CRIOPRESERVACIÓN DEL SEMEN OVINO

Karen Melissa Buelvas NegretteCristina Isabel Guerra Vergara

Jorge Andrés Rico ComasCesar Kamel Tuiran Tejada

Universidad de Córdoba2013

Rocío Sandoval M; Alexei Santiani A; Luis Ruiz G;

Víctor Leyva V; Luis Coronado S; Alfredo Delgado C.

Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes.

Objetivo

El estudio se desarrolló en dos fases. La primera fase permitió identificar y seleccionar

entre tres dilutores, el que sería incorporado en los tratamientos de la segunda fase del estudio.

2° se evaluó cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes y dos no permeantes.

Vagina artificial.

Evaluar el efecto de tres dilutores y cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. 

Experimento 1: Efecto de tres dilutores Dilutor A (fracción 1: tris 27.1 g, ácido cítrico 14 g, fructosa 10 g y

yema de huevo 10 %, diluidos en agua bidestilada csp. 1 L; y fracción 2: glicerol 6%, trehalosa 76 g y EDTA 1.5 g, diluidos en la fracción 1 csp. 1 L).

Dilutor B (fracción 1: tris 18.17 g, ácido cítrico 9.6 g, fructosa 29.72 g y yema de huevo 10%, diluidos en agua bidestilada csp. 1 L; y fracción 2: glicerol 6%, trehalosa 76 g y EDTA 1.5 g, diluidos en la fracción 1 csp. 1 L).

Dilutor C (fracción 1: leche descremada 9.5 mL y yema de huevo 0.5 mL; fracción 2: fructosa 0.49 g, yema de huevo 0.5 mL, trehalosa 0.89 g, EDTA 0.02 g y glicerol 1.47 mL, diluidos en la fracción 1 csp. 10 mL).

Resultados: experimento 1.Se evaluó la motilidad progresiva y la viabilidad e integridad acrosomal.

El dilutor A obtuvo los mayores porcentajes de espermatozoides vivos con acrosoma intacto y de espermatozoides con motilidad progresiva (p<0.05). Los resultados demuestran que los dilutores que contenían Tris (A y B), tuvieron una mejor capacidad de amortiguación, de regulación osmótica y baja toxicidad en comparación con el dilutor que contenía leche descremada (C).

Experimento 2: Efecto de diferentes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes.

Se uso dilutor A (fracción 1: tris 27.1 g, ácido cítrico 14 g, fructosa 10 g y yema de huevo 10 %, diluidos en agua bidestilada csp. 1 L; y fracción 2: glicerol 6%, trehalosa 76 g y EDTA 1.5 g, diluidos en la fracción 1 csp. 1 L).

 Los tratamientos consistieron en las combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1) Glicerol-Trehalosa, 2) Glicerol-Sacarosa, 3) Etilenglicol-Trehalosa y 4) Etilenglicol-Sacarosa.

Porcentajes de motilidad progresiva y de espermatozoides vivos con acrosoma intacto post-descongelamiento, termoresis tencia y de espermatozoides con membrana plasmática íntegra.

Resultados: experimento 2.

La calidad del semen post-descongelamiento fue significativamente mejor en los grupos que utilizaron glicerol como crioprotector permeante, que en grupos con crioprotector no permeante.

No se observó diferencias significativas entre los grupos glicerol-trehalosa versus glicerol-sacarosa, ni etileglicol-trehalosa versus etilenglicol-sacarosa.

Glicerol como crioprotector permeante, en la prevención de la pérdida de la motilidad progresiva post-descongelamiento en semen de ovinos es mejor que el etilenglicol.

El semen criopreservado con glicerol (más trehalosa o sacarosa), tuvo una mayor proporción de espermatozoides vivos con acrosoma intacto en comparación con el semen criopreservado con etilenglicol (más trehalosa o sacarosa).

Se obtuvo un mayor porcentaje de espermato-zoides con membrana plasmática íntegra cuando se utilizó glicerol en comparación con etilenglicol.

Los crioprotectores no permeantes (trehalosa y sacarosa), no mostraron diferencia significativa en lo concerniente a la motilidad, viabilidad e integridad acrosomal, integridad de membrana y termoresistencia.

La adición de trehalosa en un dilutor en base de Tris mejoró la motilidad progresiva en un 19%.

La sacarosa tiene las mismas cualidades de protección que la trehalosa en el espermatozoide ovino durante el proceso de criopreservación. 

