciados de los cuales se seleccionaron 29 aislamientos representativos (Cuadro 8.1). Del

grupo uno fueron seleccionados 13, del grupo dos 7, y del grupo tres 9 aislamientos.

31

Cuadro 8.1. Aislamientos de Bradyrhizobium sp. recolectados en las provincias de Manabí y Loja representativos de los grupos generados por el análisis fenotípico.

No. Código de amplificación Cepa Origen 1 1 ECUM­L102 Loja 2 2 ECUM­P5 Portoviejo 3 3 ECUM­P7­2 Portoviejo 4 4 ECUM­P2­3 Portoviejo 5 5 ECUM­P22­2 Portoviejo 6 6 ECUM­P20­1 Portoviejo 7 7 ECUM­L27 Loja 8 8 ECUM­L124 Loja 9 9 ECUM­P11 Portoviejo 10 11 ECUM­P13­2 Portoviejo 11 12 ECUM­P13­4 Portoviejo 12 13 ECUM­L53 Loja 13 14 ECUM­P12 Portoviejo 14 15 ECUM­L23 Loja 15 16 ECUM­L66 Loja 16 17 ECUM­L51 Loja 17 18 ECUM­P15­1 Portoviejo 18 20 ECUM­L83 Loja 19 21 ECUM­L82 Loja 20 22 ECUM­P17 Portoviejo 21 23 ECUM­L85 Loja 22 24 ECUM­L91 Loja 23 25 ECUM­L62 Loja 24 26 UMR 6011 Universidad de Minessota 25 28 CIAT 3550 Colombia 26 29 CIAT 5013 Colombia 27 30 CIAT 14 Colombia 28 31 ECUM­L105 Loja 29 32 ECUM­P10­1 Portoviejo

32

Coefficient 0.29 0.47 0.64 0.82 1.00

L81 L91 L115 3080 P94 P15­1 L61 CIAT3825 L93 P6­1 P3L102 CIAT3555 CIAT3551 P10­3 L113 L36 P91 L42 L112 L45 P93 P12 L22 L96 P16­3 P21 L103 L125 L101 P8­5 L104 P82 L52 P2­1 L94 L15 P19 L116 P13­1 CIAT865 CIAT3548 P71 L55 L76 P1P16­1 L126 L95 P16­2 P13­3 P20­1 3077 CIAT14 P20 P92 CIAT6 P6­2 CIAT3824 P14 CIAT3550 P2­2 L51 CIAT5013 P11 L62 6011 P86 L124 L74 P84 L105 L82 3081 3079 P17 P2­3 P13­2 L83 L85 CIAT866 L53 L54 L63 L66 P10­2 L23 L27 P5P10­1 P13­4 P72 P22­2

3

1

2

Figura 8.1 Dendograma en base a la caracterización fenotípica de la colección de 93

aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní en el

Ecuador

33

Caracter ización molecular .

El patrón de bandas (fingerprint) de 29 aislamientos (Cuadro 8.1) representativos de los grupos de

la caracterización fenotípica, demostró una gran variedad de perfiles lo cuál sugiere que desde el

punto de vista del análisis general del genoma de cada aislamiento, las cepas de la bacteria asociada

al cultivo de maní en el Ecuador, son muy diversas. No se encontraron patrones de bandas

idénticos, y tampoco fue posible establecer una asociación entre los patrones (fingerprints) y lugar

de origen del aislamiento (Figura 8.2 y 8.3).

Figura 8.2. Dendrograma mostrando la relación de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al maní. Los aislamientos fueron seleccionados de los grupos generados en el dendograma del análisis fenotípico. El método usado fue ERIC­PCR.

34

Figura 8.3. Dendrograma mostrando la relación de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní. Los aislamientos fueron seleccionados de los grupos representativos del análisis fenotípico. El método utilizado fue REP­PCR.

35

Análisis RFLP

De la amplificación de la región intergénica 16S­23S rRNA de los 29 aislamientos, se obtuvieron

dos grupos que se diferenciaron por el tamaño del producto PCR. Los tamaños fueron de 950 y

1200 (Cuadro 8.2) 12 aislamientos no amplificaron y no se prosiguió con su análisis

Figura 8.2. Perfiles de la región intergénica 16S­23S RNAr de 29 aislamientos de “Bradyrhizobium”.

Cuadro 8.2. Grupos diferenciados por el tamaño de pares de bases obtenidos del producto PCR de la región intergénica 16S­23S rRNA.

No. CEPA Origen Tamaño de banda (bp) 1 ECUM­L102 Loja 950 2 ECUM­P5 Portoviejo 1200 3 ECUM­P2­3 Portoviejo 1200 4 ECUM­P20­1 Portoviejo 950 5 ECUM­L27 Loja 1200 6 ECUM­L124 Loja 950 7 ECUM­P13­4 Portoviejo 950 8 ECUM­P12 Portoviejo 950 9 ECUM­L23 Loja 1200 10 ECUM­L51 Loja 950 11 ECUM­L83 Loja 950 12 ECUM­L91 Loja 950 13 UMR 6011 U. de Minnesota 950 14 CIAT 3550 Colombia 950 15 CIAT 5013 Colombia 950 16 CIAT 14 Colombia 950 17 ECUM­L105 Loja 950

36

El producto de la amplificación de los 17 aislamientos fue sometido al análisis RFLP con enzimas

de restricción. A cada perfil resultante de la incubación con una endonucleasa se le asignó una letra

distintiva (cuadros 8.3 y 8.4), y a partir de esa matriz se compararon los distintos aislamientos. Se

obtuvieron 10 grupos (cuadro 8.5), algunos de los cuales tuvieron mayor representación que otros;

así por ejemplo el grupo 1 comprendió a los aislamientos 1, 10 y 17 mientras que el grupo 10 comprendió cinco aislamientos: 6,11,14,15,16.

El análisis desde el punto de vista de los sitios de aislamiento indica que el grupo 1 tiene una buena representación en la colección de aislamientos de Loja ya que tres aislamientos comparten el grupo

1. Asimismo, el grupo 10 con dos aislamientos aparece como abundante en Loja. Examinando los asilamientos de Portoviejo, se observa que el grupo 6 tiene una mayor representación en la

colección de aislamientos analizada.

Cuadro 8.3. RFLP de la región intergénica 16S­23S RNAr del producto de la amplificación de 17 aislamientos de Bradyrhizobium, asociados al cultivo de maní.

No. CEPA Alu I Hae III

Taq I Msp I Rsa 1

1 ECUM­L102 A A A A A 2 ECUM­P5 B B A B B 3 ECUM­P2­3 C C B C B 4 ECUM­P20­1 D A B D C 5 ECUM­L27 B D C E D 6 ECUM­L124 D E D D C 7 ECUM­P13­4 D F ­ F ­ 8 ECUM­P12 D F E G C 9 ECUM­L23 E D E H E 10 ECUM­L51 A A E A A 11 ECUM­L83 D E E G C 12 ECUM­L91 D G F D F 13 UMR 6011 D A D I G 14 CIAT3550 D F D D C 15 CIAT5013 D E D ­ H 16 CIAT14 D E D D H 17 ECUM­L105 E A D A A

37

Cuadro 8.4. Matriz obtenida a partir de perfiles de la incubación con endonucleasas de 17 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní.

Enzimas de Restricción Alu I Hae III Taq I Msp I Rsa 1

A = 1­10­17 A = 1­4­10­13­17 A = 1­2 A = 1­10­17 A = 1­10­17 B = 2­5 B = 2 B = 3­4 B = 2 B = 2­3 C = 6 C = 3 C = 5 C = 3 C = 4­6­8­11­14 D = 4­6­7­8­11­12­

13­14­15­16 D = 5­9 D = 6­13­14­15­16­

17 D = 4­6­12­14­16 D = 5

E = 9 E = 6­11­15­16 E = 8­9­10­11 E = 5 E = 9 F = 7­8­14 F = 12 F = 7 F = 12 G = 12 G = 8­11 G = 13

H = 9 H = 15­16 I = 13

Cuadro 8.5. Grupos obtenidos a partir de la incubación con endonucleasas de 17 aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní.

Grupo Cepas Descr ipción 1 1­10­17 ECUM­L102­ ECUM­L51­ ECUM­L105 2 2 ECUM­P5 3 3 ECUM­P2­3 4 4 ECUM­P20­1 5 5 ECUM­L27 6 7­8 ECUM­P13­4­ ECUM­P12 7 9 ECUM­L23 8 12 ECUM­L91 9 13 UMR 6011 10 6­11­14­15­16 ECUM­L124­ ECUM­L83­CIAT 3550­ CIAT 5013­

CIAT 14

Los resultados del análisis genético de los aislamientos de “Bradyrhizobium” asociados al cultivo de maní, y colectados en las Provincias de Manabí y Loja, muestran que la población del

microsimbionte es muy heterogénea dentro de 2 grupos de bacterias de crecimiento lento y

crecimiento rápido. La heterogeneidad se encuentra a nivel de sitio de aislamiento, observando que

las situaciones de similitud se encuentran entre aislamientos provenientes de sitios geográficamente

distanciados entre sí.

Actividad 1b. Almacenamiento de las cepas.

El banco germoplásmico del microsimbionte perteneciente a los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa,

soya y maní, se encuentra almacenado en la sección de Microbiología del DNPV, Estación Santa

38

Catalina. Las cepas están almacenadas bajo liofilización y tubos de vidrios con medio de cultivo, y

a una temperatura de 4º C. Las cepas liofilizadas podrán ser mantenidas en ese estado por dos años,

y las cepas en tubos de vidrio con medio de cultivo podrán ser mantenidas por cuatro meses.

Actividad 2 a. Estudio de la compatibilidad genética entre Rhizobium y fréjol.

La estimación de la diversidad genética fue mayor cuando se usaron los cultivares locales de fréjol.

Las figuras 8.5 y 8.6 muestran los perfiles Box A1R­PCR de aislamientos de los suelos de

Cañicapac y Mater. El agrupamiento es evidente de acuerdo al hospedero usado, lo cual demuestra

la compatibilidad genética (especificidad) entre el Rhizobium colectado en suelos ecuatorianos y sus respectivos hospederos locales.

