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SILAS FERNANDES ETO
ESTUDO DAS VIAS DE INOCULAÇÃO SOBRE A RESPOSTA
IMUNE HUMORAL E CARACTERÍSTICAS HISTÓLOGICAS
DO BAÇO DE GALINHAS POEDEIRAS IMUNIZADAS COM
HEMÁCIA DE CARNEIRO
LONDRINA
2010
Livros Grátis
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SILAS FERNANDES ETO
ESTUDO DAS VIAS DE INOCULAÇÃO SOBRE A RESPOSTA
IMUNE HUMORAL E CARACTERÍSTICAS HISTÓLOGICAS
DO BAÇO DE GALINHAS POEDEIRAS IMUNIZADAS COM
HEMÁCIA DE CARNEIRO
Dissertação apresentada ao programa de Mestrado e
Doutorado em Patologia Experimental da
Universidade Estadual de Londrina, como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em Patologia
Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Emerson José Venâncio
LONDRINA
2010
Catalogação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca
Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
E85e Eto, Silas Fernandes.
Estudo das vias de inoculação sobre a resposta imune humoral e características
histológicas do baço de galinhas poedeiras imunizadas com hemácia de carneiro /
Silas Fernandes Eto. – Londrina, 2010.
49 f. : il.
Orientador: Emerson José Venâncio.
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) Universidade Estadual de
Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental, 2010.
Inclui bibliografia.
1. Imunologia veterinária – Teses. 2. Galinha – Imunologia – Teses. 3. Resposta imune –
Teses. 4. Ave – Baço – Histologia – Teses. 5. Anticorpos policlonais – Teses. 6.
Imunoglobulinas – Teses. 7. Carneiro – Eritrócitos – Teses. I. Venâncio, Emerson José. II.
Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-
Graduação em Patologia Experimental. III. Título.
CDU 619:577.27
SILAS FERNANDES ETO
ESTUDO DAS VIAS DE INOCULAÇÃO SOBRE A RESPOSTA IMUNE
HUMORAL E CARACTERÍSTICAS HISTÓLOGICAS DO BAÇO DE
GALINHAS POEDEIRAS IMUNIZADAS COM HEMÁCIA DE
CARNEIRO
Dissertação apresentada ao programa de Mestrado e
Doutorado em Patologia Experimental da
Universidade Estadual de Londrina, como requisito
à obtenção do título de Mestre em Patologia
Experimental.
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________
Prof. Dr. Emerson José Venancio
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________
Prof. Dr. Mario Agusto Ono
Universidade Estadual de Londrina
____________________________________
Profª Drª Solange de Paula Ramos
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, __ de ________ de 2010.
Aos meus amados pais, Antonio Kusuo Eto e
minha mãe Cláudia Pinto Brandão Eto, e meus
amados irmãos, José Alberto Brandão Pires,
Claudia Brandão Pires Thomé e Antonio Vitor
Brandão Eto, pelo grande apoio e dedicação em
todas as etapas de minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao Senhor Deus, pela vida e por permitir redescobrir um
pouco de sua criação.
Ao meu honrado e amado pai Antonio Kussuo Eto, que alem de permitir meu
primeiro sopro de vida e me conduzir a este mundo, foi meu mestre maior conduzindo este
jovem aos bons caminhos e permitindo a oportunidade deste mesmo jovem de enxergar a
longe.
A minha nobre mãezinha Cláudia Brandão Eto, que com todo amor adotou este
jovem como fruto de seu próprio ventre.
Ao meu nobre Orientador Prof. Dr. Emerson José Venâncio, que em conjunto a
meus amados familiares, prosseguiu com o treinamento deste jovem abrindo as portas e me
elevando na escadaria da ciência.
Meus sinceros agradecimentos especiais ao nobre Prof. Dr. João Waine Pinheiros,
pela valiosa amizade, sendo peça chave para o desenvolvimento do trabalho, e pela confiança
depositada neste jovem.
A todos os honrados amigos do laboratório de Imuno IV, agradeço pela a amizade
e a sabedoria transmitida, gostaria de citar todos, porem graças a Deus vocês são muito, e em
meu coração tenho todos os nomes gravados a fogo.
Em particular o nobre amigo e conselheiro Doutorando Fábio Goulart de Andrade,
que em todos os momentos foi um grande amigo e grande orientador na vida e na ciência.
A nobre amiga e eterna orientadora Prof. Drª. Solange de Paula Ramos, pela
maravilhosa amizade, e por sua paciência inesgotável.
Aos nobres Professores Doutores do corpo docente da Pós Graduação em
Patologia Experimental, em particular a nobre Prof. Drª. Maria Angélica Ehara Watanabe e o
nobre Prof. Dr. Phileno Pinge Filho e o honrado Prof. Dr. Mário Augusto Ono pelos valorosos
conselhos e sua inestimável amizade.
Aos nobres amigos do laboratório de Patologia Clínica Veterinária–UEL, pela
grande amizade e por serem peças chave para meu trabalho.
Gostaria aqui em particular agradecer a todos os amigos técnicos que me deram o
maior tesouro que é o conhecimento, escrevo e guardo o nome de cada um de vocês em meu
coração
ETO, Silas Fernandes. Estudo das vias de inoculação sobre a resposta imune humoral e
características histológicas do baço de galinhas poedeiras imunizadas com hemácia de
carneiro. 2010. 49 fls. Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) – Universidade
Estadual de Londrina, 2010.
RESUMO
O objetivo do trabalho foi comparar o efeito das vias de inoculação, na resposta imune
humoral de galinhas poedeiras da linhagem White Leghorn e Isa Brown imunizadas com
hemácia de carneiro, avaliar a produção de anticorpos anti-hemácia de carneiro das classes
IgM e IgY e a produção de anticorpos naturais anti-hemácia de coelho. Também foi analisado
as características histológica do baço das galinhas imunizadas com hemácia de carneiro. A via
de inoculação mais eficiente na produção de anticorpos foi a via endovenosa, em ambas as
linhagens testadas, porém a via intramuscular induziu o aumento dos níveis de anticorpos da
classe IgM nas aves da linhagem White Leghorn. A via intraperitoneal se mostrou mais
eficiente na produção de anticorpos totais do que a via endovenosa nas galinhas Isa Brown.
Porém, os níveis de anticorpos da classe IgY são menores. A análise histológica do baço
revelou o aumento das áreas de polpa branca e B dependente nas aves da linhagem Isa Brown.
Palavras-chave: Vias de inoculação. Hemácia de carneiro. Anticorpos naturais e baço.
ETO, Silas Fernandes. Study of inoculation routes on the humoral immune response and
histological features of the spleen of hens immunized with sheep erythrocytes. 2010. 49 p.
Thesis (Master’s Degree in Experimental Pathology) - Universidade Estadual de Londrina,
2010.
ABSTRACT
The aim of this work was to compare the effect of different routes of inoculation on humoral
immune response of White Leghorn e Isa Brown chickens immunized with sheep red blood
cells, to analyse anti- sheep red blood cells IgM and IgG antibodies and natural anti-rabbit
antibodies production. It was also characterized the histological features of spleen of sheep
red blood cells immunized chickens. The most efficient route of inoculation was the
endovenous one, in both strains, but intramuscular route induces a significant increase of IgM
levels in White Leghorn animals. The intraperitoneal route was more efficient than
endovenous one in total antibodies production in Isa Brown chickens. However IgY
antibodies levels were decreased. The spleen analysis demonstrated increased white pulp and
B cell areas in Isa Brown animals.
