St 150. Enfermedades virales del trébol rojo en Uruguay. compartidos... · 2014-05-15 · en plantas de trébol rojo silvestres y en cultivos comerciales. En trébol rojo provoca

Editores: Leticia Bao*Diego Maeso**Nora Altier***

* Lic. Bioq., Protección Vegetal, Facultad de Agronomía, UDELAR.** Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.*** Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

ENFERMEDADESVIRALES DEL TRÉBOLROJO EN URUGUAY.AVANCES DE LAINVESTIGACIÓN EN ELPERÍODO 1994-2004

Título: ENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOL ROJO EN URUGUAY.AVANCES DE LA INVESTIGACIÓN EN EL PERÍODO 1994-2004

Editores: Leticia BaoDiego MaesoNora Altier

Serie Técnica N° 150

© 2005, INIA

ISBN: 9974-38-212-2

Editado por la Unidad de Agronegocios y Difusión del INIA.Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy

Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.

Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., Ph. D. Pablo Chilibroste - Presidente

Ing. Agr., Dr. Mario García - Vicepresidente

Ing. Agr. Eduardo Urioste

Ing. Aparicio Hirschy

Ing. Agr. Juan Daniel Vago

Ing. Agr. Mario Costa

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INTRODUCCIÓN: LA PROBLEMÁTICA DE LAS ENFERMEDADESVIRALES DEL TRÉBOL ROJO EN URUGUAY

Altier, N.; Maeso, D.

ANTECEDENTES ...............................................................................................1VIROSIS QUE AFECTAN AL TRÉBOL ROJO.....................................................1TÉCNICAS DE DETECCIÓN ..............................................................................3

1. Técnicas serológicas ..............................................................................31.1. Microscopía electrónica inmunoabsorbente ...................................31.2. Enzimoinmunoanálisis: Test de ELISA ...........................................3

2. Plantas indicadoras ................................................................................4MODOS DE TRANSMISIÓN DE VIRUS EN TRÉBOL ROJO .............................5

1. Transmisión por semilla ..........................................................................52. Transmisión por áfidos ...........................................................................6

RESEÑA DE LOS TRABAJOS REALIZADOS PARA EL ESTUDIO DE LASENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOL ROJO ............................................6

1. Primera aproximación al problema .........................................................72. Estado sanitario de los cultivos ..............................................................73. Detección de AMV y Potyvirus en semilla y su transmisión a plántula ...74. Importancia de los áfidos en la dispersión viral .......................................75. Estudios de transmisión de AMV y Potyvirus por áfidos en condiciones ..

controladas............................................................................................86. Conclusiones y perspectivas ..................................................................8

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................8

1. IDENTIFICACIÓN Y DIAGNÓSTICO DE VIRUS EN TRÉBOL ROJOMaeso, D.; Larsen, R.; Altier, N.

INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 11MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................12

1. Material vegetal .....................................................................................122. Técnicas serológicas ............................................................................123. Transmisión mecánica a plantas indicadoras .......................................12

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..........................................................................12BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................16

ÍNDICEPág.

2. RELEVAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE LAS ENFERMEDADESVIRALES EN CULTIVOS DE TRÉBOL ROJO

Veiga, L.; Maeso, D.; Altier, N.

INTRODUCCIÓN ...........................................................................................17MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................................17

1. Relevamiento de campo .......................................................................172. Técnicas de diagnóstico en laboratorio ................................................18

2.1. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) ....................................................182.2. Microscopía electrónica inmuno-absorbente con decoración

(ISEM-D) .........................................................................................182.3. Plantas indicadoras ......................................................................18

RESULTADOS ..................................................................................................191. Relevamiento de campo .......................................................................192. Técnicas de diagnóstico en laboratorio ................................................21

2.1. Enzimoinmunoanálisis (ELISA) ....................................................212.2. ISEM-D .........................................................................................212.3. Plantas indicadoras ......................................................................24

DISCUSIÓN ..................................................................................................24CONCLUSIONES .............................................................................................26BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................26

3. DETECCIÓN DE AMV Y POTYVIRUS EN SEMILLA DE TRÉBOL ROJO YSUS IMPLICANCIAS EPIDEMIOLÓGICAS

Arias, M.; Veiga, L.; Maeso, D.; Altier, N.

INTRODUCCIÓN ...........................................................................................29MATERIALES Y MÉTODOS..............................................................................29

1. Detección de virus en plántula ..............................................................291.1. Semilla de lotes comerciales .......................................................291.2. Semilla cosechada de plantas madre con infección

viral conocida ............................................................................302. Detección de virus en semilla ...............................................................30

2.1. Semilla de lotes comerciales .......................................................312.2. Semilla cosechada de plantas madre con infección

viral conocida ............................................................................312.3. Semilla de otras especies de leguminosas forrajeras .................32

3. Detección de AMV en semilla y en plántula ...........................................32RESULTADOS ..................................................................................................32

1. Detección de virus en plántula ..............................................................321.1. Semilla de lotes comerciales .......................................................321.2. Semilla cosechada de plantas madre con infección

viral conocida ............................................................................322. Detección de virus en semilla ...............................................................32

2.1. Semilla de lotes comerciales .......................................................32

Pág.

2.2. Semilla cosechada de plantas madre con infección viral conocida ...............................................................................34

2.3. Semilla de otras especies de leguminosas forrajeras .................343. Detección de AMV en semilla y en plántula ...........................................35

DISCUSIÓN ....................................................................................................35CONCLUSIONES ...........................................................................................37BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................37

4. DISPERSIÓN DE AMV Y POTYVIRUS EN CULTIVOS DE TRÉBOL ROJOY SU RELACIÓN CON ÁFIDOS CAPTURADOS EN TRAMPAS DE AGUA

Bao, L.; Arias, M.; Carballo, R.; Maeso, D.; Altier, N.

INTRODUCCIÓN ...........................................................................................39MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................39

1. Estudio de la dispersión viral en el campo ............................................391.1. Primavera/1999 ............................................................................401.2. Otoño/2000 ...................................................................................401.3. Primavera/2000 ............................................................................40

2. Captura de áfidos alados ......................................................................413. Determinación de los áfidos alados capturados ...................................424. Registro de variables climáticas ...........................................................42

RESULTADOS ..................................................................................................431. Estudio de la dispersión viral en el campo ............................................43

1.1. Primavera/1999 ............................................................................431.2. Otoño/2000 ...................................................................................461.3. Primavera/2000 ............................................................................48

2. Captura de áfidos alados ......................................................................512.1. Primavera-verano/1999-2000 .......................................................512.2. Otoño/2000 ...................................................................................512.3. Primavera-verano/2000-2001 .......................................................52

3. Determinación de los áfidos alados capturados ...................................53DISCUSIÓN .....................................................................................................54CONCLUSIONES .............................................................................................57BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................58

5. ESTUDIOS DE TRANSMISIÓN DE AMV Y POTYVIRUS POR ÁFIDOS ENCONDICIONES CONTROLADAS

Carrión, F.; Bao, L.; Maeso, D.; Altier, N.

INTRODUCCIÓN ...........................................................................................59MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................59

1. Captura de áfidos alados ......................................................................592. Identificación de los áfidos capturados .................................................593. Cría de áfidos ........................................................................................59

Pág.

4. Experimentos de transmisión ...............................................................60RESULTADOS ..................................................................................................61

1. Colecta de áfidos sobre trébol rojo y alfalfa ..........................................612. Identificación de los áfidos capturados .................................................623. Cría de áfidos ........................................................................................624. Experimentos de transmisión ...............................................................62

DISCUSIÓN ......................................................................................................64CONCLUSIONES .............................................................................................65BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................65

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVASAltier, N.; Maeso, D.

PRINCIPALES RESULTADOS DE LOS TRABAJOS REALIZADOS PARA ELESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOL ROJO ...........67

1. Identificación viral ..................................................................................671.1. Virus predominantes ....................................................................671.2. Técnicas de detección .................................................................67

2. Estado sanitario de los cultivos ............................................................673. Detección de AMV y Potyvirus en semilla y su transmisión

a plántula ...........................................................................................684. Importancia de los áfidos en la transmisión viral ..................................685. Estudios de transmisión de AMV y Potyvirus en condiciones

controladas..........................................................................................696. Consideraciones finales........................................................................69

ANEXOS ........................................................................................................71ANEXO 1 ........................................................................................................73ANEXO 2 ........................................................................................................75ANEXO 3 ........................................................................................................77

Pág.

AGRADECIMIENTOS

Queremos expresar nuestro agradecimiento a Richard Larsen, MichaelMcLaughlin, Said Ghabrial, Richard Smith, Kenneth Leath, Mónica Rebuffo, DiegoRisso, Wilma Walasek, Daniel Pagliano, Ema Solares, Mónica García, WilliamÁlvarez, José Furest y Francisco Formoso, pues de una u otra forma han contri-buido para que los trabajos presentados en esta publicación se hayan desarro-llado con éxito; a Jorge Paullier, por la corrección del manuscrito.

ENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOL ROJO EN URUGUAYINIA LAS BRUJAS

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INTRODUCCIÓNLA PROBLEMÁTICA DE LAS

ENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOLROJO EN URUGUAY

1 Ing. Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2 Ing. Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

ANTECEDENTES

El trébol rojo (Trifolium pratense L.) esuna especie de distribución mundial. Es uncomponente importante en la producciónforrajera del país, siendo una de las legumi-nosas preferidas para las praderas mixtasartificiales, sobre todo en la zona sur y litoral(Izaguirre y Beyhaut, 1998). La inclusión deesta leguminosa en el sistema mejora elbalance de nitrógeno a través de la fijaciónbiológica de este nutriente. Mejora la pro-ductividad de los cereales incluidos en larotación de cultivos y de las gramíneas quecomponen las praderas mixtas, explotandoasí las ventajas de ambas famil ias(Carámbula, 1987).

En Uruguay, el trébol rojo ocupa un lugardestacado en las rotaciones de los estable-cimientos lecheros. Si bien botánicamentees una especie herbácea perenne, en nues-tras condiciones su uso está restringido arotaciones cortas, de dos años, por lo quese la considera bianual. El comportamientobianual se debe a la escasa persistencia delas plantas, como consecuencia de lainteracción de factores climáticos, edáficos,de manejo, enfermedades y plagas, queresultan en una carga acumulativa deestreses a lo largo de la vida del cultivo(García, 1992; Leath, 1989; Rebuffo y Altier,1996). La baja persistencia de la legumino-sa en el tapiz se traduce en pérdidas econó-micas muy importantes debido a la menorproducción de carne, leche, lana y semillafina (Altier, 1996).

Altier, N.1; Maeso, D.2

Con la finalidad de mejorar la persisten-cia, el programa de mejoramiento genéticode trébol rojo del Instituto Nacional de Inves-tigación Agropecuaria (INIA) realizó dos ci-clos de selección a campo, obteniendo ma-teriales con mayor persistencia que el culti-var histórico ‘LE 116’, el más utilizado ennuestro país (Rebuffo y Altier, 1996). Noobstante, al incrementar la sobrevivencia delas plantas en el campo, sistemáticamentese han registrado síntomas atribuibles aenfermedades a virus como mosaicos,moteados, amarillamientos, distorsión defolíolos, falta de vigor y enanismo. La mayorincidencia de estos síntomas en plantas desegundo y tercer año ha dificultado el man-tenimiento de los clones selectos del pro-grama, reduciendo la vida de las propaga-ciones vegetativas (Rebuffo y Altier, 1996).

VIROSIS QUE AFECTAN ALTRÉBOL ROJO

Según Campbell (1986), las enfermeda-des causadas por virus son factores signifi-cativos en la reducción de la producción ypersistencia de muchas leguminosasforrajeras; disminuyen el rendimiento de fo-rraje y la calidad nutricional del heno,ensilado o alimento disponible en laspasturas, e interfieren en el proceso defijación simbiótica de nitrógeno. Esto provo-ca un incremento general de los costos deproducción.

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ENFERMEDADES VIRALES DEL TRÉBOL ROJO EN URUGUAY INIA LAS BRUJAS

En estudios realizados en trébol blanco(Trifolium repens L.) en EE.UU., se observóuna disminución en la producción de forrajede 23 a 55%, una reducción en la floraciónde 20 a 40% y en la producción de semillasde 29 a 54% (Barnett y Diachun, 1986). Entrébol rojo se han alcanzado reducciones enla producción de semillas de un 89% (Gothy Wilcoxon, 1962) y en la producción deforraje de 25 a 75% (Potter, 1993).

Se reportan diversos efectos negativossobre la producción y persistencia del culti-vo, dado que los virus alteran la fisiologíanormal de la planta al emplear la maquinariabiosintética de la célula vegetal para repro-ducirse (Campbell, 1986). Entre los efectosproducidos se señalan: disminución del nú-mero y peso seco de hojas y estolones,reducción del crecimiento foliar y radicular(Smith y Maxwell, 1971), atraso en la flora-ción (Bowen y Plumb, 1979), disminucióndel potencial de fijación del nitrógeno y de lanodulación (Mc Laughlin et al., 1992), des-censo en la actividad de la nitrogenasa y enla concentración de leghemoglobina en losnódulos (Gibson et al., 1980, 1981; Kadhairet al., 1984), reducción de la longevidad yproductividad de la planta (Kahn et al., 1978)y aumento en la susceptibilidad a los orga-nismos causantes de la podredumbre de laraíz (Pratt et al., 1982).

A nivel mundial, las enfermedades viralesconstituyen una limitante para la produccióny persistencia del trébol rojo, existiendo 35virus reportados con capacidad de infectareste cultivo (Barnett y Diachum, 1986;Edwardson y Christie, 1986). De estos viruslos de mayor importancia y distribución son:Bean yellow mosaic potyvirus (BYMV),Clover yellow vein potyvirus (CYVV), Alfalfamosaic alfamovirus (AMV), White clovermosaic potexvirus (WCMV), Clover yellowmosaic potexvirus (CYMV), Peanut stuntcucumovirus (PSV), Red clover vein mosaiccarlavirus (RCVMV) y Pea streak carlavirus(PeSV) (Barnett y Diachum, 1986;Edwardson y Christie, 1986).

BYMV y CYVV pertenecen al género Po-tyvirus y están relacionados serológicamente(McLaughlin y Boykin, 1988). BYMV es elvirus más común y ampliamente distribuido

en plantas de trébol rojo silvestres y encultivos comerciales. En trébol rojo provocaamarillamiento internerval y en algunos ca-sos necrosis letal sistémica. CYVV causaaclaramiento de nervaduras y moteado (Bar-nett y Diachun, 1986). La principal forma detransmisión de ambos virus es por áfidos demanera no persistente y no es común sutransmisión por semilla (Bos, 1970; McLaug-hlin y Ensign, 1989).

AMV pertenece al género Alfamovirus;causa mosaicos (Jaspars y Bos, 1980), setransmite por áfidos de manera no persis-tente y la diseminación del virus dentro deun campo es rápida (Crill et al., 1970). Sutransmisión por semilla no es común entrébol rojo (Barnett y Diachun, 1986). Sinembargo, en alfalfa (Medicago sativa L.) sehan reportado niveles de transmisión porsemilla de 0.5 a 26.5% (Frosheiser, 1974).

WCMV y CYMV pertenecen al géneroPotexvirus; WCMV normalmente no produ-ce síntomas en las plantas que infecta, peroa veces causa mosaico difuso, aclaramien-to de nervaduras y moteados en las hojas(McKirdy y Jones, 1997). Ambos virus setransmiten principalmente en forma mecá-nica por inoculación de savia,diseminándose al contacto de las plantassanas con material de plantas infectadas(Barnett y Diachun, 1986). CYMV no estáampliamente distribuido a nivel mundialcomo es el caso de WCMV (Barnett yDiachun, 1985). Hampton (1963) reportótransmisión por semilla de WCMV (6%) y deCYMV (10%). Si bien fue reportada la trans-misión por el áfido Acyrthosiphon pisum(Harris) para este virus en un bajo porcenta-je de casos (Goth, 1962), esto no se hapodido confirmar con estudios posteriores(Bercks, 1971).

Las enfermedades virales son diagnosti-cadas, en su mayoría, por los síntomas queprovocan en el huésped, pero éstos no sonsiempre confiables para la identificación.Los diferentes virus pueden causar reaccio-nes similares en la misma planta, y cepasde un mismo virus pueden producir diferen-tes reacciones en un huésped (Barnett yDiachun, 1986). Por otra parte, los síntomasque aparecen en infecciones múltiples pue-


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den no distinguirse de aquellos causadospor infecciones simples (McLaughlin et al.,1984). El diagnóstico de gran parte de lasvirosis se hace por el estudio de reaccionesen plantas indicadoras (Amorim y Salgado,1995), pero los datos obtenidos son másútiles e informativos cuando se emplean enconjunto con resultados de observacionesmicroscópicas y ensayos serológicos(McLaughlin y Scott, 1986). La serología esel método de identificación más fácil y am-pliamente aplicado, siendo la técnica deEnzimoinmunoanálisis (ELISA) la más utili-zada (McLaughlin y Barnett, 1978). Por otraparte los avances de la biología molecular y dela biotecnología se aplican para el desarrollode herramientas sensibles, específicas y rápi-das para la detección de patógenos vegetales(Njeru et al., 1997).

TÉCNICAS DE DETECCIÓN

A continuación se presenta una breverevisión bibliográfica de técnicas serológi-cas como microscopía electrónica inmunoab-sorbente y enzimoinmunoanálisis; y trans-misión mecánica a plantas indicadoras parala detección de virus en material vegetal.

1. Técnicas serológicas

1.1 Microscopía ElectrónicaInmunoabsorbente

En la microscopía electrónica inmunoab-sorbente ISEM (Immunology Specific Elec-tron Microscopy) descrita por Derrik (1973),se utiliza un anticuerpo para identificar par-tículas virales en grillas preparadas paramicroscopía. El anticuerpo de la grilla con-centra las partículas de la muestra permi-tiendo detectar más rápidamente los viruspresentes a bajas concentraciones (Mc Laug-hlin y Scott, 1986). La detección límite esusualmente entre 0.1 y 10 ng/ml de virus(Koenig, 1988). Las grillas son primero tapi-zadas con el anticuerpo contra el virus bus-cado, luego se agrega la muestra y los anti-cuerpos ligan los virus y los concentran(Agrios, 1988). Posteriormente se lava. Laspartículas atrapadas pueden ser teñidasnegativamente o decoradas para ser exami-

nadas (ISEM-D). Si el virus va a ser decora-do, se aplica un segundo anticuerpo quepuede ser el mismo que se utilizó inicial-mente para tapizar la grilla u otro diferente.Las partículas decoradas tienen un halodistintivo alrededor del virus (McLaughlin yScott, 1986). Este es un método muy rápidoque mejora la observación de las partículasy permite obtener información sobre el gra-do de relación serológica, probando dilucio-nes seriadas de antisuero con virus homólo-gos y heterólogos (Koenig, 1988). Es ade-más un método muy sensible, en algunoscasos más que el test de ELISA (Mandahar,1981). La desventaja es que no resulta seruna técnica práctica a la hora de evaluar ungran número de muestras simultáneamente,por lo que no es adecuada para relevamientoso pruebas de rutina.

Las ventajas de ISEM sobre otras prue-bas serológicas son: clara observación delas características morfológicas de las par-tículas, requerimientos de menor título deantisuero y tolerancia a la presencia deanticuerpos contra proteínas normales de laplanta dada la observación directa. Es unatécnica eficiente en el caso de plantas conmuy pequeña concentración de virus y losresultados se obtienen en muy corto tiempo(Ducasse, 1997).

1.2 Enzimoinmunoanálisis: Test deELISA

La prueba de enzimoinmunoanálisis oELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay) es la técnica serológica más utiliza-da para la detección de virus dentro delgrupo de pruebas con moléculas indicadoras.Hay diferentes variantes de esta prueba.

En el caso del test de ELISA sandwich odirecto, el más adecuado para la detecciónen mezclas complejas como lo son los ex-tractos vegetales, los anticuerpos específi-cos son adsorbidos en los pocillos de unaplaca de poliestireno. La placa es lavadapara eliminar aquellos anticuerpos que nose han unido totalmente a ella. Luego seagrega la preparación viral o savia de unaplanta infectada, de la cual se unen aquellosantígenos reconocidos por los anticuerposadsorbidos. Aquellos que no se unen o son

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antígenos inespecíficos son lavados. Poste-riormente se adiciona una segunda prepara-ción de anticuerpos para el virus en estudio,conjugados con una enzima (normalmentefosfatasa alcalina o peroxidasa), comple-tando así el “sandwich” del anticuerpo. Elproducto coloreado puede medirsecolorimétricamente y los valores que se ob-tienen son proporcionales a la concentra-ción de virus en la muestra (Agrios, 1988).

También se ha aplicado a virus vegetalesel llamado ELISA indirecto, donde se detec-ta un anticuerpo específico unido al antígeno(virus) (McLaughlin y Scott, 1986). El com-plejo enzima-anticuerpo utilizado no reac-ciona contra el virus sino contra el sueronormal del animal en el cual se produjeronlos anticuerpos contra el virus. Losanticuerpos del complejo pueden ser porejemplo, anticuerpos anti-ratón producidosen otro animal como la cabra.

Las pruebas indirectas también difierende las pruebas directas en que el antígenose une directamente a la placa de poliestire-no. En estas pruebas la cuantificación se vedirectamente afectada por el proceso deesta unión. Debido a que la mayoría de lasproteínas sin distinción se unen a la placa depoliestireno, podría haber una competenciapor los sitios disponibles entre las proteínasdel huésped y los antígenos virales en losextractos crudos de plantas; además estasproteínas podrían bloquear los sitios antigé-nicos. Este fenómeno de interferencia fuedemostrado y limita el uso del ELISA indi-recto para cuantificar antígenos virales enextractos crudos. Puede ser muy útil comoherramienta de rutina en la detección devirus vegetales para el diagnóstico de enfer-medades virales y cuando la cuantificaciónno es necesaria (Agrios, 1988).

2. Plantas indicadoras

El diagnóstico de gran parte de las virosistradicionalmente se ha realizado por el estu-dio de reacciones en plantas extremada-mente sensibles a ciertos virus, por lo quereciben el nombre de plantas indicadoras(Amorim y Salgado,1995).Teóricamentecualquier planta tiene potencial para actuarcomo huésped indicador. Sin embargo, la

mayoría de los virus son capaces de infectarmiembros de pocas familias de plantas(McLaughlin y Scott, 1986).

En términos generales una planta eshuésped cuando un virus puede infectar suscélulas y replicarse en ellas (Dawson y Hilf,1992). Varias especies de los génerosNicotiana y Chenopodium son buenasindicadoras para virosis vegetales (Amorimy Salgado, 1995). Cuando los síntomas dedos virus en una única especie son simila-res, es posible distinguirlos utilizando otraespecie menos común (McLaughlin y Scott,1986).

