Embed Size (px)
Citation preview
PROTEOMIKA 2015/2016
Pondělí 14/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
Aktuální koncentrace proteinu
Translace
Degradace
Ribosome profiling (Ribosome footpriniting)
Které mRNA se aktuálně aktivně translatují?
Princip:
mRNA aktuálně translatovaná v
ribozomu a jím chráněná (cca 30 bazí)
může být izolována s použitím
nuklázy, která rozštěpí nechráněné
úseky. Následně je fragment reverzně
transkribován, amplifikován a
sekvenován
Jaké jsou starty translace?
Místo cykloheximidu lze použít
harringtonin – inhibitor počáteční
fáze translace. Ribozomy jsou
zastaveny za iniciačním kodonem.
Aktuální koncentrace proteinu
Translace
Degradace
SILAC
Pulsed SILAC
Pulse-chase SILAC
Pulse-chase SILAC
SILAC – Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture
LIGHT
běžné AA
HEAVY
1-2 AA značené
stabilním izotopem
• smíchání
• subcell. frakcionace
• separace
• štěpení trypsinem
• LC-MS/MS
13C-lysine13C-arginine
MW
Kvantifikace MS
Identifikace MS/MS
Bezsérové systémy
nebo dializované
sérum !
Naznačení různě těžkými aminokyselinami po kratší dobu, než
nezbytnou k úplnému proznačení, umožňuje studovat rychlost
translace jednotlivých proteinů mezi dvěma a více vzorky
pulsed-SILAC (pSILAC)
Schwanhausser et al. Proteomics 2009, 9, 205-209
LIGHT
Lys-0, Arg-0
MEDIUM
Lys-4, Arg-6HEAVY
Lys-8, Arg-10
pulse-chase SILAC (pcSILAC)
Metoda umožňující studovat změnu translace i degradace po nějakém zásahu
Buňky jsou nejdříve kompletně naznačeny „těžkým“ R a následně přeneseny
do média s „těžkým“ K.
Používáme však pro 2 různé „těžké“ topoizomery R i K.
Úbytek peptidů s těžkým R
Příbytek peptidů s těžkým K
degradace
translace
Fierro-Monti I, et al. PLoS One. 2013 Nov 27;8(11):e80423.
Peptidy s Arg Peptidy s Lys
Vše kompletně naznačeno
R6 nebo R10
Značeno K4 nebo K8
Ubývá značeného R
(degradace)
Přibývá značeného K
(translace)
Peptidy s Arg Peptidy s Lys
Ubývá značeného R
(degradace)
Přibývá značeného K
(translace)
Vše kompletně naznačeno
R6 nebo R10
Proveden zkoumaný zásah a
přeneseno do nového média
S K4 nebo K8
Peptidy s Arg Peptidy s Lys
Vše kompletně naznačeno
R6 nebo R10
Proveden zkoumaný zásah a
přeneseno do nového média
S K4 nebo K8
V čase ubývá značeného R
(degradace)
Přibývá značeného K
(translace)
Peptidy s Arg Peptidy s Lys
Vše kompletně naznačeno
R6 nebo R10
Proveden zkoumaný zásah a
přeneseno do nového média
S K4 nebo K8
V čase ubývá značeného R
(degradace)
Přibývá značeného K
(translace)
• Využití vzorku značeného SILAC jako srovnávacího standardu (Super-SILAC)
• Stanovení intracelulární lokalizace proteinů (LOPIT)
Další netradiční využití metod založených na inkorporaci stabilních izoptopů
Expresní proteomika
pacientských nádorových
vzorků. Jako kontrolní
standard slouží
homogenát ze směsi
buněčných linií
odvozených ze stejného
typu nádoru naznačených
metabolicky„heavy“ Arg
a/nebo Lys.
IP or other
analyses
SUPER-SILAC
Geiger et al. Nat Methods 2010, 7, 383-385
Metody studia subcelulární lokalizace proteinů
1) Na základě signálních sekvencí a struktury
2) Mikroskopie a imunohistochemie
3) Proteomická analýza jednotlivých izolovaných organel
4) LOPIT - Localization of organelle proteins by isotope tagging
Proteins in four gradient fractions
corresponding to the peaks of organelle
distributions are digested with trypsin and
the resulting peptides are derivatized with
different iTRAQ reagents. Samples are
next pooled and analyzed by LC-MS.
Proteins derived from the same
membrane have similar quantitation
profiles, as they co-fractionate in the
density gradient.
Sadowski PG, et al . Nat Protoc. 2006;1(4):1778-89.
