Seminar Nasional Tahunan IX Hasil Penelitian Perikanan dan ... filekarakterisasi sifat-sifat fenotipik yang berbasis kultur, observasi terhadap profil asam lemak, dan pengujian sifat

Semnaskan _UGM / Penyakit Ikan & Lingkungan (pPL-09) - 1

Seminar Nasional Tahunan IX Hasil Penelitian Perikanan dan Kelautan, 14 Juli 2012

ANALISIS KERAGAMAN MORFOLOGI DAN FISIOLOGI ISOLAT-ISOLAT Vibrio BERPENDAR ASAL TAMBAK DAN PEMBENIHAN UDANG WINDU

Endang Susianingsih*, Ince A. K. Kadriah dan Koko Kurniawan

Balai Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya Air Payau. Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129 Maros.90511

*Penulis untuk korespondensi, E-mail: [email protected]

Abstrak

Pendekatan karakterisasi, dan identifikasi bakteri Vibrio berpendar antara lain didasarkan pada karakterisasi sifat-sifat fenotipik yang berbasis kultur, observasi terhadap profil asam lemak, dan pengujian sifat patogenisitas bakteri. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman morfologi dan fisiologi isolat-isolat vibrio berpendar asal tambak dan pembenihan udang windu. Karakteristik morfologi yang diamati adalah bentuk, warna, bau dan kemampuan pendaran koloni. Pada uji biokimia setiap spesies dikarakterisasi berdasar atas kemampuan fisiologisnya. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bakteri Vibrio berpendar memiliki karakteristik morfologi warna koloni hijau, bentuk koloni bundar dengan elevasi cembung dan dapat memendarkan cahaya bila diamati di ruang gelap. Dari hasil uji biokimia diperoleh hasil beberapa strain (galur) dari V. harveyi mampu mereduksi lisin dan ornitin, tetapi tidak terhadap arginin. Semua isolat V. harveyi memiliki kemampuan berpendar (bioluminescence), menghasilkan asam dari kellobiosa, glukosa dan dapat mereduksi nitrat dengan Voges-Proskauer (VP) negatif (Austin & Austin 1993). Sedangkan beberapa isolat V. mimicus dapat memproduksi enzim amylase namun sebagian lagi tidak, tidak dapat menghasilkan asam propionat dan kellubiosa.

Kata kunci: udang windu, uji biokimia, Vibrio berpendar

Pengantar

Kejadian serangan vibriosis yang sering mematikan benur pada panti-panti pembenihan secara massal biasanya diawali dengan fenomena air bercahaya. Pendaran cahaya yang terlihat di air dan di benur disebabkan adanya infeksi bakteri Vibrio berpendar. Bakteri Vibrio berpendar ini biasanya menyerang sistem pembenihan baik telur, larva maupun lingkungan pemeliharaan (Baticados et al., 1990). Populasi bakteri Vibrio yang sudah mencapai quorum bisa berubah sifatnya dari saprofit menjadi patogen dan kemudian bersepakat untuk bersama-sama “menyalakan lampu (biolumenescence)” sambil melepaskan toxin yang dapat mematikan hewan budidaya dengan cepat.

Pada studi mengenai infeksi bakteri patogen terhadap hewan budidaya, kegiatan pertama yang biasa dilakukan jika terjadi serangan adalah melakukan analisis gejala klinis hewan budidaya yang terserang penyakit. Setelah itu dilanjutkan dengan analisis patologi anatomi. Analisis ini penting untuk mengetahui jenis bakteri yang menyerang dari ciri-ciri morfologi udang yang terserang maupun ciri-ciri morfologi koloni bakteri yang diisolasi dari air, sedimen dan udang sakit. Analisis lebih lanjut dapat dilakukan dengan melakukan uji histopatologi terhadap jaringan dari organ udang sakit.