La planta ideal para ser inoculada debeser lo suficientemente grande para facilitarsu transplante, pero al mismo tiempo lo másjoven posible para que la susceptibilidadsea máxima. En la inoculación de virus lapared celular debe romperse para permitirla transferencia de las partículas virales alhuésped a nivel de la membranacitoplasmática. En la inoculación mecánicaexperimental, la suspensión viral preparadacon un macerado de hojas infectadas ensolución tampón, es frotada sobre la super-ficie del huésped, en presencia de un abra-sivo como el carburo de silicio (carborundo),polvo de diatomeas (celita) o silicato demagnesio, cuya función es provocar peque-ñas heridas en las plantas (Amorim ySalgado, 1995). Se pueden agregar al tam-pón compuestos que preserven la integri-dad del virus y potencien así la infectividaddel mismo (Ducasse, 1997).

En el caso de que el virus y el huéspedensayados sean compatibles, el éxito de lainoculación dependerá de múltiples facto-res relacionados con el inóculo y la plantareceptora. En lo referente al inóculo, éstepuede variar de acuerdo a la planta donante,a la forma de preparación del mismo, y a lapresencia o ausencia de compuestosinhibidores de la infección o inactivadoresde virus presentes en la planta donante. Encuanto a los factores relacionados con laplanta receptora, estará influyendo el esta-do fisiológico de la misma y las condicionesdel cultivo. Los síntomas visibles pueden irdesde una leve disminución en el desarrollode la planta, desarrollo de varios tipos de


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mosaicos, moteados y lesiones locales asícomo otras desviaciones de las característi-cas normales de crecimiento, hasta la muer-te rápida de la planta.

Si bien la inoculación de especies hués-pedes puede dar algún indicio de la identi-dad del virus, las numerosas variables po-tenciales en el crecimiento de la planta y enel proceso de inoculación, la interacción deéstas con factores ambientales, la presen-cia de cepas de virus y/o infecciones mez-cladas, hacen que la identificación de unvirus en el huésped sea arriesgada. Losdatos obtenidos son más útiles e informati-vos cuando se emplean junto con resultadosde observaciones microscópicas de tejidos,ensayos serológicos y estudio de propieda-des bioquímicas y biofísicas del virus(McLaughlin y Scott, 1986).

MODOS DE TRANSMISIÓN DEVIRUS EN TRÉBOL ROJO

Los virus se transmiten de una planta aotra de diferentes maneras. Conocer losmecanismos de dispersión viral en el campoes esencial para el desarrollo de medidas decontrol satisfactorias. La transmisión puedeocurrir a través de material vivo, (por semi-lla, en propagación vegetativa o injertos);por acción mecánica (a través de herramien-tas o por la acción del pastoreo de animales)y a través de vectores biológicos (hongos,nemátodos y artrópodos, principalmente in-sectos).

1. Transmisión por semilla

La transmisión por semilla es importanteen el pasaje del patógeno de una generacióna la siguiente; sin embargo, no juega un rolen la propagación de virus de plantas enfer-mas a plantas sanas en la misma genera-ción. Esta forma de transmisión lleva a infec-ciones primarias y puede ser de gransignificancia ecológica para la perpetuación,perennación y diseminación viral (Johansenet al., 1994; McKirdy y Jones, 1997). Lasplántulas producidas por germinación desemillas infectadas sirven como fuente ini-cial de inóculo viral y foco de infección a

partir del cual el virus puede ser luego trans-mitido por insectos a otras plantas en elcampo (Bedendo, 1995). Por esta razón,aún una baja tasa de transmisión por semi-lla, junto con una diseminación secundariapor insectos vectores, puede resultar en laintroducción de virus en nuevas áreas y enla infección de plantas sanas desde focosprimarios del mismo cultivo y/o de pasturascercanas, durante la misma estación de cre-cimiento.

Si bien la transmisión por semilla fue, enun principio, considerada como un factorraro e insignificante en la epidemiología delas enfermedades virales, la cantidad dereportes para virus transmitidos de esta for-ma ha ido aumentando así como el númerode especies en las cuales ocurre este tipo detransmisión. Se ha probado que al menos untercio de los virus vegetales puedentransmitirse por semilla en al menos unhuésped (Stace-Smith y Hamilton, 1988).

El porcentaje de semilla infectada produ-cida por una planta individual varía enorme-mente, dependiendo del virus y de la plantahuésped involucrados, entre otros factores.Generalmente, la cantidad de semillas in-fectadas en un lote comercial es más bajaque el porcentaje de semillas infectadasoriginadas de una planta madre infectada.Esto se debe a que la proporción de semillascomerciales infectadas es diluida por semi-llas libres de virus, producidas por las plan-tas sanas del mismo cultivo.

La detección de virus en un lote de semi-llas puede ser directa, analizando una mues-tra representativa, o indirecta, mediante elensayo de plántulas germinadas de las se-millas a evaluar (Njeru et al., 1997). Noobstante, al evaluar una muestra de un lotede semilla no se puede determinar con pre-cisión cuál va a ser la proporción de plántulasinfectadas que se obtendrán al sembrar undeterminado número de semillas. En el casode virus contenidos dentro o sobre la cubier-ta de la semilla, los mismos pueden serinactivados durante la maduración de lasemilla. La incapacidad para sobrevivir a lamaduración de la semilla es una de lascausas de la no-transmisibilidad por estavía, y ha sido observada para AMV (Bailiss

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y Offei, 1990).

En términos epidemiológicos, la transmi-sión por semilla provee un punto de partidaideal para el establecimiento de una enfer-medad en un cultivo en el campo. Primero,facilita que la infección ocurra lo más tem-prano posible en el desarrollo de la plántula,un factor que determina la severidad de lainfección viral en una planta. Segundo, lainfección por semilla da por resultado plan-tas individuales infectadas, siendo cada unaun reservorio de virus para subsiguientesdiseminaciones secundarias por insectos.

2. Transmisión por áfidos

De los vectores biológicos de virus enplantas, el grupo más importante pertenecea los insectos, dentro del cual los másexitosos son los áfidos (o pulgones, orden:Homoptera, familia: Aphididae). Aún enpatosistemas con baja tasa de transmisiónviral por semilla, la transmisión subsecuentepor áfidos puede conducir a una alta inciden-cia viral en el cultivo (Garran y Gibbs, 1982).

La mayoría de los virus citados para tré-bol rojo en Uruguay son transmitidos poráfidos en forma no persistente, lo que impli-ca que los mismos se adquieren y transmi-ten muy rápidamente, a la vez que se pierdela capacidad de transmisión en un muy cortoperíodo de tiempo (Berger et al., 1987).

Una vez que los áfidos llegan a una hojarealizan pruebas (generalmente de menosde 30 segundos) para analizar la aptitud dela planta como fuente de alimento. Luego dela primer prueba, caminan hacia abajo ha-ciendo dos o tres pruebas más antes deinstalarse (Nault, 1997). No se conoce conexactitud el mecanismo de transmisión delos virus no persistentes, si bien es claro quelos procesos biológicos que definen la trans-misión están vinculados al comportamientode prueba (Collar et al., 1997).

Los áfidos o pulgones presentan aparatobucal del tipo pico-suctor, el cual es introdu-cido en la planta hasta los vasos cribososdel floema de donde adquieren el alimento(Minks y Harrewijin, 1987). El proceso de

transmisión puede completarse en un tiem-po muy breve, antes que el áfido sea elimi-nado por un insecticida u otra medida decontrol. Mientras que los insecticidas ac-túan sobre los áfidos luego de cierta canti-dad de horas, estos transmiten virus luegode probar por algunos segundos.

Dada la forma en que se transmiten es-tos virus resulta muy importante conocer elrol de los áfidos como transmisores, y cuá-les son las especies que constituyen unmayor riesgo, ya sea como dispersores den-tro de un cultivo con una fuente de inóculoendógena, o como transportadores de viruspresentes en otros cultivos como fuente deinóculo exógena.

En Uruguay, la producción de semilla detrébol rojo y trébol blanco se ha desplazadoa la región Este del país para obtener laaislación necesaria entre semilleros. Estasituación contrasta con la de la región Su-roeste, donde los sistemas de producciónlecheros y agrícola-ganaderos determinanuna continuidad geográfica de pasturas deleguminosas forrajeras, huéspedes comu-nes de diversas virosis y de sus insectosvectores. En dichas condiciones de produc-ción, es preciso establecer los mecanismosde transmisión viral y determinar su impor-tancia epidemiológica relativa.

En ambas regiones los áfidos represen-tan un riesgo para la sanidad de los cultivos.La gran capacidad de estos insectos espe-cialmente para transmitir virus no persisten-tes, plantea la necesidad de conocer mássobre la epidemiología de este tipo de enfer-medades.

RESEÑA DE LOS TRABAJOSREALIZADOS PARA EL ESTUDIODE LAS ENFERMEDADESVIRALES DEL TRÉBOLROJO

En esta publicación se describen los tra-bajos realizados a partir de 1994, en elmarco del proyecto “Manejo de enfermeda-


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des virales en trébol rojo”, a través del cualse ha obtenido información sobre los virusrelevantes y la importancia de los diferentesmodos de transmisión viral para el cultivo detrébol rojo en nuestro país.

1. Primera aproximación alproblema

Los objetivos de esta etapa fueron: de-terminar los principales virus involucrados,evaluar las técnicas para su diagnóstico,ajustar la metodología más adecuada parala detección de virus en trébol rojo en nues-tras condiciones y evaluar la eficiencia de latécnica de cultivo de meristemos como mé-todo de saneamiento de plantas de trébolrojo infectadas por virus.

En el capítulo 1 de la publicación sedescribe el trabajo de identificación de losvirus presentes en clones selectos del pro-grama de mejoramiento genético (germo-plasma seleccionado por buena persisten-cia). El diagnóstico se realizó por medio deensayos serológicos (ELISA, ISEM-D) y eluso de plantas indicadoras. En la mayoríade las plantas analizadas se determinó lapresencia de más de un virus. En base aestos resultados se inició un proceso desaneamiento mediante el cultivo in vitro demeristemos, trabajando junto con la Unidadde Biotecnología de INIA Las Brujas (Maesoet al., 1997). La finalidad del proceso demeristemación fue producir plantas libresde virus a partir de los clones selectos.

2. Estado sanitario de los cultivos

Una vez conocidos los virus que afecta-ban las plantas de trébol rojo del programade mejoramiento genético, se planteó lapregunta: ¿este diagnóstico refleja el esta-do sanitario del cultivo en las diferenteszonas productivas?

En el capítulo 2 de la publicación sepresenta el trabajo realizado a los efectosde contestar dicha pregunta (Veiga, 2001).En el mismo se realizó una evaluación a

campo a fin de cuantificar la incidencia delos virus descritos en el trabajo de Maeso etal. (1997) para diferentes zonas donde estápresente el cultivo, y se estudió la correla-ción entre los síntomas observados en elcampo y los virus presentes.

3. Detección de AMV y Potyvirus ensemilla y su transmisión aplántula

En la siguiente etapa se plantearon laspreguntas: ¿para los virus estudiados, cuáles el potencial de transmisión por semilla?¿cuál es la proporción de plántulas quepresenta infección viral derivada de la trans-misión por semilla?

En el capítulo 3 de la publicación sedescribe el trabajo realizado por Arias (2003)con el objetivo de contestar tales preguntas.Se evaluaron plántulas germinadas de se-milla de lotes comerciales y de plantas ma-dre con infección viral conocida. Se ajustóuna técnica para detección de virus en semi-lla, para facilitar el proceso de evaluación delotes de semilla de uso comercial. Para elcaso de AMV, se estudió la transmisión devirus a plántula a partir del mismo lote eva-luado con la técnica de detección en semilla.Finalmente, se evaluó la presencia de losvirus estudiados en semilla de otras espe-cies de leguminosas forrajeras.

4. Importancia de los áfidos en ladispersión viral

Al conocer la incidencia a campo de losvirus analizados y el rol de la transmisiónpor semilla surgieron las interrogantes:¿cómo evoluciona la infección viral a partirde las primeras plantas infectadas?, ¿cuá-les son los mecanismos por los que sediseminan en el cultivo las infeccionesvirales? y ¿cuál es el rol epidemiológico delos áfidos en la dispersión?

En el capítulo 4 de la publicación sereportan los resultados de la evaluación dela dispersión viral en el campo en cultivos detrébol rojo de primer y segundo año durante

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la primavera y el otoño (Arias, 2003; Bao,2003). Paralelamente, se presenta la infor-mación obtenida de la colecta de los áfidosalados presentes en la zona del cultivo estu-diado (INIA La Estanzuela, Colonia), en cuan-to a las especies encontradas y el número deindividuos (Bao, 2003).

5. Estudios de transmisión de AMVy Potyvirus por áfidos encondiciones controladas

Una vez conocidas las principales espe-cies de áfidos que arriban al cultivo se for-mularon las interrogantes: ¿cuál es la efi-ciencia de las especies colectadas comotransmisoras de los virus de interés?, ¿cuá-les son las principales especies colectadasen otros cultivos de leguminosas forrajerasque interaccionan con trébol rojo? Para ellose estableció un protocolo de cría y se rea-lizaron bioensayos de transmisión con tresespecies de áfidos en condiciones controla-das, lo cual se describe en el capítulo 5.Simultáneamente se colectaron áfidos me-diante trampas de agua en un cultivo detrébol rojo y uno de alfalfa (INIA Las Brujas,Canelones).

6. Conclusiones y perspectivas

Los principales resultados que surgen delos trabajos realizados, se presentan en elcapítulo 6 y se discute su utilidad para elmejor manejo y utilización de las legumino-sas forrajeras.

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INTRODUCCIÓN

Los trabajos realizados en el programade mejoramiento genético de trébol rojo delINIA, han permitido obtener materiales conmayor persistencia que el cultivar ‘LE 116’.Al incrementar la sobrevivencia de las plan-tas se registraron con frecuencia síntomasatribuibles a enfermedades virales (Figura1) (Rebuffo y Altier, 1996). En Uruguay, noexistían antecedentes de investigación enenfermedades causadas por virus en legu-

1. IDENTIFICACIÓN Y DIAGNÓSTICO DEVIRUS EN TRÉBOL ROJO

Maeso, D.1; Larsen, R.2; Altier, N.3

1 Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2 USDA-ARS, Irrigated Agriculture Research and Extension Center, EE.UU.3 Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

Figura 1. Síntomas atribuibles a virus en clones selectos de trébol rojo del programa demejoramiento genético del INIA, desarrollados por la infección con BYMV y AMV.

minosas forrajeras hasta 1994, momento enque el INIA comenzó un trabajo de identifi-cación y diagnóstico de virus presentes entrébol rojo (Maeso et al., 1997).

Este primer trabajo tuvo como objetivos:evaluar y ajustar técnicas eficientes para ladetección de virus en trébol rojo, identificarlos virus presentes en clones selectos delprograma de mejoramiento del INIA, anali-zar el estado sanitario de dichos clones y delos meristemos derivados de los mismos.

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MATERIALES Y MÉTODOS

1. Material vegetal

Se empleó un total de 87 clones de trébolrojo provenientes de planteles del programade mejoramiento genético del INIA y propa-gaciones in vitro (meristemos) derivadas deellos. Las plantas se mantuvieron en inver-náculo a prueba de insectos.

Para el ajuste de las técnicas de detec-ción de virus (serológicas y plantasindicadoras), se utilizó una muestra de 10clones. Posteriormente todos los clones ysus meristemos fueron analizados en el la-boratorio de virología del INIA Las Brujas.Paralelamente se enviaron muestras de 35clones con sus respectivos meristemos alDr. R. Larsen (USDA/IAREC, Prosser, WA,EE.UU.) para su análisis y así confirmar lasdetecciones realizadas en INIA Las Brujas.

2. Técnicas serológicas

En los análisis realizados en INIA LasBrujas se utilizaron las técnicas de ISEM-D(Milne y Luisoni, 1977) y ELISA indirecto(Lommel et al., 1982) (Anexo 1), empleandoantisueros crudos para los siguientes virus:Alfalfa mosaic alfamovirus (AMV), Whiteclover mosaic potexvirus (WCMV), Cloveryellow mosaic potexvirus (CYMV), Cloveryellow vein potyvirus (CYVV), Pea seed-borne mosaic potyvirus (PSBMV), Red clovernecrotic mosaic dianthovirus RCNMV (pro-cedencia: ATCC, Rockville, MD), PeSV (pro-cedencia: Dr. R. Larsen, Prosser, WA), Beanyellow mosaic potyvirus (BYMV) y Peanutstunt cucumovirus (PSV) (procedencia: Dr.S. Ghabrial, Lexington, KY). En todas laspruebas de ELISA indirecto, se utilizaroninmunogamaglobulinas anti-conejo conjuga-das con fosfatasa alcalina (SIGMA St. Louis,MO).

En las pruebas de ELISA realizadas porel Dr. R. Larsen en Estados Unidos se em-pleó el antisuero PSA 27200 (Agdia Inc.Elkhart, IN) para la detección de Potyvirus yel antisuero contra la cepa ATCC PV87 parala detección de PeSV.

3. Transmisión mecánica a plantasindicadoras

Se inocularon las siguientes plantasindicadoras: Catharantus roseum,Chenopodium amaranticolor, C. quinoa,Cucumis sativus cv. ‘National pickling’, Daturastramonium, Gomphrena globosa,Lycopersicum esculentum, Nicotiana glutino-sa, N. tabacum cv. ‘White Burley’, Phaseolusvulgaris cvs. ‘Black turtlesoup’ y ‘Top crop’,Tetragonia expansa, Trifolium incarnatum yVigna sinensis cv. ‘Black eye cowpea’. Lasmismas fueron seleccionadas siguiendo lasrecomendaciones para ensayo o diagnósticode Bercks (1971), Bos (1970, 1973), Hollingsy Stone (1974), Jaspars y Bos (1980), Mink(1972) y Varma (1970).

Las plantas fueron cultivadas en inver-nadero a prueba de insectos con control detemperatura y suplementación de luz y seinocularon en el momento adecuado paracada especie.

El inóculo usado correspondió a extrac-tos de 10 clones. Los extractos se inocula-ron en cada una de las plantas indicadoras.Las muestras frescas se conservaron enfreezer a -80° C hasta su inoculación. Elmaterial vegetal infectado se maceró en PB0.03 M pH 8.0 conteniendo Na-DIECA 4.5mg/ml y 2-ME 1.6 µl/ml. Para la inocula-ción, las hojas fueron espolvoreadas conabrasivo (carborundo 500-mesh) y se frotóel inóculo sobre las hojas con un trozo deesponja. Para el caso de G. globosa, P.vulgaris, V. sinensis y C. sativus (legumino-sas), el inóculo se frotó de la misma formapero sobre los cotiledones. Las plantas semantuvieron en las mismas condicionescontroladas bajo las cuales crecieron antesde la inoculación. Se observó y registró eldesarrollo de síntomas durante tres sema-nas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Mediante la técnica de ISEM-D se detec-tó la presencia de partículas que reacciona-ron con antisueros de los siguientes virus:AMV, WCMV, BYMV, CYVV, CYMV yPSBMV (Cuadro 1). Esta técnica, en nues-


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Indicadora Síntomas

Catharantus roseum Sin síntomas

Chenopodium amaranticolor Lesiones locales cloróticas y necróticas, aclaramiento de nervaduras

C. quinoa Lesiones locales necróticas, borde oscuro y centro claro

Cucumis sativus Lesiones locales cloróticas

Datura stramonium Lesiones locales cloróticas, moteado, mancha anular

Gomphrena globosa Lesiones locales necróticas, borde rojizo, moteado

Lycopersicum sculentum Sin síntomas

Nicotiana glutinosa Lesiones locales cloróticas y necróticas, moteado, mancha anular

N. tabacum Lesiones locales cloróticas, aclaramiento de nervaduras, mancha anular

Phaseolus vulgarisLesiones locales necróticas, borde rojizo, aclaramiento o necrosis de nervaduras, deformación apical

Tetragonia expansa Lesiones locales necróticas

Trifolium incarnatum Moteado internerval

Vigna sinensis Lesiones locales cloróticas y necróticas

Phaseolus vulgaris

AM

V

WC

MV

CY

MV

BY

MV

CY

VV

PS

BM

V

PeS

V

PS

V

RC

NM

V

Inf doble

Inf triple

ISEM-D 5 8 4 9 9 3 0 0 2 3 5ELISA 9 9 0 8 8 1 0 0 0 6 5

Cuadro 1. Detección de virus en plantas de trébol rojo por las técnicas serológicas de ISEM-D yELISA; número de resultados positivos en base a 10 clones evaluados del programa demejoramiento genético del INIA.

Figura 2. Partículas virales observadas al mi-croscopio electrónico por la técnicade ISEM-D. Partículas de BYMV a15000x, 0.48cm=100nm.

Cuadro 2. Descripción de síntomas observados en las plantas indicadoras ensayadas.

tras condiciones, permitió un diagnósticoconfiable, principalmente para virus de par-tículas filamentosas (Potyvirus, Potexvirusy Carlavirus) (Figura 2). Con la técnica de

ELISA se confirmó la detección de los virusmencionados, con excepción de CYMV, para elcual podría haberse observado decoración departículas de WCMV en ISEM-D por reaccióncruzada con antisuero de CYMV (WCMV tam-bién pertenece al grupo Potexvirus) (Cuadro 1).

El método de ELISA fue efectivo paradetectar la presencia de virus de partículasisométricas (por ej. AMV), de difícil obser-vación en nuestro laboratorio con la técnicade ISEM-D. En la mayoría de las plantasanalizadas se detectó la presencia de másde un virus, con infecciones dobles y aúntriples.

La inoculación en plantas indicadoraspermitió observar síntomas característicosde infecciones virales (Cuadro 2, Figura 3).No obstante, la ocurrencia de infeccionescompuestas no permitió una correcta aso-ciación de síntomas con la presencia de un

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Figura 3. Síntomas observados en plantas indicadoras. A) Phaseolus vulgaris cv. Black turtle soupinoculada con Potyvirus+AMV+WCMV presentó moteado y deformación de lámina, B)Chenopodium quinoa inoculada con WCMV presentó lesiones cloróticas, C) Chenopo-dium amaranticolor inoculada con Potyvirus+AMV presentó anillos cloróticos y aclara-miento de nervaduras, D)Gomphrena globosa inoculada con Potyvirus+AMV+WCMVpresentó lesiones locales necróticas con borde y deformación de lámina, E) Nicotianaglutinosa inoculada con Potyvirus+AMV+WCMV presentó lesiones locales necróticas y F)Nicotiana tabacum inoculada con Potyvirus+AMV+WCMV presentó lesiones localescloróticas y aclarado de nervaduras.

cmyk


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Nº plantas evaluadas 10 35 10 87Nº plantas libres de virus 0 2 6 39

virus en particular (McLaughlin et al., 1984).

