PROTEINSKA ELEKTROFOREZA

AK proteina poseduju određene elektro-karakteristike, što je ovisno od njihovih bočnih grupa i

posttranslacijskih modifikacija, kao što je fosforilacija. Od ovih ostataka zavisi njihova pH vrijednost i

izoelektrična tačka proteina.

Naboj proteina je odgovoran za njegovu topivost.Zahvaljujući naboju proteini se u električnom polju

kreću prema suprotno naelektrisanoj elektrodi. Njihovo putovanje je različito i zavisi od fizičkih osobina

proteina te od elektroforetskog sistema kojeg koristimo. Pri tom kretanju važan je i otpor kojeg pruža

matrix kroz koji se protein kreće i taj otpor je proporcionalan masi proteina. Ukupan naboj proteina je

zbir pozitivnog i negativnog naboja bočnih lanaca AK. Ako je protein nabijeniji elektricitetom putuje brže

i obrnuto.Putovanje zavisi od:

Jačine električnog polja

pH vrijednosti pufera

viskoznosti pufera.

Fig. 23.1. Physical basis of electrophoresis

Molekule se kreću u električnom polju na osnovu ukupnog eletričnog naboja i oblika. Manje I nabijenije

čestice se kreću većom brzinom. Proteini sa identičnim nabojem su odvojeni zbog njihovog različitog

oblika.

Kao puffer za PE se najčešće koristi Tris-Cl i Tris-glicin.Pufer ispunjava prostor između suprotno

naelektrisanih elektroda elektroforetskog sistema. Visok napon može da dovede do zagrijavanja gela ili

polimera koji se koristi za elektroforezu te do povećanja viskoznosti pufera a što skupa doprinosi lošijoj

razdvojivosti i rezoluciji analiziranih proteina.

Tokom elektroforeze napon struje treba biti konstantan kao i pH vrijednost pufera.

Za EP koristimo gelove koji poseduju mrežastu strukturu i različite mehaničke karakteristike.Za analizu

proteina uglavnom se koristi:

vertikalna elektroforeza sa pločastim gelom

elektroforeza u tubama

mikrokapilarna elektroforeza.

Gel mora posedovati određenu stabilnost zbog postelektroforetske manipulacije.

Gel mora biti hemijski nereaktivan ili sa minimalnom reaktivnošću sa analiziranim proteinima.

Gelove najčešće pravimo od akrilamidnog polimera uz pomoć male količine bisakrilamida(N,N ′-

metilenbisakrilamid) uz pomoću kojeg pravimo metilenske mostove između dugih susednih lanaca

1

akrilamida. Na taj način se dobija gelsa određenom veličinom pora. Za separaciju proteina odnos

akrilamida i bisakrilamida je obično 40:1. Takva solucija predstavlja osnovni razlog za pravljenje gelova

od 5.20% akrilamida u finalnom volumenu. Debljina ovakih gelova je različita a obično se kreće oko 1

mm. Njihova pH vrijednost mora biti stalna.

Fig. 23.2. Acryalide polymerises in the presence of persulphate radicals to form polyacrylamide.

N,N ′-methylene bisacrylamide introduces crosslinks between the polyacrylamide

strands

Table 23.1.Raspon razdvajanja proteina na poliakriamidnim gelovima zavisno od conc.poliakrilamida.

Zbog upotrebe poliakriamidnog gela ovu elektroforezu nazivamo PAGE.

pHvrijednost ovakvih gelova moze biti od 6,9-9 pH, zavisno od vrste proteina koje želimo da

dobijemo.Gelovi manje koncentracije imaju neutralniji pH a gelovi veće koncentracije su uglavnom

baznog karaktera.Od koncentracije gela zavisi I njegova jonska snaga odnosno elektrohemijska

inerntnost.

Da bismo napravili gradijentni pH gel koristimo amfolite tj.molekule koje imaju grupe sa pozitivnim i

negativnim polom. Odnosno molecule koje su polimeri različitih dužina dobijene polimerizacijom amino

ili karboksilnih skupina.

SDS -poliakriamidna gel elektroforeza.Proteini se međusobno drže slabim elektrostatičkim vezama i

mostovima formiranim uz pomoć određene soli. Tokom elektroforeze može doći do hidrolize slabih

elektrostatičkih veza između peptide proteina koji imaju tercijalnu strukuru. Elektroforetska mobilnost se

zbog toga razlikuje u denaturirajućim i nedenaturirajućim uslovima elektroforeze. To moramo imati na

umu kada želimo da zadržimo biološku aktivnost ili kvarternu strukturu ciljnog proteina.

Denaturirajuće uslove postižemo dodavanjem npr.uree(najčeešć). Visoka koncentracija uree razgrađuje

hidrogenske veze što dovodi do destrukcije sekundarne,tercijalne i kvarterne structure. Urea jeste vrlo

hidrosolubilna ali nije polarna i ne kreće se u električnom polju.

