SİTOGENETİK

Düzen Laboratuvarlar GrubuSitogenetik Birimi

Dr. Zuhal Candemir, MDTıbbi Genetik Uzmanı

SİTOGENETİK

Tıbbi Genetik; Sitogenetik, Moleküler sitogenetik, Moleküler genetik ve Klinik genetik şeklinde alt birimlere ayrılmış bir bilim dalıdır. İnsan kromozomlarını inceleyen dalına SİTOGENETİK adı verilmektedir.

TARİHÇE

İnsan kromozomları ilk olarak 1879’daArnold tarafından tümör hücrelerinden elde edilmiştir. 1882’de ilk olarak Flemmingtarafından fotoğraflanmıştır.Bundan sonra yapılan çalışmalar daha yavaş ilerlemiş, total kromozom sayısı ve cinsiyet kromozomları açısından birbirinden çok farklı sonuçlar elde edilmiştir.

TARİHÇE• 1923’de Painter tarafından insanda

diploid sayıda 48 kromozom olduğu ileri sürülmüştür.

• 1949’da Murray Barr dişi kedi interfaz nükleuslarında X-kromatinini, diğer adıyla Barr cisimciğini keşfetmiştir.

• Bundan 10 yıl sonra Klinefelter, Turner sendromu ve diğer sex kromozomanöploidileri tanımlanmış, 20 yıl sonra ise Y kromatini keşfedilmiştir.

TARİHÇE

Kanser hücreleri üzerinde yaptığı çalışmaları ile patolojik bozuklukların kromozom sayısı ve yapısındaki anomaliler nedeniyle oluşabileceği teorisi ilk olarak 1914’de Theodor Boveri tarafından ortaya atılmış, 46 yıl sonra 1960’da Novel veHungerford tarafından malignite ile birlikte görülen ilk spesifik kromozom anomalisi Phkromozomu tanımlanmıştır.

TARİHÇE

1932’de Waardenburg ilk olarak Down Sendromunun sayısal bir kromozomalanomali olabileceğini ileri sürmüş, 1958’de aynı sendromda Lejeune ve arkadaşları tarafından en küçük kromozomlardan birindeki trizomi keşfedilmiştir.

TARİHÇE

1950’lerde üç yeni tekniğin -hipotoniksolüsyonu, fitohemagglutinin vekolsemidin- keşfi ve kullanılmaya başlanması ile beraber sitogenetikçalışmalar hız kazanmıştır.1956’da ise Tjio ve Levan tarafından insan kromozom sayısının 48 değil 46 olduğu kesin olarak saptanmıştır.

TARİHÇE

• 1960’larda kromozomlar, uzunluk, sentromer lokalizasyonu, heterokromatin bölge içermeleri ve DNA replikasyon paterni gibi özelliklerine göre ayrı ayrı tanımlanmıştır.

• 1970 yılında ise Pardue ve Gall, in situ hibridizasyon ve C-bantlama tekniklerini geliştirerek modern sitogenetik analiz için önemli adımlar atmıştır.

TARİHÇE

Sitogenetik tekniklerde son 40 yılda meydana gelen gelişmeler ile kromozomlar üzerindeki daha küçük çapta anomalilerin belirlenebilmesi mümkün hale gelmiş bu nedenle kromozom analizi endikasyonlarızamanla artış göstermiştir.

SİTOGENETİK ANALİZİN BAŞLICA ENDİKASYONLARI

1- Bilinen kromozom sendromlarının kesin tanısı veya ekarte edilmesi2- Dismorfik özellikler ile birlikte olan ya da tek başına görülen psikomotor retardasyon.3- Seksüel değişim ve gelişim anomalileri.4- İnfertilite5- Tekrarlayan abortus ya da ölü doğum hikayesi.

SİTOGENETİK ANALİZİN BAŞLICA ENDİKASYONLARI6- Mental retardasyon ve/veya dismorfiközellikler ile birlikte görülen monogenikhastalıklar.7- Maternal serum tarama testleri ya daultrasonografide anöploidi riski olan gebelikler.8- Tanı ve takibinde belirleyici kromozomalbozuklukların görüldüğü malign hastalıklar, özellikle hematolojik maligniteler.

Sitogenetik analiz için hazırlanan kromozomlar bölünen hücrelerden elde edilirler. Kemik iliği, testis, korionik villus,neoplazi gibi bazı dokulardan direkt elde edilebileceği gibi cilt, kan, amniotik sıvı gibi diğer canlı dokulardan uzun süreli kültürler yoluyla da elde edilebilirler.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

Sitogenetik analiz için genetiklaboratuvarına materyal gönderilmesi istendiğinde kültür açısından uyulması gereken bazı şartlar vardır.