39

Fig 8.5. Dendograma Box A1R­PCR mostrando los aislamientos de fréjol (variedad local Bolon B1) y la variedad introducida (I) sembrados en suelo de Cañicapac C. Se incluyen las cepas referencias: UMR 6917, UMR1632, UMR1899, y UMR6815.

40

Fig. 8.6 Dendograma Box A1R­PCR mostrando los aislamientos de fréjol (variedad local Machete MA), y la variedad introducida Imbabello (I), sembradas en suelo de Mater (M). Se incluyen las cepas referencia: UMR 6917, UMR 1632, UMR 1899, y UMR 6815.

41

Actividad 2 b. Estimación del potencial fijador de nitrógeno de las cepas de Rhizobium en invernadero.

La estimación de la capacidad de fijación de nitrógeno en invernadero, de las cepas

correspondientes a los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní, se determina una vez realizado

los análisis estadísticos de cada una de las variables analizadas (ver apéndices).

Cuadro 8.6. Cepas seleccionadas por cada leguminosa con relación a la capacidad de fijación de

nitrógeno bajo condiciones de invernadero. Las variables consideradas para la selección fueron:

color de la planta, número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso

seco (g/planta) de la parte aérea de la planta.

ARVEJA

No. CEPA ORIGEN OBSEVACIONES 1. ECUA­M19 Zhoray Las cepas fueron recolectadas en las 2. ECUA­P1 Pindiling Provincias de Cañar y Azuay. 3. ECUA­S5 Cojitambo 4. ECUA­I1 Ingapirca 5. ECUA­M39 Pindiling 6. ECUA­M52 Vaqueria 7. ECUA­M35 Pindiling 8. ECUA­Z1 Zhoray 9. ECUA­M53 Vaqueria 10. ECUA­V1 Verde Loma 11. ECUA­M38 Cojitambo 12. ECUA­M51 Vaqueria 13. ECUA­M11C Zhoray 14. ECUA­P3 Pindiling 15. ECUA­JC1 Cojitambo 16. ECUA­M48 Verde Loma 17. ECUA­S3 Zhoray 18. ECUA­Z2 Zhoray

42

MANI

No. CEPA ORIGEN OBSEVACIONES 1. ECUM­P5 Portoviejo Las cepas fueron recolectadas en 2. ECUM­P16­1 Portoviejo localidades de las Provincias de 3. ECUM­L126 Loja Manabí y Loja 4. ECUM­L15 Loja 5. ECUM­P1 Portoviejo 6. UMR 3081 Universidad de Minnesota 7. ECUM­P10­3 Portoviejo 8. ECUM­L105 Loja 9. ECUM­P17 Portoviejo 10. ECUM­P6­1 Portoviejo 11. ECUM­P13­1 Portoviejo 12. ECUM­P2­3 Portoviejo 13. ECUM­P10­1 Portoviejo 14. ECUM­P13­4 Portoviejo 15. ECUM­P9­1 Portoviejo 16. ECUM­L94 Loja 17. ECUM­P16­3 Portoviejo 18. ECUM­P9­3 Portoviejo 19. ECUM­P7­1 Portoviejo 20. ECUM­L76 Loja 21. ECUM­L104 Loja 22. ECUM­L115 Loja 23. ECUM­P7­2 Portoviejo 24. ECUM­P21 Portoviejo 25. ECUM­P11 Portoviejo 26. UMR 6011 Universidad de Minnesota 27. ECUM­P3 Portoviejo 28. ECUM­L74 Loja 29. ECUM­P22­2 Portoviejo 30. ECUM­P2­1 Portoviejo 31. ECUM­L81 Loja 32. ECUM­L52 Loja 33. ECUM­L112 Loja 34. ECUM­P13­3 Portoviejo 35. ECUM­P8­6 Portoviejo 36. ECUM­L63 Loja 37. ECUM­L45 Loja 38. UMR 3080 Universidad de Minnesota 39. ECUM­L36 Loja 40. ECUM­P15­1 Portoviejo 41. ECUM­L102 Loja 42. UMR 3079 Universidad de Minnesota

43

SOYA

No. CEPA 0RIGEN OBSERVACIONES 1. CIAT 51 Colombia 2. 6001 Universidad de Minnesota 3. ECUS­005 Quevedo Provincia de Los Ríos 4. ECUS­10S3 Quevedo 5. TAL 571 Niftal 6. ECUS1­SJ Quevedo 7. ECUS­P1 Quevedo 8. ECUS­001 Quevedo

FREJOL

Las cepas para fréjol fueron probadas directamente en campo ya que los estudios de invernadero se

realizaron en la investigación de Bernal y Graham (2001).

ALFALFA

Las cepas fueron probadas directamente en campo. El estudio de selección en invernadero se realizó

en 1984 como parte de un estudio colaborativo entre el INIAP y la Facultad de Ciencias Agrícolas.

Los ensayos de campo se realizaron con la colaboración del Cuerpo de Paz.

Actividad 2 c. Estimación del potencial fijador de nitrógeno bajo condiciones de campo

Cuadro 8.7. Cepas seleccionadas por cada leguminosa con relación a la capacidad de fijación de

nitrógeno, bajo condiciones de campo. Las variables consideradas para la evaluación fueron:

número y peso seco de nódulos (mg/100 nódulos), peso fresco (g/planta) y peso seco (g/planta) de

la parte aérea de la planta, y porcentaje de nitrógeno.

ARVEJA

No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. ECUA­ I1 Ingapirca Aislamientos del banco base del Dr. Venancio Arana

(Universidad Central del Ecuador­Facultad de Ciencias Agrícolas).

2. ECUA­Z2 Zhoray 3. ECUA­ P3 Pindiling 4. ECUA­M53 Vaqueria 5. ECUA­M35 Pindiling 6. ECUA­Z1 Zhoray 7. *CL 05 U. Central Utilizada como control. 8. *CL 14 U. Central Control 9. *CL 09 U. Central Control 10. *CA 34L U. Central Control

44

MANI

No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. ECUM­L45 Loja 2. ECUM­L81 Loja 3. ECUM­P8­6 Portoviejo 4. ECUM­L102 Loja

SOYA

No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. CIAT 51 Colombia 2. 6001 U. de Minnesota 3. ECUS­001 Quevedo 4. ECUS1­SJ Quevedo

FREJOL

No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES

1. UMR 1478 U. de Minnesota 2. UMR 1481 U. de Minnesota 3. UMR 1899 U. de Minnesota

ALFALFA

No. CEPA ORIGEN OBSERVACIONES 1. 6008 U. de Minnesota Las pruebas se realizaron en la provincia de

Chimborazo con la colaboración del Cuerpo de Paz. 2. TAL 380 Niftal

Actividad 2 d. Estudio de la competitividad de cepas asociadas al cultivo de fréjol.

Análisis antigénico de las cepas de Rhizobium etli (UMR 1478 y 1481) y de la cepa de Rhizobium

tropici (1899) mediante inmunodifusión.

Determinación del título de aglutinación.

La determinación del título de aglutinación se muestra en el cuadro 8.8. Se observa que todos los

sueros de las cepas muestran valores elevados en cuanto al título de aglutinación. Estos resultados

indican que los sueros obtenidos pueden ser utilizados para realizar las reacciones de

inmunodifusión.

45

Cuadro 8.8. Titulación

CEPA DILUCION

1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 25600

UMR1899(a) +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + + +

UMR1899(b) +++ +++ +++ +++ +++ ++ + + + + +

UMR1481(a) +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ + + + ­

UMR1481(b) +++ +++ +++ +++ ++ ++ + + + + ­

UMR1478(a) +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + + + +

UMR1478(b) +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ + + ­ ­

Prueba de reacción cruzada.

Esta prueba fue utilizada para verificar la existencia de reacción cruzada entre cepas. Se utilizó la

misma técnica utilizada en la titulación. Los sueros pertenecientes a cada una de las cepas fueron

probados contra antígenos de las otras cepas. Se observó que la cepa de Rhizobium tropici (UMR

1899) reaccionó con todos los sueros utilizados, mientras que las cepas de Rhizobium etli (UMR

1478 y 1481) reaccionaron únicamente con sus correspondientes sueros.

Cuadro 8.9. Número Más Probable (NMP) de Rhizobium en el suelo.

Suelo de Pifo

Dilución R1 R2 R3 R4

10 2 + + + + 4

10 3 + + + ­ 3

10 4 + ­ ­ ­ 1

10 5 ­ ­ ­ + 1

10 6 ­ ­ ­ + 1

10 7 ­ ­ ­ ­ 0

10 8 ­ ­ ­ ­ 0

Testigo ­ ­ ­ ­ 0

Total 10

Según la tabla de número más probable (NMP), y considerando 6 diluciones (S=6), los números de

rizobios/ml de la dilución 10 2 son de 5.8 x 10 1 . De acuerdo con la fórmula: NMP= m x d / v x n

46

Donde: m= número más probable (por ml) en la primera dilución

d= dilución de la primera dilución considerada

v= volumen inoculado (1ml);

n= volumen o peso del suelo

Por lo tanto, para el suelo de esta parcela en Pifo, el promedio y desviación estándar son iguales a

5.8 x 10 2 células de Rhizobium por gramo de suelo. El bajo contenido de células de Rhizobium en la parcela utilizada indica que el suelo es apropiado para realizar estudios de competitividad.

Evaluación de las relaciones de competitividad entre cepas.­

Esta etapa de la investigación se encuentra en proceso de evaluación. Los nódulos colectados de

cada tratamiento fueron sembrados y purificados en levadura manitol agar (LMA) y posteriormente

serán sometidos al análisis de inmunodifusión. Este proceso utiliza las cepas UMR 1478

(Rhizobium etli), UMR 1481 (R. etli), y la UMR 1899 (R. tropici).

Actividad 3 a. Recolección de los soportes

Siete soportes recolectados y procesados se encuentran almacenados en la bodega del Departamento

de Protección Vegetal, Estación Santa Catalina del INIAP.

