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Seminarios en Biotecnología y
Bioseguridad de OGMs
Agro-infiltración (expresión transitoria por
transformación de Agrobacterium)
Dra. Rocío Díaz de la Garza
ITESM
14 de noviembre de 2014
10:00 a 12:00 Hrs
TRANSFORMACIÓN ESTABLE vs
TRANSITORIA EN PLANTAS UNA TRANSFORMACIÓN ESTABLE SIGNIFICA QUE ES HEREDABLE PARA QUE ESTO SUCEDA, EL ADN FORÁNEO DEBE DE INTEGRARSE AL GENOMA NUCLEAR O AL DEL CLOROPLASTO DE LAS CÉLULAS GERMINALES EN UNA TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EL ADN FORÁNEO NO SE INTEGRA AL GENOMA DE LA CÉLULA EN TODOS SUS TEJIDOS (ÓVULOS O POLEN)
¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA
EN PLANTAS?
A. ADN (ácido desoxirribonucleico)
B. mARN (ácido ribonuleico mensajero)
C. tARN (transferencia) D. Ribosoma E. Proteína
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
Las proteínas pueden ser estructurales o pueden ser enzimas (catalizadores biológicos) que generen compuestos de interés
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN
TRANSITORIA EN PLANTAS?
Aún si el ADN no se integra al núcleo en todos los tejidos, éste puede leerse para generar proteínas de interés en la célula vegetal por un corto tiempo Estas proteínas por lo general son de alto valor (farmacia) También esta transformación es muy rápida (toma días expresar una proteína) y en el laboratorio es una técnica muy útil para estudiar múltiples aspectos de la biología vegetal desde el punto de vista científico
TRANSCRIPCIÓN
TRADUCCIÓN
TRANSFORMACIÓN VEGETAL
• DOS TÉCNICAS BÁSICAS
– AGROBACTERIUM (TUMEFACIENS o RHIZOGENES) • Transfiere el ADN a la célula vegetal y puede dar
transformantes estables o transientes dependiendo del método de transformación
– BIOBALÍSTICA • Utiliza micropartículas de oro o tugnsteno cubiertas
de ADN y las dispara al tejido vegetal • Genera transformantes estables cuando el ADN se
incorpora al genoma del núcleo o cloroplasto de la célula
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
• Bacteria fitopatógena que se encuentra usualmente en suelos y causa la enfermedad conocida como agalla de corona en las plantas
• Esta bacteria tiene la habilidad de transferir genes a las plantas para que éstas produzcan metabolitos que benefician a la bacteria
Agrobacterium tumefaciens
Agalla de corona
TRANSFERENCIA DE ADN DEL
AGROBACTERIUM A LA PLANTA
Los genes que normalmente transfiere son para que la planta genere compuestos que sirven de alimento al Agrobacterium y además genes que ocasionan un crecimiento indeterminado de la célula vegetal
USO DEL AGROBACTERIUM EN
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Estos genes de la bacteria se cambian
por los de interés
Ti = Tumor- inducing plasmid
Así, el Agrobacterium le puede transferir a la célula vegetal genes de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano, etc.)
¿Cómo se genera una transformación
estable?
• A través de cultivo de tejidos in vitro – Se infectan tejidos de la planta con el Agrobacterium que
contiene nuestro gen de interés y otro de resistencia a un herbicida/antibiótico
– Se cultivan los tejidos in vitro y se induce la formación de una planta con el uso de fitohormonas
Planta resistente al herbicida/antibiótico Alta posibilidad de que esté transformada de manera estable (sus semillas serán transgénicas y generarán plantas transformadas también)
¿Cómo se genera una transformación
transitoria?