Del análisis conjunto de resultados, sepuede concluir que AMV, WCMV y el grupoPotyvirus fueron los virus prevalentes en lasplantas estudiadas, con un valor de inciden-cia cercano al 80%. De acuerdo con losresultados de las técnicas de ELISA e ISEM-D, dentro del grupo Potyvirus los virus pre-dominantes fueron BYMV y CYVV. En lamuestra evaluada en Estados Unidos seobservó la prevalencia de los mismos viruscon valores de incidencia similares paraAMV y Potyvirus (Cuadro 3). En amboslaboratorios, en el material vegetal analiza-do no se detectaron los siguientes virus:Pea streak carlavirus (PeSV) y Peanut stuntcucumovirus (PSV).

En los análisis realizados en INIA LasBrujas, el 44.8% de las plantas obtenidaspor meristemación resultaron libres de virus(39/87 plantas) (Cuadro 3), correspondien-do 64.4% a plantas libres de Potyvirus, 49.4%a plantas libres de AMV y 49.4% de WCMV.

Cuadro 3. Porcentajes de infección viral registrados en plantas de trébol rojo provenientes de losclones selectos del programa de mejoramiento genético y de los meristemos obtenidospor micropropagación.

La evaluación realizada en Estados Unidosen base a 10 clones y sus respectivosmeristemos, arrojó resultados similares (60%de meristemos libres de virus: 6/10 plantas)(Cuadro 3).

En suma, los resultados obtenidos reve-lan una eficiencia importante de la técnicade micropropagación en trébol rojo para elsaneamiento de plantas infectadas. Los va-lores de obtención de meristemos saneadospara los diferentes virus ensayados son si-milares a los reportados en la bibliografía(Rupert y Collins, 1985; Servitova y Pokorny,1987, citados por Taylor y Quesenberry,1996).

Para conocer si la situación observadaen estas plantas provenientes de plantelesdel programa de mejoramiento genético re-flejaba lo que ocurre a nivel del cultivo co-mercial, surgió la necesidad de realizar unrelevamiento de campo en pasturas de tré-bol rojo, para determinar la incidencia yseveridad de las virosis detectadas, a nivel

a Testaje realizado por el Dr. Richard Larsen (USDA/IAREC, Prosser, WA, EE.UU.), en base a 10 clones y susrespectivos meristemos. Antisueros procedentes de AGDIA Inc. Indiana EE.UU.

b Testaje realizado por el Dr. Richard Larsen (USDA/IAREC, Prosser, WA, EE.UU.), en base a 35 clones.Antisueros procedentes de AGDIA Inc. Indiana EE.UU.

c Testaje realizado en INIA Las Brujas, Uruguay, en base a 87 meristemos. Antisueros procedentes de ATCC paraAMV, WCMV y CYVV-Potyvirus, antisuero procedente del Dr. S. Ghabrial para BYMV-Potyvirus. SD:Sin datos.

Virus 29/08/1995a 12/09/1995b 29/08/1995a 07/02/1996c

Potyvirus 80,0 85,7 20,0 35,6AMV 80,0 71,4 30,0 50,6

WCMV SD SD SD 50,6PSV SD 0 SD SD

RCVMV 20,0 5,7 0 SD

Plantas infectadas (%)Clones Meristemos

16


de chacra.

BIBLIOGRAFÍA


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17

2. RELEVAMIENTO Y CUANTIFICACIÓNDE LAS ENFERMEDADES VIRALES EN

CULTIVOS DE TRÉBOL ROJO

INTRODUCCIÓN

Luego de obtenidos los primeros resulta-dos sobre la detección de virus en plantasde trébol rojo del programa de mejoramientogenético del INIA, se buscó evaluar la im-portancia de los mismos en situaciones deproducción.

El presente trabajo describe unrelevamiento de campo de enfermedadesvirales que afectan al trébol rojo, como pri-mer etapa para definir estrategias para elmanejo del cultivo. Los objetivos específi-

Veiga, L.1; Maeso, D.2; Altier, N.3

1Lic. Bioq. Trabajo Especial II realizado en Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.3Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

Figura 1. Mapa de Uruguay en el cual se indi-can las regiones muestreadas para elrelevamiento de virus en cultivos detrébol rojo.

cos fueron: determinar la incidencia de lasprincipales virosis a nivel de chacra en lasdiferentes regiones productivas del país ydescribir los síntomas asociados a las infec-ciones virales (Veiga, 2001).


1. Relevamiento de campo

Durante setiembre a noviembre de 1998se muestrearon 16 cultivos de trébol rojo cv.LE 116 ubicados en los Departamentos deColonia, Flores, Lavalleja, y Treinta y Tres(Figura 1).

En cada cultivo se utilizó un diseño demuestreo al azar en “W” evaluando unasuperficie de 100 x 100 m. La unidad demuestreo consistió en un tallo (con sus co-rrespondientes hojas) y se recolectaron enla mayoría de los casos de 40 a 42 tallos porcultivo totalizando 660 muestras para elrelevamiento. Las muestras se guardaronen bolsas de plástico, y en conservadorapara su transporte al laboratorio, donde seanalizaron individualmente. La incidenciaviral fue determinada en base al número deplantas observadas con síntomas atribuiblesa enfermedades virales, sobre el total deplantas evaluadas por cultivo y se expresóen porcentaje.

Los síntomas encontrados en las plantasanalizadas fueron descritos detalladamentey se separaron en categorías (Anexo 2) pararelacionarlos posteriormente con los resul-tados obtenidos en el laboratorio. Se selec-cionaron 135 plantas con síntomasatribuibles a virus (algunas provenientes del

18


muestreo al azar y otras provenientes de unmuestreo dirigido) y se analizó la presencia dePotyvirus, AMV y WCMV porEnzimoinmunoanálisis (ELISA).

Se determinó el porcentaje de coinciden-cia entre el número de plantas donde sedetectó infección viral por ELISA para losvirus analizados y el número de plantassintomáticas (n=135). Con los resultados delos análisis serológicos se determinó la fre-cuencia relativa de los distintos virus estu-diados, siendo ésta el cociente del númerode plantas en las que se detectaron losdiferentes virus sobre el total de plantasanalizadas por ELISA.

2. Técnicas de diagnóstico enlaboratorio

2.1 Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

La presencia de Potyvirus, AMV y WCMVen el relevamiento se determinó por la prue-ba ELISA. Para Potyvirus se utilizó ELISAindirecto, y para AMV ELISA doble sandwich(DAS-ELISA), según lo recomendado por elproveedor de los reactivos (kits comercialesPSA 27200/0480 y PSA 87600/0480 AgdiaInc., Elkhart, IN) (Anexo 1). WCMV se ana-lizó por ELISA indirecto siguiendo el mismoprocedimiento que para Potyvirus (Lommelet al., 1982), pero no se utilizó un kit comer-cial. El antisuero para este virus (PVAS-190) se adquirió en American Type CultureCollection (ATCC, Rockville, MD) y el conju-gado de fosfatasa alcalina (8025A) en Sigma(St. Louis, MO, EE.UU.).

Las muestras de aproximadamente 1g detejido se colocaron en bolsas de polietilenoresistente y se trituraron obteniéndose así elextracto a analizar.

Se utilizaron placas de poliestireno de 96pocillos (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp F96,Nunc InterMed, Dinamarca), a los que seagregaron 100 ml de muestra. Las mismasse analizaron por duplicado. Los controlespositivos para Potyvirus y AMV fueron apor-tados por el kit comercial y para WCMV seutilizaron controles positivos de estudiosprevios. Los controles negativos correspon-dieron a tejido de plantas sanas analizadas

en estudios anteriores.

Los resultados del ELISA se registraronmidiendo la absorbancia a 405 nm en unlector Dynatech Laboratories Inc., modeloMR 700. Se tomaron como resultados posi-tivos aquellas muestras que presentaronvalores de absorbancia mayores al dobledel control negativo.

2.2 Microscopía electrónica inmuno-absorbente con decoración (ISEM-D)

Se seleccionaron muestras de siete plan-tas sintomáticas en las que se detectaronlos distintos virus por ELISA y se analizaronpor microscopía electrónicainmunoabsorbente (ISEM-D), usando elmétodo descrito por Derrick (1973) y pordecorado de las partículas virales (Milne yLuisoni, 1977). De esta manera se corrobo-ró la presencia de los virus detectados porELISA y se visualizó la forma de sus partícu-las (ver introducción, Capítulo 1 y Anexo 1).

Los virus analizados fueron BYMV,CYVV, Pea seed born mosaic potyvirus(PSBMV), AMV, WCMV y CYMV; se utiliza-ron antisueros crudos provenientes de ATCC(PVAS-368 para BYMV, PVAS-123 paraCYVV, PVAS-184 para PSBMV, PVAS-92para AMV, PVAS-190 para WCMV y PVAS-200 para CYMV).

2.3 Plantas indicadoras

Se utilizaron las plantas indicadoras re-comendadas para ensayo o diagnóstico porBercks (1971), Bos (1970, 1973), Hollings yStone (1974), Jaspars y Bos (1980), Mink(1972) y Varma (1970): Chenopodiumquinoa, C. amaranticolor, Nicotiana glutino-sa, N. tabacum cv. ‘White Burley’, Daturastramonium , Gomphrena globosa,Phaseolus vulgaris cvs. ‘Black turtle soup’ y‘Top crop’, Vigna sinensis cv. ‘Black eyecowpea’, Cucumis sativus cv. ‘Nationalpickling’, y Lycopersicum esculentumcv.‘Rutgers’.

El inóculo usado correspondió a extrac-tos de seis plantas sintomáticas recogidasen el campo y analizadas previamente porELISA para Potyvirus, AMV y WCMV. Los


19

Subtotal

LocalidadEdad del cultivo

(años)

Número de plantas

muestreadas (n=660)

Número de plantas con síntomas

Incidencia

visual (%)a

Número de plantas con (n=135) síntomas

seleccionadasb

Número de plantas ELISA

positivo

Coincidencia (%)c

(ELISA positivo/ síntomas)

Colonia 1 40 0 0 2 0 0 (0/2)Colonia 1 70 0 0 0 NSA SDColonia 1 71 0 0 0 NSA SD

181 0 0 2 0 0Colonia 2 41 12 29 9 9 100 (9/9)Colonia 2 40 11 28 14 14 100 (14/14)Colonia 2 40 8 20 16 11 69 (11/16)Colonia 2 40 7 18 10 10 100 (10/10)Colonia 2 70 12 17 8 7 87 (7/8)Colonia 2 0 SD SD 42 41 98 (41/42)Flores 2 43 9 21 9 9 100 (9/9)Flores 2 0 SD SD 6 6 100 (6/6)

274 59 133 114 107 94.3*Lavalleja 2 41 2 5 2 0 0 (0/2)Treinta y Tres 2 41 5 12 5 2 40 (2/5)Treinta y Tres 2 42 4 10 4 1 25 (1/4)Treinta y Tres 2 40 5 12 5 5 100 (5/5)Treinta y Tres 2 41 3 7 3 2 67 (2/3)

205 19 46 19 10 46.4*

Subtotal

Subtotal

Subtotal

resultados de la técnica de ELISA para cadauna de las plantas fueron: 1) Potyvirus + AMV+ WCMV, 2) Potyvirus + AMV, 3) Potyvirus +WCMV, 4) AMV, 5) WCMV y 6) testigo sindetección viral. Estos seis extractos se inocu-laron en cada una de las plantas indicadoras(ver introducción, Anexo 3) con la finalidad decorroborar las detecciones de laboratorio.

RESULTADOS

1. Relevamiento de campo

No se detectaron síntomas atribuibles aenfermedades virales en el muestreo al azarde cultivos de primer año, mientras que encultivos de segundo año se registró unaincidencia visual promedio de 12% (78/660)con un rango de 5 a 29% (Cuadro 1). La

incidencia varió de acuerdo a la región delpaís, con un promedio de 22% (17-29%) enel Oeste y 9% (5-12%) en el Este (Figura 2).

El porcentaje de coincidencia entre elnúmero de plantas en las que se detectaronvirus en el laboratorio y el número de plantascon síntomas atribuibles a virus por obser-vación visual fue alto. De las 135 plantassintomáticas seleccionadas para ser anali-zadas por ELISA, en el 86.7% (117/135) sedetectaron uno o más de los virus estudia-dos (Cuadro 2). En la región Oeste la coin-cidencia fue de 92.2%, y en la región Estefue de 52.6% (Figura 3). Los rangos decoincidencia, considerando solamente loscultivos de segundo año, fueron de 69 a100% para la región Oeste y de 0 a 100%para la región Este (Cuadro 1).

En el total de las muestras positivas, lamayor frecuencia correspondió a Potyvirus(94.0%, 110/117), seguido por AMV (43.6%,

a La incidencia visual se determinó en base al número de plantas con síntomas atribuibles a enfermedades a viruspor observación visual sobre el total de plantas evaluadas, y se expresó en porcentaje.

b Plantas sintomáticas obtenidas del muestreo al azar y de un muestreo dirigido.c La coincidencia se determinó en base al número de plantas en que se detectaron Potyvirus, AMV y/o WCMV

por ELISA sobre el total de plantas seleccionadas que presentaron síntomas, y se expresó en porcentaje.SD Sin datos.NSA No se analizó.* Valores promedio

Cuadro 1.Incidencia visual (%) de síntomas atribuibles a enfermedades a virus en cultivos de trébolrojo en cuatro departamentos de Uruguay y la coincidencia (%) entre plantas sintomáticase infección viral por Potyvirus (POTY), AMV y WCMV determinada por ELISA.

20


135 18 117 52 6 1 20 13 2513.3 (18/135) 86.7 (117/135) 44.4 (52/117) 5.1 (6/117) 0.9 (1/117) 17.1 (20/117) 11.1 (13/117) 21.4 (25/117)

Total Porcentaje (%)

POTY AMV WCMVPOTY +

AMVPOTY +

WCMV

POTY + AMV + WCMV

Colonia 1 2 2 0 0 0 0 0 0 0Colonia 2 9 0 9 3 0 0 1 4 1Colonia 2 14 0 14 0 0 0 1 4 9Colonia 2 16 5 11 5 0 1 2 2 1Colonia 2 10 0 10 10 0 0 0 0 0Colonia 2 8 1 7 7 0 0 0 0 0Colonia 2 42 1 41 3 6 0 15 3 14Flores 2 9 0 9 8 0 0 1 0 0Flores 2 6 0 6 6 0 0 0 0 0

116 9 107 42 6 1 20 13 25Lavalleja 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0

Treinta y Tres 2 5 3 2 2 0 0 0 0 0Treinta y Tres 2 4 3 1 1 0 0 0 0 0Treinta y Tres 2 5 0 5 5 0 0 0 0 0Treinta y Tres 2 3 1 2 2 0 0 0 0 0

19 9 10 10 0 0 0 0 0

LocalidadNo. de

plantas con deteción viral

No. de plantas en las que se detectób:Edad del cultivo (años)

No. de plantas

analizadas

por ELISAa

No. de plantas sin detección

viral

Subtotal

Subtotal

Figura 2. Incidencia visual promedioa ycoincidenciab de plantas con síntomasatribuibles a enfermedades virales encultivos de trébol rojo de segundo añopara dos regiones de Uruguay, expresa-das en porcentaje.a La incidencia se determinó mediante elcociente de plantas con síntomas atribuiblesa enfermedades a virus por observaciónvisual, sobre el total de plantas evaluadas,por cultivo (promedio para cada región).

bLa coincidencia se determinó mediante elcociente de número de plantas ELISApositivas sobre el número de plantasvisualmente sintomáticas (total para cadaregión).

a Plantas sintomáticas obtenidas del muestreo al azar y de un muestreo dirigido, seleccionadas para seranalizadas por ELISA (n=135).b POTY= Potyvirus, AMV= Alfalfa mosaic virus, WCMV= White clover mosaic virus

Cuadro 2. Detección de Potyvirus, AMV y WCMV en cuatro Departamentos de Uruguay en plantasde trébol rojo analizadas por ELISA.

Figura 3. Frecuencia relativaa dePotyvirus, AMV y WCMV en cultivos detrébol rojo de segundo año para dosregiones de Uruguay, expresada enporcentaje.a La frecuencia relativa se determinómediante el cociente de plantas conPotyvirus, AMV y/o WCMV sobre el total deplantas ELISA positivos para cada región.

POTY

AMV

WCMV

120

100

80

60

40

20

0

región oeste región este

POTY

AMV

WCMV

0

20

40

60

80

100

región oeste región este

Incidencia

Coincidencia

POTY +AMV

POTY +WCMV

cmyk


21

51/117) y por último WCMV (33.3%, 39/117)(Cuadro 2, Figura 3).

El 49.6% de las plantas en las que sedetectaron los virus estudiados presentóinfecciones múltiples, todas ellas corres-pondientes a cultivos de la región Oeste delpaís (Figura 4). El 28.2% presentó infeccio-nes dobles (17.1% AMV+Potyvirus, 11.1%Potyvirus+WCMV) y el 21.4% infección tri-ple (AMV+Potyvirus+WCMV); en ningúncaso se detectaron AMV y WCMV en lamisma muestra (Cuadro 2). En los cultivosde la región Este se encontró únicamenteinfección simple por Potyvirus (Figura 4).

De las plantas con infecciones simples lamayoría presentaron Potyvirus (44.4%);AMV se encontró en uno de los cultivosrelevados (5.1%) y WCMV en una únicaplanta (0.9%) (Cuadro 2).

Los síntomas encontrados en elrelevamiento de campo se describen en elAnexo 2 y aquellos más característicos semuestran en la Figura 5. Las plantas quemanifestaron distintos tipos de mosaicos(mosaico leve, mosaico, mosaico amarillo,mosaico “verde limón”), moteados (motea-do y moteado amarillo), clorosis (clorosisleve, clorosis nerval y anillos cloróticos) ynecrosis (necrosis, necrosis internerval ynecrosis nerval) siempre presentaron algu-

no/os de los virus en estudio. Las plantas enlas que se detectaron infecciones porPotyvirus presentaron como síntomas máscaracterísticos mosaicos (mayoritariamentemosaico “verde limón”), y en menor númeroclorosis (clorosis nerval y clorosisinternerval). La única planta en la que sedetectó infección simple por WCMV, pre-sentó rugosidad. En las plantas en que sedetectaron infecciones múltiples los sínto-mas más destacados fueron mosaicos (mo-saico leve, mosaico, mosaico amarillo, mo-saico “verde limón”) y necrosis internerval,apareciendo mosaico leve y mosaico amari-llo únicamente en este tipo de infecciones.En las plantas que presentaron bordes roji-zos y folíolos filiformes no se detectaronninguno de los virus estudiados. Tampocose encontraron virus cuando las plantaspresentaron como único síntoma folíolospequeños.

2. Técnicas de diagnóstico enlaboratorio

2.1 Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

En los análisis por ELISA de las plantassintomáticas de cultivos de primer año, pro-venientes del muestreo dirigido, no se de-

tectaron los virus estudiados. Encambio, en las plantas sintomáticasde segundo año se detectaron losvirus analizados en todas las locali-dades excepto en las muestras deLavalleja.

2.2 ISEM-D

Todas las muestras analizadaspor microscopía electrónica confir-maron los resultados obtenidos porELISA. En los casos en que se de-tectaron Potyvirus, se observó deco-ración de partículas filamentosasflexuosas con antisueros de BYMV,CYVV y PSBMV en ISEM-D. Tam-bién se observaron partículasfilamentosas, más cortas que las dePotyvirus, decoradas por antisueros

Figura 4. Frecuencia relativaa de infecciones simples ymúltiples en cultivos de trébol rojo de segundoaño para dos regiones de Uruguay, expresadaen porcentaje.

aLa frecuencia relativa se determinó mediante el cociente deplantas con infección viral simple o múltiple sobre el total deplantas ELISA positivos para cada región.

Infecciones múltip

Infecciones simple120

100

80

60

40

20

0 región oeste región este

Infecciones múltiples

Infecciones simples

22


Figura 5. Síntomas encontrados en plantas de trébol rojo en el muestreo al azar. A) clorosisinternerval y necrosis, B) clorosis y necrosis, C) mosaico verde limón y rugosidad, D)mosaico amarillo, E) aclaramiento de nervaduras y necrosis bronceada, F) mosaicoamarillo y necrosis nerval, G) mosaico verde limón, rugosidad y deformación de lámina,H) moteado, necrosis y deformación de lámina.

B

C D

E F

G H

A

cmyk


23

Planta Virus detectados por ELISA

Antisuero utilizado en ISEM-D

Observación de partículas decoradas

1 Potyvirus + AMV AMV SiWCMV Si CYMV SDWCMV SiCYMV SiCYVV Si

PSBMV SiCYVV Si

PSBMV NoBYMV SiCYVV No

PSBMV NoBYMV Si

7 WCMV WCMV Si

Potyvirus 5

6 Potyvirus

2

3

4

Potyvirus + WCMV

Potyvirus + WCMV

Potyvirus

Cuadro 3. Análisis por microscopía inmunoabsorbente con decoración (ISEM-D) de plan-tas de trébol rojo en las que previamente se detectaron virus por ELISA.

Figura 6. Partículas virales observadas al microscopio electrónico por ISEM-D a 15000 X. A y B)AMV a distintos aumentos, C) BYMV, D y E) WCMV a distintos aumentos, F) CYVV.

A

C

E

B

D

F

Sin dato

24


POTY (BYMV y CYVV) AMV WCMVChenopodium amaranticolor AC, A de N AC, A de N ACChenopodium quinoa LLC, DL LLC, A de N, DL LLCPhaseolus vulgaris cv. Black turtle soup MN, DL, NN Mo, N, NN, DL NPhaseolus vulgaris cv. Top crop LLN, NN LLN, NN LLN, NN

VirusPlanta indicadora

de WCMV y CYMV (Potexvirus) y partículasbaciliformes decoradas con antisuero deAMV (Alfamovirus) (Cuadro 3, Figura 6).

2.3 Plantas indicadoras

De las plantas indicadoras evaluadas,Chenopodium amaranticolor, C. quinoa,Phaseolus vulgaris cv. ‘Black turtle soup’ yP. vulgaris cv. ‘Top crop’, desarrollaron lossíntomas característicos de la infección porPotyvirus, AMV y WCMV (Cuadro 4). Enalgunas especies la inoculación no fueexitosa (Nicotiana glutinosa y N. tabacumcv. ‘White Burley’) y en otras no se desarro-llaron los síntomas característicos (Datura

el primer y segundo año, y se estabilizacuando el 30 a 50% de las plantas estáninfectadas.

