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INDICE
Introduzione…………………………………………………………………..2
Epatite Autoimmune…………………………………….…..…………………..2
Cirrosi Biliare Primitiva……………………………………….…………………7
Colangite Sclerosante Primitiva……………………………………………….20
Scopo dello studio………………………...………………………………23
Pazienti e Metodi………………………..…………………………………24
Selezione dei pazienti………………………………………………………….24
Immunofluorescenza Indiretta…………………..…….………………………25
Immunoblot………………………………………………...……………………26
Valutazione clinica dello score system dell’IAIHG……...……………………27
Risultati…………………………………………………………………………28
Immunofluorescenza Indiretta………………………….………………………28
Immunoblot……………………………………………….………………………29
Valutazione clinica dello score system dell’IAIHG……………………………29
Discussione………………………………………….…………………..……30
Tabelle…….………………………………………….…………………………36
Riassunto…………………………………………….………………….………38
Bibliografia………………………………………….…….……………………41
1
Introduzione
La dizione di “sindrome da overlap” (SO) esprime il concetto di sovrapposizione
che, applicato alla patologia epatica autoimmune, sottende la contemporanea
presenza di caratteri peculiari di differenti entità nosologiche in un singolo
paziente. Lo spettro delle patologie a carattere autoimmunitario del fegato vede
ad un estremo l’epatite autoimmune (EAI), classicamente suddivisa in tipi in
funzione delle reattività autoanticorpali presenti, all'altro le patologie a carattere
colangitico classicamente rappresentate dalla colangite cronica non suppurativa,
meglio nota come Cirrosi Biliare Primitiva (CBP), e dalla Colangite Sclerosante
Primitiva (CSP). Prima di affrontare l'aspetto propriamente riconducibile alla
sovrapposizione della componente epatitica e di quella colangitica riteniamo
opportuno affrontare un breve excursus su quelle che sono le tre entità
nosologiche autoimmunitarie epatiche; e cioè l'EAI, la CBP e la CSP.
Epatite Autoimmune
L’epatite autoimmune (EAI) è “una malattia che non mostra tendenza alla
risoluzione spontanea, ha un substrato istopatologico di epatite periportale, è di
solito associata ad ipergammaglobulinemia policlonale e presenza di
autoanticorpi sierici e risponde alla terapia immunosoppressiva nella maggior
parte dei casi” [1]. L’EAI è una malattia relativamente rara (incidenza 0.1-1.2 x
2
105 casi/anno ed una prevalenza stimabile in circa 15 x 105 casi) [2] e ad
eziologia sconosciuta, per cui non esiste un singolo criterio in sè sufficiente per
porre una diagnosi, che risulta quindi una diagnosi di esclusione. Nel 1999
l’International Autoimmune Hepatitis Group-IAIHG ha ribadito i criteri diagnostici
dell’EAI [3], già proposti qualche anno prima, e basati su un sistema di punteggio
- positivo o negativo- che tiene in considerazione una serie di parametri clinici,
biochimici, virologici ed immunologici, la presenza di fattori eziologici noti, il
quadro istologico, l’assetto genetico e la risposta alla terapia
immunosoppressiva. Il punteggio cumulativo permette di concludere per una
diagnosi di EAI “definita” o “probabile”, ovvero di escludere la diagnosi di EAI
(Tabella 1). La presentazione clinica della malattia risulta estremamente
polimorfa, e può essere schematicamente suddivisa in 3 modalità: acuta, cronica
ed asintomatica. L’esordio acuto, osservabile nel 20-30% dei casi, simula in tutto
e per tutto il quadro dell’epatite acuta itterica, virale o da altre cause. La
progressione insidiosa della malattia determina nel 30-40% dei casi una
sintomatologia aspecifica contraddistinta da astenia, malessere generale e calo
ponderale. Nel restante 30-40% dei casi non è presente alcuna sintomatologia e
la diagnosi risulta del tutto incidentale. Spesso l'EAI è associata a manifestazioni
extra-epatiche quali distiroidismo, artriti/artralgie, diabete mellito, malattie
infiammatorie intestinali, sindrome di Sjögren, per cui spesso tali pazienti sono
osservati inizialmente in ambiente endocrinologico o reumatologico [4]. L’EAI, in
linea generale, è una malattia ad alta attività biochimica (elevati valori di
transaminasi e di -globuline) ed istologica, con quadri di epatite dell’interfaccia
3
(“piecemeal necrosis”), necrosi “a ponte”, necrosi multilobulare. L’IAIHG ha
considerato marcatori di rilevanza diagnostica i seguenti autoanticorpi, ricercati
mediante immunofluorescenza indiretta alla diluizione del siero test di 1:40 (un
cut-off di positività più basso è suggerito in caso di patologia pediatrica):
- autoanticorpi antinucleari (ANA)
- autoanticorpi anti muscolo liscio (SMA)
- autoanticorpi anti microsomi di fegato e rene (anti-LKM1).
In caso di negatività dei suddetti marcatori sono presi in considerazione altri
autoanticorpi “definiti”, dei quali cioè siano disponibili informazioni pubblicate,
relative alla metodologia di indagine e alla rilevanza nella diagnosi di EAI
(anticorpi anti-ASialoGlycoProtein Receptor – anti-ASGP-R, anti-Soluble Liver
Antigen/Liver Pancreas – anti-SLA/LP, anti-Liver Cytosol type 1 – anti-LC1, anti-
Human Hepatocyte Plasma Membrane – anti-HHPM, anti-Sulfatide) [5].
In base alla presenza dei diversi autoanticorpi l’EAI è correntemente suddivisa in
tre forme:
l’EAI di tipo 1, positiva per ANA e/o SMA,
l’EAI di tipo 2, positiva per anti-LKM1 e/o anti-LC1,
l’EAI di tipo 3, positiva per anti-SLA/LP.
Va comunque sottolineato che il quadro clinico, biochimico ed istopatologico
delle tre forme è sostanzialmente simile. Fa eccezione l’età di insorgenza della
malattia, significativamente più bassa nella maggior parte dei casi di EAI di tipo
2, che spesso esordisce in età pediatrica. Da segnalare infine la recente
osservazione di anticorpi anti citoplasma perinucleare dei neutrofili (pANCA) in
4
due terzi dei casi di EAI di tipo 1, ma non di EAI di tipo 2; la rilevanza dei pANCA
nella diagnostica e nel monitoraggio rimane tuttora da chiarire [6]. Autoanticorpi
pANCA sono osservabili con la stessa prevalenza nel 70-80% dei casi di CSP.