Protocolo El enfriamiento del semen comprendió 2 fases: en la primera, se diluyó el semen con la primera fracción del dilutor a 35 ºC, luego se disminuyó la temperatura hasta llegar a los 5 ºC en un lapso de 90 minutos. En la segunda fase se agregó la segunda fracción del dilutor (sustancias crioprotectoras), y se incubó a 5 ºC durante 30 minutos para estabilizar la muestra. Luego, las muestras fueron envasadas en pajillas de 0.5 mL. Las pajillas fueron congeladas con los vapores de nitrógeno líquido; para tal efecto, se disminuyó la temperatura de 5 a -25 °C en un lapso de 6 minutos y finalmente fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-196 ºC).

El descongelamiento se realizó sumergiendo las pajillas en agua temperada a 37 °C por 10 segundos. Luego, el semen fue diluido (1:10) con una solución base isotónica (27.1 g de Tris, 14.0 g de ácido cítrico, 10.0 g de fructosa y agua bidestilada csp. 1,000 mL) temperada a 37 ºC. Luego de 20 minutos se procedió a la evaluación.

Brito, F. I.; Valencia, M. J.; Balcázar, S. A.; Angulo, M. R. y

Mejía, V. O.

Congelación de semen de carnero en pellets con los diluyentes Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo.

Objetivo

Se colectaron 30 eyaculados de nueve carneros de dos razas, dos Rambouillet y siete Suffolk .

Vagina artificial. Color, volumen, concentración, motilidad y

morfología.

Comparar la recuperación de la motilidad al descongelar el semen congelado en pellets utilizando el diluyente Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo.

Cada eyaculado fue dividido en dos partes iguales para proceder a una dilución inicial 1:1 (semen: diluyente) con el diluyente Tris-glucosa-yema de huevo y la otra mitad, con el diluyente Lactosa-yema de huevo.

En ambos casos el glicerol ya iba incorporado en el diluyente.

Fórmulas diluyentes utilizados

Diluyente A (Tris-glucosa-yema de huevo): Tris 4.361 g Glucosa 0.600 g Ácido cítrico 2.388 g Sulfato de estreptomicina 0.005 g Penicilina 0.006 g Glicerol 6.0 ml Agua tridestilada 76.0 ml 76.0 ml Por cada 10 ml de la solución anterior se agregaron 2.2 ml. de yema de huevo.

Diluyente B (Lactosa-yema de huevo): Lactosa 5.5 g Agua tridestilada (aforar a) 50 ml De esta solución al 11% se agregaron por cada 7.4 ml: Glicerol 0.6 ml Yema de huevo 2.0 ml Sulfato de estreptomicina 0.005 g Penicilina G sódica 0.006 g

Protocolo El semen, una vez diluido en un tubo de centrífuga, se colocó en un

vaso de precipitado con agua a 30ºC.

Se introdujo al refrigerador a 5ºC, en donde permaneció dos horas (tiempo de equilibrio).

Después de haber calculado la concentración espermática.

Se añadió el resto del diluyente al término del periodo de equilibrio (dilución final), de manera que la concentración final de la dosis fuera de 100 x 106 espermatozoides mótiles en un volumen de 0.1 ml.

el diluyente se mantuvo a la misma temperatura que el semen (5ºC), para evitar variaciones en la temperatura al realizar la dilución final.

Una vez preparados los diluyentes, se procedió a inactivar la yema de huevo, las lecitinas específicamente, colocando los diluyentes en baño María a 56ºC, durante 30 minutos.

Posteriormente, se mantuvieron en baño María a 30ºC, durante media hora previa a la dilución inicial del semen.

Se procedió a elaborar los pellets (concentración de 80-100 millones/dosis ).

Después de 15 minutos, los pellets congelados se envasaron en recipientes de plástico previamente identificados y fueron introducidos en el nitrógeno líquido.

La descongelación se realizó utilizando pequeños viales de vidrio, que contenían un volumen de 0.15 ml de solución salina fisiológica (para obtener un volumen total de 0.25 ml al descongelarse el pellet).

Manteniéndolos en baño María a una temperatura de 37ºC durante 10 a 15 segundos, tiempo en que tardó en descongelarse el pellet.

Resultados El semen antes de congelar presentó, en promedio, una

concentración espermática de 3.13 x 109

espermatozoides/ml. Cuadro 1, presenta el porcentaje de la motilidad en masa

obtenida en los diferentes eyaculados teniendo como mínimo 80% de motilidad.

