Sistemas de Expresión Génica

Objetivo

Conocer el diseño de una estrategia para expresión de proteínas

Conocer los sistemas de expresión génica en bacterias, levaduras e insectos.

Diseño de una estrategia para expresión de proteínasDiseño de una estrategia para expresión de proteínas

Elección del vectorAplicación u objetivos experimentales con la proteína expresadaInformación conocida de la proteína. Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión.

Preparación del vectorcorte con ER/desfosforilación/purificación

Preparación del inserto de DNA plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación

Clonado del inserto dentro del vectorLigación/transformación en huesped/identificación.

De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación.

Transformación dentro del huesped para expresión.

Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica.

Scale-up Purificaión de la proteína y análisis funcional

Sistemas de expresión de proteínasSistemas de expresión de proteínas

Sistema Vel de crecimiento/ Costo

Nivel de

expresión

Modificaciones post-traduccionales

E. coli 30 min.

Bajo

Alto NO

Levaduras 90 min

Bajo

Medio glicosilación

Alta manosa

Células insectos 18-24 hs.

Alto

Medio glicosilación

(largo, contenido manosa)

Células mamíferos 24 hs

Alto

Bajo Si

Sistema de expresión en bacterias

Manipulación de la expresión génica en bacterias

• El objetivo principal de la ingeniería genética con fines industriales es lograr la correcta expresión a altos niveles del gen clonado en el microorganismo huésped elegido.

• Sin embargo, la clonación directa (sin manipulación adicional) de un gen en un vector normal (ej. como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de interés se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas filogenéticamente. Por esta razón hay que proceder al diseño de vectores especializados y a menudo a modificaciones del gen de interés, con objeto de que este pueda transcribirse y traducirse bien en el microorganismo huésped.

Elementos a considerar para determinar el sistema de expresión

adecuado Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripción

(promotores-operadores, terminadores) Señales para el comienzo de la traducción Eficiencia de la traducción Estabilidad de la proteína en la célula huésped Localización celular de la proteína a expresar Número de copias del gen clonado.

Lo que debe tener un vector de expresión en E. coli

Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas –35 (TTGACA o parecida) y –10 (TATAAT o parecida)

A corta distancia del promotor, una región que al transcribirse suministre el sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria del extremo 3’ del ARNr 16S

A unos 3-11 pb aguas abajo (dowstream) de la secuencia de Shine-Dalgarno, debería situarse el codón ATG que señala el comienzo de la traducción del ARNm. Este codón lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vector puede disponer de ese codón, seguido de alguna diana que permita la inserción del gen a expresar

Finalmente, y situado al lado 3’ de todo lo anterior, una secuencia que funcione como terminador de la transcripción (que en su forma de ARN constituye la típica horquilla por emparejamiento, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recién formado).

Ejemplos de promotores regulables en E. coli

– Derivados del promotor lac– Derivados del promotor trp– Promotor híbrido artificial tac– Promotores derivados del fago – Promotor del fago T7

Promotores fuertes y regulables

Expresar un gen a alto nivel, no siempre deberíamos escoger un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayor parte de las veces no conviene usar tal tipo de

promotores, porque al estar expresando permanentemente el gen de interés a alto nivel, pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las células.

Esto es especialmente delicado si la proteína foránea tiene efectos negativos para el huésped.

Por lo tanto, lo normal es emplear promotores regulables, que el investigador puede conectar y desconectar a voluntad.

Una estrategia habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante hasta que se logran grandes densidades, momento en que se suministra la señal para que el promotor se active y transcriba el gen insertado.

Elección del sistema de expresión en Elección del sistema de expresión en E. coliE. coli

1) Tamaño de la proteína:

< 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión.

>100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión.

Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares.Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis

2) Cantidad de proteína:

- Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard

- Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación.

3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión.

Proteínas expresadas en Proteínas expresadas en E. coliE. coli

1) Proteínas de fusión:

Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target.

Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión

purificación

protege de proteólisis a la proteína de interés

mejora la solubilidad de la proteína

estabiliza a la proteína de interés

oriAmpr

ATG A B MCSPromotor

A Secuencia “tag”:*Dominio con función enzimática*Señales topogénicas

B Secuencias consenso paraCorte con una proteasa

MCS Sitio múltiple de clonado

Esquema genérico del vector

Fusion partner gene of interest

MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... EndATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG

Nco I

Note: translation stop of fusion partner gene must be removedNote: reading frame of fusion protein must be contiguous

Construcción de una proteína de fusiónConstrucción de una proteína de fusión

Secuencias consenso para el corte con una proteasa– Clivan una secuencia corta y definida de aa– La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés

fusion partner gene of interest

protease cleavage sequence

Esquema general purificación de proteínas de fusión:GSTEsquema general purificación de proteínas de fusión:GST

Glutation

Corte con proteasa

GST Proteína

1-

2-

3-

4- Elution

Optimización de la expresión de proteínas en Optimización de la expresión de proteínas en E. coliE. coli

1) Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA

Se requiere optimizar la traducción.

UAAGGAGGAUUCCUCC AUG5’ 3’

mRNA

3’ 5’16S rRNA

small ribosomal subunit

Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en

16S rRNA (subunidad pequeña del ribosoma)

Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG

2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa.Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no sonusados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt]

Codon Aminoácido Frec. uso en E. coli

Frec. uso en humanos

GAG Glutámico 0,3 0,59

GAA Glutámico 0,7 0,41

CCG Prolina 0,55 0,11

CCA Prolina 0,20 0,27

CCU Prolina 0,16 0,29

CCC Prolina 0,10 0,33

Cepa RosettaTM: cepa diseñada para aumentar la expresión de proteínas eucariotas que poseen codones de baja frecuencia en E.coli.

3) Estructura del mRNA:

Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNAno debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción

4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT

Elección del promotor Elección del promotor

Promotores basados en el operón Lac:

1) Promotor Lac

Lac promoter

pGEM®-3Z Vector sequence reference points.T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69lac operon sequences 94.323; 2564-2724binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 104-125lacZ start codon 108; lacZ operator 128-144β-lactamase (Ampr) coding region 1265-2125binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2677-2700T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2727-3Cepa huesped: lacZM15. Expresa LacIq

2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac

• Híbrido de promotores lac y trp

• Regulado por el represor lac

• Independiente de la regulación por cAMP

XXXXXXXXXXXXXXXXXX

-35 promotor trp -10 promotor lac

Separación16 pb=promotor tac

17 pb=promotor trc

Gen de interés

Ptac promoter

MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta afinidad por maltosa.

Promotor Ptac/IPTG:

Polylinker:

: terminador de la transcripción

3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7:

Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse

lac pro T7 RNA Pol

g10 pro gene of interest

Protein of Interest

Inducer

T7 RNA Pol

T7 RNA PolEl gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en genómico de E.coli

El gen de interés puede estar bajo el control del

promotor del gen 10

T7 promoter

pRSET Expression Vector

The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers:

•High-level expression from the bacteriophage T7 promoter

•T7 gene 10 sequence to provide protein stability

•N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin

•N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody

•Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag

•f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis

PL promoter- triptofano

Mechanism of transcriptional regulation with pLEX

POPtrp cI repressor

Bacterial Chromosome

POPL ATG-GENE

cI repressorNo transcription

Transcription

pLEX vector

No tryptophan

POPtrp cI repressor

Bacterial Chromosome

POPL ATG-GENE

No transcription

Transcription

pLEX vector

Tryptophan

trp repressor

4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago pL:

Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:• Inestables.• Sin actividad biológica.• Contaminantes procarióticos.

Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y

funcionales a la proteína natural.

Modificaciones post-traduccionales– Formación de uniones disulfuro correctas.– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación,

agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos

Producción de proteínas recombinantes en células eucariotas• Problemas que suelen aparecer cuando

proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas– inestables– sin actividad biológica– contaminantes procarióticos

Sistemas de expresión eucariotas

• Para eliminar los problemas de expresión en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas– Esp. importantes para proteínas terapéuticas– Necesidad de que tengan idénticas

propiedades a la proteína natural : bioquímicas biofísicas funcionales

Sistemas de expresión eucariotas

• Cuál es la diferencia?– Modificación post-traduccional de la mayoría

de las proteínas eucariotas – Cél procariotas no pueden realizar estas

modificaciones

Modificaciones post-traduccionales

– Formación de uniones disulfuro correctas– Clivaje proteolítico del precursor inactivo– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar– Alteración de aminoácidos en la proteína

