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Splice site recognition by the splicing machinery

정확한 5’-(GU)와 3’-(AG)를 인식하기 위해서는 exonic splicing enhancer와 그곳에 결합 하는 SR protein이 필요하다. 그림; SR이 ESE에 결합하고 U1 snRNP를 5’-splice site로 불러드린다. 그리고 U2AF65, U2AF35를 pyrimidine tract과 3’-splice site의 AG로 불로 드린다. U2AF는 U2 snRNP를 branch point sequence (A)로 불러드린다. 또한 SR은 U1 snRNP와 U2 snRNP가 반응을 하게 한다.

Pre-mRNA 분자는 exon recognition을 repress하는 서열을 갖고 있다. 이를 exonic splicing silencer (ESS) 혹은 intronic splicing silencer (ISS)라고 한다. 예로 hnRNP 단백질은 ESS나 ISS에 결합하여 SR이 ESE에 결합하는 것을 막는다고 생각한다.

또한 splicing은 교과서 그림 17.39에서 보는 것처럼 전사가 되면서 동시에 splicing이 일어난다고 생각된다. 물론 전사 이후에 posttranscriptional process로도 진행 된다.

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17.5 Cleavage/polyadenylation & transcription

termination

1. cleavage at the poly(A) site (cleavage/polyadenylation site)

2. addition of the poly(A) tail at the new 3' end

3. transcription termination downstream from the cleavage site

Transcription termination involves three steps

Poly(A) tail synthesis and transcription termination are coupled, cotranscription processes.

포유류에서 cleavage/polyadenylation site selection에 관여하는 3가지 sequence element가 존재한다.

(a)

(b)

(a) Poly(A) site recognition in

mammals; ①cleavage site에서 10-30 nucleotide 앞의 polyadeny lation signal (AAUAAA)

②U-rich downstream element ③UGUA sequence

(b) Poly(A) site recognition in yeast

cleavage site의 5’ 쪽에 있는 efficiency element (EE)와 positioning element (PE) 존재. 또한 Py(A)n 서열이 존재.

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cleavage/polyadenylation

machinery in mammals

1. CPSF; polyadenylation signal

AAUAA에 결합. cleavage와 poly A의 첨가에 필수적. 2. CstF; U-rich 서열에 결합. cleavage에 필수적 3. CFI과 CFII; cleavage에 필요. 4. PAP; 3’-end에 A를 첨가 5. PABII; poly(A)의 첨가를 촉진 poly(A)의 길이를 조절 6. Ssu72 & PC4; TFIIB와 interact 7. Symplekin; CstF complex를 안정화 8. CTD of RPB1 (largest subunit

in RNA polymerase II); CPSF,

CstF와 결합하고 3’ cleavage가 일어나는 동안 다른 factor와 함께 존재 해야 한다.

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Transcription and polyadenylation factors are linked early in transcription

Figure 17.42

transcription과 cleavage/polyadenylation factor는 전사의 초기부터 끝까지 서로 연관이 되어있다.

전사를 시작하기 위하여 PC4 (red)가 general transcription factor인 TFIID, TFIIB 등을 불러드리고 CPSF가 TFIID와 연관을 맺고 pre-initiation complex로 오게된다. 또한 Ssu72가 TFIIB와 연관을맺는다. RNA polymerase II와 다른 factor들도 promoter에 모인다. Initiation; TFIIH의 subunit인 Kin28이 CTD의 인산화를 촉매. CPSF, CstF,Ssu72 PC4, symplekin등이 인산화된CTD에 연관이 되어있다. Elongation; RNA polymerase II가 RNA chain을 신장함. Polyadenylation/termination; CPSF,

CstF등이 poly A signal을 인식하고 PC4가 CTD로부터 떨어져 나온다. 3’ cleavage site를 자르고 poly A tail이 첨가된다.

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Alternative poly(A) site selection

많은 transcription unit는 두개 혹은 그 이상의 alternative polyadenylation site를 갖고 있으며 3가지 형태로 되어있다.

