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Western Blottingに よ る ム ン プ ス ウ イ ル ス抗 体 検 出 法 の確 立

東京医科大学小児科学教室

〔 指導:東 京医科大学小児科学教室 本多輝男教授

北里研究所ウイルス部 牧野 慧部長〕

村 山 是

(平成2年10月4日 受付)

(平成2年12月20日 受理)

key words : mumps virus Western Blotting, ELISA antibody,

live mumps vaccine

要 旨

Vero細 胞 を用 い増殖 させ た ム ンプス ウイル スを庶 糖 密度 勾 配超 遠 心法 に よ り精 製 しウ イル ス抗原 と

して用 い,Western Blotting(以 下WBと 略す)に よる抗体 検 出法 を確立 し,従 来 のELISA法 との比

較検 討 を行 った.WBに よれば,生 ワクチ ン接 種後ELISA抗 体 の出現 時期 に一 致 してHemagglutinin-

neuraminidase (HN)蛋 白に対 す る抗体 が2週 後 よ り検 出 され,5週 後 に はHN, Fusion (F), Large

(L)蛋 白に対す る抗 体 も検 出 された.生 ワクチ ン接 種後 ムン プスELISA抗 体陽 性血 清 は,WB法 で も抗

体 が検 出 され,ELISA抗 体非 陽 性転 倒 中,呼 光度(optical density, OD) 0.100以 下 を示 した6例 の血

清 は,WB法 で も全 例陰 性 で あ り,0.101～0.130のcut off値 付 近 のELSIA抗 体陰 性3例 中2例 はWB

法 で抗体 が検 出 され た.以 上 の事実 よ りWB法 はELISA法 に勝 る感度 を もった 方法 と考 え られ る.

序 文

流行性耳下腺炎(以 下 ムンプスと略す.)は,小

児によく見 られる感染症の一つである.わ が国で

は晩冬か ら春にかけて多発 し,時 時に流行の型を

とる.本 症は,耳 下腺炎を示す病型が最 も多いが,

時に髄膜炎 ・睾丸炎 ・卵巣炎 ・難聴等の合併症が

見 られ,軽 視 しがたい感染症である.わ が国では,

昭和56年 よ り本症の予防に生 ワクチンが一般に使

用 されるよ うになった.ム ンプス生 ワクチンのウ

イルス中和抗体陽転率 とその平均抗体価は,麻 疹

並びに風疹 と比較してやや劣ることが一般に知 ら

れている.そ こで,よ り感度の高い抗体検索法の

開発が要望され,酵 素免疫吸着法enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA)が 広 く利用され

るに至 った.こ の方法は鋭敏であり検査に要する

時間 も短いため生 ワクチン接種後の効果判定に利

用 されている.反 面,発 育鶏卵培養により作製 し

たELISA抗 原 中に含 まれ るovomacroglobulin

に対する非特異反応が問題にな り1),血 清を対照

抗原で吸収することによ り,特 異性の高いムンプ

スELISA抗 体測定法が牧野 らによって改良され

た2).ELISAに よる検査成績は吸光度で示される

ため,使 用するプレー トや検査 日時,検 査室内の

照度等に より結果にば らつ きが生 じることがあ

り,そ の術式 と判定法に細心の注意が必要 とされ

ている.ま た,現 行のELISAは,ム ンプスウイル

ス粒子の各蛋白抗原に対す る抗体の総和を検出す

る方法である.

ムンプス生 ワクチン接種後EHSA抗 体非陽転

例の中にも細胞性免疫能が検出され ると中山らは

報告 し3),よ り感受性の高い抗体測定法で行 えば,

ムンプス生 ワクチンの免疫賦与効果は必ず しも低

いものではないと考えられ る.

McCarthyら はムンプスウイルスの抗原解析を

行い,ウ イルス蛋 白中に6種 類の Majorprotein

が存在す ることを明らかにした4).更 にこれ ら蛋別刷請求先(〒160)新 宿区西新宿6-7-1

東京医科大学病院小児科 村山 是

感染症学雑誌 第65巻 第3号

ウエ ス タ ン ブ ロ ッ トに よ るム ン フ.ス抗 体 検 出 337

白の 抗 原 性 は,ム ン プ ス ウ イ ル ス 野 生 株 と ワ ク チ

ン株 で共 通 性 が あ る こ とが 明 か と な った5)～9).そ

こで 著 者 は,今 回WB法 を 用 い て ム ン プ ス粒 子 構

成 蛋 白抗 原 に 対 す る抗 体 検 出法 の確 立 を 試 み た.