Cuadro 2, presentan los porcentajes de la motilidad progresiva antes de la congelación y después de haberse realizado la dilución inicial.

Cuadro 3, presentan los porcentajes de la motilidad progresiva al diluir y al descongelado. Después de transformar al arcoseno, los porcentajes de la motilidad progresiva al descongelado, se encontraron diferencias significativas entre los diluyentes, siendo mayor la motilidad del semen diluido en Lactosa-yema de huevo (45.8%), que el diluido en Tris-Yema de huevo (40.2%). El grado de dilución promedio fue de 1+ 2.1 (semen + diluyente).

Hernán Guerrero V., Wilfredo Huanca L., Fernando Raymundo T., Sandra Huerta O.y Daphne Ramos D.

Uso de dilutores hipertónicos en la criopreservación de

semen ovino

Objetivo

Vagina artificial. El semen se colectó con una frecuencia de dos

veces por semana y por un periodo de tres meses. El semen, inmediatamente después de su colección,

se conservó a 37 °C para su evaluación.

Evaluar el efecto crioprotector en la congelación de semen de carnero de dos dilutores con altas concentraciones de disacáridos (trealosa y lactosa) sobre las características físicas del semen de ovinos Blackbelly.

Se utilizaron los eyaculados que tuvieron un volumen 0.4 ml, una concentración espermática superior a 2,000 x 106 espermatozoides/ml, una motilidad masal 4, una motilidad individual 70% y <15% de anomalías espermáticas.

Cuadro 1. Composición de dos dilutores para su utilización en la congelación de semen ovino.

  COMPONENTE DILUTOR

TRIS - TREALOSA TRIS - LACTOSA

DILUYENTE BASE TrisÁcido cítrico

FructosaGlicina

Yema de huevo

27.1 g/l14.0 g/l10.0 g/l10.0 g/l

10.0% (v/v)

27.1 g/l14.0 g/l10.0 g/l10.0 g/l

10.0% (v/v)

DILUYENTEHIPERTÓNICO

Diluyente base +Trealosa 76.0 g/l +Glicerol 6.5% (v/v)

Diluyente base +Lactosa 76.0 g/l +Glicerol 6.5% (v/v)

Protocolo La congelación del semen se hizo en un tanque de

nitrógeno líquido.

Las varillas, goblets y canastillas se refrigeraron a 5 ºC para evitar cambios de temperatura.

El rango de enfriamiento para el semen fue de 50-60 ºC/min.

Luego de aproximadamente tres meses, las pajillas fueron descongeladas en un recipiente con agua a 37 ºC por 60 segundos.

Resultados Cuadro 2. Características seminales reportadas en la literatura científica para ovinos de pelo.

  BLACKBELLY1 PELIBUEY2

Volumen (ml) 1.5 ± 0.1 1.1 ± 0.2 0.6 ± 0.3

Motilidad individual (%) 83.6 ± 1.4 75.3 ± 4.1 87.7 ± 4.6

Concentración espermática (x 109/ml)

3.7 ± 0.2 3.6 ± 1.0 4.2 ± 1.2

Motilidad masal - - 4.2 ± 0.2 - -

Espermatozoides vivos (%) - - 89.2 85.4 ± 7.1

Espermatozoides anormales (%)

- - 4.5 ± 0.6 13.6 ± 5.2

1 Quispe et al., 19982 Manco, 1999, y Carmenate y Hernández, 1982, respectivamente.

Cuadro 3. Valores seminales de ovinos Blackbelly utilizados como reproductores en el valle de Lima.

  Promedio Máximo Mínimo

Volumen (ml) 1.1 ± 0.1 1.4 0.8

Motilidad individual (%) 3.5 ± 0.1 3.3 3.8

Concentración espermática (x 109/ml)

87.0 ± 2.4 95 80

Motilidad masal 4.4 ± 0.2 5 4

Espermatozoides vivos (%) 90.2 ± 3.8 95 80

Espermatozoides anormales (%)

1.8 ± 0.7 5 0

Cuadro 4. Efecto de los dilutores Tris-Trealosa y Tris-Lactosa en la motilidad individual y porcentaje de espermatozoides vivos post-descongelamiento de semen de ovino Blackbelly  Dilutor Tris-Trealosa Dilutor Tris-Lactosa

Animal Eyaculados(n)

Motilidad(%)

Esperm.Vivos (%)

Eyaculados(n)

Motilidad(%)

Esperm.Vivos (%)

