SERVICE PUBLIC FEDERAL SANTE PUBLIQUE,SECURITE DE … · Rapport global Page 1 sur 85 Microbiologie 2003/1 I. REMARQUES GENERALES Pour la première enquête du cycle 2003 (enquête

I.S.P. - LPRue Juliette Wytsman 14B - 1050 BRUXELLES

ISSN 0778 - 8363

SERVICE PUBLIC FEDERALSANTE PUBLIQUE,SECURITE DE LA CHAINE ALIMENTAIRE ET ENVIRONNEMENT

COMMISSION DE BIOLOGIE CLINIQUE

SERVICE DES LABORATOIRES DE BIOLOGIE CLINIQUECOMITE D’EXPERTS

EVALUATION EXTERNE DE LA QUALITEDES ANALYSES EN BIOLOGIE CLINIQUE

RAPPORT GLOBAL

MICROBIOLOGIE / SEROLOGIE / PARASITOLOGIE

ENQUETE 01/2003

Ce rapport ne peut être reproduit, publié ou distribué sans l’accord de l’I.S.P.

ISP-LP/01/03/Micro./Séro./ Para. 51

Microbiologie (identification)Enterococcus faeciumNeisseria gonorrhoeaeBacillus cereusSalmonella berta

ParasitologieLoa loa

SérologieCMVEBVToxoplasme

COMITE D’EXPERTS EN MICROBIOLOGIE / SEROLOGIE

ISP-LP (secrétariat) : 02/642.55.21 - FAX : 02/642.56.45Dr Kris VERNELEN : 02/642.55.29 - FAX : 02/642.56.45

E-mail : [email protected]

Dr BODEUS Monique : 02/764.34.20 - FAX :E-mail : [email protected]

Dr CLAEYS Geert : 09/240.36.45 - FAX : 09/240.36.59E-mail : [email protected]

Dr CROKAERT Françoise : 02/541.37.00 - FAX : 02/541.32.95E-mail : [email protected] et [email protected]

Pharm CRUCITTI Tania : 03/247.65.52 - FAX : 03/247.64.40E-mail : [email protected]

Dr DE BEENHOUWER Hans : 02/582.76.27 - FAX : 053/72.42.72E-mail : [email protected]

Dr DE GHELDRE Yves : 081/42.32.00 - FAX : 081/42.32.04E-mail : [email protected]

Dr DEDISTE Anne : 02/538.54.21 - FAX : 02/535.45.30E-mail : [email protected]

Dr DELFORGE Marie-Luce : 02/555.34.53 - FAX : 02/555.64.59E-mail : [email protected]

Dr JADIN Jean-Marie : 064/23.40.81 - FAX : 064/23.38.47E-mail :

Pharm LONTIE Marc : 016/31.01.72 - FAX : 016/31.01.88E-mail : [email protected]

Dr LUYASU Victor : 010/43.74.63 - FAX : 02/653.91.20E-mail : [email protected]

Dr MAGERMAN Koen : 011/30.97.40 - FAX : 011/30.97.50E-mail : [email protected]

Dr NAESSENS Anne : 02/477.50.02 - FAX : 02/477.50.15E-mail : [email protected]

Dr VAN RANST Marc : 016/34.79.08 - FAX : 016/34.79.00E-mail : [email protected]

Dr VERHAEGEN Jan : 016/34.70.73 - FAX : 016/34.79.31E-mail : [email protected]

Dr VERVOORT Tony : 03/247.64.36 - FAX : 03/247.64.40E-mail : [email protected]

Dr ZISSIS Georges : 02/535.45.30 - FAX : 02/535.46.56E-mail : [email protected]

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I. REMARQUES GENERALES

Pour la première enquête du cycle 2003 (enquête 2003/1) lematériel suivant a été expédié le 20 janvier 2003

1.1. Quatre échantillons lyophilisés pour identification.Pour un échantillon, les tests de sensibilité ont étédemandés.

1.2. Deux frottis sanguins pour la recherche de parasites.

1.3. Trois échantillons lyophilisés de plasma pour larecherche des anticorps de CMV, EBV et Toxoplasme.

NOMBRE DE PARTICIPANTS

Le nombre de formulaires de réponses évaluables estde:1. Pour les identifications : 2162. Pour la parasitologie : 2083. Pour la sérologie :

CMV : 206EBV : 190Toxoplasme : 206


2.1. La culture M/4086 était un Enterococcus faeciumrésistant à la Vancomycine

I. Identification des Entérocoques : cf rapport EEQn°01/2002

II. Antibiogramme des Entérocoques :

1. Milieu à utiliser : Muëller-Hinton II sans ajoutde sang

2. Incubation : 35°C, air ambiant, 16 à 18h mais24h pour la Vancomycine.

3. Inoculum : 0.5 McFarland4. Souches de contrôle de qualité :

S. aureus ATCC 25923E. faecalis ATCC 29212 (sensible)E. faecalis ATCC 51299 (résistant)

5. Certaines résistances s’expriment peu ou malin vitro et sont difficilement détectables parla méthode de diffusion ou par les automates;il est dès lors nécessaire d’effectuer des CMIen bouillon ou par la méthode E-test® si on veutdéterminer la sensibilité aux antibiotiques.

Les souches sauvages d’Entérocoques quoiquesensibles à l’ampicilline sont résistantes demanière intrinsèque à de nombreux antibiotiques(cf. tableaux 1 et 2). Depuis quelques annéescertains Entérocoques ont acquis des mécanismesde résistance à haut niveau (notamment auxpénicillines, glycopeptides et aminoglycosides)(cf. tableau 3), c’est pourquoi il devient impératifde réaliser un antibiogramme en cas d’infectiongrave. Il faut cependant noter que l’acquisitionde cette multirésistance ne les rend pas pluspathogènes.

II. IDENTIFCATIONS


Tableau 2.1.1. Résistance intrinsèque commune au genre Enterococcus

Aminoglycosides

Céphalosporines

Clindamycine

Cotrimoxazole

Oxacilline

CommentaireAntibiotique

Résistance de bas niveau. CMI 4 à 250 µg/ml

Toutes les générations

Sauf E.faecium, E.durans, E.hirae (mais quipeuvent présenter une R acquise)

On décrit cependant des succès thérapeutiquesdans l’infection urinaire

Ces antibiotiques ne doivent pas être testés et nepeuvent être rapportés comme sensibles. Les aminosidesne doivent pas être testés aux concentrationshabituelles.

Tableau 2.1.2. Résistance intrinsèque spécifique de certaines espècesd’Enterococcus

E. faecium

E. gallinarum,E. casselliflavus

E. faecalis

AntibiotiqueEspèce

[AAC(6’)-1] = enzymeacétyltransférase

Van C. Opéronchromosomique nontransférable.Modification de lacible

R naturelle auxstreptogramines A(Dalfopristine)

Mécanisme derésistance

Tous lesaminoglycosides (R dehaut niveau) saufGentamicine etStreptomycine

Vancomycine : R debas niveau

Quinupristine -Dalfopristine


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*Test de la R de haut niveau aux aminoglycosides :La résistance de haut niveau aux aminoglycosides nes’exprime in vitro qu’avec la Gentamicine(éventuellement Streptomycine ou Kanamycine).L’Amikacine et la Netilmicine ne l’expriment pas in vitro.Le test est effectué selon le schéma suivant pardétermination de la CMI ou par diffusion :disquespapier ou tablettes ROSCO .Recommandations selon les normes 2002 :

TestGentamicine(High LevelResistance)

Charge(µg/ml)

I R

CMI(NCCLS)

NCCLS

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ROSCO

120

500

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> 500 µg/ml

6 mm

≤ 11 mm

< 14 mm

7-9 mm

S

≤ 500 µg/ml

≥ 10 mm

≥ 17 mm

En cas de R de haut niveau aux aminoglycosides iln’existe plus de synergie avec la Pénicilline, l’Ampicillineet la Vancomycine.

R aux glycopeptides :

Les premières souches d’Entérocoques résistants auxglycopeptides (VRE) ont été décrites en 1986 aux USA.Depuis lors la fréquence des VRE n’a cessé d’augmenter(>20% en 1998) pour devenir un problème majeur à lafois de transmission nosocomiale et de prise en chargede traitement aux USA et au Canada surtout. EnEurope, la fréquence des VRE reste <10%. En Belgiquedes études de surveillance en 1995 et 1996 ont montréun taux de colonisation de 3.5% et 5.7% chez despatients hospitalisés. Ce taux a chuté depuis lasuppression, en 1997, de l’Avoparcine comme promoteurde croissance dans l’alimentation animale. Il n’y a quequelques cas décrits d’infections à VRE en Belgique.


La majorité des VRE isolés aux USA présentent aussiune R de haut niveau à l ’Ampicilline et auxaminoglycosides, ce qui n’est pas le cas en Europe.

Résistance des entérocoques aux glycopeptides

E. faecium>>E.faecalis>>autres espèces

E. faecium>>E.faecalis

E. gallinarum,E. casselliflavus

E. faecium(rarement décrit)

E. faecalis(rarement décrit)

Type de résistanceEspèce

R inductible souventplasmidique

R par modification dela cible desglycopeptides

R inductible souventchrosomique, maissur transposon, donctranférable

R par modification dela cible desglycopeptides

R non transférable, debas niveau parmodification de lacible desglycopeptides

R chromosomique nontranférable

Similaire à Van C

Mécanisme

R acquise haut niveauVanco RTeico R

R acquise niveauvariable

Vanco RTeico S (mais peut

acquérir unerésistance à laTeico)

R intrinsèque basniveau

Vanco RTeico S

R acquise niveauvariable

Vanco RTeico limite S

R intrinsèque basniveau

Vanco R bas niveauTeico S

Van A

Van B

Van C

Van D

Van E

Il existe différentes techniques de biologie moléculairequi permettent de mettre en évidence les gènes derésistance. Elles sont effectuées dans les laboratoiresde référence.


Test par diffusion en gélose : recommandations selonles normes 2002Vancomycine Charge

(µg/ml)I R

CMI(NCCLS)

NCCLS

SFM

ROSCO

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30

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≥ 32 µg/ml

≤ 14 mm

−

≤ 12 mm

15-16 mm

13-14 mm

S

≤ 4 µg/ml

≥ 17 mm

≥ 17 mm

≥ 15 mm

Teicoplanine Charge(µg/ml)

I R

CMI(NCCLS)

NCCLS

SFM

ROSCO

30

30

60

≥ 32 µg/ml

≤ 10 mm

-*

≤ 13 mm

11-13 mm

14-15 mm

S

≤ 8 µg/ml

≥ 14 mm

≥ 17 mm*

≥ 16 mm

* SFM : si le diamètre < 17 mm : mesurer la CMI

Screening de la résistance aux glycopeptides : il existedifférents milieux commerciaux de type Vanco Screenagar permettant la détection rapide de VRE.

A. Dediste, CHU ST-Pierre, Bruxelles


REFERENCES

1. Manual of Clinical microbiology. Murray P. et al. 7th ed.1999.ASM Press.

2. Précis de bactériologie clinique. Freney J., Renaud F., HansenW., Bollet C. 3ème éd 2000. Editions Alexandre Lacassagne.

3. NCCLS. Performance standards for Antimicrobial susceptibilityTesting ; 12th Informational Supplement. M100-S12. January2002

4. Comité de l’antibiogramme de la société française demicrobiologie. Recommandations 2002. http:\\www.sfm.asso.fr

5. User’s guide Neosensitabs. 2002. 15th edition.http:\\www.rosco.dk

6. Y. Cetinkaya et al. Vancomycin-Resistant Enterococci. ClinicalMicrobiology Reviews. 2000. 13(4) ; 686-707.

7. B.Gordts et al. Vancomycin-resistant enterococci colonizingthe intestinal tract of hospitalized patients. JCM. 1995 ;33 :2842.

8. M.Kanchana et al. Cost-Effective Algorithm for Detection andIdentification of Vancomycine-Resistant Enterococci inSurveillance Cultures. Eur. J. Clin.Microbiol. Infect. Dis. 2000 ;19 : 366-9.

9. Leclercq R. Faut-il identifier les entérocoques et comment ?La lettre de l’infectiologue. sept. 2001. XVI(7) ; 217-221.


2.2. La culture M/4181 Neisseria gonorrhoeaeElle a été isolée à partir d’un frottis cervical chez unejeune femme ayant des plaintes de sécrétion vaginaleet de dysurie. Il s’agit de Neisseria gonorrhoeae. Lasouche produit une β-lactamase et est résistante à lapénicilline (CMI >32 µg/ml), à la tétracycline (CMI =64 µg/ml) et à la ciprofloxacine (CMI >32 µg/ml) etelle est sensible à la ceftriaxone (CMI = 0.012 µg/ml).