ま た ム ン プ ス 星 野 株 生 ワ ク チ ン接 種 後 の ム ン プス

ELISA抗 体 価 とWB法 に よ る ム ン プ ス ウ イ ル ス

粒 子 の 各major proteinに 対 す る各 抗 体 の産 生 状

態 を 比 較 検 討 した の で,そ の 成 績 を こ こ に報 告 す

る.

材 料 及 び方 法

1) 対 象

ム ン プ ス生 ワ クチ ン を含 む2種 類 の麻 疹,ム ン

プ ス,風 疹3混 生 ワ ク チ ン(占 部 株 ム ン プ ス生 ワ

ク チ ンを 含 む 統 一 株MMR. Lot 01,及 び 星 野 株 ム

ン プ ス 生 ワ ク チ ンを 含 む 北 里 研 究 所 独 自株 MPR,

Lot TV-110),以 下MMR, MPRと そ れ ぞ れ 略 す)

被 接 種 児 よ り得 られ た 血 清 を対 象 と し,ワ ク チ ン

接 種 前 並 び に 原 則 と して 接 種6週 後 の血 清,ム ン

プ ス 自然 感 染 児2名 の 発 症 直 後 並 び に 回復 期 血 清

を-20℃ に 保 存 し,本 研 究 に用 い た.

2) ム ン プ ス抗 原

北 里 研 究 所 に 保 管 して あ る ム ン プ ス ウ イ ル ス 笹

崎 株(野 性 株)のVero細 胞 継 代 ウ イル ス を種 ウ イ

ル ス と した.な お 種 ウイ ル ス は継 代 を 重 ね る こ と

に よ る変 異 を 防 ぐた め4代Vero細 胞 で継 代 した

もの を 使 用 した.こ の ウ イ ル ス を さ らに Vero細

胞 で 増 殖 させ て 抗 原 作 製 用 材 料 と した.初 期 培 養

液 に はEagle's MEM液 に2%仔 牛 血 清 を 加 え た

が ウ イル ス接 種 後2日 異 種 蛋 白で あ る仔 牛 血 清 を

除 去 す る 目的 で,感 染 細 胞 をHanks液 で2回 洗

浄 し こ の後 血 清 を 含 ま な い培 養 液 と交 換 し て37℃

で培 養 を 続 け た.ム ン プ ス ウ イル ス の細 胞 変 性 効

果 が50%以 上 認 め られ た と こ ろ(接 種 後3日)で

4℃ 一 晩 放 置 し,翌 日組 織 培 養 瓶 を振 と うし感 染

細 胞 を 剥 離 した.ム ン プ ス ウ イ ル ス 感 染Vero細

胞 浮 遊 液 を3,000rpm, 6,000rpmで そ れ ぞ れ20分

間 遠 心 し(日 立automatic refrigerated

centrefuge 9～20ロ ー タ ー)細 胞 成 分 を 除 去 し た

後,上 清 を更 に17,000rpmで90分 間遠 心 して(同

20～2ロ ー タ ー)ウ イル ス ペ レ ッ トを作 成 した.

こ の ペ レ ッ トが 浸 る く ら い の 量 のTNE buffer

(0.01M-tris-HCl, 0.1M-NaCl, 0.001M- MDTA

pH7.2)を 加 えて4℃ に 一 晩 放 置 した 後,こ れ を

50～30%の 不 連 続 庶 糖 密 度 勾 配 の 上 に 重 層 し,

30,000rpm90分 間 超 遠 心 を 行 っ た (Beckman

ultracentrifuge L8-55SW41 ロー タ ー).超 遠 心 終

了後,庶 糖 密 度 勾 配 中 に 認 め られ た ウ イル ス バ ン

ドを 採 取 し て,Mg,Caを 含 ま な い燐 酸 緩 衝 食 塩

水(pH 7.2PBS (-))中 で24時 時 間 透 析 を行 っ

た 後,ポ リエ チ レ ン グ リコ ール(分 子 量6,000)を

用 い て濃 縮 し,冷 凍 保 存 を 行 つた.繰 り返 し作 製

し た抗 原 を 一 度 解 凍 した 後,.混 和 して成 分 を 均 一

に した 上,50μlず つ 分 注 し再 び-20℃ で 冷 凍 保 存

を 行 った.精 製 抗 原 を 混 和 し た 後 のHA力 価 は

25で あ った.ま た 含 有 蛋 白濃 度 はLoury法 に よ

り1.5μg/mlで あ った.ワ ク チ ン株 と し て 星 野 株

を 用 い,同 様 に 抗 原 を 作 製 し た.ELISA抗 原 は

Enders株 を 用 い 艀 化 鶏 卵 培 養 法 に よ り製 作 し

た2).