Key words: Routes of inoculation, sheep red blood cells, antibodies, spleen.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Títulos de anticorpos totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem White
Leghorn após imunização com SRBC .................................................................... 33
Figura 2. Títulos de anticorpos naturais totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem
White Leghorn após imunização com SRBC .......................................................... 34
Figura 3. Análise histológica das áreas de polpa vermelha e branca e do número de
centro germinativos de baços de animais linhagem White legohrn submetidos
a estimulação antigênica ......................................................................................... 35
Figura 4. Títulos de anticorpos totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem Isa
Brown após imunização com SRBC ....................................................................... 36
Figura 5. Títulos de anticorpos naturais totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem
Isa Brown após imunização com SRBC ................................................................. 37
Figura 6. Análise histológica das áreas de polpa vermelha e branca e do número de
centro germinativos de baços de animais linhagem Isa Brown submetidos a
estimulação antigênica. * médias diferem significativamente em relação ao
grupo controle (P <0,05). # médias diferem significativamente em relação ao
grupo i.v. (P <0,05) ................................................................................................. 38
Figura 7. Analise de correlação entre a produção de anticorpos da classe IgY e número
de centro germinativos Experimento I galinhas da linhagem White legohrn e
Experimento II galinhas da linhagem Isa Brown submetidos a estimulação
antigênica ................................................................................................................ 39
LISTA DE ABREVIATURAS
APCs Células apresentadoras de antígeno
BASP Peptídeo anti-esteroidogênico Bursais
ENAC Células não-linfóides associadas
FDC Células dendríticas foliculares
GALT Tecidos linfóides associados à mucosa do sistema digestivo
HSB Soro albumina humana
IL Interleucinas
im Intramuscular
INF- γ Interferon-gamma
Ip Intraperitoneal
Iv intravenoso
MALTs Tecidos Linfóides Associados à Mucosa
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
PALS Bainha Linfóide Periarteriolar
PVC Vênulas pós capilares
PWP Arteríolas penincilares
sc Subcutâneo
SRBC Hemácia e Carneiro (sheep red blood cells)
TGF-α Fator de crescimento transformador alfa
TGF-β Fator de crescimento transformador beta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 11
2 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 12
2.1 IMUNOFISIOLOGIA DAS AVES .............................................................................................. 12
2.2 MECANISMOS DE ATIVAÇÃO DO SISTEMA IMUNE INATO E ADQUIRIDO EM AVES ............... 15
2.3 RESPOSTA IMUNE CELULAR EM AVES ................................................................................ 16
2.4 RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM AVES ............................................................................... 17
2.4.1 Desenvolvimento e Sobrevivência de Células B na Bursa de Fabrícius e
Produção de Imunoglobulinas ................................................................................................. 17
2.4.2 Imunoglobulinas em Aves .............................................................................................. 18
2.4.3 Mecanismos de Transferência de Anticorpos Maternais em Aves ................................ 19
2.4.4 Anticorpos Naturais em Aves ......................................................................................... 19
2.4.5 Produção de Anticorpos IgY .......................................................................................... 20
2.4.6 Vias de Inoculação e Resposta Imune em Baço de Aves Imunoestimuladas ................. 21
3 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 25
3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 25
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................... 25
4 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 26
4.1 ANIMAIS ............................................................................................................................. 26
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ...................................................................................... 26
4.2.1 Seleções dos Animais (Controle da Postura) .................................................................. 26
4.2.2 Formação dos Grupos Experimentais ............................................................................. 27
4.2.3 Imunização e Obtenção de Amostras Biológicas ........................................................... 27
4.3 PREPARO DO ANTÍGENO ...................................................................................................... 27
4.5 CARACTERIZAÇÃO SOROLÓGICA, HISTOLÓGICA E MORFOMÉTRICA ................................... 28
4.5.1 Dosagem de Anticorpos Séricos ..................................................................................... 28
4.5.2 Coleta do Baço ............................................................................................................... 29
4.5.3 Processamento do Material Histológico ......................................................................... 29
4.5.4 Morfometria .................................................................................................................... 30
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................................ 30
5 RESULTADOS ................................................................................................................... 31
6 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 40
CONCLUSÕES ...................................................................................................................... 44
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 45
11
1 INTRODUÇÃO
O estudo do sistema imune das aves tem despertado o interesse de pesquisa
devido a diversas razões, entre elas o surgimento de novas pandemias relacionadas ao vírus da
gripe aviária (DAVISON, 2003). As aves são animais migratórios e podem ser o reservatório
para diversos patógenos, por isso, a compreensão dos mecanismos dos mecanismos de ação
do sistema imune das aves pode contribuir para o desenvolvimento de novas metodologias de
imunização, prevenção e controle destas pandemias (DAVISON, 2003).
Outra razão para estudos do sistema imune das aves é o interesse comercial,
uma vez que o consumo e a produção de carne ou de ovos de aves têm aumentado devido
principalmente à expansão populacional e ao aumento da demanda por alimentos de baixo
custo (DAVISON, 2003).
Além disso, os estudos sobre a produção de anticorpos específico da classe
IgY em aves têm permitido o desenvolvimento de novas tecnologias e alternativas na
prevenção e tratamento de doenças infecciosas e crônicas em humanos e animais
(CHACANA et al., 2004). O uso de anticorpos da classe IgY tem inúmeras vantagens em
relação ao uso de anticorpos da classe IgG de mamíferos, por exemplo, a obtenção de
anticorpos IgY a partir da gema do ovo, evitando a sangria e contribuindo para o bem estar do
animal usado na produção de anticorpos (CARLANDER, 2002; CHACANA et al., 2004). Os
IgY quando utilizados em ensaios biológicos e terapêuticos em mamíferos, não apresentam
reação cruzada com o fator reumatóide e não provocam a ativação do sistema complemento,
com a ativação da via clássica (CHACANA et al., 2004). Estas particularidades funcionais
estão relacionadas à distância filogenética entre os dois grupos (CARLANDER, 2002). Por
isso, estudos do sistema imune das aves podem contribuir para o desenvolvimento e
aperfeiçoamento de métodos de produção de anticorpos policlonais em aves e,
conseqüentemente, para o desenvolvimento de novas tecnologias de imunoterapia e
imunodiagnóstico (LI et al., 1998; CHACANA et al., 2004).
Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar as características
histológicas de órgãos e tecidos linfóides em galinhas poedeiras inoculadas com hemácias de
carneiro por diferentes vias à fim de contribuir para o melhor entendimento da dinâmica de
produção de anticorpos em aves e para o estabelecimento de novos protocolos de imunização
que otimizem a produção de anticorpos em aves.
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 IMUNOFISIOLOGIA DAS AVES
O sistema imune das aves é funcionalmente semelhante ao dos mamíferos,
sendo constituído por vários mecanismos de defesa contra microorganismos (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2000; GLICK; OLAH, 1981; ERF, 2008). Estes mecanismos incluem
barreiras físicas, químicas e biológicas tais como a pele e a mucosa; citocinas, peptídeos
antimicrobianos e os componentes do sistema complemento, células (linfócitos, macrófagos,
neutrófilos e células dendríticas) e tecidos e órgãos linfóides (ERF, 2008; ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2000).
Nas aves, os leucócitos, trombócitos e eritrócitos são gerados na medula
óssea. Local onde os eritrócitos, os heterófilos, basófilos e eosinófilos e monócitos sofrem o
processo de desenvolvimento e maturação e migram para a circulação sistêmica e para tecidos
e órgãos linfóides secundários (MACARI; FURLAN; GONZALES, 2002; CAMPBELL,
2004; FERRO et al., 1994).
A resposta imune das aves pode ser dividida em resposta imune inata, que
representa a primeira linha de defesa de um organismo após o rompimento das barreiras
físicas, químicas e biológicas iniciais, e a resposta imune adaptativa (ERF, 2008; STAR et al.,
1979). A resposta imune inata envolve a participação de células fagocíticas, moléculas do
sistema complemento e anticorpos naturais, entre outras moléculas, além de células não
linfóides (ABBAS; LICHTMAN, POBER, 2000; ERF, 2008; STAR et al., 1979). Por outro
lado, a resposta imune adaptativa é o resultado da cooperação entre linfócitos T e B, células
apresentadoras de antígenos e anticorpos específicos, e tem duas propriedades básicas: a
especificidade e a memória imunológica (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). A
especificidade é a capacidade da molécula de anticorpo e dos receptores de membrana dos
linfócitos T se ligarem ao antígeno específico. Enquanto a memória imunológica é um
fenômeno relacionado à expansão clonal, ocorrendo a diferenciação de células, efetoras e de
memória, a partir de um linfócito B ou T específico para um antígeno. As células de memória
são células que têm a mesma especificidade do linfócito B do qual são originadas e
sobrevivem no organismo por um longo período de tempo (ABBAS; LICHTMAN; POBER,
2000; JANEWAY, 2000; FELLAH; JAFFREDO; DUNON, 2008).
13
A reposta imune inata é composta de células fagocíticas, heterófilos,
monócitos e células dendríticas, moléculas do sistema complemento e anticorpos naturais da
classe IgM, IgA e IgY. A fagocitose ocorre diretamente por meio de receptores de
reconhecimento de padrão presentes na superfície da membrana nos fagócitos, por
opsonização dos microrganismos por anticorpos ou moléculas do sistema complemento. A
fagocitose e a apresentação do antígeno interligam a resposta imune inata à resposta imune
adaptativa, colaborando para a eliminação e neutralização do patógeno ou agente agressor
(SCOTT, 2004; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000). Desta forma, a resposta imune
adaptativa pode potencializar a resposta imune inata, facilitando a captura e fagocitose do
microrganismo. Por outro lado, a resposta imune inata estimula a reposta imune adaptativa
por meio da captura do antígeno por células especializadas, conhecidas com células
apresentadoras de antígeno (APCs), que apresentam peptídeos antigênicos aos linfócitos T,
via moléculas de histocompatibilidade principal de classe II, e estimulam a ativação e
produção de anticorpos pelos linfócitos B (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERF,
2008).