Drugi denaturant koji se koristi u vertikalnoj EP je sodijum didecil sulfat (SDS).Sadrži 12-karbonskih

hidrofobni lanac i polarnu sulfatnu glavu.I on je jak denaturant proteinske structure.Zbog svoje

bipolarnosti on se vezuje za protein stvarajucći jedan sloj koji im daje negativan naboj i takvi proteini

uvek putuju prema anodi zbog čega se SDS i najviše koristi.

2

IZOELEKTRIČNO FOKUSIRANJE

Ukupni naboj proteina varira zaisno od pH vrijednosti što je povazeno sa bočnim AK-skim lancima ili

posttranslacijskom modifikacijom. U standardnim elektroforetskim uslovima i odsustvu hemijske

modifikacije izoelektrična tačka je konstantna osobina proteina. Uz pomoć pufera ne možemo napraviti

gel sa gradijentnom pH vrijednošću. Zato koristimo amfolite koji su heteropolimeri (polimeri različitih

dužina)oligoamino i oligokarboksilne kiseline.Različitom kombinacijom amino i karboksilnih grupa

možemo sintetizirati veliki broj različitih amfolita koji imaju različitu izoelektričnu tačku (pI). Kada

uspostavimo električno polje amfoliti se u gelu raspoređuju (migriraju) do svoje individualne izoeletrične

tačke. Dalje se ne kreću jer su u svojoj izoelektričnoj tačci elektroneutralni. Oni na svojoj lokalnoj

poziciji deluju kao pufer i na taj način je napravljen gel sa različitim pH gradijentom. Kada protein dođe u

odgovarajuće pH polje u kome odpušta I prima isti broj elektrona postiže svoju elektroneutralnost i

prestaje da se kreće.Tada kažemo da je protein dostigao svoju izoelektričnu tačku. Ova karakteristika nam

pomaže za bolju separaciju ili ekstrakciju proteina.

KAPILARNA ELEKTROFOREZA

Kod proteinske kapilarne elektroforeze koristimo tanke kapilare malog unutrašnjeg volumena ali relativno

velike unutrašnje površine sa kojom protein mogu doći u kontakt. Kapilare od stakla imaju unutrašnji

dijametar od 10-100 mikrona a spoljašnji prečnik do 300 mikrona. Dužine su od 10-100cm- veoma su

korisne zato što zahtevaju malu količinu uzorka. Mogu se puniti samo poliakriamidom koji nije unakrsno

povezan bisakrilamidom.Možemo formirati i denaturirajuće uslove ako je potrebno. Unutrašnji zidovi

staklenih ili siliko-kapilara imaju negativan naboj pa se prije upoterbe moraju tretirati jonima Na+ ili H+

jonima kako bi sprečili interakciju zidova kapilare sa analiziranim proteinima.

Napon pri kapilarnim elektroforezama je mnogo veći i kreće se od 5-50 KV, dok kod obične elektroforeze

se kreće od 300-500 V.

3

Fig. 25.1. Schematic of a capillary electrophoresis system

EP koristimo za:

1. određivanje molekularne mase

2. određivanje bioloske aktivnosti kao u slučaju katalitičkih enzima gde upotrebljavamo spec.bojenje ili

umetne supstrate kako bi uz pomoć inteziteta bojenja gela determinisali katalitičku aktivnost.

3. SDS EP koristimo za determinaciju disulfidnih mostova.

4. Radi bolje razdvojivosti proteina koristi se dvodimenzionalna SDS PAGE ELEKTROFOREZA(2D

SDS

POSTTRANSLACIJSKE MODIFIKACIJE PROTEINA(PTM)

Je hemijska modifikacija ili isjecanje dijela proteina nakon translacije. Protein se može modificirati

djelovanjem proteolitičkih enzima, formiranjem disulfidnih uslova, kovalentnim djelovanjem fosfora,

sulfata, alkalne grupe, lipida, karbohidrata, polipetdida i na druge načine.

PTM kao npr. M-glikolizacija se moze događati tokom translacije ili nakon translacije proteina, dakle

imamo ko- i postranslacijsku modifikaciju. Većina proteina prolazi kroz postranslacijsku modifikaciju.

30% proteina sisara u ćeliji je u fosfoniliranoj fazi. Skoro svi cirkulirajući protein plazme su glikolizirani.

PTM utiče na naboj, hidrofobnost, konformaciju, imunološke karakteristike, stabilnost, lokalizaciju te

aktivnost proteina. Biološke funkcije mnogih proteina zavise od njihove posttranslacijske modifikacije,

kao npr.specifični oligosaharidi na receptorima limfocita igraju vrlo važnu ulogu u njihovoj aktivnosti i

sazrevanju, signalna kaskada se isključuje i uključuje reverznim dodavanjem ili oduzimanjem fosfata.

Ubikvitacija igra važnu ulogu u degradaciji intracelularnih proteina. Naravno svaka posttranslacijska

modifikacija nužno ne menja aktivnost ili druge karakteristike proteina. Zbog svega navedenog vrlo je

važno proučavati odnos proteinske strukture i njihove funkcije. Tu nam pomaže sekvenciranje AK-skog

sastava proteina i upoređivanjem te sekvence sa odgovarajućim DNA/mRNA sekvencama. Međutim na

osnovu ove komparacije ne možemo da odredimo vrstu posttranslacijske modifikacije. Ova proučavanja

su vrlo važna za kreiranje proteinskih terapeutika. Sastavni su dio funkcionalne genomike i proteomike.