Non esiste una cura per l’EAI, per cui l’obiettivo è quello di “spegnere” la flogosi
epatica cercando di limitare al minimo gli effetti collaterali legati ai farmaci
utilizzati. Il cardine della terapia farmacologica dell’epatite autoimmune è
rappresentato dalla terapia immunosoppressiva, in particolare dalla terapia
steroidea, da sola o in associazione con aziatioprina. La maggior parte dei
pazienti trae beneficio dalla terapia steroidea, mediante una riduzione della
citonecrosi epatocitaria e della flogosi epatica con remissione della malattia. Con
il termine di remissione si intende la normalizzazione dei parametri biochimici
(transaminasi, ipergammaglobulinemia) ed un miglioramento del quadro
istologico. La terapia steroidea non è però completamente soddisfacente; infatti
le recidive di malattia durante il “tapering” del cortisone e nel caso di
sospensione completa, la frequente comparsa di effetti collaterali quali diabete,
irsutismo, osteoporosi, ipertensione rendono comunque necessaria una continua
ed attenta modulazione del dosaggio terapeutico dello steroide nel singolo
paziente. Vengono considerate indicazioni assolute alla terapia
immunosoppressiva valori di transaminasi uguali o superiori a 10 volte la norma,
oppure superiori a 5 volte la norma ed associati ad un aumento di più del doppio
delle -globuline, il riscontro istobioptico di necrosi a ponte o multilobulare e la
presenza di sintomi inabilitanti. Laddove le alterazioni cliniche, biochimiche ed
istologiche siano invece di minore entità non vi è indicazione alla terapia. Se il
5
quadro è già evoluto verso uno stadio di cirrosi con insufficienza epatica
l’indicazione terapeutica è il trapianto d’organo. Il protocollo terapeutico prevede
una prima “fase di attacco” con dosaggi medio-elevati (0,5-1 mg/Kg/die) di
metilprednisolone (Urbason, Medrol) allo scopo di contrastare la flogosi
epatica, verosimile espressione biochimica ed istopatologica dell’attacco
immuno-mediato verso l’epatocito. In seguito, quando è stato ottenuto un
controllo soddisfacente della citonecrosi epatocitaria la terapia deve essere “di
mantenimento” della remissione, per cui è opportuno ridurre molto lentamente il
dosaggio steroideo, al fine di ridurre o comunque limitare gli effetti indesiderati di
tale farmaco. Quando gli effetti collaterali siano importanti o non sia possibile
ridurre lo steroide senza evitare che la flogosi epatica riprenda con vigore, può
essere utile introdurre, in combinazione con il cortisone, l’azatioprina (Imuran) al
dosaggio di 50 mg/die. L’introduzione dell’azatioprina si pone l'obiettivo di ridurre
ulteriormente, in corso di mantenimento, il dosaggio dello steroide. Il trattamento
combinato risulta invece mandatorio in tutti quei casi in cui coesistano patologie
che verrebbero ulteriormente aggravate da terapie steroidee prolungate ad alti
dosaggi (diabete, osteoporosi, ipertensione, obesità). Le principali
controindicazioni all’utilizzo dell’azatioprina sono rappresentate da età giovanile,
gravidanza e coesistenza di pancitopenia. In caso di riaccensione della flogosi
epatocitaria è indicato il ricorso ad un nuovo ciclo di terapia “di attacco”. Alcuni
pazienti non rispondono in maniera completa alla terapia, in quanto, nonostante
un miglioramento dei parametri biochimici, non è raggiunto lo stato di completa
remissione; in tali casi l’obiettivo deve essere quello di identificare, in maniera del
6
tutto empirica, il più basso dosaggio di steroidi efficace. Altri farmaci ad azione
immunosoppressiva (tacrolimus, ciclosporina, budesonide, mofetil micofenolato)
sembrano produrre risultati promettenti, ma necessitano di ulteriori conferme
sono necessarie prima di potere essere affiancati agli attuali farmaci d’elezione.
Non sembra invece avere nessuna efficacia l’associazione degli acidi biliari alla
terapia steroidea. In corso di EAI, oltre alla terapia specifica tesa al controllo
della malattia, spesso si rivela utile il ricorso a terapie adiuvanti atte al controllo
delle manifestazioni che la terapia di base può comportare; in quest’ottica trova
ragione ed ha un suo razionale la somministrazione di calcio, vitamina D,
difosfonati, e di terapia ormonale nella donna in post-menopausa. Il trapianto di
fegato è riservato sostanzialmente a quei pazienti che presentano evoluzione in
cirrosi scompensata con quadro di insufficienza epatica, e ai casi di epatite acuta
a decorso fulminante che non rispondono alla terapia steroidea ad alti dosaggi.
Da non trascurare comunque che il trapianto di fegato in pazienti con EAI
comporta una maggior serie di problemi nel post-trapianto legati a rigetto
d’organo acuto e cronico ed alla scarsa responsività alla terapia steroidea
rispetto ai pazienti trapiantati per epatopatie ad eziologia differente. E’ stata
segnalata la possibilità di recidiva della EAI a livello del fegato trapiantato, specie
in relazione alla riduzione del trattamento immunosoppressivo.
Cirrosi Biliare Primitiva
7
La Cirrosi Biliare Primitiva (CBP) è una patologia epatica cronica ad impronta
colestatica, di origine sconosciuta ed a carattere evolutivo che colpisce
preferenzialmente donne di mezza età, la cui evoluzione può portare ad
insufficienza epatica ed a necessità di trapianto d’organo [7]. L’incidenza e la
prevalenza della CBP sono rispettivamente di 1.6 x 105 casi/anno e di 14.6 x 105
[2]. La diagnosi di CBP si basa su criteri clinici, biochimici, immunologici ed
istologici; un singolo test, cioè la positività per l’anticorpo anti-mitocondrio (AMA)
mediante immunofluorescenza indiretta, è però di per sè sufficiente per avanzare
il sospetto diagnostico di CBP con un grado di probabilità estremamente elevato.
La positività dell’AMA rappresenta il primo evento che compare nella storia
naturale della CBP [8]; può infatti precedere anche di molti anni le alterazioni
biochimiche tipiche della malattia aumento della fosfatasi alcalina e della
gammaglutamiltranspeptidasi (-GT), le quali a loro volta precedono la
comparsa della sintomatologia clinica (prurito, ittero, sintomi e segni di
insufficienza epatica). La precocità della comparsa dell’AMA, unitamente alla
sensibilità ed alla specificità di malattia che tale reattività esprime, rafforza
l’ipotesi a favore di un suo possibile coinvolgimento anche in ambito
patogenetico. La precocità della sua comparsa permette inoltre di effettuare una
diagnosi precoce e conseguentemente di instaurare a tempo debito l’appropriata
terapia. E’ degli ultimi anni l’acquisizione che il trattamento con acido
ursodesossicolico sembra in grado di modificare la storia naturale della malattia
rallentandone l’evoluzione senza indurre apprezzabili effetti collaterali [9, 10].
Sotto il profilo clinico e biochimico la colestasi rappresenta l’aspetto più
8
caratteristico della CBP. Naturalmente, l’espressione della colestasi varia sotto il
profilo sia qualitativo che quantitativo nel corso della malattia. L’unico stadio nel
quale, per definizione, non sono identificabili alterazioni correlate alla colestasi è
quello preclinico, quando come detto in precedenza può però essere già
identificabile l’AMA. I più sensibili marcatori biochimici di colestasi e quindi i più
utili nella pratica clinica sono rappresentati dalla fosfatasi alcalina e dalla -GT.
