Špecifická humorálna imunita

Imunológia – 2. blok

Špecifická humorálna imunita

-schopnosť organizmu reagovať na cudzorodý antigén špecifickou imunitnou odpoveďou protilátkového typu

Protilátky: IgA IgD IgE IgG IgM

Stanovenie IgG radiálnou imunodifúziou (RID):

Princíp: Molekuly IgG (v sére pacienta) difundujú z jamiek v agaróze do okolia a reagujú s protilátkou proti IgG, ktorá je inkorporovaná v agaróze. Výsledkom interakcie je precipitačný prstenec. Veľkosť prstenca zodpovedá množstvu stanovovanej protilátky (Ab) v sére. Pomocou štandardov možno zostrojiť kalibračnú krivku a odčítať množstvo IgG v sére pacienta.

Materiál: preparáty RID, RID šablóny, milimetrový papier

Postup: 1. Zmerať priemery prstencov séra a štandardov.

2. Zostrojiť kalibračnú krivku.

3. Vypočítať množstvo protilátky IgG v sére.

RID je imunoprecipitačná metóda, založená na interakciiAg-Ab, pri ktorej vzniká zrazenina. Pre obmedzenú citlivosťsa stanovuje IgG, IgA, IgM. Pre stanovenie nízkych hladín, akosú IgD a IgE, nie je vhodná (tam RIA, ELISA).

RID

ELISA = enzyme linked immunosorbent assay

-je viac typov (sendvičová, priama, nepriama,...)

-buď sa dokazuje prítomnosť špecifických protilátok alebo prítomnosť určitého antigénu vo vyšetrovanej vzorke

ELISA na detekciu protilátok IgE:

Princíp: ELISA je sérologická metóda kvantifikácie Ag alebo Ab prostredníctvom kovalentne nadviazaného enzýmu (peroxidáza, alkalická fosfatáza) : množstvo farebného produktu sa stanoví

fotometricky

Pomôcky: 1. komerčné stripy (v jamkách adherované monoklo- nové protilátky + anti-IgE + blok 3% BSA) 2. premývací roztok 3. konjugát (Ab značená chrenovou peroxidázou) 4. substrát (H2O2 + indikátor farebnej zmeny = TMB) TMB = tetrametylbenzidín

5. STOP roztok (H2SO4)

6. vzorky séra

Postup: 1. Do jamiek 50 μl séra a inkubovať 45 min. pri 37 °C.

2. Premyť 2 x 200 μl premývacieho roztoku a vytriasť dosucha.

3. Pridať 50 μl konjugátu a inkubovať 30 min pri 37 °C v termostate.

4. Ako krok 2.

5. Pridať 50 μl substrátu a čakať 2 min. na farebnú zmenu.

6. Pridať STOP roztok a zmerať absorbanciu na ELISA reader-i.

IMUNOKOMPLEXY

-väzba Ab-Ag-v nadbytku môžu indukovať zápal (ukladanie IK do steny ciev, synovie kĺbov, glomerulov, plexus chorioideus a pod.

Hodnotenie cirkulujúcich imunokomplexov (CIK):

1) Zmerať absorbanciu prázdnej mikroplatničky.2) Zo vzorky pridať 20 μl do jamky A1 a B1.3) Do A1 pridať 150 μl borátového tlmivého roztoku.4) Do B1 pridať 150 μl polyetylénglykolu (PEG).5) Premiešať a inkubovať 60 min. pri laboratórnej teplote.6) Zmerať absorbanciu pri 450 nm.7) Výpočet hodnoty CIK.

Najprv vypočítať výslednú hodnotu absorbancie v danejjamke ako rozdiel absorbancie plnej jamky a prázdnej.

POTOM:

(výsledná hodnota B1 – výsledná hodnota A1) x 1000

Referenčné hodnoty: do 50

Metóda IMUNOFIXÁCIE

• pri gamaglobulinopatiách, Waldenströmovej makroglobulinémii, myelómoch

• netvoria sa niektoré imunoglobulíny v dostatočnom množstve, alebo je chyba v produkcii Ig reťazcov• detekcia a typizácia monoklonálnych Ab alebo Ig v

sére alebo moči• precipitácia viditeľná voľným okom• náhrada proteínovej elektroforézy, lebo je rýchlejšia,

citlivejšia, jednoduchšie čitateľná a interpretovaná

Detekcia autoprotilátokNepriamy imunofluorescenčný test

• IFA je podobná ELISA metóde, môže sa stanovovať aj na sklíčku

• na značenie sa používa fluorochróm (pri ELISE enzým, ktorý po pridaní substrátu indukuje farebnú zmenu)

• fluorescenčný mikroskop

Postup: 1. Na sklíčko „potiahnuté“ antigénom sa kvapne sérum. 2. Inkubuje sa 30 min. vo vlhkej komôrke. 3. Premytie. 4. Aplikácia antiséra konjugovaného s fluorochrómom (napr. SwAHu/Ig). 5. ako krok 2 6. Premytie. 7. Odčítanie preparátu vo fluorescenčnom mikroskope.

- infikované bunky fluoreskujú na tmavom pozadí

- IFA sa využíva pri niektorých infekciách, autoimunitných ochoreniach (napr. štítnej žľazy,...)

Ďakujem za pozornosť