(a) terminal exon 내에 multiple poly(A) site를 갖고 있는 경우. 상황에 따라서 poly(A) site를 선택함.

(b) physiological condition에 따라서 internal exon 혹은 terminal exon으로 작용을 한다. terminal exon으로 작용하면 전사가 그곳에서 끝나고 internal exon으로 작용하면 다음 poly (A) 부위까지 전사가됨

(c) 두 개 혹은 그 이상의 alternative 3’- terminal exon이 있는 경우. termianl exon으로 작용하거나 아니면 exon으로 작용을 하지 못한다.

구체적인 예는 다음 페이지에서 배움

(a)

(b)

(c)

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calcitonin pre-mRNA undergoes alternative splicing and polyadenylation

The IgM transcription unit can also be alternatively processed

6개의 exon이 있고 조직에 따라 두 가지 단백질을 만든다. thyroid나 대부분 다른 조직에서 처음 4 개의 exon이 사용되고 exon4의 poly(A)가 사용되어 calcitonin을 만든다. 신경세포에서는 exon 3,5가 사용되고 exon 6의 poly(A)가 사용되어 clacitonin gene related peptide (CGRP)를 만든다.

IgM transcription unit는 두가지의 poly(A) site를 갖으며 두 가지의 IgM을 만든다.

B cell은 membrane bound IgM을 만들며 weak upstream poly(A)를 splicing 될때 제거하고 다음 poly(A) site을 이용한다. Plasma cell은 soluble IgM을 만들고 weak upstream poly(A)를 이용하여 짧고 soluble 한 형태를 만든다.

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Nuclear run-on shows that termination takes place after poly(A) cleavage 전사의 종결은 cleavage/polyadenylation site로부터 수백 bp downstream에서 일어난다. 이를 증명하기 위하여 nuclear run-on 실험을 사용. (1)핵을 분리하여 (2) radioactive necleoside triphosphate를 포함한 반응 혼합액에 넣은 후 일정기간 반응을 시킨다 (red). (3) 반응을 멈추고 radioactive RNA (red)를 추출한다. transcript 는 주형 DNA를 따라 각각다른 위치까지 전사가 됨 (4) 다른 지역을갖고 있는 (A-E) DNA fragment와 반응 시킴. termination site 전에 것은 (A-D)는 강한 신호가 있고 뒤의 것은 신호가 없다 (E)

• transcription termination requires poly(A) signals

• transcription termination requires factors for 3'-cleavage but does not require factors for poly- adenylation

• transcription terminates downstream from the poly(A) site (200 – 2000bp downstream)

• some transcripts terminate efficiently at a single site, whereas others terminate inefficiently over an extended region

• RNA polymerase II release requires 3' end processing

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(a) The antitermination

model for termination

(b) The torpedo model

for termination poly(A) cleavage signal은 RNAP II가 전사 종결을 하게끔 유도한다. 어떻게 poly(A) site가 전사 종결을 자극하는가 두 가지 모델이 존재.

(a) antitermination model

positive elongation/antitermination

factor를 갖고 있다가 polyadenylation signal (pA) site를 지나면서 negative elongation/ termination factor를 갖고 형태 변화가 일어나 RNAPII가 분리됨.

(b) Torpedo model

adenylation/polyadenylation에 의하여 RNA가 절단되어 분리되면 uncapped 5’-end를 갖은 RNA가 남고 이것은 Rat1•Xm2 nuclease에 의하여 절단이 된다. 이것은 mRNA의 extra part만 절단하는 것이 아니라 termination을 야기시킨다.

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Processing mechanism of histone pre-mRNA Histone은 poly(A) tail이 없으며 cleavage recognition signal이 다른 pre-mRNA와 완전히 다르다. Histone pre-mRNA는 cleavage site 위로 26-nucleotide stem loop structure와 아래쪽으로 purine이 많은 histone downstream element (HDE)가 존재 한다. stem-loop structure 에는 stem-loop binding protein (SLBP)이 결합하고 small nuclear ribonucleoprotein 인 U7snRNP가 결합하게 한다. U7snRNA는 HDE와 base pair를 이루어 cleavage site를 확립한다.