Ciri-ciri udang yang terserang vibriosis antara lain kondisi tubuh lemah, berenang lambat, nafsu makan hilang, badan mempunyai bercak merah-merah (red discoloration) pada pleopoda dan abdominal (perut) serta pada malam hari terlihat menyala. Udang yang terkena vibriosis akan menunjukkan gejala nekrosis (Karunasagar, 1994). Tujuan penelitian ini untuk mengamati karakteristik morfologi dan fisiologi dari isolat bakteri Vibrio berpendar

pPL-09

2 - Semnaskan _UGM / Penyakit Ikan & Lingkungan (pPL-09)


Bahan dan Metode Bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk mengisolasi bakteri dari sampel air dan tanah tambak adalah: media TSA (Tryptic Soy Agar), media TCBS (Tio Citrat Bile Sucrose) agar, larutan fisiologis (Benson 1985). Sampel air dikoleksi dengan menggunakan botol steril kemudian dibawa ke laboratorium. Sedangkan sampel sedimen diambil menggunakan sudip steril dan dibawa ke laboratorium menggunakan botol steril. Bakteri juga diisolasi dari benur sakit yang digerus kemudian dikultur pada media agar-agar. Metode

Koloni bakteri berpendar yang tumbuh pada media TSA (Difco) dalam cawan petri kemudian dimurnikan dengan cara ditanam kembali pada media TCBSA (Difco) dalam cawan petri serta pada media TSA (Tryptic Soy Agar) dalam tabung reaksi dengan metode gores dan diinkubasi pada suhu 280C.

Isolat terpilih kemudian diamati karakter morfologinya dengan mengamati bentuk koloni, warna, bau dan kemampuan berpendarnya. Seleksi awal isolat bakteri dilakukan berdasarkan pertumbuhan dan kemampuan pendarannya. Isolat bakteri yang tetap dapat tumbuh dengan baik serta tetap berpendar setelah diremajakan kemudian dipilih untuk uji selanjutnya.

Uji biokimia dilakukan berdasarkan metode yang dilakukan oleh Austin (1991); Austin & Austin (1993); Alsina & Blanch (1994); Baumann et al. (1994); Brock et al. (1994); Muir (1996a). Untuk menentukan spesies dari bakteri Vibrio berpendar, data hasil uji biokimia yang diperoleh diolah dengan menggunakan perangkat lunak Fortran Computer Program (Muir, 1996b).

Hasil dan Pembahasan

Proses isolasi bakteri Vibrio yang dilakukan dari sampel benur sakit, sedimen tambak, air tambak dan air laut di sekitar Sulawesi Selatan, Banyuwangi dan Bali menghasilkan 55 isolat Vibrio berpendar. Koloni tunggal isolat Vibrio ditumbuhkan pada media agar TSA miring dan disimpan pada suhu 37oC. Selama proses isolasi bakteri yang memakan waktu kurang lebih enam bulan, hanya ada 35 isolat yang dapat terus tumbuh dengan baik tanpa mengalami kontaminasi dan perubahan morfologi (Tabel 1). Bakteri hasil isolasi ditumbuhkan pada media selektif Vibrio (TCBSA) untuk diamati karakteristik morfologinya. Terdapat koloni bakteri hijau dan kuning dengan bentuk bundar, tidak beraturan, elevasi cembung dan agak rata, tepian licin dan berlekuk (Gambar 1). Koloni bakteri yang berwarna hijau ada yang berpendar dan tidak, sedangkan koloni bakteri yang berwarna kuning tidak ada yang berpendar.

Morfologi koloni bakteri Vibrio patogen yang menyerang pada kasus Vibriosis umumnya berwarna hijau (green colony) jika ditumbuhkan di media agar-agar TCBS dengan bentuk koloni bulat, cembung mengkilap, elevasi rata dan terlihat memendarkan cahaya bila diamati di ruang gelap (Gambar 1). Menurut penelitian Moriarty (1998) tambak udang di Indoensia yang tidak menggunakan probiotik mengalami kematian masal pada hampir semua unit dengan adanya serangan bakteri Vibrio berpendar. Bakteri Vibrio berpendar ini membunuh udang sebelum mencapai 80 hari masa pemeliharaan.

Penelitian yang dilakukan Liu et al. (1996) pada tambak udang kuruma (P. japonicus) di Taiwan berhasil mengisolasi bakteri Vibrio berpendar dari hepatopankreas udang yang mengalami kematian masal. Dari hasil identifikasi dan karakterisasi diketahui bahwa bakteri yang menyerang adalah V. harveyi. Alapide-Tendencia & Dureza (1997) menemukan V. harveyi dan V. parahaemolyticus sebagai dua spesies utama penyebab penyakit Vibriosis yang menyerang udang windu di Philipina. Bakteri Vibrio berpendar juga ditemukan menyerang benur udang di panti pembenihan di Tamil Nadu, India (Abraham & Palaniappan, 2004).