E’ consueto osservare, in genere in una fase successiva a quella dell’elevazione
della fosfatasi alcalina e della -GT un aumento delle aminotransferasi, spesso
con inversione del rapporto tra alanina- e aspartato-aminotransferasi. L’ultimo a
modificarsi tra gli indici di laboratorio associati alla colestasi è la bilirubinemia. La
sua correlazione inversa con l’integrità dei dotti biliari rendono particolarmente
utile ai fini prognostici le modificazioni dei suoi valori, a differenza di quanto
avviene per i livelli sierici degli enzimi e degli acidi biliari. La ragione per cui la
bilirubinemia compare solo tardivamente rispetto ad altri indici è da ricercare
nella notevole riserva funzionale dei meccanismi di trasporto epato-canalicolare
della bilirubina coniugata che sono, a parità di richieste fisiologiche, circa 5-10
volte più efficienti di quelli degli acidi biliari. Sotto il profilo clinico il segno più
tipico correlato alla colestasi è l’ittero che, comunque, è riconoscibile a livello
sclerale solo a livelli di bilirubinemia superiori a 2 mg/dL e a livello cutaneo a
livelli all’incirca doppi; è superfluo ricordare a questo punto come l’ittero
rappresenti un segno “tardivo” ai fini diagnostici e possa essere invece utilizzato
come marcatore prognostico di malattia. Altri segni cutanei correlati più o meno
direttamente alla colestasi sono l’iperpigmentazione, con una sfumatura
9
melanica localizzata prevalentemente al tronco, e gli xantomi; questi ultimi sono
lesioni giallastre, soffici strettamente correlate all’ipercolesterolemia che
contraddistingue i pazienti con CBP; ne esistono due varianti, una piatta
(xantelasmi) variamente localizzata a livello del collo, dorso, mammelle e tronco
e una variante tuberosa che è preferenzialmente localizzata a livello delle
superfici estensorie degli arti e delle cicatrici. Sono lesioni reversibili, per cui
quando si ha una riduzione della colestasi e quindi dei livelli di colesterolo, si può
verificare una loro riduzione e scomparsa. Il sintoma principale della CBP, che
talora rappresenta anche il sintoma iatrotropo, è rappresentato dal prurito;
l’intensità di tale sintoma varia grandemente, è generalizzato e può essere
invalidante le normali attività quotidiane; per quanto non sussista l’evidenza
scientifica che il prurito correli con l’aumentata concentrazione sierica di una
qualche sostanza normalmente escreta con la bile, la terapia standard del prurito
in corso di CBP avviene con resine a scambio ionico a livello intestinale che
legano e fanno precipitare gli acidi biliari [11]. Recentemente sono stati effettuati
vari studi atti a verificare ed a confermare un’origine centrale del prurito; sono
stati proposti modelli animali in cui vi era l’evidenza che il prurito e quindi l’attività
di grattamento, oggettivamente registrata attraverso appositi sensori cutanei,
associasse con un’attivazione del tono opioidergico e che la colestasi fosse in
grado di determinare un attivazione del tono opioidergico [11]. A questo punto la
terapia sarebbe volta all’utilizzo di molecole antagoniste i recettori per gli
oppiacei (es. naloxone). Le alterazioni del metabolismo osseo, osteomalacia e
osteoporosi soprattutto, sono state costantemente associate alla CBP; il ridotto
10
assorbimento della vitamina D secondario alla colestasi, il ridotto assorbimento
del calcio, le alterazioni ormonali estro-progestiniche del post-menopausa ed
eventuali terapie steroidee sono le molteplici cause alla base di tali quadri; è
altresì vero che un recente studio [12] abbia documentato come l’osteoporosi
non rappresenti un carattere specifico di CBP; infatti la prevalenza della
osteoporosi nei pazienti con CBP era analogo a quello di un gruppo di controllo
matchato per sesso ed età. Il sospetto clinico-laboratoristico di CBP richiede in
genere il supporto del dato istologico ottenuto mediante biopsia epatica. Le
informazioni così ottenute risultano preziose sia sotto il profilo di una conferma
diagnostica sia per la corretta stadiazione della malattia. A questo proposito è
opportuno ricordare che la istopatologia della CBP è stata suddivisa da Scheuer
in 4 stadi [13]. La lesione istopatologica che caratterizza la CBP è rappresentata
da una "colangite segmentaria, cronica, progressiva, non suppurativa e
distruttiva dei dotti biliari interlobulari del diametro di 40-80 . La reale
dimensione dei dotti interessati può peraltro risultare di difficile valutazione, in
quando essi tendono ad allargarsi come effetto della lesione della membrana
basale e della proliferazione epiteliale reattiva conseguente al danno. Nella fase
iniziale della malattia (stadio I) i segmenti interessati mostrano rigonfiamento dei
biliociti o condensazione eosinofila degli stessi e, a tratti, l’epitelio appare
pluristratificato ed infiltrato da linfociti e plasmacellule. Sono presenti inoltre
rotture focali delle strutture dei dotti. Aggregati di cellule epitelioidi o chiari
granulomi si sviluppano in stretta vicinanza o intorno ai dotti interessati. I
granulomi peri- o iuxtabiliari sono costituiti da linfociti, plasmacellule, istiociti,
11
eosinofili e, non raramente, chiare cellule giganti multinucleate. Ludwig ha
proposto una classificazione generale delle colangiti in forme granulomatosa,
linfocitarie e pleiomorfe [14]. La colangite, che costituisce il substrato della
lesione duttale della CBP e che si ritrova nel 50% dei campioni bioptici prelevati
nelle fasi iniziali della malattia, è quella definita da Ludwig come granulomatosa.
Nelle fasi più avanzate il riscontro della "lesione duttale florida" scende al 25%
delle biopsie. Meno frequente è il riscontro, peraltro possibile anche in fase
iniziale di malattia, di una colangite linfocitaria o pleiomorfa ad evoluzione verso
la fibrosi. I dotti di dimensioni inferiori ai 40 possono apparire circondati da
edema e fibrosi, verosimile espressione di un’ostruzione più distale. Ha inoltre
una precisa utilità diagnostica la dimostrazione istologica di un accumulo di rame
e della proteina legante il rame, la metallotioneina; tali alterazioni sono peraltro
indicative di epatopatia cronica colestatica più che di CBP. Col progredire della
malattia verso lo stadio II si assiste allo sconfinamento dell’infiltrato infiammatorio
nel circostante parenchima periportale (da portale l’epatite diviene periportale);
questo si associa a marcata proliferazione duttulare, ben visibile all’interfaccia
porto-parenchimale. Gli epatociti periportali appaiono vacuolati e circondati da
macrofagi d’aspetto "schiumoso" a questo quadro è stato dato il nome di
"piecemeal necrosis biliare". Lo stadio III è contraddistinto dall’accentuazione
della fibrosi, già iniziata nello stadio II, con comparsa di setti che uniscono spazi
portali adiacenti. Nello stadio IV è presente cirrosi franca. La paucità di dotti
biliari interlobulari può essere l’unico indizio della natura della cirrosi. Va rilevato
che lo staging della CBP presenta problemi che possono limitarne alquanto
12
l’utilità dell’operazione. Infatti lesioni caratteristiche di più di una stadio di malattia
possono coesistere nella stessa biopsia; in questi casi è la lesione più avanzata
a definire lo stadio. Il carattere di segmentarietà della lesione duttale fa sì che la
stessa possa non essere inclusa nel campione in esame, specie se non vengono
eseguite sezioni seriate. Sotto il profilo immunologico abbiamo precedentemente
accennato all’AMA ed alla sua utilità diagnostica, che lo rende unitamente al dato
istologico, uno dei due criteri maggiori per porre diagnosi di CBP. L’associazione
AMA-CBP risale alla metà degli anni ’60 [15]. Attualmente la ricerca della
reattività antimitocondriale viene comunemente effettuata nella pratica clinica
mediante immunofluorescenza indiretta, western immunoblotting ed ELISA. Tutte
e tre le metodiche presentano una elevata sensibilità e l’utilizzo dell’una o
dell’altra dipende essenzialmente dall’esperienza degli operatori e dalle
attrezzature di cui il laboratorio dispone. L’IFL utilizza come substrato sezioni
criostatiche non fissate di rene e stomaco di roditore; l’utilizzo di tali substrati
trova la sua giustificazione nell’abbondanza di mitocondri che questi tessuti
propongono, in particolare modo le cellule dei tubuli renali e le cellule parietali
gastriche. Non vi è dubbio che il riconoscimento del pattern immunomorfologico