Après une baisse du nombre des cas de gonorrhée aumilieu des années 80, il y a une nouvelle recrudescencedepuis 1997, surtout chez les hommes.

Le genre Neisseria se compose de diplocoques àcoloration de Gram négative (à l’exception de N.elongata qui est coccobacillaire) qui poussent enatmosphère aérobie à une température de 35-37°C etdont la croissance est stimulée en milieu CO2. Le CO2est nécessaire pour la croissance de N. gonorrhoeae.Les espèces du genre Neisseria sont oxydase positives,et à l’exception de N. elongata, catalase positives.Pour la culture de N. gonorrhoeae à partird’échantillons d’origine génitale, avec flore commensale,il faut utiliser un milieu sélectif, tel que le ThayerMartin ou le New York City agar, qui contiennent de lavancomycine, de la colistine, de la nystatine ou del’amphotéricine B et du triméthoprime. Etant donné quela vancomycine et le triméthoprime peuvent inhiber lacroissance des gonocoques, il faut ensemencerégalement un agar chocolat non sélectif.Après 24 heures d’incubation les colonies de gonocoquesont une taille de 0.5-1 mm et il n’y a pas d’hémolyse.L’identification au niveau du genre se fait sur base dela coloration de Gram, de l’oxydase et de la catalase etéventuellement d’une culture sur un milieu non enrichi(TSA).L’identification au niveau de l’espèce se fait sur basede leur production d’acide à partir de sucres.


Etant donné que les Neisseria sp. utilisent les sucresde manière oxydative au lieu de fermentative, il fautplutôt utiliser un milieu sensible, tel que du CTA avecrouge de phénol comme indicateur. Cette méthode nepose pas de grands problèmes si on tient compte desprécautions suivantes : ensemencement suffisant destubes, utilisation de disques de sucre (qui sont plusstables que les solutions) et incubation dans une étuveà air au lieu d’une étuve à CO2.La confirmation de l’identification peut être faite àl’aide d’un test de latex genre Phadebact MonoclonalGC Test (Boule Diagnostics).


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Tests de sensibilitéLa production de β-lactamase plasmidique estdéterminée à l’aide du test de nitrocéphine. Laprésence de cet enzyme indique une résistance à lapénicilline avec des valeurs de CMI élevées.Habituellement cette résistance est accompagnéed’une résistance à haut niveau à la tétracycline,également d’origine plasmidique.Une résistance de bas niveau chromosomique à lapénicilline et à la tétracycline est largement répandue.Elle est causée par des mutations ponctuelles. Dans lecas de la pénicilline ceci provoque une diminution del’affinité des PBPs (Penicillin Binding Proteins) pourl’antibiotique. Cette forme de résistance peut êtrespécifique pour la pénicilline ou la tétracycline ou êtrepléiotrope, dépendant du type de mutation ponctuelle.L’effet de ces mutations est additif (mutations àétapes multiples).Les mutations provoquant des changements d’acidesaminés dans les sous-unités A et B de la DNA gyrase(gyrA et gyrB) et dans la sous-unité ParC de latopoisomérase IV induisent une sensibilité diminuée ouune résistance aux fluoroquinolones. Les souches avecdes mutations dans les deux sous-unités ont unerésistance aux fluoroquinolones avec des valeurs deCMI élevées (CMI ≥ 2.0 µg/ml) ; les souches avecseulement une mutation dans le gyrA ont une résistancemodérée (CMI 0.06-0.5 µg/ml).La ceftriaxone ne pose pas de problèmes de résistancepour le moment. Il est néanmoins vrai que lesgonocoques avec une résistance aux fluoroquinolonesont des CMI pour les céphalosporines significativementplus hautes que les gonocoques avec une sensibilitédiminuée ou les gonocoques sensibles.Les tests de sensibilité peuvent être effectués enutilisant la méthode de diffusion sur un GC-agar avec1% d’Isovitalex. Le NCCLS a établi des critères1.


Pour les souches qui sont résistantes auxfluoroquinolones, des tests de sensibilité àl’azithromycine sont de plus en plus demandés.Actuellement, il n’existe pas de critères NCCLS pourcet antibiotique. Des valeurs de CMI peuvent néanmoinsêtre retrouvées dans la littérature 2. La résistance àl’azithromycine a déjà été décrite.

Toutes les souches de N. gonorrhoeae, y compris lessouches sensibles, doivent être envoyées au laboratoirede référence. Dans ce but, il faut ensemencer la souchesur un agar chocolat, l’incuber une nuit à 35-37°C enatmosphère 5% CO2 et en cas de croissance, l’envoyerpar la poste en veillant que la souche arrive au plus tard2 jours après dans le laboratoire de référence. Lesenvois le jeudi, le vendredi ou juste avant un jour fériésont donc à proscrire.

M. Van Esbroeck, ITG , Antwerpen


REFERENCES

1. National Committee for Clinical Laboratory Standards.Approved standard M100-S11. Performance standards forantimicrobial susceptibility testing. Eleventh informationalsupplement. Wayne, PA: National Committee for ClinicalLaboratory Standards, 2001.

2. Dillon JR, Rubabaza J-PA, Benzaken AS, et al. 2001. Reducedsusceptibility to azithromycin and high percentages ofpenicillin and tetracycline resistance in Neisseria gonorrhoeaeisolates from Manaus, Brazil, 1998. Sex Transm Dis (28):521-526.


2.3 La culture M/4229 est un Bacillus cereus

2.3.1. Caractéristiques de B. cereusDans le cadre de l’enquête, il était mentionnéque la culture provenait d’un frottis nasaleffectué lors d’un attentat bioterroriste. Onpouvait dès lors penser à Bacillus anthracis etle diagnostic différentiel devait être fait entrecette espèce et les espèces voisines qui luiressemblent.B.cereus, comme B.anthracis appartient augroupe des bacilles sporulés à cellulesvégétatives larges (≥ 1,3µm) et à spores nondéformantes (endospores). Ce groupecomprend également B.thurigiensis etB.mycoïdes très apparentés à B.cereus ainsi queB.megatherium. Les autres espèces trèsnombreuses de Bacillus dont certaines sontmaintenant classées dans les nouveaux genres:Paenibacillus, Brevibacillus, etc … ont descellules bactériennes plus étroites (0.7 – 0.9µm), certaines se décolorent facilement aupoint de ressembler à un bacille à Gram négatifet de nombreuses espèces ont des sporesdéformantes rondes ou ovalaires. Ces espècesprésentent donc peu de risque de confusionavec B.anthracis.C’est à l’intérieur du premier groupe à celluleslarges que la distinction doit être faite.B.megatherium est aérobie strict alors que lecomplexe cereus – anthracis est facultatif etfermentant. B.mycoïdes produit des colonies àcontour rhizoïde chevelu envahissant la gélose.B.thurigiensis est un pathogène des insectestrès semblable à B.cereus.C’est donc surtout entre B.cereus et B.anthracisque le diagnostic différentiel se pose. Sur lesmilieux de culture usuels, tels que les géloses


au sang, les deux espèces forment rapidementdes spores non-déformantes (endospores) leplus souvent subterminales. Une disposition enchaînettes est fréquente. Ceci est surtoutévident à l ’examen direct des produitspathologiques dans lesquels B.anthracis formedes longs chapelets dont les éléments sontcomme coupés à angle droit et qui sontentourés d’une capsule mise en évidence par laméthode de M’Fadeyan.Les colonies de B.cereus sont grandes (2 àplusieurs mm de diamètre), à bords réguliersou crénelés, d’aspect généralement sec et mat,plus rarement lisse et humide. Elles sontfranchement β-hémolytiques sur gélose ausang. Celles de B.anthracis y ressemblent; ellessont grisâtres, souvent légèrement plus petiteset ne présentent pas d’hémolyse ou, si celle-ciexiste, elle est très légère, en rien comparableà celle de B.cereus. B.cereus est mobile alorsque B.anthracis est immobile. Une souche mobilepermet d’exclure ce dernier, mais une soucheimmobile ne permet pas d’affirmer qu’il s’agitde B.anthracis. En effet, certaines souches deBacillus mobiles peuvent perdre leur mobilité,de plus B.mycoïdes est immobile mais il a étédit plus haut que sa culture rhizoïdeenvahissante permet d’éviter toute confusion.Les souches virulentes de B.anthracisélaborent une capsule volumineuse de naturepolypeptidique. Cette capsule est formée surdes milieux riches en protéines et un moyensimple de la détecter consiste à ensemencerla souche dans un petit volume de sérum quiest incubé quelques heures à 37°C, poureffectuer ensuite la recherche des capsulespar la technique de l’encre de Chine (ou lacoloration M’Fadeyan)


Enfin, sauf rares exceptions, B.anthracis estsensible à la pénicilline alors que B.cereusélabore des β-lactamases et est résistant.En résumé, le diagnostic différentiel B.cereus– B.anthracis et donc la suspicion de bacillesdu charbon, peut suivre la démarche suivante:1. Situer la souche dans le groupe B.anthracis

– B.cereus : grands bacilles à Gram positifde largeur nettement supérieure à 1 µm,présentant des spores non-déformantes(endospores), formant de grandes coloniesmates, rondes ou irrégulières, aérobies-anaérobies facultatifs, fermentant leglucose.

2. Suspicion de B.anthracis: souche immobile,non (ou très peu) hémolytique, sensible à lapénicilline, formant de volumineusescapsules sur sérum.

G. Wauters, UCL, Bruxelles


2.3.2. Traitement des échantillons en routineMême si le Bacillus anthracis appartient à laclasse de risque 3 et ne peut pas être manipuléen tant que tel dans la plupart des laboratoires,la possibilité existe néanmoins qu’une tellesouche soit isolée en routine. Cette possibilitéexiste également pour les autres organismesappartenant à la classe 3 (Mycobacteriumtuberculosis, Salmonella typhi, Shigelladysenteriae type 1, Histoplasma capsulatum, …).Les cultures suspectes seront traitées avec laprudence appropriée. Il est utile et mêmerecommandé d’avoir à sa disposition un fluxlaminaire. L’éthique médicale demande d’autrepart une approche rapide : il est donc importantde pouvoir reconnaître un Bacillus anthracissans délai. Les cultures suspectes peuvent êtreconfirmées par le laboratoire de référence :CERVA (Centre d’Etudes et de RecherchesVétérinaires et Agrochimiques)Groeselenberg 991180 BruxellesTel.: 02/ 379 04 00Fax: 02/ 379 04 01E-mail: [email protected]: http://www.var.fgov.be

Nous remercions le Professeur G. Wauterspour la rédaction de ce rapport.

M. Lontie, MCH, Leuven


2.3.3 Traitement des échantillons dans le cadred’une attaque bio-terroriste

La souche de contrôle M/4229 était unBacillus cereus. Les informations cliniquessuivantes vous étaient communiquées: « Frottisdu nez après une exposition possible à uneattaque bio-terroriste ».

Le gouvernement fédéral a établi une directivepour le traitement des échantillons cliniqueset des échantillons d’environnement,consultable à l ’adresse internetwww.health.fgov.be/biotox. Cette directiveimpose que des échantillons suspects soientenvoyés immédiatement à un laboratoire deréférence de la classe 3 de biosécurité. Cettedirective explique également comment cetenvoi doit être effectué.

Cette directive est différente de celle du CDC(www.bt.cdc.gov) où des laboratoires de laclasse A (satisfaisant à une classe 2 debiosécurité) peuvent ensemencer deséchantillons cliniques suspects et exclure laprésence de B. anthracis. S’il y a une suspicionde B. anthracis ils doivent envoyerimmédiatement la souche à un laboratoire dela classe B ou C. Pour raison de perte de tempset de risque il leur est déconseillé d’effectuerdes tests de confirmation eux-mêmes. Leslaboratoires de la classe A ne peuvent pasanalyser les échantillons provenant del’environnement

Si nous avions strictement appliqués ladirective belge, nous n’aurions pas pu envoyercette souche. Dans un objectif didactique nous


avons considéré qu’il était toutefois utile desouligner quelques aspects.