<電 気 泳 動 及 びWestern Blotting>

実 験 の 手 順 は 以 下 の 方 法 で 行 った.WB法 は

Dubeyら11), McVoyら12)の 方 法 に 準 じた.

1)1レ ー ン に 付 き5μlの 精 製 ム ン プ ス 抗 原 を

精 製 滅 菌 水 で4培 に 希 釈 し,同 量 の sample

buffer (0.125mM-tris(HCl), 0.16M-SDS, 0.001

M-ETA, 10% 2-mercapto ethanol, 20% glycerol)

と混 和 後100℃10分 間 加 熱 し蛋 白成 分 を 分解 した.

こ の 後 氷 水 中 で 急 速 冷 却 を 行 い12,000rpmで 20

秒 間 遠 心 し試 料 と した.

2) マ リ ソル 社 ス ラ ブ 用 電 気 泳 動 槽 を 用 い,

3%,10%ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル板 を 作 製 し,

12レ ー ン のcombを 装 着 した 後 泳 動 槽 に セ ッ トし

た.running buffer (0.025M-tris, 0.19M-glycerol,

0.0035M-SDS)を 満 た した 後,作 製 した試 料 を 40

μlず つ ゲ ル 板 の 各 レー ン に 注 入 し3%ゲ ル を75

V,10%ゲ ル を200Vの 定 電 圧 で 電 気 泳 動 を 行 っ

た.

3) 泳 動 終 了 後 不 要 な ゲル を 切 り捨 て, transfer

buffer (running buffer: Methanol= 4:1)の 中

に 浸 し ニ ト ロ セ ル ロ ー ス シ ー ト(Schlich &

Schuell社BA85以 下 シ ー トと略 す)を 密 着 させ,

両 側 を濾 紙 で 挟 み マ リ ソ ル 社transfer用 泳 動 槽

平成3年3月20日

338 村山 是

に セ ッ トした.こ の 後200mAの 定 電 流 で90分 間

transferを 行 った.

4) <ABC感 染>

(a) transfer終 了 後 シ ー トを 取 り出 し0.05%

Tween 20-PBS(-)(以 下 洗 浄 液 と記 述 す る)で

20分 間 洗 浄 した.

(b) 2%ヤ ギ血 清10ml中 に シ ー トを浸 し,攪 拌

器 で40分 盥 絆 した(post coating).

(c) シ ー トを レー ン ご と に切 り出 し,そ れ ぞ れ

PBS(-)で300倍 に希 釈 した 被 検 血 清(1次 抗 体)

10ml中 に 浸 し30分 間 反 応 させ た.反 応 終 了後 洗 浄

液 で30分 間 洗 浄 した,1次 抗 体 の 希 釈 は,ガ ラ ス

容 器 に 抗 体 が 吸 着 す る の を 防 ぐた め に0.1%結 晶

ウ シ血 清 アル ブ ミン(BSA)を 含 む(PBS (-)

で 行 っ た.

(d) ビ オ チ ン 化 ア フ ィニ テ ィ精 製 抗 ヒ ト免 疫

グ ロブ リンIgG(Fab) (Vectastein社 PK3000)

を50倍 に希 釈 し,1mlず つ 分注 した もの を-20℃

で 保 存 した.こ れ を 使 用 直 前 に 解 凍 し,PBS (-)

で10倍 に希 釈 し こ の 中 に シ ー トを浸 し30分 間 反 応

させ た.終 了 後 洗 浄 液 で30分 間 洗 浄 した.

(e) ABC試 薬(Vectastein社PK4000) A液(ア

ビヂ ンDH),B液(ビ オ チ ン化 ワサ ビペ ル オ キ シ

ダ ーゼ)を そ れ ぞ れ2滴 ず つPBS(-)10ml中 に

滴 下 し混 和 した 後,シ ー トを 浸 し30分 間 反 応 さ せ

免 疫 複 合 体 を形 成 させ た.終 了 後 洗 浄 液 で30分 間

洗 浄 した.