Os heterófilos são células semelhantes funcionalmente aos neutrófilos dos
mamíferos: apresentam núcleo segmentado (dois a três lóbulos), com heterocromatina
formando massa densa e seus grânulos citoplasmáticos específicos são elípticos e esféricos de
coloração acidófila (MACARI; FURLAN; GONZALES, 2002; CAMPBELL, 2004). Os
heterófilos são as primeiras células a migrarem para o sítio inflamatório, além de realizarem
fagocitose, também produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina 1 beta (IL-
1β), IL-6 e IL-8. A expressão destas citocinas foi de mostrado durante a resposta a Salmonella
enterites. Estas citocinas apresentam propriedades quimiotáxicas e induzem a maturação e
diferenciação de leucócitos, em aves (FERRO et al., 1994).
Uma particularidade do sistema imune das aves é o papel dos trombócitos
no sistema imune inato. Estas células apresentam núcleo e são funcionalmente semelhantes às
plaquetas dos mamíferos. Elas têm função hemostática, participando na cascata de
coagulação, e uma atividade fagocítica semelhantes a dos heterófilos (MACARI; FURLAN;
GONZALES, 2002; CAMPBELL, 2004; QURESHI; HUSSAIN; HEGGEN, 1998).
A resposta imune adaptativa pode ser subdividida em resposta imune
humoral e em resposta imune celular. A primeira tem como moléculas efetoras os anticorpos
produzidos pelos plasmócitos. A resposta imune humoral é em parte, dependente dos
linfócitos T auxiliares (CD4+), especificamente a população de células efetora auxiliares do
tipo 2 (T helper 2, Th2). Esta resposta é mais eficiente na eliminação de microorganismos
14
extracelulares (ERF, 2008; JANEWAY, 2000). A imunidade celular é dirigida contra
patógenos intracelulares (vírus, bactérias e parasitas intracelulares) ou contra células alteradas
do próprio organismo. Esta resposta é dependente de linfócitos T CD4+ da sub-população
efetora Th1, linfócitos T CD8+ (citotóxico) e células Natural Killer (NK) (ERF, 2008).
Eosinófilos de aves são homólogos ao tipo celular de mamíferos que recebe
o mesmo nome (BANKS, 1992). A ação deste tipo celular está relacionada ao ataque de
membrana plasmática da célula infectante por degranulação de enzimas digestivas. Atuam
também por liberação de grânulos que contêm histaminase, uma enzima que degrada a
histamina encontrada nos basófilos e mastócitos, moderando assim as reações de anafilaxia.
Nas reações imunológicas frente a parasitemias, não se percebe eosinofilia, indicando que as
aves não reagem da mesma forma que os mamíferos a este estímulo imunológico
(ANDREASEN; LATIMER, 1990; MORGULIS, 2002).
Os macrófagos desempenham um papel importante da defesa inata das aves,
atuando imediatamente quando um microorganismo invade o hospedeito e também como
célula efetora durante a fase tardia na imunidade adquirida. Os macrófagos apresentam
funções antimicrobianas, fagocíticas e antitumorais e agem como células regulatórias através
da produção de citocinas e outros metabólitos. Os monócitos são as principais células
fagocíticas presentes no sangue das galinhas, enquanto os macrófagos teciduais são
encontrados em quase todos os órgãos (JEURISSEN; JANSE, 1994; QURESHI; HEGGEN;
HUSSAIN, 2000).
Os linfócitos T e B se desenvolvem na medula óssea das aves e sofrem
maturação e diferenciação em outros órgãos linfóides primários. O timo é o local de
diferenciação dos linfócitos T, enquanto a bursa de Fabricíus é o local de diferenciação de
linfócitos B. Após o processo de diferenciação e maturação os linfócitos migram para os
tecidos e órgãos linfóides secundários (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERF, 2008;
JANEWAY, 2000; GLICK; OLAH, 1981).
A bursa de Fabrícius localizada na região da cloaca. Este órgão possui o
micro ambiente ideal para a diferenciação dos linfócitos B e sua importância na diferenciação
destas células foi demonstrada em ensaios onde animais bursectomizados perderam a
capacidade de montar uma resposta imune humoral (GLICK; OLAH, 1981).
Os linfócitos T diferenciam-se no timo, órgão formado por sete lóbulos,
localizado na região dorsal do pescoço, paralelo a veia jugular. Após a diferenciação, os
linfócitos migram para a circulação sanguínea e para os órgãos e tecidos linfóides secundários
(GLICK; OLAH, 1981).
15
Os tecidos linfóides secundários são o baço localizado na região dorsal ao
proventrículo as tonsilas cecais, placas de Peyer localizadas na região do íleo e tecidos
linfóides associados às mucosas (MALTs) presentes no proventrículo, pulmões, pele; nódulos
linfóides epidérmicos; tecidos linfóides associados ao trato reprodutivo: infundíbulo e mucosa
vaginal; e glândula de Harderian. Nestes órgãos e tecidos também estão presentes células não
linfóides, como macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos e heterófilos. É nos
órgãos e tecidos linfóides secundários que se desenvolve a resposta imune humoral. Nestes
locais os antígenos são capturados e processados por células apresentadoras de antígeno
(APCs) e apresentados ao sistema imune adaptativo. Estudos mostram que a resposta imune
humoral é dependente de processos celulares que envolvem os folículos linfóides. Os
folículos linfóides estão organizados na região onde são encontradas as células acessórias e os
linfócitos necessários para o desencadeamento da resposta imune humoral. São nestas
estruturas que os linfócitos T ativados, após o reconhecimento do antígeno na superfície de
uma APC, estimulam a diferenciação dos linfócitos B em células produtoras de anticorpos
(WIGH et al., 1971; BURNS; MAXWELL, 1985; GLICK, 1986; KHAN et al., 1997; OLÁH;
VERVELDE, 2008).
2.2 MECANISMOS DE ATIVAÇÃO DO SISTEMA IMUNE INATO E ADQUIRIDO EM AVES
Após a entrada do microorganismo pelas barreiras físicas e químicas da pele
e da mucosa, inicia-se a ativação do sistema imune inato. Inicialmente, ocorre a vasodilatação
e aumento da permeabilidade vascular e a migração dos fagócitos para o foco inflamatório,
este mecanismo é conhecido como inflamação (JUUL-MADSEN et al., 2008; ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2000).
Em aves, ocorre o aumento da permeabilidade vascular e migração de
células fagocíticas, incluindo heterófilos, monócitos e trombócitos. Durante a reação
inflamatória em aves também é observado à presença de basófilos no foco inflamatório
(MACARI; FURLAN; GONZALES, 2002; JUUL-MADSEN et al., 2008). O basófilo parece
ter dupla função no processo inflamatório, liberação de substâncias farmacologicamente
ativas e fagocitose (FUDGE, 2000).
As respostas imunes celular e humoral são dependentes de linfócitos T e B,
moléculas de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I e II e de citocinas. As
16
moléculas de classe I são expressas por todas as células nucleadas, enquanto as de classe II
são exclusivas das APCs. Após a captura e processamento do antígeno pelas APCs, estas
células expressam as moléculas de MHC de classe II associadas ao antígeno e as apresentam
aos linfócitos T, resultando na liberação de citocinas e ativação da resposta imune (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2000; ERF, 2008; SCOTT, 2004).
Nas aves, as moléculas de MHC de classe I e II são denominadas de B-F e
B-L respectivamente. Outro conjunto de moléculas do MHC foi identificado e denominado de
B-G. As moléculas B-G são expressas em vários tipos celulares, trombócitos, linfócitos B e T,
timócitos e células do estroma da bursa e células presentes nas tonsilas cecais. Sua função
parece estar associada à pré-seleção de células B na bursa das aves (SALOMONSE et al.,
1991; MACARI; FURLAN; GONZALES, 2002).
2.3 RESPOSTA IMUNE CELULAR EM AVES
No timo das aves são gerados três tipos de linfócitos: linfócitos T CD4+,
(auxiliares) os linfócitos T CD8+ (citotóxico) e linfócitos T reguladores. Os linfócitos T
auxiliares, após sua maturação no timo, se diferenciam em dois subgrupos, sob estimulação
antigênica. Estes subgrupos são identificados pela produção de citocinas em linfócitos Th1 e
Th2, o primeiro direciona a resposta imune celular e o segundo a resposta imune humoral
(QUERE; COOPER; THORBECKE, 1990; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERF
2008; VIERTLBOECK et al., 2008; KUMAR et al., 2009).
Após a apresentação do antígeno pelas APCs aos linfócitos T auxiliares
naïve ou Th0, ocorre à liberação de citocinas por ambas as células. As citocinas responsáveis
pela resposta imune celular são IL-2, interferon-γ (INF-γ), fator de necrose tumoral-α (TNF-
α) e IL-6 (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERL, 2008; VIERTLBOECK et al., 2008).
