İstanbul’daki El Ayak Ağız Hastalığı Vakalarında

Coxsackievirus A6 ve Coxsackievirus A16’nın Saptanması

Dr. Ayşe Nur CEYLAN

Antalya

11/11/2017

Sunum Planı

1. Amaç

2. Enterovirüsler

3. El Ayak Ağız Hastalığı(EAAH)

4. Materyal MetodHasta seçimi

Örneklerin toplanması

Hücre kültürü

RNA izolasyonu ve Revers Transkripsiyon

Primerlerin tasarlanması ve PCR

Sekanslama

5. Bulgular

6. Tartışma

1. Amaç

• EAAH etkenini belirlemeye yönelik dünyada yapılmış çok sayıda

çalışma olmasına rağmen ülkemizdeki çalışmalar daha çok hastalığın

kliniğine yönelikti.

• Hastanemize başvuran EAAH şüpheli çocukların döküntülerinden

alınan sürüntü örneklerinde hastalık etkenini tespit etmeyi amaçladık.

• Picornaviridae ailesine ait olan Enteroviruscinsi içerisinde 13 tür bulunur.

• Bunlar Enterovirus A-J ve Rhinovirus A-C’dir.

2. Enterovirüsler

Picornaviridae

Enterovirus

Enterovirus A

Coxsackievirus A6

Coxsackievirus A10

Coxsackievirus A16

Enterovirus A71

Enterovirus BCoxsackievirus B

Echovirus

Enterovirus C Poliovirus 1-3

Enterovirus D Enterovirus D68

Rhinovirus A,B,C

*The Picornavirus Pages. 2017; Available from: http://www.picornaviridae.com/.

2. Enterovirüsler

• Batı Pasifik Bölgesi'ndeki birçok ülkede yaygın salgınlar bildirilmiştir.

• Batı Pasifik Bölgesi dışındaki ülkelerde Enterovirus enfeksiyonlarının ayrıntılı epidemiyolojisi ile ilgili daha az bilgi vardır.

*Organization, W.H., A guide to clinical management and public health response for hand, foot and mouth

disease (HFMD). 2011, Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific.

3. El Ayak Ağız Hastalığı

Tanım

• İlk kez 1957 yılında Toronto’da meydana gelen bir yaz salgınında tanımlanmıştır.

• Çocuklarda kısa süreli ateş ve deri döküntüleri ile karakterize viral bir hastalıktır.

• Başlıca etiyolojik ajanlar coxsackievirus A16 (CV-A16) ve enterovirus A71 (EV-A71)’dir.

*Robinson, C., F.W. Doane, and A. Rhodes, Report of an outbreak of febrile illness with pharyngeal lesions and exanthem: Toronto, summer 1957—isolation of group A coxsackie virus. Canadian Medical Association Journal, 1958. 79(8): p. 615.

*Goksugur, Nadir, and Sevil Goksugur. Hand, foot, and mouth disease. New England Journal of Medicine 362.14 (2010): e49.

4. Materyal Metod

Hasta seçimi

• 2015-2017 tarihleri arasında

• Pediatrik Enfeksiyon Hastalıkları Polikliniği

• Döküntü şikâyetiyle başvuran EAAH şüpheli çocuklar

4. Materyal Metod

Örneklerin toplanması

• Çocukların oral mukozasındaki veya ciltlerindeki döküntülerden

sürüntü örneği alındı.

• Alınan örnekler PBS içeren steril kapaklı tüplerde çalışmaya

alınıncaya kadar -80˚C’de saklandı.

4. Materyal Metod

Primerlerin tasarlanması

Toplanmış olan örneklerde etken varlığını araştırmak için Enterovirus cinsine, CV-A16 ve EV-A71’e yönelik primerler geliştirildi.

PanEV-5’UTR Outer-primer

Forward*

5’-CYTTGTGCGCCTGTTTT-3’

Reverse* 5’-ATTGTCACCATAAGCAGCC-3’

Inner-primer Forward* 5’-CAAGYACTTCTGTMWCCCC-3’

Reverse* 5’-CCCAAAGTAGTCGGTTCC-3’

EV-A71-VP1 Forward* 5’-AGAGCATGATTGAGACACG-3’

Reverse* 5’-RTCTTTCTCYTGTTTGTGTTC-3’

CV-A16-VP1 Forward* 5’-TGCAGACATGATTGACCAG-3’

Reverse* 5’-TGCCTACAGTTCTGATGCTA-3’