(f) ペル オ キ シ ダ ー ゼ 基 質 溶 液

(Diaminobenzidin Tetrahydrochloride 1mg +

30% H2O2 0.7μl/ml PBS(-))中 に シ ー トを 浸

し シ ー ト表 面 に パ ン ドの描 出 が 認 め られ る ま で2

～3分 間 染 色 を 行 った.こ の 後 流 水 中 で5分 間洗

浄 した.

<ム ン プ スELISA抗 体 価 測 定 法>

被 検 血 清 の ム ン プ スELISA抗 体 価 検 出 に は,

北 里研 究 所 法 を 用 い た2).

結 果

1) ム ン プ ス ウ イ ル ス株 間 に お け る構 成 蛋 白

ム ン プ ス ウイ ル ス構 成 蛋 白に つ い て野 性 株 と し

て笹 崎 株,ワ ク チ ン株 と して 星 野 株,及 びELISA

抗 原 と して 使 用 し て い るEnders株 に つ い て そ れ

ぞ れSDS-ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 を

行 った 後,銀 染 色 とWB法 に よ る解 析 を 行 い結 果

をFig.1に 示 し た.3株 間 で,Hemagglutinin

neuraminidase (HN:75K), Nucleocapsid pro-

tein (NP:69K), Fusion protein (F:62K),

Polymerase (P:45K), Membrane protein (M:

42K)のmajor proteinに は差 が な く,漿 尿 膜 腔 継

Fig. 1 Silver staining and Western Blotting of three strains of mumps virus. the

Sasazaki strain, the Hosino strain, and the Enders strain.

Silver staining ; lane 1: high molecular marker, lane 2 ; low molecular marker,

lane 3: the Sasazaki strain, lane 4: the Hoshino strain, lane 5: the Enders

strain. Immunoblotting : ELISA (+) means positive serum in ELISA and

ELISA (-) means negative serum in ELISA.

immunoblotting immunoblotting immunoblotting

1 2 3 4 5

感染症学雑誌 第65巻 第3号

ウ エス タ ン ブ ロ ッ トに よ るム ン プス抗 体 検 出 339

Fig. 2 Western Blotting of mumps virus, using different serum dilutions and

different protein concentration of mumps virus antigen.

ELISA

Serum

Dilution

Antigen

代 のEnders株 で はLarge protein (L:200K) の

バ ン ドは検 出 され な か った .

2) 1次 血 清 濃 度 の 決 定

非 特 異 反 応 を 抑 制 す るた め に ヤ ギ血 清 を 用 い

POstcoatingを 行 っ た が,次 の段 階 で 使 用 す る被

検 血 清(1次 抗 体)は ポ リク ロー ナ ル 抗 体 で あ る

た め 非 特 異 因 子 の 除去 は 困 難 を極 め る.抗 原 量 が

十 分 に存 在 す る場 合1次 血 清 の濃 度 が 高 い ほ ど抗

原 抗 体 反 応 が 強 く起 こ りシ ー ト上 に 現 れ る パ ン ド

も明 瞭 に な る と考 え られ るが,非 特 異 反 応 に よ る

バ ン ド検 出 の 可 能 性 も 高 くな る.major protein

に 対 す る抗 体 が 検 出可 能 で あ り,し か もそ れ 以 外

の バ ン ド描 出 が 最 小 限 に抑 え られ る1次 血 清 の濃

度 を 明 らか に す るべ く検 討 を 行 い,結 果 をFig.2

に 示 した.実 験 に用 い た血 清 は,ム ン プ ス ワク チ

ン接 種 前 でELISA抗 抗 体,中 和 抗 体 と も に 陰 性

の血 清 と20年 前 に ム ン プ ス に 罹 患 した 正 常 成 人 血

清(ELISA, OD 0.302,中 和 抗 体23倍)を 用 い そ

れ ぞ れPBS (-)で100倍 ・200倍 ・300倍 に希 釈 し

反 応 させABC染 色 を 行 っ た.100倍,200倍 希 釈 で

は シ ー ト上 に 非 特 異 反 応 に よ るバ ン ドが 認 め られ

た が,300倍 希 釈 で は抑 え られ て い る.ELISA陰 性

血 清 で は バ ン ドの 描 出 は 認 め られ な か った.使 用

した 抗 原 量 は1レ ー ン 当 た り5μgと10μgで 比 較

を 行 った が,両 者 で差 は 認 め られ な か った.以 上

の結 果 よ り抗 原 量 は5μg/レ ー ン,血 清 希 釈 は300

倍 が 至 適 条 件 と考 え られ た.

