7
Striate Palmoplantar Keratoderma Resulting from Desmoplakin Haploinsuf®ciency Neil V. Whittock, Gabrielle H.S. Ashton, Patricia J.C. Dopping-Hepenstal, Matthew J. Gratian, Fiona M. Keane, Robin A.J. Eady, and John A. McGrath Department of Cell and Molecular Pathology, St John's Institute of Dermatology, The Guy's, King's College, and St Thomas' Hospitals' Medical School, St Thomas' Hospital, London, U.K. Recently, the ®rst example of a human mutation in the gene encoding the desmosomal plaque protein, desmoplakin, has been described in a patient with autosomal dominant striate palmoplantar kerato- derma. We now report a further case of a desmoplakin mutation in a proband with striate palmoplantar keratoderma that also results in a null allele and haploinsuf®ciency. The mutation was a heterozygous G>A transition at the donor +1 site of intron 7 of the desmoplakin gene (939 + 1 G>A; Genbank M77830). The aberrant splicing leads to retention of the entire intron 7, which contains a premature termination codon within the N-terminal domain of the peptide. Because the mutant null allele could not be identi®ed on cDNA sequencing, we determined by polymerase chain reaction the exon-intron organization of the desmoplakin gene to facilitate analysis of genomic DNA. The gene spans approximately 45 kb of chromosome 6 and comprises 24 exons ranging in size from 51 bp to 3922 bp. We have also characterized fully the 3¢UTR of the desmoplakin cDNA. This study demonstrates the relevance of haploinsuf®ciency for desmoplakin in the pathogenesis of this genodermatosis. Assess- ment of family members bearing the mutant allele also emphasizes the signi®cance of an individual's age and exposure to skin trauma in manifesting full phenotypic expression of the disorder. Key words: autosomal dominant/desmosome/genetic skin disease. J Invest Dermatol 113:940±946, 1999 S triate palmoplantar keratoderma (PPK) (MIM 148700) is a rare autosomal dominant skin disorder characterized clinically by linear and focal hyperkeratosis of the palms and soles (Grif®ths et al, 1998; Armstrong et al, 1999). Genetically, the disease is heterogeneous as linkage has been found to two separate loci. Initially, Hennies et al (1995) found linkage to chromosome 18q12 near to the 650 kb cluster of desmosomal cadherin glycoprotein genes, which comprise the desmogleins (DSG1±3) and the desmocollins (DSC1±3). This has subsequently been supported by the recent detection of a mutation in the desmoglein 1 gene (Rickman et al, 1999). Another study (Armstrong et al, 1999), which demonstrates a pathogenetic mutation in this genodermatosis, has shown linkage to the desmosomal plaque protein desmoplakin at chromosome 6p21. These authors identi®ed a nonsense mutation in the amino terminal domain of desmoplakin that leads to haploinsuf®ciency. Both the desmosomal cadherin glycoproteins and desmoplakin, along with other proteins such as plakoglobin (PG) and plakophilin 1, are involved in the formation of desmosomes (Burdett, 1998; Chitaev et al, 1998; Marcozzi et al, 1998; Kowalczyk et al, 1999). Desmosomes are disc-like structures, 0.1±0.5 mm in diameter and found primarily in epithelial cells, where they have a major role in cell±cell adhesion as well as cell communication. A major component of desmosomes is the plaque protein desmoplakin I that consists of 2677 amino acids and is divided into a central rod domain ¯anked by two globular domains. The peptide forms a parallel dimer through its rod domain and associates with desmosomal cadherins and type II keratins through its amino and carboxyl terminal domains, respectively, thereby forming a structural bridge between the cytoplasmic intermediate ®lament network and the cell membrane. These component macromole- cules enable desmosomes to play two essential roles within keratinocytes. First, they form membrane anchorage sites for intermediate ®laments (IF), and secondly, a speci®c membrane domain interacts with the corresponding domain of the plasma membrane of an adjacent cell forming stable intercellular adhesion. In this study, we have investigated a patient with striate palmoplantar keratoderma and report the second example of haploinsuf®ciency of the desmosomal plaque protein desmoplakin I. We also reveal the genomic organization of the desmoplakin gene, along with primer sequences for the analysis of cDNA (GenBank M77830) and genomic DNA. MATERIALS AND METHODS Light and electron microscopy Skin specimens were ®xed in half- strength Karnovsky ®xative (containing 2% formaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.04 M cacodylate buffer) (Karnovsky and Klymkowsky, 1995), followed by further ®xation in 1.3% osmium tetroxide. The samples were then processed using standard techniques and embedded in epoxy resin (Eady, 1985). For light microscopy, semi- thin sections (1 mm) were stained with Richardson's solution. For electron microscopic examination, ultra-thin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and observed in a JEOL 100CX transmission electron microscope. 0022-202X/99/$ 14.00 ´ Copyright # 1999 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 940 Manuscript received June 1, 1999; revised August 25, 1999; accepted for publication August 26, 1999. Reprint requests to: Mr N.V. Whittock, Department of Cell and Molecular Pathology, St John's Institute of Dermatology, St Thomas' Hospital, Lambeth Palace Road, London, SE1 7EH, U.K. Email: [email protected]

Striate Palmoplantar Keratoderma Resulting from Desmoplakin Haploinsufficiency

  • Upload
    john-a

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

������� ���������� �������� ��������� ����������� ����������������

���� �� ����� ��������� ���� ���� ������� ���� ��������������� ����� �� ������ ��� �� !���� "��� ���� #�$% ��$ ��� �� �����������&�� ' ���� ��$ ����(��� �����% � ���)� *���(� ' ���&���% +�� �(%)� !���)� ������ ��$ � +�&��) �������) ��$����

���� � +�&��) ������ ,�$� -�!�

��������� ��� ���� ������ � � ���� ������ ����� ���� ������� ��� ������ ������ ����������������� ��� ���� ��������� �� � ������� ���������� ������ ������� ���������� ����� ����! "� �� ����� � ������� ���� � ���������� ������ �� � ������ ���� ����������������� ��������� ���� ��� ������� �� � ���������� ��� ����������������! #�� ������ ��� ������$���� %&' ��������� �� ��� ��� () ���� ������ * � ��� ��������� ���� +,-,( ) %&'.%������ /**0-12! #�� �������� �������� ����� ��������� � ��� ������ ����� *� ����� ������� ��������� ��������� ��� ������ ��� 3 ����������� � ��� �������! 4������ ��� ����� ���������� ���� �� �� ��������� � ��3' �����������

�� ��������� �� �������� ����� ������� ������ ����� �����$���� � ��� ��������� ���� ����������� �������� � ����� �3'! #�� ���� ���������������� 56 �� � ����� 7 ���������� 85 ���� ������� �� ��$� �� 6)�� �-,88 ��! "� ��9� ��� ����������$�� ����� ��� -�:#�� ��� ��������� ��3'! #��� ����� ������������� ����9���� � ���������������� �� ����������� ��� ����������� � ���� �����������! '����� ��� � ����� ����� ������� ��� ����� ��������� ������$�� ��� ����������� � �� ����9�����;���� ��� ������� � ���� ����� �� ���������� ������������� ��������� � ��� �������! ��� ���������� � �� �������� ��� ��������� ���� �������� ������ ��� ��� ��������� ! ����

����� ���&������ ����$��&� .��!/ .�*� 012344/ ��� ���� �(�&�� $&���� ���� $���$�� ���������5�$���������% �% ������ ��$ '��� �%���������� ' �� ���&���$ ���� .���'6�� �� �� 07728 ��&���� �� �� 0777/����������% �� $������ �� ��������(� �� ������� ���

���� '(�$ � ������� ���� *������% ������� �� �� .0779/'(�$ ������� ���&�&� 02:0; ���� �� <94 �� ��(��� '$��&�&�� ��$����� ��%������ ����� ����� �&����� ��$��&������ .���0=>/ ��$ �� $��&������ .���0=>/� +��� ����(���:(���% ���� �(����$ �% �� ����� $����� ' � &(����� �� $��&����� 0 ���� ."���&�� �� �� 0777/� ����� �($%.��&���� �� �� 0777/ ����� $�&������ � ���������&(��� �� ��� ���$��&���� ��� ���� ������� ��$��&�&�� ���:(� ����� $��&������ � ���&�&� <�;0�+���� �(��� �$���6�$ � ������� &(��� �� �� �&�� ��&����$&��� ' $��&������ �� ���$� �������('6�����%� ?� ��$��&�&�� ��$����� ��%������� ��$ $��&������ ���� ������ ������ �(�� �� ��������� .��/ ��$ ���������� 0 �����@�@�$ �� �� '�&��� ' $��&�&�� .?(�$� 07728 �����@�� �� 07728 ����55� �� �� 07728 !����5%� �� �� 0777/����&�&�� ��� $�������� ��(�(��� 4�0=4�9�& �� $��&��� ��$'(�$ ���&����% �� ��������� ����� ����� ��% ��@� � &�A� ��� ������=���� �$����� �� ���� �� ���� �&&(������� � &�A��&���� ' $��&�&�� �� �� ���:(� ����� $��&������ *

�� ������ ' ;<33 �&�� ���$� ��$ �� $�@�$�$ �� � ������ �$$&��� B����$ �% � ���(��� $&����� +�� ����$� '�&� ��������� $�&�� ��(�� �� �$ $&��� ��$ �������� ���$��&�&�� ��$������ ��$ %�� ** ������� ��(�� �� �&�� ��$����C%� ��&���� $&���� �������@��% �����% '�&��� ���(�(��� ���$�� ������ �� �%����&�� ����&�$��� 6��&������� ��$ �� ���� &�&������ +���� �&���� &���&����(��� ������ $��&�&�� ���% � �������� ���� ������������%��� ��� ��% '�& &�&����� �������� ���� '�����&�$��� 6��&��� .* / ��$ ����$�% � �����6� &�&�����$&��� ������� ��� �� �������$��� $&��� ' �� ����&�&�&����� ' �� �$A���� ���� '�&��� ����� ��������(��� �$������*� ��� �($% �� ��@� ��@������$ � ����� ��� ��������&������ ����$��&� ��$ ���� �� ����$ �C�&��� '�������('6�����% ' �� $��&�&�� ���:(� ����� $��&������*� �� ��� ��@��� �� ���&�� �����5��� ' �� $��&���������� ���� ��� ���&�� ��:(����� '� �� ����%��� ' ����.���?��� �332>4/ ��$ ���&�� ����

��+#"*�,� ��� �#+�D��

<���� ��� ������� ������� ���� �����&��� ���� 6C�$ �� ���'������� !���@��% 6C��@� .�������� ;E '�&��$��%$� ��$ ;�9E��(����$��%$� �� 4�41� ���$%��� �(''��/ .!���@��% ��$!�%&����% 0779/ '����$ �% '(���� 6C��� �� 0�>E �&�(&��C�$�� +�� ��&���� ���� ��� �������$ (���� ���$��$ �����:(����$ �&��$$�$ �� ��C% ����� .#�$% 0729/� � ���� &������% ��&����� ������ .0�&/ ���� �����$ ��� "�����$��)� ��(��� � ������&�������� �C�&����� (������� ������ ���� �����$ ��� (���%������ ��$ ���$ ����� ��$ ����@�$ �� � �#D, 044�F ����&����������� &��������

44;;�;4;FG77GH 01�44 I ��%���� � 0777 �% +�� ����% '� *�@������@� ���&���% *���

,51

���(����� �����@�$ �(�� 0 07778 ��@���$ �(�(� ;9 07778 ������$ '��(������� �(�(� ;< 0777�"����� ��:(��� J �� ���� ����� �����&�� ' ���� ��$