Actividad 3 b. Análisis físico y químico de los soportes.

La mayoría de soportes utilizados contuvieron un alto porcentaje de materia orgánica, con

excepción de la zeolita que es netamente mineral. El pH de cada material varió de ligeramente ácido

a alcalino, lo que determinó la cantidad y el neutralizante a utilizar (Cuadro 8.10).

47

Cuadro 8.10. Análisis de los materiales utilizados en la preparación de soportes para inoculantes.

Cutuglagua ­ Pichincha 2003.

Análisis C. Rosa Ceniza Zeolita T. Chimb T. LLoa Compost T. Alaska

pH 4.2 Ac 8.8Al 5.1Ac 5.5LAc 6.3LAc 7.7 LAl 6.5LAc

NH4(ppm) 69.00 A 44.00M 72.00A 166.00A 172.00A 90.00A 42.00M

P (ppm) 63.00 A 183.00A 10.00M 36.00A 14.00M 160.00A 5.00B

K(meq/100ml) 0.14B 0.88A 0.20M 0.41ª 0.62A 3.60A 0.77A

M.O. % 16.80 A 19.80A 0.60 11.20ª 9.40A 9.90A 44.10A

Bases(meq/100ml) 22.89 24.50 15.11 18.94 18.22 27.90 14.47

C/N ** 29.93 3.53 19.75 11.84 11.30 **

Interpretación

pH Elementos

Ac = Ácido N= Neutro

Lac = Liger. Ácido LAl = Lige. Alcalino

PN = Prácticamente neutro Al = Alcalino

B = Bajo

M = Medio

A = Alto ** No se realizó el análisis.

Análisis biológico de las turbas.

El análisis biológico de las turbas no mostró diferencias significativas con relación a poblaciones

microbianas. Como promedio las turbas presentaron poblaciones de 1 x 10 4 bacterias /g, 1 x 10 5

actinomicetes/g, y 2 x10 3 hongos/g de turba. Es necesario indicar la presencia de mayor número de

actinomicetes y la presencia de hongos benéficos como es el caso de Trichoderma. Esto permite sugerir el uso de las turbas como inoculante microbiano en la preparación de compost. Dentro del

grupo de los actinomicetes, bacterias y hongos del suelo se encuentran especies solobilizadores de

fósforo y también especies antagónicas a patógenos del suelo, que podrían mejorar la calidad y

eficiencia de un compost.

Actividad 3 c. Interacción rizobio­portador.

Número de r izobios en cada soporte.

Los inoculantes preparados con la turba proveniente de la Provincia del Chimborazo dieron un

promedio de 7.50x10 8 ufc/g de inoculante a los 120 días (cuadro 8.11). La turba de Alaska 3.41x10 8

ufc/g de inoculante. El soporte a base de ceniza 1.77x10 8 ufc/g de inoculante fueron los que

48

presentaron mayor supervivencia después de 120 días de almacenamiento a 4ºC. El compost

presentó una concentración de 1.10x10 8 ufc/g. Los sustratos que no cumplieron con la

concentración estándar exigida (1x10 8 ) fueron: la capa rosa, zeolita, la turba de Lloa, y el soporte a

base de vaina de fréjol con materia orgánica.

Evaluación de mater iales alternativos como soporte de la bacter ia, hasta los 120 días.

Cuadro 8.11. Datos reales para unidades formadoras de colonias por gramo de inoculante en la

evaluación de sustratos como alternativas para portadores.

SUSTRATOS (S) 8 días

ufc/g ino

15 días

ufc/g ino

30 días

Ufc/g ino

60 días

Ufc/g ino

90 días

ufc/g ino

120 días

ufc/g ino

1. Capa rosa

2. Ceniza

3. Zeolita

4. T Chimborazo

5. T. Lloa

6. Compost

7. Turba alaska

8. Vaina de fréjol

1.43x10 8 bc

6.06x10 8 ab

3.41x10 8 ab

1.63x10 9 a

4.01x10 6 d

4.79x10 8 ab

1.41x10 8 bc

6.35x10 7 c

1.05x10 8 abc

2.60x10 8 abc

2.02x10 8 abc

1.16x10 9 a

3.39x10 7 c

1.14x10 9 a

4.44x10 8 ab

3.98x10 7 bc

1.97x10 8 bc

6.92x10 8 ab

1.03x10 8 c

1.94x10 9 a

6.84x10 7 c

5.58x10 8 ab

2.44x10 8 bc

3.72x10 6 d

1.21x10 8 abc

3.63x10 8 ab

7.03x10 7 bc

1.09x10 9 a

2.57x10 7 c

2.38x10 8 abc

8.28x10 8 ab

1.33x10 6 d

1.20x10 8 bc

2.70x10 8 ab

8.97x10 7 bc

1.10x10 9 a

2.34x10 7 c

2.24x10 8 ab

6.34x10 8 ab

0.00 d

5.43x10 7 cd

1.77x10 8 abc

4.01x10 7 cd

7.50x10 8 a

1.06x10 7 d

1.00x10 8 bc

3.41x10 8 ab

0.00 e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 50 100 150

Días

Log (x+1) u

fc/g ino

s1 Capa rosa s2 Ceniza s3 Zeolita s4 T. Chimborazo s5 T. Lloa Compost s7 Turba alaska s8 Vaina de fréjol

Figura 8.7. Log ufc/ g de inoculante para 8, 15, 30, 60, 90, 120 en el experimento evaluación de

sustratos como alternativa de portadores.

49

Actividad 4 a. Evaluación de la esterilización de los portadores.

Este estudio no se realizó dentro del plazo establecido del proyecto, por falta de tiempo, pero podría

llevarse a cabo en un período de ampliación del proyecto. Para esto se ha buscado la colaboración

de la Comisión Ecuatoriana de Energía Atómica, quines disponen de una fuente radioactiva la

misma que servirá como herramienta en la metodología de esterilización de los portadores. El otro

método constituye la esterilización al vapor utilizando un autoclave del laboratorio del

Departamento de Protección Vegetal.

Se compararán los dos métodos de esterilización conociéndose cual de ellos es el mejor en el

mantenimiento de la viabilidad de la bacteria Rhizobium, el mismo que será utilizado para la preparación de los inoculantes en la leguminosas en estudio.

Actividad 5.1 Difusión de los resultados y el uso de los productos generados por el proyecto.

En el caso de arveja y alfalfa, las actividades han sido constantemente transmitidas a los

agricultores de la comunidad, a través de la radio “AS la radio” en Chaupiloma­Tabacundo

(Pichincha), y a través de la radio Ingapirca en la comunidad de Virgen de la Nube (Cañar). Estas

actividades están siendo conducidas con la colaboración directa de la Fundación GAIA, la cual

participa también como colaboradora del Proyecto Comminandes (anexo 2).

Las actividades de difusión incluyen a) información general del proyecto, b) información acerca de

la importancia de los inoculantes de Rhizobium y del compost como bio­fertilizantes y mejoradores del suelo, y c) entrevistas con expertos en agricultura.

Se ha iniciado un programa de radio denominado “Pakarina de Los Andes” perteneciente a la

emisora “AS la Radio” de Tabacundo, el mismo que es producido y dirigido por gente de la

localidad. El programa enfatiza en temas relacionados con la importancia de las leguminosas, los

inoculantes, y el uso del compost, manejo del suelo, y agricultura orgánica. Complementariamente

se incluyen aspectos relacionados con la revalorización de las prácticas de agricultura ancestral

como el uso de leguminosas, la elaboración del compost y aplicaciones. Como evidencia de estos

eventos radiales, se guardan las grabaciones de los temas presentados semanalmente, especialmente

en la radio “AS la radio” de Tabacundo. Además las actividades de ambos proyectos han sido

50

cubiertas por los diarios “Heraldo” y “El Tiempo” en Cañar, y “El Chasqui” de Chaupiloma

(Tabacundo).

Actividad 6.1. Institucionalización de un sistema de control de calidad del inoculante.

El Departamento de Protección Vegetal de la Estación Santa Catalina (INIAP), cuenta con una

sección de Microbiología de Suelos, para la producción de inoculantes de fréjol, arveja, alfalfa,

soya, y maní. Se tiene un sistema de control de calidad basado en la elaboración de antisueros

(fréjol), crecimiento de la bacteria en apropiados medios de cultivo, viabilidad del producto

(número de células/gramo de inoculante), y empaquetamiento del producto debidamente

identificado con fecha de expiración, recomendaciones, tipo de Rhizobium, y su correspondiente leguminosa.

9. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

Con relación a la caracterización de las cepas, esta se realizó solo con los aislamientos asociados al

fréjol y al maní tal como se explica en los métodos. Los resultados obtenidos en fréjol muestran

que los aislamientos de bacterias aisladas en el Ecuador, presentan una gran diversidad genética. La

investigación ha mostrado que (i) las cepas de R. etli del Ecuador asociadas al cultivo de fréjol, muestran separación fenotípica y genotípica del Rhizobium asociado con el fréjol de Mesoamérica,

con algunas subdivisiones.

En el caso de los aislamientos asociados al cultivo de maní, se observó a través de la

caracterización fenotípica tres grupos de aislamientos, algunos de los cuales presentan

características fenotípicas similares a cepas del género Rhizobium. Los resultados de las pruebas genéticas muestran gran heterogeneidad en base a los estudios de ERIC­PCR, REP­PCR, y RFLP

de la región intergénica 16S­23S rRNA. Se recomienda realizar estudios moleculares

complementarios (ej. Gene 16S rRNA, hibridación del ADN), para poder confirmar la posición

taxonómica de estos aislamientos asociados al cultivo de maní. Al respecto Taurian et. al (2002),

indican que el cultivo de maní es asociado con cepas pertenecientes tanto al género Rhizobium como al género Bradyrhizobium. Los resultados obtenidos con los aislamientos asociados al fréjol, muestran que el uso de cultivares

locales o introducidos en el caso del fréjol, puede influenciar la diversidad genética de las cepas

aisladas, esto también podría darse en el caso del maní.