En los cultivos de segundo año, la varia-ción registrada en la incidencia visual (5-29%) estuvo asociada a las dos regionesrelevadas. Los rangos de incidencia con-trastan marcadamente entre las dos regio-nes muestreadas (Este: 5-12% y Oeste: 17-29%), siendo comparables los valores den-tro de cada región. La incidencia promedioal Oeste del país (22%) fue más del dobleque al Este (9%). Estas regiones se carac-terizan por sistemas de producción diferen-tes. Colonia y Flores, al Oeste del país,

Cuadro 4. Síntomas característicosa observados en plantas indicadoras inoculadas con muestrasen las que se detectó previamente Potyvirus, AMV y WCMV por ELISA.

a De acuerdo a “Description of plant viruses. Commonw. Mycol. Inst./Assoc. Appl. Biol.”El desarrollo de síntomas se observó y registró periódicamente durante 3 semanas. AC = anillos cloróticos, Ade N = aclaramiento de nervaduras, DL = deformación de lámina, LLC = lesiones leves cloróticas, LLN =lesiones leves necróticas, Mo = moteado, N = necrosis, NN = necrosis nerval.

stramonium, Gomphrena globosa, Vignasinensis cv. ‘Black eye cowpea’, Cucumissat ivus cv. ‘National pickl ing’, yLycopersicum esculentum cv. ‘Rutgers’).

DISCUSIÓN

La ocurrencia de plantas con síntomasatribuibles a virus en cultivos de segundoaño, y su ausencia en cultivos de primeraño, confirma las observaciones realizadaspor Rebuffo y Altier (1996) en los plantelesdel programa de mejoramiento genético detrébol rojo. Jones y Diachun (1976) reporta-ron que las pasturas de trébol rojo másviejas tienen mayor cantidad de plantas in-fectadas que aquellas de primer o segundoaño. De acuerdo a Barnett y Diachun (1986),la incidencia de las enfermedades virales entrébol rojo se incrementa rápidamente entre

pertenecen a una región lechera, agrícola-ganadera y de producción de semillas, don-de tradicionalmente se instalan pasturas detrébol rojo y otras leguminosas, que deter-minan una continuidad geográfica de culti-vos forrajeros. En cambio, Treinta y Tres yLavalleja, ubicados al Este, corresponden auna región donde el cultivo de trébol rojo sedesplazó a los efectos de obtener aislaciónpara la producción de semilla. Las caracte-rísticas de las regiones pueden ser la causade que la infección viral de trébol rojo hayasido significativamente mayor en Colonia yFlores que en la región Este del país. Porotra parte, las infecciones múltiples sola-mente aparecieron en la región Oeste deUruguay.

El valor de coincidencia entre la determi-nación visual de plantas sintomáticas y eldiagnóstico en el laboratorio (sin considerar


25

el tipo de virus), fue alto (86.7%), si bien seobservó una variación importante entre loscultivos estudiados en cada región (Veiga,2001). En general, un porcentaje de coinci-dencia superior a 85% sugiere una correctaevaluación de los síntomas atribuibles aenfermedades virales. La brecha de aproxi-madamente 13% entre el diagnóstico delaboratorio y la incidencia calculada por es-timación visual se puede deber a diversosfactores. Algunos de los síntomas conside-rados en el relevamiento podrían no haberestado asociados a los virus estudiados.Por otro lado, la ausencia de infección viralen plantas sintomáticas se pudo deber a quela cantidad de virus en la planta no fuerasuficiente para ser detectado. En algunasplantas muestreadas los síntomas fueronleves. Si no se hubiesen evaluado comoplantas sintomáticas aquellas que presenta-ron síntomas muy leves (mosaicos muy le-ves) o dudosos (necrosis bronceada), o sín-tomas que no correspondieron a la infeccióncon los virus estudiados y que no se debíana plantas enfermas (bordes rojizos, folíolosfiliformes o folíolos pequeños como únicosíntoma), los valores de coincidencia proba-blemente hubieran sido cercanos a 100% enla mayoría de los cultivos evaluados. En esecaso, los valores de frecuencia relativa se-rían algo más bajos a los registrados (Veiga,2001).

En la región Este se manifestaron sínto-mas que no son los característicos de lainfección por Potyvirus, AMV y/o WCMV y,en otros casos, los síntomas fueron muyleves. Esta situación, y la baja incidenciaregistrada en los cultivos del Este, pudo serla causa de que en dicha región la coinci-dencia haya sido menor que la observada enla región Oeste (52.6% y 92.2%, respectiva-mente).

Se debe tener en cuenta que los sínto-mas causados por diferentes virus puedenser similares y que las infecciones múltiplesllevan al enmascaramiento de los síntomascausados por infecciones simples(McLaughlin et al., 1984). De esta manera,las enfermedades de tréboles ocasionadaspor virus no pueden distinguirse adecuada-mente sólo en base a sus síntomas. Lametodología de estudio para la detección

viral debe incluir diversos ensayos para res-paldar los diagnósticos (Stuteville y Hanson,1965). En este trabajo las técnicasserológicas de diagnóstico utilizadas fueronELISA e ISEM-D. Los anál isis pormicroscopía electrónica permitieron corro-borar los resultados obtenidos por ELISA,mostrando que esta última es una técnicaconfiable y eficiente para la detección deinfecciones virales. También se ensayaronplantas indicadoras para confirmar la utili-dad de la técnica de ELISA. En este ensayoalgunas plantas no manifestaron infecciónviral o no presentaron los síntomas caracte-rísticos. La ocurrencia de infecciones múlti-ples lleva al enmascaramiento de síntomas,como se mencionó anteriormente, o al desa-rrollo de nuevos síntomas. Los resultadosobtenidos en este trabajo muestran que elensayo de plantas indicadoras tienelimitantes para el diagnóstico cuando seencuentra presente más de un virus.

Las diferencias en los valores de inci-dencia y coincidencia entre ambas regio-nes, corroboran la importancia de estudiarlas variables epidemiológicas más relevan-tes de estas enfermedades, en función delos sistemas de producción característicosde cada región. La ocurrencia de transmi-sión de virus por semilla, como fuente deinfección primaria, y la eficiencia de losinsectos vectores, como mecanismo de di-seminación secundaria, pueden explicar lospatrones de incidencia y distribución de lasdiferentes virosis diagnosticadas.

De acuerdo a los resultados obtenidosen este trabajo, las plantas sintomáticaspresentaron mayoritariamente infección porPotyvirus (94.0%). La infección por AMV enplantas sintomáticas fue menor, y ademáscorrespondió mayormente a infecciones múl-tiples con Potyvirus, el cual surge comoprincipal responsable de los síntomas quepresentaron las plantas sintomáticas. Losvirus pertenecientes a este género se dise-minan en el campo por áfidos en forma nopersistente. Esto permite una rápida distri-bución de los mismos y lleva a que un cultivode trébol rojo se pueda infectar rápidamentesi se planta cerca de cultivos viejos detréboles o pasturas de leguminosas en susegundo o tercer año (Barnett y Gibson,

26


1975). Esto es lo que ocurre en la regiónOeste, bajo sistemas de producción leche-ros o ganaderos, donde existe una continui-dad geográfica de cultivos de leguminosasforrajeras perennes, huéspedes comunesde las virosis y de sus insectos vectores. Losresultados sugieren que AMV en la mayoríade los casos no produce síntomas atribuiblesa virus, o los mismos pueden quedar enmas-carados por la sintomatología que induce lainfección con Potyvirus. Al igual que losvirus del género Potyvirus, AMV se transmi-te por áfidos en forma no persistente, por loque se repiten las consideraciones anterio-res en cuanto a los mecanismos de disemi-nación viral, en una misma estación de cre-cimiento. La menor frecuencia de plantasdiagnosticadas con AMV, y su ausencia enla región Este, se podría deber a una eficien-cia diferencial en la diseminación por áfidos,hipótesis que requiere ser estudiada en pos-teriores investigaciones.

CONCLUSIONES

No se observaron síntomas atribuibles aenfermedades virales en los cultivos de pri-mer año muestreados al azar, mientras queen cultivos de segundo año se registró unaincidencia visual promedio de 12% (5-29%).El porcentaje de incidencia varió de acuerdoa la región evaluada, registrándose un pro-medio de 22% en la región Oeste del país(cultivos de trébol rojo para producción deforraje) y de 9% en el Este (cultivos de trébolrojo para producción de semilla).

De las 135 plantas sintomáticas selec-cionadas para ser analizadas por ELISA, enel 86.7% se detectaron uno o más de losvirus estudiados, lo cual indica un alto valorde coincidencia entre la determinación vi-sual de las plantas sintomáticas y el diag-nóstico de laboratorio.

En el 94.0% de las plantas de trébol rojocon infección viral se detectaron Potyvirus,en el 43.6% AMV y en el 33.3% WCMV. El49.6% de las plantas infectadas presentóinfecciones múltiples (28.2% infeccionesdobles y 21.4% triples), las cuales corres-pondieron a cultivos de la región Oeste. Encultivos de la región Este se encontró única-

mente infección simple por Potyvirus.

En las plantas que manifestaron distin-tos tipos de mosaicos, moteados, clorosis ynecrosis siempre se detectaron alguno/osde los virus en estudio.

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28



29

INTRODUCCIÓN

Al conocerse los virus presentes en tré-bol rojo en los relevamientos de campo, seplanteó la necesidad de definir la importan-cia y eficiencia de la transmisión de losmismos por semilla. Este mecanismo podríaestablecer un nivel inicial de inóculo en elcultivo y determinar su introducción a zonasnuevas.

El presente trabajo tuvo como objetivos:determinar la potencialidad de la transmi-sión de AMV y Potyvirus por semilla a plántulaen nuestras condiciones de producción, yajustar una técnica para la detección dedichos virus en semilla de trébol rojo, conalcance a otras especies de leguminosasforrajeras.


1. Detección de virus en plántula

Para determinar la transmisión de virusde semilla de trébol rojo a plántula se reali-zaron dos experimentos, empleando dosorígenes de semilla: a) lotes comerciales y

b) semilla cosechada de plantas madre coninfección viral conocida.

Para la detección en plántulas, las semi-llas se sembraron individualmente enalmácigos y se mantuvieron en invernaderoa prueba de insectos bajo condiciones con-troladas de temperatura y suplementaciónde luz. A los 45 días de la siembra, lasplántulas se cosecharon y analizaron engrupos de cinco, siguiendo el método des-crito en el capítulo anterior para la detecciónde AMV, Potyvirus y WCMV empleando eltest de ELISA (Veiga, 2001).

Las plántulas se cultivaron en INIA LaEstanzuela y los estudios de ELISA se rea-lizaron en INIA Las Brujas.

1.1 Semilla de lotes comerciales

En el primer experimento se analizaron1100 plántulas provenientes de semillas detrébol rojo de cinco lotes suministrados porcentros de recibo de los Departamentos deSalto, Colonia y Treinta y Tres (Calsal,Calprose e INIA, respectivamente) (Figura 1del Capítulo 2). La variedad, la edad delcultivo y la categoría de multiplicación desemilla correspondiente a cada lote se des-

3. DETECCIÓN DE AMV Y POTYVIRUSEN SEMILLA DE TRÉBOL ROJO Y SUS

IMPLICANCIAS EPIDEMIOLÓGICAS

1Lic. Bioq. Trabajo Especial II realizado en Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.3Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

Arias, M.1; Veiga, L.1;

Maeso, D.2; Altier, N.3

30


LE 116 Calsal Salto 1 Certificada 110LE 116 Calsal Salto 2 Comercial 115LE 116 Calprose Colonia 2 Comercial 110LE 116 Calprose Colonia 2 Comercial 115

INIA Mizar INIA Treinta y Tres 3 Madre 650

Categoría de multiplicación

de semilla

No. de plántulas analizadas a

Variedad Centro de recibo LocalidadEdad del

cultivo (años)

POTY + AMV + WCMV 7POTY + AMV 7POTY + WCMV 1POTY 2AMV 4

Infección viral en la

planta madreaNo. de plantas

madre

cribe en el Cuadro 1.

1.2 Semilla cosechada de plantasmadre con infección viral conocida

En un segundo experimento se analiza-ron 1610 plántulas provenientes de semillascosechadas de plantas con infección viral,que fueron sometidas a polinización contro-lada. Para ello, 21 plantas con síntomasvirales, recogidas en el campo y analizadaspreviamente por ELISA, se mantuvieron enuna carpa durante 60 días desde comienzode floración a la cosecha. Se colocaron dosmicro-colmenas de abejas para controlar lapolinización. Todas las plantas conteníaninfección viral por lo que el pool de polendisponible para la producción de semillaprovino de un 86% de plantas con AMV, un81% de plantas con Potyvirus, y un 38% deplantas con WCMV (Cuadro 2). La semillacosechada de nueve de las 21 plantas fue

utilizada para la obtención de plántulas (mo-mento de cosecha: verano de 1999).

2. Detección de virus en semilla

Para el ajuste de la técnica de detección,se utilizó semilla de trébol rojo de cinco lotessuministrados por el Laboratorio de Semi-llas de INIA La Estanzuela. La variedad, lacategoría de multiplicación, el orígen y elporcentaje de germinación correspondientea cada lote se describe en el Cuadro 3.

Se tomó como base la metodología em-pleada por Njeru et al. (1997). Las semillasfueron molidas en un mortero utilizando ni-trógeno líquido. Se partió de 10 gramos desemilla (aprox. 4000 semillas de trébol rojo)y luego se fue disminuyendo la cantidad deésta a la mitad hasta llegar a 0,3125 g (10g,5g, 2,5g, 1,25g, 0,625g, 0,3125g). Se agre-garon 3,2 ml de PBS-T por gramo de semillamolida, y esa suspensión se incubó en hielodurante 30 minutos para luego sercentrifugada a 6000 rpm por 10 minutos(HIMAC centrifuge, HITACHI, SCR20B). Elsobrenadante se transfirió a un tubo limpio yel pellet se descartó. Al sobrenadante se lehicieron diluciones sucesivas desde 1/2 has-ta 1/64 (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64) usan-do buffer de extracción. El objetivo de esteprocedimiento fue obtener la mínima canti-dad de semilla necesaria para detectar lainfección viral en un lote y encontrar la

Cuadro 1. Caracterización de cinco lotes de semilla de trébol rojo suministrados por centros derecibo de distintas regiones del país que fueron testados para la detección de virus enplántula.

a Las plántulas se analizaron por ELISA, en grupos de cinco plántulas de 45 días de edad.

Cuadro 2. Caracterización de 21 plantas con sín-tomas virales sometidas a polinizacióncontrolada en carpa con abejas.

aLa infección viral se determinó por ELISA. POTY=Potyvirus, AMV, WCMV.

a


31

Trébol rojo Estanzuela 116 98061177764A Fundación

CALVASE (Soc.

Corrales)94

Trébol rojo Estanzuela 116 98061177736A Fundación CALVASE

(Sr. Ardao) 89

Trébol rojo INIA Mizar 96177427 Madre INIA Treinta y Tres 8

Trébol rojo INIA Mizar Comercial INIA La Estanzuela 72

Trébol rojo INIA Mizar 98603 Madre Cufré 91

Trébol rojo INIA Mizar 0006317709 Madre Sr. Lauber 95

Trébol blanco Estanzuela Zapicán 002661777062 Fundación CALVASE 93

Trébol alejandrino INIA Calipso 00351177062 Comercial INIA La

Estanzuela 92

Alfalfa Estanzuela Chaná 99176177437 Fundación Sr. Uthermak 96

Lotus San Gabriel 9907177457 Fundación PAS S.A. 88

Origen Germinación (%) Especie Variedad Nº loteCategoría de

multiplicación de semilla

dilución en buffer a la cual se logra unadetección confiable de virus, eliminandointerferencias.

Las diluciones obtenidas se analizaronpor ELISA para AMV y Potyvirus. Comocontrol positivo se testaron plantas con in-fección conocida a las que se les realizó elmismo tratamiento que a las semillas.

Para la detección de virus en semilla, serealizaron tres experimentos con diferentesfuentes de semilla: a) lotes comerciales, b)semilla cosechada de plantas madre coninfección conocida y c) semilla de otrasespecies de leguminosas forrajeras.


Se partió de 0,6 gramos de semilla, loscuales fueron macerados en mortero connitrógeno líquido. A este macerado se leagregó PBS-T (3.2 ml de PBS-T por gramode semilla molida) y esa suspensión seincubó en hielo durante 30 minutos. Luego

se centrifugó a 6000 rpm por 10 minutos, elsobrenadante se transfirió a un tubo limpio yel pellet se descartó. Se realizó una dilución1/8 en buffer de extracción y se analizó cadamuestra en hoyos duplicados por ELISA(para detección de AMV y Potyvirus). Esteprotocolo fue el que se utilizó en los siguien-tes ensayos para detección en semilla.


En este experimento se analizó semillade trébol rojo cosechada de plantas coninfección viral sometidas a polinización con-trolada. Para ello, 25 plantas de trébol rojocon síntomas virales, recogidas en el campoy analizadas previamente por ELISA, semantuvieron en una carpa durante 60 díasdesde el comienzo de floración a la cose-cha. Se colocaron dos micro-colmenas deabejas para controlar la polinización. Las 25plantas contenían infección viral por lo que

Cuadro 3. Caracterización de los lotes de semilla de trébol rojo y otras leguminosas utilizados enlos distintos ensayos.

98536

32


el pool de polen disponible para la produc-ción de semilla provino de un 28% de plantascon AMV y un 96% de plantas con Potyvirus(momento de cosecha: verano de 2000). Separtió de 0.6 g de semilla y se analizó porELISA la presencia de Potyvirus y AMV.

2.3 Semilla de otras especies deleguminosas forrajeras

Se realizó el análisis de semilla de cincoleguminosas reportadas como huéspedespara AMV según Edwardson y Christie(1986): Medicago sativa (alfalfa), Lotuscorniculatus (lotus), Trifolium alexandrinum(trébol alejandrino), Trifolium repens (trébolblanco) y Trifolium pratense (trébol rojo)(Cuadro 3). Se partió de 0.6g de semilla decada especie y se procedió de la mismaforma que en el experimento anterior para ladetección de AMV por ELISA.

3. Detección de AMV en semilla y enplántula

A los efectos de validar la técnica dedetección de virus en semilla y en plántulade trébol rojo, se seleccionaron los lotes98061177764A y 98061177736A.

Siguiendo la metodología anteriormentedescrita para la detección en plántulas, sesembró semilla de dichos lotes. A los 45días, se procedió a la cosecha tomando doshojas trifolioladas por plántula, y se hicierongrupos de 10 plántulas cada uno. Se anali-zaron un total de 500 plántulas de cada lote(2 repeticiones de 250 plántulas) por la téc-nica de ELISA para detectar AMV. Paralela-mente se tomaron muestras de semilla delos lotes antes mencionados. Se hicieron 6repeticiones de molienda partiendo de 0.6gramos de semilla (aproximadamente 250semillas) siguiendo la metodología para ladetección de virus en semilla.

Las diluciones obtenidas se analizaron porELISA para AMV. Como control se testaron

plantas infectadas a las que se les realizó elmismo tratamiento que a las semillas.

RESULTADOS

1. Detección de virus en plántula


En ninguna de las 1100 plántulas anali-zadas provenientes de semilla de lotes co-merciales se detectaron los virus estudia-dos.


En las plántulas obtenidas de semillas deplantas madre con infección conocida, sedetectó AMV, Potyvirus y WCMV con ran-gos variables de ocurrencia: AMV (0.5-14.3%), Potyvirus (1.4-18.8%) y WCMV (2.8-87.5%) (Cuadro 4).

Se encontró AMV en plántulas prove-nientes de cinco de las siete plantas madresen las que este virus había sido detectado,siendo consistente la ocurrencia de trans-misión. Se detectó Potyvirus en la progeniede dos de las siete plantas madres en lasque se habían detectado previamente, y enun caso en que no se habían encontrado enla planta madre. WCMV se detectó en laprogenie de dos de las tres plantas madreen las que había sido detectado, y tambiénen casos en que este virus no estaba pre-sente en la planta madre (Cuadro 4).

2. Detección de virus en semilla


En el experimento que se realizó paraajustar la técnica para la detección de virusen semilla de trébol rojo, no se detectópresencia de Potyvirus en ninguno de loslotes estudiados, mientras que sí se detectópresencia de AMV en alguna de las dilucio-


33

Cuadro 4. Detección de Potyvirus, AMV y WCMV por la técnica ELISA en plántulas de trébolrojo de 45 días de edad provenientes de semillas de plantas donde estos virushabían sido detectados previamente.

aNueve de las 21 plantas madres que fueron sometidas a polinización controlada se analizaron por ELISAdeterminando la presencia de Potyvirus, AMV y/o WCMV.

bSe analizaron por ELISA las plántulas provenientes de semillas cosechadas de plantas madres quecontuvieron los virus en estudio. Fueron ensayadas en grupos de cinco plántulas.

c Porcentajes calculados considerando que una o todas las plántulas analizadas del grupo de cinco fueranpositivas.

NSA: no se analizó.

Cuadro 5. Detección de AMV en semilla por ELISA en cinco lotes de trébol rojo evaluados endiferentes diluciones.

nes (Cuadro 5).

Se eligieron los lotes 96177427,98061177736A y 98061177764A para estu-diar la detección de AMV en semilla, partiendode distintas cantidades de muestra y analizan-do distintas diluciones. El primer lote fue elmismo que utilizó Veiga (2001) para la detec-ción de virus en plántula. Los otros dos lotesfueron seleccionados por haberse detectadoAMV en todas las diluciones en el experimen-

to de ajuste de metodología. Los resultadosse muestran en el Cuadro 6.

Fue posible detectar virus en semilla detrébol rojo partiendo de 250 semillas comomínimo y haciendo diluciones de 1/4, 1/8 y1/16. La dilución en la cual se obtuvo mayordiferencia entre la absorbancia 405 nm de la

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

96177427 + + + - - -98536 - + - - - -98603 + + - - - -

98061177764A + + + + + +98061177736A + + + + + -

DiluciónLote ensayado

AMV 185 1.6 - 8.1 1.6 – 5.4 3.8 – 18.9AMV 205 0.5 – 2.4 0 0Potyvirus 65 NSA 0 NSAPotyvirus 195 0 0 NSAPotyvirus + AMV 270 1.5 – 7.4 0 3.3 – 16.7Potyvirus + AMV + WCMV 160 0 0 NSAPotyvirus + AMV + WCMV 210 2.8 – 14.3 1.4 – 7.1 2.8 – 14.3Potyvirus + AMV + WCMV 240 0 0 17.5 – 87.5Potyvirus + AMV + WCMV 80 1.2 – 6.2 3.8 – 18.8 0

Porcentajes mínimo-máximo de

detección por ELISAc

Virus detectados previamente

en la planta madrea

No. de plántulas

analizadasbAMV POTY WCMV

34


Cuadro 6. Detección de AMV en semilla por ELISA en tres lotes de trébol rojo. Se realizarondiluciones seriadas y se partió de distintas cantidades de muestra.

muestra y el testigo en la prueba ELISA fue1/8 (datos no presentados). En el lote 96177427hubo problemas para detectar virus usando1,25 y 2,5 g de muestra (Cuadro 6 a).