Células somáticas infectadas por vírus liberam INF-α e INF-β, que
sinalizam para células vizinhas bloquearem seus receptores de membrana para a entrada do
vírus e estimulam a ação dos linfócitos T citotóxicos que reconhecem o peptídeo viral
acoplado a molécula de MHC classe I expressados na superfície da célula infectada. A ligação
dos receptores das células T citotóxicas à molécula de MHC de classe I inicia a sinalização de
morte celular programada (apoptose) na célula infectada, com formação de poros de
membrana e influxo de cálcio (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERL, 2008).
17
Muitos vírus apresentam mecanismos para bloquear a apresentação do
peptídeo viral através do MHC classe I. As células NK, ao contrário dos linfócitos T CD8+,
não precisam da presença da molécula de MHC classe I para a sua ativação. A redução da
expressão do MHC classe I é dos fatores de ativação das células NK e o mecanismo e morte
celular é semelhante ao desencadeado pelos linfócitos T citotóxicos. As células NK também
apresentam receptores de membrana, para a porção Fc dos anticorpos. Estes receptores se
ligam na porção Fc dos anticorpos específicos ligados aos peptídeos virais, presentes na
membrana plasmática das células infectadas, levando a célula infectada a morte celular
(ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000; ERL, 2008).
2.4 RESPOSTAS IMUNES HUMORAL EM AVES
A diferenciação dos linfócitos B ocorre na bursa de Fabrícius. Os linfócitos
B podem reconhecer antígenos através de imunoglobulinas de membrana, semelhante ao que
ocorre em mamíferos. Nas aves, porém, existem apenas três classes de anticorpos: IgY, IgM e
IgA (GLICK, 1986; CHACANA et al., 2004). As citocinas que estimulam a resposta imune
humoral são IL-4, IL-5, IL-10 e o fator de crescimento transformador - β (TGF-β) (SCOTT,
2004).
Em aves a IL-6 é responsável pela diferenciação das células B em
plasmócitos secretores de anticorpos (RATCLIFFE, 2002). As citocinas IL-5 e IL-15 foram
identificadas em aves e também atuam na resposta humoral na diferenciação das células B nos
GALT (KIYOSHI, 1998; HIROI et al., 2000; RATCLIFFE, 2002).
2.4.1 Desenvolvimento e Sobrevivência de Células B na Bursa de Fabrícius e Produção de
Imunoglobulinas
Vários fatores estão ligados ao desenvolvimento e maturação das células B
na Bursa de Fabrícius, tais como hormônios (bursina), peptídeos anti-esteroidogênicos bursal
(BASP) e citocinas (OTSUBO et al., 2001; CADWELL; HARGIS, 1999). A bursina é
produzida por células do estroma da bursa de Fabrícius, sua função está ligada a maturação e
18
diferenciação de células B, principalmente células B produtoras de anticorpos IgM (SCOTT,
2004). O BASP está relacionado a sincronização da divisão de células B, durante o período
embrionário e neonatal das aves (SCOTT, 2004). As citocinas envolvidas no
desenvolvimento, diferenciação e ativação das células B na Bursa de Fabrícius, são IL-4, IL-5
e IL-7 (RATCLIFFE, 2002). As imunoglobulinas encontradas na bursa, são
predominantemente da classe IgM e IgY e podem ser detectadas na região medular do órgão
no 21° dia do desenvolvimento embrionário (KINCADE; COOPER, 1971).
Após o desenvolvimento, maturação, as células B migram para o baço e
tecidos linfóides, como o MALT, onde podem dar início à resposta imune humoral
(HEMMINGSSON; LINNA, 1972).
2.4.2 Imunoglobulinas em Aves
As imunoglobulinas das aves são glicoproteínas sintetizadas por células B e
plasmócitos, e são divididas em três classes: IgM, IgA e IgY (GLICK; OLAH, 1981;
MACARI et al., 2002). A IgY é análoga da IgG e IgE dos mamíferos, com baixa massa
molecular, estando predominantemente presente no soro, e é responsável pela defesa contra
infecções sistêmicas e pelas reações anafiláticas em aves (MACARI et al., 2002.). A IgM são
imunoglobulinas de fase aguda, produzidas durante a resposta imune primária e secretadas
em forma de pentâmero e expressas também na forma receptores de membrana plasmáticas
dos linfócitos B. Estudos mostraram diferenças na massa molecular das cadeias pesadas, da
IgY, que apresenta massa molecular de aproximadamente 67.500 daltons, enquanto a IgG dos
mamíferos tem cerca de 50.000 daltons (LESLIE; CLEM, 1969). A IgY são imunoglobulinas
sistêmicas, produzidas após a resposta imune secundária, com função de opsonização e são
caracterizadas como imunoglobulinas de fase crônica. As IgAs são as imunoglobulinas
predominantemente produzidas pelos plasmócitos presentes nas placas de Peyer e nos MALTs
presentes nas tonsilas cecais (LESLIE; CLEM, 1969; GLICK, 1983).
19
2.4.3 Mecanismos de Transferência de Anticorpos Maternais em Aves
A transferência passiva de anticorpos maternos para sua prole em mamíferos
é realizada pela placenta, via circulação materno-fetal, ou pelo colostro que é um exemplo de
transferência passiva de anticorpos após a vida intra-uterina (GRINDSTAFF; BRODIE III;
ELLEN, 2003). Em aves, a transferência de anticorpos maternos da classe IgY ocorre pela
passagem de anticorpos para a gema do ovo em desenvolvimento. A transferência é um
processo que ocorre em duas etapas (LOEKEN; ROTH, 1983). A primeira tem início com a
deposição de anticorpos na gema, utilizando receptores para IgY localizados nos capilares
presentes nos folículos ovarianos, que capturam estas moléculas da circulação sanguínea
materna (LESLIE; CLEM, 1969). A quantidade de IgY depositada no folículo é proporcional
a quantidade presente no soro materno (LOEKEN; ROTH, 1983). A porcentagem de IgY
transferida do plasma materno para a gema é de 30% enquanto apenas 1% de IgM e IgA são
depositadas na clara, através dos tecidos linfóides ligados as mucosas do oviduto (HAMAL et
al., 2006). A segunda etapa é a transferência de anticorpos do saco da gema para o embrião
em formação. Acredita-se que os anticorpos IgY sejam transferidos por difusão do saco da
gema para a circulação embrionária. A transferência de IgY inicia-se no 7° dia do estágio
embrionário e aumenta progressivamente do 14° ao 21° dias da vida intra-ovo (KREMER;
CHO, 1970; KOWALCZYK et al., 1985).
Segundo Yamamoto et al. (1975), a IgA e IgM são as imunoglobulinas
predominantes na clara do ovo, e sua taxa de transferência da circulação maternal sistêmica
para a prole é de 1% .
2.4.4 Anticorpos Naturais em Aves
Os anticorpos naturais estão presentes em aves não imunizadas. Estes
anticorpos são preferencialmente derivados de células B1 CD5+ presentes na cavidade
peritoneal ao longo do trato intestinal. Em aves a produção de anticorpos naturais parece estar
correlacionada à molécula do complexo de histocompatibilidade maior IV (B-G) (NEU;
HÁLA; WICK, 1984; LONGENECKER; MOSMANN, 2001).
20
Duas classes de anticorpos naturais são relatadas em aves, a IgM e IgY.
Ambas as classes podem ser expressas contra uma variedade de antígenos exógenos e
endógenos. Foi relatada a presença de anticorpos naturais contra antígenos exógenos de
hemácia de carneiro, coelho, cabra e antígenos microbianos como o LPS (PARMENTIER;
WALRAVEN; NIEUWLAND, 2004).
Anticorpos naturais contra hemácia de coelho têm sido amplamente
pesquisados em aves. As hemácias de coelho apresentam em sua membrana plasmática uma
proteína conhecida como alfa-galactose, que está presente em bactérias comensais presentes
no intestino das aves (COTTER; AYOUB; PARMENTIER, 2005). Os anticorpos naturais
atuam na opsonização e fagocitose de antígenos extracelulares em cooperação com os
fagócitos e o sistema complemento na resposta imune inata (THORNTON et al., 1994).
2.4.5 Produção de Anticorpos IgY
Devido à distância filogenética entre aves e mamíferos, as aves produzem
anticorpos com alto grau de afinidade contra antígenos de mamíferos (LI et al., 1998;
CHACANA et al., 2004).
A produção de anticorpos IgY apresenta vantagens em relação a produção
de anticorpos em mamíferos. Primeiro, não ocorre a sangria e por isso há a diminuição do
estresse ao qual são submetidos as espécies de mamíferos utilizadas na produção de
anticorpos. Segundo, os anticorpos IgY não apresentam reação com os fatores reumatóides e
não ativam o sistema complemento de mamíferos, diminuindo a chances de falso positivo em
ensaios biológicos com a mostras de mamíferos (CHACANA et al., 2004).
Um ovo possui em média 100 mg de IgY em uma gema. Sabendo-se que as
galinhas poedeiras produzem mais de 20 ovos por mês, a produção de IgY em um mês pode
facilmente chegar a valores maiores de 2 gramas por animal (CARLANDER, 2002).
