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Spettroscopia Spettroscopia RamanRaman e microscopia AFM e microscopia AFM
di di cheratinociticheratinociti umani: umani:
modificazioni cellulari dopo esposizione a modificazioni cellulari dopo esposizione a
basse dosi di agenti basse dosi di agenti xenobioticixenobiotici
G. Perna, M. Lasalvia, V. Capozzi
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,
Università degli Studi di Foggia, Viale L. Pinto - 71122 Foggia
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Applied Physics Laboratory
University of Foggia
OutlineOutline
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
• Sostanze xenobiotiche: HgCl2 e pesticidi
• Modello cellulare: cheratinociti
• Metodi di indagine: microspettroscopia Raman e
microscopia AFM
• Risultati su cellule fissate e viventi esposte a HgCl2
• Risultati su cellule fissate esposte a Chlorphyriphos e
Deltametrina
• Risultati preliminari curve forza-distanza su cellule esposte
a prodotto commerciale
• Conclusioni
Sostanze xenobioticheSostanze xenobiotiche
composti che non vengono prodotti dal metabolismo degli
organismi viventi
Sono sintetizzati dall’industria chimica:
• per la loro utilità nei processi produttivi industriali (catalizzatori,
coloranti, polimeri, etc.)
• per incrementare la produzione agricola (pesticidi, fitofarmaci,
concimi)
• per attività domestiche
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Composti a base di mercurio (es. HgClComposti a base di mercurio (es. HgCl22))
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
HgCl2: presente in insetticidi, antisettici e disinfettanti
PesticidiPesticidi
Prodotti chimici in grado di controllare, limitare, respingere o
distruggere microrganismi considerati come nocivi
Organofosfati: neutralizzano un enzima (acetilcolinaesterasi)
fondamentale per il corretto funzionamento degli stimoli nervosi.
Piretroidi: agiscono sui canali del sodio delle membrane nervose.
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a sostanze xenobiotiche: inalazioneEsposizione a sostanze xenobiotiche: inalazione
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Insediamento urbano e industriale Campi coltivati
Atmosfera Atmosfera
Insediamento urbano e industriale
Atmosfera
Emissione Ricaduta con la pioggia
Acque dolci e salate
Suolo
Campi coltivati
Trasformazione
Animali d’allevamento
Distribuzione e
vendita
Acq
ua
Consumatore
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a sostanze xenobiotiche: ingestioneEsposizione a sostanze xenobiotiche: ingestione
Esposizione a sostanze xenobiotiche: contattoEsposizione a sostanze xenobiotiche: contatto
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Insediamento urbano e industriale Campi coltivati
Atmosfera Atmosfera
Esposizione a sostanze xenobiotiche: limitiEsposizione a sostanze xenobiotiche: limiti
Per ciascuna sostanza esistono limiti di esposizione (dose
giornaliera accettabile: 0.01 mgKgpeso corporeo -1giorno-1)
Esposizione a basse concentrazioni (≤ 1 ordine di grandezza
rispetto alla concentrazione citotossica)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Effetti tossici hanno origine da alterazioni a livello cellulare →
strutture e funzioni cellulari possono essere alterate da
modificazioni chimiche e morfologiche di componenti cellulari →
analisi su cellule in vitro
Modello cellulare: Modello cellulare: cheratinociticheratinociti
Cheratinociti umani normali (linea primaria HUKE)
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• Cellule in coltura in EpiLife
medium a 37 C e 5% di CO2
• Esposizione per 24 h a diverse
concentrazioni di xenobiotico
Test colorimetrici Trypan blue MTT
Concentrazione citotossica: provoca la morte di più del 50% del
campione cellulare
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Cellule viventi o cellule fissate?Cellule viventi o cellule fissate?
Fissazione
Immersione in soluzione di paraformaldeide
Formazione legami con proteine sulla membrana
Cellula e componenti cellulari mantengono la loro morfologia
anche in assenza delle condizioni chimico fisiche vitali
Effetti fissazione:
• arresto dei processi vitali cellulari
• preservazione dei componenti cellulari contro processi di
disgregazione.
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Metodi di indagine: microMetodi di indagine: micro--spettroscopia Ramanspettroscopia Raman
ground state
excited state
virtual state
ƒpump
Raman
Stokes
Q.Matthews et al., Physics in Medicine
and Biology 56, 19-38 (2011)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Metodi di indagine: microscopia AFMMetodi di indagine: microscopia AFM
T. Puntheeranurak et al., Nature Protocols
6, 1443-1452 (2011)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: Raman cellule fissate: Raman cellule fissate ~10-4M concentrazione citotossica
1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp;
1232 cm-1: amide III ( sheet);
1262 cm-1: amide III ( helix);
1287 cm-1 T, A (n.a.);
1302 cm-1: CH2 twisting (l);
1338 cm-1: CH2 twisting (p) + A, G (n.a.);
1379 cm-1: A, G, T (n.a.).