dell’AMA richiede la capacità di differenziarlo da quello di altri autoanticorpi,
come l’anti-liver kidney microsome (LKM1), reattivi a livello degli stessi substrati
tissutali [16]. Il maggior limite della ricerca dell’AMA in immunofluorescenza,
intrinseco alla tecnica immunomorfologica, è tuttavia rappresentato dal fatto che
il test può peccare di specificità, in quanto consente di valutare la presenza o
l’assenza della reattività ma non l’identificazione dell’antigene o degli antigeni
13
riconosciuti; sono noti infatti anticorpi diretti contro molecole mitocondriali diverse
dai bersagli dell’AMA (ad esempio, gli anticorpi anticardiolipina, che riconoscono
l’epitopo contenente il difosfatidilglicerolo). Più complessa, ma anche dotata di
maggiore sensibilità e specificità, è la tecnica rappresentata dal western
immunoblotting che utilizza preparazioni mitocondriali come sorgente di
antigene. E’ rapidamente emerso che l’AMA reagisce con più peptidi
mitocondriali di vario peso molecolare, compreso tra 74 e 41 kDa. Nel 1987 è
stato sequenziato e clonato il cDNA che codifica per un peptide target di 74 kDa
[17], riconosciuto come il principale autoantigene bersaglio dell’AMA ed
identificato nel 1988 come la componente E2 del complesso della piruvato
deidrogenasi (PDC-E2) [18, 19]. Allo stesso modo sono stati identificati i bersagli
antigenici corrispondenti agli altri peptidi reattivi in immunoblotting. In generale, si
tratta delle componenti E2 (ad attività diidrolipoamide acetiltransferasica, in
grado di catalizzare il trasferimento riduttivo di un gruppo acetilico dai rispettivi
substrati al coenzima A per l’ossidazione nel ciclo di Krebs) di una famiglia di
enzimi funzionalmente correlati, chiamata complesso della 2-oxo-acido-
deidrogenasi (2-OADC), comprendente il complesso della piruvato deidrogenasi
(PDC-E2), il complesso della branched-chain 2-oxo-acido deidrogenasi
(BCOADC-E2) [20] [21], ed il complesso della oxoglutarato deidrogenasi (OGDC-
E2) [22, 23]. Inoltre viene riconosciuta dall’AMA la subunità E1a [24] e la
proteina E3BP (la cui funzione sembra essere quella di legare la subunità E3)
della piruvato deidrogenasi [25]. Mediante immunoblotting con preparato di
mitocondri è possibile determinare la fine caratterizzazione delle specificità di
14
ogni singolo siero; non sembra comunque esistere una correlazione clinico-
immunologica fra data specificità e stadio clinico della malattia, e questo rende
superfluo il monitoraggio della patologia mediante lo studio delle singole
reattività. L’identificazione biochimica degli antigeni mitocondriali riconosciuti
dall’AMA, la clonazione e l’espressione di proteine mitocondriali in forma
ricombinante hanno facilitato la fine caratterizzazione della reattività
antimitocondriale e la messa a punto di specifici reattivi diagnostici per il
rilevamento dell’AMA mediante ELISA. L’ELISA è un test sensibile e specifico e
consente di saggiare contemporaneamente più sieri a varie diluizioni. In
considerazione della diversa prevalenza di reattività dei sieri AMA positivi nei
riguardi delle varie proteine target e considerando che nessuna di esse è
riconosciuta dal 100% dei sieri, è necessario che l’ELISA utilizzi uno spettro di
antigeni che comprenda tutte le varie proteine target. Questo si è ottenuto
attraverso la costruzione di "designer molecules", in cui più antigeni bersaglio
sono espressi come una singola proteina ibrida. L’ELISA allestito con questo
reattivo non sembra essere più sensibile e specifico dell’immunoblotting con le
singole proteine antigeniche ricombinanti; tuttavia è un test di facile esecuzione
che offre il grande vantaggio di consentire lo studio contemporaneo di un alto
numero di campioni. L’AMA rappresenta sicuramente il marcatore sensibile e
specifico di CBP, ma vi è una minoranza di casi (5-10%) in cui tale reattività non
è riscontrabile a livello sierico, e ciò può ritardare od addirittura misconoscere la
diagnosi di CBP; l’assenza di AMA nell’ambito della CBP è argomento
largamente dibattuto, e al quale sono stati dedicati numerosi studi in questi ultimi
15
anni [26-29]. Di recente e’ stato introdotto il termine di colangiopatia o colangite
autoimmune (CA) [30-33]. Nell’accezione più ampia dovrebbe definire ogni
malattia biliare con aspetti indicativi di autoimmunità. In un’accezione più ristretta
è usato per descrivere una patologia colestatica le cui caratteristiche
biochimiche, cliniche ed istologiche sono del tutto sovrapponibili a quelle della
CBP: il quadro della colangio-pancreatografia retrograda endoscopica non rivela
alterazioni dell’albero biliare, escludendo di fatto il sospetto di Colangite
Sclerosante Primitiva; l’AMA, marcatore sensibile e specifico della CBP, è
assente, mentre sono presenti autoanticorpi antinucleari e/o anti muscolo liscio.
Studi condotti su ampie casistiche di pazienti con diagnosi clinica ed istologica di
CBP non hanno dimostrato differenze significative sul piano biochimico, clinico e
istologico tra pazienti AMA positivi e pazienti AMA negativi [26, 27, 34]. Sotto il
profilo della collocazione nosologica i casi di colangite autoimmune sono
inquadrabili in tutto e per tutto come CBP, negativi per AMA, ma con altre
autoreattività anticorpali dimostrabili, lasciando la dizione di CBP AMA negativa
ai casi senza autoreattività evidenziabili. La natura delle reattività nucleari
descritti in corso di CA sono analoghe a quelle presenti in corso di CBP. Per
chiarezza espositiva noi ci limiteremo a suddividere i casi in CBP AMA positivi e
CBP AMA negativi. Fra i pattern immunomorfologici descritti in associazione con
la CBP una rilevanza di primo piano la possiedono il Multiple Nuclear Dots
(MND) e il Rim-like/Membranoso, mentre la presenza di altri pattern è spesso
subordinata a patologie coesistenti con la CBP stessa, come per esempio
l’anticorpo anti-Centromero diagnostico sia della variante CREST della
16
sclerodermia senza CBP, sia dell’associazione CBP+CREST. Con il termine di
anticorpi anti-MND si intende una reattività diretta contro antigeni nucleari,
rilevabile mediante tecniche immunomorfologiche. Usando come substrato
cellule HEp-2 il pattern di positività è assai caratteristico ed è costituito da una
positività nucleare punteggiata: si osserva la presenza 3-20 punti di diverse
dimensioni, variamente distribuiti all’interno del nucleo, ma non a livello dei
nucleoli. Tipicamente negativi sono i nuclei delle cellule in mitosi. Tale reattività è
stata descritta con prevalenze variabili nelle varie casistiche (13-42%) di
CBP[35] [36]; la sua importanza deriva tuttavia dal fatto che è presente nel 60%
di casi di CBP AMA negative. Per quanto caratteristico, il pattern di positività
della reattività MND deve essere differenziato da quello di reattività similari, quali
ad esempio quello dell’anticorpo anti-centromero (dots più numerosi, positività
delle cellule in mitosi) [37]. Inoltre la eventuale presenza di altri anticorpi
antinucleari con positività di tipo punteggiato (speckled) può rendere difficile il
riconoscimento del pattern MND. Per tali motivi l’immunofluorescenza indiretta
non può essere considerata la tecnica d’elezione nella ricerca della reattività anti-
MND. Mediante western immunoblotting la reattività anti-MND tipica della CBP è
diretta contro proteine nucleari del peso molecolare di 78-92-kDa e 96-100-kDa,
presenti nei "nuclear bodies" [38]. I target antigenici del pattern
immunomorfologico MND sono stati identificati nella proteina Sp100 e nella
proteina denominata PML, entrambe rappresentate a livello dei “dots” nucleari;
l’Sp100 è una proteina con un peso molecolare di 53 kD, che però a livello
elettroforetico presenta una migrazione aberrante a 100 kD; l’importanza di tale
17
proteina, della quale, invero, non si sa molto, risiede nella sua azione di
stimolazione della attività di trascrizione e nel fatto che la sua prodzione sia
accresciuta dall’interferone gamma; la sequenza di Sp100 presenta due regioni
con notevole grado di omologia nei confronti di proteine note. Un dominio di 40
aminoacidi, localizzato nella metà aminoterminale, presenta un’omologia
superiore al 60% con la regione legante l’antigene delle molecole HLA di classe
I. Una sequenza localizzata nella regione carbossiterminale presenta notevole
somiglianza con vari fattori che regolano la trascrizione [39]. La PML è una
proteina originariamente descritta in pazienti con leucemia acuta promielocitica.