Além da alta produtividade, os anticorpos extraídos da gema de galinhas
poedeiras apresentam aplicações profiláticas e terapêuticas em doenças crônicas, infecciosas e
toxicológicas (CHACANA et al., 2004). Sua aplicação em medicina humana e veterinária tem
crescido e despertado o interesse de pesquisa (CHACANA et al., 2004). Atualmente, estudos
mostram que a aplicação de IgY em doenças infecciosas pode favorecer a neutralização da
aderência de agentes microbianos aos seus tecidos alvos, como pode ser observado em
21
estudos sobre a profilaxia de diarréia de leitões neonatos causado por Escherichi coli, em
úlcera gástrica causada por Helicobacter pylori , em fungos como Candida albicans, em
doenças virais como a Cinomose em cães e contra toxinas de venenos de animais peçonhentos
e bactérias (CARLANDER, 2002; CHACANA et al., 2004).
2.4.6 Vias de Inoculação e Resposta Imune em Baço de Aves Imunoestimuladas
Cada via de inoculação gera uma resposta imune específica em diferentes
órgãos e tecidos linfóides e que pode influenciar os níveis de produção e a especificidade do
anticorpo (WHITE et al., 1975; GATICA et al., 2004). Sabe-se que a via intravenosa (i.v),
induz uma potente resposta imune no baço em mamíferos e em aves, enquanto a via
intramuscular (i.m) e intraperitoneal (i.p) induzem uma resposta imune intensa nos linfonodos
regionais e no baço, nos casos dos mamíferos (WHITE et al., 1975). Nas galinhas, a
inoculação pela via intraperitoneal aparentemente leva a uma resposta imune no baço e nos
MALTs, como a tonsila cecal e placa de Peyer no íleo. Por outro lado, o principal sítio de
resposta imune ao antígeno inoculado pela via intramuscular permanece desconhecido em
galinhas devido a ausência de linfonodos, e provavelmente sejam o baço e os MALTs os
principais locais de produção de anticorpos. Em mamíferos, é bem estabelecido que os
linfonodos regionais são os principais locais de produção de anticorpo, em resposta a
inoculação subcutânea (s.c) Acredita-se que o principal local de resposta através da
inoculação subcutânea em galinhas poedeiras, seja o baço (WHITE et al., 1975; WENDY;
WAYNE; ALAN, 1998; GATICA et al., 2004; IGYARTÓ et al., 2006).
Em aves, são poucos os estudos sobre os efeitos da via de inoculação sobre
a produção de anticorpos, a afinidade dos anticorpos e a geração de memória imunológica.
Além disso, existem poucos estudos sobre qual é o órgão linfóide ou tecido responsável pela
resposta imune aos antígenos inoculados pelas vias intramuscular e subcutânea. Em um
estudo que comparou o efeito das vias intramuscular e subcutânea na produção de anticorpos
para a enzima frutose-1,6-bifosfato foi observado que não houve diferença entre as vias
(GATICA et al., 2004).
A rota que o antígeno percorre após a inoculação pela via subcutânea não é
bem definida. Em galinhas, a presença de células dendríticas epiteliais foi demonstrada por
análise histoquímica e imunohistoquímica, com marcadores para ATPases e MHC classe II
22
(TORRES et al., 1994; IGYÁRTÓ et al., 2006). Contudo, o local para o qual estas células
migram para desencadear a produção de anticorpos não foi demonstrado. Um possível local
são os tecido linfóides encontrados ao longo dos vasos linfáticos e que foram recentemente
caracterizados. Outra possibilidade é a migração das células dendríticas para os órgãos
linfóides secundários (TORRES et al., 1994; IGYÁRTÓ et al., 2006).
A via intraperitoneal acarreta a produção da classe IgA nas mucosas
intestinas, especificamente nas tonsilas cecais e placas de Peyer presentes na região do íleo.
Foi demonstrado que aves inoculadas, com Salmonella typhimurim por via i.p. têm uma alta
eficiência na indução da resistência a este microrganismo em infecções posteriores (WENDY;
WAYNE; ALAN, 1998).
Em aves, a maior produção de anticorpos ocorre quando o antígeno é
inoculado pela via intravenosa, resultando na ativação da resposta imune humoral e celular no
baço. A resposta humoral se desencadeia com a formação de centros germinativos, onde há
uma alta produção de anticorpos e expansão clonal dos linfócitos B. Estímulos consecutivos
resultam na troca de classe de imunoglobulinas e favorecem o aumento da afinidade do
anticorpo (OLÁH; VERVELDE, 2008).
Funcionalmente, o baço é semelhante ao dos mamíferos com função
imunológica e hemocatarese. Além disso, ele atua na hematopoiese no período embrionário
colaborando com a produção e migração de linfócitos T e B, macrófagos e células dendríticas
para a bursa de Fabrícius (OLÁH; VERVELDE, 2008).
A hemocatarese ocorre na polpa vermelha, onde macrófagos capturam
hemácias velhas que passam pelos sinusóides, são drenadas e fagocitadas (OLÁH;
VERVELDE, 2008). A resposta imune ocorre basicamente na polpa branca onde são
encontrados os linfócitos B (MAST et al., 1997; OLÁH; VERVELDE, 2008).
O baço de aves apresenta características morfológicas em comum em
relação ao baço dos mamíferos, como as regiões de polpa vermelha, polpa branca e folículos
linfóides. Porém o baço de aves não apresenta folículo primário como ocorre em mamíferos
(YASUDA et al., 2003).
A polpa vermelha é formada por um conjunto celular que inclui linfócitos T
CD8+ e CD4+, células NK, macrófagos, linfócitos B e plasmócitos (MAST et al., 1997).
A polpa branca é o local do desencadeamento da resposta imune e apresenta
três áreas morfológicas distintas; bainha linfóide periarteriolar (PALS), capilares penincilares
(PWP) e centro germinativo (CG) (JEURISSEN, 1993; MAST et al., 1997; OLÁH;
VERVELDE, 2008). A PALS é denominada região T dependente, apresenta uma arteríola
23
central envolvida por células T CD8+ e CD4+, células B e células dendríticas dispersas nesta
região (JEURISSEN; CLAASSEN; JANSE, 1992; JEURISSEN, 1993). A PWP é a região B
dependente, formada por arteríolas penicilares circundadas por células B, que expressam os
marcadores chB6 e CD57 e uma rede de macrófagos que atuam na filtração do antígeno
(JEURISSEN; CLAASSEN; JANSE, 1992).
O destino do antígeno após a inoculação intravenosa é a bainha linfocítica
periarteriolar através da arteríola central. A seguir, o antígeno é capturado por célula
dendríticas e apresentado às células T CD4+ que por sua vez auxiliam as células B a se
diferenciarem e formarem o centro germinativo. Após 14 horas da inoculação do antígeno
HSB as células dendríticas contendo o antígeno aparecem na região de PALS e após 19 horas
se localizam na bifurcação da arteríola central e assumem uma formação circular. Em 6 dias,
as APCs aparecem nos centros germinativos (WHITE et al., 1974).
Os fenótipos e função de várias populações de células não linfóides foram
estudas em aves, usando anticorpos monoclonais após a administração de antígeno. Dois tipos
de antígeno foram usados, um mitogênico (LPS e partículas de Brucella abortus) e antígenos
não bacterianos (Ficol e Carragena). Anticorpos monoclonais foram usados para marcar
macrófagos, células dendríticas e monócitos na polpa vermelha, ou detectar células elipsóides
não linfóide associadas (ENAC) (JEURISSEN; CLAASSEN; JANSE, 1992). As ENAC
pertencem a rede de tecido conjuntivo que envolve várias estruturas do baço incluindo o
envoltório presente no centro germinativo de aves. Foram observados macrófagos da polpa
vermelha e anéis de macrófagos envolto da PALS e células dendríticas foliculares (FDC) nos
centros germinativos e pequenos grupos de células estromáticas nas áreas de células T. Após a
inoculação de LPS ocorreu uma drástica diminuição dos macrófagos da polpa vermelha
enquanto os da região de PALS não foram afetados (JEURISSEN; CLAASSEN; JANSE,
1992).
Em contrapartida quando as mesma aves eram inoculadas com Brucella
abortus inativadas, os dois subtipos de macrófagos e EANC diminuíam, enquanto ocorreu
um aumento significativo de células dendríticas na regiões de T dependente. A inoculação de
antígenos não mitogênicos não alterou nenhum dos fenótipos celulares não linfóides,
macrófagos, monócitos, células interdigitais ou células elipsóides estrómaticas não linfóides.
Os resultado sugerem que o complexos formados por EANC e macrófagos envolto da bainha
linfóide periarteriolar após o estímulo antigênico com antígeno mitogênicos são semelhantes a
zona marginal presente no baço de mamíferos (JEURISSEN; CLAASSEN; JANSE, 1992).