Si se asume que al detectarse virus enuna muestra de 250 semillas hay por lomenos una semilla infectada, el porcentajemínimo de transmisión detectable sería 0,4%.Si se hace el mismo cálculo partiendo de4000 semillas se obtiene un porcentaje de0,025%. Por lo tanto, de acuerdo a este expe-rimento la estimación del rango de porcentajemínimo de infección por AMV detectado ensemillas de trébol rojo sería de 0,025 a 0,4%.


En las semillas obtenidas a partir deplantas madre infectadas con AMV se de-tectó la presencia de este virus. Sin embar-go, no se detectó Potyvirus en las semillasprovenientes de plantas infectadas con di-cho virus.

2.3 Semillas de otras especies deleguminosas forrajeras

GramosNº aprox. semillas

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

10 4000 + + + + + +5 2000 + + + + - -

2,5 1000 - + + + + -1,25 500 - + + + - -

0,625 250 + + + + - -0,3125 125 + + - - - -

(c) Lote 98061177764A

Dilución


1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

10 4000 + + + + + -5 2000 + + + + - -

2,5 1000 + + + + + -1,25 500 - + + + + -

0,625 250 + + + + + +0,3125 125 + + + + - -

(b) Lote 98061177736ADilución


1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

10 4000 + + + - - -5 2000 - + + - - -

2.5 1000 - - - + + -1.25 500 - - - - - -

0.625 250 + + + - - -0.3125 125 - + + + - -

(a) Lote 96177427Dilución


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EspecieGramos de

semilla testada

Nº aprox. de semillas

analizadasResultado

Alfalfa 0,6 g 250 AMVTrébol blanco 0,6 g 770 AMV

Trébol alejandrino 0,6 g 220 - Lotus 0,6 g 420 -

Trébol rojo 0,6 g 300 AMV

Cuadro 7. Detección de AMV por ELISA en semilla de alfalfa,trébol blanco, trébol alejandrino, lotus y trébol rojo.

De las cinco leguminosas testadas, sedetectó AMV en la semilla de alfalfa, trébolblanco, y trébol rojo (Cuadro 7). Los resulta-dos de ELISA fueron negativos para trébolalejandrino y lotus.

3. Detección de AMV en semilla y enplántula

En todas las muestras de semilla anali-zadas de los lotes 98061177764A y98061177736A se detectó AMV, usando seisrepeticiones de molienda a partir de 0.6gramos de semilla de trébol rojo, a unadilución de 1/8. Sin embargo, no se detectóAMV en ninguna de las 500 plántulas anali-zadas, provenientes de los lotes anteriores,a los 45 días de la siembra.

DISCUSIÓN

En los análisis de plántulas provenientesde semilla de lotes comerciales no se detec-taron los virus estudiados. En un estudiorealizado por McKirdy y Jones (1998) endistintas especies de Trifolium, se encontra-ron bajos niveles de transmisión viral (0.03%,calculado en base a 3000 semillas testa-das). Los resultados sugieren que si en estetrabajo se hubiese analizado un mayor nú-mero de plántulas se podría haber detectadoinfección viral.

En el estudio de semillas provenientes deplantas madre con infección conocida, seobservó transmisión de AMV, Potyvirus yWCMV, con rangos variables de ocurrencia.

Los porcentajes de transmisión encontra-dos para WCMV fueron muy altos si seconsidera que no es común su transmisiónpor semilla (Johansen et al., 1994), a pesarde existir un reporte (Hampton, 1963). Estevirus se transmite principalmente en formamecánica por inoculación de savia,diseminándose al tocar las plantas sanascon material de plantas infectadas (Barnetty Diachun, 1986). La alta detección de WCMVsugiere la ocurrencia de contaminaciónmecánica como consecuencia del manteni-miento de las plantas en el invernadero,situación reportada por McLaughlin y Boykin(1988). En menor proporción se detectaronAMV (0.5-14.3%) y Potyvirus (1.4-18.8%).En particular, se destaca la consistencia detransmisión de AMV, que fue detectado en laprogenie de cinco de las siete plantas madreensayadas, infectadas con AMV. Por el con-trario, la ocurrencia de transmisión dePotyvirus no fue consistente, detectándosesólo en la progenie de dos de las sieteplantas madre ensayadas, infectadas conPotyvirus. Se debe considerar que las plan-tas madre de estas semil las fueronpolinizadas con polen proveniente de plan-tas infectadas. Esto se traduce en la exis-tencia de un pool de polen que provino deplantas que contenían AMV (86%) yPotyvirus (81%). En los casos donde lasplántulas presentaron infección por virusque no contenía la madre, este pudo prove-nir del polen, explicando así la ocurrencia depositivos con madres negativas para deter-minado virus. La transmisión de virus porpolen no es común y ocurre con unos pocos

36


virus (Agrios, 1988). La frecuencia de trans-misión del virus a la plántula es mayor através del óvulo que por medio de poleninfectado (Mink, 1993). Sin embargo, enalfalfa se ha visto que AMV se transmite porsemilla más frecuentemente a través delpolen que del óvulo (Frosheiser, 1974;Hemmati y Mc Lean, 1977).

La comprobación de transmisión por se-milla, especialmente de AMV y de Potyvirus,confirma la importancia de este mecanismopara la perpetuación y diseminación viral, ypara establecer las infecciones primarias(Johansen et al., 1994; McKirdy y Jones,1997). Es particularmente relevante el rolque puede tener este mecanismo en la intro-ducción de virus en nuevas áreas de cultivo,como puede ocurrir en la región Este delpaís.

Posteriormente, en los estudios realiza-dos en semilla, no se detectó presencia dePotyvirus en la semilla proveniente de lotescomerciales analizados, ni en la semilla pro-veniente de plantas madre infectadas condicho virus. McKirdy y Jones (1998) no de-tectaron transmisión por semilla en T.pratense, si bien reportaron este tipo detransmisión en otras especies de Trifolium.

Con el ajuste de la metodología para ladetección de virus en semilla, se observóinfección con AMV tanto en la semilla de loslotes comerciales como en la semilla cose-chada de plantas infectadas con este virus.Sin embargo, no se puede afirmar que de-tección en semilla sea sinónimo de infecciónen plántula.

En los ensayos para determinar la trans-misión por semilla a plántula a los 45 días desembradas las mismas, no se detectó pre-sencia de AMV en ninguna de las 500plántulas analizadas. La falla para detectartransmisión por semilla no debe ser tomadacomo un indicativo de no-transmisión, debi-do a que un testaje de mayor número deplántulas podría haber resultado en detec-ción de infección viral.

La mayoría de los virus transmitidos porsemilla se encuentran en todo el tejido de lasemilla, pero el factor crítico que permite latransmisión a la progenie normalmente essu habilidad para invadir y sobrevivir en el

embrión. Otros virus que no son comúnmen-te transmitidos por semilla están alojadosen la cubierta de ésta. Por tanto, se conside-ra que la verdadera transmisión es la trans-misión embrionaria (Walkey, 1991).

La incapacidad para sobrevivir a la ma-duración de la semilla es una de las causasde la no-transmisibilidad por esta vía. Bailissy Offei (1990) observaron la inactivación deAMV en la cubierta de las semillas durantela maduración de las mismas. El éxito y lacantidad de transmisión por semilla depen-den también de la cepa del virus. Latransmisibilidad por semilla de diferentescepas de un virus puede diferir incluso en elmismo cultivar (Shepherd, 1972). SegúnFrosheiser (1974), la transmisión por semi-lla de AMV varía considerablemente entrelas diferentes cepas. Pathipanawat et al.(1997) reportaron porcentajes de transmi-sión por semilla que van desde 0 a 77% enespecies del género Medicago.

Montenegro y Castillo (1996) estudiaronla transmisión por semilla de Maize Chloroticmottle virus en maíz. Detectaron virus en lassemillas pero no detectaron transmisión porlas mismas. Ellos proponen alguna de lassiguientes causas para explicar este hecho:a) la inactivación del virus por el bajo nivelde humedad, b) la acción de sustanciasinhibidoras de la infección, c) la probabledegradación del ácido nucleico por acciónde ribonucleasas.

Los mecanismos de inactivación de virusen semilla son aún desconocidos, pero es-tán probablemente asociados a los cambiosfisiológicos durante la maduración de la se-milla. Se reportan como ejemplo, la reloca-lización de nutrientes, la cesación de activi-dades celulares, y el aumento de la concen-tración de componentes inhibitorios talescomo fenoles y quinonas durante la deshi-dratación (Johansen et al., 1994).

Los análisis de detección de AMV ensemillas de otras leguminosas forrajerashuéspedes para este virus, dieron positivopara alfalfa y trébol blanco, además de tré-bol rojo. Frosheiser (1974) detectó infecciónde AMV en semilla de lotes comerciales dealfalfa; además, Hemmati y McLean (1977)


37

encontraron porcentajes de transmisión porsemilla en alfalfa de hasta un 10,3%. Latransmisión de AMV por semilla está biendocumentada en alfalfa (Frosheiser, 1974;Mandahar, 1981; Hemmati y McLean, 1977),pero los reportes de transmisión para trébolrojo no son concluyentes. Si bien Stuteville(1964) no reporta transmisión, Veiga (2001)observó rangos de transmisión por semillade 0.5-14.3% al analizar plántulas de trébolrojo provenientes de semillas de plantasmadre infectadas con AMV.

La comprobación de detección en semi-lla de AMV confirma la importancia de estemecanismo para la perpetuación y disemi-nación viral. Las semillas infectadas jueganun rol importante en la epidemiología deAMV y pueden ser la fuente de inóculoprimaria responsable de la introducción devirus en nuevas áreas de cultivo. Por elcontrario, los resultados del presente traba-jo indican una escasa importancia de latransmisión por semilla en la diseminaciónde Potyvirus.

Los valores de frecuencia relativa deinfección por Potyvirus y su dispersión ge-neralizada en el campo reportados por Veiga(2001) sugieren que el principal mecanismode transmisión es a través de pulgones. Latransmisión por insectos cumple una fun-ción fundamental en la propagación de virusde plantas enfermas a plantas sanas en lamisma generación. Los insectos no sola-mente pueden introducir un virus a un culti-vo (infección primaria) sino que además lotransmiten desde plantas infectadas a plan-tas sanas dentro de la misma generación ydurante la misma estación de crecimiento(infecciones secundarias).

Surge así la necesidad de estudiar laeficiencia de los pulgones como transmiso-res de virus, para explicar la dispersión dePotyvirus en el campo.

CONCLUSIONES

La ocurrencia de transmisión por semillapudo ser confirmada por la detección devirus en plántulas provenientes de semillasde plantas madre con infección conocida,con rangos variables de ocurrencia: AMV

(0.5-14.3%), Potyvirus (1.4-18.8%) y WCMV(2.8-87.5%).

La metodología ajustada por Arias (2003)permitió detectar AMV tanto en semilla delotes comerciales de trébol rojo como ensemilla cosechada de plantas madre infec-tadas con dicho virus. Sin embargo, no sepudo confirmar la transmisión viral a partirde dicha semilla ya que en los ensayos enplántula no se detectó AMV.

En ninguna situación se detectó presen-cia de Potyvirus en semilla. Los valores defrecuencia relativa reportados por Veiga(2001) y la dispersión generalizada dePotyvirus en el campo señalan claramenteel rol principal de los insectos vectores en latransmisión viral. En el caso específico deAMV la transmisión por semilla también pue-de cumplir un rol relevante en la introducciónde los mismos a nuevas áreas de cultivo.

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39

INTRODUCCIÓN

En el presente capítulo se reportan losresultados del trabajo realizado para eva-luar el progreso de la dispersión de virus enel campo a partir de plantas de trébol rojocon infección viral conocida. El estudio secomplementó con la colecta y conteo deáfidos totales, así como la identificación delas principales especies (Arias, 2003; Bao,2003).

Los objetivos específicos del trabajo fue-ron: estudiar la evolución de la dispersiónviral en función del tiempo y del espacio, apartir de un número dado de plantas infecta-das, conocer las especies de pulgones quearriban a un cultivo de trébol rojo y registrarsu dinámica poblacional durante un cicloproductivo.


1. Estudio de la dispersión viral enel campo

Durante noviembre de 1999 a diciembredel 2000 fueron muestreados tres cultivosde trébol rojo ubicados en la Estación Expe-rimental Alberto Boerger, INIA La Estanzuela,en el Departamento de Colonia.

Se evaluó la evolución de la infecciónviral por Potyvirus y por AMV (alfalfa mosaicvirus) a partir de plantas con infección cono-cida (plantas foco), ubicadas en puntos dife-rentes de los cultivos en estudio. En torno acada planta foco se marcaron tres circunfe-rencias concéntricas a las distancias radia-les de 1, 2 y 3 metros. Se identificaron cuatroplantas en la primera circunferencia (segúnlos cuatro puntos cardinales), ocho en lasegunda y ocho en la tercera (según lospuntos cardinales y también puntos inter-medios) (ver Figura 6). A estas 20 plantas selas llamó plantas muestreadas (plantas M).Se tomaron muestras de la planta foco, delas 20 plantas M y de aquellas plantas consíntomas atribuibles a infección viral que seencontraran en las tres circunferenciasconcéntricas (plantas sintomáticas o plan-tas S). Para ello, se colocó el extremo de unhilo en la ubicación de cada planta foco conmarcas a 1, 2 y 3 metros desde el centro, yse fue girando a lo largo de las circunferen-cias buscando las plantas sintomáticas. Paracada planta a ensayar se extrajeron cincohojas, las que se envolvieron en papel hú-medo y se colocaron en bolsas plásticas,siendo luego trasladadas al laboratorio enuna caja de material aislante con refrigeran-te para evitar su marchitamiento. Las plan-tas muestreadas fueron marcadas con pin-

4. DISPERSIÓN DE AMV Y POTYVIRUSEN CULTIVOS DE TRÉBOL ROJO Y

SU RELACIÓN CON ÁFIDOSCAPTURADOS EN TRAMPAS DE AGUA

Bao, L.1; Arias, M.2; Carballo, R.3;

Maeso, D.4; Altier, N.5

1Lic. Bioq., Protección Vegetal, Facultad de Agronomía, UDELAR.2Lic. Bioq., Trabajo Especial II realizado en Protección Vegetal, INIA Las Brujas.3Ing.Agr., Protección Vegetal, Facultad de Agronomía, UDELAR.4Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.5Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

40


tura en aerosol para asegurar la identidad decada una de ellas en el campo.

1.1 Primavera/1999

En una primera etapa, desde noviembrede 1999 a enero del 2000 (que se menciona-rá de aquí en adelante primavera/1999), semuestrearon dos cultivos de trébol rojo, unode primer año y uno de segundo año. Losmomentos de muestreo para esta etapa fue-ron tres: 8/11/99, 29/11/99 y 3/1/00.

En el cultivo de primer año se estudió unsolo foco (TR1 FOCO 1). Debido a que en elcultivo seleccionado para el estudio no sedetectaron plantas sintomáticas, setransplantaron a este cultivo cuatro plantasinfectadas provenientes del laboratorio, delas cuales se seleccionó como foco (fuentede inóculo) una planta con diagnóstico posi-tivo para Potyvirus por la prueba de ELISA.En este cultivo se determinó una densidadde 37 plantas/m2 (F. Formoso, 2003, comu-nicación oral), lo que equivale aproximada-mente a 38, 72 y 109 plantas evaluadas enlas circunferencias de 1, 2 y 3 m de radio,respectivamente.

En el cultivo de segundo año se evalua-ron dos focos (TR2 FOCO 1 y TR2 FOCO 2).La infección viral de las dos plantas focoseleccionadas fue diagnosticada por la prue-ba de ELISA, presentando AMV y Potyvirusel foco 1 y Potyvirus el foco 2. En este cultivose estimó una densidad de 20 plantas/m2 (F.Formoso, 2003, comunicación oral), lo queequivale aproximadamente a 21, 39 y 59plantas evaluadas en las circunferencias de1, 2 y 3 m de radio, respectivamente.

1.2 Otoño/2000

En una segunda etapa, desde abril ajunio de 2000 (que se mencionará de aquí enadelante otoño/2000) se utilizó la mismametodología, trabajando con tres focos devirus en un cultivo de segundo año (TR2FOCO 3, TR2 FOCO 4 y TR2 FOCO 5). Lainfección viral de las tres plantas foco selec-cionadas fue diagnosticada por la prueba deELISA. Las plantas foco 3 y 5 presentaronPotyvirus, y la planta foco 4 presentó dobleinfección Potyvirus-AMV. En este cultivo de

trébol rojo se estimó una densidad de 33plantas/m2 (F. Formoso, 2003, comunica-ción oral), resultando en 34, 64 y 97 plantasevaluadas en las circunferencias de 1, 2 y 3m de radio, respectivamente. Los momentosde muestreo fueron 25/4/00, 25/5/00 y 19/6/00.

1.3 Primavera/2000

En una tercera etapa, desde octubre hastadiciembre de 2000 (que se mencionará deaquí en adelante primavera/2000) se siguióla evolución de la infección viral por Potyvirusy por AMV en el cultivo de trébol rojo desegundo año, en base a los tres mismosfocos evaluados en otoño/2000 (TR2 FOCO3, TR2 FOCO 4 y TR2 FOCO 5), siendo losmomentos de muestreo 30/10/00, 20/11/00,11/12/00. Al igual que en el otoño/2000, seestimó una densidad de 33 plantas/m2.

En todas las etapas de evaluación, parael cálculo del número de plantas evaluadasen cada circunferencia se consideró la esti-mación de la densidad de plantas y se utilizóel diseño gráfico de una cuadrícula a escala.En dicha cuadrícula se representó la ubica-ción de las plantas de acuerdo a la densidadregistrada en el cultivo, y se trazaron las trescircunferencias concéntricas. Se consideróentonces como número de plantas evalua-das (posibles de ser muestreadas), al totalde coincidencias entre los puntos de la cua-drícula que representan plantas y cada unade las circunferencias, sumándole ademásla planta foco.

En las tres etapas, para todos los focos ytodos los momentos de muestreo, se deter-minó la incidencia de infección viral como elporcentaje de plantas infectadas sobre eltotal de plantas con posibilidad de sermuestreadas (total de plantas en las trescircunferencias más la planta foco).

Los focos se dividieron en cuadrantes afin de evaluar la dispersión espacial de losvirus. El cuadrante 1 corresponde a la cuar-ta porción NW del foco, que incluye a lasplantas que se ubican en la línea que une lospuntos 1, 5 y 13; el cuadrante 2, de orienta-ción NE, incluye las plantas que se ubicanen la línea que une los puntos 2, 7 y 15; el


41

cuadrante 3, orientado hacia el SE, incluyelas plantas ubicadas en la línea descrita porlos puntos 3, 9 y 17; el cuadrante 4, orienta-do hacia el SW, incluye las plantas ubicadasen la línea que describen las plantas 4, 11 y19 (Figura 1).

2. Captura de áfidos alados

En forma simultánea al estudio de dis-persión viral, se realizó la captura de áfidosalados con el objetivo de seguir la evoluciónde las poblaciones de las especies másabundantes.

Se utilizaron dos trampas de agua(Robert, 1988). Estas consisten en bande-jas metálicas cuadradas de 60cm de lado y10cm de profundidad, con un desagüe pararecoger la colecta; las mismas se ubican a70cm de altura respecto al suelo (Figura 2).Están pintadas de color amarillo en su inte-rior. Se llenaron a 2/3 de su volumen total

Figura 1. División de los focos en cuadrantes. Elcuadrante 1 tiene orientación cardinal NW (colorrojo), el cuadrante 2 tiene orientación cardinal NE(color azul), el cuadrante 3 tiene orientación car-dinal SE (color verde) y el cuadrante 4 tieneorientación cardinal SW (color amarillo).

A B C

DE

Figura 2. Trampa de agua o Moericke para captura de áfidos. A) Ubicación de la trampa en el predio.B) Vista cercana de la trampa mostrando el nivel de llenado de agua. C) Vista ampliadade una colecta mostrando la diversidad de insectos y otros artrópodos que pueden sercolectados. D) Tapón de desagüe de la trampa.E) Desagüe de la trampa por donde sedrena el contenido de la colecta.

cmyk

42


(previendo ocurrencia de lluvias) y se leagregaron aproximadamente 2ml deformaldehído como repelente de pájaros ypredadores acuáticos, y unas gotas de de-tergente líquido para disminuir la tensiónsuperficial y favorecer el hundimiento de lospulgones.

En la primer etapa del trabajo las tram-pas se colocaron en el cultivo de segundoaño, linderas a cada uno de los focos, y lascolectas fueron realizadas semanalmentedurante la primavera-verano/1999-2000,desde el 22/10/99 al 19/4/00. En el otoño de2000, las trampas se colocaron contiguas alos focos muestreados, y las colectas serealizaron semanalmente desde el 9/5/00 al28/6/00. Durante la primavera-verano/2000-2001, desde julio de 2000 hasta febrero de2001, se continuó la colecta, realizandosólo el conteo de áfidos totales.

3. Determinación de los áfidosalados capturados

El líquido de colecta de las trampas se filtróa través de una bolsa de gasa, recuperandolos ejemplares en alcohol 95% para su trasla-do al laboratorio (Figura 3). Los pulgonesfueron separados de los demás grupos de

artrópodos y colocados nuevamente en alco-hol 95%.

Para la identificación se usó una lupaNikon de 20 aumentos. Se tuvieron en con-sideración todas aquellas características yestructuras de las formas aladas que per-miten una rápida identificación de losespecímenes, y que son utilizadas en elseguimiento de sus poblaciones. Se utiliza-ron como referencia los grabados y comen-tarios de las publicaciones disponibles,(Blackman y Eastop, 1985; Remaudière,1987; Robert, 1988); y una colección nacio-nal de este grupo de insectos perteneciente auno de los autores (Carballo, R).

La identificación hasta la categoría deespecie se realizó sólo para las colectas deoctubre de 1999 hasta junio de 2000.

4. Registro de variables climáticas

Para todo el período de trabajo experi-mental se obtuvieron los registros de lassiguientes variables climáticas: precipita-ción, humedad relativa, temperatura máxi-ma y mínima e intensidad y dirección delviento en la estación meteorológica de INIA

Figura 3. Procesamiento y conservación de la muestra. A) Bolsa de gasa colocada en el desagüepara filtrar la colecta de la trampa. B) Las colectas se colocan en frascos con alcohol 95%para su traslado al laboratorio.

A B


43

La Estanzuela.

RESULTADOS

1. Estudio de la dispersión viral enel campo

1.1 Primavera/1999

En el foco estudiado en el trébol rojo deprimer año, el porcentaje de plantas coninfección viral fue bajo a lo largo de todo elperíodo de muestreo (Figura 4). Entre elprimer y el tercer muestreo se registró unaumento en la incidencia de infección porPotyvirus (0.5 a 1.8%). La ocurrencia deinfección por AMV sólo se registró en eltercer muestreo, con una muy baja inciden-cia (0.5%). Se detectó una planta con AMV,si bien la planta foco sólo estaba infectadacon Potyvirus.