Humani genom sadrži do 25000 gena(sadasnja predpostavka) koji kodiraju do 1 milion različitih proteina

koji su nastali zahvaljujući alternativnom splasingu(srastanje) i posttranslacijskim modifikacijama.

Zadatak proteomike je da izvrši inventuru svih proteina prije svega kod čovjeka, da odredi njihovu

strukturu i funkciju. Misli se da se to ne može ostvariti manje od 3 naredna vijeka imajući u vidu

predpostavljeni napredak tehnologije. Ako se tome doda i određivanje (definisanje) protein, protein

interakcije onda ova predpostavka ima smisla.

Zadatak funkcionalne genomike je da izvrši inventuru gena, njihovu strukturu, funkciju i intergenske

odnose. U ovom pogledu proučavanje transkriptoma (mRNA) predstavlja važan zadatak. Preko

4

trnskriptoma dolazimo do informacija o ekspresiji gena (proteina u određenom tkivu) ali ne i do

informacija o posttranslacijskim modifikacijama.

PTM dovode i do promjene mase proteina što najbolje možemo odrediti masenom spektrometrijom. Neke

modifikacije menjaju i naboj proteina usled acetilacije, alkilacije, karboksimetilacije,fosforilacije,

sulfatacije . Promene u naboju možemo odrediti primjenom izoelektričnog fokusiranja, putem afmolitne

dvodimenzionalne gel elektroforeze. Ova elektroforeza služi još i kao sredstvo za izdvajanje proteina iz

proteinskog mixa i njegovih izoformi. Osim navedene elektroforeze za purifikaciju proteina za ove svrhe

može nam koristiti 2D HROMATOGRAFIJA, masena spektrometrija i proteolitička restrikcija enzima.

Pri ovim proučavanjima nezaobilazne su baze podataka i specifični softveri za analizu predpostavljenih

posttranslacijskih modifikacija još ne okarakteriziranih proteina. Ipak se PTM specifično događa na

određenim AK sekvencama što možemo programski simulirati putem izrde njihovih predpostavljene 3D

struktura koje možemo praviti kod nepoznatih proteina na osnovu DNA/mRNK sekvence.

PTM možemo podeliti na:

Ireverzibilne i reverzibilne

Enzimatske i neenzimatske, što zavisi od biološke funkcije i lokalizacije određenog proteina.

Metode

Proteolitičkom restrikcijom-hidrolizom možemo pročavati različite PTM kao npr. N-terminalnog

signala kraja peptide i 2D gel elektroforezom i masenom spektrometrijom analizom dobijenih peptidnih

fragmenata. Peptidne fragmente možemo podvrgnuti analizi aminokiselinske sekvence putem N ili C-

terminalnim sekvenciranjem (Edmanovom reakcijom) ili masenom spektrometrijom.

Određivanje disulfidnih veza proteinu koje nastaju oksidacijom sulfhidrilne grupe (-SH) koja se nalazi

na AK Cistein. Ove veze značajno doprinose stabilizaciji trodimenzionalne structure kao i biološkoj

aktivnosti ovakvih proteina.Određivanje ovih mostova predstavlja obaveznu karakterizaciju proteina.

Postoje različiti protokoli za određivanje slobodnih cisteinskih ostataka (SH grupa) , najčešće se radi

hidroliza proteina a kasnije određivanje AK sastava peptide.

Mapiranje prisustva cisteina u peptide može se odrediti hemijski hidrolizom proteina uz pomoć amonijum

hodroksida NH4OH na mjestima prisustva SH grupa cisteina. Kasnije se to potvrđuje masenom

spektrometrijom.

Fosforilacija proteina je reverzibilna. Vrši se dodavanjem fosfatne grupe na AK ostatke serina,

treonina,tirozina putem enzima kinaza. Ovom analizom određujemo i funkciju proteina koji igraju vrlo

važnu biološku ulogu u mnogim ćelijskim procesima uključujući signalnu transdukciju, regulaciju

ćelijskog ciklusa, stepena enzimtske aktivnosti. Zato je determinacija fosforilacije vrlo važna za dublje

5

poznavanje regulatornih mehanizama ćelije. Aberantna fosforilacija je prisutna kod mnogih bolesti i zato

predstavlja jedno od ciljnih mjesta za djelovanje terapeutika. Masena spektrometrija predstavlja jako

dobru metodu za određiivanje fosforilacije kao i automatsko hemijsko određivanje AK sekvence peptide

(Edmanovom degradacijom). Naravno prije toga moramo izdvojiti (purificirati) fosfoproteine. U tome

nam može pomoći 2D gel elektroforeza.