ER
PM
Mito/chloro
Golgi
Vacuolar membrane
Filled - known
Open - predicted
PROTEOMIKA 2015/2016
Pondělí 14/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
KLINICKÁ PROTEOMIKA, PLAZMA A SÉRUM
Co je to biomarker ?
Protein nebo peptid vykazující reprodukovatelné rozdíly
v expresi či struktuře
specifické pro dané onemocnění.
Nejlépe ve snadno dostupné tkání či tělní tekutině.
Krevní plazma a sérum
• Dosud spolehlivě identifikováno zhruba 3500 bílkovin
• Extrémní rozdíly v koncentracích (10 řádů)
Albumin 40 000 000 000 pg/ml
Interleukin 6 5 pg/ml
Krevní plazma a sérum
• Dosud spolehlivě identifikováno zhruba 3500 bílkovin
• Extrémní rozdíly v koncentracích (10 řádů)
Albumin 40 000 000 000 pg/ml
Interleukin 6 5 pg/ml
• 10 hlavních proteinů představuje cca 90% bílkoviny
(Albumin, IgG, IgA, Tf, alpha-2 makroglobulin, haptoglobin…)
• 22 majoritních proteinů představuje více než 99 % bílkoviny
• složení séra se mění (nejen) při chorobných stavech
albumin
IgG HC
IgG LC
Tf
haptoglobin
IgA
a1-
antitrypsin
a2-macroglobulin
Apo A1
fibrinogen
haptoglobin
Deplece majoritních proteinů a chromatografické přístupy !!!
• Imunodeplece nejkoncentrovanějších proteinů
„Top6“ „Top10“„Top12“ „Top14“„Top20“
(albumin, transferrin, haptoglobin,antitrypsin, IgG, IgA….)
Protilátky + Cibacron Blue (albumin)+ Protein A, protein G (IgG, IgA)
• „Ekvalizace“
knihovna náhodných hexapeptidů sloužících jako ligandy
„ProteoMiner“
Při depleci jsou odstraňovány asociované proteiny a peptidy!
Cena!
Nízká reproducibilita!
Afinitní mechanismy deplece majoritních proteinů
Knihovna náhodných hexapeptidů sloužících jako ligandy
„ProteoMiner“
běžná identifikace 500-1500 proteinů
Kvantifikace iTRAQ, TMT, štěpění v 018, label free
Sérum
Plasma
CSF
Odstranění majoritních
proteinů
(plus analýza depletovaných?)
(Frakcionace)
LC-MS
Rýžování zlata nebo přebírání odpadků ?
Dosud identifikované „biomarkery“ jsou
Relativně hojné sérové bílkoviny nebo
jejich fragmenty !
Fibrinopeptid A
Transferin
C3a, C3f,C4
fibrinogen
haptoglobin
alpha 1-antitrypsin
transthyretin
serum amyloid A
Hb alpha, beta
apolipoprotein A-I, A-II…apod.
….až na vzácné výjimky
Jaký protein má potenciál nádorového markeru ?
•Fragmenty bílkovin pocházející přímo z nádoru nebo okolní tkáně
(navázané na nosič ?)
•Fragmenty vzniklé štěpením sérových proteinů nádorovými proteázami
(navázané na nosič ? Nebo vzniklé ex-vivo ?)
• Proteiny odrážející systémovou odpověď na nádor (protilátky…)
• další?
• renální filtrace versus nosiče
• vhodná negativní kontrola, výběr skupiny
•odběr a zpracování vzorků, plastik
• ???
Další proměnné
PROTEOMIKA 2015/2016
Pondělí 14/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
MALDI IMAGING
MALDI IMAGING
Grey matter
Granule cells
White matter
70 μm resolution
70 µm Image of Rat Cerebellum
MALDI Imaging of Breast Cancer
Lymphocyte infiltration
1mm
Carcinoma in situ
1mm
MALDI Imaging of Breast Cancer
Invasive Tumor
1mm
MALDI Imaging of Breast Cancer
Clozapine Drug Imaging
MH+ 327.137 Th
MS/MS 192 Th.
Binds to cortical D1-like dopamin receptors
Clozapine Dosed Rat Brain (100 mg/kg)
MS/MS
100 mg/kg
control
PROTEOMIKA 2014-2015
Pondělí 15/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
• Protilátky
• Rekombinantní (izolované) proteiny
• Proteiny syntetizované in situ
Možnosti studia exprese
(přítomnosti), fosforylací
a interakcí protein-protein nebo
protein ligand
Proteinové čipy - Protein arrays
forward arrays reverse arraysZakotvená
protilátka nebo
specifický
protein
Zakotvený
komplexní analyt.