En los focos estudiados en el trébol rojode segundo año el porcentaje de plantas coninfección viral fue marcadamente superior(Figura 5). La incidencia de infección conPotyvirus aumentó progresivamente entreel primer y el tercer muestreo (13.3 a 22.5%y 17.5 a 30.0%, para los focos 1 y 2 respec-tivamente). Si bien los valores de incidenciapara AMV fueron significativamente másbajos, también en esta variable se registróun aumento entre el primer y el tercermuestreo (1.7 a 4.2% y 0 a 2.5%, para losfocos 1 y 2 respectivamente).

En el foco de primer año, en el segundoy tercer momento de muestreo se registra-ron mayores valores de incidencia viral a 1m de distancia de la planta foco (Cuadro 1).El mayor número de plantas infectadas seregistró en el cuadrante SW.Figura 4. Incidencia viral en un cultivo de trébolrojo de primer año durante los tres momentos demuestreo en primavera de 1999, 1:8/11/99,2:29/11/99, 3:3/01/00. Incidencia viral: númerode plantas infectadas sobre número total deplantas evaluadas, expresado en porcentaje.

Figura 5. Incidencia viral en un cultivo de trébol rojo de segundo año durante los tres momentos demuestreo en primavera de 1999, 1:8/11/99; 2:29/11/99, 3:3/01/00. Incidencia viral: númerode plantas infectadas sobre número total de plantas evaluadas, expresado en porcentaje.

TR1 FOCO 1

0,5 1,4 1,80,0 0,0 0,5

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Potyvirus

AMV

Momento de muestreo

Inci

de

nci

a v

ira

l

TR2 FOCO 1

13,3

20,8 22,5

1,7 1,74,2

0

10

20

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

TR2 FOCO 2

17,5

30,0

0,0 0,02,5

25,8

0

10

20

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

30

20

10

0

44


Circunferencia 08/11/1999 29/11/1999 03/01/2000

1 m 0 2,6 5,32 m 0 1,4 2,83 m 0 0 0

Incidencia viral (%)

Cuadro 1. Incidencia viral1 en función de ladistancia a una planta foco en un cultivo de trébolrojo de primer año para tres momentos de mues-treo en primavera de 1999. TR1 FOCO 1: Infec-ción con Potyvirus.

1Incidencia viral: número de plantas infectadas sobrenúmero de plantas evaluadas en cada circunferencia,expresado como porcentaje; el número de plantasevaluadas en las circunferencias de 1, 2 y 3 m deradio a la planta foco es 38, 72 y 109, respectivamente.

Figura 6. Dispersión viral para los focos 1 y 2 (TR2 FOCO 1 y TR2 FOCO 2, trébol rojo desegundo año) en la primavera de 1999. Cada círculo verde corresponde a unaplanta sana, los círculos celestes corresponden a plantas infectadas con Potyvi-rus, los círculos rojos corresponden a plantas infectadas con AMV y los círculosamarillos representan plantas con doble infección Potyvirus-AMV.

En los dos focos estudiados en el trébolrojo de segundo año, se observó una disper-sión generalizada de plantas con infecciónviral, prevaleciendo claramente la ocurren-cia de infección con Potyvirus (Figura 6). Enel primer momento de muestreo, en ambosfocos se registró una mayor incidencia virala 1 m de la planta foco respecto a lasdistancias de 2 y 3 m. En el foco 1 estatendencia se mantuvo durante los siguien-tes muestreos, aunque el rango de variaciónfue menor. En el foco 2, en el segundo ytercer muestreo, los valores de incidenciaviral fueron variables, no observándose unarelación con la distancia radial a la plantafoco (Cuadro 2). Si bien no se observarondiferencias notorias en el número de plantascon infección viral entre los cuadrantes, alfinal del período de muestreo el mayor nú-

1 m

2 m

3 m


45

Circunferencia 08/11/1999 29/11/1999 03/01/2000

1 m 19 28,6 28,62 m 17,9 23,1 33,33 m 13,6 25,4 25,4

b) Incidencia viral (%) TR 2 FOCO 2

Circunferencia 08/11/1999 29/11/1999 03/01/2000

1 m 19 19 23,82 m 15,4 17,9 20,53 m 8,5 16,9 16,9

a) Incidencia viral (%) TR 2 FOCO 1

Cuadrante 08/11/1999 29/11/99 3/1/00

1 (NW ) 5 9 102 (NE) 5 7 73 (SE) 4 4 44 (SW ) 6 10 14

Nº plantas infectadas TR 2 FOCO 2

Cuadrante 08/11/1999 29/11/99 3/1/00

1 (NW ) 2 6 62 (NE) 4 5 63 (SE) 2 6 64 (SW ) 7 7 8


Cuadro 2. Incidencia viral1 en función de la distancia a una planta focoen un cultivo de trébol rojo de segundo año para tresmomentos de muestreo en primavera de 1999. TR2 FOCO1: Infección con Potyvirus y AMV; TR2 FOCO 2: Infeccióncon Potyvirus.

1 Incidencia viral: número de plantas infectadas sobre número de plantasevaluadas en cada circunferencia expresado como porcentaje; el númerode plantas evaluadas en las circunferencias de 1, 2 y 3 m de radio a laplanta foco es 21, 39 y 59, respectivamente.

Cuadro 3. Número de plantas con infección viral en función de laorientación cardinal respecto a una planta foco, en uncultivo de trébol rojo de segundo año para tres momen-tos de muestreo en primavera de 1999.

De acuerdo a la densidad de plantas registrada en el cultivo, el númerode plantas evaluadas en cada cuadrante fue 30.

1 m

2 m

3 m

1 m

2 m

3 m

46


mero siempre se registró en el cuadranteSW, para ambos focos (Cuadro 3).

1.2 Otoño/2000

Los tres focos estudiados en otoño, en uncultivo de segundo año, registraron un incre-mento de la incidencia viral en función deltiempo (Figura 7). Los valores fueron inter-medios entre aquellos observados en la pri-mavera de 1999 para el foco ubicado en eltrébol rojo de primer año y los focos ubica-dos en el trébol rojo de segundo año. Mien-tras que los rangos de incidencia viral en laprimavera fueron de 0.5 a 1.8% y de 13.3 a30.0% para un trébol rojo de primer y segun-do año, respectivamente, el rango registra-do en el otoño fue de 5.1 a 13.3%, para uncultivo de 12 a 14 meses de edad (Figuras 4

y 5).

Al igual que en la primavera de 1999, laocurrencia de infección por Potyvirus fuenetamente prevalente frente a la infecciónpor AMV. Entre el primer y el tercer muestreo,el porcentaje de plantas infectadas conPotyvirus se duplicó, alcanzando valores deincidencia viral de 10.2 a 13.3 % (Figura 7).

En los tres focos estudiados en esteperíodo, se observó una dispersión genera-lizada de las plantas con infección viral(Figura 8). En el primer y segundo muestreo,los valores de incidencia viral más altos seregistraron a 1 ó 2 m de la planta foco,observándose en general valores más bajosa 3 m (Cuadro 4). En el tercer muestreo, losvalores de incidencia no mostraron un pa-trón consistente asociado con la distancia

Figura 7. Incidencia viral en un cultivo de trébolrojo de segundo año durante los tres momentosde muestreo en otoño de 2000, 1:25/4/00,2:25/5/00, 3:19/6/00. Los focos evaluados fue-ron TR2 FOCO 3, TR2 FOCO 4 y TR2 FOCO 5(trébol rojo de segundo año). Incidencia viral:número de plantas infectadas sobre númerototal de plantas evaluadas, expresado en por-centaje.

TR2 FOCO 4

5,1

9,2 10,2

0,5 0,5 0,5

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

TR2 FOCO 5

6,68,2

11,2

1,0 1,5 2,0

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

TR2 FOCO 3

5,17,7

13,3

0,0 0,5 1,0

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV


47

Figura 8. Dispersión viral para los focos 3, 4 y 5 (TR2 FOCO3, TR2 FOCO4 y TR2 FOCO5, trébolrojo de segundo año) en otoño de 2000. Cada círculo coloreado de verde corresponde a una plantasana, los círculos celestes corresponden a plantas infectadas con Potyvirus, los círculos rojos aplantas infectadas con AMV y los círculos amarillos representan plantas con doble infecciónPotyvirus-AMV.

radial a la planta foco. Al final del período demuestreo, el foco 5 presentó mayor númerode plantas con infección viral en el cuadran-te SW, habiendo una diferencia notoria conlos demás cuadrantes del foco (Cuadro 5).Si bien los focos 3 y 4 presentaron mayornúmero de plantas infectadas en el cuadran-te NW, la diferencia con los demás cuadran-tes no fue importante.

1.3 Primavera/2000

En los tres focos estudiados, la inciden-cia de plantas infectadas con Potyvirus yAMV fue aumentando en el tiempo a medidaque se realizaron los distintos muestreos(Figura 9).

En general, no se observó una relaciónentre la incidencia y la distancia a la plantafoco, tanto para la infección con Potyviruscomo con AMV (Cuadro 6).

En el cuadro 7 se muestra el número deplantas infectadas con Potyvirus y AMV enfunción de los puntos cardinales. En el foco

19/06/00

19/06/00

48


Circunferencia 25/4/00 25/5/00 19/6/00

1 m 5,9 19 23,82 m 7,8 12,5 14,13 m 2,1 5,2 5,2

Incidencia viral (%) TR 2 FOCO 4

Circunferencia 25/4/00 25/5/00 19/6/00

1 m 5,9 8,8 8,82 m 6,3 9,4 15,63 m 3,1 6,2 12,4


Cuadrante 25/04/00 25/05/00 19/06/00

1 (NW) 3 3 42 (NE) 2 3 43 (SE) 3 4 44 (SW) 4 7 9


Cuadrante 25/04/00 25/05/00 19/06/00

1 (NW) 4 5 72 (NE) 3 5 53 (SE) 1 2 34 (SW) 1 5 5


Cuadrante 25/04/00 25/05/00 19/06/00

1 (NW) 3 4 72 (NE) 2 5 73 (SE) 1 3 64 (SW) 3 3 5


Circunferencia 25/4/00 25/5/00 19/6/00

1 m 11,8 11,8 14,72 m 3,1 4,7 7,83 m 5,2 8,2 11,3


Cuadro 4. Incidencia viral1 en función de la distancia a una planta foco enun cultivo de trébol rojo de segundo año para tres momentosde muestreo en otoño de 2000. TR2 FOCO 3: Infección conPotyvirus; TR2 FOCO 4: Infección con Potyvirus y AMV; TR2FOCO 5: Infección con Potyvirus.

Cuadro 5. Número de plantas con infección viral en función de la orienta-ción cardinal respecto a una planta foco, en un cultivo de trébolrojo de segundo año para tres momentos de muestreo en otoñode 2000.

De acuerdo a la densidad de plantas registrada en el cultivo, elnúmero de plantas evaluadas en cada cuadrante fue 49.

1Incidencia viral: número de plantas infectadas sobre número total deplantas evaluadas, expresado en porcentaje; el número de plantasevaluada en las circunferencias de 1,2 y 3 m de radio a la planta focoes 34, 64 y 97 respectivamente.

1 m2 m3 m

1 m2 m3 m

1 m2 m3 m

Circunferencia19,0


49

Circunferencia 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 m 5,9 11,8 14,72 m 4,7 6,3 14,13 m 6,2 10,3 12,4


1 m2 m3 m

11/12/00

11/12/00

11/12/00

Figura 9. Incidencia viral en un cultivo de trébolrojo de segundo año durante los tres momentosde muestreo en primavera de 2000, 1:30/10/00;2:20/11/00, 3:11/12/00. Los focos evaluados fue-ron TR2 FOCO 3, TR2 FOCO 4 y TR2 FOCO 5.Incidencia viral: número de plantas infectadassobre número total de plantas evaluadas, expre-sado en porcentaje.

Cuadro 6. Incidencia viral1 en función de la distancia a una planta foco, enun cultivo de trébol rojo de segundo año para tres momentos demuestreo en primavera de 2000.

1Incidencia viral: número de plantas infectadas sobre número deplantas evaluadas en cada circunferencia expresado comoporcentaje; el número de plantas evaluadas en las circunferenciasde 1, 2 y 3 m de radio a la planta foco es 34, 64 y 97, respectivamente.

TR2 FOCO3

9,2

16,4 16,9

1,5

4,15,6

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

TR2 FOCO4

7,7

10,8

14,9

1,5 2,64,1

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

TR2 FOCO5

7,7

11,313,3

1,5 2,64,1

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3

Momento de muestreo

Incid

encia

viral

Potyvirus

AMV

2,6

7,7

7,7

2,6

Circunferencia 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 m 5,9 11,8 11,82 m 7,8 17,2 18,83 m 8,2 16,5 16,5


1 m2 m3 m

Circunferencia 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 m 8,8 11,8 14,72 m 7,8 10,9 15,63 m 5,2 9,3 13,4


1 m2 m3 m

Circunferencia

1 m2 m3 m

50


Cuadrante 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 (NW) 4 6 92 (NE) 3 5 73 (SE) 3 5 74 (SW) 2 4 5


Cuadrante 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 (NW) 4 7 72 (NE) 2 7 83 (SE) 3 7 74 (SW) 7 11 11


Cuadrante 30/10/00 20/11/00 12/11/00

1 (NW) 5 9 112 (NE) 5 7 93 (SE) 3 3 54 (SW) 1 3 5


3 se observa una distribución bastante ho-mogénea de las plantas infectadas, si biense registra una leve tendencia a agregarsehacia el cuadrante SW. En los focos 4 y 5 seregistra un mayor número de plantas coninfección viral hacia el cuadrante NW. Sinembargo, en un cultivo en estas condicionessanitarias, donde ya hubo una dispersiónviral importante, parece no existir una rela-ción entre el número de plantas con infec-ción viral y los puntos cardinales (Figura10).


2.1 Primavera-verano/1999-2000

En este período, las capturas más abun-dantes correspondieron a las semanas del27/10/99 al 17/11/99, y del 9/2/00 al 23/2/00.El valor máximo en este período se registróel 27 de octubre, con 560 y 588 áfidoscapturados en las trampas 1 y 2, respectiva-mente. El número total de áfidos colectadosen este período de tiempo fue 2888 (valor

Cuadro 7. Número de plantas con infección viral en función de laorientación cardinal respecto a una planta foco, en uncultivo de trébol rojo de segundo año para tres momentosde muestreo en primavera de 2000.

promedio de trampas 1 y 2), (Figura 11).

Las precipitaciones en este período decaptura fueron muy escasas en compara-ción con el promedio histórico, llegando aun total acumulado de 231.8 mm desdeoctubre de 1999 hasta marzo de 2000. Lahumedad relativa promedio mensual semantuvo por debajo del 75%. Considerandolos vientos mayores a 10 km/h, se observóuna predominancia de vientos NE y ENE.

2.2 Otoño/2000

En este período, la captura más impor-tante correspondió a la semana del 14 dejunio de 2000, con 16 y 10 áfidos para lastrampas 1 y 2, respectivamente. En todaslas capturas realizadas el número de áfidoscolectados fue muy escaso en comparacióncon las cantidades capturadas en el perío-do de colecta anterior. El total de áfidoscolectados en esta temporada fue 41 (valorpromedio de trampas 1 y 2) (Figura 12).

Las precipitaciones registradas duranteeste período fueron muy abundantes y ma-

De acuerdo a la densidad de plantas registrada en el cultivo, el númerode plantas evaluadas en cada cuadrante fue de 49.

11/12/00

11/12/00

11/12/00


51

0

100

200

300

400

500

600

700

úe

ode

ádos

Trampa 1

Trampa 2

Fecha de Colecta

Figura 10. Dispersión viral para los focos 3, 4 y 5 (TR2 FOCO 3, TR2 FOCO 4 y TR2 FOCO 5, trébol rojo desegundo año) en la primavera de 2000. Cada círculo verde corresponde a una planta sana, los círculoscelestes corresponden a plantas infectadas con Potyvirus, los círculos rojos corresponden a plantasinfectadas con AMV y los círculos amarillos representan plantas con doble infección Potyvirus – AMV.

Nú

me

ro d

e á

fido

s

Figura 11. Áfidos co-lectados en las trampas1 y 2 durante el períodop r i m a v e r a - v e r a n o /1999-2000. Se indicacon una flecha cada mo-mento de muestreo delos focos que corres-ponden a las fechas 8/11/99, 29/11/99y 3/1/00.

cmyk

52


yores al promedio histórico, llegando a untotal acumulado de 612.3 mm desde abrilhasta junio. La humedad relativa tambiénaumentó a partir del momento que seincrementaron las precipitaciones, con unpromedio mensual por encima del 80%. Enlos vientos superiores a 10 km/h, para esteperíodo, se observó una predominancia delas direcciones ENE y NNE.

2.3 Primavera-verano/2000-2001

Desde julio hasta setiembre las colectasregistraron poblaciones de áfidos muy esca-sas. A partir de setiembre comienza a regis-trarse un aumento en el número de áfidoscapturados, obteniéndose el mayor númeroen la semana del 18/10/00 (Figura 13).

Figura 12. Áfidos to-tales colectados en lastrampas 1 y 2 durante elotoño/2000. Se indicacon una flecha cada mo-mento de muestreo delos focos que correspon-den a las fechas 25/4/00, 25/5/00 y19/6/00.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

9-May 18-May 24-May 31-May 7-Jun 14-Jun 21-Jun 28-Jun

Fecha de colecta

Núm

ero

de

áfidos

Trampa 1

Trampa 2

Figura 13. Áfidos totales co-lectados en las trampas 1 y 2desde el 5/7/00 al 2/2/01.

3. Determinación de las especies deáfidos alados capturados

Durante la primavera-verano/1999-2000las cuatro especies colectadas en mayorabundancia fueron Therioaphis trifolii(Monell), Nearctaphis bakeri (Cowen), Aphiscitricola (van der Goot = spiraecola Patch) yRhopalosiphum padi (L.) (Figura 14). R.padi y A. citricola son transmisores dePotyvirus, mientras que T. trifolii y N. bakeritienen la capacidad de transmitir Potyvirus yAMV. Otras especies que aparecen conmenor número de ejemplares son tambiéntransmisores de uno o los dos virus deinterés para este trabajo (Cuadro 8).

0

20

40

60

80

100

120

5/7

/00

20/7

/00

2/8

/00

16/8

/00

30/8

/00

20/9

/00

18/1

0/0

0

18/1

/01

2/2

/01

Fecha de colecta

Nº

de

áfidos

Trampa 1

Trampa 2


53

Especie AMV PotyvirusMáximo

poblacional

Promedio de la colecta

máx.

Therioaphis trifolii (Monell) X X 17/11/1999 332.5Aphis citricola (van der Goot) X 22/10/1999 228.5Rhopalosiphum padi (L.) X 23/02/2000 80.5Nearctaphis bakeri (Cowen) X X 17/11/1999 76.5Macrosiphum euphorbiae (Thomas) X X 27/10/1999 16

Aphis fabae (Theobald) X X 03/11/1999 7Rhopalosiphum maidis (Fitch) X 02/03/2000 6Aphis craccivora (Koch) X X 03/11/1999 6Brevicoryne brassicae (L.) X 27/10/1999 6Myzus persicae (Sulz.) X X 27/10/1999 3Aphis gossypii (Glover) X NP 1.2*Acyrthosiphon pisum (Harris) X X NP 0.8*

Figura 14. Principales especies de áfidos colectadas en primavera-verano/1999-2000.

pTrampa 1

0

100

200

300

400

50022-O

ct

03-N

ov

17-N

ov

01-D

ic

15-D

ic

29-D

ic

19-E

ne

02-F

eb

16-F

eb

02-M

ar

15-M

ar

05-A

br

19-A

br

Fecha de colecta

Nº

de

áfid

os

Aphis citricola

Nearctaphis bakeri

Rhopalosiphum padi

Therioaphis trifolii

Trampa 2

050

100150200250300350400450500

22

-Oct

03

-No

v

17

-No

v

01

-Dic

15

-Dic

29

-Dic

19

-En

e

02

-Fe

b

16

-Fe

b

02

-Ma

r

15

-Ma

r

05

-Ab

r

19

-Ab

r

Fecha de colecta

Nº

de

áfidos

Aphis citricola

Nearctaphis bakeri

Rhopalosiphum padi


a

b

Cuadro 8. Especies de áfidos colectadas, reportadas como transmisoras de AMV, Potyvirus oambos.

aSe indica en la columna “máximo poblacional” la fecha en que se colecta el máximo número de áfidosde la especie en cuestión. El promedio de la colecta máxima se realiza en base a las colectas de lastrampas 1 y 2 para dicha fecha.NP: No presenta un máximo.bSegún Jones, 1996.*Este promedio corresponde a todas las capturas donde aparece la especie considerada.

500

400

300

200

100

0

500

400

300

200

100

0

54


Durante el otoño del 2000 las especiescapturadas en mayor abundancia fueronRhopalosiphum padi, Tetraneuranigriabdominalis, Schizaphis graminum yTherioaphis trifolii. Del total de especiesencontradas, R. padi, R. maidis y B. brassicaeson potenciales transmisores de Potyvirus.

DISCUSIÓN

La incidencia viral registrada en los seisfocos de trébol rojo evaluados mostró unaestrecha relación con la edad del cultivo,aumentando sistemáticamente en funcióndel tiempo.

Para los virus estudiados en este trabajoestá reportada la transmisión por semilla(Jaspars y Bos, 1980; Martelli, 1997). Unaplántula enferma que nace de una semillainfectada actúa como fuente de dispersiónprimaria en un cultivo. Sin embargo, losvalores de transmisión por semilla citadosno son muy elevados (Bos, 1970; Jaspars yBos, 1980; Veiga, 2001), por lo que inicial-mente el cultivo presenta una muy baja inci-dencia viral. A partir de los escasos focosvirales presentes en un cultivo de trébol rojode corta edad, es posible la transmisión dePotyvirus y AMV en forma no persistente,por acción de los áfidos.

A medida que se dan los primeros even-tos de transmisión por áfidos en un cultivo,se incrementa el número de plantas queactúan como focos secundarios de disper-sión viral. Un grupo de plantas infectadasalrededor de un foco de infección resulta enuna fuente de diseminación que es particu-larmente característico de enfermedadescausadas por virus que son transmitidos poráfidos de forma no persistente (Tresh, 1976).Los virus transmitidos de esta forma sonadquiridos durante breves penetraciones su-perficiales de los estiletes sobre la planta(Powell, 1991). Pruebas de muy corta dura-ción sobre la epidermis tienen un rol crucialen la identificación del huésped por parte delos áfidos (Kring, 1972; Nault, 1997). Si laplanta no es adecuada, los áfidos vuelanhacia otra (Nault, 1997), pero este compor-tamiento es suficiente para adquirir un virusno persistente.