24
O centro germinativo após o estímulo imunológico apresenta célulasT e B,
plasmócitos e produção de IgM e IgY confirmada pela expressão de RNAm de ambas as
imunoglobulinas. A IgM é expressa 7 dias após o estímulo imunológico, ocorrendo uma troca
de classe para IgY no segundo estímulo (YASUDA et al., 2003).
Os efeitos da inoculação de hemácias de carneiro (antígeno dependente da
ativação de células T helper) perianal e o efeito na produção de anticorpos na morfologia da
região de vênulas pós-capilares (PCV) da bursa de Fabrícius demonstra, um aumento
significativo dos anticorpos e da região PCV, com aumento de células T em relação ao grupo
controle. A passagem das células T e B da circulação sistêmica ocorre através da PCV após o
estímulo com hemácias de carneiro. O fator ligado a regulação deste mecanismo não é
conhecido, porem moléculas similares a IgY presentes na parede das PCV podem estar
associados ao reconhecimento das células B.e de células T (ROMPPANEN et al., 1974;
SYRJÃNEN; NAUKKARINEN, 1982).
25
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Comparar o efeito da via de inoculação de hemácia de carneiro na resposta
imune humoral de galinhas poedeiras.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito da via de inoculação sobre a produção de anticorpos séricos
específicos das classes IgM e IgY em galinhas poedeiras imunizadas com hemácias de
carneiro.
Avaliar o efeito da via de inoculação sobre na produção de anticorpos
naturais em galinhas poedeiras imunizadas com hemácia de carneiro.
Caracterizar histologicamente o baço de galinhas poedeiras imunizados com
hemácia de carneiro por diferentes vias de inoculação.
26
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram realizados dois experimentos independentes. No experimento I foram
utilizadas 28 galinhas poedeiras Gallus gallus linhagem White Leghorm com 45 semanas de
vida, provenientes da Granja da Fazenda Escola da Universidade Estadual de Londrina – PR,
mantidas em gaiolas individualizadas, a temperatura ambiente, recebendo água potável e
ração de postura à vontade (Purina, Brasil).
No experimento II foram utilizadas 35 galinhas poedeiras Gallus gallus
linhagem comercial Isa-Brown com 32 semanas de vida, provenientes da Granja da Fazenda
Escola da Universidade Estadual de Londrina – PR, mantidas em gaiolas individualizadas, á
temperatura ambiente, recebendo água potável e ração de postura à vontade (Purina, Brasil).
Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Londrina.
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
4.2.1 Seleções dos Animais (Controle da Postura)
Para a seleção dos animais utilizados nos experimentos I e II, inicialmente
foram separadas 80 aves em gaiolas individuas sendo que cada animal recebeu uma
identificação numérica. Durante um período de 14 dias foi realizado o controle de postura de
ovos como medida da sanidade do animal. As aves com o ciclo de produção de ovos normais
foram separadas em um grupo de 60 animais. Para o experimento I foram selecionadas 24
aves que foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos experimentais com 7 animais
por grupo. Para o experimento II foram selecionados 35 aves distribuídas aleatoriamente em
cinco grupos experimentais de 7 aves.
27
4.2.2 Formação dos Grupos Experimentais
No experimento I, as galinhas foram distribuídas nos seguintes grupos:
grupo controles (C) inoculados com PBS pH 7,2, pela via intravenosa usando a veia braquial.;
grupo i.v. inoculados pela via intra venosa veia braquial: grupo i.m. inoculados pela via
intramuscular, no músculo peitoral em quatro pontos distintos e grupo s.c., aves inoculados
pela via subcutânea na membrana da asa. Todas as aves dos grupos i.v., i.m. e s.c. foram
inoculadas com hemácias de carneiro a 2,5% em PBS pH 7,2 (250 μl).
No experimento II, as galinhas foram distribuídas nos seguintes grupos:
grupo C, animais controles inoculados com PBS pH 7,2, pela via iv.; grupo iv.; grupo im.,
grupo sc. e grupo i.p. com aves inoculadas pela via intraperitoneal (i.p.). Todas as aves dos
grupos i.v., i.m., s.c. e i.p. foram inoculadas com hemácias de carneiro a 2,5% em PBS pH 7,2
(250 μl).
4.2.3 Imunização e Obtenção de Amostras Biológicas
As aves dos grupos iv., im., s.c. e i.p. receberam duas inoculações de
hemácia de carneiro (SRBC) 2,5% no 1º e no 28º dia do experimento, enquanto os animais
dos grupo C de ambos os experimentos foram inoculados apenas com o veículo (PBS 0,15M,
pH 7,2). Amostras do sangue periférico foram obtidas antes da primeira inoculação e no 7º e
35º dia do experimento. No último dia do experimento, os animais foram sacrificados e os
baços foram coletados, pesados e fixados em solução de Bouin aquoso. O procedimento
experimental foi o mesmo para ambos os experimentos.
4.3 PREPARO DO ANTÍGENO
Inicialmente foram coletados 10 ml de sangue de carneiro, em tubos de
vidro com solução de Alsever (v/v). O sangue foi centrifugado durante 5 min a 2.000 rpm. O
sobrenadante foi descartado e as hemácias lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2, estéril e
28
centrifugado por 5 min a 2.000 rpm. A lavagem foi repetida duas vezes. A seguir, a suspensão
de hemácia de carneiro a 2,5% foi preparada em PBS 0,15 M estéril, pH 7,2, a partir da papa
de hemácia obtida.
4.5 CARACTERIZAÇÃO SOROLÓGICA, HISTOLÓGICA E MORFOMÉTRICA
4.5.1 Dosagem de Anticorpos Séricos
A dosagem de anticorpos séricos foi feita pela aglutinação de eritrócitos na
presença de anticorpos específicos no soro para determinar o título de imunoglobulinas totais
(Ig Totais), IgY e IgM presentes no plasma de aves imunizadas com hemácia de carneiro por
diferentes vias de inoculação.
Amostras de plasma de todos os animais foram inativadas a 56ºC por 30
minutos em banho-maria antes da utilização. Em seguida, fez-se uma diluição seriada de fator
2 destas amostras, em placas de microtitulação com fundo em U. Primeiro, foram adicionados
25 μl de PBS em todos os poços e, a seguir, adicionou-se 25 μl de plasma inativado no poço 1
da placa, fez-se a homogeneização da solução e a transferência de 25 μl para o orifício
seguinte, repetindo o mesmo processo até o poço 11, aonde o mesmo volume da solução foi
desprezado. Este procedimento foi realizado para todas as amostras de plasma. Em seguida,
foi adicionado igual volume de hemácia de carneiro a 2% em cada poço, e a placa foi
incubada por 1 hora a 37ºC, e 22 horas a 4ºC. Após esse período realizou-se a leitura visual
das placas, comparando o padrão de sedimentação do poço controle sem plasma (poço
número 12) com os padrões de sedimentação dos demais. O título de anticorpos totais foi
identificado como a maior diluição em que foi observada uma aglutinação positiva das
hemácias.
Para a determinação do título de IgY, 50 μl das amostras de plasma
inativadas foram incubadas com igual volume de 0,2M de 2-mercaptoetanol por 30 minutos a
37 ºC. Em seguida, procedeu-se a diluição seriada fator 2 como descrito anteriormente. O
título de IgM foi determinado com a subtração dos valores do título de Ig Totais e os valores
encontrados para IgY.
29
4.5.2 Coleta do Baço
As aves foram sedadas com éter etílico e eutanasiadas por inalação de dose
letal de éter etílico, em conformidade com o Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Estadual de Londrina.
A necropsia foi realizada conforme o método recomendado por Zander e
Mallinson (1991).
4.5.3 Processamento do Material Histológico
Após a retirada, os órgãos foram pesados e colocados em solução de Bowin
aquosa, fixados por 12 horas e transferidos para uma solução de álcool 70% (BEÇAK;
PAULETE, 1970).
O protocolo utilizado para a desidratação e inclusão dos órgãos foi: dois
banhos de álcool etílico 95% por 30 minutos cada; um banho de álcool etílico 95% por 1
hora; dois banhos de álcool etílico 100% por 30 minutos cada; dois banhos de álcool etílico
100% por 1 hora cada; três banhos de Xilol por 30 minutos cada; um banho de xilol por 30
minutos em estufa à 60ºC; três banhos de Paraplast em estufa à 60ºC; inclusão em moldes
histológicos.
Após o resfriamento completo, as peças incluídas foram submetidas à
microtomia. Foram obtidos cortes de 5µm de espessura em micrótomo semi-automático Leica
RM 2145. Os cortes foram colocados em banho-maria à temperatura de 37ºC e coletados em
lâmina de microscopia e armazenadas em estufa a 37ºC por 24 horas.