Essa co-localizza con l’Sp100 a livello dei “dots” nucleari e risulta
abbondantemente prodotta nei tessuti sede di flogosi e neoplasia. Sp100 e PML
oltre a possedere una analoga localizzazione a livello nucleare sono state
dimostrate essere anche co-immunogeniche, per cui nel 90% dei casi si trovano
reattività sia contro l’una che contro l’altra proteina [40]. Non stupisce che le
prevalenze fra il pattern immunomorfologico MND e gli anticorpi anti-Sp100 siano
differenti, a favore di una maggiore sensibilità dell’anti-Sp100 (34% vs 17%); la
spiegazione risiede sia nel fatto che la metodica immunoenzimatica (ELISA)
utilizzata per la ricerca dell’anti-Sp100 sfrutti l’utilizzo di una proteina
ricombinante come fonte antigenica, sia nel fatto che, come accennato in
precedenza il pattern MND possa essere in talune occasioni mascherato dalla
coesistenza con altri pattern immunomorfologici. Oltre ad una maggiore
sensibilità, l’Sp100 rispetto all’MND presenta anche una specificità di malattia
superiore [37] [41]. Rare ed occasionali reattività anti-Sp100 sono state anche
18
riscontrate in pazienti “reumatologici”. Unitamente all’MND, l’altro pattern
immunomorfologogico caratteristico della CBP è rappresentato dal cosidetto
Rim-like pattern, caratterizzato dalla positività in fluorescenza a livello della
membrana nucleare; tale positività può essere poi distinta in “smooth” o
“punctate”, in funzione degli antigeni sottostanti tale reattività [42]: come nel caso
dell’MND infatti le specificità antigeniche responsabili di tale pattern sono state
identificate e caratterizzate; si tratta sostanzialmente di un “cluster” di proteine
facenti parte della membrana nucleare interna e del “complesso dei pori
nucleari”, la cui azione specifica è rappresentata dal fatto di costituire una sorta
di barriera permeabile al passaggio di proteine, di cui media e regola il passaggio
dal nucleo al citoplasma e viceversa [43]. La specificità proteica responsabile del
pattern Rim-like “smooth” è rappresentata dal recettore per la lamina B (LBR), la
cui importanza risiede in una elevatissima specificità per CBP [42], mentre la
sensibilità e’ assolutamente modesta (1-4%), mentre del pattern Rim-like
“punctate” sono responsabili proteine quali la gp210 e la p62, facenti parte del
“complesso dei pori nucleari” [44-50]. In particolar modo negli ultimi anni sono
stati approfonditi studi su tali specificità anticorpali, che propongono una
sensibilità nell’ordine del 20 % ma una elevata specificità di malattia. Recenti
studi hanno anche individuato in tali reattività un possibile marcatore prognostico
negativo sulla storia naturale e sull’evoluzione della malattia [51, 52]. Altre
reattività e pattern immunomorfologici nucleari associati alla CBP sono stati
descritti nel corso degli anni [35, 36, 53]; si tratta comunque di pattern non
specifici e la cui presenza può essere spesso giustificata da patologie, di cui
19
sono marcatori, associate alla CBP (è il caso per esempio dell’anticorpo anti-
Centromero, marcatore della sindrome CREST, e del pattern speckled che talora
può sottendere la presenza di anticorpi anti-antigeni nucleari estraibili (anti-ENA)
quali l’SS-A e l’SS-B, marcatori immunologici della sindrome di Sjiogren) [54].
Colangite sclerosante primitiva
La colangite sclerosante primitiva è una patologia epatica cronica ad impronta
colestatica ad eziologia ignota, caratterizzata da un quadro di infiammazione,
distruzione e fibrosi interessante l’intero albero biliare, sia nella sua componente
intraepatica, sia in quella extraepatica [55]. L’aspetto patognomonico valutabile
mediante ERCP è rappresentato da un’alternanza di ristringimenti e dilatazioni a
carico dell’intero sistema billiare, il cosidetto "beading". L’incidenza e la
prevalenza della CSP sono rispettivamente 1.3 x 105 casi/anno e 8.5 x 105 [2]. A
differenza di tutte le altre patologie a verosimile origine autoimmunitaria la CSP
presenta una prevalenza del sesso maschile rispetto a quello femminile [56].
Sotto il profilo istologico la CSP può essere suddivisa in 4 stadi differenti, che
rappresentano uno l’evoluzione dell’altro [57], a cominciare da un quadro di
degenerazione dell’epitelio biliare con infiltrato linfocitario a livello dei dotti biliari
ed allargamento degli spazi portali (stadio I); tale quadro tende poi a diffondersi
con carattere evolutivo, a cui si asociano duttopenia e possible presenza di
necrosi periportale e fibrosi (stadio II) fino ad arrivare alla proliferazione di setti
fibrosi, scomparsa dei dotti biliare (stadio III) e franca cirrosi (stadio IV). Uno dei
limiti della valutazione istologica nella CSP è rappresentata dal campionamento
20
delle sezioni istologiche, per cui spesso ci si trova davanti ad aspetti aspecifici e
non diagnostici, mentre la caratteristica lesione a “buccia di cipolla” dei dotti
biliari, quella si patognomonica, è difficilmente visualizzabile. In seguito a queste
considerazioni il "gold standard" per la CSP è rappresentato dalla
colangiopancreatografia retrograda perendoscopica (ERCP), esame invasivo ma
efficace nella fine valutazione sia delle vie biliari intraepatiche sia in quello delle
vie biliari extraepatiche; a tutt'oggi l'ERCP non è ancora stata sostituita come
esame d'elezione dalla Risonanza Magnetica delle vie biliari, anche se l'auspicio,
considerata la mancata invasività di quest'ultimo esame, è che ciò possa
avvenire in tempi rapidi. L’eziopatogenesi della CSP, così come quelle delle altre
patologie a genesi autoimmunitaria è sconosciuta; nel corso degli anni si sono
susseguite varie ipotesi su quali potessero essere i fattori deteminanti un danno
ricorrente a livello delle vie biliari che potesse poi perpetuare la malattia e
determminarne la sua progressione; fenomeni infettivi (sia di origine batterica
intestinale sia di natura virale), metaboliti tossici della bile, danni vascolari a
carico dei dotti biliari unitamente ad un substrato genetico sono i vari elementi
presi in considerazione per formulare le ipotesi patogenetiche alla base di tale
patologia, anche se tutt'ora nessuna delle ipotesi prese in considerazione ha
fornito risposte concrete. Sotto il profilo clinico la patologia decorre generalmente
in modo asintomatico e la diagnosi è spesso incidentale; solo una modesta
percentuale di pazienti (10-15%) presenta una sintomatologia coclamata
all’esordio della malattia, sintomatologia che puo’ essere polimorfa e variare dalla
febbre, all’astenia, all’ittero, al senso di peso all’ipocondrio destro [58]. Come le
21
altre patologie a carattere autoimmunitario la CSP è spesso associata ad altre
patologie, e nel caso specifico presenta una stretta associazione con le Malattie
Infiammatorie Intestinali, ed in special modo con la Rettocolite Ulcerosa (circa il
75% dei pazienti con CSP presentano anche associata una rettocolite ulcerosa)
[59, 60]; proprio dall'associazione con tale patologia sono originate le
speculazioni secondo le quali alla base della CSP potesse essereci una
infezione batterica di origine intestinale [61, 62]. Altre associazioni significative
sono raprresentate da quelle con la tiroidite e con il Diabete Mellito di tipo 1 [57].
Sotto il profilo immunologico, la CSP propone un’ampia prevalenza di p-ANCA
[63], che come visto in precedenza sono anche caratteristici della EAI di tipo 1,
per cui non possono rappresentare un substrato diagnostico specifico di malattia.
Chiaramente non esiste una terapia eziologica per la CSP, l’acido
ursodesossicolico al dosaggio di 13/15 mg/kg/die ha mostrato miglioramenti del
quadro biochimico di colestasi, soprattutto nei primi mesi di terapia, senza
tuttavia grossi benefici sul lungo termine [64], sono tutt’ora in fase di promettente
sperimentazione trials clinici con acido ursodesossicolico a dosaggi maggiori (25-
30mg/kg/die). Inefficaci si sono rivelati invece i farmaci immunosoppressori
testati e valutati quali i corticosteroidi, la penicillamina e il methotrexate [56]. Al
momento il trapianto ortotopico d’organo rappresenta l’unico valido approccio
terapeutico nei pazienti con quadro di insufficienza epatica [56].
22
Scopo del lavoro
Lo scopo dello studio è stato quello di valutare quale fosse la prevalenza di
sindromi da overlap nella nostra casistica di CBP e di CSP, di confrontare i nostri
dati con quanto emerge dalla letteratura e di verificare l'eventuale impatto
epidemiologico che tale quadro potesse esprimere nell'ambito delle patologie
epatiche a carattere autoimmunitario, soprattutto in funzione dei differenti
approcci terapeutici che le singole patologie presuppongono.