La directive du CDC déconseille l’utilisation defrottis du nez pour le diagnostic de l’anthrax,pour déterminer si une prophylaxie doit êtreadministrée ou arrêtée, ou comme échantillonsupplémentaire pour l’environnement.Les frottis du nez sont utiles pour définir unezone d’exposition et, en cas d’anthrax, dedéterminer où et quand le patient seraitexposé.La sensibilité du frottis de nez diminue aucours du temps. Les frottis doivent êtreeffectués dans les 7 jours suivant l’exposition.

Les conseils du CDC pour la culture de Bacillusanthracis sont les suivants:

Utilisez une hotte à flux laminaire(« biohazard »)Utilisez des gantsEmpêchez la création des aérosolsLavez-vous les mainsUtilisez l’écran de protection

K. Magerman, Hôpital VirgaJesse, Hasselt


REFERENCES

1. Directives au sujet de la propagation intentionnelle de l’anthrax.FICHE TECHNIQUE– WIV/ISP, disponible surwww.health.fgov.be/biotox

2. Level A lab procedure for identification of Bacillus anthracisdisponible sur www.bt.cdc.gov/agent/anthrax/lab-testing

3. Biosafety in the Laboratory disponible sur www.cdc.gov4. Large-Scale screening of Nasal Swabs for Bacillus anthracis :

Descriptive Summary and Discussion of the National Instituteof Health’s Experience, P Kiratisin et al. , Journal of clinicalMicrobiology, Aug. 2002, p. 3012-3016

5. Laboratory Response to Anthrax Bioterrorism, New York City,2001, M.B. Heller et al., Emerging Infectious Diseases, Vol. 8,No. 10, Oct 2002, p. 1096-1102

6. Bioterrorism – A Perspective for the Community Hospital, J.M.Miller, Clinical Microbiology Newsletter, Vol. 23, No. 23, Dec.2001, p. 179-185

7. Bioterrorism: Implications for the Clinical Microbiologist, W.F.Klietmann and K.L. Ruoff, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 14,No. 2, Apr. 2001, p. 364-381

8. Interim Guidelines for Investigation of and Response to BacillusAnthracis Exposures, MMWR, Vol. 50, No. 44, Nov. 2001, p. 987-990


Fig. 2.3.1. Aspect microscopique de B. anthracis avecspores (en culture)


2.4. La culture M/4063 Salmonella Berta

Le germe avait été isolé de selles provenant d’un hommede 40 ans avec une diarrhée, après son retour d’un paysd’Europe du Sud.

Une enquête externe de la qualité a été menée sur cetteculture afin de vérifier l ’identification et laterminologie utilisée par les différents laboratoirescomme lors des enquêtes 02/2000 (culture M/903) et02/2002 (culture M/3093). Le germe était uneSalmonella enterica, sous-espèce enterica, sérovarBerta avec la formule antigénique suivante : 1,9,12 :[f],g,[t] : -.Pour la nomenclature des Salmonella et l’utilisation desmilieux d’isolement différentiel, se référerrespectivement aux rapports des enquêtes 02/2000et 02/2002.De manière générale, les laboratoires de routineidentifient biochimiquement les salmonelles jusqu’augenre, voire l ’espèce (enterica ou bongori) etconfirment le diagnostic par un test sérologique(généralement sérums polyvalents ou plus rarementsérums correspondant aux sérotypes les plusfréquents :O:4,5 (B) – O:6,7,8 (C1,C2,C3) – O:9 (D1) (environ 90%des souches d’origine humaine). La détermination dusérovar ou sérotype sur base du schéma de Kauffmann-White revient alors au Centre de Référence National.

Bases phénotypiques de l’identification :Les Salmonella possèdent les caractères de définitiondes entérobactéries : bacilles droits à coloration Gram-négatif, souvent mobiles, se développant sur milieuxordinaires aéro-anaérobies, fermentant le glucose enproduisant souvent du gaz, oxydase négatifs etréduisant les nitrates en nitrites.


La très grande majorité (99,8%) des souches deSalmonella, isolées de l’homme et des animaux à sangchaud, appartiennent à la sous-espèce I, dont le profilbiochimique est le suivant :

ONPG : orthonitrophényl-β-D-galactopyranosideADH : arginine-dihydrolaseLDC : lysine-décarboxylaseTDA : tryptophane-désaminaseODC : ornithine-décarboxylaseRM : rouge de méthyle

- lactose-, ONPG-, H2S+, gaz (glucose)+ ;- LDC+, ODC+, ADH-, uréase-, TDA-, indole-, gélatinase-

, DNase- ;- absence de production d’acétoine (test de Voges-

Proskauer-), RM+, citrate de Simmons+, adonitol-,glycérol-, galacturonate-.

Il y a cependant des exceptions importantes : lesérovar Typhi ne décarboxyle pas l’ornithine, nepousse pas sur milieu au citrate de Simmons, estagazogène et ne produit que des traces de H2S ; lesérovar Paratyphi A ne produit pas de H2S, nedécarboxyle pas la lysine et ne pousse pas sur milieuau citrate de Simmons.Chez le sérovar Berta, certains isolats sont H2S- (cequi était le cas de la culture M4063) et les coloniesapparaissent donc sans centre noir sur des milieuxd’isolement différentiel à base de citrate de fer etde thiosulfate de sodium (ex. : XLD, DCLS, Hektoen,SS). Les sérovars Choleraesuis et Gallinarum (aviaire),sont également H2S-.

Les genres avec lesquels les Salmonella peuvent êtreconfondues sont Citrobacter (lysine et souventornithine décarboxylase négatif, fermente le 2-cétogluconate), Hafnia (H2S-, ONPG+, VP+ et citrate– à20-30°C). Le piège classique est la galerie API 20 E,incubée à 37°C avec Hafnia alvei qui donne des testsONPG et VP négatifs à cette température.


Préalablement à l’identification avec galerie (ex. : API20 E), il est donc intéressant de soumettre les coloniessuspectes à des tests d’orientation tels que :- Kliger-Hajna ou TSI- Urée indole de Fergusson (élimine les Proteus qui

présentent une réaction uréase positive en deuxheures et les Edwardsiella qui sont indole+)

- Milieu Lysine décarboxylase- Réactif pour la recherche de la β-galactosidase

Identification antigénique :La détermination du sérotype des salmonelles se faitpar la recherche des antigènes somatiques O,flagellaires H et de surface (Vi) selon le schéma deKauffmann et White. L’antigène Vi est uniquementretrouvé chez Typhi, Paratyphi C et quelques rares casde Dublin. La grande majorité des antigènes H existentsous une forme biphasique, c’est-à-dire possédant deuxspécificités antigéniques différentes. Certainssérovars importants comme Enteritidis (1,9,12:g,m:-)sont monophasiques. Les antigènes qui varientfacilement par mutation sont placés entre crochets etceux qui ont un déterminisme phagique ou plasmidiquesont soulignés (ils peuvent être perdus ou acquis à toutmoment).Dans certains cas, le facteur O accessoire (placé entrecrochet) pourra être recherché pour préciser la variétéantigénique.ex. : la présence du facteur O:5 permet diviser lesérovar Typhimuriumen Typhimurium = 1,4,[5],12 : i : 1,2ou en Typhimurium var. Copenhagen = 1,4,12 : i : 1,2


Résultats : Culture M/4063 (selles)

Salmonella groupe D 74Salmonella groupe D (non S. Typhi) 8Salmonella groupe D (non S. Enteritidis) 1Salmonella Berta 1Salmonella enterica O:9 3Salmonella groupe O:9 2Salmonella groupe OMA* 2Salmonella enteritidis 19Salmonella groupe B 1Pas traité au labo 1

* OMA contient les agglutinines pour les facteurs 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 12,15, 19, 21 et 46 correspondants aux groupes A, B, D, E, L

Note: le caractère H2S négatif a été rapporté par 12laboratoires au total ; 8 sous l’identification Salmonellasp. et 4 sous l’identification Salmonella groupe D

La majorité des participants ont fourni une bonneréponse (réponses soulignées), un laboratoire allantjusqu’au sérotype correct. Par contre, 19 laboratoiresont répondu Salmonella Enteritidis (1, 9,12 : g,m : -),sérovar du même groupe (O:9, anciennement dénommépar la lettre D1) qui a une formule antigénique prochedu sérovar Berta (1,9,12: [f],g,[t] : -). En effet, seulela formule de la phase H1 est différente avec, de plus,un antigène en commun (g). La souche isolée de laculture M/4063 agglutinait avec les sérums H:f, H:g,met H:t et n’agglutinait pas avec les sérums H:m et H:s,d’où la phase H1:f,g,t. En plus de la présence du H:f,l’absence d’agglutination avec H:m excluait le sérovarEnteritidis et l’absence d’agglutination avec H:sexcluait une Salmonella de la sous-espèce II (S. II 9,12: g,s,t : e,n,x), puisque aucune inversion de phase n’aété réalisée (phase H2 absente chez le sérovar Berta).


S. Berta human cases in Belgium

0

10

20

30

40

1962

1965

1968

1971

1974

1977

1980

1983

1986

1989

1992

1995

1998

2001

Year

Nb c

ases

Berta cases

Douze laboratoires avaient également mentionné lasouche comme H2S négatif.

Le sérovar Berta est un sérovar très peu représentédans notre pays, sauf en 1990 où 35 cas ont étérecensés (Fig. 2.4.1). La recrudescence de ce sérovaren Angleterre et au Pays de Galles a été attribuée àdes carcasses de volaille importées du Danemark. Uneépidémie de S. Berta a été également rapportée auCanada en 1994 suite à la consommation d’un fromageà pâte molle. Aucun rapport particulier de paysd’Europe du Sud sur ce sérovar n’a été publiérécemment. Dans le cas présent, l’association avec unvoyage à l’étranger n’était pas déterminante, mais dixlaboratoires ont de ce fait recherché et exclu laprésence de S. Typhi étant donné que les symptômesdu patient n’étaient pas rapportés.

Fig. 2.4.1. : Nombre de cas humains de Salmonella Berta recensésen Belgique par le Centre National de Référence des Salmonellaet des Shigella depuis 1962.


Recommandations du Centre National de Référencedes Salmonella et Shigella :

Chaque isolement de Salmonella humaine doit êtreenvoyé au Centre à l’adresse suivante :

Centre National de Référence des Salmonella et desShigellaSection de BactériologieInstitut de Santé PubliqueRue J. Wytsman 14B-1050 Bruxelles

Le typage moléculaire (PFGE) est réalisé à la mêmeadresse (Tél. : Dr S. Bertrand au 02/642 50 82).

Il faut également adresser la fiche de renseignementssur la souche et l’épidémiologie. Les caractèresantigéniques déjà recherchés doivent être aussimentionnés. En cas d’épidémie ou de toxi-infectionalimentaire collective, seulement quelques souchesprovenant de malades différents doivent être envoyéesen indiquant qu’il s’agit d’une épidémie et enmentionnant le nombre total de cas recensés.

L’acheminement des cultures se fera en tube droit etvissé sur milieu de conservation et l’emballage seraconforme à la réglementation internationale.

Dr J.-M. CollardDirection du Centre National de Référence

Chef de Section


REFERENCES

1. A community outbreak of Salmonella berta associated with asoft cheese product. Epidemiol Infect. 1998 Feb;120(1):29-35.

2. Grimont P.A.D., Grimont F., et Bouvet P.J.M. Salmonella. 2000.In Précis de Bactériologie clinique. Ed. J. Freney, F. Renaud,W. Hansen, C. Bollen. Eska, Paris, pp. 557-568.

3. Grimont P.A.D., Grimont F., et Bouvet P.J.M. Salmonella. 1994.In Manuel de Bactériologie clinique. Vol. 2. Ed. Freney J.,Renaud F., Hansen W. et Bollet C., Elsevier, Paris. pp. 1017-1042.

4. Kaufmann F. The bacteriology of Enterobacteriaceae. 1966.Munksgaard, Copenhagen.

5. Le Minor L. et Richard C. Méthodes de laboratoire pourlidentification des entérobactéries. 1993, Ed. Institut Pasteur,Paris, pp. 217.

6. Popoff M.Y. Formules antigéniques des serovars. 2001. 8ème éd.Institut Pasteur de Paris, WHO Collaborating Centre forReference and Research on Salmonella.

7. Threlfall EJ, Hall ML, Ward LR, Rowe B. Plasmid profilesdemonstrate that an upsurge in Salmonella berta in humans inEngland and Wales is associated with imported poultry meat.Eur J Epidemiol. 1992 Jan;8(1):27-33.


III. RESULTATS DES IDENTIFICATIONS (N=)

Les identifications correctes ou acceptables sont soulignées.