As lâminas histológicas foram submetidas ao seguinte protocolo de
coloração em hematoxilina e eosina: dois banhos de Xilol por 10 minutos; um banho em
álcool etílico 100% por 5 minutos; um banho em álcool etílico 95% por 5 minutos; um banho
em álcool etílico 70% por 5 minutos; um banho em água destilada por 5 minutos; lavagem em
água por 5 minutos; coloração em solução aquosa de Hematoxilina de Harris por 15
segundos; viragem em água corrente por 5 minutos; coloração em solução aquosa de Eosina
de Lison por 20 segundos, passagem rápida em água destilada; desidratação em álcool etílico
70%; um banho em álcool etílico 95% por 5 minutos; dois banhos de álcool etílico 100% por
30
10 minutos cada; um banho em solução de álcool e xilol (v/v) por 10 minutos; dois banhos
em xilol por 10 minutos cada; montagem das lamínulas com Bálsamo do Canadá, secagem
das lâminas histológicas em estufa a 37ºC por 3 a 5 dias.
4.5.4 Morfometria
a. Contagens totais de centros germinativos (CG)
A contagem das estruturas histológicas foi realizada em microscópio óptico
em objetiva de 10x. As imagens foram capturadas em sistema de captura de imagens
MOTICAN (Motic, Japan). Para contagem de centros germinativos 5 lâminas por animal de
cada grupo foram analisados e todos os centros germinativos presentes, nos campos
selecionados foram contados totalizando o total por grupo.
b. Área total de polpa vermelha e polpa branca
A mensuração das áreas histológicas foi realizada em microscópio óptica
em aumento de 40x utilizando a câmera de captura e software de análise morfometrica Motic
Image Plus ®. Foram capturadas 10 imagens por lâmina de cada animal e analisadas, a área
das regiões de polpa vermelha e polpa branca.
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística dos doados foi usada a análise de variança (ANOVA)
seguida do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05.
31
5 RESULTADOS
Os resultados obtidos no experimento I mostram que no 7º dia do
experimento após a inoculação do antígeno (resposta primária) as vias que resultaram na
maior produção de anticorpos totais específicos foram as vias i.m. e s.c. (P<0,05, Figura 1).
Quando foram analisados os títulos de IgM ou de IgY, foi observado um aumento dos títulos
de anticorpos em todos os animais imunizados, independente da via, porém, este aumento não
foi significativo em relação aos animais do grupo controle (P >0,05, Figura 1).
Na resposta imune secundária (35º dia), um aumento significativo dos
títulos de anticorpos totais foi observado nos animais dos grupos i.v., i.m. e s.c. em relação ao
grupo controle (P<0,05, Figura 1). Também foi observado que os títulos de anticorpos totais
dos animais do grupo i.v. estavam aumentados em relação aos animais do grupo s.c.. Com
relação aos títulos de anticorpos IgY, foi observado uma diferença significativa entre o grupo
i.v. e os grupos c, i.m. e s.c. (P<0,05, Figura 1). Enquanto os níveis de anticorpos IgM
mostram uma diferença significativa entre os grupos controle e i.m. (P<0,05, Figura 1). A
inoculação com hemácia de carneiro não resultou em alteração dos níveis de anticorpos
naturais, avaliados pelos títulos de anticorpos contra hemácia de coelho (P>0,05, Figura 2).
As análises histológicas dos baços dos animais do experimento I, após a 2ª
inoculação de hemácia de carneiro, não mostraram diferenças significativas nas áreas
correspondentes as polpas vermelha e branca (P>0,05, Figura 3). Não foram observadas
diferenças significativas em relação ao número de centros germinativos.
No experimento II, com animais Isa Brown, após a 1ª imunização com
hemácia de carneiro não foram observadas diferenças significativas dos níveis de anticorpos
totais e IgM entre os grupos (P>0,05, Figura 5). Neste mesmo tempo, os títulos de anticorpos
IgY aumentaram significativamente em todos os grupos inoculados com SRBC em relação ao
grupo controle não inoculado (P<0,05, Figura 5). Após a 2ª inoculação foi observado um
aumento nos títulos de anticorpos totais específicos nos animais dos grupos i.v. e i.p. em
relação aos animais do grupo c (P<0,05, Figura 5). Os títulos de anticorpos totais dos animais
do grupo i.v. também estavam significativamente aumentados em relação aos animais do
grupo i.m. (P<0,05, Figura 5). Com relação aos níveis de anticorpos IgY, foram observadas
diferenças significativas entre os títulos de anticorpos do grupo c e os títulos dos anticorpos
dos animais dos grupos i.v. e i.p. (P<0,05, Figura 5). E ainda, os títulos de IgY nos soros dos
animais do grupo i.v. foram significativamente maiores que os títulos observados no soros dos
32
animais dos grupos i.m., s.c. e i.p. (P<0,05, Figura 5). Por outro lado, não foram observadas
diferenças significativas estatisticamente entre os títulos de anticorpos IgM (P<0,05, Figura
5). Com relação aos anticorpos naturais, foi observado que os animais do grupo i.v.
apresentavam níveis mais elevados de anticorpos totais e de IgM do que os animais dos outros
grupos antes da inoculação do antígeno. Após a inoculação do antígeno não foram observadas
diferenças significativas entre os títulos de anticorpos naturais dos diferentes grupos (Figura
6).
Com relação ao experimento II, foi observada uma redução significativa da
área de polpa vermelha nos animais dos grupos i.v e s.c, em relação ao grupo controle (Figura
7). Além disso, foi observado que as áreas de polpa vermelha dos grupos i.m e i.p estavam
aumentadas significativamente em relação a área do grupo i.v (Figura 7). Resultados idênticos
foram observados em relação as áreas de polpa branca .
A analise correlação entre a produção de anticorpos da classe IgY e o
número de centros germinativos entre os grupos não apresentou diferenças estatísticas
significativas (Figura 7).
33
Figura 1. Títulos de anticorpos totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem White
Leghorn após imunização com SRBC. Os dados estão expressos como média (+/-
erro padrão) do recíproco do título do soro. * médias diferem significativamente em
relação ao grupo controle (P <0,05). # médias diferem significativamente em
relação ao grupo i.v. (P <0,05).
34
Figura 2. Títulos de anticorpos naturais totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem White
Leghorn após imunização com SRBC. Os dados estão expressos como média (+/-
erro padrão) do recíproco do título do soro.
35
Figura 3. Análise histológica das áreas de polpa vermelha e branca e do número de centro
germinativos de baços de animais linhagem White legohrn submetidos a
estimulação antigênica.
36
Figura 4. Títulos de anticorpos totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem Isa Brown
após imunização com SRBC. Os dados estão expressos como média (+/- erro
padrão) do recíproco do título do soro. * médias diferem significativamente em
relação ao grupo controle (P <0,05). # médias diferem significativamente em
relação ao grupo i.v. (P <0,05).
37
Figura 5. Títulos de anticorpos naturais totais, IgY e IgM no soro das aves da linhagem Isa
Brown após imunização com SRBC. Os dados estão expressos como média (+/-
erro padrão) do recíproco do título do soro. * médias diferem significativamente em
relação ao grupo controle (P <0,05). # médias diferem significativamente em
relação ao grupo i.v. (P <0,05).
38
Figura 6. Análise histológica das áreas de polpa vermelha e branca e do número de centro
germinativos de baços de animais linhagem Isa Brown submetidos a estimulação antigênica. *
médias diferem significativamente em relação ao grupo controle (P <0,05). # médias diferem
significativamente em relação ao grupo i.v. (P <0,05).
39
Figura 7. Análise de correlação entre a produção de anticorpos da classe IgY e número de
cen-tro germinativos. Experimento I, galinhas da linhagem White Leghorn (A), e
Experimento II, galinhas da linhagem ISA Brown submetidas a estimulação
antigênica (B).
40
6 DISCUSSÃO
A via de entrada do antígeno influencia o local e a intensidade da resposta gerada
(WHITE et al., 1975). Embora o efeito da via de inoculação sobre a resposta imune humoral
seja bem conhecido em mamíferos, existem poucos estudos sobre o efeito da via de
inoculação de antígenos na produção de anticorpos em aves. Estudos mostram que após a
inoculação pela via i.v. há uma resposta imune predominantemente no baço, enquanto a via
i.m e i.p resulta na estimulação de células imunes do baço e de tecidos linfóides secundários
(WHITE et al., 1975; DONKER et al., 1989; KREUKNIET et al., 1992). Quando comparada
as vias i.v., i.m. e i.p., usando SRBC como antígeno, foi observado que a via que leva a títulos
mais altos de anticorpos na resposta primária é a via i.v. semelhante aos mamíferos
(KREUKNIET et al., 1992). Por outro lado, a via intraperitoneal parece ser eficiente na
estimulação da resposta imune humoral nas mucosas (MUIR et al., 1998) credita-se que a via
s.c. em galinhas não resulte em níveis significativos de anticorpos quando comparado com as
vias i.v. e i.m (GATICA et al., 2004). A via de inoculação ocular-nasal é uma importante via
de inoculação de antígenos em frangos e galinhas criadas comercialmente devido à facilidade
de imunizar grandes quantidades evitando a contenção e stress nas aves, porém a capacidade
de gerar uma resposta imune na produção de anticorpos sistêmicos pode oscilar entre as vias
de inoculação (RAUWA et al., 2010; CHIOU, et al., 2000).