23
Pazienti e Metodi
Selezione dei Pazienti
Abbiamo studiato 173 pazienti con colestasi cronica; di questi 173 pazienti in 157
venivano soddisfatti i criteri clinici, biochimici ed immunologici di CBP; in 122 su
157 (78%) presentavano in Immuno Blot una positività per l'AMA, per la diagnosi
posta è stata di CBP AMA positiva; in 35 su 157 (22%) la ricerca di AMA è
risultata negativa, per cui è stata posta la diagnosi di CBP AMA negativa. Tutti e
35 i pazienti con CBP AMA negativa sono stati sottoposti a ERCP al fine di
escludere il quadro tipico “a corona di rosario”, caratteristico di Colangite
Sclerosante Primitiva. In 16 pazienti la colestasi cronica era invece riconducibile
alla CSP, dove il sospetto clinico ha trovato la sua conferma diagnostica
nell'esecuzione di una ERCP. Nella nostra casistica, come atteso, il sesso
femminile era largamente predominante nella CBP (143 donne/14 uomini),
mentre il sesso maschile era maggiormente rappresentato nella CSP (4
donne/12 uomini). Tutte le possibili cause di ostruzione biliare extraepatica sono
state escluse mediante ecotomografia addominale. Le infezioni da virus B e C
dell’epatite sono state ricercate ed escluse mediante le appropriate tecniche di
indagine, così come sono stati escluse sotto il profilo eziologico tutte le cause di
epatopatia metabolica (malattia di Wilson, deficit di alpha-1-antitripsina) e
mediante una attenta e circostanziata raccolta anamnestica le cause di natura
24
tossica e farmacologica. Tutti i campioni di siero sono stati consevati a –20° fino
al momento del loro utilizzo.
Immunofluorescenza Indiretta
Tutti i sieri sono stati testati, ad una diluizione di 1:40 in tampone salino fosfato
(PBS), su vetri contenenti sezioni congelate di fegato, rene e stomaco di ratto.
Dopo un’incubazione in “camera umida” di 20 minuti e successivi tre lavaggi in
PBS di cinque minuti ciascuno, i vetri sono stati incubati, sempre in “camera
umida”, e sempre per 20 minuti con antisiero, cioè con immunoglobuline anti-
umane coniugate con fluorescina, diluite 1:100 in PBS. Dopo ulteriori lavaggi in
PBS, i vetri sono stati “montati” tramite una soluzione di glicerolo e PBS in un
rapporto di 1:1 ed i pattern delle reattività presenti sono stati valutati mediante
microscopio ottico a fluorescenza (Orthoplan, Leitz, Wetzlar, Germany). Tutti i
sieri sono stati successivamente valutati, utilizzando la stessa metodica, su vetri
commerciali contenenti la linea cellulare HEp-2 alla diluizione del siero di 1:100.
I granulociti neutrofili da utilizzare come substrato per la ricerca dei p-ANCA sono
stati purificati come segue a partire da sangue venoso periferico di donatore
sano di gruppo sanguigno 0. Dopo sedimentazione del sangue eparinato e
addizionato con 10 % di destrosio a 37 ºC per 1 ora, il buffy coat ottenuto e’ stato
sottoposto a centrifugazione su gradiente di Ficoll-Hypaque per separare le
cellule mononucleate. Il pellet, contenente globuli rossi e granulociti e stato poi
25
recuperato e sottoposto a lisi ipotonica dei globuli rossi. Dopo aver riportato la
soluzione in condizioni di isotonicità, la sospensione è stata centrifugata a 200 g
per 10 minuti. Dopo ulteriori due lavaggi in soluzione fisiologica, i granulociti
neutrofili così ottenuti sono stati portati alla concentrazione di circa 1x106/ml e
centrifugati su vetrini mediante Cytospin Shadon a 600 rpm per 3 minuti. I vetrini
sono stati poi fissati in alcool assoluto per 10 minuti a temperatura ambiente e
conservati a –20 ºC fino al loro utilizzo.
Immunoblot
Tutti i sieri sono stati testati in immunoblot per la ricerca delle reattività anti-
mitocondriali utilizzando mitocondri di cuore bovino come fonte antigenica. In
breve, le proteine mitocondriali (ad una concentrazione iniziale di 1 mg/ml) sono
state separate mediante una corsa elettroforetica su un gel al 10 % di
poliacrilamide sodio-dodecil solfato (SDS) e successivamente transblottate su
filtri di nitrocellulosa. Dopo un incubazione di tali filtri per un’ora con PBS
contenente latte in polvere al 3 % (soluzione di blocco), tali filtri sono stati tagliati
in strisce, ciascuna delle quali è stata successivamente incubata con il siero da
testare per 90 minuti ad una diluizione di 1:100 nella soluzione di blocco. Dopo 3
lavaggi di 5 minuti ciascuno con PBS contenente Tween allo 0,1 %, le strisce
sono state incubate per 60 minuti con il siero secondario, costituito da IgG anti-
umane coniugate con perossidasi, alla diluizione di 1:500. Dopo ulteriori lavaggi
26
la reazione colorimetrica è stata sviluppata in una soluzione contenente H2O2 e
cloro naftolo per 10 minuti.
Valutazione score clinico dell’IAIHG
Tutti 173 i pazienti sono stati valutati secondo le direttive dell' IAIHG (tabella 1)
mediante l'applicazione dello score numerico che permette di escludere la
diagnosi di EAI, di renderla "probabile" qualora il range raggiunto fosse fra 10 e
15 prima della terapia o 12 e17 dopo la terapia, o di renderla "definita" se fosse
superato lo score di 15 nel pre-terapia e 17 nel post-terapia.
27
Risultati
Immunofluorescenza Indiretta
Fra i 157 pazienti con CBP il tipico pattern antimitocodriale su sezioni di rene
fegato e stomaco di ratto era presente in 112, mentre anticorpi antinucleo erano
presenti nel 56 % (88/157) utilizzando come substrato le HEp-2 alla diluizione di
1:100; fra i 45 pazienti negativi per AMA, 31 erano ANA positivi. La
caratterizzazione delle reattività nucleari ha evidenziato i seguenti pattern:
Speckled in 41 casi (26%), MND in 22 (14%), Rim-like/Membranoso in 17 (11%),
anti-Centromero in 21 (14%) ed Omogeneo in 5 (3%). I 31 casi ANA positivi
AMA negativi evidenziavano i seguenti pattern immunomorfologici in differenti
associazioni: MND (9 pazienti, 20 %), Speckled (19 pazienti, 42 %), Rim-like (11
pazienti, 24%), Omogeneo (5 pazienti, 11 %) ed anti-Centromero (4 pazienti,
9%). 17 (11%) pazienti presentavano anche una reattività anti-muscolo liscio
(SMA); il pattern SMA era di tipo SMA-V (vasi) in 14 casi, SMA-G (glomerulo) in
1, e SMA-T (tubulare) in 1 [65]. 4/157 (2%) erano positività per p-ANCA. Fra i 16
casi di CSP le reattività antinucleo erano pari al 31% (5/16) rappresertate da 2
casi di pattern Speckeld, 2 Omogeneo e 1 Rim-like/Membranoso. Le reattività
anti-SMA erano pari al 27%, in 2 casi il apttern era SMA-T e in 2 casi il pattern
era SMA-V. Nel 69% dei casi (11/16) era presente una positività per p-ANCA.
28
Immunoblot
122 pazienti su 157 (78%) riconoscevano le specifiche bande di positività
all’immunoblot utilizzando come antigene mitocondri di cuore bovino. 117 su 122
reagivano con la proteina E2 del complesso della piruvato deidrogenasi
localizzato a 74 KD, in differenti associazioni con altre proteine mitocondriali
quali la subunità E3 (E3BP), la subunità E2 della 2-ossi-glutarato deidrogenasi
(OGDC) a 48 kD, la subunità E2 della catena corta della 2 ossi-acido
deidrogenasi (BCOADC) a 52 kD e la subunità E1 della piruvato deidrogenasi a
41 kD; 5 dei 122 sieri reagivano solo con la BCOADC a 52 kD. 10 pazienti
negativi per AMA in IFL sono risultati positivi in blot. Sono stati testati in IB per
AMA anche tutti i 16 casi di CSP che sono risultati negativi.