3) ム ン プ ス ワク チ ン接 種 後 に お け る 抗 体 出 現

時 期 の 検 討

北 里 研 究 独 自株MPRワ ク チ ンを 接 種 した1歳

児6例 を 対 象 と し,接 種 前,接 種 後1週, 2週,

3週,5週,10週 と経 時 的 にこ採 血 し,各 血 清 を使

用 し た.そ の うち1例 のWB法 の 結 果 をFig.3

に示 した.ム ン プスELISA抗 体 は 接 種 後2週 よ

り検 出 され,WB法 で は この 時 期 の 血 清 で はHN

蛋 白(75K)に 対 す る抗 体 が検 出 さ れ た. ELISA

法 とWB法 で は ほ ぼ 同 時 期 に 抗 体 の検 出 さ れ る

こ とが 判 明 した.HN蛋 白以 外 のmajor protein

で あ るL(200K), NP(69K), F(62K)は ワク

チ ン接 種 後3週 よ り検 出 さ れ た.P(45K), M (42

Fig. 3 Western Blotting of the serial sera obteined

from the recipient of live mumps virus vaccine.

Serial sera was obteined before vaccination, and

1, 2, 3, 5, lOweeks after vaccination.

Vaccination

pre 1W 2W 3w 5W 10W

平成3年3月20日

340 村山 是

Fig. 4 Western Blotting of the sera obteined from

two patients with naturally acquired mumps

infection.

lane a : sera obteined in acute phase, lane b : sera

obteined in convalescent phase.

Natural Infection

1 2

a b a b

K)は3週,5週 では淡いバン ドとして認められた

が,10週 では明暸に検出された.尚,他 の5例 で

も同様の結果が得られた.

4)自 然感染例の血清についての検討

ムンプス自然感染後の患者2例 について急性期

及 び 回 復期 の ペ ア血 清 を用 い てWBを 行 い,結 果

をFig.4に 示 した.ELISA法 で 得 られ た 吸 光 度

は い ず れ も回 復 期 に は0.800以 上 で あ り強 陽 性 を

示 した.Case1で は,急 性 期 にHNの み に バ ン ド

が 認 め られ,他 の淡 い バ ン ドと して 認 め られ た.

Case2で は急 性 期 か らHNを は じめNP, F, P,

Mに 対 す るバ ン ドが 認 め られ,回 復 期 にL蛋 白 に

対 す る バ ン ドも検 出 され た.ま た バ ン ドの 濃 さ は,

ELISA法 で ほ ぼ 同 じ吸 光 度 を 示 し た ワ ク チ ン接

種 例 の もの よ りも濃 く,ELISA吸 光 度 とバ ン ドの

濃 淡 は 必 ず し も相 関 して い な い と考 え られ る.

5) MMRワ ク チ ン接 種 ペ ア 血 清 に お け る抗 体

産 生 状 況 の 検 討

(a) ワク チ ン接 種 前 後 と もELISA抗 体 陽 性 例

MMRワ ク チ ン接 種 前 後 の ペ ア血 清 の うち,ワ

ク チ ン接 種 歴 も な く,し か もム ン プ ス顕 性 発 症 の

既 往 歴 もな い に も関 わ らず,ワ クチ ン接 種 前 よ り

ELISA抗 体 が 陽 性 を 示 した 血 清 に つ い てWBを

行 った.被 検 血 清 は い ず れ も北 研ELISA法 で 吸

光 度0.131以 上 を示 し,ワ ク チ ン接 種 後 抗 体 価 の 上

昇 を 認 め た4例(booster(+)), 及 び 抗 体 価 に 変 化

を 認 め な か った4例(booster(-)) に つ い て検 討 を

行 い,結 果 の一 部 をFig.5に 示 した.全 例 で 少 な

Fig. 5 Western Blotting of the sera obteined before and after vaccination.

