Upload
tate
View
32
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta???. Odabrati model sistem (npr. Leydig-ove ćelije testisa pacova). Odabrati signalni put od interesa i sakupiti dovoljno literaturnih podataka o njegovim komponentama. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Odabrati model sistem (npr. Leydig-ove ćelije testisa pacova)
Odabrati signalni put od interesa i sakupiti dovoljno literaturnih podataka o njegovim komponentama
Koju ćemo osobinu i/ili funkciju odabranog model sistema da posmatramo pod uticajem datog signalnog puta (npr. uticaj NO-cGMP puta na biosintezu testosterona).
Krenuti od genske ekspresije datog signalnog puta (ako se geni za komponente nekog signalnog puta ekspresuju u odabranoj ćeliji, zasigurno imaju i FUNKCIJU... Koju?)
METODE: izolacija DNK i RNK RT-PCR RQ-PCR agarozna elektroforeza...
Ekspresija proteina (za komponente signalnog puta ILI proteine na koje dati signalni put eventualno ostvaruje svoj uticaj)
METODE: liza ćelija i izolacija proteinaBradfordova metoda imunoprecipitacija SDS-PAGE elektroforeza Western blotting
Ispitivanje nivoa sekrecije hormona ili sekundarnih glasnika, od strane ćelija gajenih u primarnoj kulturi
METODE:RIA za merenje nivoa hormona (T+DHT, PROG i
E2)ELISA komercijalni kit za odredjivanje nivoa
produkcije cAMP-a i cGMP-a
Priprema ogledaAutoklavirati sisteme za filtriranje medijuma i
boce za čuvanje medijumaNapraviti medijume po standardnoj recepturi i
profiltrirati ih kroz prethodno autoklavirane sisteme za filtriranje (sve se izvodi u strogo sterilnim uslovima, u vertikalnom laminaru (hood-u)). Do početka ogleda ovako sterilisane rastvore čuvati u frižideru, a pred početak ogleda izvaditi ih da se temperiraju na sobnoj temperaturi (kako se ćelije ne bi „stresirale“ od hladnoće).
U hood postaviti svo plastično posudje, mrežice i ostalo što nam je potrebno za sutrašnji eksperiment. Uključiti UV lampu u hood-u!
Uključiti UV lampu, koja steriliše čitavu prostoriju u kojoj će se izvoditi ogled.
DOPUNJAVANJE FALKONA OD 50ml MEDIJUMOM (ISPIRANJE)
CENTRIFUGIRANJERESUSPENDOVANJE TALOGA U MEDIJUMU BROJANJE PURIFIKOVANIH LC
SAĐENJE STIMULACIJA