U7snRNP는 CPSF subunit, Cst-77, Cst-64, symplekin등을 불러드린다. CPSF 73 subunit는 다른 결합된 factor의 도움을 받아 endonuclease로 작용하여 histone pre-mRNA를 자른다.

화살표가 cleavage site임

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17.6 RNA editing RNA editing permits a cell to recode genetic information in a systematic and

regulated fashion.

RNA editing; 해독 이전에 RNA base를 변화 시켜서 DNA coding sequence와는 다른 서열이 된다. 고등 생명체에서 가장 잘 연구된 것은 deamination reaction으로 cytidine이 uridine으로 그리고 adenosine이 inosine로 된다. translation machinary는 codon에서 inosine를 guanosine으로 해독한다.

Editing of spliced ApoB RNA in the intestine

Human apoenzyme B (ApoB) 유전자는 43 kb이고 29개의 exon으로 되어있다. liver cell에서는 전부 해독이 되어 512kDa의 ApoB100를 만든다 (좌측그림), 그러나 intestine cell에서는 exon 26에 있는 codon 2153의 CAA(glutamine)가 UAA로 바뀌어 termination codon으로 바뀐다. 그 결과 C-terminal이 없는 truncated protein (ApoB48)이된다 (우측그림).

(C-to-U editing)

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C-to-U RNA editing of ApoB

Editing of pre-mRNAs by ADAR

The mechanism of RNA editing

apoB mRNA에 일어나는 C-to-U RNA editing 기작. deamination이 될 C (red asterisk) 주위의 35 nucleotide에 regulatory elements, spacer element 11 nucleotide mooring sequence가 있어 이차 구조를 만든다. 이곳에 cytidine deaminase acting on RNA (CDAR) homodimer가 additional stimulatory factor (ASF)의 도움으로 editing이 일어난다.

A-to-I editing 기작은 intron이 있는 동안 pre- mRNA에서 일어난다. neurotransmitter receptor 를 암호화하는 pre-mRNA에서 일어나며 CAG (glutamine)가 CIG(argine)로 바뀌면 receptor에 ca2+가 통과하지 못하게 된다. A-to-I conversion은 A 부근의 double stranded RNA 구조를 요구하며 exon complementary structure (ECS)라고 한다. 이곳에 adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)이 작용하여 A가 I로 바뀌게 된다. 핵내에서 일어난다

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17.7 Messenger RNA export Messenger RNA splicing and export are coupled processes

완전히 processing이 끝난 mRNA를 세포질로 이동 시키는 것은 매우 중요한 기작이다. exon junction complex (EJC)는 새로이 생긴 exon-exon junction에 결합하며 중요한 역할을 한다. stage 1; SR protein이 exon에 결합하고 spliceosome을 부른다. UAP56 (U2F associated protein)이 spliceosome과 관계를 맺으며 RNA export factor (REF1을 부른다) stage 2: REF1과 NMD factor등 다른 단백질들이 모여 EJC를 만든다. mRNA export protein (heterodimer)이 REF1에 결합한다. 이때 UAP56은 방출된다. mRNA binding protein과 nuclear pore protein사이의 interaction으로 mRNA가 이동한다. stage 3; cytoplasm으로 mRNA가 이동 후 mRNA export factor가 분리된다.