Before vaccination, these sera showed positive in ELISA. Booster (+) meanes

the cases with booster response in ELISA and booster (-) meanes the cases

without booster response.

boostcr (+) booster ( - )

感染症学雑誌 第65巻 第3号

ウエ ス タ ン ブ ロ ッ トに よる ム ンプ ス抗 体検 出 341

Fig. 6 Western Blotting of the sera obteined from the recipients without ser-

oconversion in ELISA, demonstrating below 0.100 in OD. demonstrating 0.101～0 .130 in OD, with seroconversion in ELISA, demonstrating 0.131～0.160 in

OD.

(0Dく0.100) (0D0.101 ～ 0.130) (0D0.131 ～ 0.160)

く と もHN蛋 白 に 対 す る バ ン ドは 明 暸 に 検 出 さ

れ た.NP, F, P, Mの 構 成 蛋 白 に対 す るバ ン ド

は,か な り不 明 暸 なが ら も認 め られ た.

(b) ワ ク チ ン接 種 後 のELISA抗 体 非 陽 転 例 及

び低 値 陽 転 例

同MMRワ ク チ ン接 種 後ELISA抗 体 非 陽 転 例

を 吸 光 度0,100以 下 の血 清 と 吸 光 度0.101～0.130

の2群 に分 け,ま た 低 値 陽 性 と判 定 さ れ る吸 光 度

0.131～0.160の 血 清 につ い てWBを 行 い,結 果 の

一 部 をFig.6に 示 した.吸 光 度0.100以 下 の血 清

で は,全 例 バ ン ドは 検 出 さ れ な か った.吸 光 度

0.101～0.130を 示 す 血 清3例 の うち2例 で バ ン ド

が認 め られ,こ の うち の1例 で はHN蛋 白 に 対 す

る バ ン ドの み が 検 出 さ れ た.残 りの1例 で は

HN,NP,F,P,Mの 各 構 成 蛋 白 に対 す る バ ン ド

が 検 出 され た.吸 光 度0.131～0.160を 示 す4例 で

は,全 例HN,NP,F,P,Mの 各 構 成 蛋 白に 対

す る バ ン ドが 検 出 され た.

(c) MMRワ ク チ ン 接 種 後 の 血 清 に つ い て

ELISA値 で 吸 光 度<0.100, 0.101～ 0.130,

0.131～o.160,>0.161の 群 に 分 け,WB法 に よ り

抗 体 の検 出 され た 例 数 を ま と め てTable1に 示

した.吸 光 度0.100以 下 で はバ ン ドの 描 出 は認 め ら

れ ず 抗 体 の 検 出 は 不 可 能 で あ った.吸 光 度

Table 1 Comparison with ELISA & WB

0.101～0.130を 示 すELISA陰 性 血 清 の 中 に は

WB法 で 抗 体 が 検 出 さ れ る 例 も存 在 し,吸 光 度

0.161以 上 で は全 例 抗 体 の検 出 が 可 能 で あ った.

考 案

ム ン プ ス ウ イ ル ス を 構 成 す る蛋 白 は, majior

proteinと してL,HN,NP,F,P,M の6 種 類

が存 在 し,電 気 泳 動 を 行 った 場 合 そ れ ぞ れ200K,

75K,69K,62K,45K,42Kの 位 置 に バ ン ドが 描

出 され る.こ のmajor proteinの 種 類 は 各 株 間 で

同一 で あ り4),今 回 のWB法 で は これ らの 蛋 白 に

対 す るバ ン ドはMMR, MPR間 で も差 が な く,非

特 異 反 応 は認 め られ な か った こ と よ り特 異 性 も高

い もの と考 え られ る.ま たMajor protein以 外 の

分子 量 の 小 さい 蛋 白 に対 す るバ ン ドが 非 特 異 反 応

と し て 観 察 さ れ た が,ム ン プ ス ウ イ ル ス Enders

株 を ニ ワ ト リ発 育 鶏 卵 培 養 で 増 殖 させ 精 製 した 抗

平成3年3月20日

342 村山 是

原 を 対 照 と して 同 時 に 泳 動 す る こ とで,こ れ らの

バ ン ドがVero細 胞 由来 か あ る い は ウ イ ル ス蛋 白

由 来 か の 鑑 別 を し た.Naruseら7) は chick

embryo cellを 用 い て 実 験 を 行 い,ム ン プ ス ウ イ

ル ス感 染 後,細 胞 内 で はP-proteinが 最 初 に合 成

さ れ る と報 告 し て い る.一 方Herrlerら13)は,

Vero細 胞 にEnders株 を感 染 させ,NPが 最 初 に

細 胞 内 に 合 成 され る と報 告 して い る.し か し我 々

の実 験 で は,ワ ク チ ン接 種 後 最 初 にWBで 検 出 さ

れ て く る抗 体 は,先 のP-proteinあ る い はNPに

対 す る抗 体 よ りも,ウ イ ル ス表 面envelope pro-

teinのHN蛋 白 に 対 す る 抗 体 で あ る こ とが 明 か

とな った.