1 12 47.4 ± 11.0 38.3 ± 9.1 11 25.0 ± 7.6 17.1 ± 6.9

2 11 25.0 ± 7.7 18.5 ± 8.3 12 23.0 ± 8.0 22.8 ± 8.0

3 12 39.5 ± 12.0 33.1 ± 13.1 12 29.0 ± 9.6 25.6 ± 10.3

4 12 48.9 ± 11.5 46.4 ± 16.4 11 43.6 ± 10.9 31.8 ± 11.8

Total 47 40.3 ± 5.9a 34.4 ± 6.6 46 30.0 ± 5.0b 24.3 ± 5.0

ab Superíndices con letras diferentes son significativamente diferentes (p<0.05)

Se encontró diferencia estadística significativa (p<0.05) entre los dilutores por encontrarse mejor respuesta en el de trealosa, en términos de motilidad y porcentaje de vivos postdescongelamiento.

Es posible que el deterioro en la motilidad se haya debido a la distancia entre el lugar de muestreo y el lugar de procesamiento de las muestras, así como el manejo de los eyaculados;

La ventaja de la trealosa se basa en el efecto protector estabilizante de la membrana celular, lo cual se refleja en la integridad acrosomal. Además, tiene un efecto deshidratante por ser un medio hipertónico, resultando en una menor formación de cris tales.

ConclusionesEstudio Congelación semen Descongelación semen

Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes.

Las pajillas fueron congeladas con los vapores de nitrógeno líquido; para tal efecto, se disminuyó la temperatura de 5 a -25 °C en un lapso de 6 minutos y finalmente fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-196 ºC). 

Se sumergieron las pajillas en agua temperada a 37 °C por 10 segundos.

Congelación de semen de carnero en pellets con los diluyentes Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo. 

5 °C congelaron e introducción en nitrógeno líquido.

Baño María a una temperatura de 37ºC durante 10 a 15 segundos.

Uso de dilutores hipertónicos en la criopreservación de semen ovino 

Rango de enfriamiento para el semen fue de 50-60 ºC/min.La congelación del semen se hizo en un tanque de nitrógeno líquido.  

Recipiente con agua a 37 ºC por 60 segundos.

Estudio Criopreservante / Diluyente

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos con 

acrosoma intacto

termoresistencia Integridad de la membrana

Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes.

Glicerol + Trehalosa 64.1 ± 4.8 57.8 ± 6.9 40.4 ± 4.4 62.7 ± 2.8

Congelación de semen de carnero en pellets con los diluyentes Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo. 

Lactosa-yema de huevo

40.2

Uso de dilutores hipertónicos en la criopreservación de semen ovino 

Tris-Trealosa 40.3 ± 5.9 34.4 ± 6.6

Recomendación

Mejor motilidad progresiva. Mayor proporción de espermatozoides vivos con acrosoma intacto. La trehalosa es un protector específico de las membranas

espermáticas que, como resultado de su interacción con los fosfolípidos, puede unirse con el hidrógeno de las cabezas fosfolipídicas de la membrana, de una manera mas fuerte que el glicerol (Foote et al., 1993). Además, posee una acción crioprotectora relacionada al efecto osmótico, que protege al espermatozoide del congelamiento (Aisen et al., 2002).

Células espermáticas del efecto de la criopreservación.

Estudio Criopreservante / Diluyente

Motilidad progresiv

a

Espermatozoides vivos con

acrosoma intacto

termoresistencia

Integridad de la

membrana

Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes.

Glicerol + Trehalosa

64.1 ± 4.8 57.8 ± 6.9 40.4 ± 4.4 62.7 ± 2.8

Referencias bibliográficas Rocío Sandoval M; Alexei Santiani A; Luis Ruiz G; Víctor Leyva V;

Luis Coronado S; Alfredo Delgado C. Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes. Rev. investig. vet. Perú v.18 n.2 Lima jul./dic. 2007.

Brito, F. I.; Valencia, M. J.; Balcázar, S. A.; Angulo, M. R. y Mejía, V. O. Congelación de semen de carnero en pellets con los diluyentes Tris-glucosa-yema de huevo o Lactosa-yema de huevo. Rev. Avances en investigación agropecuaria. México.

Hernán Guerrero V., Wilfredo Huanca L., Fernando Raymundo T., Sandra Huerta O.y Daphne Ramos D. Uso de dilutores hipertónicos en la criopreservación de semen ovino. Rev Inv Vet Perú 2009; 20 (1): 41-46

Gracias por la atención prestada.

Dios Les

Bendiga…