51

La coevo lución del hospedero y su microsimbionte podría ser un factor de las diferencias reportado

en este estudio entre el Rhizobium del Ecuador y de Mesoamérica. La separación de P. vulgaris en estos dos centros de origen data a 5000 años (Kaplan 1965), con una incompatibilidad genética

ahora evidente entre representativos de ambos acervos genéticos (Singh y Gutiérrez, 1984 y Gepts

and Bliss, 1985). Por lo tanto, es muy probable que un aislamiento a largo plazo de hospederos

específicos y su Rhizobium en cada centro de origen debiera conducir a cierto nivel de especificidad

en sus asociaciones. Esto podría darse también en el caso de maní, por lo que se sugiere mayor

estudio en la asociación del maní con su microsimbionte. Bernal (1993) reportó ya diferencias en la

velocidad de la nodulación de cultivares, por parte del Rhizobium perteneciente a los dos diferentes acervos genéticos en el caso de fréjol. El mismo autor en 1993 evaluó la velocidad de nodulación de

cepas de Ecuador en variedades representativas, encontrando que los cultivares Mesoamericanos

Durango y Puebla 152 eran significativamente más lentos para nodular con las cepas Ecuatorianas.

Entre los factores que pueden contribuir a la heterogeneidad y a las diferencias en la respuesta

simbiótica entre las cepas de fréjol del Ecuador, está la dependencia local sobre los “landraces”,

incluyendo cultivares volubles en lugar de variedades mejoradas, la práctica en el sur del Ecuador

de sembrar y mantener mezclas varietales, y la topografía irregular y aislamiento de los valles

Interandinos donde el fréjol es un cultivo de subsistencia. Estudios adicionales se requieren tanto en

la bacteria asociada a fréjol como a la de maní, para definir de mejor manera la extensión e

importancia de la especificidad y la coevolución en esta simbiosis.

Las diferencias en el Rhizobium asociado a cultivares representativos de los diferentes centros de origen de un cultivo, podría tener implicaciones en el campo. Tanto Chaverra y Graham (1992), y

Bernal (1993) reportaron especificidad entre cultivares de fréjol y su microsimbionte, lo cual podría

también existir en maní. Esto permite afirmar de la necesidad de elaborar inoculantes de Rhizobium

con cepas nativas de la región donde la leguminosa requiere de inoculación.

Con relación a las cepas seleccionadas (ver productos), el proyecto contribuye a la producción de

las leguminosas, con la presencia de cepas de buena respuesta a la inoculación en fréjol, arveja,

alfalfa, soya y maní, en base a los parámetros analizados como peso seco de la parte aérea, peso

seco de nódulos, porcentaje de nitrógeno, y rendimiento. Así por ejemplo en fréjol, las cepas de Rhizobium etli, especialmente la cepa UMR 1478 se destacó en el rendimiento de grano fresco, peso

seco y peso seco de nódulos. En este caso de fréjol, los resultados obtenidos se corroboran con los

estudios realizados por (Bernal y Graham, 2001, Graham P.H. 1999) quienes usaron la prueba de la

velocidad de nodulación, la misma que mostró que las cepas ecuatorianas UMR 1478, 1481, 1468

52

son eficientes en nodular al hospedero, y a nivel de invernadero mostraron ser buenos fijadores de

nitrógeno.

Con respecto a las variables analizadas, la que tuvo mayor influencia en la determinación de la

eficiencia de fijación de nitrógeno fue el peso seco. Al respecto Castellanos y Peña­Cabrales (1989)

afirman, que el peso seco explica de buena manera la eficiencia de fijación biológica, en donde, la

producción de materia seca es de primordial importancia y la producción de semilla es secundaria.

Sin embargo, en fréjol por ejemplo, en donde el producto utilizado es el grano o la vaina verde, el

efecto de la nodulación debe ser observado preferiblemente llevando a las plantas hasta la

fructificación completa, siendo el rendimiento, la variable más razonable para predecir el

comportamiento simbiótico. La ventaja de haber usado la variable rendimiento es, que esta es una

variable de rutina en todos los ensayos de las leguminosas. Con relación al porcentaje de nitrógeno,

la extracción de nitrógeno puede ser secundaria en la determinación de la eficiencia de fijación de

nitrógeno.

Al momento el Departamento de Protección Vegetal dispone de cepas altamente fijadoras de

nitrógeno, probadas a nivel de campo, y de un sistema de control de calidad del inoculante. Para

esto se han seguido las metodologías sugeridas por Controux (1991). Para el proceso de

inoculacion, al momento se cuenta con medios de divulgación como trípticos, los cuales explican el

proceso de inoculación y siembra de leguminosas que debe seguir el agricultor (Bernal et al. 2002).

En el estudio de sustratos, se comprobó que la turba proveniente de la Provincia del Chimborazo

mantiene una sobrevivencia adecuada de la bacteria, como por ejemplo las cepas de fréjol

pertenecientes a la especie Rhizobium etli: UMR 1478 la misma que tuvo una sobrevivencia por 120

días. Si bien el valor de pH de algunos portadores utilizados en el proyecto no es el más indicado

para la supervivencia del Rhizobium, el agregado de CaCO3 (5­15%) permitió obtener un pH

adecuado (6.5­7.0 ) para la viabilidad de las bacterias. De los tres materiales mencionados, la turba

de la Provincia de Chimborazo (Fig. 7.7) presentó las mejores características para mantener viable a

la bacteria UMR 1478. Esto se corrobora con los trabajos realizados por Cevallos y Rodríguez

(2003), quienes experimentaron con bacterias gram – y gram + excepto Rhizobium, determinando que para las primeras el material de la Provincia de Chimborazo presentó las mejores condiciones.

Estos resultados permiten señalar a la turba de Chimborazo como potencial portador en la

producción de inoculantes.

53

El sustrato a base de ceniza aparece también como un sustrato con mayor concentración de

unidades formadoras por gramo de inoculante. Respecto al uso de ceniza como portador Sparrow

y Ham (1981), en sus trabajos con Rhizobium phaseoli, determinaron que éste material, fue exitosamente usado como soporte.

La zeolita (mineral aluminosilicato hidratado), pese a su naturaleza, ofreció una buena sobrevivencia

en los tres primeros registros debido a su capacidad de retención de agua, y a la disponibilidad de

ciertos nutrientes. Al respecto, los estudios realizados por Graham­Weiss et al. (1987) con

vermiculita (silicatos de hierro aluminio y magnesio hidratados), determinaron, que sustratos con

estas características deben ser suplementados con materia orgánica para mantener sus cualidades

por un período más largo.

El sustrato preparado especialmente con restos de vainas de fréjol no fue funcional, se debió en gran

medida a los tiempos de esterilización, puesto que, los ensayos realizados con respecto a este

parámetro, han utilizado primordialmente turbas. Los tiempos obtenidos en estos experimentos han

sido aproximados a otros materiales alternativos, no siendo siempre los más adecuados.

10. SITUACION INICIAL Y ACTUAL DEL GRUPO META.

El conocimiento del grupo meta sobre el uso de los inoculantes de Rhizobium en leguminosa era

limitado. Podría mencionarse que pocos agricultores de la Sierra y Costa conocían la presencia y

uso de los inoculantes. No existía información de las prácticas de inoculación. El grupo meta tiene

actualmente conocimiento de la presencia de inoculantes elaborados a base de Rhizobium. Algunos agricultores de la Sierra dedicados a producir fréjol, alfalfa, arveja en la Provincia del Cañar y

Chimborazo, y los agricultores que cultivan soya en la Provincia de Los Ríos y maní en las

Provincias de Loja y Manabí, conocen los principales pasos a seguir para la inoculación de las

cepas de Rhizobium en la semilla. Conocen de ciertas cepas competitivas y fijadoras de nitrógeno que fácilmente pueden ser conseguidas en el INIAP y usadas en los respectivos cultivos y

difundidas a otros agricultores de cada región.

11. ESTIMACION DE EFECTOS E IMPACTOS.

Efectos tecnológicos

Sin duda la tecnología generada por el proyecto viene a constituir un componente importante dentro

54

del nuevo enfoque de la agricultura limpia u orgánica. Esta alternativa de fertilización biológica es

clave dentro de los sistemas de manejo de suelos para su recuperación y aumento de la fertilidad.

Esta tecnología conjuntamente con el uso del compost combinado con otros microorganismos del

suelo (micorrizas, y bacterias promotoras de crecimiento vegetal) vendrían a complementarse

dentro de las prácticas de fertilización de las leguminosas, las mismas que son muy importantes

como cultivos de rotación en los diferentes sistemas agrícolas.

Además la tecnología generada contribuye considerablemente con la protección del medio ambiente

al reducir el uso de los agroquímicos, y por lo tanto contribuye con el equilibrio del ecosistema.

Efectos Económicos

En la mayoría de suelos en los que realiza agricultura en el Ecuador se puede apreciar una creciente

disminución de su fertilidad. Esta situación pone de manifiesto un deterioro permanente del suelo,

con consecuencias nefastas si no se incorporan inmediatamente alternativas que controlen este

problema. Esto se agravaría con la reducción de los ingresos de los productores, y escasas

superficies apropiadas para la agricultura originando un problema económico. Esto trae como

consecuencia un aumento progresivo en el uso de fertilizantes, lo cual incrementa los costos por

unidad producida. La utilización de inoculantes en las leguminosas dentro de los sistemas de

producción agrícola, logra una mayor disponibilidad de nutrientes que permiten un rendimiento

sostenibles de los cultivos, y una mayor tasa de retorno, ya que disminuye el costo de ciertos rubros

principalmente fertilizantes, mano de obra y transporte.

La utilización de inoculantes es una alternativa de bajo costo y de fácil manejo que permite dar

respuesta a uno de los graves problemas de la agricultura ecuatoriana, como es el déficit nutricional

de nitrógeno en los suelos. Si se compara el precio (US $ 60) de cuatro sacos de fertilizante químico

18­460 más dos sacos de urea (US $ 22) usados en fréjol, versus el precio de US $ 5 de un paquete

de 200 g del inoculante generado por el proyecto ( dosis: 5g/0.5 kg de semilla) más el costo de

fertilizante químico (20 kg N/ha, dosis baja recomendada a la siembra), la reducción del fertilizante

nitrogenado sería significativa, y más rentable si la incorporación del inoculante se la realiza en

semilla de calidad (Mendoza, 2003).