Sulfatacija proteina se odvija uz pomoć enzimske aktvinosti sulfotransferaze. Ova modifikacija se

većinom događa na ostacima tirozina pa je zato nazivamo tirozin O-sulfacija. Javlja se kod sekretornih i

transmembranskih proteina za koje se misli da su ključni modulatori u interakcijama proteina te različitim

biološkim procesima uključujući homeostazu,međusobnu komunikaciju limfocita, proces proteolize

proteina i proces sekrecije proteina. Za detreminaciju ove modifikacije koristi se:

radioaktivno obeležavanje proteina sa 35s izotopom

edmanova analiza sa 3 fluor acetnom kiselinom (TFA)

radioaktivno obeležavanje sa 3 H izotopom na mjestu tirozina.

Za mapiranje peptida koristi se HPLC metoda i MALDI –MS za analizu odvojenih peptida ili separacione

metode kao sto su HPLC,SDS PAGE ili TLC-hromatografija pod alkalnim uvjetima.

Glikolizacija je kovalentno vezanje saharida na protein tokom kao i posttranslacijski. To se događa na:

karboksi amino nitrogenu ostatku asparagina-N vezana glikolizacija

ili na hidroksilnom ostatku serina i treonina- O vezana glikolizacija

Oligosaharidi menjaju fizičke karakteristike proteina kao što su steričke i visoko hidrofilne karakteristike.

Glikoproteini mogu postojati u različitim izomernim i razgranatim formama, što im daje kompleksnu

trodimenzionalnu strukturu od čega i zavisi njihova biološka funkcija.Glikolozacija utiče na:

savijanje proteina

njihovu stabilnost

međusobno povezivanje

unutar ćelijsku komunikaciju

imuni odgovor

maskiranje ćelija raka

zarastanje povreda

regulacija upalnih procesa

kao selektivni ligandi.

Ne može se baš tvrditi da se na osnovu vrste glikolizacije može precizno definisati biološka funkcija

proteina. Analiza ove modifikacije zahteva različite protokole za određivanje N ili O-glikolizacije.To se

može raditi direktno pomoću

6

fluorescentnog bojenja ili

specifičnog vezivanja lecitina ili

određivanja masenog spectra nakon peptidne fragmentacije. U tome nam pomažu 2D gel

elektroforeza i selektivno fluorescentno bojenje.

Ovu modifikaciju mozemo detektirati i pomoću analize karboksilnih dodataka tj.karakterizacijom

njihovih monosaharida koju čine karbohidrati

Naravno da moramo izolirati protein, izvršiti odvajanje oligosaharidne komponente kako bi analizirali

njegov sastav. Pri tome nam pomaže hromatografska separacija, detekcija i kvantifikacija. Acidnu analizu

karbohidrata možemo vršiti tri fluor sirćetnom kiselinom (TFA) ili hlorovodoničnom kiselinom (HCl).

Nakon toga analizu monosaharida možemo vršiti jono izmenjivačkom hromatografijom.

N-vezanu glikolizaciju proteina možemo istraživati uz pomoć enzima . Zavisno od tipa ove modifikacije

koja može biti manozni oligosaharid ili complex oligosaharid. Oligosaharidi se vezuju za aspartan uz

pomoć oligosaharid tranferaze koja prepoznaje sekvencu asparaginska kiselina-x, - serin/treonin.

Enzimskom hidrolizom na navedenoj sekvenci možemo dobiti fragmente koje možemo fluorescentno

označiti a razdvojiti sa hromatografijom I okarakterisati direktno masenom spektrometrijom.

O-vezanu glikolizaciju možemo determinisati eliminacijom saharida putem beta hidrolize uz pomoć Na-

hidroksida i Na-hlor hidrata budući da znamo da se saharidne komponente i oblika di i tri saharida dodaju

na hidroksilnim ostacima treonina i serina.

O-glicin N-acetilglukozamin proteinska modifikacija (O-GlcNAc) je modifikacija uključena kod

proteina transkripcije, translacije, nuklearnog transporta i ćelijske signalizacije. Mnogi protein nukleusa

citoskeleta, citoplazme kao i membranski proteini tj.njihovi citoplazmatski ostaci se modificiraju na

hidroksilnim grupama serina I treonina kovalentinim vezanjem β-N acetil proteinskih glukozaminskih

monosaharida. Najpogodnija metoda za detekciju ove PTM je MS,KE I HPLC.

Modifikacija Glikozilfosfatidilinozitolom (GPI) je česta za protein ćelijskih membrane i to spoljašnjeg

sloja, kod epitelnih ćelija, ćelija imunog odgovora. Ove modifikacije imaju i patološki značaj u slučaju

infektivnih bolesti.

Modifikacije masnim kiselinama, brojni eukarioti kao i proteini virusa prolaze kroz kovalentnu

modifikaciju tj.dodavanje masnih kiselina uglavnom enzimatskim putem kako na N tako na C-terminusu

(kraju).

Acetilacija i metilacija su posttranslacijske promene koje se često događaju na proteinima. Metil grupa

se uključuje na atomoma Nitrogena ili Oksigena nukleofilnog dijela lanca mijenjajući hidrofobnost i

naboj proteina. Može se dodavati više metil grupa.