3.1. Culture M/4086 Enterococcus faecium (hémoculture)N = 216

Enterococcus faecium 159 (73,6%)Enterococcus species 6 (2,8 %)Enterococcus gallinarum 22Enterococcus casseliflavus 12Streptococcus faecium 9Enterococcus avium 2Leuconostoc species 2Enterococcus faecalis 1Enterococcus hirae 1Streptococcus casseliflavus 1Pas traité au labo 1

3.2. Culture M/4181 Neisseria gonorrhoeae (frottisvaginal)N = 216Neisseria gonorrhoeae 202 (93,5 %)Neisseria species 3Neisseria meningitidis 2Brucella species 1Enterococcus durans 1Moraxella species 1Neisseria cinerea 1Pas de croissance 3Pas de pathogène 1Pas traité au labo 1


3.3. Culture M/4229Bacillus cereus (frottis du nez)N = 216Bacillus cereus 147 (68,0%)Bacillus non anthracis 41 (19,0%)Bacillus cereus /thuringiensis 1 (0,5%)Absence de Bacillus anthracis 1 (0,5%)Pas de pathogène 3 (1,4%)Négatif 1 (0,5%)Bacillus species 11Bacillus thuringiensis 5Bacillus pseudo anthracis 1Bacillus mycoides 1Oerskovia xanthineolytica 1Flore nasale 1Pas de réponse 1Pas traité au labo 1

3.4. Culture M/4063 Salmonella berta (selles)N = 216Salmonella species 102 (47,2%)Salmonella species (non S. typhi) 1 (0,5%)Salmonella species (non S. typhi ou paratyphi) 1 (0,5%)Salmonella groupe D 74 (34,2%)Salmonella groupe D (non S. typhi) 8 (3,7%)Salmonella groupe D (non S. enteritidis) 1 (0,5%)Salmonella berta 1 (0,5%)Salmonella enterica O:9 3 (1,4%)Salmonella groupe O:9 2 (0,9%)Salmonella groupe OMA* 2 (0,9%)Salmonella enteritidis 19Salmonella groupe B 1Pas traité au labo 1


* OMA contient les agglutinines pour les facteurs 1,2, 3, 4, 5, 9, 10, 12, 15, 19, 21 et 46 correspondantsaux groupes A, B, D, E, L

Note: le caractère H2S négatif a été rapporté par 12laboratoires au total ; 8 sous l’identification Salmonellasp. et 4 sous l’identification Salmonella groupe D.


IV. ANTIBIOGRAMMEL’antibiogramme type est basé sur les résultats obtenus lorsde l’étude EARRS, où la même souche a été envoyée.

4.1. Culture M/4086

Le nombre de participants était de 216 laboratoires.Certains laboratoires ont utilisés plusieurs techniquespour certains antibiotiques. Néanmoins, un seul résultata été repris par laboratoire dans le tableau 4.1.1. Dansla plupart des cas, les résultats obtenus par chaquelaboratoire sont identiques pour chaque antibiotiquequelle que soit la technique utilisée. Dans 3 casseulement, une différence entre 2 techniques a étéconstatée pour la vancomycine : 2 fois le résultat‘intermédiaire’ a été obtenu avec une méthode dediffusion et le résultat ‘résistant’ avec une méthodede CMI ; une fois le résultat ‘intermédiaire’ a étéobtenu avec le E-test et le résultat ‘résistant’ avec le’Vancoscreen agar’. Ces trois laboratoires ont étéclassés dans la catégorie ‘R’ pour la vancomycine dansle tableau ci-dessous.

Tableau 4.1.1. Les résultats des antibiogrammes effectués

Antibiotique

Amoxycilline

Ampicilline

Gentamicine1

Vancomycine

Teicoplanine

Résultatattendu

R

R

R

R

S

S

2

1

9

18

153

I

2

1

1

3

1

R

92

200

191

189

3

1 Deux laboratoires ont mentionné, la nécessité de tester le «High level gentamicine»,mais ont déclaré ne pas avoir ce type de disque au sein de leur laboratoire.


Un laboratoire a mentionné une résistance àl’amoxycilline et à l’ampicilline et déclare qu’il envoieses échantillons de routine à un laboratoire deréférence pour déterminer la sensibilité des troisautres antibiotiques.Cinq laboratoires ont mentionné que la souche était VanB positif; un laboratoire a mentionné que la souche étaitVan C positif.

Les laboratoires n’ont pas tous mentionné la méthodecomplète avec la charge. Dans le cas où cette méthodeest reprise, nous avons déterminé le diamètre médian,minimum et maximum pour les méthodes de diffusionsur disque selon NCCLS et ROSCO (NEO-SENSITABS).Certains laboratoires n’utilisent pas la chargeappropriée ou ne mentionnent pas la charge des disquesutilisés ; ces laboratoires ne sont pas pris en comptepour le calcul des diamètres médians, minima et maxima.

Tableau 4.1.2. Diamètres obtenus avec la méthode de diffusion sur disque selon leNCCLS

Antibiotique Nbretotal

d’utilisateurs

Nbred’utilisateurs

ayantmentionné la

charge

Charge Diamètremédian

Diamètreminimum

Diamètre maximum

Amoxycilline 15 8 25 1 1 0 16Ampicilline 52 49 10 6 0 7Gentamicine1 49

21 10 6 0 1020 120 5 0 10

Vancomycine 44 39 30 10 0 19Teicoplanine 21 21 30 18 16 20

1 Même si pour les entérocoques l’utilisation des disques « High level gentamycine » est conseillée, il ya 21 laboratoires qui ont néanmoins déterminé la résistance avec un disque avec une charge de 10 µg.


Amoxycilline 61 61 30 14 0 20Ampicilline 86 86 33 1 1 0 20Gentamicine1 99

30 40 8 0 2762 250 9 0 25

Vancomycine² 8971 5 9 0 2112 70 9 0 26

Teicoplanine 59 59 60 20 14 30

Tableau 4.1.3. Diamètres obtenus avec la méthode de diffusion sur disque selon leROSCO

1 Même si pour les entérocoques l’utilisation des disques « High level gentamycine » est conseillée, il ya 30 laboratoires qui ont néanmoins déterminé la résistance avec un disque avec une charge de 40 µg.

2 Même si pour les entérocoques l’utilisation des disques de vancomycine avec une charge de 5 µg estconseillée, il y a 21 laboratoires qui ont néanmoins déterminé la résistance avec un disque avec unecharge de 70 µg.

REMARQUEIl est à noter qu’un certain nombre de laboratoiresrapportent un diamètre égal à «zéro» dans le cas où ily a une croissance jusqu’au bord du disque.Néanmoins, il est conseillé de ne pas répondre «zéro»dans ces cas, mais de rapporter le diamètre du disque.(Ces «zéro» expliquent également pourquoi le diamètremédian semble être plus petit que le diamètre du disque,ce qui est évidemment impossible).

Antibiotique Nbretotal

d’utilisateurs


ayantmentionné la

charge

Charge Diamètremédian

Diamètreminimum

Diamètre maximum


Les résultats de la méthode de détermination de la CMIla plus utilisée, le E-test, sont repris dan le tableau 4.1.4.

Amoxycilline 8 Concentration :Moyenne : 37 mg/LMaximum : 16 mg/LMinimum : 64 mg/L

Ampicilline 20 Tous les résultats ≥ 48 mg/L11/20 résultats ≥ 256 mg/L

Gentamicine 12 Tous les résultats ≥ 256 mg/L2/12 résultats ≥ 1024 mg/L

Vancomycine 49 Voir remarque1

Teicoplanine 30 Concentration :Moyenne : 2 mg/LMaximum : 1 mg/LMinimum : 15 mg/L

Tableau 4.1.4. Résultats obtenus avec le E-test

Antibiotique Nombred’utilisateur

Résultat

1 Pour la vancomycine les participants ont répondu les résultats suivants : 6laboratoires ont répondu « S » (avec des concentrations ≤ 3 mg/L), deux ont répondu« I » (concentrations de 8 et 16 mg/L) et 41 « R » (concentrations ≥ 32 mg/L ; 33d’entre eux ont même trouvé une concentration ≥ 256 mg/L)


Les résultats obtenus avec Vitek sont repris dans letableau 4.1.5.

Tableau 4.1.5. Résultats obtenus avec Vitek

Amoxycilline 1 - 1 - -Ampicilline 13 - 13 > 16 7Gentamicine1 13 - 13 - -Vancomycine2,3 15 1 14 > 32 6Teicoplanine 15 15 - < 4 7

1 Un laboratoire a mentionné une dilution de < 500 pour la gentamicine sur Vitek 2 ; ce laboratoire adonné comme interprétation pour la gentamicine « S »

2 Un laboratoire a mentionné une dilution de < 0,5 pour la vancomycine sur Vitek 2 ; ce laboratoire adonné comme interprétation pour la vancomycine néanmoins « R »

3 Un laboratoire a mentionné une dilution de < 1 pour la vancomycine sur Vitek 2 ; ce laboratoire adonné comme interprétation pour la vancomycine « S »

AntibiotiqueNbretotal

d’utilisateurs


ayant mentionné cettedilution

Dilutionla plus

mentionnée

Vitek 1

Résultats

S R

Amoxycilline 8 - 8 - -Ampicilline 34 - 34 ≥ 32 30Gentamicine1 32 1 31 ≥ 500 5Vancomycine2,3 32 1 31 ≥ 32 26Teicoplanine 33 33 - ≤ 1 28

AntibiotiqueNbretotal

d’utilisateurs


ayant mentionné cettedilution

Dilutionla plus

mentionnée

Vitek 2

Résultats

S R


Les utilisateurs de la méthode ATB peuvent être classéscomme suit : 5 laboratoires ont déterminé la résistanceà l’amoxycilline, 19 à l’ampicilline, 17 à la gentamicine,20 à la vancomycine et 16 à la teicoplanine.

Quatre laboratoires ont déterminé la résistance à lavancomycine avec le « Vancoscreen agar ».

Il reste à mentionner :- un laboratoire a déterminé la résistance à la

vancomycine avec la méthode de dilution sur agar;- un laboratoire a déterminé la résistance à

l’ampicilline, la gentamicine, la vancomycine et à lateicoplanine avec la méthode de microdilution;

- un laboratoire a déterminé la résistance àl’ampicilline, la gentamicine, la vancomycine et à lateicoplanine sur Phoenix;

- un laboratoire a déterminé la résistance àl’ampicilline, la gentamicine, la vancomycine et à lateicoplanine sur galerie Mini Api;

- un laboratoire a déterminé la résistance àl’ampicilline, la gentamicine et à la vancomycine avecla méthode Sensititre.

Finalement, il y a 6 laboratoires qui n’ont pas mentionnéla méthode utilisée pour un ou plusieurs antibiotiques.


V. PARASITOLOGIE

5.1. Les échantillons

Deux frottis sanguins ont été envoyés aux laboratoires.

L’échantillon P/3175 était accompagné desinformations cliniques suivantes :Après son retour du Congo, un coopérant de 25 ans seprésente chez son médecin avec des oedèmes fugacesau poignet. L’examen hématologique montre uneéosinophilie. Le frottis a été fait pendant la journée.Cet échantillon contenait des microfilaires de Loa loa.

L’échantillon P/4164 était accompagné desinformations cliniques suivantes :Une femme de 40 ans présente de la fièvre deuxsemaines après son retour d’un voyage en Afrique deSud. Durant son séjour en Afrique, elle a pris lesmédicaments prophylactiques appropriés.Cet échantillon était négatif.

5.2. Les résultats

5.2.1 Echantillon P/3175Au total 208 laboratoires ont participé àl’enquête. Un laboratoire a mentionné laprésence de deux parasites différents.Les résultats sont repris dans le tableau 5.2.1.


Tableau 5.2.1. Parasites retrouvés dans l’échantillon P/3175

Parasite

Loa loaFilariasisOnchocerca volvulusWuchereria bancroftiMansonella ozzardiMansonella speciesMansonella streptocercaPlasmodium malariaeBartonella speciesDirofilaria immitisMansonella perstansNaegleria fowleriPlasmodium falciparumPlasmodium vivaxPlasmodium speciesOnchocerca volvulus ou Wuchereria bancrofti1

Absence de parasites

Total

Nombre

14134542222111111119

2091 Un laboratoire a mentionné «Onchocerca volvulus ou Wuchereria bancrofti».

Les réponses « Loa loa » et « filariase » peuvent êtreconsidérées comme correctes.Pour le Loa loa, les stades suivants du cycle évolutifont été mentionnés :microfilaires (135), larve (3), forme adulte (2) et nonprécisé (1).Pour le filariase les stades suivants du cycle évolutifont été mentionnés :microfilaires (30), forme adulte (1) et non précisé (4)(un laboratoire a mentionné deux stades évolutifs :microfilaires et forme adulte).Sept laboratoires enverraient l’échantillon à unlaboratoire de référence pour une identificationcomplémentaire ou pour une confirmation de leuridentification : deux laboratoires ont répondu filariase,trois ont répondu un Loa loa, un autre a répondu unOnchocerca volvulus et un dernier a répondu uneabsence de parasites.