(lyzát, sérum a pod)
Anti-GST ImageHuman IgG
MAPKAP
BSA
Buffer PKCeta
GST Gradient
Alexa a-
Mouse Ab
Alexa a-
Mouse Ab
Calmodulin
a-Human IgG
Empty PKCeta
Alexa a-
Mouse Ab
a-Biotin Ab
Biotin Ab V5-CamK
CamK
AutoAntigens
Human IgGHuman IgG
MAPKAPMAPKAP
BSA
Buffer PKCeta
GST GradientGST Gradient
Alexa a-
Mouse Ab
Alexa a-
Mouse Ab
Alexa a-
Mouse Ab
Alexa a-
Mouse Ab
CalmodulinCalmodulin
a-Human IgGa-Human IgG
EmptyEmpty PKCetaPKCeta
Alexa a-
Mouse Ab
a-Biotin Aba-Biotin Ab
Biotin AbBiotin Ab V5-CamKV5-CamK
CamKCamK
AutoAntigensAutoAntigens
• ~9,000 human proteins available on a single array
• All clones fully sequenced
• Baculovirus Expression System
• GST tagged
• Expressed in Sf9 insect cells
ProtoArray™ Human Protein Microarray v5.0
Screen:
• interactions
• antibodies
• kinase substrates
Hledání antigenů v séru
PISA ARRAY
Protein In Situ Array
Imobilizace: (His)6-Ni2+
DNA není zakotvená
NAPPA ARRAY
Nucleic Acid Programmable
Protein Array
DNA je imobilizovaná
PROTEOMIKA 2014-2015
Pondělí 15/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
Protein arrays Cílené metody (aqua, MRM/SRM)
Protein arrays Cílené metody (aqua, MRM/SRM)
Protein arrays Cílené metody (aqua, MRM/SRM)
TOP-DOWN
Kellie et al. Mol.Biosyst 6(9):1532-9.
TOP-DOWN přístup – identifikace intaktních proteinů/proteoforem
Kellie et al. Mol.Biosyst 6(9):1532-9.
Tran et al Nature 2011, 480, 254-258
Mapping intact protein isoforms in discovery mode
using top-down proteomics
(GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis
TOP-DOWN identifikace
cca 1000 proteinů/3000 proteoforem
Tran et al Anal. Chem. 2008, 80, 1568-1573
(GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis
Tran et al Nature 2011, 480, 254-258
Mapping intact protein isoforms in discovery modeusing top-down proteomics
(GELFrEE) - gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis
TOP-DOWN identifikace
cca 1000 proteinů/3000 proteoforem
1996 2004 2015
iCAT iTRAQSILAC Label free
MRM/SRM
2-DE
Shot-gun
?
Závody v počtu
ID
nebo detailní
analýza všech
proteoforem?
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014
Maximální počet bílkovin identifkovaných MS v jediném experimentu
PROTEOMIKA 2014-2015
Pondělí 15/12
Zvláštní aplikace
izotopových metod
Klinická proteomika
MALDI imaging
Protein arrays
TOP-DOWN
???
3 8 36 62154
374
747
1231
1656
2581
3027
3584
3909
46094748
5130
5567
5886 5887
6547
Počet publikací s proteomickou tématikou (Entrez/PubMed)
PUBLISH OR PERISH…
Molecular and Cellular Proteomics (IF 6.6)
Journal of Proteome Research (IF 4.2)
Journal of Proteomics (IF 3.9)
Proteomics (IF 3.8 )
Expert Reviews of Proteomics (IF 2.9)
Protomics – Clinical Applications (IF 2.9)
BBA – Proteins and proteomics (IF 2.7)
Proteome Science (IF 1.7)
IF 2014
HUPO – HUman Proteome Organization
EuPa – European Proteomic Association
Proteomická sekce ČSBMB (www.czproteo.cz)
http://patofyziologie.lf1.cuni.cz/proteome
PROTEOMICKÁ LABORATOŘ
Ústav patologické fyziologie 1. LF UK
Prezentace z přednášek budou ke stažení na adrese:
http://patf.lf1.cuni.cz/proteomika
včetne pdf souborů s doporučenou literaturou
ZKOUŠKA
……
Podmínkou připuštění ke zkoušce je vypracování eseje na zadané téma
a odevzdaní eseje ([email protected]) nejpozději 2 dny před zkouškou.
Téma obdržíte po přihlášení na zkoušku.
Zkouška probíhá na Ústavu patologické fyziologie 1. LF UK,
U Nemocnice 5, Praha 2.
(po schodišti nahoru a doprava za roh)
PRAKTIKA Z PROTEOMIKY - max. 12. zájemců, duben nebo květen
Předpokládané termíny po 10/1/2015 a dále dle potřeby