N-metilacija se odvija na ostacima lizina,histidina, arginina, glutamine i asparagine.

O-metilacija se odvija : glutamin i asparagine.

7

Postoji tzv.S-metilacija koja se događa na cisteinu.

Metode za detekciju metiliranih proteina je MS.

Ubikvitacija je kovalentno dodavanje ubikvitin peptide od 76-AK mase 8 kDa na amino grupu

lizina,celularnih proteina. Česta modifikacija koja pomaže prailnu degradaciju putem ubikvitin-

proteozom sistema. Pomaže u regulaciji mnogih ćelijskih procesa kao što je dioba, signalna transdukcija,

diferencijacija (specijalizacija ćelija) i mnogi kontrolni ćelijski mehanizmi.

Abekvantna ubikvitacija je udružena sa mnogim bolestima kao što su neurodegenerativne bolesti,

inflamatorne bolesti i maligniteti. Dobra metoda za detekciju je MS.

Histidin –ubikvitacija se može detektovati Nikl-afinitetnom hromatografijom.

Pored ubikvitina postoji jos 10 sličnih njemu homologa kojima se vrši PTM.

Aminacija i deaminacija nekih eukariotskih proteina, neurotransmitera i faktora rasta se događa na C-

kraju proteina glicina sto utiče na aktivnost ovih proteina a time i na signalnu transdukciju i vezujuće

receptore proteina signalne transdukcije.

Za predikciju tercijalne i kvarterne structure kao i PTM neophodno je koristiti podatke iz adekvatnih

baza, zatim softvere za modifikaciju 3D i 4D proteinske structure uz pomoć odgovarajućih nukleotidnih i

mRNK sekenci. Ovi alati nam pomažu da preciznije okarakterisemo sve nivoe structure proteina i

modifikacija kako bi bolje definisali aktivna mesta proteina I sve njegove dr.karakteristike.

Ova proučavanja su neizostavna u procesu kreiranja proteina za različite terapeutike, dijagnostiku i

dr.upotrebne svrhe.

MONOKLONALNA ANTITIJELA

Su monospecifična, producirana od strane jedne ćelije (klona), za razliku od poliklonalnih antitijela koja

su nastala od nekoliko klonova ćelija. Monoklonalna At su monovalentna, vezuju se samo za isti epitop

(peptid ne vise od 20 AK). Kao takva mogu nam poslužiti za:

Vizuelizaciju

Detekciju

Smanjenje aktivnosti,za izdvajanje specifičnog supstrata iz određenog mixa.

Vrlo su važna za istraživanje za th. i dg.

Razvoj produkcije Mat naglo je počeo od 70-ih. Danas je vrlo raširena metoda. Najraširenija metoda

proizvodnje Mat je HIBRIDOMA TEHNOLOGIJA-koja se zasniva na fuziji mijeloma ćelija sa

određenom klasom B-ćelije koju izdvajamo iz slezene predhodno imunizirane životinje,obično miša ili

kunića koristeći polietilenglikol za uspešnu fuziju membrane ćelija u mešavini. Da bi izvršili selekciju

fuzirane ćelije moramo koristiti selektivni medij (podlogu) za uzgoj hibridnih ćelija.

8

Ćelije mijeloma su izgubile sposobnost produkcije At tokom neoplastične transformacije, a mutirane su

za sintezu guanine zbog mutacija na genu hipoksantin-guanin-fosforibozin transferaze(HG PRT).

Međutim, ćelije imaju alternativni put sinteze purina kojeg blokiramo dodavanjem aminopterina-analoga

folne kiseline koji inhibira dihidrofolat reduktazu (DHFR). Na ovaj način smo mijeloma ćelije blokirali u

njihovom rastu jer ne mogu izvršiti replikaciju DNK molecule hromosoma.

Selektivni medij se naziva HAT medij zato sto sadrži hipoksantin,aminopterin i timidin. Na njemu mogu

rasti fuzirane hibridoma ćelije.Izolirane zdrave ćelije iz slezene domaćina mogu rasti samo ograničeno do

45 dioba pa ugibaju. Mijeloidne ćelije su potrebne da fuziranoj ćeliji daju besmrtnost, a hibridna ćelija od

zdrave ćelije je nasledila mogućnost za produkciju monoklonalnog At. Hibridoma ćelije su sposobne da

na ovakom mediju rastu neograničeno i postanu besmrtne.

Nakon ovoga sledi još jedna selekcija, jer smo iz slezene verovatno pored target ćelije zahvatili i ćelije

drugoga klona pa iz te eventualne mešavine hibridoma ćelija moramo ispitati koja producira željeno Mat.

Za tu svrhu koristimo ELISA ili Ag-mikroset ili imuno-dot-blot.

Imunizacija odabrane životinje domaćina se vrši u toku 2-3 sedmice i u slezeni takve životinje uglavnom

dominira željeni klon B-ćelije.