Tableau 5.2.2. Parasites retrouvés dan l’échantillon P/4164

Parasite

Absence de parasitesPlasmodium speciesPlasmodium falciparumPlasmodium vivaxPlasmodium malariaePlasmodium vivax ou ovale1

Trypanosoma speciesLoa loa

Total

Nombre

1983211111

2081 Un laboratoire a mentionné « Plasmodium vivax ou Plasmodium ovale ».

Notons qu’un laboratoire enverraitl’échantillon à un laboratoire de référence pourune confirmation ; un autre effectuerait destests sérologiques pour la malaria. Deuxlaboratoires conseillent de prendre undeuxième échantillon (une goutte épaisse) à unmoment de fièvre. Il s’agit de quatrelaboratoires qui considèrent l’échantilloncomme négatif.

5.2.2 Echantillon P/4164Au total 208 laboratoires ont participé àl’enquête. Les résultats sont repris dans letableau 5.2.2.


5.3. Commentaire

Echantillon P/3175 Loa loa

Ces lames contiennent quelques microfilaires Loa loa.La plupart des microfilaires sont retrouvées auxbords des frottis.

Caractéristiques générales des filairesLes filaires forment un groupe hétérogène denématodes filiformes, dont les adultes vivent dans lestissus, les voies lymphatiques ou les cavités de l’hôtefinal. Habituellement le stade diagnostique estl’embryon, la microfilaire.

Les différences entre ces microfilaires sont (4):1. une certaine périodicité, diurne ou nocturne, en

accord avec l’activité du vecteur;2. la localisation chez l’hôte final, dans le sang ou dans

la peau;3. l’aspect global des parasites sur les lames (formes

courbées);4. la dimension (en particulier le diamètre, doit être

comparé avec les globules rouges);5. la présence d’une gaine (avec le Giemsa, la gaine de

Brugia malayi est colorée en rose, celle deWuchereria bancrofti ne l’est presque pas et celledu Loa loa ne l’est pas du tout; avec l’Hématoxyline,les gaines de ces trois espèces se colorent);

6. l’aspect de l’extrémité caudale (la présence oul’absence de noyaux somatiques jusqu’à la fin del’extrémité, forme);

Distribution géographiqueLe Loa loa est une filaire typiquement Africaine, quipeut être retrouvée en Afrique occidentale et centrale.Au Congo-Kinshasa, ce sont surtout les régionsforestières (Mayumbe, Uélé) qui en sont les plus


atteintes.

Vers adultesLa femelle mesure 60 mm sur 0.5 mm. Le mâle est unpeu plus petit (30 mm x 0.4 mm). Les adultes vivent dansle tissu sous-cutané et circulent activement. Parfois lever peut être remarqué dans les conjonctives (eyeworm). Chez des personnes allergiques leur passage peutcauser des réactions locales et des oedèmes (oedèmesfugaces de Calabar, Calabar swellings). On a évoquéune relation causale avec l’endomyocardofibrose etd’autres pathologies.

CycleLa femelle adulte dépose les microfilaires dans le tissusous-cutané. Elles gagnent la circulation et montrentune périodicité diurne correspondant à l’activité del’hôte intermédiaire, la femelle d’une petite (1cm)mouche, Chrysops. Le cycle complet est repris dans lafigure 5.3.1.

DiagnosticLe ver adulte est parfois observé sous la conjonctiveou la peau fine. D’habitude l’infection est accompagnéed’une hyperéosinophilie. Cette éosinophilie peut varieren fonction du temps (courbe de Lavier).Dans la plupart des cas le diagnostic se fait grâce à laprésence de microfilaires typiques dans le sang. Lagoutte épaisse, un frottis sanguin ou une techniqued’enrichissement (d’habitude après hémolyse) peuventêtre utilisés (3, 4).Au Congo-Kinshasa, trois sortes de microfilairespeuvent être retrouvées dans le sang (tableau 5.3.1).Les microfilaires d’Onchocerca volvulus et deMansonella streptocerca (ancien nom Dipetalonema)peuvent également être trouvées dans lesscarifications dermiques au Congo (3, 4).


Les microfilaires de Loa loa mesurent 230(200) – 300µm sur 6.0 à 8 µm, et 270 – 300 µm en milieu formolé(1, 2, 3, 4).D’autres techniques de diagnostic sont expliquées surle site Web du CDC (5).

TraitementEn ce qui concerne le traitement, nous vous renvoyonsau Sanford. Il faut surtout se méfier de possiblesréactions allergiques.

Périodicité

Vecteur

Dimension

Queue

Gaine

Mansonellaperstans

Loa loa

diurne/nocturne

mouches(Culicoides spp.)

< 200 µm

présence de noyauxdans l’extrémité

caudale

absence

diurne

mouches(Chrysops spp.)

> 250 (230) µm

présence de noyauxdans l’extrémité

caudale

présence (noncolorable au Giemsa)

M. Lontie (MCH, Leuven)K. Vernelen (ISP-LP, Bruxelles)

Wuchereria bancrofti

nocturne

moustiques(Culex, Anopheles, )

> 250 µm

absence de noyauxdans l’extrémité

caudale

présence (noncolorable au Giemsa)

Tableau 5.3.1. : Microfilaires présentes dans le sang au Congo-Kinshasa,d’après J. Sonnet et J. Vandepitte (3, 4).


Figure 5.3.1. : Cycle de Loa loa d’après J. Vandepitte (4)

Loa loa

Adultes dans tissu sous-cutané

Entre peau par piqûre

Microfilaires

Circulation

Larve IIIStade infectant

HOMME

Microfilairesdans le sang

(stade diagnostique)

Migre vers tête et trompe

Larve II

CHRYSOPS

Perd gaine, pénétre paroiestomac

Larve IMuscles thoraciques

Ingéré


Figure 5.3.2.: Microfilaire Loa loa: les noyaux somatiques detaille variable sont présents jusqu’au bout de l’extrémitécaudale. La gaine est bien visible par coloration négative.Préparation de cette enquête (P/3175), colorée par le May-Grünwald-Giemsa.

Figure 5.3.3.: Petite microfilaire Mansonella perstans(à gauche) et microfilaire plus grande Loa loa dans lamême préparation. Cette préparation provient duLaboratoire de Microbiologie de l’Hôpital Universitairede Lovanium à Kinshasa.


REFERENCES

1. Ash L. & Oribel T. 1980. Atlas of human parasitology. AmericanSociety of Clinical Pathologists, Chicago.

2. Lamy L. 1980. Protozoaires et helminthes parasites. Maloine,Paris.

3. Sonnet J. 1964. Syllabus des techniques usuelles de laboratoiremédical. Université Lovanium, Kinshasa.

4. Vandepitte J. 1988. Helminthologie médicale. Acco, Leuven.5. http://www.dpd.cdc.gov/DPDx/HTML/Filariasis.htm


VI. SEROLOGIE

6.1. TESTS

6.1.1. Description des échantillons

Trois échantillons ont été envoyés. Leséchantillons S/3942 et S/4034 contenaientdes anticorps anti-EBV et anti-CMV.L’échantillon S/2724 contenait des anticorpsanti-Toxoplasme. Pour ce dernier, deuxéchantillons différents ont été envoyé : leslaboratoires avec un numéro d’agrément pairont reçu un échantillon avec IgG élevées et IgMfaibles ; les laboratoires avec un numérod’agrément impair ont reçu un échantillon avecIgG faibles et IgM élevées.

Les échantillons étaient accompagnés desinformations cliniques suivantes :

S/3942 : Femme en âge de procréation, ayantconsulté pour un syndrome grippalaccompagné de myalgies, de fièvreet d’un malaise généralisé.L’échantillon soumis au QC a étéprélevé un mois après le début desmanifestations cliniques.

S/4034 : Homme de 60 ans, en bonne santéet sans plainte particulière.

S/2724 : Une jeune femme se plaint defatigue, des ganglions sontprésents.


6.2. CMV

6.2.1. Les participants

Au total 206 laboratoires ont participé à cetteenquête. La plupart des laboratoires ontrecherché les anticorps IgG et IgM, certainsont effectué ces déterminations avec plusieursréactifs. Un laboratoire n’a recherché que lesanticorps IgM. Sept laboratoires ontdéterminé les anticorps totaux; pour troisd’entre-eux (trois centres de transfusion)c’était le seul test effectué. L’avidité des IgGa été évaluée par 72 laboratoires surl’échantillon S/3942 et par 31 laboratoires surl’échantillon S/4034.

6.2.2. Réactifs utilisés

Les tableaux suivants décrivent les réactifsutilisés:

Tableau 6.2.2.1. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorpstotaux

Beckton DickinsonBioMérieux

Dade BehringDiesseEurogenetics

Total

Trousses S/3942 S/4034Fabricant

211111

7

211111

7

CMV Scan Test KitVironostika anti-CMV IIVironostika anti-CMV IIINon spécifiéEnzywell CMV ScreenCMV IgM/IgG Elisa


Tableau 6.2.2.2. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorpsIgG

AbbottBiokitBioMérieuxBioRadDade BehringDiamedDiamedixDiaSorin

DPCEurogeneticsMikrogenHome made

Total


981

671

1611

11213112

206

981

671

1611

11213112

206

AxSYM CMV IgGCMV-IgG Bio-ElisaVIDAS CMV IgGNovum cytomegalovirus IgGEnzygnost anti-CMV IgGCMV IgGCMV IgGETI-CYTOK G PlusLiaison CMV IgGNon spécifiéImmulite CMV IgGCMV IgGrecomBlot CMV IgGEIA IgG

Tableau 6.2.2.3. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorps IgM

Abbott

BioMérieux

BioRadDade BehringDiamedixDiaSorin

EurogeneticsGamma SA BelgiumMikrogenHome made

Total


862

7711

161

18311112

211

842

8411

171

19311112

218

AxSYM CMV IgMIMx CMV IgMVIDAS CMV IgMVironostika anti-CMV IgM IINovum cytomegalovirus IgMEnzygnost anti-CMV IgMCMV IgMETI-CYTOK M reverse PlusLiaison CMV IgMNon spécifiéCMV IgMElisa IgM Antibody G11recomBlot CMV IgMEIA IgG


Tableau 6.2.2.4. Réactifs utilisés pour évaluer l’avidité des IgG

BioMérieuxDade Behring

DiaSorinHome madeNon spécifié

Total

Trousses S/3942

S/4034

Fabricant

273

1

31

636

111

72

VIDAS CMV IgG avidityEnzygnost anti-CMV IgGavidityLiaison CMV IgG avidityHome madeNon spécifié

6.2.3. Résultats

6.2.3.1. Echantillon S/3942

Tous les laboratoires ont répondu les anticorpstotaux et les IgM comme positifs.Pour les IgG, 202 des résultats étaient positifs,deux «borderline» et deux négatifs. Les deuxrésultats «borderline» ont été obtenus avecla trousse ETI-CYTOK G Plus de DiaSorin etla trousse CMV IgG de Diamedix, les résultatsnégatifs ont été obtenus avec la trousse ETI-CYTOK G Plus de DiaSorin et la trousseAxSYM CMV IgG de Abbott.Les 72 participants ayant réalisé un testd’avidité des IgG ont trouvé une avidité faible.

L’interprétation est reprise dans le tableausuivant.


Prise de sang supplémentaire 59Avidité 39Culture CMV dans les urines 6Détermination du CMV glycoprotéine B 2Détermination de l’EBV 2PCR CMV 2Détermination d’antigène CMV 1Contrôle des IgM par Elisa spécifique 1Echografie 1Détermination du VIH 1Détermination du facteur rhumatoïde 1

Total 115

12874

31

206

Interprétation Nombre

Infection primaireTest IgM positif mais tests supplémentairesnécessairesAutrePas d’interprétation

Total

Les trois interprétations «autre» ont étéfaites par des centres de transfusion, où nesont recherchés que les anticorps totaux. Cescentres ont répondu: « séropositivité ».La non-interprétation a été faite par un deslaboratoires qui ne recherchait que lesanticorps totaux.Le laboratoire qui ne recherchait que les IgMa répondu “infection primaire”.