*Ge, S., et al., Specific primer amplification of the VP1 region directed by 5′ UTR sequence analysis: enterovirus testing and identification in clinical samples from hand-foot-and-mouth

disease patients. Journal of virological methods, 2013. 193(2): p. 463-469. Y:C/T, R:A/G, M:A/C, W:A/T

4. Materyal Metod

RNA izolasyonu, Revers Transkripsiyon ve PCR

• RNA ekstraksiyonu

• Revers transkripsiyonla cDNA sentezi

• Pan-Ev primerleri kullanılarak Nested PCR

• Nested PCR ile Enterovirus tespit edilen örneklere CV-A16 ve EV-A71’e yönelik PCR

4. Materyal Metod

Hücre kültürü

• Vero hücre hattında kültür

• Sitopatik etki görülen kuyularda viral enfeksiyon olduğu kabul edildi.

• Süpernatant kısmı yeni bir 2 ml’lik tüpe alınarak -80 ˚C ’lik

dondurucuya kaldırıldı ve RNA izolasyonu yapılıncaya kadar saklandı.

5. Bulgular

• 2016 sonuna kadar alınan 15 hasta örneğine uygulanan Nested PCR sonucunda 12 hastada Enterovirus tespit edildi.

5. Bulgular

5. Bulgular

• Vero hücrelerinde sitopatik etki

İnfekte olmayan Vero hücreleri Enterovirus ile infekte Vero hücreleri

5. Bulgular

• 2016 sonuna kadar toplanmış olan örneklerden Enterovirus tespit edilenlere CV-A16 ve EV-A71’ya yönelik PCR uygulandı fakat pozitiflik saptanmadı.

5. Bulgular

• Pozitiflik yakalanamaması üzerine 12 örnek sekanslandı. Örneklerin tamamı CV-A6 ile uyumlu bulundu.

PCR Ürünlerinin CV-A6 ile uyumlu sekans verileri

5. Bulgular

• Teyit amaçlı yapılan türe özgü PCR ile örneklerin CV-A6 olduğu doğrulandı .

5. Bulgular

• 2017 yılında:12 hasta

• 7 örnek Pan-EV PCR pozitif

• Önceki verilerin negatif çıkmasından haraketle, bu hastalara EV-A71 ve CV-A16 için PCR uygulanmadan sekanslama yapıldı.

5. Bulgular

• Sekanslama sonucunda 7 örneğin 3’ünün sekans sonucu CV-A6 ile uyumlu gelirken, 4’ünün ise CV-A16 ile uyumlu olduğu tespit edildi.

PCR Ürünlerinin CV-A16 ile uyumlu sekans verileri

6. Tartışma

• Dünya literatürüyle uyumlu; örnekler yaz aylarında yoğunlaşmıştı.

0

2

4

6

8

10

12

14

ocak şubat nisan mayıs haziran temmuz ağustos ekim aralık

*Hii, Y.L., J. Rocklöv, and N. Ng, Short term effects of weather on hand, foot and mouth disease. PLoS one, 2011. 6(2): p. e16796.

6. Tartışma

• Erkek/kız oranı 16/11

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

erkek çocuk

kız çocuk

*Huang, X., et al., Epidemiological and etiological characteristics of hand, foot, and mouth disease in Henan, China, 2008-2013. Sci Rep, 2015. 5: p. 8904.*Topkarcı, Z., A clinical and demographic properties of hand-foot-mouth disease. Medical Journal of Bakirköy, 2013. 9(1): p. 12-15.

6. Tartışma

• El ayak ağız hastalığı salgınları sırasında etkilenen bireylerin yarısından fazlası 1 ile 3 yaş arasındadır.

• Çalışmamızdaki 27 çocuğun 21'inin yaşı 1 ile 3 arasında bulunmuştur (%78).

0

2

4

6

8

10

12

Toplam

0,3

1

2

3

4

5

9

*Kliegman, S. and S.S. Geme, Nelson Textbook of Pediatrics, 2-Volume Set. Medicine, 2015.

6. Tartışma

• Çalışmamızda CV-A6(15) ve CV-A16(4) etken olarak tespit edilmiştir.

• Dünyada major etiyolojik ajanlar: CV-A16 ve EV-A71’dir.

• Ancak CV-A6 giderek önem kazanan etken konumundadır.

• Bu yönüyle çalışmamızdaki CV-A6 tespiti dikkat çekmektedir.*Organization, W.H., A guide to clinical management and public health response for hand, foot and mouth disease (HFMD). 2011, Manila: WHO Regional Office for the Western Pacific.

6. Tartışma

Teşekkürler