Otro ejemplo del beneficio económico de la fijación biológica de nitrógeno, es el caso de la alfalfa

55

en la región del medio oeste de los Estados Unidos, donde también predominan las fincas

familiares. El uso de la alfalfa en rotación con el maíz reduce sustancialmente el empleo de

fertilizantes químicos, sin causar bajas en la producción. El beneficio neto estimado oscilaba entre

US $ 50­90 millones en toda la región (Peterson y Russelle, 1991).

Efectos Ambientales.

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) contribuye globalmente con cerca de la mitad del

nitrógeno utilizado en el cultivo de las plantas. La otra mitad procede casi en su totalidad del

amonio sintetizado vía Haber Bosch con un gasto, para conseguir el H2 y la alta temperatura y

presión requeridas, del 1 % de la energía consumida en el ámbito mundial. Hoy día la FBN cobra

más valor, ya que puede evitar el uso abusivo de fertilizantes nitrogenados con el consiguiente

ahorro en el consumo de energía y la disminución de la degradación del medio ambiente.

Los resultados y productos generados por el proyecto van dirigidos a la sostenibilidad de la

producción agrícola, ya que con el racional y adecuado manejo del nitrógeno, se contribuye al uso

de una agricultura de bajos insumos, caracterizada por la reducción de la dependencia de los

fertilizantes químicos, los cuales a más de ser costosos representan un peligro ambiental como

fuentes de contaminación y degradación principalmente de los recursos suelo y agua.

12. PRODUCTOS DEL PROYECTO.

11.1 Cepas (inoculantes) de la bacter ia Rhizobium para leguminosas.

Tres cepas para fréjol: UMR 1478, UMR 1481, y UMR1468.

Dos cepas para maní: ECUM­L 102, ECUM­P8­6

Tres cepas para arveja: ECUa­I1, ECUA­Z2, ECUA­P3.

Dos cepas para alfalfa: UMR 6008, TAL 380

Cuatro cepas para soya: CIAT 51, UMR 6001, ECUS­001, ECUS1­SJ

11.2 Trípticos:

1. Inoculación de la semilla de leguminosas con la bacteria Rhizobium.

56

2. Inoculación con Rhizobium de la semilla del cultivo de soya. 3. Estudio en campo de la fijación simbiótica de nitrógeno en dos variedades de fréjol, con

tres cepas de Rhizobium etli. 4. Identificación de cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno para producción de

inoculante en maní.

5. Evaluación de sustratos como alternativa de portadores de Rhizobium.

11.3 Publicaciones:

1. Diversidad del Rhizobium asociado con Phaseolus vulgaris L. en Ecuador y evaluación de la capacidad fijadora de nitrógeno de tres cepas en dos variedades. Revista Rumipamba.

Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Central del Ecuador.

2. Selección de biotipos prominentes de Bradyrhizobium sp. en el cultivo de maní (Arachis hipogeae) en las provincias de Manabí y Loja. Revista Rumipamba. Facultad de Ciencias

Agrícolas. Universidad Central del Ecuador.

11.4 Días de campo

1. En Chuquipata, Provincia del Cañar (arveja). Participaron . Se realizó el 19 de

Noviembre del 2002.

2. En la Provincia de Loja (maní). Participaron agricultores de la Granja el Almendral y

técnicos. Se realizó el 20 de Marzo del 2003.

3. En Chambo, Chimborazo (alfalfa). Participaron agricultores de la zona de Chambo y

técnicos del Cuerpo de Paz. Se realizó el 17 de Noviembre del 2002.

4. En Tumbaco, Pichincha (fréjol). Participaron estudiantes y docentes de la Facultad de

Ingeniería Agronómica de la Universidad Central. Se realizó el 11 de Junio del 2002.

5. En Pifo, Pichincha (fréjol). Participaron agricultores de la zona de Pifo y estudiantes de la

Facultad de Ingeniería Agronómica de la Universidad Central. Se realizó el 13 de

Diciembre del 2003.

6. En la Granja Chaltura, Imbabura (fréjol). Participaron estudiantes de la Facultad de

Agronomía de la Universidad Técnica del Norte. Se realizó en Febrero del 2002.

57

11.5 Laborator io de Microbiología de Suelos en el Depar tamento de Protección Vegetal.

Estación Santa Catalina, INIAP.

13. LOGROS ADICIONALES.

Colaboración con los proyectos: a) “Fijación biológica de nitrógeno en leguminosas forrajeras de la

Costa” de la Universidad Técnica Estatal de Quevedo, concretamente con el Ing. Gorky Díaz. b)

Proyecto COMMINANDES. Así por ejemplo el uso de los inoculantes de Rhizobium (proyecto PROMSA) conjuntamente con el uso del compost generado por el proyecto COMMINANDES ha

permitido que los agricultores de la comunidad Virgen de la Nube en el Cañar, y la comunidad de

Chaupiloma de la Provincia de Pichincha, hagan uso de ambas tecnologías logrando resultados

satisfactorios. También comunidades de la Provincia de Chimborazo conjuntamente con miembros

del Cuerpo de Paz llevan a cabo experimentos usando estas tecnologías (anexo 3).

Los resultados y productos del proyecto permiten usarlos como parte de un paquete tecnológico

orientados hacia una agricultura ecológica, limpia u orgánica. Los resultados conjuntamente con los

del Proyecto COMMINANDES han sido difundidos tanto en la comunidad científica Ecuatoriana e

Internacional, concretamente en los siguientes eventos: 1) Taller: Formulación del Plan Nacional de

Innovación en Agricultura Orgánica” realizado en la Estación Experimental Tropical Pichilingue

del INIAP (Octubre 2003), 2) Taller: Marco conceptual y Normativa de la Agricultura Orgánica,

realizado en la Estación Experimental Pichilingue del INIAP (Octubre 2003), 3) Primer Encuentro

58

Mesoamericano y del Caribe y Tercer Encuentro Nacional de Investigadores, Experimentadores y

Técnicos en Agricultura Orgánica, realizado en la Escuela Centroamericana de Ganadería, Atenas,

Costa Rica (Agosto 2003).

La interacción directa con Centros de Investigación Internacional, así como por ejemplo con la

Universidad de Minnesota (Estados Unidos) y con la Universidad de la Plata (Argentina). En este

ultimo caso, gracias a la colaboración del Dr. Mario Aguilar del Laboratorio de Biotecnología de la

U. de la Plata, este laboratorio permitió la capacitación del Egresado Mauricio Jerez en técnicas

moleculares y concretamente con la caracterización genética de cepas de Bradyrhizobium asociadas al cultivo de maní.

La capacitación de los Ings. Diego Campaña y Aracely Jaramillo (colaboradora del proyecto

Comminandes), y del Egdo. Mauricio Jerez en los cursos: 1) Curso teórico práctico de

Microbiología Ambiental, organizado por la Universidad Católica del Ecuador (PUCE), durante los

meses de Agosto y Septiembre del 2003. 2) Curso teórico práctico de Microbiología Agrícola,

organizado por la PUCE (Septiembre 2003).

La visita de la Dra. Marcela Franco de la Universidad Javeriana de Colombia, y del Dr. Rene Novo

de la Universidad de Cuba, permitió el inicio y continuación de una estrecha interacción

principalmente relacionada con el intercambio de información científica.

Los resultados del proyecto también han sido fundamentales como antecedentes de propuestas de

proyectos aprobados. Así por ejemplo, el perfil del proyecto PFNR­03­008 “Establecimiento y

mantenimiento de un cepario de micorrizas nativas de soya y cacao que incrementen sus

rendimientos y contribuyan con la conservación de los recursos suelo y agua” ha sido seleccionado

por el Comité de Proyectos de Investigación del FUNDACYT, para la presentación de la propuesta

en extenso (anexo 4).

14. LIMITACIONES EN EL DESARROLLO DEL PROYECTO.

1. Retraso del inicio del proyecto. El investigador principal (IP) estuvo fuera del país en la

fecha en que debía iniciarse el proyecto (Enero 2001), ya que estuvo terminando sus

estudios de Doctorado (Ph.D.) en la Universidad de Minnesota. El proyecto sé inicio siete

meses después (Agosto 2001).

59

2. El proyecto tuvo que suspender temporalmente la ejecución de diferentes actividades

planificadas debido al problema de la “devolución del IVA”. Experimentos de laboratorio,

invernadero y campo fueron suspendidos por casi tres meses, así como la conservación del

valioso germoplasma de la bacteria Rhizobium y de otros microorganismos colectados durante algunos años por el Instituto, debido precisamente a la falta de reactivos y material

de laboratorio necesarios para su conservación.

Se realizaron todas las consultas pertinentes en la Estación Santa Catalina para solucionar el

“problema de la devolución del IVA” de parte del SRI, pero lamentable fue difícil encontrar

alternativas viables y rápidas, que permitan la continuidad inmediata del proyecto. En este

punto es necesario enfatizar que el manejo administrativo­financiero fue responsabilidad

exclusiva de las áreas Financiera y de Contabilidad de la EESC. El proyecto contribuyó con

los demás proyectos PROMSA de la Estación Santa Catalina, para contratar dos

profesionales contadoras específicamente para las actividades de manejo de los fondos de

cada proyecto. Por tal razón, los investigadores de ninguna manera fueron responsables de

solucionar un problema estrictamente administrativo. Con estos antecedentes, el

investigador principal del proyecto se permitió solicitar por escrito al Director General del

INIAP se digne convocar a varias reuniones con carácter urgente y con la presencia de las

autoridades de la Estación Santa Catalina, Director Financiero, Director de Planificación, y

técnicos involucrados, con el fin de encontrar una solución definitiva y en conjunto al

problema en mención.

3. La salida del Ing. Alfonso Suárez del proyecto, quien desempeñaba las funciones de

investigador principalmente en las actividades de campo.