Valutazione dello score system proposto dall’IAIHG
Dei 173 pazienti studiati 9 pazienti raggiungevano un valore numerico dello score
compatibile almeno con EAI “probabile” e precisamente 3 pazienti con CBP , di
cui 2 con CBP AMA negativa, e 6 con CSP (tabella 2). Nessuno dei pazienti con
CBP, indipendentemente dalla positivita’ per l’AMA raggiungeva lo stato di EAI
“definita”, mentre 2 pazienti su 16 con CSP presentavano un valore numerico
dello score compatibile con diagnosi di EAI “definita”.
29
Discussione
Una prima analisi dei nostri risultati comporta una valutazione di carattere
"epidemiologico"; nel complesso nella nostra casisitica costituita da 173 pazienti
solo 7 raggiungevano uno score sufficiente per EAI "probabile" e solo 2
(entrambi con CSP) raggiungevano uno score di EAI "definita"; questo primo
elemento sta a significare come l'entità numerica del problema sia sicuramente
circoscritta, in considerazione anche dei dati epidemiologici delle patologie
colestatiche autoimmuni già ricordati a livello introduttivo. L’altro aspetto da
sottolineare è rappresentato dalla marcata discrepanza esistente nella frequenza
della SO CBP-EAI e SO CSP-EAI; la prevalenza di questa ultima è
significativamente maggiore (p<0,01) (tabella 2) e le motivazioni alla base di
questa differenza sono molteplici; innanzitutto la CBP rappresenta una patologia
maggiormente "oggettiva", cioè è generalmente sufficiente la presenza di un
autoanticorpo affidabile come l'AMA per porre la diagnosi, tanto che la sua
presenza nell'ambito dello score system proposto dall'IAIHG assume un marcato
peso specifico in negativo. E' comunque giusto anche osservare come l'assenza
di AMA, cioè i casi di CBP AMA negativa non propongano variazioni
statisticamente significative nella prevalenza della sindrome da overlap CBP-EAI,
e questo va a confermare come le due patologie (CBP e EAI) rappresentino due
entità generalmente ben separate e di facile distinzione, cosa che però non
esclude la possibile coesistenza di caratteri sovrapposti. Risale alla fine degli
anni settanta la prima segnalazione di questa SO con la descrizione di casi in cui
veniva riscontrata la coesistenza di caratteri clinici appartenenti sia all’EAI, sia
30
alla CBP [66]; successivamente tale sindrome ha acquisito una base
immunologica con la descrizione di “epatiti colestatiche” in cui coesisteva la
positività degli anticorpi caratteristici della EAI e dell’AMA [67]. Gli studi proposti
in letteratura sulla sindrome da overlap CBP-EAI hanno evidenziato prevalenze
analoghe (7 e 9% rispettivamente) [32] [68] e superiori a quella da noi
riscontrata. E' giusto però sottolineare come siano stati applicati criteri diagnostici
differenti rispetto a quelli da noi utilizzati; da una parte l'applicazione dello score
cumulativo proposto nel 1993 [69], che evidenziava una prevalenza di SO EAI-
CBP nel 7% dei casi considerati, dall'altra si è giunti a risultati analoghi (9%)
ricorrendo a criteri diagnostici meno rigidi, che comunque si basavano sull’analisi
di parametri biochimici, immunologici ed istologici rilevanti [68]. Uno degli aspetti
più controversi e fonte di confusione è rappresentato dalla mancanza di
uniformità dei termini usati ai fini della definizione nosografica: ne deriva che
quadri analoghi possono venire etichettati in modo diverso con la conseguenza
che i risultati di indagini epidemiologiche o terapeutiche condotte da gruppi
diversi sono talvolta difficilmente comparabili. Un esempio è rappresentato dalla
dizione “SO” che in talune occasioni è stata utilizzata come sinonimo di
“colangite autoimmune” [31] [70] , laddove invece vi è un sostanziale accordo
nell’identificare la “colangite autoimmune” con una malattia in cui la sindrome
colestatica predomina largamente sulla sindrome epatitica ed è pertanto
essenzialmente sovrapponibile alla CBP, se si eccettua la negatività dell’AMA.
Allo stesso modo si comprende l’importanza di attribuire ad ogni singolo
parametro, sia esso clinico, istologico, immunologico, biochimico o genetico, un
31
appropriato peso specifico ed una giusta valenza; nella revisione dello score
cumulativo per la diagnosi di EAI, recentemente effettuata, è stato raddoppiato il
valore negativo del riscontro dell’AMA, portandolo da –2 a –4; in tal modo oltre
ad aumentare inevitabilmente la specificità della diagnosi di EAI, si è ridotta la
probabilità di raggiungere la diagnosi di SO EAI-CBP, laddove il punto di
partenza fosse rappresentato dalla diagnosi di CBP (AMA positiva). Nel recente
passato è stata proposta un’interessante ipotesi per cui un sottogruppo di
pazienti, accomunati da un particolare substrato genetico, sviluppi caratteri
compatibili con la SO EAI-CBP [71]. Tale ipotesi parte dal presupposto che
difficilmente possano coesistere in un unico paziente due patologie comunque
rare, quali la EAI e la CBP; dal momento che la diagnosi di CBP si fonda su
criteri ben definiti e maggiormente specifici i pazienti con SO EAI-CBP sarebbero
pazienti con CBP; in tali individui un particolare assetto genetico (HLA B8, DR3 o
DR4), che è significativamente associato all’EAI, condizionerebbe la comparsa di
alterazioni comuni all’EAI. Un’ulteriore valutazione in merito alle SO CBP-EAI
proviene dalla sporadica osservazione di casi di CBP che nel tempo hanno
sviluppato caratteristiche proprie di una EAI non solo sotto il profilo biochimico
(con un marcato aumento delle transaminasi), ma anche sotto il profilo
immunologico (con perdita cioè della reattivita’ antimitocondriale e sviluppo di
reattività nucleari), e ciò lascerebbe intravvedere la possibilità che tali disordini
immunologici possano rappresentare un “continuum” di uno stesso spettro e la
cosiddetta sindrome da overlap il punto di passaggio da una condizione all’altra
[70]; se così fosse però, la prevalenza delle SO dovrebbe essere probabilmente
32
maggiore e non rappresentare un quadro relativamente raro rispetto alla CBP e
all’EAI singolarmente diagnosticate. Come accennato in precedenza nel nostro
studio la SO EAI-CSP presenta una prevalenza maggiore ed una signicatività
statistica rispetto alla SO EAI-CBP, e questo a dispetto del fatto che rispetto alla
EAI e alla CBP, la patogenesi autoimmune della CSP sia maggiormente messa
in discussione; essa infatti, a differenza delle classiche patologie autoimmuni,
presenta una maggiore prevalenza nel sesso maschile e non è caratterizzata da
autoanticorpi specifici, oltre a presentare una scarsa responsività alla terapia
steroidea; inoltre l’aspetto istologico epatico che la caratterizza, la fibrosi
periduttulare “a buccia di cipolla”, non è tipica della patologia autoimmune
epatitica o colangitica, caratterizzata dall’infiltrato di cellule mononucleate. Ci
sono però caratteri peculiari della CSP che ricordano quelli dell’EAI, ed in
particolare modo l’associazione con determinati alleli HLA (HLA-B8, DR3, e
DRw52), l’elevata prevalenza di pANCA, la frequente associazione con altre
patologie di natura autoimmunitaria. Queste analogie contribuiscono
verosimilmente in maniera determinante a giustificare l’elevata prevalenza di SO
EAI-CSP, qualora si applichi lo score cumulativo dell’EAI; le differenti casistiche
propongono una prevalenza della SO variabile tra il 35 e il 52 %[32] [72], quando
sia stata applicata la prima edizione dello score; è doveroso però sottolineare
come in realtà la maggioranza dei casi raggiungesse un punteggio compatibile
con una diagnosi di EAI probabile e solo l’1.7 % uno score di EAI definita. La
recente revisione dello score cumulativo, modificando il punteggio attribuito ad
alcuni parametri biochimici (rapporto fosfatasi alcalina/transaminasi glutammico
33
piruvica) ed aumentando la specificità del dato istologico delle lesioni biliari, ha
comportato una soddisfacente riduzione della prevalenza di SO EAI-CSP. La
nuova analisi condotta su una casistica di 114 casi di PSC, in cui inizialmente la
prevalenza di EAI probabile era del 33% e di EAI definita dell’1.7%, ha ridotto la
prevalenza di EAI probabile (e quindi la presenza di SO EAI-CSP) all’8.7%,
lasciando inalterata la prevalenza di EAI definita [3]. Nella nostra esperienza
rimane comunque elevata la presenza di SO EAI CSP (37%) e, a nostro parere,
rimane dunque aperta la necessità di individuare un parametro sufficientemente
precoce e specifico di CSP, che possa essere contemplato nello score
cumulativo dell’EAI, al fine di aumentarne ulteriormente la specificità diagnostica.