Certains laboratoires ont conseillé plusieurstests supplémentaires, repris dans le tableausuivant

Test Nombre


Nombre de semaines Nombrede laboratoires

Le tableau ci-dessous reprend le nombre desemaines estimé nécessaire avant d’effectuerune nouvelle prise de sang.

1 – 2 12 162 – 3 83 283 – 4 24 14 – 6 1Non indiqué 2

Total 59

Treize laboratoires ont, malgré l’interprétation“infection primaire”, conseillé d’effectuer destests supplémentaires. Dix d’entre-eux lesconseilleraient dans tous les cas et trois, encas de grossesse seulement. Ces tests sontrepris dans le tableau ci-dessous :

Nouvelle prise de sang après 3 semainesNouvelle prise de sang après 12 semainesAviditéNouvelle prise de sang après 2 semaines +aviditéNouvelle prise de sang après 3 semaines +aviditéDétermination des paramètreshématologiques et transaminasesDétermination des paramètreshématologiques et transaminases, avidité etculture

Total

Test Nombre

5112

2

1

1

13



Tous les participants ayant recherchéles anticorps totaux ont rendu unrésultat positif.Parmi les 206 participants, 205 onttrouvé les IgG positives; un participantconsidère qu’elles sont négatives(trousse AxSYM d’Abbott).Parmi les 211 participants, 203 onttrouvé les IgM négatives, sept«borderline» et un positives. Lesréponses «borderline» ont toutes étéobtenues avec la trousse ETI-CYTOK-M reverse plus de DiaSorin, la réponsepositive a été obtenue avec la trousseLiaison CMV IgM de DiaSorin.Les 31 participants qui ont effectuéune détermination de l’avidité des IgGsur cet échantillon ont tous trouvé uneavidité élevée.

L’interprétation est reprise dans letableau suivant:

1962

431

206


Infection ancienneTest IgM borderline IgM mais testssupplémentaires nécessairesSéronégatifAutrePas d’interprétation

Total


Les trois interprétations «autre» ontété répondues par des centres detransfusion, qui ne recherchent queles anticorps totaux. Ces centres ontrépondu: « séropositivité ».La non-interprétation a été faite parun des laboratoires qui ne déterminaitque les anticorps totaux.Deux des laboratoires qui ont trouvéles IgM «borderline» ont conseillé deréaliser des tests supplémentaires: l’una proposé d’effectuer une nouvelleprise de sang après deux semaines +transaminase + paramètreshématologiques, l’autre a conseilléd’effectuer une nouvelle prise de sang+ avidité + détermination de l’EBV.Le laboratoire qui a trouvé les IgMpositives et deux des laboratoires quiont trouvé les IgM «borderline» ontrépondu “ infection ancienne” sur based’une avidité élevée. Trois autreslaboratoires qui ont trouvé les IgMpositives ont répondu «infectionancienne» sans effectuer de testssupplémentaires.L’interprétation «séronégatif» a étéproposée par le laboratoire quin’effectue que les IgM (et les atrouvées négatives) et par troislaboratoires qui ont trouvé les IgMnégatives, mais les IgG positives.Il est à noter qu’un laboratoire arépondu «infection ancienne» mais anéanmoins conseillé d’effectuer unenouvelle prise de sang après deuxsemaines.


6.2.4. Commentaires sur les résultats de l’enquête

Echantillon S/3942 : Infection récente àCMV chez une jeune femme

Pour cet échantillon tous les tests IgM réalisésse sont révélés positifs. En ce qui concerne larecherche des IgG quatre résultats s’écartentdu résultat positif attendu (deux résultats«borderline» et deux résultats négatifs). Cesdiscordances apparaissent d’avantage liées àla réalisation technique qu’au choix d’un réactifparticulier; en effet deux des trois troussesconcernées ont été utilisées sans problème pard’autres participants au EEQ.

L’interprétation “infection primaire”a été cellede 128 laboratoires.

- dans 72 cas l’avidité des IgG avait étéévaluée et trouvée faible.

- dans 56 cas, le diagnostic d’infectionprimaire a été posé sur base d’un résultatIgM positif associé à une cliniqueévocatrice.

Il faut se rappeler que la seule preuve formellede primo-infection est l’observation d’uneséroconversion et que la présence d’IgM dansun sérum ponctuel ne peut en aucun cas êtreconsidérée comme un marqueur d’infectionrécente. Certains tests ont été développés cesdernières années et leur utilisation comme testcomplémentaire a d’ailleurs été proposée pardifférents laboratoires (la mesure de l’aviditédes IgG et la recherche des anticorps anti-gB).


Il faut cependant garder à l’esprit qu’il s’agitde tests qui permettent d’exclure uneinfection récente, mais qu’ils ne permettent pasde conclure à une infection récente.

Enfin, il faut noter qu’un des laboratoiresparticipant n’a réalisé que la recherche desIgM et a conclu à une infection primaire surbase d’un résultat positif, sans connaître lestatut IgG de la patiente. Il faut se rappelerque:

- la présence d’IgM en l’absence d’IgG nepermet pas de conclure à une infectionrécente; seule une séroconversion IgGéventuellement observée sur un sérumtardif pourra apporter la réponse.

- que la présence d’IgM en présence d’IgG estun critère insuffisant pour conclure à uneinfection récente (cfr. ci-dessus).

- que dans le cadre du suivi d’une grossesse,le suivi des IgM seules peut être aléatoire:des séroconversions sans IgM sont décrites,certaines patientes perdent trèsrapidement leurs IgM. Si le choix est de netester qu’un seul paramètre, il estpréférable de rechercher les IgG.


Echantillon S/4034 : Infection ancienne àCMV chez un homme de 60 ans

Pour cet échantillon tous les tests IgG réalisésse sont révélés positifs, sauf un. Cettediscordance apparaît d’avantage liée à laréalisation technique qu’au choix du réactif,utilisé sans problème par beaucoup d’autresparticipants au EEQ.

Tous les résultats IgM étaient négatifs, saufsept réponses IgM borderline et une réponseIgM positive observées avec des trousses deDiaSorin. Il n’est pas rare d’obtenir en routinedes résultats discordants pour les IgM surtoutlorsqu’elles sont «borderline» ou faiblementpositives et ce, quels que soient les réactifsutilisés. Le choix d’un autre sérum pour le EEQ,aurait pu donner un «profil» de discordancedifférent, pour d’autres trousses.

De façon un peu surprenante, 31 laboratoires(parmi lesquels la plupart avait un résultat IgMnégatif) ont évalué l’avidité des IgG dans cetéchantillon. Il s’agit probablement plus d’un«réflexe de EEQ» que d’un algorithmehabituel...

Enfin, quatre laboratoires ont donné commeinterprétation pour ce sérum «Séronégatif»sur base d’un résultat IgM négatif. Pour évitertoute confusion, les termes séropositif ouséronégatif doivent strictement s’appliquer àdes patients qui ont ou non des IgG et ce, quelque soit le résultat des IgM.

M. Bodeus, Cliniques universitaires St-Luc , Bruxelles


6.3. EBV

6.3.1. Les participants

Au total 190 laboratoires ont participé à cetteenquête. La plupart d’entre-eux ont recherchéles anticorps IgG et IgM, certains ont effectuéces déterminations avec plusieurs réactifs.Treize laboratoires ont recherché lesanticorps hétérophiles dans l’échantillon S/3942, douze l’ont fait dans l’échantillon S/4034. Un laboratoire a déterminé les anticorpstotaux, sans spécification de la trousse ou dufabricant. Un laboratoire a déterminé l’aviditéavec la trousse Enzygnost anti-EBV IgG avidityde Dade Behring dans l’échantillon S/3942 eta trouvé une forte avidité.Quatre laboratoires ont déterminé seulementles IgM dans les deux échantillons. Uncinquième a déterminé IgG et IgM dansl’échantillon S/3942 mais seulement les IgMdans l’échantillon S/4034.

6.3.2. Réactifs utilisés

Les tableaux suivants décrivent les réactifsutilisés:

Tableau 6.3.2.1. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorpshétérophiles

BiokitBioMérieuxLucronMeridianOxoidUnipathNon spécifié

Total

Trousses S/3942

S/4034

Fabricant

211-152

12

2111152

13

MonolatexMonoslide TestMNI Fumouze testMonospot LatexMono G TestClearviewNon spécifié


Tableau 6.3.2.2. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorpsIgG

Trousses S/3942

S/4034

Fabricant

Alphadia EBV IgG 2 2Biognost anti-EBV-CA Elisa IgG 14 14

CAPTIA VCA IgG 5 5anti-EBV-EA Elisa IgG 1 1anti-EBV-EBNA IIF IgG 1 1EBNA-1 IgG EIA 1 1Non Spécifié 6 6

BioMérieux Vironostika EBV VCA IgG 5 5Vironostika EBV EBNA IgG 2 2

BioRad Novum Epstein Barr virus 1 1VCA IgG

Biotest anti-EBV EBNA-IgG Elisa 8 7anti-EBV EA-IgG Elisa 4 4Non Spécifié 1 1

BMD Immunodot Mono-G Test 15 14EBV VCA IgG Immunowell 7 7EBV EBNA IgG Immunowell 1 1Non Spécifié 1 1

Dade Behring Enzygnost anti-EBV IgG 50 50DiaSorin ETI-VCA-G 8 8

Liaison VCA IgG 5 5Non Spécifié 2 2

Euroimmun IgG anti-EA 1 1IgG anti-EBNA 1 1IgG anti-VCA 1 1

Forlab/Focus EBV VCA IgG IFA 6 6Gamma SA Belgium Elisa IgG G21 1 1Immunoconcepts EBV VCA IgG 1 1componentsMeridian EBV IgG IFA 23 23

EBV IgG EIA 11 11EBNA-1 IgG EIA 2 2EBV-EA IFA 2 2EBNA ACIF 1 1

Merifluor EBV IgG IFA/IFT 1 1Mikrogen recomLine EBV IgG 1 1Sigma EBV IgG 1 1Viron/Serion EBV VCA IgG 5 5Non Spécifié Non Spécifié 4 4

Total 202 200


Tableau 6.3.2.3. Réactifs utilisés pour rechercher les anticorpsIgM

Trousses S/3942

S/4034

Fabricant

Alphadia EBV IgM 2 2Biognost anti-EBV-CA Elisa IgM 14 14

CAPTIA VCA IgM 5 5Non Spécifié 7 7

BioMérieux Vironostika EBV VCA IgM 5 5BioRad Novum Epstein Barr virus 1 1

VCA IgMBiotest anti-EBV EA-IgM Elisa 9 9

anti-EBV VCA-IgM Elisa 1 1Non Spécifié 1 1

BMD Immunodot Mono-M Test 14 14EBV VCA IgM Immunowell 7 7Non Spécifié 1 1

Dade Behring Enzygnost anti-EBV IgM 50 50DiaSorin Liaison EBV IgM 6 6

ETI-EBV-M-reverse 5 5Non Spécifié 2 2

Euroimmun IgM anti-VCA 1 1Forlab/Focus EBV VCA IgM RIFA 8 8Gamma SA Belgium Elisa IgM G22 1 1Immunoconcepts EBV VCA IgM RIFA 1 1componentsMeridian EBV IgM IFA 27 25

EBV IgM EIA 16 16Merifluor EBV IgG IFA/IFT 1 1Mikrogen recomLine EBV IgM 1 1Viron/Serion EBV VCA IgM 4 4Non Spécifié 4 4

Total 194 192


6.3.3. Résultats


Tous les laboratoires qui ontrecherché les anticorps hétérophiles,les ont trouvés négatifs.Les conclusions concernant lesanticorps IgG et IgM sont reprisesdans le tableau suivant :

Conclusion IgG IgM

Positif 197 62Borderline 1 33Négatif 4 99

Totaal 202 194

Trois des quatre résultats négatifssont des résultats des IgG-EA ; ceslaboratoires ont trouvé les IgG-VCAet/ou les IgG-EBNA positives. Lequatrième laboratoire ayant répond« IgG négatives » n’a déterminé qu’untype d’IgG, ainsi que le laboratoire quia répondu «borderline».

