Studi Epidemiologi Agen Zoonosis Escherichia Coli

142

Jurnal Veteriner Juni 2011 Vol. 12 No. 2: 142-151ISSN : 1411 - 8327

Studi Epidemiologi Agen Zoonosis Escherichia coliO157:H7 melalui Analisis Random Amplification

of Polymorphic DNA (RAPD)

(EPIDEMIOLOGYCAL STUDY OF ZOONOTIC AGENT Escherichia coli O157:H7 BYRANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA ANALYSIS)

I Wayan Suardana1, Wayan Tunas Artama2, Widya Asmara3, danBudi Setiadi Daryono4

1 Mahasiswa S3 Program Studi Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Staf Bagian KesehatanMasyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana, Jl. PB.Sudirman

Denpasar, Bali Tlp.(0361) 223791, 701808; E-mail : [email protected] Bagian Biokimia, 3 Bagian Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Hewan Univesitas Gadjah Mada

Jl. Olahraga Karangmalang, Yogyakarta 55281, Tlp.(0274) 560864, Fax.(0274) 560861;E-mail : [email protected]

4 Bagian Genetika, Fakultas Biologi Universitas Gadjah MadaJl. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta 55281. E-mail: [email protected]

ABSTRAK

Studi epidemiologi terhadap agen zoonosis Escherichia coli O157:H7 pada umumnya menggunakananalisis secara fenetik dan atau secara genetik. Pada analisis secara fenetik, pengelompokan bakterididasarkan dengan adanya kemiripan baik fenetik maupun genetik, tanpa memperhatikan aspek asal-usul ataupun evolusinya. Mempertimbangkan pentingnya aspek epidemiologi dari E. coli O157:H7, makastudi variasi genetik dari isolat yang berasal dari berbagai sumber sangat perlu dilakukan, denganharapan patogenesis dari infeksi dapat diperkirakan. Sebanyak 20 isolat yang berasal dari feses manusiaklinis, feses manusia non-klinis, feses sapi, feses ayam dan daging sapi digunakan sebagai materi dasardalam penelitian ini. Penelitian diawali dengan konfirmasi ulang terhadap keseluruhan isolat dengan ujiaglutinasi latek O157 dan uji antiserum H7, yang dilanjutkan dengan uji molekuler untuk analisis DNAgenom dengan uji random amplification of polymorphic DNA (RAPD). Data hasil uji RAPD dianalisisdengan metode simple matching coeficient (Ssm) dan alogorhythm unweighted pair group method usingarithmetic averages (UPGMA). Hasil penelitian menunjukkan bahwa DNA genom dari isolat lokal E. coliO157:H7 memiliki kemiripan paling rendah 75,1% dan paling tinggi 96,6% dibandingkan dengan isolatkontrol ATCC 43894. Diketahui bahwa isolat asal feses sapi SM-7(1) dan isolat asal feses manusiaklinis KL-68(1) memilki kemiripan yang paling tinggi 96,6% dibandingkan isolat kontrol ATCC 43894.Disamping itu, isolat klinis KL-52(7) juga memiliki kemiripan 96,6% dengan isolat asal feses ayam MK-35 disamping juga isolat asal daging sapi (DS-21(4) dan DS-16(2)) juga memiliki kemiripan yang tinggiyakni 84,9% terhadap isolat lainnya termasuk isolat kontrol. Adanya kemiripan yang cukup tinggi dariisolat asal feses sapi, feses ayam dan daging sapi dengan isolat asal feses manusia mengindikasikanbahwa kedua jenis hewan berpotensi sebagai reservoir untuk penyebaran agen zoonosis tersebut kemanusia.

Keywords: Zoonosis, E. coli O157:H7, fenetik.

ABSTRACT

Epidemiological studies of zoonotic agent Escherichia coli O157:H7 have been analyzed pheneticallyand or phylogenetically. In a phenetic classification, micoorganisms are arranged into groups (phena) onthe basis of high overall similarity using both phenotypic and genotypic methods without judgementaspect of its ancestry or evolutionary. Due to its importance to epidemiological aspect, the study of geneticvariation of isolates origin from some sources need to be conducted in order to trace the routes of infection.A total of 20 samples obtained from some sources i.e clinically human feces, non-clinically human feces,cattle feces, chicken feces, and beef feces were used in this study. The study was started by confirming allof the isolates using O157 latex agglutination test and H7 antiserum test, followed by genomic DNAanalysis by random amplification of polymorphic DNA /RAPD methods. RAPD results were analyzed