Nakon toga vršimo skrining prisustva At u serumu životinje i određujemo titar At ELISA tehnikom i

nakon toga pristupamo izdvajanju željenih B-ćelija.

Monoklonalna antitijela se koriste:

Istraživačke, th. i dg. svrhe,

Imunofruoroscencija je neizostavna u dg.različitih oboljena

Fluocitometrija za izdvajanje subpopulacija limfocita, CD3, CD4 (Helpert-T limfociti), CD8

(citotoksicni T limfociti)

Kod izdvajanja At komplementarnih bilo kojih ćelija iz kosšane srži ili periferne krvi. T-ćelije iz

uzorka koštane srži davaoca da bi minimizirali reakciju grafta na organizam domaćina. Možemo

kod davaoca izdvojiti CD3 i CD4 ćelije da bi smo pospješili imunotoleranciju na transplatirani

organ.

Koriste za određivanje krvnih grupa

U dg. CA u slučaju monoklonalne T akutne limfaticne leukemije (ALL) i time je diferencirati od

B-ALL.

Mat nam pomazu u preciznom dostavljanju radioaktivne antiCA-Th.

Za izdvajanje nekog specificnog proteina iz seruma ili dr.bioloskog uzorka npr.afinitetnom

hromatografijom.

MASENA SPEKTROMETRIJA PROTEINA I PEPTIDA

9

Masena spektrometrija predstavlja jedan od osnovnih alata za identifikaciji i karakterizaciju proteina i

peptida. Moguće je izmeriti protein mase od>100kDa sa tačnošću od nekoliko Da i masu peptida od

nekoliko MDa. MS je vrlo specifična, ima visoku osetljivost u rasponu femtomola (10-15mola), pa je

pogodna za analizu tragova iz uzorka.

MS se temelji na osobinama nabijenih čestica koje se kreću pod uticajem električnog i magnetnog

polja, pa su vrste proučavanja joni a ređe molekule. Većina MS eksperimenata se izvodi na

pozitivnim jonima, koji se mogu stvoriti uklanjanjem jednog ili više elektrona iz svake molekule ili

dodavanjem jednog ili više katjona, obično protona. Prema tome prvi korak u svakom mjerenju MS je

transfer molekule u plinsku fazu i jonizirati je, čime smo izmjerili omjer mase i naboja

molecule(m/z).

Većina bioloških uzoraka je smjesa brojnih spojeva, pa njihovi m/z spectri mogu biti vrlo složeni.

Većina peptida i proteina su polarne, involatilne i termički nestabilne, tako da klasične metode

proizvodnje jona osiguravaju malo informacija o molekulskoj strukturi, one najčešće razbijaju

molekulu na male komadiće. Ova situacija se dramatično promenila prije 20 godina razvojem novih

jonizacionih tehnika kao sto su matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), i electrospray

ionization (ESI)-tehnike koje su dobro prilagođene za analizu velikih biomolekula.

MALDI (jonizacija potpomognutu matriksom uz desorpciju laserskim zračenjem )-analit je

pohranjen na ćvrstu podlogu, obično u vakumu zajedno sa znatnim viskom matrice i izloženi su

djelovanjem lasera. Kao matrica se koriste otopine određenih tvari u smjesi vode i organskog otapala.

Analit je otopljen u matrici.Na matricu se djeluje laserom, najčešće dušikovim laserom. Matrica štiti

analit od lasera, služi da apsorbuje energiju od lasera a njezinim isparavanjem i ionizacijom, ona

prenosi dio naboja na analit, ionizirajući ga. MALDI tehnika je pogodna za ionizaciju biomolekula i

velikih organskih molekula.

ESI (jonizaciju elektro raspršenjem )-jonizacija jonizira analit u obliku otopine. Kao otapalo,

obično se koristi nekakva tvar koja je hlapljivija od analita. Otopljeni analit, stvara ione u otopini.

Otopina se propušta kroz kapilaru u prostor pod vakuumom. Kada otopina uđe u evakuiranu komoru,

ona se raspršuje u aerosol, zbog odbijanja iona u otopini. Otapalo isparava s kapljicama, ostavljajući

ione analita. Ova tehnika se koristi za ionizaciju makromolekula, jer se one vrlo lako

fragmentiraju.Za ovu tehniku, dodjeljena je Nobelova nagrada za kemiju za 2002.godinu.

Figure 27.2 Figure 27.3

MASENI SPEKTROMETRI

10

Su uređaji koji razdvaju jone, nastale u jonizatoru po njihovoj masi i/ili naboju. Služe za mjerenje m/z

ili samo mase molecule ako je naboj stanice poznat. Klasične metode koriste magnetski sector

masenog spektrometra, koji daje visoku preciznost ali slabu senzitivnost. Ovi instrumenti su gotovo u

potpunosti zamenjeni novim instrumentima poput time-of-flight (TOF), kvadrupolni, i

jonrezonancija masenim spektrometrima.

Time-of-Flight Mass Spectrometer(TOF) je metoda koja je dobro prilagođena MALDI mjerenju.