Pengujian secara biokimia menggunakan 25 macam uji untuk melihat kemampuan fisiologi bakteri dalam memetabolisme asam amino dan kemampuan tumbuhnya pada beberapa kondisi tumbuh. Dari hasil uji biokimia diperoleh hasil 26 isolat diidentifikasi sebagai V.harveyi, 5 isolat diidentifikasi sebagai V. mimicus, 1 isolat diidentifikasi sebagai V. campbelli dan 3 isolat lainnya



baru teridentifikasi sebagai V. harveyi atau V. mimicus (Tabel 2). Tidak ada spesies lain yang teridentifikasi selain V. harveyi, V. campbelli dan V. mimicus. Uji identifikasi spesies secara molekuler dilakukan untuk 12 isolat yang mewakili semua daerah sampling serta isolat yang terbukti patogen berdasarkan uji patogenisitas. Hal ini dilakukan setelah mengamati hasil identifikasi spesies menggunakan uji biokimia ternyata tidak mampu membedakan secara jelas antara V. harveyi dengan V. parahaemolyticus dan V. campbelli.

Gambar 1 Karakterisasi morfologi bakteri Vibrio patogen pada media TCBSA.

Keterangan: A. V. harveyi; B. V. campbelli; C. V. parahaemolyticus dan D. V. mimicus.

B A

C D



Tabel 1 Isolat-isolat bakteri hasil koleksi.

Asal Daerah Jenis Sampel

By-1 Banyuwangi Benur sakit Nb-2 Negara-Bali Benur sakit Gb-3 Gondol-Bali Benur sakit T-109 Takalar Air tambak T-110 Takalar Air tambak T-111 Takalar Air tambak M-112 Maros Sedimen tambak M-114 Maros Air Laut M-115 Maros Air tambak M-116 Maros Air tambak M-119 Maros Air tambak M-120 Maros Air tambak M-128 Maros Air tambak M-130 Maros Air tambak M-133 Maros Air tambak M-137 Maros Air tambak M-139 Maros Air tambak M-144 Maros Air tambak M-145 Maros Air tambak M-154 Maros Air tambak M-159 Maros Air tambak T-671 Takalar Air tambak T-672 Takalar Air tambak T-673 Takalar Air tambak T-675 Takalar Air tambak T-676 Takalar Air tambak M-5575 Maros Air tambak M-5582 Maros Sedimen tambak M-5584 Maros Sedimen tambak M-5585 Maros Sedimen tambak T-168 Takalar Air tambak T-170 Takalar Air tambak T-173 Takalar Air tambak P-275 Pinrang Air tambak P-276 Pinrang Sedimen tambak



Tabel 2. Hasil uji biokimia beberapa isolat bakteri Vibrio berpendar. Uji Biokimia Kode Isolat

By-1 Nb-2 Gb-3 M-109 M-110 M-111 M-112 M-114 M-115 M-116 Swarming − − − − − − − − − − Luminescence ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ VP Test − − − − − − − − − − Arginine Dihydr − − − − ₊ − − − − − Gas Form Glucose

− − − − − − − − − −

Growth at 400C

− ₊ − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

Lysine decarb ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ ₊ Pigmentation − − − − − − − − − − Amylase ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Sucrose ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ − − − − Indole − − − ₊ − − − − − − Ornithine Decarb ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ −

Putrescine − − − − − − − − − − Ethanol − − − − − − − − − − Serine ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ − Heptanoate ₊ ₊ ₊ − − − − − − − Xanthine ₊ − ₊ − − − − − − − Aminobutyrate − − − − − − − − − − Arabinose − − − − − − − − − − Cellubiose − − − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Glucoronate − − − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Ketoglutarate ₊ ₊ − − − − − − − − L-alanine − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − Leucine ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ Propionate − − − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − Species V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.mimi Keterangan : + = Terjadi reaksi positif - = Tidak terjadi reaksi positif V. harv = Vibrio harveyi V. mimi = Vibrio mimicus



Tabel 2. Hasil uji biokimia beberapa isolat bakteri Vibrio berpendar (lanjutan). Uji Biokimia Kode Isolat