En todos los casos sin excepción, lainfección con Potyvirus fuesignificativamente predominante frente a lainfección con AMV. Estos resultados soncoincidentes con los registrados por Veiga(2001) en cultivos de trébol rojo en losDepartamentos de Colonia, Flores, Lavallejay Treinta y Tres.

En el cultivo de trébol rojo de primer añoevaluado durante la primavera de 1999, losvalores de incidencia tanto para Potyviruscomo para AMV fueron muy bajos a lo largode todo el período de muestreo (rangos deincidencia viral de 0.5 a 1.8% y de 0 a 0.5%,respectivamente). En el presente estudio,inicialmente, la única planta infectada fueaquella instalada como foco primario deinfección. Por lo tanto, era de esperar que ladispersión fuera lenta, dada la ausencia defuentes secundarias de virus.

En el cultivo de trébol rojo de segundoaño, evaluado durante la primavera de 1999,se observaron valores de incidencia viralcomparativamente altos (rangos de 13.3 a36% y de 0 a 4.2% para Potyvirus y AMV,respectivamente). Desde el inicio de losmuestreos se partió de un número impor-tante de plantas infectadas, existiendo altaprobabilidad de que hubiera ocurrido dis-persión por áfidos desde focos de infecciónendógenos, generando permanentementenuevos focos.

En el cultivo de trébol rojo de segundoaño, evaluado durante el otoño de 2000, losvalores de incidencia registrados fueron in-termedios entre los obtenidos en el trébol deprimer año y el trébol de segundo año eva-luados en la primavera de 1999 (rangos deincidencia viral 5.1 a 13.3% y 0 a 2% paraPotyvirus y AMV, respectivamente).

Cuando se evaluó el mismo cultivo detrébol rojo de segundo año durante la prima-vera/2000, el valor inicial de incidencia dePotyvirus fue menor que el valor final delotoño/2000 (rangos de incidencia de 5.1 a13.3% y 7.7 a 16.9% para otoño y primave-ra, respectivamente). Estas diferencias en-tre los valores finales de otoño y los valoresiniciales de primavera, mostrando una apa-rente disminución de la incidencia viral, po-


55

dría estar explicada por una menor eviden-cia de síntomas en las plantas en los iniciosde la primavera. Dado que para cadamuestreo se evaluaron las plantassintomáticas, sería posible que una menorexpresión de síntomas provocara una me-nor detección de plantas infectadas, consi-derando que a principios de primavera lasplantas presentan más vigor. Por otra parte,los valores de incidencia viral al inicio de laprimavera podrían estar subestimados porla ocurrencia de muerte de plantas enfer-mas entre otoño y primavera, con la conse-cuente disminución de la densidad de plan-tas en el cultivo. De todas formas, se obser-va un aumento de la incidencia viral en eltranscurso de ambos períodos de muestreo.

Desde el punto de vista espacial, la dis-tancia y la orientación cardinal respecto dela planta foco, surgen como factores deter-minantes de la dispersión en la etapa inicialdel cultivo en el que aún no ha ocurrido unadispersión generalizada.

En el cultivo de primer año la incidenciaviral fue mayor en la circunferencia máspróxima a la planta foco, descendiendo ha-cia distancias mayores y sin registro deplantas infectadas a los 3 metros de distan-cia. En la evaluación inicial de los cultivosde segundo año se registraron plantas infec-tadas en las tres distancias estudiadas. Haciael final del segundo año del cultivo, a medidaque el tiempo transcurre, aumenta el núme-ro de focos secundarios, por lo que la evolu-ción de la dispersión ya no muestra unarelación directa con la distancia a la plantafoco central.

Respecto a la orientación cardinal, tantoen el cultivo de primer año como en los desegundo año se observó una prevalencia dela dispersión de virus hacia los cuadrantesSW y NW. Los vientos predominantes fue-ron NE y ENE durante la primavera de 1999y ENE y NNE en el otoño de 2000. Laocurrencia de este registro estaría explican-do la predominancia de plantas infectadasen los cuadrantes SW y NW, pues dichosvientos favorecerían el traslado de áfidos enel mismo sentido, pudiendo traer consigocarga viral e inocular virus en esa orienta-

ción. Estas observaciones coinciden con lasrealizadas por Schultz et al. (1980, citadospor Irwin y Goodman, 1981) para otro virusde transmisión no persistente, donde el nú-mero de infecciones disminuyó con el au-mento de la distancia, y su distribución serelacionó a la dirección del viento.

Hacia el final del segundo año, un cultivode trébol rojo presenta un patrón espacial dedispersión viral no dependiente de la distan-cia a la planta central, ni de los puntoscardinales, indicando una distribuciónaleatoria de las plantas infectadas comoconsecuencia de una diseminación secun-daria por áfidos, ya generalizada (Barnett yDiachun, 1986).

Considerando la evolución de la disper-sión en los distintos focos estudiados a lolargo del tiempo, en conjunto con la dinámi-ca de vuelo de los áfidos se evidencia queexiste una relación con el aumento de laincidencia viral. En general, los incrementosmás notorios en la incidencia viral coincidie-ron con picos de captura de áfidos, sugirien-do la ocurrencia de transmisión viral a travésde los mismos. En su rol de vectores, losáfidos pueden traer carga viral provenientede las plantas infectadas dentro del foco, deotras plantas del cultivo o de plantas decultivos aledaños también susceptibles alos virus estudiados. Por otro lado, la claraprevalencia de Potyvirus frente a AMV, su-giere una eficiencia diferencial en la trans-misión viral por parte de las especies quecomponen la población de áfidos captura-dos.

En la primavera de 1999, el mayor incre-mento en la incidencia de Potyvirus coincidecon la captura de Therioaphis trifolii,Nearctaphis bakeri y Aphis citricola, repor-tadas como transmisoras (Edwardson yChristie, 1986; Jones, 1996). También enprimavera, al siguiente momento demuestreo ocurre el mayor incremento deincidencia de AMV que coincide con la pre-sencia de T. trifolii dentro de las especiespredominantes con capacidad de transmitirel virus (Edwardson y Christie, 1986; Jones,1996).

Durante el otoño de 2000 los momentosde mayor incremento en la incidencia de

56


Potyvirus coincidieron con capturas deRhopalosiphum padi, el cual está reportadocomo transmisor (Edwardson y Christie,1986). Por el contrario, para AMV, los valo-res de incidencia se mantuvieron práctica-mente constantes, lo cual concuerda con laescasa presencia de especies transmiso-ras. En resumen, los resultados indican quela dispersión, desde un punto de vista cuan-titativo difiere a lo largo de cada estación yestá correlacionada positivamente con latasa de aterrizaje de los áfidos (Irwin yGoodman, 1981).

Por otro lado, también deben considerar-se aquellos factores que determinan la po-blación de áfidos, como las condiciones am-bientales, las plantas espontáneas y los cul-tivos aledaños.

De los conteos de áfidos totales captura-dos, queda en evidencia la influencia am-biental tanto sobre el número como sobre lacomposición de especies de una poblaciónde pulgones. La humedad, la temperatura ylos vientos, tienen marcados efectos sobreel movimiento y los hábitos alimenticios delos áfidos (Mathews, 1991).

Los máximos números de ejemplares co-lectados se registraron en períodos con al-tas temperaturas, baja humedad relativa ymuy escasas precipitaciones (primavera de1999-verano de 2000). Estas condicionesresultaron favorables para el arribo de losáfidos. En el período de temperaturas másbajas, con elevada humedad relativa y muyabundantes precipitaciones (otoño de 2000),el número de áfidos colectados disminuyódrásticamente. La determinación de espe-cies de primavera y otoño indica claramenteque T. trifolii, N. bakeri y A. citricola predo-minan cuando las condiciones ambientalesson más benignas, mientras que R. paditolera las condiciones más severas de otoñoe invierno. Es de suponer que en un año conmenor registro de precipitaciones durantedicho período (cercano al promedio históri-co), las poblaciones de R. padi sean másabundantes que las obtenidas en este traba-jo, pues es una especie que registra susmáximos poblacionales en el invierno (McKirdy y Jones, 1994).

Las formas aladas que arriban al cultivose dispersan sobre las plantas sembradas oespontáneas, convirtiéndose éstas últimasen nuevas fuentes de virus (Carballo, 2001).En las zonas templadas y escasas áreas dela zona mediterránea donde se usa riego,existe un continuo “puente verde” de culti-vos y forrajeras que permite la sobrevivenciade un rango más amplio de virus con capa-cidad de infectar a las pasturas (Jones, 1996).

El hecho de que Potyvirus y AMV setransmiten de forma no persistente lleva aque un cultivo de trébol rojo pueda infectarserápidamente si se siembra cerca de cultivosviejos de tréboles o pasturas de legumino-sas en su segundo o tercer año (Barnett yGibson, 1975). Esto es lo que ocurre en laregión Oeste de nuestro país, bajo sistemasde producción lecheros o ganaderos, dondeexiste una continuidad geográfica de culti-vos de leguminosas forrajeras perennes,huéspedes comunes de las virosis y de susinsectos vectores (Veiga, 2001).

Se puede concluir que a partir del otoñodel segundo año del cultivo comienza ageneralizarse la dispersión de Potyvirus enel campo, a través de pulgones, momento enque ya no hay efecto de la infección primariapor semilla. Se evidencia la importancia delos áfidos en la dispersión generalizada dePotyvirus y se plantea la necesidad de rea-lizar estudios de eficiencia de transmisiónpara las especies de áfidos predominantes.

Al momento de analizar alternativas parael manejo de las enfermedades virales y susinsectos vectores, se deben considerar to-das las variables mencionadas hasta el mo-mento. Dentro de las posibles medidas decontrol encontramos: el empleo de cultivaresresistentes (Lobo y Willink, 1995); el uso deentomófagos y entomopatógenos (Carballo,2001); el uso de barreras físicas donde sedificulta la llegada del vector a la planta(Avilla et al., 1994; Vieira, 1994); la siembrade cultivos barrera para el manejo de virusno persistentes, donde los áfidos realizanpruebas y pierden carga infectiva. Esta po-dría ser una estrategia que mejore el estadosanitario de un cultivo de trébol rojo, o que almenos retrase la evolución de la dispersiónde tales virus (Avilla et al., 1996). Se em-


57

plean especies de gran porte, no suscepti-bles al virus (ej. maíz, sorgo, girasol, Avillaet al., 1996). En cultivos de trébol rojo nodestinados al consumo animal (ej.: semille-ros), se podría considerar la aplicación deinsecticidas, seleccionando aquellos que noafecten la conducta del vector (Collar et al.,1997) y sean efectivos en su acción, puesexisten algunos reportes de insecticidas quepueden incrementar la dispersión del virus(Ferro et al., 1980). Otra alternativa es el usode aceites minerales, que pueden impedir laretención de virus en el estilete del áfido(Wang y Pirone, 1996).

CONCLUSIONES

Los valores de incidencia viral mostraronuna definida relación positiva con la edaddel cultivo. Los valores máximos de inciden-cia viral registrados fueron de 30% paraPotyvirus (trébol de segundo año, primave-ra/1999) y 5.6% para AMV (trébol de segun-do año, primavera/2000), corroborándoseun neto predominio del primero en todos losmuestreos realizados.

En los cultivos más jóvenes se observóuna relación entre la dispersión viral y ladistancia a la planta foco, registrándose losmayores valores de incidencia a un metro dela planta central. Así mismo, en estos culti-vos se registró una mayor incidencia viral enlos cuadrantes SW y NW como consecuen-cia de la dirección predominante de los vien-tos (NE y ENE en primavera, y ENE y NNEen otoño) que afecta la distribución de losáfidos vectores. Sin embargo en los cultivosde segundo año las plantas infectadas si-guen un patrón espacial generalizado, nodependiente de la distancia a la planta foconi de la orientación cardinal.

Las condiciones ambientales influyerontanto en la cantidad como en la composiciónde especies de las poblaciones de áfidoscolectadas, registrándose capturassignificativamente más abundantes en pri-mavera (colecta máxima 27/10/99: 577pulgones por trampa) que en otoño (colectamáxima 14/06/00: 13 pulgones por trampa).La composición específica de las capturasfue también diferente entre primavera y oto-

ño. En primavera predominan las especiesTherioaphis trifolii, Nearctaphis bakeri, Aphiscitrícola y Rhopalosiphum padi. Las pobla-ciones de otoño fueron mucho más escasaspredominando R. padi. Probablemente lasintensas lluvias y elevada humedad relativadurante el otoño hayan influido, disminu-yendo el número de áfidos colectados.

Los mayores incrementos en los valoresde incidencia de Potyvirus en primaveracoincidieron con altas poblaciones de T.trifolii, N. bakeri, A. citricola y R. padi, pu-diendo ser responsables de la dispersiónviral entre el primer y tercer momento demuestreo.

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59

INTRODUCCIÓN

Los resultados de los estudios de disper-sión viral realizados en cultivos de trébol rojode primer y segundo año han puesto enevidencia la importancia de los áfidos en latransmisión de Potyvirus y AMV. Este hechoplanteó la necesidad de conocer la eficien-cia de transmisión viral por las especies deáfidos prevalentes en pasturas de legumino-sas forrajeras.

Los objetivos específicos de este trabajofueron: registrar las especies de áfidos co-lectadas en cultivos de trébol rojo y alfalfa enla zona de Rincón del Colorado, Departa-mento de Canelones y estudiar la eficienciade transmisión de Potyvirus y AMV en labo-ratorio por tres especies de áfidos.



Desde setiembre de 2002 hasta mayo de2003, se realizó la captura de áfidos median-te trampas de agua o de Moericke (Robert,1988). Las condiciones de instalación y pro-cesamiento del material de la trampa hastasu traslado al laboratorio fueron los mismosque se presentan en el capítulo 4. Se coloca-ron dos trampas, una en un cultivo de trébolrojo y otra en un cultivo de alfalfa, ambosubicados en la Estación Experimental INIA

Las Brujas, en el Departamento de Canelo-nes.

2. Identificación de los áfidoscapturados

El procesamiento del material provenientede la trampa consisitió en separar los áfidosde los demás artrópodos, conservando losprimeros en alcohol 95%. Se identificaronlos áfidos citados como más abundantespara trébol rojo en evaluaciones anteriores(Bao, 2003) siguiendo la metodología pre-sentada en el capítulo 4.

3. Cría de áfidos

Las poblaciones iniciales se colectaronen cultivos de alfalfa y trébol rojo y se colo-caron en plantas de dichas especies, libresde virus (testadas por ELISA), instaladas enmacetas. A cada maceta se le colocó untubo de acetato, el cual fue cubierto convoile para evitar el escape de los áfidos,además de permitir una adecuada ventila-ción de la planta y de la colonia de áfidos quesobre ella se multiplicaba (Figura 1). Unavez que las poblaciones se tornaban muyabundantes, se procedía al traslado de áfidospara una nueva planta iniciando una nuevacolonia. Las especies criadas y posterior-mente utilizadas para los ensayos de trans-misión fueron: Therioaphis trifolii, Aphiscraccivora y Acyrthosiphon pisum (Figura2).

5. ESTUDIOS DE TRANSMISIÓN DE AMVY POTYVIRUS POR ÁFIDOS ENCONDICIONES CONTROLADAS

Carrión, F.1; Bao, L.2;Maeso, D.3; Altier, N.4

1Bach. Trabajo Especial II realizado en Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2Lic. Bioq., Protección Vegetal, Facultad de Agronomía, UDELAR.3Ing.Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.4Ing.Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

60


Figura 1. Metodología empleada para la cría deáfidos en laboratorio.

4. Experimentos de transmisión

En los ensayos de transmisión, los áfidosfueron primero sometidos a una hora deayuno, para luego ser instalados en gruposde cinco, sobre plantas con infección viral

conocida durante cinco minutos, permitien-do la adquisición del o de los virus. Poste-riormente, cada grupo de áfidos fue coloca-do nuevamente sobre otra planta sana decorta edad y debidamente identificada a finde permitir, y luego evidenciar, la posibletransmisión de los virus evaluados (Figura3A). Los áfidos fueron dejados por un perío-do de una hora y luego eliminados mecáni-camente o con insecticida. Una vez conclui-do este procedimiento, las plantas fueronllevadas a un invernáculo a prueba de in-sectos con los tubos de acetato (Figura 3B).En esas condiciones, se mantuvieron du-rante un tiempo suficiente para que se de-sarrolle infección viral (en algunos casos,indicado por la aparición de síntomas en lashojas más jóvenes). Posteriormente, unamuestra de cada planta se ensayó por latécnica de ELISA (capítulo 2, Anexo 1), endos momentos, el primero entre los 30 y 60días posteriores a la inoculación, y el se-gundo a los 30 días del primero.

En el caso de AMV, que en nuestrascondiciones de trabajo no desarrolla sínto-mas, la infección fue comprobada mediantela transmisión mecánica a plantas de poro-to (Phaseolus vulgaris) (Figura 4).

A B

C

SARDI Entomology

SARDI Entomology

Figura 2. Especies de áfidos criadas en labora-torio para los ensayos de transmisión viral. A)Therioaphis trifolii, B) Aphis craccivora y C) Acyr-thosiphon pisum.(Fuente:http://www.sardi.sa.gov.au/foto/order.php?ordNo=4).

SARDI Entomology

cmyk


61

Figura 3. A) Metodología empleada para la manipulación de áfidos en los ensayos de transmisiónviral. B) Condiciones de mantenimiento de las plantas inoculadas con virus.

A B

Figura 4. Síntomas desarrollados por plantas indicadoras para verificar la transmisión de AMV deaquellas plantas de trébol rojo en las que no se observaron síntomas pero que tuvieronresultado positivo por el test de ELISA

Entre setiembre de 2002 y mayo de 2003,se realizaron diez experimentos que se dife-renciaron básicamente en la especie depulgón utilizada y el estado sanitario de laplanta sobre la cual se adquirió el virus.Para cada especie evaluada se realizaronpruebas sobre plantas con infección simplede AMV o Potyvirus y con plantas infectadaspor ambos virus (plantas fuente de virus).En cada experimento se incluyeron de 16 a20 repeticiones.

RESULTADOS

1. Colecta de áfidos alados sobretrébol rojo y alfalfa

En líneas generales, las colectas en am-bos cultivos fueron similares, no registrán-dose colectas importantes de alguna espe-cie asociada únicamente a uno de los culti-vos (Figura 5).

cmyk

62


2. Identificación de los áfidoscapturados

Las especies más abundantes en ordendecreciente fueron: Therioaphis trifolii, Aphiscitricola, Myzus persicae, Nearctaphis bakeri,Rhopalosiphum padi y R. maidis (Figura 6).La mayoría de las especies colectadas entrébol rojo fueron capturadas también enalfalfa, a excepción de tres especies cuyascolectas fueron sumamente escasas.

No obstante, algunas especies fueronmás abundantes en un cultivo que en otro, alcomparar los conteos totales desde el 10/9/02hasta el 7/5/03. De acuerdo a estos resultadosT. trifolii fue más abundante en alfalfa (pro-medio de 32.8 pulgones por colecta en alfal-fa frente a aproximadamente 18.5 pulgonespor colecta en trébol rojo), al igual que M.persicae (promedio de 4.7 pulgones por co-lecta en alfalfa frente a 2.7 pulgones porcolecta en trébol rojo), mientras que el totalde individuos de A. citricola fue similar entrébol rojo y alfalfa (valores próximos a 25pulgones por colecta).

3. Cría de áfidos

Se logró optimizar la cría de T. trifoliitrabajando a temperaturas en el entorno de20º C (Kindler y Staples, 1970; Ruggle yGutierrez, 1995).

Figura 5. Áfidos totales colectados desde el 3/10/02 al 7/05/03, mediantetrampas de agua en un cultivo de trébol rojo y un cultivo dealfalfa ubicados en el Departamento de Canelones.

0

50

100

150

200

250

300

350

3/1

0/0

2

24

/10

/02

14

/11

/02

29

/11

/02

27

/12

/02

20

/01

/03

02

/05

/20

03

18

/02

/03

13

/03

/03

28

/03

/03

16

/04

/03

7/0

5/0

3

Fecha de colecta

Nº

de

áfid

os

Alfalfa

Trébol rojo

4. Experimentos de transmisión

Las tres especies de áfidos evaluadasfueron capaces de transmitir alguno de losvirus ensayados (Cuadro 1).

Utilizando T. trifolii, se logró un 12.5% detransmisión a partir de plantas con infecciónsimple con AMV, mientras que se obtuvo un18.8% de transmisión en la prueba con laplanta con Potyvirus. En el experimento detransmisión a partir de una planta con infec-ción doble (AMV+Potyvirus), se registró un18.8% de transmisión de AMV y un 6.3% detransmisión de Potyvirus. Estos resultados,en los que se comprueba la transmisión dePotyvirus por T. trifolii, son coincidentes conlos reportados por Jones (1996), en dondese presenta a esta especie como transmiso-ra de este grupo de virus.

A. craccivora logró transmitir tanto AMVcomo Potyvirus a partir de plantas con infec-ción simple, pero no logró transmitir AMV apartir de la planta con infección doble. Cuan-do se partió de las plantas con infecciónsimple se registró 6.3% de transmisión deAMV y 12.5% de transmisión de Potyvirus.A partir de una planta con doble infección,se logró transmitir solamente Potyvirus, enun 25% de los casos ensayados.


63

En los experimentos realizados con A.pisum, no se registró transmisión a partir dela planta con infección simple de AMV. Cabeaclarar que la absorbancia a 405 nm en laprueba de ELISA para dicha planta fue bas-tante menor que la observada en las otrasplantas de adquisición en los diferentes ex-perimentos. Por otro lado, a partir de laplanta infectada con Potyvirus se observóun 12.5% de transmisión del virus. Cuandose partió de las dos plantas con infeccióndoble, se registró en promedio 40.7% detransmisión de AMV y un 18.8% de transmi-sión de Potyvirus. Este experimento se rea-lizó por duplicado utilizando dos plantas coninfección mixta diferentes.

Aquellos áfidos que se alimentaron deuna planta con un valor de absorbancia a405 nm por la prueba de ELISA más altopara AMV, presentaron una mayor eficaciaen la transmisión de dicho virus.

Aquellas plantas que dieron resultadospositivos para Potyvirus desarrollaronsintomatología característica de dicha in-fección en trébol rojo. En los resultadospositivos de AMV no se observaron sínto-mas; por lo tanto se comprobó la infección através de transmisión mecánica sobre plan-tas de poroto, dando como resultado la apa-rición de manchas necróticas localizadas enla superficie de las hojas más jóvenes de laplanta a los siete días posteriores a la inocu-

Figura 6. Principales especies de áfidos colectados en trébol rojo y alfalfadesde la primavera de 2002 hasta el otoño de 2003.