同 一 のELISA抗 体 価(吸 光 度)を 示 した 自然 感

染 例 と ワ ク チ ン接 種 例 の 画 血 清 をWB法 で 比 較

す る と,自 然 感 染 群 の 方 が バ ン ドは濃 厚 で あ った.

即 ち,ELISA法 で 区 別 で きな い 抗 体 量 が,WB法

で 量 の 差 を検 出 す る こ とが 可 能 で あ った.ま た ワ

クチ ン群 のELISA抗 体 陰 性 血 清 の 一 部 に, WB

法 に よ り抗 体 が 検 出 され た 例 も存 在 した.以 上 の

こ とか ら,ELISA法 よ りWB法 の方 が 感 度 が 高

い もの と考 え られ る.

WB法 は シ ー ト上 に 出 現 す る ノミン ドの 有 無 を

観 察 す る定 性 的 方 法 で あ り,定 量 的 な 測 定 法 で は

な い こ とが 欠 点 と して 挙 げ られ る.し か し先 に述

べ た 如 く,感 度 の面 でELISA法 に比 べ て も劣 る

こ との な い新 し い方 法 で あ り,Major proteinで

判 定 す る 限 り非 特 異 反 応 も生 じ な か っ た こ と か

ら,ELISA法 で の判 定 に 苦 慮 す る場 合,WB法 を

併 用 す る こ と に よ り確 実 な診 断 に結 び つ け る こ と

が で き る た め,有 用 な検 査 法 と考 え られ る.

本論文の要旨は,第93回 日本小児科学会学術集会(平 成

2年5月12日) において発表 した.

謝辞 稿を終 えるにあた り御指導,御 校閲賜わ った恩師,

東京医科大学 ・小児科学教授本多輝男先生並 びに,北 里研

究所 ・ウイルス部長牧野 慧先生に厚 く御礼申し上げます.

また,本 研 究に あた り技術 的御指導 と適切 な御 助言を賜

わ った済生会中央病院 ・小児科医長中山哲夫先生に深謝致

します.尚, 終始御親切な御援助 を賜わ った北里研究所 ・

ウイルス第1室 長佐 々木繁子博士並 びに中川正治,森 孝

之両先生をは じめ諸兄姉に厚 く御礼申し上げます.ま た本

研究の検体を採取 して頂いた東京医科大学 ・小児科学教室

の諸先生に深謝致 します.

文 献

1) 河 島 尚志: 酵 素 免 疫 吸着 法(ELISA) 発 育鶏 卵 培

養精 製 ム ソプ ス抗 原 に含 まれ る宿 主 由来 抗原 につ

い て の研 究. 感 染 症誌, 60: 257-266, 1985.

2) Tsuji, M. , Sasaki, K. , Nakagawa, M. , Mori, T. , Nakayama, T. , Makino, S. & Okamura, M. : Improved enzyme-linked immunosorbent assay

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Evaluation of Immunoblotting Method for the Detection of Antibodies to Mumps Virus

Tadashi MURAYAMA

Department of Pediatrics, Tokyo Medical College

I developed on immunoblotting assay for the detection of antibodies to mumps virus components, using purified mumps virus propagated in Vero cell cultures, and investigated the presence of antibodies after vaccination in comparison with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In the immunoblotting assay, antibodies to hemagglutinin-neuraminidase (HN) and fusion (F) protein were detected two weeks after vaccination with live mumps vaccine, in accordance with the presence of ELISA antibodies. All serum samples positive in ELISA showed positive in immunoblotting, and two out of nine samples negative in ELISA after vaccination were positive in immunoblotting. Thus, the immunobotting method is considered to be more sensitive than ELISA for the detection of antibodies to mumps virus.

平成3年3月20日