G. Perna et al., Journal Molecular
Structure 834, 182-187 (2007)
Raman shift (cm-1)
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Inte
nsity (
a.u
.)
control
treated with 10-6
M HgCl2
treated with 10-4
M HgCl2
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule fissate: AFM cellule fissate
controllo 10-4 M HgCl2 10-6 M HgCl2
G. Perna et al., Journal Molecular
Structure 834, 182-187 (2007)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi
Cellula prima dell’esposizione a 10-7 M HgCl2
x(m)0 5 10 15 20 25 30 35
y(
m)
0
1
2
3
4
line 1
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi Cellula 15 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl2
x(m)0 5 10 15 20 25 30
y(
m)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
line 1
line 2
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi Cellula 35 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl2
x(m)0 10 20 30 40
y(
m)
0.0
0.6
1.2
1.8
line 1
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi Cellula 55 minuti dopo inizio esposizione a 10-7 M HgCl2
M. Lasalvia et al., Journal of
Microscopy 243, 40-46 (2011)
(a)
(b)
x(m)0 10 20 30 40 50
y(
m)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
line 1
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a HgClEsposizione a HgCl22: AFM cellule viventi: AFM cellule viventi
Relazione diretta tra morfologia cellulare ed HgCl2 sui cheratinociti ad una concentrazione di 100 nM
100 nM 1 μM 10 μM 100 μM 1 mM
citotossica
non citotossica
ALTERAZIONE
MORFOLOGIA
CELLULARE
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: vitalità cellulareEsposizione a pesticidi: vitalità cellulare
Chlorphyriphos
(organofosfato)
Deltametrina
(piretroide)
deltamethrin concentration (M)
HU
KE
ce
lls (
%)
0
20
40
60
80
100alive cells
dead cells
control 10-6 10-5 10-4 2.5x10-4
chlorpyriphos concentration (M)
HU
KE
ce
lls (
%)
0
20
40
60
80
100alive cells
dead cells
control 10-6 10-5 10-4 10-3
Concentrazione citotossica (24h)
~10-3M (Chlorphyriphos)
~2.5x10-4 M (Deltametrina)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: microspettroscopia RamanEsposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman
Cellule esposte a Chlorphyriphos
G. Perna et al., Applied Physics
Letters 95 (8), 083701 (2009)
Raman shift (cm-1)
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
inte
nsity (
a.u
.)
0.0
0.4
0.8
1.2
control
10-6
M
10-5
M
pro
tein
pro
tein
lipid
+ p
rote
in
pro
tein
+ D
NA
DN
A
pro
tein
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: microspettroscopia RamanEsposizione a pesticidi: microspettroscopia Raman
Cellule esposte a Deltametrina
Raman wavenumber (cm-1
)
1000 1200 1400 1600 1800
Ram
an Inte
nsity (
a.u
.)
0.0
0.4
0.8
1.2
control
10-6 M
10-5 Mp
rote
in
pro
tein pro
tein
+D
NA
pro
tein
DN
A
lip
id+
pro
tein
G. Perna et al., Vibrational
Spectroscopy 57, 55-60 (2011)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Deconvoluzione con funzioni Gaussiane
Raman shift (cm-1
)1550 1600 1650 1700
0.0
0.4
0.8
1.2
1200 1300 1400 15000.0
0.4
0.8
1.2
1000 1040 1080 1120
Inte
nsity (
a.u
.)
0.0
0.2
0.4
10
00
10
32
10
88
11
23
11
77
12
06
12
32
12
62
13
02
13
37
13
79
14
12
14
50
14
80
15
52 15
81
16
15
16
55
16
80
(a)
(b)
(c)
1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe;
1032 cm-1: CH in-plane bending Phe;
1088 cm-1: PO2- stretching (n.a.) + C-O, C-C
stretching (p) + C-C stretching (l);
1123 cm-1: C-N stretching (p);
1177 cm-1: C-H bending Tyr;
1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp;
1232 cm-1: amide III ( sheet);
1262 cm-1: amide III ( helix);
1302 cm-1: CH2 twisting (l);
1337 cm-1: CH2,, CH3 wagging (p) + A, G (n.a.);
1379 cm-1: A, G, T (n.a.);
1450 cm-1: CH2/CH3 scissoring (l.) + CH2 bending (p.);
1480 cm-1: A, G (n.a.);
1552 cm-1: Trp;
1581 cm-1: A, G (n.a.);
1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp;
1655 cm-1: amide I ( helix);
1680 cm-1: amide I ( sheet)
Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Chlorphyriphos
0.8
1.2
1.6
2.0
(1655-1680 cm-1)
(1220-1280 cm-1)
0 (control) 10-6 10-5
inte
ns
ity (
a.u
.)