M-120 M-128 M-130 M-133 M-137 M-139 M-144 M-145 M-154 M-159

Swarming − − − − − − − − − − Luminescence ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ VP Test − − − − − − − − − − Arginine Dihydr − − − − − − − − − − Gas Form Glucose

− − − − − − − − − −

Growth at 400C

₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

Lysine decarb ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Pigmentation − − − − − − − − − − Amylase ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ Sucrose − − − − − − − − − − Indole − − − − − − − − − − Ornithine Decarb

₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

Putrescine − − − − − − − − − − Ethanol − − − − − − − − − − Serine ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Heptanoate − − − − − − − − − − Xanthine − − − − − − − − − − Aminobutyrate − − − − − − − − − − Arabinose − − − − − − − − − − Cellubiose ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ - ₊ Glucoronate ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Ketoglutarate − − − − − − − − − − L-alanine ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Leucine ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Propionate ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ - ₊ Species V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.harv V.mimi V.harv V.mimi V.harv Keterangan: + = Terjadi reaksi positif - = Tidak terjadi reaksi positif V. harv = Vibrio harveyi V. mimi = Vibrio mimicus



Tabel 2. Hasil uji biokimia beberapa isolat bakteri Vibrio berpendar (lanjutan). Uji Biokimia Kode Isolat

M-672 M-673 M-675 M-676 M-5575 M-5582 M-5584 M-5585

Swarming − − − − − − − − Luminescence ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ VP Test − − − − − − − − Arginine Dihydr − − − − ₊ − − − Gas Form Glucose

− − − − − − − −

Growth at 400C ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Lysine decarb ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Pigmentation − − − − − − − − Amylase − ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Sucrose − − − − − − − − Indole − − − − − − − − Ornithine Decarb

₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊

Putrescine − − − − ₊ − − − Ethanol − − − − − − − − Serine ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ Heptanoate − − − − − − − − Xanthine − − − − − − − − Aminobutyrate − − − − ₊ − − − Arabinose − − − − − − − − Cellubiose ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ Glucoronate ₊ ₊ ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ Ketoglutarate − − − − − − − − L-alanine ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − Leucine − − ₊ ₊ − ₊ ₊ ₊ Propionate ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ − − Species V. harv V.harv V.mimi/harv V.harv V.camp V.harv V.mimi/harv V.mimi/harv Keterangan :

+ = Terjadi reaksi positif V. camp = Vibrio campbelli - V. harv V. mimi

= = =

Tidak terjadi reaksi positif Vibrio harveyi Vibrio mimicus

V. harv/V. mimi

= Baru teridentifikasi pada level sebagai Vibrio mimicus atau Vibrio harveyi



Tabel 2. Hasil uji biokimia beberapa isolat bakteri Vibrio berpendar (lanjutan).

Keterangan :

Pengujian secara biokimia diperlukan untuk mengetahui ciri-ciri fisiologis dari isolat

bakteri dan untuk identifikasi spesies. Hasil pengujian yang disajikan pada Tabel 2 menunjukkan bahwa masing-masing jenis bakteri mempunyai sifat biokimiawi yang berbeda satu sama lain. Beberapa strain (galur) dari V. harveyi mampu mereduksi lisin dan ornitin, tetapi tidak terhadap arginin. Semua isolat V. harveyi memiliki kemampuan berpendar (bioluminescence), menghasilkan asam dari kellobiosa, glukosa dan dapat mereduksi nitrat dengan Voges-Proskauer (VP) negatif (Austin & Austin 1993). Sedangkan beberapa isolat V. mimicus dapat memproduksi enzim amylase namun sebagian lagi tidak, tidak dapat menghasilkan asam propionat dan kellubiosa.