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17.8 siRNA and miRNA pathways for silencing Short mRNA molecules can silence gene expression

1998년 sense 혹은 antisense RNA를 c. elegance에 넣었을때 특정 유전자의 발현이 안되는 것을 발견함. myofilament 유전자의 742 nucleotide에 해당하는 sense strand, antisense strand, 이들을 합쳐서 만든 double-stranded RNA를 주입했을때 double stranded RNA가 myofilament 유전자의 발현을 막는데 100배 이상 효과가 있는 것을 발견하고 이중 가닥 RNA에 의한 sequence specific silencing을 RNA interference (RNAi)라고 명명하였다. 그림은 초파리의 gene silencing pathway를 나타낸다.

double stranded RNA에 heterodimer protein이 결합 하며 이중 하나는 Dicer2 (DCR2)라는 RNase III enzyme의 한 종류이고 다른 하나는 RNA binding protein인 R2D2이다. 이들은 double stranded RNA를 short interfering RNA (siRNA)로 만든다. siRNA의 두가닥 중 한가닥은 RNA induced silencing complex (siRISC)로 모여서 target mRNA의 절단을 촉매 한다. siRISC assembly는 siRNA duplex, DCR2•R2D2 heterodimer 그리고 부가적인 단백질들이 모여서 만들 어진 RISC loading complex (RLC)가 필요하다.

guide strand RNA는 siRISC로 조립되고 passenger RNA 는 방출되고 파괴된다. Argonaute (AGO) protein은 guide가 mRNA와 쌍을 이룰때 target mRNA를 파괴한다.

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Transitive RNAi in C. elegans Transitive RNAi는 소량의 double stranded RNA에 의하여 silencing이 한 세포에서 일어 나면 다른 세포까지 퍼져나가는 현상을 말하며 c. elegance와 식물에서 관찰되어지나 척추 동물이나 초파리에서는 관찰되지 않는다. transitive RNAi라는 용어는 silencing signal이 특정 mRNA target의 upstream으로 이동하는 현상에서 나온 용어임. 그림; C. elegance의 myofilament (UNC-22)를 GFP와 fusion을 하고 intact UNC-22와 cell 내에 동시에 존재하게 한다. UNC-22는 warm의 coordinated된 움직임을 위하여 필요하다. 또한 이곳에 GFP를 target으로 하는 dsRNA를 넣어주어 작동할 경우에는 GFP가 파괴된다.

좌측; UNC-22의 3’ 말단에 GFP가 fusion. 이 경우는 RNA dependent RNA polymerase가 double strand RNA를 이용 하여 RNA를 합성한다. 이것에 의하여 UNC-22-GFP와 intact한 UNC-22가 파괴 된다. fluorescence가 없어지고 움직임도 uncoordinated 하다.

우측; UNC-22의 5’ 말단에 GFP가 fusion. 이 경우는 GFP만 dsRNA가 작용하여 fluorescence는 없어지나 UNC-22는 온전 하여 coordinated한 움직임을 갖게 된다.

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miRNA formation and action endogenous imperfect hairpin RNA structure (micro RNA 혹은 miRNA)를 이용하여 mRNA의 해독을 조절하는 기작에도 siRNA의 기작에 쓰이는 동일한 효소들이 작용을 한다. C. elegans의 lin-4 유전자는 첫번째 larval stage에서 두번째 단계로 넘어가는데 중요한 역할을 한다. lin-4 전사체는 해독이 되는 것이 아니라 22- nucleotide의 RNA precursor로 작용하여 lin-14와 lin-28의 3’-UTR 지역에 결합하여 이들의 해독을 방해하는 것이 밝혀짐. 그림은 불완전한 homology에 의한 7개의 결합 중 두 개의 결합을 보여줌

miRNA의 pathway DNA에서 pri-miRNA (primary RNA)가 전사가 되면 microprocessor complex (Drosha, Pasha를 포함)가 60-70염기의 stem-loop 구조를 갖은 pre-miRNA (miRNA precursor)로 만든다. 이것이 세포질로 이동하여 Dicer1 (DCR1)에 의하여 잘려진다. 이중 가닥 RNA는 miRNA RISC loading complex

(miRLC)에 의하여 단일 가닥이 되고 Argonaute (AGO)가 결합한다.

22-nucleotide의 guide RNA와 3’-UTR 지역간에 incomplete homology가 있으면 3’-UTR 지역에 결합하여 해독을 막는다. guide RNA와 target RNA간에 complete homology가 존재 하면 결합하여 AGO 단백질이 target mRNA를 파괴하게한다.