• También se utiliza Agrobacterium
• Pero no hay regeneración de una planta completa
• Se realiza por medio de infiltración del Agrobacterium a la célula vegetal
• Usualmente se utilizan vectores virales para tener más proteína acumulada en los tejidos de la planta
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
USO DE VECTORES VIRALES
Las primeras transformaciones transitorias tomaron ventaja de la capacidad de los virus de viajar a través de la planta (movimiento sistémico) para que así se expresara el transgén en la planta entera
Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007
COMPOSICIÓN GENÉTICA DE UN
VECTOR DE VIRUS COMPLETO
VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO (TMV siglas en inglés)
Vectores basados en el virus P - Promotor TMV Pol – RNA- dependiente RNA polimerasa para la producción del mensajero MP – Proteína de mobilidad GOI – Gen de interés CP – Proteína de la cápside T - terminador
Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004
Nota: estos virus utilizados son fitopatógenos, es decir no representan ningún riesgo para la salud
humana, sólo infectan plantas
TIENE LA CAPACIDAD DE REPLICARSE EN LA PLANTA Y FORMAR
PARTÍCULAS VIRALES
VECTORES VIRALES
• Las plantas se infectan ya desarrolladas con virus que expresan nuestro gen de interés
• Los virus se pueden mover sistémicamente a través de la planta – Se infecta una célula
vegetal
– El virus se mueve de célula a célula a través del plasmodesmata (canales de comunicación que existen en células vegetales)
Zhang et al., Plant Methods 2013
Virus del mosaico del narciso utilizado como vector para producir
antocianinas
VECTORES VIRALES
“DECONSTRUIDOS”
• La desventaja de utilizar virus completos es que la planta emplea muchos recursos en sintetizar las proteínas de la cápside viral
• Así, se empezaron a modificar estos vectores para que ya no la expresaran
Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004
X X
VECTORES VIRALES “DECONSTRUIDOS”
Marillonnet et al., Nat Biotech 2005
Aumentos en eficiencia de
transfección y en los niveles de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP)
Marillonnet et al., Nat Biotech 2005
Además se han hecho otros cambios en la secuencia de los vectores para que tuviera mejor expresión de los genes en la célula vegetal
VECTORES DECONSTRUIDOS
PARA INFILTRACIÓN • magnICON® - Vectores producidos por Icon Genetics
(compañía alemana). Son los más utilizados para las “magninfecciones” con Agrobacterium. Este sistema está basado en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus X de la papa
• Sistema de replicación de ADN geminiviral. Está basado en el virus del mosaico enano amarillo del frijol (BeYDV)
• Sistema de replicación basado en el virus del mosaico del caupí (CPMV)
Vectores virales
deconstruídos
Chung et al., 2005
Estas mejoras han dado como resultado que se necesite menos concentración de Agrobacterium para infectar con mayor eficiencia la planta y una mayor expresión de las proteínas de interés
Más células transfectadas
DIFERENCIAS EN EXPRESIÓN DE VECTORES
VIRALES COMPLETOS Y DECONSTRUIDOS
Las partículas virales completas viajan a través del floema de la planta hacia tejidos jóvenes
Infectando con Agrobacterium que contiene los vectores deconstruidos (que inclujyen una proteína de movilidad), en una semana se cubre casi toda la superficie foliar
Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007
AGROINFILTRACIÓN
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
A nivel laboratorio se puede hacer con una jeringa A. Primero se realiza una pequeña herida en el envés de la hoja (en la figura
se muestran hojas de Nicotiana benthamiana de plantas de 6 semanas) B. Luego se agrega la solución del Agrobacterium tumefaciens ya
modificado con el vector viral y el gen de interés utilizando una jeringa sin aguja a través de la herida en los espacios intracelulares de la hoja
AGROINFILTRACIÓN DE PLANTA COMPLETA
UTILIZANDO VACÍO
Loh&Wayah, Asian Journal of Biotechnology, 2014
La aplicación del vacío fuerza la formación burbujas de aire fuera de los estomas, entonces cuando se libera, entra con mayor facilidad del Agrobacterium por los estomas (orificios en las plantas en donde se realiza el intercambio de gases)
Al sumergir toda la planta en una solución diluida del Agrobacterium, y aplicar vacío se busca que entren miles de células en todas las
hojas de la planta
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
FLUORESCENTE DESPUÉS DE
LA AGROINFILTRACIÓN
JERINGA
VACÍO
ASPERJADO DE SOLUCIÓN DE
AGROBACTERIUM