Este é o primeiro estudo que compara o efeito da via de inoculação de hemácias de
carneiro usando concentrações idênticas do antígeno e sobre a concentração de anticorpos
séricos e as alterações histopatológicas nos baços de galinhas poedeiras.
Em galinhas White Leghorn, o aumento dos títulos de anticorpos totais observado
nos animais inoculados pelas vias i.m. e s.c. em relação ao grupo controle e i.v. pode estar
correlacionados aos níveis de anticorpos da classe IgM produzidas pelas vias i.m. e s.c.. Estes
resultados conferem com os encontrado por Gatica et al. (2004). Que testou as duas vias de
inoculação na produção de anticorpos anti- fructose 1,6-bisfosfatase, demonstrando que
ambas as vias produziam títulos elevados de anticorpos específicos. White et al. (1975)
observaram que o principal local de produção de anticorpos através da via i.m. é os MALTs
com grande produção de IgM. Porém, o órgão ou tecido responsável pela produção de
anticorpos através da via s.c. é desconhecido (YASUDA et al., 2003b).
Como esperado, na resposta imune secundária a via i.v. resultou em títulos de
anticorpos totais e IgY maiores do que as vias a i.m. e s.c. (WHITE et al., 1975).
41
Em galinhas ISA Brown, os resultados obtidos mostraram um elevado nível de
anticorpos contra hemácia de carneiro, mesmo antes da inoculação do antígeno. Estes
anticorpos provavelmente correspondem a anticorpos naturais uma vez que são da classe IgM,
como demonstrado pela utilização de 2-mercaptoetanol. Este resultado não era esperado uma
vez que níveis significativos de anticorpos naturais no soro de galinhas são esperados contra
hemácias de coelho (COTTER; AYOUB; PARMENTIER, 2005). Por isso, novos estudos
devem investigar os níveis de anticorpos naturais contra hemácias de carneiro em diferentes
linhagem e o seu possível papel nas diferenças na resistência a doenças destas linhagens.
Com relação à resposta imune primária da linhagem ISA Brown, foi observado um
aumento significativo dos títulos de anticorpos da classe IgY em todos os grupos inoculados
com SRBC. Este resultado é diferente do observado no experimento com os animais White
Leghorn, onde os títulos de IgY não aumentaram significativamente, sugerindo diferenças na
resposta imune humoral entre estas duas linhagens. Por outro lado, não foram observadas
diferenças significativas nos títulos de anticorpos IgM. A resposta primária de IgM
provavelmente foi mascarada pela presença de altos níveis de anticorpos naturais nesta
linhagem de animais. Na resposta imune secundária os níveis de anticorpos totais mostram
que as vias i.v. e i.p. são as mais eficientes. Este resultado foi confirmado pela análise dos
anticorpos da classe IgY. Estudos anteriores mostraram que a inoculação do antígeno
(Salmonella typhimurium) pela via i.p. leva a produção inicialmente imunoglobulinas da
classe IgA, e após o segundo estímulo ocorre a produção de anticorpos das classes e IgY
(WENDY et al., 1998).
A observação que a via i.v. é mais eficiente do que a via i.m. está de acordo com os
resultados obtidos por Boa-Amponsem et al. (2001) que compararam o efeito das vias de
inoculação i.v. e i.m. na produção de anticorpos anti-SRBC. Estes autores investigaram o
efeito da via de inoculação em 2 linhagens de galinhas White Leghorn selecionadas para alta e
baixa produção de anticorpos. Os autores compararam a inoculação de 0,1 ml de SRBC a
0,25% pela via i.v. com a inoculação de 0,1 ml de SRBC a 0,25% pela via intra muscular no
peito ou na coxa. Os resultados obtidos mostraram que os animais da linhagem de alta
produção de anticorpos inoculados pela via i.v. responderam com níveis mais altos de
anticorpos dos que os animais inoculados pela via i.m. após a primeira dose do antígeno. No
entanto, um aumento do volume inoculado de hemácia de carneiro para 0,5 ml pela via i.m.
eleva os níveis de anticorpos produzidos para níveis similares ao da via i.v. Nesta condição foi
observado uma diferença significativa entre a inoculação no peito ou na coxa com relação à
produção de anticorpos nos animais da linhagem de baixa produção de anticorpos. Nestes
42
animais, a inoculação no peito resultou em títulos significativamente maiores de anticorpos.
Também foi observado que a inoculação no músculo da coxa resulta em um número maior de
animais que respondem a inoculação do que as outras vias (BOA-AMPONSEM et al., 2001).
Aves apresentam anticorpos naturais contra hemácia de coelho, estas hemácias
apresentam em sua membrana plasmática uma proteína conhecida como alfa-galactose que
também está presente na parede de microorganismos presentes na microbiota intestinal das
aves, isso explica a presença de heteroanticorpos IgM e IgY (COTTER; AYOUB;
PARMENTIER, 2005).
Aparentemente os níveis de anticorpos naturais podem estar correlacionados a genes
do MHC e células B-1 (STAR et al., 1979). Neste trabalho, em ambos os experimentos não
foram observadas diferenças significativas nos níveis de anticorpos naturais após as respostas
1ª e 2ª mostrando que a via de inoculação não influencia a produção anticorpos naturais. Estes
resultados estão de acordo aos obtidos por outros autores (COTTER; AYOUB;
PARMENTIER, 2005; SOARES et al., 2000).
Em aves, acredita-se que o baço seja o principal órgão linfóide relacionado com a
produção de anticorpos.
A PWP é a região B dependente fazem parte da polpa branca, formada por capilares
onde são encontradas as células B que expressam os marcadores chB6 e CD57 e uma rede de
macrófagos que atuam na filtração do antígeno (JEURISSEN et al., 1992). Mast et al. (1999)
descreveu que estímulos imunológicos durante o período embrionário e na primeira semana
de vida das aves leva a um aumento o número de PALS e PWP no baço destas aves, porém
não há nada descrito em animais imunocompetentes.
Os níveis maiores de anticorpos observados no experimento I e II refletiram em
alterações significativas no baço dos animais.
Em ambos os experimentos, a IgM foi a classe de anticorpo mais abundante na
resposta imune primária, enquanto a IgY foi a mais abundante na resposta imune secundária.
Este fenômeno é explicado devido a troca de classe de anticorpos que ocorre no centro
germinativo, da classe IgM para IgY, após 7 dias da primeira inoculação do antígeno. A IgM
é expressa 7 dias após o estímulo imunológico, ocorrendo uma troca de classe para IgY no
segundo estímulo (YASUDA et al., 2003).
Não foi observada uma relação entre os níveis de anticorpos produzidos e o número
de centro germinativo. O aumento do número de centros germinativos pela utilização da via
i.v. era esperado e está de acordo com os resultados obtidos por outros autores (LI et al., 1998;
YASUDA et al., 2003a). O que não foi esperado é a resposta do baço a via s.c. já que o
43
transporte do antígeno por esta via até o baço não foi descrita ainda por nenhum estudo. Sabe-
se que na epiderme existe a presença de células dendríticas epiteliais, identificáveis pelo uso
de anticorpos ATPases e MHC classe II específicos. Estas células estão presentes na epiderme
de aves em pequenos agregados de tecido linfóide chamados de nódulos linfóides epidermais.
Estes nódulos não apresentavam uma rede linfática como em mamíferos. Até o momento não
se sabe como as células dendríticas atingem estes nódulos linfáticos, ou se há a migração
destas células para o baço (TORRES et al., 1994; IGYÁRTÓ et al., 2006).
44
CONCLUSÕES
A via de inoculação de SRBC mais eficiente na produção de anticorpos é a
via i.v. em ambas as linhagens testadas.
A via i.m. leva a um aumento significativo dos anticorpos da classe IgM nos
animais da linhagem White Leghorn, mas não nos animais da linhagem Isa Brown.
A via i.p., em animais Isa Brown, resulta em títulos mais altos de anticorpos
do que as vias i.m. e s.c. Porém, os títulos de anticorpos IgY obtidos são menores do que os
obtidos pela via i.v..
O aumento da produção de anticorpos leva a um aumento das áreas de polpa
branca no baço das aves Isa Brown.
45
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![TOELAATBARE BELASTING [kN] · 2018-06-27 · schoren - 01 - cts - 03.03.2015. eto 140 eto 100 eto 120 eto 50 eto 40 eto 60 eto 80. uitgeschoven lengte [m] toelaatbare belasting [kn]](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5fb11910c2255b1fa87c2964/toelaatbare-belasting-kn-2018-06-27-schoren-01-cts-03032015-eto-140.jpg)