143

Suardana et al Jurnal Veteriner

PENDAHULUAN

Sampai saat ini informasi keberadaan E.coliO157:H7 dalam kaitannya sebagai agen zoonosisdi Indonesia masih sangat jarang terungkap.Padahal Shiga toxin yang dihasilkan olehbakteri ini dapat menimbulkan bahaya yangcukup fatal terutama pada anak-anak dengantingkat morbiditas dan mortalitas yang sangattinggi (Acheson, 2000; Centers fo Disease Controland Prevention, 2000). Hasil temuan cemaranE.coli O157:H7 oleh Suardana et al. (2010) padadaging sapi, feses sapi, feses ayam, manusia non-klinis dan manusia klinis masing-masingsebesar 2,6; 5; 2,5; 6,7; dan 15%, menunjukkanbahwa keberadaan agen zoonosis tersebut telahterdistribusi secara luas baik pada hewanmaupun manusia, sehingga karakter molekulerepidemiologinya perlu dikaji secara lebihmendalam.

Kajian epidemiologi suatu agen zoonosisdengan aplikasi teknik genetik telah banyakdigunakan oleh para peneliti termasukdidalamnya adalah penggunaan metode DNAsubtyping untuk mengkarakterisasi genombakteri seperti pulsed-field gel electrophoresis(FGE), ribotyping, random amplifiedpolymorphic DNA (RAPD) dan DNA sequencing(Hill dan Jinneman, 2000).

Strain verocytotoxigenic E. coli seperti E.coli O157:H7 dapat memiliki karakter yangbervariasi, serta dapat diklasifikasikan secaraartificial ataupun natural. Klasifikasi naturalterbagi menjadi klasifikasi phenetic danphylogenetic. Dalam klasifikasi fenetik,mikroorganisme tersusun menjadi grup (phena)berdasarkan kemiripan sifat fenotip atau genotiptanpa menyinggung asal usul atau evolusiorganisme tersebut, sedangkan klasifikasifilogenetik lebih didasarkan pada kesamaangenetik (genealogik) yang menelusuri evolusidan asal usul organisme (Priest dan Austin,

1993). Drastini (2007) melaporkan karakterVTEC berdasarkan profil ribotypingmenggunakan enzim restriksi EcoR1 maupunSalI. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwaVTEC (O157 maupun non-O157) terletak dalamklaster yang berbeda dengan O157:H7 darimanusia. Dengan enzim EcoR1, VTEC terletakdalam tingkat kemiripan 77,6%, sedang denganenzim SalI dalam tingkat 59,9%. Penelitilainnya, Fadil Al-Darahi et al., (2008)menggunakan metode Random Amplification ofPolymorphic DNA (RAPD) berhasilmenemukan 56 genotipe dari 10 isolat E. coliO157:H7 yang diuji dan menyimpulkan bahwaanlisis PCR-RAPD merupakan metode yangterbukti dapat memberikan nilai diversitymoleculer yang tinggi terutama dalam studiepidemiologi dari E. coli O157:H7.

Bertitik tolak dari permasalahan di atasdengan memperhatikan metode randomlyamplified polymorphic DNA (RAPD) sebagaisalah satu metode sidik jari DNA yangdidasarkan pada reaksi PCR yang umumdigunakan untuk mengklasifikasikan strainbakteri (Franklin et al., 1999), sertamempertimbangkan belum adanyakarakterisasi genetik E.coli O157:H7 isolat lokal,maka terpikirkan untuk mengetahui variasigenetik diantara isolat E.coli O157:H7 antaramanusia dan hewan melalui pengujian denganmetode RAPD, sehingga pola epidemioloogipenyebaran agen E.coli O157:H7 sebagai agenzoonosis dapat diteguhkan.

METODE PENELITIAN

Persiapan IsolatIsolat Escherichia coli O157:H7 yang

digunakan dalam penelitian ini yaitu 20 isolatyang terdiri dari 11 isolat asal feses manusiaklinis, 2 isolat asal feses manusia non-klinis, 2

using a simple matching coeficient (Ssm) and alogorhythm unweighted pair group method using arithmeticaverages (UPGMA) programe. Results showed there were range of genetic DNA from local isolates (75.199,6%) which was almost similar to ATCC 43894 control isolate. The highest similarity (99.6%) to ATCC43894 control was showed by SM-7(1) isolate obtained from cattle fecal and KL-68(1), isolate obtainedfrom clinically human fecal. In addition, KL-52(7) obtained from clinically human fecal had high similarity(99.6%) to MK-35 isolate obtained from chicken fecal. On the other hand, DS-21(4) and DS-16(2) isolatesthat were obtained from beef had high similarity (84.9%) to other isolates including ATCC 43894 controlisolate. The highest similarity of E. coli O157:H7 isolates that were obtained from cattle feces, beef, andchicken feces to human feces isolate indicated that there were both cattle and chicken were potentialreservoirs of the zoonotic agen which can be transmitted to human.