Il problema si pone in termini rilevanti per l’esistenza di casi di EAI ad impronta
colestatica, quantificabili in circa il 10 % [3], in cui si pone il sospetto di una SO
EAI-CSP; in tale casistica il trattamento steroideo potrebbe aumentare in modo
significativo il rischio di colangiti batteriche. Non sembra percorribile la possibilità
di sottoporre tutti questi pazienti ad ERCP in considerazione dell’invasività della
tecnica; potrà essere importante lo sviluppo ed il perfezionamento di un esame
non invasivo, quale la risonanza magnetica delle vie biliari, come nuovo “gold
standard” diagnostico della CSP. La SO EAI-CSP, relativamente rara nell’adulto,
sembrerebbe presentare una maggiore prevalenza nei bambini, anche se tale
dato non ha trovato conferme precise [73] [74] [75]. Uno degli aspetti
fondamentali nella identificazione delle SO è rappresentato dall’approccio
terapeutico che dovrà poi essere utilizzato; in corso di patologia colestatica
cronica l’unico farmaco che attualmente parrebbe comportare un miglioramento
34
del quadro sia sotto il profilo clinico che biochimico é rappresentato dall’acido
ursodesossicolico [76], anche se tale dato é stato recentemente messo in
discussione [77]; il cardine della terapia dell’EAI è rappresentato dalla terapia
steroidea. Proprio alla luce di due approcci terapeutici così differenti è importante
riuscire a rendere omogenei i criteri diagnostici attraverso i quali giungere alla
diagnosi di SO e di raggiungere quindi una ottimizzazione della terapia. Il
dilemma non è nuovo e già in passato era stato proposto un ciclo di terapia
steroidea ex iuvantibus al fine di dirimere il dubbio diagnostico qualora
coesistessero caratteri comuni a patologie epatitiche e colestatiche [78].
35
Tabella 1 - Revised score system for diagnosis of autoimmune hepatitis (1999)(15)
Female sex +2
ALP:ALT ratio<1.5 +21.5-3.0 0>3.0 -2
Serum globulins or IgG above normal>2.0 +31.5-2.0 +21.0-1.5 +1<1.0 0
ANA, SMA, or LKM-1>1:80 +31:80 +21:40 +1<1:40 0
AMA positive -4
Hepatitis viral markersPositive -3Negative +3
Drug historyPositive -4Negative +1
Average alcohol intake<25 gr/day +2>60 gr/day -2
Liver histologyInterface hepatitis +3Predominantly lynfoplasmacytic infiltrate +1Rosetting of liver cells +1None of above -5Byliary changes -3Other changes -3
Other autoimmune disease(s) +2Optional additional parametersSeropositivity for other defined Abs +2HLA DR3 or DR4 +1
Response to therapyComplete +2Relapse +3
Interpretation of aggregate scorePre-treatment:Definite AIH >15Probable AIH 10-15
Post-treatmentDefinite AIH >17Probable AIH 12-17
36
Tabella 2
EAI “probabile” EAI “definite”
CBP tutte 3/157° 0/157°
CBP AMA positva 1/122 0/122
CBP AMA negativa 2/35 0/35
CSP 4/16° 2/16°
Legenda:
° p< 0.01
CBP: Cirrosi Biliare PrimitivaAMA: Anticorpo anti-mitocondrioCSP: Colangite Sclerosante PrimitivaEAI: Epatite Autoimmune
37
Riassunto
Col termine di “sindrome da overlap” nella patologia epatica autoimmune viene
espresso il concetto di sovrapposizione, che si identifica con la coesistenza a
livello di uno stesso paziente della componente epatitica, propria dell’Epatite
Autoimmune e della componente colangitica propria della Cirrosi Biliare Primitiva
e della Colangite Sclerosante Primitiva. Lo scopo del nostro studio è stato quello
di verificare la prevalenza della sindrome da overlap, sia fra Epatite Autoimmune
e Cirrosi Biliare Primitiva sia fra Epatite Autoimmune e Colangite Sclerosante
Primitiva; abbiamo studiato una casistica di 173 pazienti con colestasi cronica di
cui 122 con diagnosi di Cirrosi Biliare Primitiva (tra i quali 35 negativi per
l’anticorpo anti-mitocondrio) e 16 con Colangite Sclerosante Primitiva. A tutti i
pazienti è stato applicato lo score proposto dall’ International Autoimmune
Hepatitis Group per la diagnosi di Epatite Autoimmune, accettato a livello
internazionale. Lo score si fonda su valori numerici positivo o negativi (a seconda
che agevolino o contrastino la diagnosi) che vengono accordati a paramentri di
natura clinica, immunologica, istologica e genetica, ed in base al punteggio
raggiunto rende la diagnosi di Epatite Autoimmune “definita”, probabile, ovvero la
esclude.
Su 122 pazienti con Cirrosi Biliare Primitiva solo 3 pazienti (2,4%) raggiungevano
uno score sufficiente almeno per la diagnosi di Epatite Autoimmune “probabile”,
mentre nessuno raggiungeva la diagnosi di Epatite Autoimmune “definita”,
Diversi sono invece i risultati per quanto riguarda i 16 pazienti con la Colangite
38
Sclerosante Primitiva; 4 su 16 e 2 su 16 raggiungevano rispettivamente uno
score sufficiente per diagnosi di Epatite Autoimmune “probabile” e “definita”.
Se la sindrome da overlap fra Epatite Autoimmune e Cirrosi Biliare Primitiva la
possiamo definire occasionale, o comunque rara, lo stesso non si puo’ dire della
sindrome da overlap fra Epatite Autoimmune e Colangite Sclerosante Primitiva
che propone una elevata prevalenza (37%); la spiegazione di tale discrepanza,
discrepanza presente tra l’altro anche in letteratura, oltre che in una maggiore
componente epatitica della Colangite Sclerosante Primitiva risiede probablmente
anche in una differenza esistente fra le due maggiori patologie colestatiche; se la
Cirrosi Biliare Primitiva presenta un marcatore sensibile e specifico di malattia
come l’anticorpo anti-mitocondrio, che proprio per questo motive assume una
marcata valenza negativa nello score system, lo stesso non può dirsi per la
Colangite Sclerosante Primitiva, il cui gold standard continua ad essere
rappresentato da una tecnica invasiva quale la colangiografia retrograda
perendoscopica, e che non presenta nessuna peculiarità sufficientemente
specifica da potere essere inserita nello score; quindi ancorchè la sindrome da
overlap Epatite Autoimmune-Colangite Sclerosante Primitiva presenti una
prevalenza significativamente maggiore, è plausibile ipotizzare una sua parziale
sovrastima proprio alla luce di un deficit di specificità dello score system nel caso
particolare.
Anche se “limitate” sotto il profilo epidemiologico, il riconoscimento delle sindromi
da overlap è importante ed utile sopratutto alla luce del differente approccio
terapeutico che esse presuppongono, per cui alla terapia di base con acido
39
ursodesossicolico nelle patologie colestatiche, è opportune associare, qualora si
sovrapponga la componente epatitica, la classica terapia immunosoppressiva
con steroidi della Epatite Autoimmune.
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