����(��� �����% � ���)� *���(� ' ���&���% � +�&��)������ ,�&��� ������ "�$ ,�$� �#0 3#� -�!� #&���J�����;������K�������(�

/������ �������� +�� "�� ��� �����$ '�& ���� ����% (���� �����$ �(���$���(& ���%���������������'�& &��$ .��&�5%������$ ������ 0723/ ��$ �(�A���$ ���$& ��C�&�� ���&�$ �����%������ .�&�����& ����&���� ?���� � ������ -�!�/� ���&�� ������ �C����$ '�& ���������� ��$ �%&���%�� (���� ���$��$ &��$�����&��� ��$ ��������� �&����(��� (��$ '� �� �&���6���� '$��&������ ���� ��� �������$ �� #���� = ��$ ��� (��$ '� ���&���6���� ' ��$�@�$(�� $��&������ �C�� '�& ���&�� ��� ����������$ �� #���� ===� ���� � ���&�� ��� ��� �$$�$ � ���&�C�������� ��%&����� ����� ������ .��"/ �(''�� L<3&� +���������2�2 0<�<&� .��1/;�D1 0�9&� ����; 4�03&� �@��� ���(&���(&�� .���&� ��� -�!�/ ���&� ��$ 04&� ;�&����������M 04 �&� ' ���� $�+� ;4 �&� ' ���� ���&�� �� � �� @�(&� ' 94����'�� �� ������ $���(���� � 79�� '� ;&�� ;�9 (��� ' +�: ��%&�����.��&��� ��$��� �*/ ��� �$$�$ '����$ �% >9 �%���� ' 79�� '�04 � ��������� '� 04 � 3;�� '� >4 � ��� � 6��� ���(���� ' 3;�� '�9&��� �@� &�������� ' �� ��" ����% ��� ���������5�$ �� � >E������ &������ �������� ���$�(& ��&�$�� ��" ��$(�� ���� �(��6�$(���� ���� ��(&�� .N����� ������% -�!�/ ��$ $�����% ��:(����$ (����?�� �%� ��&����� � �� �?* >04 ������ ����%5�� .������ #�&�� �����% ��/�

>���������� � ������ +�� &(��� �$���6�$ ��� �C����$ ��(�� �� ������� �������� ' ���� 3� + ��6�& ��� ����$ ��" ������'�&�$ � �� ����� ���� ���� ���� ��$ ���&�� ��� ���&���� ���&�� ��� ���&������ ���&��� (��$ '� �� 6�� �(�$ '�&���6���� ���� ��� ; ��$ ��� >" .#���� =/ �&���'%��� � 7;4 ����$(� ��$ ���&��� (��$ '� �� ����$ �(�$ ' ��" ���� ��� ; � ���C� 9 9������������������>� ��$ �� �3" �� ���� 3 .#���� ===/ �&���'%��� � ><0 �� ��$(�� + $���&��� ������ �� ����� 29< �� '���� 3 ��� ����($�$ �� �� ���� � ������� ����$��% ��" ���

���'�&�$ (���� �� �3� �� ���� 3 9������������������>� ��$��� >"� �� �C� 04 9�����������������>�� ����$ ��" ��$(������ �(��6�$ ��$ ��:(����$ �� $�������$ ��@��

��������� ����� ��������� ����������$���� *������% �� �������&��� �������$ ��#���� =���� (��$ �&���'% �� $��&������ ���� '�&���� ���&�� ��� (���� �� ��" ��$���� $�������$ ��@� � �%(���� �� #C���$ ,�� +�: �%��& ��� �(''�� > .?�������� ,���� -�!�/����$��� �� &��('��(���)� ����(����� ��" ��$(�� ���� �(��6�$��$ ��:(����$ �� $�������$ ��@��

>���������$���� � ��� -� :#� � ��������� ��3' +�� "����� �C����$ '�& ��&�� ���� �(�(��$ �������%�� ��$ ��@�������������$ (���� �� ��� $.+/G� 0 ���&�� .����&����/� +�� >� ��$ '$��&������ ��� �&���6�$ �� ��@� (���� ��� 02 .#���� =/ ��$ �� ���$.+/G� 0 ���&�� �(��6�$ ��$ ��:(����$ �� ��@��

%��4��� �������� ����� +�� �(&�� $��&������ * >��-+"&"�� ��� ���� $�����$ �� �� ���?��� ��:(���� $������ ����������� �� � 0>74<9� �(����$� �(&������ ��(��( �&&�����'�& �� ���������� ��� ����

"#�-,+�

>������� ��������� ��9���� � ���� ���� ��� �����$����������� +�� �����$ ��� � ��������$�$ 19�%��$ &�������(��� �������� ��� � ;4 % ����% ' $�% B����� �����''����� �� ���&� ��$ ����� ���&�� ��$ ������ ���� ��$ ���$(���%���&� ������ ��$ ��� ��$ ���� �C�������$ �% ���@% &��(������� D' �� �� �%���������� � ��� ���� ���$ ��$ � &�����

#���� =! ��������� ��3' ������

���&�� ��&� ��:(���� .9��>�/� ������ ��������� �&� .��/ ��5� .��/

��� 0 �+�����+�+��++������ .=70/=.=3;/ 93 934��� 0" ���������+��+���+++� 197=132��� ; ���+����������+�+��+ >27=142 93 9<4��� ;" ��+���+�+����������+ 7;7=712��� > ������������+��+�+�� 2<7=222 93 914��� >" +�+��+����������+�+� 0>27=0142��� 1 �+��+���������+����� 0>17=0><2 93 9<4��� 1" ��+���+�+�+��+��+��� 0227=0742��� 9 �+���++������+������ 02;7=0212 93 9<4��� 9" ��+++��+��+���+����� ;><7=;>22��� < +��������+��+������+ ;>47=;>;2 93 9<4��� <" �++���������++������ ;217=;2<2��� 3 ��������++������+��� ;327=;242 93 9<4��� 3" �+���+���+����+��+�+ >>;7=>>12��� 2 ����+���+������+���� >;97=>;32 93 <44��� 2" �+���++�+�+��������� >2>7=>292��� 7 +�++���������+������ >337=>372 93 974��� 7" �+���+���++�+�+����+ 1>17=1><2��� 04 ���+�+����+�+�+����� 1>47=1>;2 93 994��� 04" �����+��+���+����++� 12>7=1292��� 00 ��+�����������+����� 1337=1372 91 924��� 00" +++�+���+++��+�+�+�� 9>>7=9>92��� 0; ������������+�����+� 9;37=9;72 91 9>4��� 0;" �+��+�+��������++�+� 9327=9242��� 0> ������+����+������++ 93>7=9392 91 9<4��� 0>" �+���+��+���������+� <;37=<;72��� 01 ���+�������+��++���+ <;07=<;>2 9< 9<4��� 01" +�����++������+����� <397=<332��� 09 ���+����+����+�+��+� <<77=<302 9< 344��� 09" ���+�+����++��+����� 3>37=3>72��� 0< ���+�+�+�++�+���+�+� 3>07=3>>2 91 <04��� 0<" +������+�������+�+�+ 3747=37;2��� 03 �������++�������+�++ 3217=32<2 9< 114��� 03" �+�+�+������������+� 2;<7=2;22��� 02 �++����������+���+�� 2;47=2;;2 93 900��� 02" �+�+���+�+��+��������� 2<72=2307

�����$��� ����� �� �� 077; .���?��� �������� �� �332>4/��"����@� �� ���������� ��� ����

�D,� 00> �D� < �#�#�?#" 0777 �#��D�,�!*� ���,D*��- *�*#��O ,5)

������ ���������� �C��$��� @�� �� ���&�� ����� ' �� 6�������$ � �� ���&� D� �� ��' ���$ �� �%���������� ��� &��$�''(�� ��$ � �� '�� � ��� &�� '��� �����(����% ��(����� �'����� � ��(&������ ���� .?�� ) "/� ��� �� �&&�$��� '�&��%&�&���� ���� �C�&���$ �% �� ' (� . �!/� +�� �����$)�&��� ��$ ����� ' � '��� ������ ����$��&� �( �����&������ � �� ���&� ���� '�& &��$ ���� $�%����� ��� '�� �����$)� ���� �������� ��$ ��% ��&���� �������� '��(���� +�������$ ��� � ����$��� �� ' ��& .���$ 01 %/ �� �%&�&�'��� ���(�� �� ��� .���$ 2 %/ ��� �&� �%���������� � �������� ����� ' �� ���� ���� �� ��@�������� � ��(�$ ����$ �� �� �����$)� �%&�&� $�$ � ��� (��� �'�� �� ���' ;4 %�

@������ ������� ���� ���� ������ ������������ �������� � ���������� ,��� &���������C�&����� ' ������� ���&�� ���� '�& �� �����$ ��@����$�������� ��$ �%����������� *� �$$��� ���� ��� ��$����� '��������(��� ������ ������ �������%�� ��(��( �� ����(���%���� -�����(�(����% $��&�&�� ����$ �� ����% '&������� ������������ �� $��&�&�� ���� �&����� ��$'���� �� �(&��� �&����$ ��� ����&����$ ���� ���� ���(�� � '�� ������$ � �&��� &(����&����$ ����������� *��$$��� �� ����&�� ' �� ������ 6��&�� ����� ������&� &�&����� ��� ���(���$� ����% �� ������ 6��&������� ��$����$ ��$ �&����$ �� � �����(����� $�����(��.?�� 8/�

��������� ��3' �������� ���������� � ���������������� +�� "�� ��� �C����$ '�& ���� ����% '�& �������$ ��$ ��&�� ������ +�� $��&������ * &"�� �����@���� ���������$ ��" �&���6�$ ��$ ��:(����$� ����%�����@����$ � �&5%�(� ����� ������� ��%&�����& ������ 30;; .���G��+/ '� �� �����$ �� ��� ��� �������� � ����5%�(� ��� �� �� ' �� ��&�� �����8 ���@�� ��������� &(���� � ��% ����5%�(� ��:(���� ������������ $���@���$�

#�� ��������� ���� ����� A56 �� ?���(�� �� ���� (����� $��� ��% &(���.�/ � ����%��� ' ���� �� ���'�&�$���&�� ����%��� ' $��&������ ��$ $���&���$ �� �C�����������5��� ' $��&������ �% ��" ' ���&�� ��� (����

���&��� ����$ � �� $��&������ * ���� ��:(���� .���?����������� �� �332>4 ����� �� �� 077;/� +�� ����� ���� �����P19 �� ' ���&�� ��� ��$ ������ ' ;1 �C�� ������� �� ��5�'�& 90 �� >7;; �� .?�� -/� #C�� 0=;1 ���� �&���6�$ '� �������$ ��$ ��&�� ����� (���� ��" ���&��� ����$ � ��������:(����� .#���� ===/ ��$ $�����% ��:(����$�

%���� �������� �������� �������� � ��� ������ ���������� ��:(���� ����%��� ' $��&������ �C�� 0=;1 '� �������$ ��@����$ � ����5%�(� �Q� �(���(�� $����$ ��� R0 ����� ' �� $�� ������ ��� ' ���� 3 $�������$7>7R 0 �Q� .?�� 5/� ����$ ��" ' �� �����$)� ���� (����&(��� �����6� ����$��% ��" ���&��� ��� (��$ $���&����� �''�� ' �� &(���� +��� ����%��� ��@����$ �� �� �����29< �� ' ���� 3 ��� ����($�$ �� �� �����$)� &"�� ��(���� ���&����� �$� ;9 �&�� ���$� $������& '�& �� ������ ���.?�� 5"/� +��� &(��� �(�$ �� �C����$ ��(�� ��������&�$���$ &"�� $���% ' �� &(�� ������ �� �(�$ � ��$����$ (���� ��@������ "+���"� *� �$$��� ���&�� �����:(������ ��@����$ � ����5%�(� �Q+ ������� � �����30;; ����� ��� ��������% �&5%�(� �� �� ����� +��� �������%&�����& �� �&�� ���$ ������� ;>31 .���G��+/ ������� ���0 ��� ��$ ������&�� ' 044 ���� ���&�&�� �% ���0$���� ����$ �� �� �(������$ ��:(���� .����� �� �� 077;/������ �� &�A� ������ � .4�3>/8 �� &��� ������ �� + .4�;3/�-���� ��" �&���6���� ' $��&������ �C� 3 '����$ �%

��:(������ �� &(��� 7>7R 0 �Q� ��� '(�$ �� �� ���&����� ' � '(���� 6@� &�&���� .*�0 **�1 **�9 **�< ��$ ***�;/ '�� �����$)� '�&��% .?�� 5�/� + ���(�� �� �� $�� ������ ���&(��� ��� � � ��:(���� ��%&�����& 044 ���&�&��'�& ��������% &����$ ���� ��$�@�$(��� ���� �������$ �%$���� ��:(������� ��� ' �� ���� ��� ������$ �����:(���� @����� �� ������� ��� 7>7R 0 �Q� ����������� ��������� &(����

#�� ��������� ��3' ������� � *11 �� -� ����������������� "+���" ��� ���'�&�$ � �� "�� �����$ '�&�(�(��$ ���� �������%��� ��:(���� ����%��� ��@����$ � ���@�(��%(������$ 344 �� >��-+" �������� � ��% �$��%���� ������.��+���/ ��$ � ��% .�/ ��� .?�� 6/ ��$������ ���������5��� '�� ����� >��-+"�

#���� ==! ��������� ����� ���������

�� #C� ��5� .��/ *��� ��5� .��/ ��� ��:(���� ������ ��:(����

0 117 01�4 ������� �G��

; 04> ;�> ������ �������> 017 0�4 ������ ����1 039 >�> �������� �����9 0;7 0�4 ����� ��������< 90 0�< ������� �����3 0<; 4�7 ������� �������2 049 4�7 ������� �������7 7< 4�> ��� �����04 0;< 4�9 ������ ������00 09> 4�< ����� ��������0; 099 0�0 ������� �������0> 0;3 4�2 ������ �����01 ;4; 4�> ������� ������09 ;;3 ;�4 ������ �����0< 0<3 4�1 �������� �����03 0>7 4�9 ������� ������02 071 4�2 �������� �������07 0<> 4�9 �������� ��������;4 21 4�3 ����� ����;0 042 4�< ����� �������;; 77 4�3 ����� ������;> ;;79 0�0 ������� ��������;1 >7;; = �G� �������

��G� � $���&���$�

,58 ��*++D�! �� +�# �D-"��, D *��#�+*��+*�# �#"��+D,D�O

#���� ===! ������ �� ��� ���������� � ��������� ����

���&�� ��&� ��:(���� .9��>�/� ����� ��������� �&� .��/ ��$(� ��5� .��/

�� �0 ����������������� .=01</� 93 12;�� �0" ���������������� .R0<</�� �; ��������������� .=00>/ 93 >>7�� �;" ���������������� .R0;>/�� �> ������������� .=034/ 9; 1>7�� �>" ������������� .R0;4/�� �1 �������������� .=004/ 9; 10>�� �1" ������������ .R0;2/�� �9 �������������� .=2>/ 9; >14�� �9" ��������������� .R0;2/�� �< �������������� .=00>/ 9; ;39�� �<" ��������������� .R000/�� �3 �������������� .=71/ 91 >3;�� �3" �������������� .R00</�� �2 ���������� .=0;0/ 9< >>1�� �2" �������������� .R042/�� �7 ������������ .=73/ 9; >>2�� �7" �������������� .R019/�� �04 ��������������� .=0<;/ 91 10;�� �04" ������������ .R0;1/�� �00 ��������������� .=0;4/ 91 >74�� �00" ��������������� .R003/�� �0; ����������� .=79/ 91 ><4�� �0;" ������������� .R77/�� �0> ������������� .=0;0/ 91 >34�� �0>" ��������������� .R0;>/�� �01 ������������� .=7;/ 93 149�� �01" ��������������� .R000/�� �09 ������������� .=090/ 91 909�� �09" ����������������� .R0>3/�� �0< ����������� .=042/ 91 104�� �0<" ���������������� .R0>9/�� �03 ���������� .=77/ 91 >34�� �03" ������������� .R0>;/�� �02 ����������� .=2</ 9> 102�� �02" ��������������� .R0>2/�� �07 �������������� .=099/ 9; 102�� �07" ���������������� .R044/�� �;4 ���������������� .=0;3/ 91 >0>�� �;4" ������������� .R04;/�� �;0 ������������� .=049/ 9< >;>�� �;0" ����������������� .R004/�� �;; ������������������� .=0>4/ 9< 144�� ;;" ��������������� .R030/�� �;>� ����������������� .=040/ 99 >19�� �;>�" ��� 3"�

�� �;>� ��� 2 � 93 <44�� �;>�" ��� 2"�

�� �;>� ��� 7 � 93 974�� �;>�" ��� 7"�

�� �;>$ ��� 04 � 93 994�� �;>$" ��� 04"�

�� �;>� ��� 00 � 93 <72�� �;>�" ����������������� .R73/�� �;1� ���������������� .=09</ 93 939�� �;1�" ��� 0;"�

�� �;1� ��� 0> � 91 9<4�� �;1�" ��� 0>"�

�� �;1� ��� 01 � 9< 9<4�� �;1�" ��� 01"�

�� �;1$ ��� 09 � 9< 344�� �;1$" ��� 09"�

�� �;1� ��� 0< � 91 <04�� �;1�" ��� 0<"�

�� �;1' ��� 03 � 9< 114�� �;1'" ��� 03"�

�� �;1� ��� 02 � 93 900�� �;1�" ��� 02"�

� �& ���������� ��� ����� � ��:(���� ��� #���� =�

�D,� 00> �D� < �#�#�?#" 0777 �#��D�,�!*� ���,D*��- *�*#��O ,5-

�*��-��*D�

�� ��@� �$���6�$ � ����$ ����� ��� �� ����� '�& '���&������ ����$��&� �� ���(�� '�& �������('6�����% '�� $��&�&�� ���:(� ����� $��&������� ��'��� �� ��@�����&����� ' $��&�&�� ��@� �� ���� '(�$ (�$����� ��(&��� ' ������ ���� $���$��� �� ��@�@� �%���������� ' �����&� ��$ ���� �� �� ������� �������� '��(��� ����� ���&����������$��&� �� � ���������% ��������(� $���$�� �� &�% ����(��$ �% �������('6�����% ' $��&������ * $�&�����$ �%��&���� �� �� .0777/ ��$ ��� �� ��� �($% � �% ���'��&�$������ ' ��� ' �� �&�����&��(� ' �� $��&�&����$����� $��&����� 0 ."���&�� �� �� 0777/� �� ��@� ���������% $�������$ � ����� ' � ���� '������%G��$��&�� $%��������%�$�&� �� ���(��$ '�& '(������ ����(� ' �� �(&������������ 0 ���� .������ �� �� 0773 0777/� +�(� &(���� ��

���� $�''���� �&����� ' $��&�&�� &�% (�$����� ���������$��&���� ��� ���&������ �����%� ���&������ �� ���������� �&���� �� �� '�&��� ��$ ������5��� ' $��&��&�� ��$ �&������ � ������ �$ $&��� �� �� �������� ��'�&��� � ���� ������ �� ����&�$��� 6��&�� ����� ��$ ��$��&�&�� ��$������ .$��&������ ��$ $��&������/ ��$���(��� �&�� ��$ ����C% ��&���� $&���� �� '�& ������� �������� .����� �� �� 07748 ����� �� �� 077;/� �($�����@� ���� �� ��% �� 6�� 2< �&�� ���$� ' �� $��&�������&�� ��&��(� ��� ��������% ���� � $��&�&�� .�&�� ��$ (��� 0772/� +�� �&�� ��&��(� �� ��� ��:(���$ �� �������5��� ' �� $��&�&�� ��$��������������� �&���C����� � ��� ������� �����% ��� ����' $��&����� 0� ��$��������� �( �����% ��� $��&����� 0 .!����5%� �� �� 07738�&�� ��$ (��� 0772/8 ���@�� �������% ������ ��� �����:(���$ ����� �� �� '�&��� ' � ���� �&���C� ���@�(���� ��� $�&�����$ �� ����� $�@�$��� ���$��&�� ����� ��������� ��$ $��&������ ����� �� $��&�&�� ��$�������� ���� �� ���� ��� ������� �� �����5�$ &���C ' �%����&�������� �� ��� ���$ �� ������ ����&�$��� 6��&������� .�&�� ��$ (��� 0772/� �� ���� ���$��&�� �����$�''������� ���@�� �� ��&�$��� '�&��% &�&��� ����������

?����� -! ���������� �����$���� � ��� ��� ������ ����� +�� ���� ������ ' ;1 �C��������� �� ��5� '�& 90 >7;; �� ��$ �����P19 �� ' ���&�� ���� +�� ��5� ' �� ��$�@��$(�� �C�� ��$ ����� ��� �������$ �� +���� **��$��� ��:(����� ��� ��$����$ �% �� ����� ���$���� ��$ �� 9� ��$ >� (��������$ ������ ������� �% �� �������� �(&������ ��@� $������ �C��� +�� ����� ' �� �����$)� ��������� &(��� �� ��$����$ �% �� � ���

?����� )! >������� ���������� � ��� ����� ��� ���� ��� ������� ������� ���������� .�/ D� �� ���$� ���� �� ��&���� �������%���������� � �� ���� ���& �C��$��� � �� ���&�� ����� ' ��6����� D� �� ��' ���$ �� �%���������� �� &�� $�''(��� .�/ D� �� '������ �� '��� ����$��&� �� �� &� ��&���� � ��(&������ �����

?����� 8! @������ ������� ��9���� ���������� ������� ���� �������� �� ��� �� ������ ������ ����=���� ���� �� �&�����%����� �� ������ �( &�������$ ��(�� ��&�� $��&�&��������6��&�� �&���C�� �� ��� ����� ��$����$ ������ 6��&�� �(�$��� ��������� �� � �����(����� ������ ����� �� J ;�9�&�

,55 ��*++D�! �� +�# �D-"��, D *��#�+*��+*�# �#"��+D,D�O

0 �� �$$�$ �� � '(���� �(��� �� ���:(� �&��@��� �������� �� ����&�$��� 6��&��� .�&�� ��$ (��� 0772/� +������C% ��&���� $&��� ' $��&������ �� ��:(���$ '� ��������

����&�$��� 6��&�� ������ $��&�&�� @�� ������������ �� �&�� ��&���� ���$ $&��� ' �� %�� ** ���$��&��������� .!(���� �� �� 07718 ?��������� �� �� 077</ �� ���� �� ���

?����� 6! @��������� � ��������� �������������������� � ��� -� ��� � ��� ������������� = ��3'� +�� �� �$� .+��/�������� �(����$�� 2<01=2<0< �� (�$������$ ��$�� �(��@� ��% �$��%���� ������ ��+����������� �(����$�� 7;70=7;7< �� $(����(�$�������$� +�� ���� ��:(���� �����$ ��� ����$�����$ �� �� ���?��� $������ (�$�� ��������� �(&��� � 0>74<9� �(����$� �(&������ ��'�& �� ���������� ��� ����

?����� 5! =����������� � � ������ ���� ������ �� ��������� =� .�/ �(����$� ��:(������ ' �� �����$)� ��� ��@���� � ����5%�(� �Q�������� � �� $�� R 0 ������ ��� ' ���� 3 $���$ 7>7R 0 �Q�� .�/ +��� ������� �� ������(� �+ $�� ������ ��� �+ ���(���� �� �� ����(���' ��� ' ���� 3 �� �� &(�� &"�� ���$��� � $������& ���&�(�� ��&����� �$�� .�/ ��$����� ' �� ����� ���&������ ����$��&����$��$ �������� ���� ���������� �''���$ '�&��% &�&���� ��� ��$����$ �% ����� ���$��� ��$ (��''���$ '�&��% &�&���� ����%��� �� &(��� �����$����$ �% ���% ���$���� +�� &(��� ��� @���6�$ �% ��" �&���6���� ' �C� 3 '����$ �% '����$ ��$ ��@���� B(������ ��:(������� +�� �����$.**�;/ �� ��$����$ �% �� � ���

�D,� 00> �D� < �#�#�?#" 0777 �#��D�,�!*� ���,D*��- *�*#��O ,56

�� %�� *** ����&�$��� 6��&�� '�&��% &�&���� @�&���� ��$$��&�� ��$ ��&��� ��������� ������� .���� �� �� 0773/� �($�����@� ���� �� ���� ��������� ��� ������$ @�� ��;R

���(���$ ��������%����G$�������%���� ' ������ ;> ������ �� ����C% ��&���� $&��� ' $��&������ .���������� �� �� 07718 ���$�� �� �� 0779/�+���� ��� � ������� ��%� �� ����� �� �����$)� &(���

�(�$ &���'�� ����' ���������% �� ����� ���&������ ����$��&�J ��� �� &(�� ������ &�% �� $����$�$ @�� ��������&�$���$&"�� $���% ������� ��% �� �&���6���� ' �� ��&��$��&������ * ������ ��(�� "+���"� +��� �(�$ ��(�� � $�����''�� �� ����� ' ���� ���� '������� ����� �(�� �� �� ���$� �������@���% &��� ��:(��� �%������ ' $��&������ '�& ��������� ����&��� ��&�� $��&�&�� ��$ �����% ���@�� �������������%� �������@��% ����$ "+���" ' �� �����)� ���� ��"�� $�$ ��@��� �&� ����� �� ��@��� ' &(�� ��������� * ��������� ����'�� �� ���� ��������� ��� �������$ �� &(������$�� ������� �� ������ �$ $&��� ��$ �� ����C% ��&����$&���� +�� &(�� ����$�� �(�$ ����'�� �&��� ��� ����&�� ����$� '� ���$��� �� $��&�&�� ��$������ @�� ���&�� ��&���� $&���8 ���@�� ����(�� �� ����$�� ���� ������C% ��&���� $&��� �������� '� ���$��� %�� ** ������� ��A����� ' �� ����&�$��� 6��&�� ����� �� �%�������(�$ �� �&��&���$� * �� ������� �� �� ���� � �&������ '���� � &�������&� ���$� �� �������� ����%�� ' �� �����'�& ' ���&������ ����$��&��+�� ����@���� ' ��(&� ����%��� �C������� �� ������

��� $��&������ �������('6�����% ��� ������% ���� �� ����($%� �@� �$(�� �� �� '�&��% ��$ �������$ �� ������ ���&(��� � �� $��&������ ������ %� �� �������� '��(��� ����&� ��&���� �� ��$�@�$(�� **�; �� ����$ �� � &��(�� �������+�� ��� ��$�@�$(��� .*�0 **�1 **�9 **�</ �� ��$ &����$����% ��(����� ��$ &��$ � (�$������� ��%����� ������+���� ����@���� ��$ �� ��(�� ' �� &(��� ''�� '(����������� �� ��� �������$ ���� $������� �����6����% �������(�������� ��(�$ ����� �� ����@���� ' ��(&� ��$ �� ���$ &���&�5� ��� ��$(�� $������ ��@���% �� ���� �� �� �&������ '��������� '�&��% &�&���� '� &(���� �@�� �� �� ������� ' ��%�(������� ����$��&�� ��� �' �������('6�����% �� �� &��������� $�@������ ����� ��! ��� 6�$��� �(����� �������������� '� ���&�� '� �C�&��� �% ��&���� ��������$��&������ ���� �C������� �% ��&(���� ��� @��&�� � �(���@��� ����$���� �(� ''����� �� �������@� ������� ����&����(���� �� ��� �����(��� '�& ' �������$ ���� $�������*� '�&����� �''���$ ��� ����� ���&������ ����$��&� ��

��� � ����� ��(�� ��$(� ������� �($��� �� '���������&&��$���� ��� �� &�$� $���&��� �� &���(��� ����%' �� $������� +�� 6�� ��� ��(�$ �� ��:(���� �� $��&���������� '�& �� �''���$ �����)� ���� ����% ��$ $���&��������� ��% ����5%�(� ������� ��� ������� *' � ����5%�(�������� ��� ������ ��� &�% ��$���� $��&������ �������('6������% ��$ �� $��&������ ���� ��(�$ ��� �� �������$ '�&(���� ��$G� ��:(����$� +�� ���&�� �&���6���� $������������$ �� ��� ����� ���� ��� �� (�$������ (���� >1 ����� '���&��� ��� ��" ��$(�� ������� �� ��5� '�& ;39 �� 344 ��8���@�� �' ����5%�(� ������� ��� $����$ �� �� �''���$)����� ��� �� $��&����� 0 ���� � ��� ���$�$�� �������(�$ �� �������$�

��� ����� ��� ����� ��� �� ��� ������� ������ �� ��� ������ ��������� ������

����� ��� �� ��� ����� ���� ������� !������ ����� �� ����������� " !���

#$%� ��� �� &������� ����

"# #"#��#�

��&���� �!? ��!���� !# �(���� �# ����� !� #�$% "�� ,���� *� �(�����#J �������('6�����% ' $��&������ ��(��� � ����� �(�%�� ' ���&����������$��&�� ��� ��� '���� 2J01>=012 0777

?��������� #� ������ �� ���������� +� ����� !�J ?������� ���������J $�������&�� ' �� $��&�&�� ���:(� ����� $��&������'�& ����=���� ����'���� $���(�� �������� ' ����&�$��� 6��&�� �(�$�����$ ����� ��������(��� A(���� ����&��%� ( )��� !��� 0>1J729=0440 077<

?(�$� *�J ������ ' �� ��(�(�� ��$ ����&��% ' $��&�&��� ��� �� ;7J>47=>;2 0772

�����@ �� �@������ �S +�%��@��% "? +�%��@��% ��J ����(��������5��� ' �� $��&��������������� �&���C� ( )��� ��� 000J0710=0717 0772

��&�5%���� � ������ �J ���������� &��$ ' "�� ������ �% ���$�(���$���(& ���%���������������'�& �C������ ���� !������0<;J09<=097 0723

#�$% "��� +����&����� ������ &������%� *�J ������ � ������ � �$��������� �� �*�� ����� ��� ,�$�J �� ����% 0729 ��� 0=><

����� !� ����% �� ������ �� ����� �, ������ "� ���� ?� ������ ,�J��(�(�� ' �� �(&�� $��&�������� *&�������� '� '(���� �� ��$��&�&�� ���:(�� ( !��� )��� ;<9J;<4>=;<0; 0774

���'6�� ��� �($�� �" ,���� *�J ����$��� ' �������5���� *�J "� � �������� �� #����� �� �$�� �+����* �� � ������,� <� �$�� DC'�$J?�������� 0772 ��� 012>=0922

������� �� !(��� � ������� � "��� �J ,����5��� ' � ��(� '� �� �����$'�& ' ���&������ ����$��&� ���&�&� 02: ���� �� $��&�&����$����� ���� ��(���� ��� ��� '���� 1J0409=04;4 0779

!���@��% � !�%&����% �J ������ �C�� $(������� �� -������ ��$(��$ �% ��@����C������� ' �� ��$���������$��� ����� ���������� . �� /��� ���� ���#�� 7;J19;;=19;< 0779

!(���� �� �(� # (��� #J ������ � �������J $���� ���$��� ������������ ����&�$��� 6��&��� ��$ $��&�&�� ������� ( )��� !��� 0;3J0417=04<4 0771

!����5%� �� ?��������� #� ?�����$ �# �� ��J +�� �&�����&���� $&��� '$��&������ ���$� ��������� ��$ ��(���� $��&�&�� ��$��������������� �&���C��� ( )��� !��� 0>7J33>=321 0773

!����5%� �� ?��������� #� ��@��� �� ����� �, ����� !�J ���&�&��J��������(��� �$����@� A(����� ��������5�$ '� ����&�� ' ����&�$���6��&���� 0�� ��� )���� 029J;>3=>4; 0777

����55� � ?(�$� *� ?(C� "� ����� �*J ��C������� ' �� %��� '$��&�&�� ��$����� ��$ ��������� ��'��� ���� ��������(��� �$������ ()��� ��� 000J179=947 0772

������ �� �������� �" ���&��� �� �� ��J �(���� �� �� ���������� 0 �������(� �� ��$��&�� $%�������G���� '������% �%�$�&�� /�� '���� 03J;14=;11 0773

������ �� ����� �� �������� �� �� ��J ���� '������% ��$ �%���$�����$��&�� $%������� ���(���� '�& ������ ' ���������� 0� ! ( � �����014J;73=>43 0777

���� �� ?��������� #� ����� !� ������ �� *� �J +���%���$ ����%��� ��@����'(�$�&���� $�''������� �� $���� ��������� ������ $��&������ ��$ ����%��������6� ����&�$��� 6��&���� ( !��� )��� ;3;J;0179=;094> 0773

���$�� � ,� S ���� �J ���&�&� ����&��% ��$ $������&��% ��� ���(���$ �%��@������� ����� ������%���� �� �(�(��$ ��������� ������ )��� �����)����*�� >4J042=0;0 0779

"���&�� , ��&��� � ��@��� �� �� ��J �&�����&���� $����� �� � $��&�&����$����� ��(��� �� ���� $������ ����� ���&������ ����$��&�� ��� ���'���� 2J730=73< 0777

�&�� #� (��� #J ��6���� �� ��������� ������ ����&�$��� 6��&��� ��$$��&�&��� ( )��� !��� 010J0;;7=0;10 0772

���������� +� ,�&� �� ������ �� ����� !�J ������%���� ' ��$��&������ �DD� ��&��(� �����@��% ���(���� �� �������� ��� ����������&�$��� 6��&�� ������� ( )��� !��� ;<7J;7>90=;7>91 0771

����� �, ������ "� ����% �� ����� !�J ����(��� ��(�(�� ' �� �(&��$��&������ * ��$ ** �&�� ��&��(�� . �� /��� ���� ��� #�� 27J911=912 077;

,57 ��*++D�! �� +�# �D-"��, D *��#�+*��+*�# �#"��+D,D�O