Analiza MALDI-TOF metoda je identifikacije proteina dobivenih iz gela koja se temelji na razgradnji

svakog proteina uz pomoć tripsina te njihovoj ionizaciji, nakon čega se dobiveni spektri masa

fragmenata uspoređuju sa spektrima pohranjenim u bazama podataka, te se na taj način ustanovljava

o kojem je proteinu riječ. Kod analize MALDI dobiveni se fragmenti razdvajaju na temelju omjera

mase i naboja (engl. mass-to-charge, m/z).

Quadrupole Mass Spectrometers

Linear Quadrupole Mass Filter-je prilagodjen tehnikama elektrosprej jonizacije. Sastoji seod četiri

valjkste paralelne elektrode. Ioni se propuštaju između četiri elektrode.Na elektrode je priključen

izvor izmjenične struje. Kroz analizator mogu proći samo određeni ioni, a pretraživanje se provodi

mjenjanjem frekvencije napona..

Quadrupole Ion Traps-drugi instrument u mjerenju kvadrupolne masene spektrometrije je 3D -

quadrupole ion traps, koji se sastoji od 3 hiperbolicke elektrode, prstena i 2 kapice koje su simetricne

sa Z osom

.

Figure XX.Kvadrupolni spektrometar

Resonance Instruments

Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR) predstavlja tehniku analize iona po masama.

Uređaj se sastoji od velikog magneta koji proizvodi homogeno magnetsko polje. Unutar magnetskog

polja se nalazi niz elektroda. Ioni koji uđu u komoru spektrometra, gibaju se u kružnim putanjama

unutar komore zbog magnetskog polja. Pomoću dvije elekrode, koje su postavljene okomito na smjer

magnetskog polja, moguće je kontrolirati položaj iona unutar komore. Na druge dvije elektrode,

smještene paralelno magnetskom polju narine se izmjenična struja određene frekvencije. To

11

izmjenično električno polje djeluje na sve ione u komori, uređujući njihove putanje. Nakon završetka

djelovanja izmjeničnim električnim poljem, promatra se prolazak iona pored detektorskih elektroda,

koje su također smeštene paralelno smjeru magnetskog polja. Signal koji se dobiva sa detektorskih

elektroda, sadrži informaciju o svim ionima, bez obzira na njihovu masu. Na taj signal, potrebno je

primjeniti matematičku operaciju - fourierovu transformaciju. Tom operacijom se dobiva se maseni

spektar. Ova metoda je brza i ima veliko razlučivanje, ali je i jako skupa. S obzirom da je u ovakvom

instrumentu moguće manipulirati ionima, moguće je provoditi različita istraživanja na njima.

The Orbitrap-Ionska zamka je mala kutijica s nekoliko elektroda na koje je doveden izmjenični napon

i istosmjerni napon. Ion, koji uđe uzamku oscilira u zamci kompleksnim putanjama, koje se

kontroliraju elektrodama s istosmjernim naponom.Ova metoda je brza i ima nisko razlučivanje.

Masena spektrometrija se najčešće koristi za analizu primarne structure proteina, odnosno

određivanje AK sekvence. Ako odgovorajuća nukleotidna sekvenca postoji u jednoj od baza

podataka, osnovni problem je identifikacija ispitivanog proteina. To mogu biti promjene koje nisu

definirane bazom podataka kao npr.mutacije u drugom uzorku, posttranslacijske modifikacije, ali

barem je osnovna struktura proteina definisana.

Međutim, ako nukleotidna sekvenca nije pohranjena u bazi podataka, potrebno je“de novo”

sekvenciranje, koje je puno teže.Standardna metoda analize proteina (sekvenciranje bottom-up), prvo

razbija molekule djelovanjem enzima, obično tripsina, koji cijepaaminokiselinski lanac na C-

terminalnom kraju arginina ili lizina. Fragmenti dobiveni ovim digestijom tada se ispituju u

masenom spektrometru. Ako se ne uspije idendificirati protein onda je neophodno razbiti enzimatski

fragment obično sa molekulama plina pa se mjere mase proizvedenih jona pomoću MS/MS mjerenja.

Ovaj proces se vrši TANDEM masenim spektrometrom. Ovi spektrometri su evoluirali kako bi se

dobilo više informacija od ukupne vrednosti mase koje pružaju obični spektrometri. Mjerenja se

obično provode u 2 analizatora u nizu, prvi analizator odabire precursor jon ,dok ce proizvod jon

mjere u drugom analizatoru. Neki instrumenti omogucuju mjerenje u jednom instrument kao npr 3D

ion trap.Tandem spektrometri su “trostruki kvadropolni” maseni spektrometri, The Quadrupole–

Time-of-Flight Mass Spectrometer i drugi.

Masena spektrometrija se koristi za:

određivanje sastava nepoznatog uzorka (kvalitativna analiza)

određivanje izotopskog sastava uzorka

određivanje strukture molekula na bazi njihove fragmentacije

određivanje molarne mase molekule

12

određivanje količine određene materije u uzorku (kvantitativna analiza)

određivanje fizičkih i hemijskih svojstava materije

proučavanje ponašanja jona u vakuumu

MS se upotrebljava u proteomici, prehrambenoj industriji, farmaceutskoj industriji, u th.praćenju

koncentracije lijeka (TDM), istraživačkim ustanovama, u kliničkim laboratorijima itd.