• fosforilación• acetilación• agregado de grupos sulfato• Agregado de ácidos grasos

Sistemas de expresión en levaduras

Sistemas de expresión en levaduras: ventajas

– Organismo unicelular– Bien caracterizadas genética y fisiológicamente– Promotores fuertes disponibles– Plásmido natural (2µm) – Eucariotas, ocurren modificaciones post-

transduccionales– Segregan algunas proteínas– No patógeno

Vectores de levaduras

• YIp: integrativos

- una copia integrada a un cromosoma

• YEp: episomales

- ori 2m (alto número de copias)

• YCp: centroméricos-ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)

Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

Vectores episomales

– Son ampliamente usados– A menudo inestables en cultivos a gran escala

(>10L)

– Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomal

• usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos.– Leucina, Triptofano, Histidina

• el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plásmido episomal

Promotores de levaduras

Promoter Status

Acid phosphatase PHO5 InducibleAlcohol dehydrogenase I ADH I ConstitutiveAlcohol dehydrogenase II ADH II InducibleGalctokinase GAL 1 InducibleMetallothionein Cup 1 InduciblePhosphoglycerate kinase PGK ConstitutiveTriose Phosphate isomerase TPI Constitutive

Sistemas de expresión en levaduras: desventajas

– Inestabilidad de plásmidos en gran escala• Vectores episomales

– Superglicosilación de glicoproteínas• 100+ residuos manosa vs. 8-13 normal• puede alterar la actividad de la proteína

– Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular)• se usan señales peptídicas

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras

• Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = humanos– Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)

• Deleción de genes de glicosilación de levaduras• Agregado de genes de glicosilación humanos

Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras

• Usar otro tipo de levaduras– Pichia pastoris– Hansenula polymorpha– No sólo Saccharomyces cerevisiae

• Usar otros eucariotas– Cél de insectos– Cultivos de cél de mamíferos

Levaduras como sistema de expresiónLevaduras como sistema de expresión

• Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli. • Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica.• Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y O-glicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada.

Saccharomyces cerevisiae• Económico, bioseguro para aplicaciones humanos.• Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores.• Es adaptable a fermentación gran escala. • Herramienta para estudios de complementación. •otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.

Tipos de vectores

• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma

• YEp: episomales: ori 2 (alto número de copias)

• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)

Promotores

Vectores de levadurasVectores de levaduras

Promoter Status

Acid phosphatase PHO5 InducibleAlcohol dehydrogenase I ADH I ConstitutiveAlcohol dehydrogenase II ADH II InducibleGalctokinase GAL 1 InducibleMetallothionein Cup 1 InduciblePhosphoglycerate kinase PGK ConstitutiveTriose Phosphate isomerase TPI Constitutive

Vectores episomales Vectores centroméricos

Expresión de proteínas en Expresión de proteínas en Pichia pastorisPichia pastoris

1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)

2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)

3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento proteolítico.

4) Kits de expresión disponibles.

5) Empleo del gen AOX1

Diagrama general de un vector P pastoris shuttle

MCS

Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli

AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.

AOX1t: secuencias terminador transcripción.

MCS: sitio múltiple clonado.

HIS4: marcador biosintético.

3´-AOX1

Integración del vector de P. pastoris

•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.

•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)

•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.

•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).

Inserto

Inserto

Selección en medio his-

Cepa resultante aox1=Muts

Metanol: crec lento, alta producción prot.

Pichia methanolica Expression System

Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol oxidasa):

reprimido por glicerol o glucosa

Inducido por metanol

-factor: péptido señal para secreción de la proteína expresada.

V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5

6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.

ADE2: marcador biosintético.

Sistemas de expresión en insectos

Que son los baculovirus

• Los baculovirus son un grupo de virus• encontrados mayormente en insectos• (Baculoviridae).• Tienen una estructura de varilla• (baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50• nm y una longitud de entre 200-400 nm.• Su información genética está almacenada en• una molécula de ADN doble cadena, circular,• de aproximadamente 80-200 Kpb.

Baculovirus como sistema de expresión

Características Ambiente eucariota para la producción de proteínas Expresión excepcionalmente alta Expresión durante la fase de oclusión Expresión a 27ºC Capacidad de grandes inserciones Expresión eficiente de genes no

“spliceados” (cDNAs) Simplicidad de la tecnología

Asignacion