Kesimpulan

Bakteri Vibrio patogen memiliki karakteristik morfologi warna koloni hijau bentuk bundar, elevasi cembung dengan tepian licin serta berpendar dalam kondisi gelap. Beberapa strain (galur) dari V. harveyi mampu mereduksi lisin dan ornitin, tetapi tidak terhadap arginin,

Uji Biokimia Kode Isolat

T-168 T-170 T-173 P-275 P-276

Swarming − − ₊ − − Luminescence ₊ ₊ ₊ ₊ ₊

VP Test − − − − − Arginine Dihydr − − − − −

Gas Form Glucose − − − − − Growth at 400C ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Lysine decarb ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Pigmentation − ₊ ₊ ₊ −

Amylase ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Sucrose − ₊ − − − Indole − − − − −

Ornithine Decarb ₊ ₊ ₊ ₊ − Putrescine − − − − −

Ethanol − − − − − Serine ₊ − ₊ ₊ −

Heptanoate − − ₊ ₊ − Xanthine − − − − −

Aminobutyrate − − − − − Arabinose − − − − − Cellubiose ₊ ₊ ₊ ₊ −

Glucoronate ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ Ketoglutarate − − − − −

L-alanine ₊ ₊ ₊ ₊ − Leucine ₊ − − − ₊

Propionate ₊ ₊ ₊ ₊ − Species V.harv V.harv V.harv V.harv V.mimi

+ = Terjadi reaksi positif - = Tidak terjadi reaksi positif V. harv = Vibrio harveyi V. mimi = Vibrio mimicus



memiliki kemampuan berpendar (bioluminescence), menghasilkan asam dari kellobiosa, glukosa dan dapat mereduksi nitrat dengan Voges-Proskauer (VP) negatif. Daftar Pustaka Abraham, T.J. & R. Palaniappan. 2004. Distribution of luminous bacteria in semi-intensive

penaeid shrimp hatcheries of Tamil Nadu, India. Aquaculture 232: 81–90. Alsina, M. & A.R. Blanch. 1994. A set of keys for biochemical identification of environmental

Vibrio species. J Appl Bacteriol 76: 79-85. Alapide-Tendencia, E.V. & L.A. Dureza. 1997. Isolation of Vibrio spp. from Penaeus monodon

(Fabricius) with red disease syndrome. Aquaculture 154:107–114. Austin, B. 1991. Methods in Aquatic Bacteriology. John Wiley and Sons. Chichester. New York.

Brisbane. Toronto. Singapore. 425 pp. Austin, B. & D.A. Austin. 1993. Bacterial Fish Pathogens. Disease in Farmed and Wild Fish.

Second edition. New York. London. Baticados M.C.L., C.R. Lavilla-Pitogo, E.R. Cruz-Lacierda, L.D. de la Pena & N.A. Sunaz. 1990.

Studies on the chemical control of luminous bacteria Vibrio harveyi and V. splendidus isolated from diseased Penaeus monodon larvae and rearing water. Dis Aqua Org 9: 133-139.

Baumann, P., A.L. Furniss & J.V. Lee. 1994. Facultative anaerobic gram negative rods. In JG

Holt, NR Krieg, PHA Sneath, JT Staley and ST Wilins (Eds.), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore: The William and Wilkins.

Benson, H.J. 1985. Microbiological Applications: A.Laboratory Manual in General Microbiology.

Fourth Edition. Dubuque: Wm. C. Brown Publishers. Brock, T.D., M.T. Madigan, J.M. Martinko & J. Parker. 1994. Biology of Microorganism. Seventh

Edition. Prantice Hall International, Inc. Karunasagar, I., R. Pai, G.R. Malathi & I. Karunasagar. 1994. Mass mortality of Penaeus

monodon larvae due to antibiotic-resistant Vibrio harveyi infection. Aquaculture, 128:203–209.

Liu, P.C., K.K. Lee & S.N. Chen. 1996. Pathogenicity of different isolates of Vibrio harveyi in tiger prawn, Penaeus monodon. Lett Appl Microbiol 22 : 413-416.

Muir, P. 1996a. Media Used in Vibrio and Photobacterium Identification. Australia: Department of Microbiology, Biomedical and Tropical Veterinary Sciences. James Cook University of North Queensland.

Muir, P. 1996b. Identification of Vibrio and Pseudomonas Bacteria. Australia: Department of Microbiology, Biomedical and Tropical Veterinary Sciences. James Cook University of North Queensland.

Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds.

Aquaculture 168: 351-358.

Tanya Jawab

-

Documents

Seminar Nasional Tahunan IX Hasil Penelitian Perikanan dan ... filekarakterisasi sifat-sifat fenotipik yang berbasis kultur, observasi terhadap profil asam lemak, dan pengujian sifat