DOKULARIN GÖNDERİLME KOŞULLARI

1- Steril şartlarda alınması,2- Formaldehit, alkol gibi fiksatifler içinde olmaması,3- Kanın belirli oranda heparin içeren, amniotik sıvı veya diğer dokuların gerekirsebesiyeri içeren uygun tüp ya da enjektörler içerisinde gönderilmesi,4- Canlı hücre kaybını en aza indirmek için mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak 24 saat içerisinde, laboratuvara ulaştırılması gereklidir.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

İlk olarak; laboratuvara ulaşan materyallerin doku kültürü amacına yönelik mediumdenilen özel besiyerlerine ekimleri yapılır. Kan için hazırlanan mediumlar içerisindefetal calf serumu, mitotik stimülan olarakfitohemagglutinin ve antibiyotik bulunur.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

Değişik amaçlara yönelik çalışmalar yapılacaksa kan kültürünün belirli dönemlerinde, örneğin prometafaz-

kromozomları elde etmek, frajilbölgeleri indüklemek, kromozom kırıkları ile giden sendromları belirlemek için farklı ajanlar ilave edilebilmektedir.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

Kültür aşamasında kan lenfosit hücreleri için konik tabanlı steril falcon tüpleri,fibroblast hücreleri için genellikle tabanı 25 cm2 olan steril kültür flasklarıkullanılmaktadır.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG• Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle

72 saattir. Fibroblast kültür süresi hücrelerin canlılık oranına, sayısına ve aktivasyonuna bağlı olarak değişmekte ortalama 10-12 gün veya daha uzun sürebilmektedir. Kan lenfosit kültürü için 37°C’lik etüv, fibroblast kültürleri için 37°C, %5 CO2’li etüv ortamına gerek vardır.

• Kültürün son 2 saatinde hücreleri mitozaşamasında durdurmak için kültürlere kolsemidilavesi yapılır.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

• Fibroblast kültürlerinde hücrelerin flask tabanında tutunarak çoğalmaları beklenir.

• Hücre kolonileri belirli bir yoğunluğa ulaşana kadar kontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.

• Yeterli hücre elde edileceğine karar verildiğindeharvest işlemi başlatılır.

• Kolsemid ilavesinden sonra hücreleri flasktabanından kaldırmak için tripsin-EDTA kullanılır. Hücreler toplanıp bir tüpe aktarılır. Bundan sonraki işlemler diğer kültürler için yapılanlar ile aynıdır.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

• Harvest işlemi için hücreler santrifüjden sonra yaklaşık 10-15 dakika hipotonik solüsyonu (potasyum klorür veya sodyum sitrat) ile muamele edilir. Bu işlem hücrelerin şişmesi ve dolayısıyla kromozomların birbirinden ayrılmasını sağlar.

• Hipotonik işleminden hemen sonra hücreler 1:3 oranında hazırlanmış soğuk glasiel asetikasit:metanol solüsyonu ile 2-3 kez muamele edilerek fikse olması sağlanır.

DOKU KÜLTÜRÜ VE HARVESTİNG

Hazırlanmış hücre süspansiyonları temiz lamlar üzerine damlatılır, havada ya da kısa sürede yüksek sıcaklıkta kurutularak eskitme işlemi gerçekleştirilir.Eskitilen preparatların rutin analiz içinTripsin ve Giemsa ile bantlama ve boyama işlemleri yapılır.

Rutin analizde kullanılan konvansiyonelG-Bantlama dışında gerektiği durumlarda uygulanabilecek farklı bantlama yöntemleri de vardır;En sık başvurulanı C-Bantlama yöntemidir. Tüm kromozomlardaki heterokromatinbölgeleri koyu renkte boyanır, ökromatinbölgeleri açık renkli olarak kalır. Bu yöntemle heterokromatin bölgelerindeki miktar ve yer değişiklikleri belirlenmiş olur.

Reverse Bantlama ile G-Bantlama paterninin tersi elde edilir yani koyu renk bölgeler açık, açık renk bölgeler ise koyu renk boyanır. Ag-NOR Bantlama ile akrosentrikkromozomların satellit bölgeleri Ag Nitrat ile koyu olarak boyanır.Q-Bantlamada floresan boyama ile G-Bantlama paterni elde edilir, özellikle Yheterokromatin bölgesi ve satellitbölgelerine yönelik olarak kullanılır.

KROMOZOM ANOMALİLERİ

Karyotipleme; kromozomların yapısal olarak incelenmesi, anomalilerinin belirlenebilmesi için yapılan işlemdir.Günümüzde bu işlem özel bilgisayar programları yardımı ile daha kolay ve kısa sürede yapılabilir hale gelmiştir.

Karyotiplemede kromozomlar, X kromozomu hariç, büyükten küçüğe doğru homolog çiftler halinde sıralanırlar. Homolog kromozomların yanyana olması aralarındaki bant farklılıklarının daha kolay belirlenebilmesi için gereklidir.

Kromozom anomalileri başlıca 2 gruba ayrılır:

- Sayısal Anomaliler- Yapısal Anomaliler

Sayısal Anomaliler:• Poliploidiler : Normal diploid sayının dışında,

haploid sayı olan 23’ün katları şeklinde kromozom artışlarıdır. Triploidi (69), Tetraploidi(92) gibi. Hücrede bölünme hatası ya da yumurtanın multiple fertilizasyonu nedeniyle görülür.