Áfidos colectados en alfalfa

SD SD SD

050

100150

200250

3/1

0/0

2

24

/10

/02

14

/11

/02

29

/11

/02

27

/12

/02

20

/01

/03

5/0

2/0

3

18

/02

/03

13

/03

/03

28

/03

/03

16

/04

/03

7/0

5/0

3Nº

áfid

os

por

especie

Otros


Myzus persicae

Aphis citrícola

Áfidos colectados en Trébol rojo

SDSDSD

0

50

100

150200

250

300

350

3/1

0/0

2

24

/10

/02

14

/11

/02

29

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/02

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/02

20

/01

/03

5/0

2/0

3

18

/02

/03

13

/03

/03

28

/03

/03

16

/04

/03

7/0

5/0

3

Nº

de

áfid

os

por

especie Otros


Myzus persicae

Aphis citrícola

Fecha de Colecta

Fecha de Colecta

Áfidos colectados en trébol rojo

64


% plantas infectadas con

AMVa

% plantas infectadas con

Potyvirus b

AMV 0,105Potyvirus 0,629

A167-143 AMV 1.057*-0.975*


12,5 (2) 0 (0)

PS4 Potyvirus 1,555 Therioaphis trifolii

0 (0) 6,3 (1)

AMV 0,105 0 (0)Potyvirus 0,629 0 (0)

AS5 AMV 0,101 Aphis craccivora 6,3 (1) 0 (0)

PS4 Potyvirus 1,555 Aphis craccivora 0 (0) 12,5 (2)



AS5 AMV 0,101 Acyrthosiphon pisum

0 (0) 0 (0)

PS4 Potyvirus 1,555 Acyrthosiphon pisum

0 (0) 12,5 (2)

PA155 Acyrthosiphon pisum

31,3 (5) 18,8 (3)

Acyrthosiphon pisum

50,0 (8) 18,8 (3)

25,0

PA144 Therioaphis trifolii

18,8 (3)

PA144

Plantas del experimento de

transmisión (n=16)c

6,3 (1)

Aphis craccivora

Planta de origen

Virus detectado por ELISA

Abs

405nmdEspecie utilizada

PA149

Cuadro 1. Ensayos de transmisión viral a partir de plantas con infección viralconocida, utilizando las especies Therioaphis trifolii, Aphis craccivoray Acyrthosiphon pisum.

aValores de absorbancia registrados posterior a los 20 minutos de reacción del reactivo dedesarrollo de color.

*Valores de absorbancia registrados posterior a los 15 minutos de reacción del reactivo dedesarrollo de color.

bCada fila corresponde a un mismo lote de 16 plantas sobre las cuales se realizó el experimentode transmisión con una misma especie de áfidos, a partir de una misma planta de origen.

cPorcentaje de plantas en las que se detectó AMV por ELISA posterior al experimento detransmisión por áfidos. Entre paréntesis se expresa el número de plantas que resultaroninfectadas en un total de 16.

dPorcentaje de plantas en las que se detectó Potyvirus por ELISA posterior al experimento detransmisión por áfidos. Entre paréntesis se expresa el número de plantas que resultaroninfectadas en un total de 16.

lación.

DISCUSIÓN

Las especies más abundantemente co-lectadas, sobre un cultivo de trébol rojo y unode alfalfa, corresponden a T. trifolii, A. citricolay M. persicae. Estos datos coinciden con lasevaluaciones realizadas en el año 2000 entrébol rojo (Bao, 2003), con la excepción deM. persicae, que en el 2000 aparece comominoritario, y de N. bakeri, una especie muy

abundante en el 2000 y que en este períodode colecta resultó minoritario.

Las especies capturadas por las tram-pas de agua fueron las mismas en los culti-vos de trébol rojo y de alfalfa. Sin embargo,en alfalfa se registró un mayor número de T.trifolii y M. persicae mientras que el númerode A. citricola colectado no presentó dife-rencias entre las colectas en alfalfa y trébolrojo. El total de áfidos colectados fue mayoren la trampa colocada en el cultivo de alfalfaque en la del cultivo de trébol rojo.

a

b

c d


65

Una composición de especies similar enlas colectas de áfidos de ambos cultivos,hace que los mismos puedan considerarseintegrados desde el punto de vistaepidemiológico si se tiene en cuenta queambos son huéspedes de AMV y Potyvirus.

Todas las especies de áfidos fueron máseficientes en transmitir Potyvirus que AMV,cuando las pruebas se hicieron a partir deinfecciones simples. En los ensayos a partirde plantas con infección doble los resulta-dos no son tan claros; T. trifolii y A. pisummostraron una mayor eficiencia de transmi-sión de AMV mientras que para A. craccivorase observó una mayor eficiencia de transmi-sión de Potyvirus. Esto podría estar relacio-nado con la concentración viral relativa delos virus en las plantas con infección doble,como sucede con la transmisión de AMV através de A. pisum. De todas formas estosresultados sólo pueden ser interpretadoscomo tendencias, por lo que se deberíanconfirmar con un mayor número de pruebas.A pesar de ello, sí se puede afirmar que lastres especies evaluadas son capaces detransmitir tanto AMV como Potyvirus. Estastres especies se encuentran en las colectasde campo, siendo T. trifolii una especie abun-dante en las colectas de primavera y verano,mientras que A. craccivora se encuentra enmenor número y A. pisum es minoritario(Bao, 2003). Sin considerar las proporcio-nes en las que cada una de estas especiesse puedan encontrar, el hecho de que colo-nicen alguno de los cultivos monitoreadoses relevante para la dispersión de Potyvirusy AMV. Además sería importante conocercuáles de las especies colectadas con capa-cidad de transmisión viral, logran formarcolonias en el cultivo, lo cual las haría aúnmás relevantes desde el punto de vistaepidemiológico.

CONCLUSIONES

Las especies colectadas desde setiem-bre de 2002 hasta mayo de 2003 con tram-pas de agua sobre un cultivo de alfalfa y unode trébol rojo fueron las mismas. Las espe-cies más abundantes fueron Therioaphistrifolii, Aphis citricola y Myzus persicae. Enalfalfa se colectaron más individuos de T.trifolii y M. persicae que en trébol rojo mien-tras que A. citricola fue igualmente abun-dante en trébol rojo y alfalfa. Fueron colec-tadas en menor número Aphis craccivora,Rhopalosiphum padi, Rhopalosiphum maidisy Nearctaphis bakeri.

En los ensayos de transmisión se com-prueba que T. trifolii, A. craccivora y A.pisum son capaces de transmitir tanto AMVcomo Potyvirus.

BIBLIOGRAFÍA

BAO, L. 2003. Monitoreo de poblaciones deáfidos en trébol rojo (Trifolium pratense L.)y su relación con la dispersión de enferme-dades a virus. Trabajo Especial II. Universi-dad de la República. Montevideo, Uruguay.Trabajo para la obtención del título de Li-cenciatura en Bioquímica. 48p.

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PRINCIPALES RESULTADOS DELOS TRABAJOS REALIZADOSPARA EL ESTUDIO DE LASENFERMEDADES VIRALES DELTRÉBOL ROJO

Los trabajos realizados desde 1994 hanpermitido obtener información relevanteacerca de las enfermedades virales queafectan al cultivo de trébol rojo en nuestropaís. Se han identificado los principalesagentes involucrados, ajustado la metodo-logía para su detección tanto en plántulacomo en semilla, y determinado la impor-tancia relativa de los mismos en diferenteszonas del país. Por otro lado se han identi-ficado las especies de áfidos alados asocia-dos al cultivo que tienen un rol importanteen la transmisión de virus y se ha estimadola eficiencia de algunas especies de áfidoscomo vectores. Finalmente se han evalua-do aspectos vinculados a la transmisión devirus por semilla.

1. Identificación viral

1.1 Virus predominantes

Potyvirus (probablemente BYMV yCYVV), AMV y WCMV resultan ser los viruspredominantes en Uruguay, tanto en lasdeterminaciones iniciales en plantas selec-tas del programa de mejoramiento genéticocomo en los relevamientos de campo enzonas de producción.

1.2 Técnicas de detección

La técnica de ELISA ha demostrado serun método confiable y eficiente para la de-tección de virus. Se cuenta con un protocolode trabajo ajustado para tal fin.

2. Estado sanitario de los cultivos

Los relevamientos de virus en el campoconfirmaron los resultados obtenidos en lasevaluaciones de plantas del programa demejoramiento genético, siendo Potyvirus,AMV y WCMV en orden decreciente de im-portancia los principales virus que afectanlos cultivos de trébol rojo, tanto en la regiónproductiva Este como Oeste. Se logró esta-blecer además una correlación entre lossíntomas observados y los virus detectadospor la técnica de ELISA. En su mayoría, lasplantas de trébol rojo con síntomas conspi-cuos presentaron infección con Potyvirus,obteniéndose una coincidencia superior al90% entre detección visual y la detecciónmediante la técnica de ELISA. Mientras tan-to, para AMV no se logró una coincidenciaimportante (aproximadamente 30%) entre lapresencia de virus y la detección de AMV enlaboratorio. Todas las plantas sintomáticasinfectadas con AMV también lo estaban conPotyvirus por lo que la infección con estesegundo virus podría enmascarar los sínto-mas que provoca el primero.

En vista de estos resultados, la detec-ción visual de Potyvirus podría ser una bue-na aproximación inicial para estimar el esta-do sanitario de un cultivo de trébol rojo. Lossíntomas más característicos observadosen plantas infectadas con Potyvirus fueronmosaicos, mayoritariamente mosaico “ver-de limón” y en menor proporción clorosis(clorosis nerval e internerval).

Los valores de incidencia viral promediopara las zonas productivas Este y Oestefueron 9% y 22%, respectivamente. Mien-tras que en la región Este sólo se registraroninfecciones simples por Potyvirus, en la re-gión Oeste el 49.6% de las plantas infecta-das presentó infecciones múltiples.

6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

Altier, N.1; Maeso, D.2

1Ing. Agr., M.Sc., Ph.D., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.2Ing. Agr., M.Sc., Protección Vegetal, INIA Las Brujas.

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3. Detección de AMV y Potyvirus ensemilla y su transmisión aplántula

Se logró optimizar una metodología parala detección de AMV y Potyvirus en semillastanto de trébol rojo como de otras legumino-sas. Tanto en semilla de lotes comercialescomo en semilla proveniente de plantas ma-dre con infección viral conocida se detectóAMV. En ningún caso se detectó Potyvirus.Con esta misma metodología fue posibledetectar AMV en semillas de alfalfa y trébolblanco.

A pesar de la detección de AMV en semi-lla de lotes comerciales, no se pudo confir-mar su transmisión por esta vía, pues no sedetectó el virus en plantas provenientes desemillas de dichos lotes. Con el número deplántulas analizadas (n=500) resulta difícildetectar la presencia de virus, dada la esca-sa proporción de semilla infectada en el totalde semilla producida en un cultivo.

No obstante, se pudo corroborar la trans-misión por semilla tanto de Potyvirus comode AMV ensayando plántulas provenientesde semillas cosechadas de plantas madreinfectadas.

Del conjunto de resultados, se concluyeque para AMV la transmisión por semillapuede tener un papel importante en la intro-ducción de este virus en nuevas áreas delcultivo. Por otro lado, teniendo en cuentaque en ninguno de los lotes de semilla ensa-yados se detectó Potyvirus, y contraponien-do este hecho a la dispersión generalizadaregistrada en el relevamiento de campo,queda en evidencia la relevancia de losáfidos como agentes transmisores de estegrupo de virus.

4. Importancia de los áfidos en latransmisión viral

El estudio de la evolución de la infecciónviral a nivel temporal, a partir de cultivos deprimer y segundo año, permitió registrar unincremento de la incidencia viral proporcio-

nal al envejecimiento del cultivo. Este incre-mento está fuertemente relacionado a lacapacidad de los áfidos de transmitir estosvirus en forma no persistente. En todos loscasos, los incrementos registrados en laincidencia viral fueron coincidentes con unimportante número de áfidos alados presen-tes sobre el cultivo.

En las capturas de áfidos alados realiza-das con trampas de agua desde comienzosde la primavera de 1999 hasta fines delinvierno de 2000, se colectó un importantenúmero de individuos en primavera y vera-no, mientras que hacia el invierno las colec-tas fueron escasas (coincidiendo con uninvierno de altos registros de precipitacio-nes). La composición de especies fue dife-rente de acuerdo a la estación del año. Lasespecies predominantes en primavera fue-ron Therioaphis trifolii, Nearctaphis bakeri,Aphis citricola y Rhopalosiphum padi y eninvierno predominó R. padi.

En las colectas realizadas desde media-dos del invierno de 2000 hasta el verano de2001, se registró un máximo poblacional el18/10/00, con un promedio de 106 indivi-duos por trampa.

Para el período de colecta de setiembrede 2002 a mayo de 2003, la colecta másabundante se realizó en la semana del5/11/02 con un promedio de 277 individuospor trampa.

El estudio de la dispersión viral a nivelespacial indicó la ocurrencia de una mayorincidencia viral a distancias más próximas alos focos y en una orientación coincidentecon la dirección de los vientos predominan-tes. Estos vientos favorecerían el trasladode los áfidos infectivos en dicha dirección.Esta tendencia puede observarse claramen-te en las etapas iniciales del cultivo, en lascuales la infección aún no se ha generalizado.

En todos los casos evaluados, el grupoPotyvirus fue significativamente predomi-nante frente a AMV. Esta clara prevalenciade Potyvirus sugiere una eficiencia diferen-cial en la transmisión viral por parte de lasespecies que componen la población de


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áfidos capturados.

5. Estudios de transmisión de AMVy Potyvirus en condicionescontroladas

Buscando explicar la prevalencia dePotyvirus frente a AMV en los estudios dedispersión en el campo, se realizaron ensa-yos de transmisión en el laboratorio con lasespecies Therioaphis trifolii, Aphis craccivoray Acyrthosiphon pisum.

Las tres especies fueron capaces detransmitir AMV y Potyvirus. Cuando se par-tió de plantas con infección simple, se regis-tró una tendencia a una mayor transmisiónde Potyvirus, para las tres especies evalua-das. En los ensayos a partir de plantas coninfección doble se observó una mayor trans-misión de AMV para T. trifolii y A. pisummientras que A. craccivora transmitióPotyvirus en un mayor número de casos.

Se realizó además la colecta de áfidosalados mediante trampas de agua, simultá-neamente en un cultivo de trébol rojo y unode alfalfa. Las especies más abundantesfueron Therioaphis trifolii, Aphis citricola yMyzus persicae , mientras que Aphiscraccivora , Rhopalosiphum padi,Rhopalosiphum maidis y Nearctaphis bakerifueron colectados en menor número. Losáfidos predominantes fueron los mismos enambos cultivos con colectas más abundan-tes de T. trifolii y M. persicae en alfalfa y unnúmero similar de A. citricola en amboscultivos.

6. Consideraciones finales

La técnica de ELISA resultó eficientepara la detección de virus en plantas detrébol rojo. Los virus predominantes fueronPotyvirus y AMV. En los relevamientos decampo se observaron diferencias entre laszonas productivas Este y Oeste, presentan-do la primera valores de incidencia viral

promedio de 9% e infecciones simples, mien-tras que en la zona Oeste se registraronvalores de incidencia viral promedio de 22%y casos con infecciones múltiples.

En cuanto a la transmisión por semilla,ésta se pudo observar para Potyvirus y AMVen plántulas de semillas cosechadas de plan-tas infectadas; no así en plántulas prove-nientes de semilla de lotes comerciales. Porotra parte, ensayando la técnica de ELISAsobre semilla se pudo detectar AMV en lotescomerciales, pero no Potyvirus.

En los ensayos de dispersión en el cam-po se registró un incremento en la incidenciaviral proporcional a la edad del cultivo. Seobservó además una mayor incidencia enlas zonas más próximas a la fuente viral y enuna orientación coincidente con la direcciónde los vientos predominantes. A medida quela infección avanzó en el cultivo no se pudoevidenciar un patrón de dispersión en rela-ción a la distancia y dirección de los vientos.

Los áfidos más abundantes de las colec-tas realizadas en el período 1999-2000 so-bre trébol rojo fueron T. trifolii, N. bakeri, A.citricola y R. padi. En el período 2002-2003las especies mayoritarias tanto en trébolrojo como en alfalfa fueron, T. trifolii, A.citricola y M. persicae. Las poblaciones másaltas se registraron en ambos casos enprimavera.

A. craccivora, A. pisum y T. trifolii fueroncapaces de transmitir AMV y Potyvirus encondiciones de laboratorio.

Nuevos trabajos deberían apuntar a eva-luar la capacidad de ciertas especies deáfidos de colonizar el cultivo, relacionandoeste comportamiento con la dispersión en elcampo; a la vez, se podría estudiar la efi-ciencia de las especies A. citricola y R. padi.Ensayos a futuro podrían evaluar la transmi-sión por áfidos desde otros cultivos de usocomercial presentes en la región y que seansusceptibles a los virus estudiados.

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ANEXOS

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a) Microscopía electrónicainmunoabsorbente condecoración ISEM-D

En rejillas de cobre cubiertas con unapelícula de colodión en isoamilacetato 0.5%(Shioiwa Company, Japón) se colocó unagota de antisuero crudo en una dilución1:500 en buffer fosfato (PB) 0.1 M pH 7.0durante 15 minutos a temperatura ambien-te. Luego de lavar 3 veces con el mismobuffer, las rejillas se colocaron por 1 hora encámara húmeda a 4 ºC sobre el extractovegetal crudo a estudiar homogeneizado enPB 0.1 M pH 7.0. Se lavó nuevamente con elmismo buffer y las rejillas se colocaron so-bre una gota del mismo antisuero en unadilución menor (1:10) por 15 minutos a tem-peratura ambiente. Luego de lavar variasveces con PB, seguido de agua destilada,las preparaciones se tiñeron con una solu-ción de acetato de uranilo al 5% en aguadestilada.

Las preparaciones se observaron en unmicroscopio electrónico de transmisiónHitachi modelo H 300 a aumentos entre 15-30000 X.

b) ELISA indirecto

Las muestras se diluyeron en buffer ge-neral de extracción pH 9.6 (carbonato desodio anhidro 0.159%, bicarbonato de sodio0.293%, polivinilpirrolidona PVP PM 24-40.000 2%, azida de sodio 0.02%) adiciona-do con 2-Mercaptoetanol (2-ME) 0.1% ydietilditiocarbamato de sodio (Na-DIECA)0.1% (Edwardson y Christie, 1986). Se usóuna relación 1:100 para el análisis dePotyvirus y 1:20 para WCMV.

Se sembraron 100 ml de extracto porpocillo y se dejó reaccionar 1 hora a tempe-ratura ambiente. Luego de descartar lossobrenadantes se lavó 6 veces, incubando3 minutos cada vez, con buffer fosfato salino

ANEXO 1

TÉCNICAS SEROLÓGICAS

con Tween pH 7.4 (PBST: cloruro de sodio0.8%, fosfato de sodio dibásico anhidro0.115%, fosfato de potasio monobásicoanhidro 0.02%, cloruro de potasio 0.02% yTween-20 0.05%).

Posteriormente se agregaron losantisueros para detectar Potyvirus(monoclonal de ratón) en una relación 1:100y WCMV (policlonal de conejo) 1:1000 enbuffer ECI 1X pH 7.4 (PBST 1X, albúmina desuero bovino 0.2%, PVP PM 24-40.000 2%,azida de sodio 0.02%). Se dejó incubandotoda la noche a 4 ºC.

Al día siguiente se descartaron lossobrenadantes y se procedió al lavado conPBST de igual forma y se agregaron losantisueros conjugados a la enzima fosfatasaalcalina: policlonal anti-ratón de cabra paraPotyvirus y policlonal anti-conejo de cabrapara WCMV diluidos 1:100 y 1:1000 enbuffer ECI 1X pH 7.4, respectivamente. Seincubó durante una hora a temperaturaambiente.

Luego de descartar los sobrenadantes ylavar nuevamente se adicionó el sustratopara la enzima siendo p-nitrofenilfosfatodisódico (1 mg/ml) en buffer PNP pH 9.8(dietanolamina 9.7%, cloruro de magnesio0.01%, azida de sodio 0.02%) y se midió laabsorbancia a 405 nm a temperatura am-biente entre 5 y 30 minutos de agregado elsustrato.

c) ELISA doble sandwich(DAS-ELISA)

Las muestras se diluyeron en buffer ge-neral de extracción PBST pH 7.4, adiciona-do con sulfito de sodio anhidro 0.13%, PVPPM 24-40.000 2%, azida de sodio 0.02%,albúmina de huevo Grado II 0.2%, Tween-20 2%, 2-ME 0.1% y Na-DIECA 0.1% enuna relación 1:10.

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Se sembraron 100 ml de extracto porpocillo en una placa previamente tapizadacon IgG para AMV policlonal, y se incubó 2horas a temperatura ambiente. Luego dedescartar los sobrenadantes se lavó 6 ve-ces, incubando 3 minutos cada vez, conPBST pH 7.4. El lavado se repitió entre cadauno de los pasos del test.

Se agregó el conjugado enzimático confosfatasa alcalina (IgG monoclonal) contraAMV en una relación 1:100 en buffer ECI 1X pH 7.4, y se incubó 2 horas a temperaturaambiente. Se descartaron los sobrenadantesy luego del lavado se agregó 1 mg/ml desustrato p-nitrofenilfosfato disódico en bu-ffer PNP. La absorbancia a 405 nm se midióa temperatura ambiente entre 5 y 30 minutosde agregado el sustrato.


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ANEXO 2

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Se sembraron aproximadamente 60 se-millas de cada una de las plantas indicadorasen almácigos o macetas individuales y seinocularon en el momento adecuado paracada especie. Las plantas crecieron en in-vernadero a prueba de insectos con controlde temperatura y suplementación de luz.

El inóculo usado corresponde a extrac-tos de plantas con síntomas. Estos extrac-tos se inoculan en cada una de las plantasindicadoras. Las muestras frescas se con-servan en freezer a –80ºC hasta su inocula-

ANEXO 3

INOCULACIÓN DE PLANTAS INDICADORAS

ción. El material vegetal infectado se mace-ra en PB 0.03M pH 8.0 conteniendo Na-Dieca 4.5 mg/ml y 2-ME 1.6 ml/ml. Para lainoculación se espolvorean las hojas conabrasivo (carborundo 500-mesh) y se frotael inóculo sobre las hojas con un trozo deesponja. Las plantas se mantienen en lasmismas condiciones controladas bajo lascuales crecieron y se observa y registra eldesarrollo de síntomas durante 3 semanas.

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St 150. Enfermedades virales del trébol rojo en Uruguay. compartidos... · 2014-05-15 · en plantas de trébol rojo silvestres y en cultivos comerciales. En trébol rojo provoca