L’interprétation est reprise dans letableau ci-dessous


Infection ancienne 100Test IgM positif mais tests 60supplémentaires nécessairesInfection primaire 15Séronégatif 2Autre 13

Total 190


Les interprétations «séronégatif»proviennent d’un des laboratoires quin’a recherché que les IgM et les atrouvées négatives et d’un laboratoirequi a trouvé les IgM et les IgGnégatives. Deux des trois autres laboratoires quin’ont recherché que les IgM ontrépondu « pas d’infection primaire »(puisqu’ils ont obtenu des IgMnégatives) ; le troisième laboratoire aobtenu des IgM positives et a conseilléd’effectuer des tests supplémentaires(détermination des IgG, de l’EBNA, del’avidité et des anticorpshétérophiles).Les trois laboratoires qui ont trouvédes IgG-EA négatives, ont obtenu desIgG-EBNA et/ou IgG-VCA positiveset ont répondu «infection ancienne»,les IgM étant négatives. Le laboratoirequi a obtenu les IgG «borderline», aobtenu des IgM négatives et aégalement répondu «infectionancienne».

Les interprétations «autre» sont : pasd’infection primaire par EBV (2 fois),réactivation (4 fois), stimulationpolyclonale à cause d’une infection parCMV (6 fois) et réactivation oustimulation polyclonale (1 fois).


Test Nombre

Prise de sang supplémentaire 40Avidité 20EBNA 13EBNA + EA 6Détermination du CMV 5Paul et Bunnell 4EA 2Détermination des IgG EBV 1Contrôle des IgM après absorption 1Détermination des transaminases 1Détermination de la formule des 1globules blancsNon indiqué 1

Total 95

Le tableau suivant reprend le nombrede semaines estimé nécessaire avantd’effectuer une nouvelle prise de sang.

Nombre de semaines Nombre de laboratoires

2 152 – 3 33 193 – 6 14 1Non indiqué 1

Total 40

Des 15 laboratoires qui ont proposél’interprétation «infection primaire»par EBV, un n’effectue pas de testsCMV. Parmi les 14 autres, 12 proposentégalement l’interprétation «infection

Certains laboratoires ont conseilléplusieurs tests supplémentaires, reprisdans le tableau ci-dessous.



Tous les laboratoires qui ontrecherché les anticorps hétérophiles,les ont trouvé négatifs.Les conclusions concernant lesanticorps IgG et IgM sont reprisesdans le tableau ci-dessous

Conclusion IgG IgM

Positif 195 2Borderline 0 0Négatif 5 190

Total 200 192

Quatre des cinq résultats négatifssont des résultats d’IgG-EA ; troisd‘entre-eux ont trouvé les IgG-VCAet/ou les IgG-EBNA positives ; lequatrième laboratoire n’a déterminéque les IgG-EA. Le dernier des cinq nementionne pas le type des IgGdéterminés.

L’interprétation est reprise dans letableau suivant.

primaire» pour le CMV et deuxconseillent d’effectuer des testssupplémentaires (un laboratoireconseille d’effectuer l’avidité et unenouvelle prise de sang après deuxsemaines, l’autre propose d’effectuerla détermination du facteurrhumatoïde, l’antigène CMV et lesanticorps contre le VIH).



Infection ancienne 181Test IgM positif mais tests 1supplémentaires nécessairesSéronégatif 6Autre 2

Total 190

Deux des interprétations«séronégatif» proviennent delaboratoires qui n’ont recherché queles IgM et les ont trouvées négatives.Deux autres interprétations«séronégatif» proviennent delaboratoires qui ont trouvé les IgG etIgM négatives. Une interprétation«séronégatif» a été donnée par lelaboratoire qui a trouvé les anticorpstotaux et les IgM négatives. Enfin, ladernière interprétation «séronégatif»a été proposée par un laboratoire quia trouvé IgM négatives mais les IgGpositives.

Deux des trois autres laboratoires quin’ont déterminé que les IgM proposentl’interprétation «pas d’infectionprimaire» (les IgM étant négatives),le troisième laboratoire, qui aégalement obtenu des IgM négatives,propose néanmoins l’interprétation«infection ancienne».

Les trois laboratoires qui ont trouvédes IgG-EA négatives, ont obtenu desIgG-EBNA et/ou IgG-VCA positives


et on répondu «infection ancienne»,les IgM étant négatives.

Le laboratoire qui conseilled’effectuer des testssupplémentaires, propose d’effectuerune détermination de l’avidité, les IgMet IgG étant toutes les deux positives.

6.3.4. Commentaires des résultats de l’enquête

Echantillon S/3942 : Infection ancienne àEBV chez une jeune femme

Peu de problème pour la recherche des IgGanti-EBV chez cette patiente.

- 197 réponses sont positives en IgG.

- 3 des réponses négatives correspondent àdes recherche d’IgG anti-EA; dans les troiscas les IgG anti-VCA et anti-EBNA étaientpositives. Ces résultats illustrent bien queles IgG anti-EA ne doivent pas être utiliséespour évaluer «l’immunité» anti-EBV.

- reste un échantillon négatif et un échantillon«borderline» pour lesquels la nature desIgG recherchées n’est pas précisée...

Les résultats des test IgM sont plushétérogènes mais pas étonnants. Pour l’EBVcomme pour le CMV, il n’est pas rare d’obteniren routine des résultats discordants surtoutlorsque les IgM sont «borderline» oufaiblement positives et ce, quels que soient lesréactifs utilisés. En cas d’IgM anti-EBVpositives, certains tests permettent de


préciser le diagnostic sérologique et leurutilisation comme test complémentaire ad’ailleurs été proposée par différentslaboratoires (principalement la recherche desanticorps anti-EBNA et la mesure de l’aviditédes IgG).

Parmi les laboratoires participant, 100concluent à une infection ancienne et 60souhaitent des tests complémentaires au vudes résultats IgM positifs. Treize laboratoiresdont l’interprétation est classée «autre»concluent en fait eux aussi à une infectionancienne et tentent de donner une explicationà la présence des IgM: réactivation et/ouactivation polyclonale suite à la primo-infectionà CMV et/ou réaction croisée...... peut-être l’unou l’autre, ou l’un et l’autre, impossible ou pourle moins difficile à démontrer.La recherche des IgA ou des anticorps anti-EA est parfois proposée pour mettre enévidence une «réactivation». L’intérêt demettre en évidence une «putative»réactivation à EBV chez un individuimmunocompétent reste à démontrer. Chez lespatients immunodéprimés la recherche dugénome viral par des méthodes de biologiemoléculaire peut être intéressante.

L’interprétation d’infection primaire a étéfaite par 15 laboratoires sur base d’un résultatIgG positif et IgM positif. La remarque est lamême que pour le CMV, la présence d’IgM dansun sérum ponctuel ne peut en aucun cas êtreconsidérée comme un marqueur d’infectionrécente. Cet échantillon en est une belleillustration.


Echantillon S/4034 : Infection ancienne àEBV chez un homme de 60 ans

Echantillon presque sans problème.Aucun commentaire particulier sinon deuxremarques déjà formulées plus haut:- sur la bonne utilisation du vocable

«séronégatif»- sur l’interprétation d’un résultat négatif

pour les IgG anti-EA.

M. Bodeus, Cliniques universitaires St-Luc , Bruxelles


6.4. Toxoplasme

6.4.1. Participants

Au total 207 laboratoires ont participé à cetteenquête. La plupart des laboratoires ontdéterminé les anticorps IgG et IgM; certainsont effectué ces déterminations avec plusieursréactifs.Quatorze laboratoires ont déterminés lesanticorps IgA et 69 ont déterminé l’avidité. Unlaboratoire a déterminé les anticorps totaux.

6.4.2.Réactifs utilisés

Les tableaux suivants représentent lesréactifs utilisés pour la détection et le dosagedes différents anticorps.

Tableau 6.4.2.1. Réactifs utilisés pour déterminer les anticorps IgGdans l’échantillon S/2724

Trousses NombreFabricant

Abbott AxSYM Toxo IgG 95Toxo MEIA 4

Bayer ADVIA Centaur Toxo IgG 9Beckman Access Toxo IgG 28BioMérieux VIDAS Toxo IgG 42

Toxo-spot IF 5BioRad Platelia Toxo IgG 2Dade Behring Enzygnost Toxoplasmosis IgG 1Diamedix Toxo IgG EIA 1DiaSorin ETI-TOXOK-G Plus 11

Liaison Toxo IgG 2DPC Toxoplasma IgG 8Home Made EIA IgG 2Non spécifié Non spécifié 2

Total 212


Tableau 6.4.2.2. Réactifs utilisés pour déterminer les anticorpsIgM dans l’échantillon S/2724


Abbott AxSYM Toxo IgM 95Toxo MEIA 4

Bayer ADVIA Centaur Toxo IgM 8Beckman Access Toxo IgM 28BioMérieux VIDAS Toxo IgM 47

Toxo-spot IF 8Toxonostika IgM 1

BioRad Platelia Toxo IgM 3Dade Behring Enzygnost Toxoplasmosis IgM 1Diamedix Toxo IgM EIA 1DiaSorin ETI-TOXOK-M reverse Plus 13

Liaison Toxo IgM 2DPC Toxoplasma IgM 5Home Made EIA IgM 2Non spécifié Non spécifié 2

Total 220

Tableau 6.4.2.3. Réactifs utilisés pour déterminer les anticorpsIgA dans l’échantillon S/2724


BioMérieux Toxo-spot IF 2BioRad Platelia Toxo IgA 5DiaSorin ETI-TOXOK-A reverse Plus 5Home Made EIA IgA 2

Total 14


Tableau 6.4.2.4. Réactifs utilisés pour déterminer l’avidité dansl’échantillon S/2724


BioMérieux VIDAS Toxo IgG avidity 64Dade Behring Enzygnost Toxoplasmosis IgG 3DiaSorin Liaison Toxo IgG avidity 2

Total 69

6.4.3. Résultats

Deux échantillons S/2724 différents ont étéenvoyés en fonction du numéro d’agrément.

6.4.3.1. Laboratoires avec un numérod’agrément pair

Ce groupe est constitué de 118laboratoires.

Ces laboratoires ont effectué 121déterminations des IgG. Tous cesrésultats étaient positifs.Quatre n’ont pas mentionné le résultatquantitatif. Parmi les réponses onretrouve 114 fois des IgG élevées(valeur de plus de 200 U/ml). Il y aquand même 3 laboratoires qui onttrouvé des valeurs faibles ou mêmenégatives :- un de ces laboratoires utilise un

test « home made » (ce laboratoirea également déterminé les IgG avecle Toxo-spot IF sans mentionner lavaleur trouvée). Le laboratoire adéterminé les IgM avec les mêmes


méthodes et a obtenu une valeurélevée et une valeur faible,respectivement avec la trousseToxo-spot IF et la trousse « homemade ».

- les deux autres résultats avec desvaleurs faibles ont été obtenusavec les trousses AxSYM IgGd’Abbott et VIDAS IgG deBioMérieux. Ces deux laboratoiresont trouvé des IgM faibles(l’utilisateur de la trousse AxSYMa même estimé que les IgM étaientnégatives) avec les troussescorrespondantes pour détectiond’IgM de ces compagnies.

123 déterminations des IgM ont étéeffectuées. Les résultats sont reprisdans le tableau ci-dessous.

Conclusion IgM

Positif 101Borderline 18Négatif 4

Total 123

Trois des 4 résultats négatifs ont étéobtenus avec la trousse AxSYMd’Abbott (2 fois) et la trousseToxoplasma IgG de DPC. Le 4e

laboratoire a utilisée une techniqueimmunofluorescence ; ce laboratoire aégalement déterminé les IgM avec uneméthode ELISA (avec une densitéoptique de 6,98 et donc un résultatpositif).


Dix laboratoires ont déterminé lesIgA. Ils ont tous trouvé des résultatspositifs. Les valeurs divergentfortement (ceci est probablement liéà l ’utilisation de différentestechniques et unités).

L’avidité a été déterminée par 46laboratoires. 43 ont utilisé la trousse« VIDAS IgG avidity » de BioMérieux.Lorsqu’ils étaient mentionnés, lespourcentages variaient entre 15 et30%. L’utilisateur de la trousse« Liaison Toxo IgG avidity » (DiaSorin)a obtenu un pourcentage de 43%; lesdeux utilisateurs de la trousseEnzygnost Toxoplasmosis IgG avidity(Dade Behring) ont obtenu despourcentages de 72 et 82%

Les interprétations sont reprises dansle tableau ci-dessous.