• Anöploidi : Diploid sayıdaki artış ya da eksilmelerdir. Hücre bölünmesi sırasında ayrılamama veya kromozom kayıpları nedeniyle ortaya çıkar.

Sayısal Anomaliler:

• Trizomiler (Down Sendromu, Patau Sendromu,Edwards Sendromu)

• Monozomi X (Turner Sendromu)

• Klinefelter Sendromu (XXY)

• XYY, Triple X, Tetra X, Penta X Sendromugibi örnekler verilebilir.

Yapısal Anomaliler :

TranslokasyonlarDelesyonlarİnversiyonlarİzokromozomRing kromozom

TRANSLOKASYONLAR

DELESYONLAR

İNVERSİYONLAR

İZOKROMOZOMLAR

RİNG KROMOZOMLAR

LABORATUVARIMIZDA YAPILAN SİTOGENETİK ÇALIŞMALARPostnatal tanı testleri:

• Periferik kandan kromozom analizi• Cilt biyopsi materyalinden kromozom analizi

Prenatal tanı testleri• Koriyon villus biyopsi materyalinden

kromozom analizi• Amniyon sıvısından kromozom analizi• Kord kanından kromozom analizi

Prenatal tanı materyallerinin bir kısmı kültür işlemi başlatılmadan önce steril koşullarda ayrılarak moleküler genetik laboratuvarına gönderilmektedir. Burada QF-PCR ile yapılan erken TrizomiTanı Testi ile kısa sürede 13,18,21,X ve Ykromozomlarına özgü bir ön bilgi edinilebilmektedir. Kesin bilgi kültür sonrasında yapılacak, 46 kromozomu içine alan karyotiplemesonucuna göre verilmektedir.

Sitogenetik Laboratuvarıİstatistik Değerlendirmeleri

Prenatal TanıRapor edilen olgu sayısı: 122Belirlenen karyotip anomali sayısı: 7

Prenatal Tanı Anomali Bulgularımız

Hasta no: AS005Endikasyon: İleri maternal yaşQF-PCR sonucu: 13., 18., 21. Kromozomlar açısından normal / cinsiyet kromozomları açısından XXYSitogenetik sonuç: 47,XXY

Prenatal Tanı Bulgularımız

Hasta no: AS028Endikasyon: Üçlü testte yüksek risk, trizomi 21 riski: 1/78 QF-PCR sonucu: 13., 18.ve cinsiyet kromozomları açısından normal / 21. kromozom açısından trizomiSitogenetik sonuç: 47,XY,+21

Prenatal Tanı BulgularımızHasta no: AS044Endikasyon: İleri maternal yaşQF-PCR sonucu: 13., 18.ve cinsiyet kromozomları açısından normal / 21. kromozom açısından bilgi verici değilSitogenetik sonuç: 46,XX; 47,XX,+mar[5]Aynı hastaya kordosentez yapıldı,Sonuç: 46,XX; 47,XX,+mar[7]

Prenatal Tanı Bulgularımız

Hasta no: AS045Endikasyon: İleri maternal yaşQF-PCR sonucu: İncelenen kromozomlar açısından normalSitogenetik sonuç: 92,XXYY; 46,XYİki farklı kültürde de aynı sonuca ulaşıldığından kordosenteze yönlendirildi, Hasta onaylamadığı için yaptırılmadı.

Prenatal Tanı Bulgularımız

Hasta no: AS082Endikasyon: Üçlü testte yüksek riskQF-PCR sonucu: 13., 18.ve cinsiyet kromozomları açısından normal / 21. kromozom açısından trizomiSitogenetik sonuç: 47,XY,+21

Prenatal Tanı Bulgularımız

Hasta no: AS084Endikasyon: Üçlü testte yüksek riskQF-PCR sonucu: 13. ve 21. Kromozom açısından normal, 18 ve cinsiyet kromozomları bilgi verici değil. Sitogenetik sonuç: 45,XX,der(13;14)Aileye kromozom analizi yapılması önerildi.

Prenatal Tanı BulgularımızHasta no: AS101Endikasyon: Önceki çocukta kromozom anomalisiQF-PCR sonucu: İncelenen kromozomlar açısından normalSitogenetik sonuç: 46,XX,t(13,20)(q10,p10)Aileye kromozom analizi yapılması önerildi, anne de aynı translokasyon gözlendi.

Sitogenetik Laboratuvarıİstatistik Değerlendirmeleri

Postnatal TanıRapor edilen olgu sayısı: 107Belirlenen karyotip anomali sayısı: 15

Amniotik Sıvı Kültür Başarısını ve Süresini Etkileyen Faktörler

Amniotik sıvının görünümüAmniotik sıvının miktarıTransport şartları ve süresiFetal anomalilerKültür mediumlarıKontaminasyon

Analiz Sırasında Karşılaşılan Sorunlar

MozaizmMarker Kromozom