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
COMPAÑÍAS PRODUCTORAS DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES EN PLANTAS
Produce vacunas y proteínas terapéuticas en plantas a través de la expresión transiente Prueba clínica fase II en vacuna contra la influenza H5N1 Va a empezar fase II en vacuna tetravalente contra H1N1, H3N2 y dos influenzas B
http://www.medicago.com/English/Technologies/medicago-technologies/default.aspx
ZMAPP – COCTEL DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES CONTRA EL ÉBOLA PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS DISEÑADAS POR MAPP BIOPHARMACEUTICAL, COMPAÑÍA QUE CONTRATÓ A KENTUCKY BIOPROCESSING PARA PRODUCIRLAS EN PLANTAS DE TABACO TRANSFORMADAS DE FORMA TRANSIENTE COMO RESPUESTA AL CONTAGIO DE TRABAJADORES ESTADOUNIDENSES Y ESPAÑOLES EN AFRICA, SE LES PROPORCIONÓ EL SUERO EXPERIMENTAL COMO TRATAMIENTO
OTRAS VACUNAS
Y PROTEÍNAS
TERAPÉUTICAS EN
DESARROLLO
Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013
ENSAYOS PRECLÍNICOS DE PROTEÍNAS GENERADAS EN
PLANTAS AGROINFILTRADAS CON VECTORES VIRALES
Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013
VENTAJAS DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
TERAPÉUTICAS EN PLANTAS vs. CÉLULAS DE MAMÍFERO
COSTOS DE PRODUCCIÓN RENDIMIENTO RAPIDEZ EN EXPRESIÓN RAPIDEZ EN MANUFACTURA
Sistema de expresión Tiempo para obtener miligramos de anticuerpo
Tiempo para obtener gramos de anticuerpo
Cultivo de células de mamífero
2-6 meses 6-12 meses
Animales transgénicos > 12 meses > 12 meses
Plantas transgénicas estables
12 meses > 24 meses
Magnifection (expresión transitoria con magnICON®)
14 días 14-20 días *datos traducidos de PNAS 2006, 103:14645
AGROSPRAY
• Tecnología desarrollada por Nomad Bioscience GmbH, donde se asperja Agrobacterium con surfactantes (detergentes)
• Esta tecnología está en etapas tempranas, pero tiene gran potencial en agricultura y manufactura de biomateriales
• En agricultura se podría “reprogramar” transitoriamente un cultivo para ser resistente a plagas, a estrés abiótico o mejorar la producción de compuestos
• Las plantas no serían transgénicas y sólo se tendría que comprar el producto a asperjar
Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013
Esta técnica de transformación transitoria está desarrollándose y representa un potencial para mejorar cultivos en
invernadero o en el campo. Se tendría que crear un marco regulatorio para liberar Agrobacterium transformado (en el
caso de asperjar en campo)
REGULACIÓN
• Todavía no existe un producto de expresión transitoria de plantas aprobado por alguna agencia regulatoria
• Hay discusiones preliminares en cómo regular estas plantas modificadas para su expresión transitoria y cómo manejar los productos de éstas
• Aun no existen guías claras sobre su regulación
• La agroinfiltración está considerada como una técnica nueva de mejoramiento vegetal en la mayoría de los foros
TALLER DE REGULACIÓN ORGANIZADO POR LA UNIÓN
EUROPEA 2012 (JRC- Joined Research Center)
PARTICIPARON DELEGACIONES DE ARGENTINA, AUSTRALIA, CANADÁ, JAPÓN, ESTADOS UNIDOS Y SUDÁFRICA
Agroinfiltración de flores: Puede llegar a
dar plantas transformadas
• Se utiliza en el laboratorio muy comunmente para transformar Arabidopsis, la planta modelo
• En otras plantas es difícil utilizar esta técnica
• Se transforman células germinales y las semillas pueden llevar el transgén
Arabidopsis thaliana — photo by Vijay Singh
Procedimiento
Zang et al., Nat Protocols 2006
Se sumergen las plantas con inflorescencias en medio con Agrobacterium diluido (se puede aplicar vacío) Se dejan desarrollar y se colectan las semillas Además del transgén de interés se añade un gen de resistencia para poder seleccionar las semillas transgénicas, que son las que germinan y sobreviven No son necesarios los vectores virales
CONCLUSIONES
La transformación transitoria de plantas con vectores de base viral es capaz de producir proteínas de alto valor en grandes cantidades y en corto tiempo
En Norteamérica y Europa se han logrado desarrollos pre-comerciales importantes, los cuales incluyen pruebas de proteínas terapéuticas y vacunas en humanos en fase I
La tecnología está a poco tiempo de tener productos aprobados por las agencias regulatorias
Variantes de la transformación transitoria por agroinfiltración se están probando para mejorar agronómicamente plantas bajo cultivo protegido y en campo abierto
Es necesario un marco regulatorio basado en un análisis de bioseguridad que permita el desarrollo de estas tecnologías en el país