5353

93

118


Infection primaireTest IgM positif mais testssupplémentaires nécessairesInfection ancienneAutre

Total

Les interprétations « autre » sont :« infection aiguë avec une cliniquepersistante depuis 10-20 semaines »,« infection primaire ou ancienne,contrôle des IgG et IgM conseillée, etde l’avidité en cas de grossesse » et


« infection récente : détermination del’avidité est souhaitable ; si l’aviditéest faible les IgM, IgA etéventuellement les IgG doivent êtrecontrôlées après 3 semaines ».

Les interprétations des 3 laboratoiresqui ont obtenu des valeurs faibles pourles IgG étaient « infection ancienne »(1 fois) et infection primaire (2 fois).L’interprétation « infectionancienne » a été proposée par lelaboratoire qui a répondu que les IgMétaient négatives. Une interprétation« infection primaire » provient dulaboratoire qui a déterminé les IgMavec deux résultats quantitatifsdifférents en fonction de la méthode.Un autre laboratoire qui a trouvé lesIgM négatives a aussi donné commeinterprétation « infection ancienne ».Un 3e laboratoire qui a trouvé les IgMnégatives a donné commeinterprétation « infection primaire »(ce laboratoire a trouvé une aviditéfaible). Le laboratoire qui a trouvé desIgM tant négatives que positives, aproposé l ’interprétation « testssupplémentaires nécessaires, à savoirla détermination de l’avidité et unenouvelle prise de sang après 3semaines).

Certains laboratoires ont conseilléplusieurs tests supplémentaires. Cestests supplémentaires sont repris dansle tableau ci-dessous.


Test Nombre

Prise de sang supplémentaire 35Avidité 33IgA 12IgM IF 3IgM EIA 1Détermination du CMV 1Détermination de l’EBV 1Contrôle avec un autre technique 1 (VIDAS)Elisa capture 1HCG 1Réaction de la fixation du complément 1Non indiqué 2

Total 92

Dans le tableau ci-dessous est reprisl’écart estimé nécessaire entre 2prises de sang (exprimé en semaines)par les laboratoires avec un numérod’agrément pair.

Nombre de semaines Nombrede laboratoires

1 -2 12 92 – 3 33 193 – 4 24 1

Total 35

Il est à noter que 4 laboratoires quiont répondu comme interprétation« infection primaire », conseillentnéanmoins d’effectuer des testssupplémentaires (prise de sangsupplémentaire, avidité ou les deux) ;2 laboratoires qui ont répondu


6.4.3.2. Laboratoires avec un numérod’agrément impair

Ce groupe est constitué de 89laboratoires.

Ces laboratoires ont effectué 91déterminations des IgG. 89 de cesrésultats étaient considérés commepositifs et 2 comme borderline. Ces 2interprétations ont été obtenues avecla trousse ETI-TOXOK-G de DiaSorinet la trousse Enzygnost ToxoplasmosisIgG de Dade Behring.

Un seul laboratoire n’a pas mentionnéle résultat quantitatif. Deuxlaboratoires ont trouvé de fortesconcentrations en IgG ; ces résultatsont été obtenus avec la trousseToxoplasma IgG de DiaSorin et latrousse AxSYM IgG d’Abbott. Cesdeux laboratoires ont égalementtrouvé de fortes concentrations enIgM (avec la trousse ETI-TOXOK-Mreverse Plus de DiaSorin et la trousseAxSYM IgG d’Abbott). Le deuxièmelaboratoire a également retrouvé uneavidité faible.

97 déterminations des IgM ont étéeffectuées. Elles étaient toutespositives. Lorsqu’elles étaientmentionnées, les valeurs étaientélevées voir même très élevées.

« infection ancienne » conseillentégalement de déterminer l’avidité.


Quatre déterminations des IgA ontété effectuées. Trois ont étéinterprétées comme positives, unecomme borderline. Ce dernier résultata été obtenu avec la trousse Toxo-spot IF de BioMérieux.

L’avidité a été effectuée par 23laboratoires. 21 ont utilisé la trousseVIDAS IgG avidity de BioMérieux.Lorsqu’ils étaient mentionnés, lespourcentages variaient entre 2 et 7%.L’utilisateur de la trousse Liaison ToxoIgG avidity (DiaSorin) a obtenu unpourcentage de 15%; l’utilisateur de latrousse Enzygnost Toxoplasmosis IgGavidity (Dade Behring) a obtenu unpourcentage de 16%.

Les interprétations sont reprises dansle tableau ci-dessous :


Infection primaire 51Test IgM positif mais tests 36supplémentaires nécessairesInfection ancienne 1Séronégatif 1

Total 89

Les deux laboratoires qui ont trouvédes IgG élevées ont répondu« infection primaire ». Leslaboratoires qui ont obtenu des IgG« borderline » ont proposé commeinterprétation respectivement« infection primaire » et « testsupplémentaires nécessaires, à savoirl’avidité ».


Certains laboratoires ont conseilléplusieurs tests supplémentaires. Cestests supplémentaires sont repris dansle tableau ci-dessous :

Test Nombre

Prise de sang supplémentaire 30Avidité 21IgA 5Confirmation des IgM avec 4d’autres techniques Détermination du CMV 1Détermination de l’EBV 1Confirmation des IgG avec Elisa 1Envoi à autre laboratoire en cas 1de grossesse

Total 64

Dans le tableau ci-dessous est reprisl’écart estimé nécessaire entre 2prises de sang (exprimé en semaines)par les laboratoires avec un numérod’agrément impair.

Nombre de semaines Nombre de laboratoires

2 122 – 3 23 16

Total 30

Il est à noter que 4 laboratoires quiont proposé l ’interprétation« infection primaire », ont néanmoinsconseillé d’effectuer des testssupplémentaires (3 ont conseillé uneprise de sang supplémentaire, unlaboratoire a proposé la déterminationde l’avidité).


6.4.4. Commentaires sur les résultats de l’enquête

L’information clinique de l’échantillon spécifiaitqu’il s’agissait d’une jeune femme ayant desplaintes de fatigue; des ganglions étaientprésents.6.4.4.1. Discussion des résultats des

laboratoires avec un numérod’agrément pair.Les laboratoires ayant un numérod’agrément pair ont reçu unéchantillon d’une patiente qui avait euune toxoplasmose aiguë 5 moisauparavant.Cet échantillon avait des IgG élevéeset des IgM faibles.

IgGLa plupart des laboratoires ont trouvédes IgG élevées (300 à 5370 unités).Cependant trois laboratoires onttrouvé une valeur faible ou mêmenégative. Un de ces laboratoiresutilisait un test « home made », lesdeux autres des tests commerciaux.La comparaison des résultats de ces 2laboratoires avec ceux deslaboratoires qui utilisaient le mêmeréactif est reprise dans le tableau ci-dessous:

Résultats des autresutilisateurs

Résultats des2 laboratoires

Trousse

Axsym IgG Abbott: 393 - 5370 11,8Vidas IgG 300 - 3956 2,504 (-)


Le problème n’est donc pas lié à unesensibilité insatisfaisante destrousses utilisées.Ces trois laboratoires ont donc unproblème avec la détermination desIgG. Ils peuvent demander à l’ISP deleur envoyer un nouvel échantillon afinqu’ils puissent déterminer la cause duproblème. S’ils continuent à retrouverdes valeurs faibles, une analyseapprofondie de leur méthode seranécessaire.Le laboratoire qui utilise un test “homemade”, devrait également effectuerune analyse approfondie de satechnique.

IgMLes échantillons envoyés contenaientune faible quantité d’IgM. Ces IgMn’ont pas été retrouvées par tous leslaboratoires. Etant donné que les IgMpeuvent persister longtemps après uneinfection aiguë (souvent plusieursannées), il est souhaitable d’exprimerle résultat des IgM de manièrequantitative (titre ou rapport) ousemi-quantitative (faiblement positif,positif ou hautement positif). La valeurdu titre peut influencerl’interprétation du profil sérologique.Six des laboratoires (5%) n’ont donnéqu’une réponse qualitative pour lesIgM (c’est à dire : ils ont répondu :« positif » ou « négatif »). Unedétermination quantitative ou semi-quantitative est néanmoins essentielleafin de pouvoir déterminer le momentde l’infection.


InterprétationL’interprétation d’un profil sérologiqued’une toxoplasmose avec IgG élevéeset IgM faibles est toujours trèsdifficile. Chez les patients avec desIgG élevées, il y a peu de chance qu’unedeuxième prise de sang montre uneaugmentation significative étantdonné que la production des anticorpsa déjà atteint un plateau. Il serait plusintéressant d’effectuer chez cespatients des tests sérologiquessupplémentaires tel que lesdéterminations des IgM et IgG maisavec une autre technique, ladétermination des IgA, ladétermination de l’avidité des IgG, etc.La combinaison de ces différentestechniques résoudra dans la plupartdes cas la question concernant lemoment de l’infection.L’option « sérologie positive dansl’essai IgM ; afin d’exclure uneinfection récente une confirmationest nécessaire » était la meilleure desdifférentes possibilités proposées.Les techniques sérologiquessupplémentaires, qui pourraient aiderà déterminer le moment de l’infectiond’une toxoplasmose, sont lessuivantes :- Anticorps IgA: ceux-ci

apparaissent après les anticorpsIgM et disparaissent plus vite.Attention : une persistance desanticorps IgA (parfois mêmependant des années) existe chezcertains patients.


- L’avidité des IgG: il est importantque chaque laboratoire évalue sapropre technique de déterminationde l’avidité et définisse lescaractéristiques de l’efficacité. Sielle est effectuée dans desconditions optimales, une aviditéélevée, en combinaison avec les IgMpositives, exclut en principe lapossibilité d’une infection primairerécente (c’est à dire durant lestrois mois précédent la prise desang). Une avidité faible, encombinaison avec les IgM positives,par contre, n’est pasnécessairement une indication d’uneinfection récente (une aviditéfaible peut être retrouvée durantdes mois, et même plus d’une année,après une infection aiguë).

- Détermination des IgM avec uneautre technique: la période,pendant laquelle les IgM peuventêtre retrouvées dépend de latechnique utilisée dans lelaboratoire. Le taux des IgMmesurées avec des techniquesd’immunofluorescence descend, engénéral, plus vite que celui mesuréavec les immuno-essais.


6.4.4.2. Discussion des résultats deslaboratoires avec un numérod’agrément impair.Les laboratoires ayant un numérod’agrément impair ont reçu unéchantillon d’une patiente avec unetoxoplasmose aiguë (prise de sang : 4semaines après l ’infection). Cetéchantillon avait des IgG faibles etdes IgM élevées.

IgGLa plupart des laboratoires ontretrouvés des IgG faibles (7 à 87unités).Deux laboratoires ont cependantretrouvé des IgG élevées (247 et>300). Ils peuvent demander à l’ISP deleur envoyer un nouvel échantillon afinqu’ils puissent déterminer la cause duproblème.

IgMLes échantillons envoyés contenaientde IgM élevées.Tous les laboratoires ont obtenu unrésultat positif. 93 % des résultats(90 sur 97 au total) ont été rapportésd’une manière quantitative ou semi-quantitative.

InterprétationLa combinaison des IgG faibles et IgMélevées est nettement plus facile àinterpréter que la situationprécédente : un tel profil induitimmédiatement la suspicion d’uneinfection aiguë.


A. Naessens, UZ VUB, Jette

Parmi les différentes réponses, lesoptions suivantes sont acceptables :

« Infection primaire »« Sérologie positive dans l’essaiIgM ; afin d’exclure une infectionrécente une confirmation estnécessaire »

Les techniques sérologiquessupplémentaires qui pourraient aiderà déterminer le moment de l’infectionde cet échantillon sont les suivantes :- L’avidité des IgG: cet échantillon

avait une avidité faible; dans ce casl’avidité peut confirmer la suspiciond’une infection aiguë. Attention :une avidité faible n’exclut pas lapossibilité d’une infection ancienne.

- Détermination des IgA: au débutd’une infection à toxoplasme lesIgA peuvent encore être négatives.Les IgA négatives n’excluent doncpas une infection aiguë.

- Nouvelle prise de sang: le débutd’une infection aiguë est marquépar une augmentation significativedes IgG entre deux échantillonssuccessifs. Un deuxième échantillon(2 à 3 semaines après le premieréchantillon) confirmera dans ce casle diagnostic d’une infection aiguë(il faut comparer les titres avec deséchantillons couplés).

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SERVICE PUBLIC FEDERAL SANTE PUBLIQUE,SECURITE DE … · Rapport global Page 1 sur 85 Microbiologie 2003/1 I. REMARQUES GENERALES Pour la première enquête du cycle 2003 (enquête