4. El exceso de trámites burocráticos del Instituto y la lentitud en el flujo de recursos

económicos definitivamente fueron también grandes obstáculos para la ejecución rápida y a

tiempo de las actividades.

15. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.

El proyecto ha permitido la formación de un banco germoplásmico de la bacteria Rhizobium, con cepas para los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. Las cepas se encuentran almacenadas

60

bajo el proceso de liofilización, el mismo que permite una viabilidad de por lo menos cinco años.

Con relación al estudio de la compatibilidad genética entre la bacteria y el cultivo de fréjol, el

proyecto concluye que la diversidad genética de la bacteria es mayor cuando se usan cultivares

locales. Esto indica que existe cierta especificidad y por lo tanto se recomienda usar inoculantes con

cepas aisladas de suelos pertenecientes a regiones donde la leguminosa es nativa. Este

comportamiento podría darse en la asociación maní­Bradyrhizobium, pero se requiere de estudios

complementarios.

El proyecto ha seleccionado cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno, para los cultivos de

fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní. En fréjol las cepas UMR 1478 y UMR 1481, en maní: ECUM­L

102, ECUM­P8­6, en arveja ECUA –I1, ECUA­Z2, en alfalfa UMR 6008, TAL 380, y en soya

(invernadero): CIAT 151, UMR 6001, ECUS­001, ECUS1­SJ.

Todas las cepas en mención fueron estadísticamente similares al tratamiento nitrogenado, y

superiores (estadísticamente diferentes) al testigo sin inocular, tanto en los parámetros de

rendimiento y porcentaje de nitrógeno. En fréjol, la cepa UMR 1478 tuvo una respuesta en

rendimiento de 8554.53 kg/ha en peso fresco, siendo estadísticamente igual al rendimiento del

tratamiento nitrogenado, el cual fue superior con un promedio de 10121.88 kg/ha. En maní, las

cepas ECUM­P8­6 y ECUM­L102 fueron las que mostraron valores superiores tanto en rendimiento

(kg/ha), como en porcentaje de nitrógeno. Así, las cepas ECUM­P8­6 y ECUM­L102 rindieron

1248.27 kg/ha y 1234.36 kg/ha respectivamente versus 1247.92 kg/ha del tratamiento con nitrógeno

y 1038.43 kg/ha del tratamiento testigo. En nitrógeno, las cepas mostraron valores de 3.91 % y

4.00% respectivamente, versus 4.00% y 3.91% de los testigos. En cuanto a variedades, el

rendimiento de la variedad INIAP­380 fue superior al de la variedad Caramelo.

El estudio de competitividad de cepas asociadas al fréjol, permitió conseguir la elaboración de

antisueros de calidad y en suficiente cantidad para las cepas en estudio. Esto permite tener un stock

de antisueros para futuros estudios serológicos de Rhizobium.

El INIAP dispone de un stock de materiales que después de un análisis físico, químico y biológico,

muestran ser de calidad, para ser utilizada como buen portador de la bacteria Rhizobium. Se identificó en base a los sustratos disponibles localmente, el mejor sustrato (Turba de Chimborazo)

como buen portador de la bacteria Rhizobium.

61

La difusión de los resultados ha permitido que el número de agricultores que usan inoculantes,

incremente, comprobado mediante un diagnóstico en las Provincias del Cañar (comunidad Virgen

de la Nube) y de Pichincha (Chaupiloma­Tabacundo). Esta actividad se ha visto reforzada por los

programas de radio en ambos sitios.

Se ha institucionalizado un sistema de control de calidad de los inoculantes producidos

para los cultivos de fréjol, arveja, alfalfa, soya y maní.

Recomendaciones

Nuevamente es necesario enfatizar que el proyecto se inicio con siete meses de retraso. El inicio

estuvo programado para Enero del 2001 pero recién en Agosto de ese año, pudo iniciarse las

actividades cuando el investigador principal del proyecto retorno al país después de culminar sus

estudios de doctorado (Ph.D.) en la Universidad de Minnesota. Por lo tanto se recomienda y se

solicita a la vez continuar con algunas actividades inconclusas del proyecto, concretamente: 1) el

método de esterilización de la turba, 2) pruebas de inmunodifusión en el estudio de competitividad

entre cepas de Rhizobium, 3) culminación del estudio de efectividad de cepas bajo condiciones de campo en soya. Estas actividades podrían ser culminadas en un período de extensión del proyecto.

Sobre la base de los resultados de la caracterización de las cepas asociadas al cultivo de maní, se

recomienda complementar con otros estudios tanto de laboratorio como de campo. Se recomienda

una evaluación de campo de las cepas representativas de cada uno de los grupos obtenidos en el

análisis genético del RFLP, para ver su comportamiento como fijadoras de nitrógeno.

Se recomienda realizar experimentos demostrativos en la provincia de Manabí (zonas maniceras),

donde se evalúen las cepas de la colección (cepas nativas y cepas importadas), por existir cierto

grado de especificidad con el cultivo según los resultados obtenidos en Loja.

Si bien es cierto que los estudios de campo se ejecutaron en suelos pobres, se recomienda realizar

investigación sobre la respuesta de la inoculación al fósforo, sus niveles, y formas de aplicación. El

fósforo es un elemento esencial en el proceso de la fijación del nitrógeno, y en los suelos andinos

(Andisoles) el fósforo, es adsorbido por las partículas del suelo, dificultando la absorción por el

cultivo.

62

Mayor difusión de la tecnología en otras regiones donde el proyecto no tuvo mayor presencia,

especialmente en la Costa Ecuatoriana. Se recomienda la implementación de un laboratorio para la

elaboración de inoculantes en la Costa. Los agricultores necesitan proveerse fácil y constantemente

de los inoculantes al momento preciso de la siembra.

Continuar con el sistema de producción de inoculantes, incluyendo el control de calidad del

producto garantizando la eficiencia y uso por parte del agricultor.

16. LECCIONES APRENDIDAS.

En cada experimento el trabajo conjunto con el agricultor permitió que este pueda observar de una

manera directa las fortalezas y limitaciones que puede ofrecer el proceso de la inoculación de las

semillas de leguminosas.

El agricultor ha aprendido el procedimiento de inoculación de la semilla. En cada visita realizada se

puede observar el interés que el agricultor pone en el proceso. Cada vez es mayor el número de

agricultores interesados en el inoculante.

Las conversaciones con técnicos y agricultores, permitieron establecer una mayor difusión de los

conocimientos generados por el proyecto, sobre inoculantes. Estos cada vez son mas conocidos por

el agricultor.

El proyecto ha permitido adquirir una destreza de los investigadores responsables en la solución de

problemas administrativos y financieros relacionados con el manejo del proyecto. A pesar de que no

fue responsabilidad de los técnicos el manejo administrativo del mismo (ver “limitaciones en el

desarrollo del proyecto”), sin embargo los investigadores involucrados pusieron toda la energía

necesaria para motivar al personal de Contabilidad de la Estación Santa Catalina (INIAP), y así

acelerar el flujo de los fondos para responder y cumplir eficientemente con los objetivos del

proyecto.

63

17. BIBLIOGRAFIA.

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513.

18. ANEXOS.

Anexo 1. Análisis estadistico de los experimentos de invernadero y campo. Estudio de la capacidad

de fijación biológica de nitrógeno.

Cuadro 1. ADEVA para el variable peso fresco en el ensayo evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingüe – Los Ríos 2004.

Fuente de var iación Grados de liber tad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios Tratamientos Repeticiones Error

9 3 27

31.15 11.90 59.83

3.462 3.965 2.216

68

Cuadro 2. Promedios y Rangos de significación para la variable peso fresco en la evaluación de cepas de soya Pichilingüe – Los Ríos 2004

Descr ipción Promedios g/planta Rango (Tuquey 5% ) TESTIGO NITROGENADO ECUS1­SJ TAL­571 CIAT 51 ECUS­001 ECUS­005 6001 ECUS­1053 TESTIGO ABSOLUTO ECUS­P1

9.975 8.773 8.573 8.515 8.392 8.345 7.858 7.850 7.710 6.318

A abababababababab b

Cuadro 3. ADEVA para la variable peso seco en el ensayo evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingüe – Los Ríos 2004.

Fuente de var iación Grados de liber tad Suma de Cuadrados Cuadrados Medios Tratamientos Repeticiones Error

9 3 27

25.71 11.57 36.98

2.857 ns 3.858 ns 1.370

Cuadro 4. Promedios de peso seco obtenidos en la evaluación de cepas de soya. Invernadero. Pichilingue – Los Ríos 2004.

Descripción Promedios g/planta TESTIGO NITROGENADO TAL 571 ECUS1­SJ ECUS­001 CIAT 51 6001 ECUS­005 ECUS­1053 ECUS­P1 TESTIGO ABSOLUTO

6.222 4.770 3.878 3.865 3.74 3.733 3.722 3.593 3.557 3.443

69

Cuadro 5. Análisis de varianza para las variables evaluadas en el estudio de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco­ Pichincha 2003.

FUENTES DE VARIACIÓN

GRADOS DE LIBERTAD

CUADRADOS MEDIOS Peso seco follaje

Peso seco nódulos

Rendimiento. % de N

Total Tratamientos Var iedades (V) Cepas (C) c5 vs

c1,c2,c3,c4 c4 vs c1,c2,c3 c1 vs c2,c3 c2 vs c3

V x C Repeticiones Er ror Exp.

39 9 1 4 1 1 1 14

3 27

16.11** 37.08** 15.63* 28.72* 21.66* 0.55 ns 11.59 ns 11.35 ns 12.54 ns 4.41

0.30* 0.06 ns 0.63** 0.90* 1.44** 0.18 ns 0.02 ns 0.02 ns 0.25 ns 0.13

14780279.86** 32105113.69** 25168044.23** 54523767.76** 33968195.44** 469616.77 ns 11710597.31* 61307.04 ns 3908466.42 ns 2019735.46

0.35* 0.42 ns 0.52* 1.64** 0.35 ns 0.02 ns 0.07 ns 0.16 ns 0.23 ns 0.14

Promedio g/mata CV %

16.09 g/planta 13.05

2.31 g/mata 15.39%

7786.84 kg/ha 18.25%

3.68 %N 10.28%

Cuadro 6. Promedios y Pruebas de significación para los factores variedades y cepas en las variables en estudio en la evaluación de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco­ Pichincha 2003.