0.2
0.3
0.4
(1379 cm-1
)
(1581 cm-1
)
(1480 cm-1
)
Chlorphyriphos concentration (M)0 (control) 10-6 10
-5
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
(1615 cm-1)
(1206 cm-1)
(1000 cm-1)
0 (control) 10-6 10-5
Singoli amminoacidi 1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe
1206 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp
1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp
Legami fra amminoacidi 1655-1680 cm-1: amide I
1220-1280 cm-1: amide III
Acidi nucleici 1379 cm-1: A, G, T
1581 cm-1: A, G 1480 cm-1: A, G
L’intensità di ciascun
picco è normalizzata
rispetto a quella del
picco a 1450 cm-1
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Esposizione a pesticidi: analisi spettri RamanEsposizione a pesticidi: analisi spettri Raman Deltametrina
Singoli amminoacidi
1000 cm-1: symmetric ring breathing Phe
1204 cm-1: C-C6H5 Tyr, Phe, Trp
1615 cm-1: C=C, Tyr. Trp
Legami fra amminoacidi
1655-1680 cm-1: amide I
1220-1280 cm-1: amide III
Carboidrati
1056 cm-1: C-C
L’intensità di ciascun
picco è normalizzata
rispetto a quella del
picco a 1450 cm-1
1.0
1.5
2.0
(1655-1680 cm-1)
(1220-1280 cm-1)
0 (control) 10-6 10-5
inte
ns
ity (
a.u
.)
0.0
0.1
0.2
(1056 cm-1
)
Deltamethrin concentration (M)0 (control) 10-6 10
-5
0.0
0.1
0.2
0.3
(1615 cm-1 )
(1204 cm-1)
(1000 cm-1)
0 (control) 10-6 10-5
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Esposizione a pesticidi: misure AFMEsposizione a pesticidi: misure AFM Chlorphyriphos
Controllo: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori.
10-6 M and 10-5 M: forma regolare, nucleo compatto, superficie con lievi
increspature rispetto al controllo G. Perna et al., J. Raman
Spectroscopy 42, 603-611 (2011)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: misure AFMEsposizione a pesticidi: misure AFM Deltametrina
Controllo:: nucleo compatto, superficie liscia, assenza di rugosità e fori.
10-6 M e 10-5 M: forma irregolare, membrana plasmatica danneggiata. G. Perna et al., Vibrational
Spectroscopy 57, 55-60 (2011)
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Curve forzaCurve forza--distanzadistanza
modulo di Young sforzo, deformazioneE
La forza di interazione è descritta da relazioni analitiche
dipendenti dalla forma della punta e dalle caratteristiche dei due
materiali a contatto
F>0: repulsiva
F<0: attrattiva
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Curve forzaCurve forza--distanzadistanza
Dimensioni sonda ~nm => proprietà elastiche locali
Dimensioni sonda ~µm =>
=> proprietà elastiche globali
Stima di E: modello di HertzStima di E: modello di Hertz
Forza di indentazione su un materiale elastico ed omogeneo:
3/ 2
2
4
3 1
CR EF
δ: profondità di indentazione
ν: coefficiente di Poisson
RC: raggio della sonda
E: modulo di Young
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Esposizione a pesticidi: curve forzaEsposizione a pesticidi: curve forza--distanzadistanza
Prodotto commerciale: Deltametrina + coformulanti + solvente
Vitalità cellulareVitalità cellulare
Concentrazione citotossica (per 24 h):
> 2.5·10-6 M
L’aggiunta di coformulanti diminuisce la
concentrazione citotossica (~2 ordini di
grandezza)
Curve forzaCurve forza--distanzadistanza
spostamento piezoelettrico (nm)
-300 -200 -100 0 100 200
Deflessio
ne m
icro
leva (
nm
)
0
50
100
150
200
controllo
5X10-8M
5X10-7M 5x10-7 M diminuisce deflessione
aumenta indentazione
indentazione = spostamento - deflessione
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a pesticidi: calcolo modulo di YoungEsposizione a pesticidi: calcolo modulo di Young
3/ 2
2
3/ 2
2
2
4
3 1
4, con
3 1
3 1
4
C
C
C
R EF
R EF K K
E KR
2 valori di K => 2 valori di E
E1: indentazione minore di ~20 nm : regione membrana
E2: indentazione maggiore di ~20 nm: regione citosol
XCVIII CONGRESSO NAZIONALE SIF, Napoli 17-21 settembre 2012
Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori
alla citotossica causa alterazioni biochimiche nelle cellule
ConclusioniConclusioni
CHLORPHYRIPHOS
basi del DNA, singoli
aminoacidi, legami peptidici,
legami lipidici di membrana
DELTAMETRINA
legami -CH2 dei lipidi delle
citomembrane HgCl2
legami lipidici di membrana e
acidi nucleici
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ConclusioniConclusioni
DELTAMETRINA
Forma irregolare, formazione di
fori e rigonfiamenti sulla
membrana, riduzione del modulo
di elasticità di membrana
Esposizione a concentrazioni di 1 o 2 ordini di grandezza inferiori
alla citotossica causa alterazioni morfologiche e meccaniche
nelle cellule
HgCl2
Superficie irregolare, formazione
di fori e rigonfiamenti sulla
membrana
HgCl2
Azione immediata dell’HgCl2
provoca modificazioni della
membrana plasmatica