PROTOCNA CITOMETRIJA

Jedan od temelja protočne citometrije je sposobnost za mjerenje svojstava pojedinih čestica. Protočni

citometar se sastoji od 3 međusobno povezana sustava: protočnog,optičkog i elektronskog.

Protočni sustav čine pokretačka tekućina, koja je nosač stanične suspenzije, stanična suspenzija i zračni

potisak. Protočni sustav omogućuje da stanice iz stanične suspenzije pojedinačno laminarnom protokom

kroz sustav uske kapilare dolaze do snopa laserskog svjetla koje s lećama, filtrima i osjetnicima čine

optički sustav. Stanice se obasjavaju laserskim svjetlom, a stupanj raspršenja svjetlosti iste valne duljine

pokazatelj je fizičkih osobina stanica

veličine (svjetlost koja se raspršila pod malim kutom od 0,5-10°,FSC - prema engl.forward scatter) i

zrnatosti;granuliranosti(svjetlost raspršena pod pravim kutom - SSC, prema engl. side scatter).

Oba FSC i SSC su jedinstveni za svaku česticu, te kombinacijom se mogu upotrijebiti za razlikovanje

različitih tipova stanica u heterogenom uzorku. Dodatno obilježavanje stanica slobodnim ili (ponajčešće)

za monoklonska protutijela vezanim fluorescentnim bojama(fluorokromima) rabi se za dodatno

obilježavanje specifičnih staničnih struktura .Fluorokromi obasjani laserskom svjetlošću emitiraju

svjetlost veće valne duljine od ulazne svjetlosti, a hvataju je specifični osjetnici (detektori) protočnog

citometra. Detektori su ili silikonske fotodiode ili fotomultiplikacijske cijevi (PMTs). Silikonske

fotodiode se obično koristi za mjerenje FSC kada je signal jak. Specifičnost detekcije je kontrola

optičkim filterima koji blokiraju određene valne duljine a propuštaju druge. Postoje tri vrste filtera: long

pass, short pass i band pass:

Fugure 2: Različite vrste optičkih filtera

13

Svi filteri blokiraju svetlo absorbcijom.. Sve svjetlosne signale elektronski sustav pretvara u digitalne

signale koji se prenose u elektroničko računalo i služe za analizu. Brzina protoka sortiranja ovisi o

nekoliko faktora, uključujući veličinu čestica i brzine stvaranja kapljica.Tipična mlaznica je između

50-70 JM u promjeru i može proizvesti 30,000-100,000 kapljica u sekundi, što je idealno za precizno

sortiranje.

Za definiciju staničnih populacija najčešće se koristi citogram veličine i zrnatosti stanica

(FSC×SSC)na kojem se postavlja regija(R) analize oko ciljnih stanica iz kojihće se analizirati

specifični fluorescentnisignali. Upravo je to jedna od najvećih prednosti moderne protočne

citometrije, budući da stanice prije analize nije potrebno prethodno fizički razdvojiti. Od ostalih

prednosti valja izdvojiti veliku brzinu mjerenja signala (>103 stanica u sekundi) te istodobno

mjerenje više parametara (fizičkih parametara i fluorescentnih signala),pa se na modernim

citometrima istodobno može analizirati i do desetak parametara .

Figure3. Shematski prikaz tipičnog protočnog citometra

Premda je do danas razvijen velik broj protočno citometrijskih testova za analizu različitih staničnih

obilježja i/ili funkcija, ona se još uvijek ponajviše rabi u cilju imunofenotipizacije, tj.obilježavanjes

pecifičnih staničnih biljega.Od imunofenotipskih analiza posebnose izdvaja analiza limfocita

periferne krvi u cilju ocjene imunološkog statusa, imunofenotipizacija leukemija i limfomai praćenje

ostatnih malignih stanica(minimalne rezidualne bolesti), mjerenje broja CD34+ krvotvornih matičnih

stanica u perifernoj krvi i leukocitno koncentrat za potrebe transplantacije krvotvornih matičnih

stanica, dijagnostika paroksizmalne noćne hemoglobinurije(PNH) i mjerenje sadržaja stanične DNA

u cilju otkrivanja aneuploidija (najčešćeu leukemijama) i proliferacijske aktivnosti stanica (za

funkcijske testove limfocitaili procjenu proliferacije tumorskih stanica). Funkcijski testovi leukocita

14

najčešće se rabe za mjerenje aktivacije i proliferacije limfocita, kao i za analizu funkcije granulocita

(fagocitoze i respiracijskog praska).

Protočna citometrija se koristi za brojanje stanica, sortiranje stanica, detekciju biomarkera. Korsti se u

detekciji različitih bolesti naročito leukemija, ali ima brojne druge primjene u temeljnim

istraživanjima, kliničkoj praksi i kliničkim ispitivanjima.

15