Descripción

Factor variedades

Promedios Peso seco g/planta

Peso seco nódulos g/mata

Rendimiento kg/ha

% de N

v2 INIAP Canario SCC2 v1 INIAP 412 Toa

Factor Cepas

17.05 a 15.13 b

2.34 2.27

6890.95 b 8682.74 a

3.79 3.58

c5 Fertilizado y sin cepa c3 UMR 1478 c1 UMR 1481 c2 UMR 1468 c4 Testigo

17.78 a 17.10 a b 15.93 a b 15.40 a b 14.24 b

2.01 c 2.53 a b 2.38 a b c 2.60 a 2.02 b c

10121.88 a 8554.53 a b 7995.75 b 6843.49 b c 5418.56 c

4.09 a 3.56 a b 3.68 a b 3.69 a b 3.40 b

70

Cuadro 7. Promedios para la interacción variedades por cepas en las variables en estudio en la evaluación de variedades de fréjol y cepas de Rhizobium etli bajo condiciones de campo. Tumbaco­ Pichincha 2003.

Descripción

Interacción VxC v2c3 v1c5 v2c1 v2c5 v2c2 v2c4 v1c1 v1c3 v1c2 v1c4

Promedios Peso seco g/planta

19.59 18.56 17.04 17.01 16.78 14.85 14.81 14.61 14.02 13.63

Peso seco nódulos g/mata

2.60 1.94 2.43 2.08 2.56 2.06 2.33 2.46 2.64 1.97

Rendimiento kg/ha

7659.94 10874.13 7035.88 9369.63 5870.74 4518.56 8955.63 9449.13 7816.25 6318.56

% de N

3.86 3.96 3.58 4.22 3.80 3.49 3.79 3.26 3.59 3.31

Cuadro 8. Análisis de los materiales utilizados en la preparación de soportes para inoculantes. Cutuglagua ­ Pichincha 2003.

ANÁLISIS C. ROSA CENIZA ZEOLITA M. CHIMB

M. LLOA

COMPOST TUR. ALASK

pH 4.2 Ac 8.8Al 5.1Ac 5.5LAc 6.3LAc 7.7 LAl 6.5Lac NH4(ppm) 69.00 A 44.00M 72.00A 166.00A 172.00

A 90.00A 42.00M

P (ppm) 63.00 A 183.00A 10.00M 36.00A 14.00 M

160.00A 5.00B

K(meq/100 ml)

0.14B 0.88A 0.20M 0.41A 0.62A 3.60A 0.77ª

M.O. % 16.80 A 19.80A 0.60 11.20A 9.40A 9.90A 44.10ª Bases(meq/ 100ml)

22.89 24.50 15.11 18.94 18.22 27.90 14.47

C/N ­­­­­­­ 29.93 3.53 19.75 11.84 11.30 Interpretación pH Elemento

s Ac = Ácido N= Neutro Lac = Liger. Ácido LAl = Lige. Alcalino PN = Prácticamente neutro Al = Alcalino

B = Bajo M = Medio A = Alto

71

Cuadro 9. Análisis de varianza para unidades formadoras de colonia por gramo de inoculante, en el estudio evaluación de sustratos como alternativas para portadores. Cutuglagua­ Pichincha 2003.

Cuadro 10. Datos reales para unidades formadoras de colonias por gramo de inoculante en la evaluación de sustratos como alternativas para portadores Cutuglagua ­ Pichincha 2003.

SUSTRATOS (S)

8 días ufc/g ino

15 días ufc/g ino

30 días ufc/g ino

60 días ufc/g ino

90 días ufc/g ino

120 días ufc/g ino

S1 Capa rosa s2 Ceniza s3 Zeolita s4 T. chimborazo s5 T. Lloa s6 Compost s7 Turba alaska S8 Vaina de fréjol

1.43x10 8 bc 6.06x10 8 ab 3.41x10 8 ab 1.63x10 9 a 4.01x10 6 d 4.79x10 8 ab 1.41x10 8 bc 6.35x10 7 c

1.05x10 8 abc 2.60x10 8 abc 2.02x10 8 abc 1.16x10 9 a 3.39x10 7 c 1.14x10 9 a 4.44x10 8 ab 3.98x10 7 bc

1.97x10 8 bc 6.92x10 8 ab 1.03x10 8 c 1.94x10 9 a 6.84x10 7 c 5.58x10 8 ab 2.44x10 8 bc 3.72x10 6 d

1.21x10 8 abc 3.63x10 8 ab 7.03x10 7 bc 1.09x10 9 a 2.57x10 7 c 2.38x10 8 abc 8.28x10 8 ab 1.33x10 6 d

1.20x10 8 bc 2.70x10 8 ab 8.97x10 7 bc 1.10x10 9 a 2.34x10 7 c 2.24x10 8 ab 6.34x10 8 ab 0.00 d

5.43x10 7 cd 1.77x10 8 abc 4.01x10 7 cd 7.50x10 8 a 1.06x10 7 d 1.00x10 8 bc 3.41x10 8 ab 0.00 e

Anexo 2. Breve información del proyecto COMMINANDES:

Título del Proyecto: Producción ecológica de papa en áreas peri­urbanas de los Andes,

combinando compostaje e inoculantes microbianos.

Definición del problema:

En el Ecuador la papa es un cultivo de importancia económica en la Región Interandina, y

últimamente es común en áreas peri­urbanas. Lamentablemente la producción del cultivo es

baja (5­8 T/ha) como resultado de varios factores abióticos (propiedades físicas y químicas

del suelo) y bióticos (ej. enfermedades de la raíz). Además, por un lado los costos de

fertilizantes y pesticidas para contrarrestar estos problemas son altos e inaccesibles para el

pequeño y mediano productor, y por otro lado el mal manejo de estos insumos perjudica al

medio ambiente especialmente a los recursos suelo y agua.

FUENTE DE VARIACIÓN

GRADOS DE LIBERTAD CUADRADOS MEDIOS

8 días 15 días 30 días 60 días 90 días 120 días Total Sustratos Error

317 24

2.52** 0.09

1.39** 0.22

2.71** 0.09

3.57** 0.24

35.43** 0.17

33.33** 0.10

Promedio log (x+1) ufc/g inocu. Promedio de ufc/g de inoculante CV%

8.24 1.74x10 8 3.71

8.33 2.14x10 8 5.60

8.25 1.78x10 8 3.63

8.05 1.12x10 8 6.02

7.25 1.78x10 7 5.63

7.00 1.00x10 7 4.52

72

Justificación del problema:

El reciclaje de restos orgánicos originados en agro­industrias de la papa, utilizando el

poder enzimático de los microorganismos del suelo, a un producto útil y seguro (compost)

es postulado como una opción practica dirigida a mejorar la producción de papa y de otros

cultivos de áreas peri­urbanas (y urbanas). Además del reciclaje de los restos vegetales

(leguminosas, gramíneas, hortalizas, etc) y animales (estiércol), el manejo de los

microorganismos benéficos del suelo (micorrizas, Rhizobium, bacterias promotoras de crecimiento), ha sido propuesto como una importante practica agrícola para reducir los

insumos químicos (fertilizantes y pesticidas), y para mejorar el potencial ecológico y

sustentable de los suelos en sistemas peri­urbanos y también urbanos. Estos bio­protectores

de plantas y bio­fertilizantes pueden ser manejados cambiando la calidad, cantidad y

tiempo de aplicación del compost. Estas dos tecnologías (bioprotectores/biofertilizantes y

compost) han mostrado ser eficientes independientemente, pero ninguna o muy poca

información existen sobre el efecto cinegético de ambas tecnologías.

El objetivo de esta investigación es investigar la combinación del compost con inoculantes

(bio­fertilizantes / bio­protectores) basándose en microorganismos nativos a fin de 1)

Adicionar un valor a los restos orgánicos producidos por las agro­industrias y agricultores

de áreas peri­urbanas, 2) Reducir el uso de los fertilizantes químicos y de pesticidas, y 3)

Estimular la capacidad colectiva local (asociaciones de agricultores y ONG’s) para

desarrollar sistemas de compostaje a micro­escala y de manejo de inoculantes a partir de

microorganismos del suelo.

Ámbito y cobertura

Este proyecto está dirigido a los agricultores de sistemas agrícolas donde la papa juega un

rol importante, y localizados en áreas peri­urbanas de la Región Interandina. Los

productores dispondrán de compost, el mismo que vendrá a constituir en un insumo de

fertilización orgánica mejorando las condiciones del suelo, y de inoculantes basado en

microorganismos del suelo los que vendrán a constituir en promotores de crecimiento

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vegetal y de bio­fertilizantes. El proyecto es parte de un consorcio formado por Ecuador,

Bolivia, Cuba, Francia, Irlanda y Bélgica.

Fecha Inicio Proyecto: 01­01­2003

Fecha Finalización: 01­01­2005

Instituciones co­ejecutoras:

­ INIAP: Departamento Nacional de Protección Vegetal (DNPV)

Departamento de Suelos

Programa de Papa (Proyecto Fortipapa)

­ CIP (Sede Quito).

­ FAO

­ Fundación GAIA.

­ Agricultores/ productores de Chaupiloma (Tabacundo­Pichincha), y Virgen de la Nube

(Cañar).

­ Gobiernos locales (Municipios).

Objetivo principal: Contribuir con la producción ecológica de papa en la Región Interandina.

Objetivos del proyecto.

1. Obtener compost de calidad.

2. Obtener biofertilizantes a base de hongos micorrízicos y bacterias promotoras de

crecimiento vegetal en papa y otros cultivos de la Región Interandina.

Anexo 3. Informe del Dr. Jonathan Haskett* sobre el uso de la tecnología de

inoculantes de Rhizobium, en la Provincia del Chimborazo.

De: "Jonathan Haskett" <jhskt2nd@mindspring.com>

Para: <g3bernal@punto.net.ec>

Asunto: Re:_Felíz_Nuevo Año.

Fecha: Lunes, 12 de Enero de 2004 15:25

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1) How farmers feel about the use of inoculants?. Are they happy?

Most farmers are happy with this technology. One farmer reported that his peas matured

more rapidly and all matured at the same time, making harvest more easy. Another farmer

reported that his innoculated alfalfa grew as well as alfalfa recieving chicken manure, but

for half the cost at first harvest (note: he added phosphorus fertilizer and micro­nutrients).

Other farmers are very pleased by the results and have been passing on the information to

their neighbors.

One farmer did not like the results he got with innoculum in beans. He maintained that the

innocualted beans grew more poorly than those not innoculated. This was difficult to verify

and to determine because he subsequently changed his story saying that the beans actually

grew just as well. This is the only instance of someone not being happy with the innoculum

that I have encountered. (note: that the original complaint was made when the gentleman

was apparently intoxicated).

2) What more do farmers need in relation with this technology?

Access, is THE main problem. Farmers need a ready, consistent supply of innoculum,

WHEN the need it. Planting decisions are often driven by weather and can be quite

variable. The lag time between requesting the inoculums and getting it is a problem.

Inoculums should also be supplied in smaller bags so farmers can inoculate smaller

quantities of seeds. This is because there is no refrigeration and it is difficult to reseal bags

and keep them at the correct humidity. So bags should be considered single use and sized

for smaller amounts of seeds.

3) How many "field days" have you had there in the community?

I have done one formal field day. I have done numerous charlas with farmers in small

groups or individually. I find this to be much more effective, especially if we go ahead and

plant the farmer's field that day. The multiplier effect them comes in when and if the farmer

talks to his/her neighbors. I have seen this multiplier effect in action.

4) What kind of methods are you using to difuse the Rhizobium technology there?

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I have done numerous charlas with farmers in small groups or individually. I find this to be

much more effective than field days, especially if we go ahead and plant the farmer's crop

that day. The multiplier effect them comes in when and if the farmer talks to his/her

neighbors. I have seen this multiplier effect in action.

5) Please explain that inoculants supply are going to be through Peace Corp members.

Myself and three other Peace Corps volunteers have actively promoted and distributed

inoculums at our sites. These sites are widely dispered and isolated. Three of the sites are

entirely indigenous and in each of the three inoculums was an entirely new technology that

nobody had ever heard of before. We have been providing the inoculums on a trial basis at

no cost. Eventually I would like inoculums to be commercially available but at a cost that

poor people can afford.

6) What other research do you think is necessary to carry out under field conditions.

Side by side inoculums trials with different strains would be invaluable, to determine which

strains are superior and whether they are better than native strains. Another critical aspect

to determine would be response to phosphorus fertilizer and micro­nutrients. That is what

level of P is optimal, what form (super phosphate, rock phosphate) is optimal, and how this

can be related to locally available soil tests or other (cost free indicators).

Of some interest would also be the potential use of inoculated legumes as green­

manure/mulches in fruit crops such as strawberries and tomato ­ de ­ arbol.

However the strain experiments and the P fertilization experiments are much more critical.

Hope this is useful, if you need more information or more detailed descriptions let me

know. cheers, Jonathan.

* El Dr. Jonathan Haskett es Ph.D. graduado en la Universidad de Minnesota. Es

especialista en Fertilidad de Suelos y actualmente se encuentra trabajando como voluntario

del Cuerpo de Paz en comunidades de la Provincia del Chimborazo.

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Anexo 4: Aprobación de propuesta (FUNDACYT).

77

Anexo 5: Trípticos.

5.1 Inoculación de la semilla de leguminosas con la bacteria Rhizobium. Gustavo Bernal, Alfonso Suárez, Mauricio Jeréz, Diego Campaña

Plegable No. 195 (INIAP­PROMSA)

Departamento Nacional de Protección Vegetal

Estación Santa Catalina, INIAP.

Agosto 2002

(Plegable realizado)

Propósito.

La bacteria del genero Rhizobium tiene la capacidad de fijar el nitrógeno del aire y convertirlo en una forma que las leguminosas puedan aprovecharlo para su desarrollo y buen rendimiento. Este

proceso tiene lugar después de la germinación de la semilla, en los nódulos (bolitas) formados en la

raíz de la planta.

La inoculación de las semillas con Rhizobium es una práctica de fertilización biológica nitrogenada que remplaza a la fertilización química. Con esta practica, se reducen los costos de fertilización, así

como también la contaminación del suelo y del agua.

Recomendaciones generales.

El inoculante preparado a base de turba (tierra negra) debe ser tratado con ciertas precauciones, por

cuanto este reúne a millones de bacterias, las mismas que necesitan condiciones adecuadas para

sobrevivir. La concentración del producto es de 10 9 células viables de Rhizobium por gramo del inoculante.

Ver ifique la fecha de vencimiento del inoculante.

Verifique que el inoculante sea apropiado para la leguminosa a ser sembrada. Por ejemplo el

inoculante de semilla de fréjol solo funciona en este cultivo.

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Solicite el inoculante por lo menos 15 días antes de la siembra.

De preferencia use el inoculante inmediatamente después de comprarlo.

Si la siembra de la semilla no es inmediata, conserve el inoculante antes de usarlo a una temperatura

de 4 º C (parte baja de la refrigeradora), o en un lugar fresco por un máximo de cuatro meses. Evite

almacenarlo junto con pesticidas o sustancias toxicas.

¿Cuánto del inoculante debo usar por peso de semilla?

La cantidad de inoculante a utilizarse depende del tamaño de la semilla.

­ Para una leguminosa de 1 a 10 semillas por gramo (ej. Soya, Fréjol, Maní, Arveja, etc.), utilice:

10 gramos (2 cucharadas pequeñas llenas) de inoculante por kilogramo de semilla.

­ Para una leguminosa de 11­20 semillas por gramo (ej.Leucaena), utilice: 20 gramos de inoculante

por kilogramo de semilla.

­ Para una leguminosa de 20 semillas o más por gramo (ej. Trébol, Alfalfa, Pueraria, Centrosema),

utilice: 50 gramos de inoculante por kilogramo de semilla.

¿Cómo debo inocular la semilla?

­ Prepare una solución azucarada al 15%. Para esto, coloque 15 gramos (3 cucharadas pequeñas) de

azúcar negra en 85 mL (poco menos que media taza) de agua. Agite vigorosamente hasta que el

azúcar se diluya por completo. La cantidad a preparar depende de la cantidad de semilla a

sembrarse. Prepare solo lo necesario.

­ Coloque una cantidad apropiada de la solución azucarada sobre la semilla (ej. contenida en un

balde), hasta que todas las semillas obtengan un aspecto brilloso. No adicione más solución.

­ Coloque el inoculante y mezcle con la semilla usando un palo o estaca. La distribución del

inoculante debe ser homogénea, sin que se formen grumos. Seguir mezclando hasta que las

semillas empiecen a despegarse una de la otra. Cada semilla debe estar cubierta de inoculante

mostrando un color oscuro homogéneo.

­ Seque la semilla bajo sombra evitando que el inoculante se despegue de la semilla.

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¿Cuándo debo sembrar la semilla?

­ De preferencia siembre la semilla inmediatamente después de la inoculación y cúbrala con el

suelo. El suelo debe estar suficientemente húmedo. Lo ideal es sembrar en horas de la mañana (7­

10 A.M). Evite temperaturas altas y días muy soleados.

­ Evite almacenar la semilla inoculada, pues la bacteria Rhizobium puede perder la efectividad debido a toxinas producidas por la semilla, y desecamiento de las células. Además la semilla

podría ser atacada por insectos o enfermedades.

¿Qué debo hacer si el suelo es muy ácido o muy básico?

­ Si el suelo es ácido (pH 4­5) es recomendable cubrir las semillas recién inoculadas con carbonato

de calcio hasta que todas las semillas tengan una coloración blanca (pellet). Siembre

inmediatamente.

­ Si el suelo es básico (pH 8 ­8.5) es recomendable recubrir la semilla con roca fosfórica después de

la inoculación. Siembre inmediatamente.

5.2 Estudio de la fijación simbiótica de nitrógeno de 3 cepas de Rhizobium etli en dos variedades de

fréjol, bajo condiciones de campo (se adjunta).

5.3 Evaluación de sustratos como alternativas de portadores de la bacteria Rhizobium (se adjunta). 5.4 Selección de cepas eficientes en fijación biológica de nitrógeno, para producción de inoculante

en maní (se adjunta).

5.5 Inoculación de semilla de maní con bacteria Rhizobium ( se adjunta) 5.6 Tríptico en arveja (en revisión)

5.7 Tríptico en soya (en revisión)

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20. FIRMA DE RESPONSABILIDAD

ENTREGA­RECEPCIÓN DEL INFORME FINAL DEL PROYECTO IQ­CV­081

Número total de páginas:

Nombre y firma del Investigador Principal del Proyecto

Gustavo Bernal, Microbiólogo de Suelos Ph.D. Responsable del Departamento Nacional de Protección Vegetal

Estación Experimental Santa Catalina, INIAP.

Fecha

13­01­2004

NOTAS IMPORTANTES

­ El Informe Final del proyecto ha sido remitido el día martes 13 de enero del 2004. La razón

del envío en esta fecha se debe a que la toma de datos de experimentos que todavía se

encuentran en campo (caso soya) fue realizada los últimos días del mes de diciembre/2003,

de acuerdo al cronograma de actividades.

­ Mayores detalles en relación con los estudios de la selección de cepas de Rhizobium

asociadas a los cultivos de fréjol y de maní se encuentran en las Tesis de Grado de los Ings.

Diego Campaña y Mauricio Jerez. El presente informe presenta solo un resumen de las

tesis.

­ Los informes trimestrales fueron realizados y entregados a tiempo.

­ Los inventarios de los bienes adquiridos con recursos del proyecto están siendo remitidos

en el informe financiero final del proyecto, el mismo que esta a cargo del Departamento de

Contabilidad de la Estación Santa Catalina, INIAP.