Keywords: Zoonoses, E. coli O157:H7, phenetic.

144

Jurnal Veteriner Juni 2011 Vol. 12 No. 2: 142-151

isolat asal feses ayam, 2 isolat asal daging sapi,2 isolat asal feses sapi dan 1 isolat kontrol ATCC43894 diambil dari stok isolat (disimpan dalamgliserol 30% dengan suhu penyimpanan -20OC)untuk selanjutnya di kultivasi pada medialactose broth (LB) selama semalam pada suhu37OC. Isolat yang tumbuh selanjutnya dikonfirmasi ulang dengan E. coli O157 latexagglutination test (Oxoid, DR120M), dengan caramereaksikan dengan pereaksi latex (1 tetes isolatditambah 1 tetes pereaksi latex). Hasil positifditandai dengan terbentuknya presipitasi, sesuaidengan kontrol positif yang tersedia (Oxoid,2010). Konfirmasi juga dilakukan terhadap H7dengan menumbuhkan isolat pada media brainhearth infusion broth (BHI). Isolat yang tumbuhselanjutnya diinaktivasi dengan formalin 40%dengan perbandingan 0,3 bagian formalin dalam100 bagian BHI, untuk selanjutnya disebutsebagai antigen. Antigen ini diuji denganantiserum H7 (BD DifcoTM E.coli Antiserum H7,Cat.No. 221591) yang telah diencerkan denganperbandingan 1:500. Pengujian dilakukandengan mereaksikan 50 l antigen dengan 50 lantiserum di dalam plat dan diinkubasi padawaterbath dengan suhu 50OC selama 1 jam.Hasil yang positif ditandai dengan terbentuknyabutiran pasir (presipitasi) pada dasar plat (Difco,2009).

Isolasi DNA Genomik BakteriTahap isolasi DNA genomik bakteri

mengacu pada prosedur Qiagen (2007). Isolat E.coli O157:H7 yang diinokulasi pada media LBdipanen dengan cara sentrifugasi 7500 rpmselama 5 menit. Supernatan dibuang, sedangpelet sel ditambah 180 l tissue lysis buffer(Bufer ATL) dan 20 l larutan proteinase Kselanjutnya divortek selama 15 detik. Larutankemudian ditambahkan 200 l lysis buffer(Buffer AL), divortek selama 15 detik,diinkubasikan pada waterbath suhu 56OCselama 10 menit, ditambahkan 200 l etanolabsolut 96-100%, dan divortek selama 15 detik.Lysate E. coli selanjutnya digunakan untukbinding DNA. Lysate dimasukkan ke dalammicrotube penyaring yang terletak dalamependorf 2 ml (QIAamp Mini spin column) dandisentrifius 6000xg (8000 rpm) selama 1 menit.Sisa cairan dibuang, dan filter yang telahmengandung DNA dimasukkan ke dalamependorf 2 ml yang baru dan dilanjutkan dengantahapan washing DNA. Filtrat DNA ditambah500 l wash buffer (buffer AW1) dan didiamkanselama 5 menit, disentrifius 8000 rpm selama 1

menit. Sisa cairan tertampung dibuang dandiganti dengan ependorf 2 ml yang baru. Washbuffer (buffer AW2) sebanyak 500 lditambahkan dan didiamkan selama 5 menit.Ependorf disentrifius dengan kecepatan penuh14.000 rpm selama 3 menit, sisa cairan yangtertampung dibuang dan dilanjutkan untukeluting DNA. QIAamp Mini spin column yangmengandung DNA dimasukkan ke dalamependorf (Nunc, Inc) steril baru, ditambahkan50 l elution buffer (buffer AE), didiamkan padasuhu kamar selama 5 menit, dan disentrifiusdengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit(ependorf telah mengandung larutan DNAmurni). Untuk menghindari pengulanganfreezing dan thawing, DNA murni disimpanpada 4OC untuk uji selanjutnya.

Pengukuran Konsentrasi dan KemurnianDNA

Sampel DNA diencerkan 50 kali (2 l DNAdicampur dengan 98 l distilled water) dankonsentrasi DNA diukur optical density (OD)-nya dengan menggunakan Spectrofotometer(Backman DU-65) pada panjang gelombang 260dan 280 nm. Konsentrasi DNA dihitung denganmenggunakan rumus seperti yang dilaporkanoleh Sambrook dan Russel (2001).

Reaksi Polymerase Chain Reaction (PCR)dengan Random Amplified PolimorphicDNA (RAPD).

PCR-RAPD dilakukan menggunakan 4primer universal pendek yaitu A-01: 5-CAG GCCCTTC-3; A-02: 5- TGC CGA GCTG-3; A-03: 5-AGT CAG CCAC-3 dan A-04: 5-ATT CGGGCTG-3. Reaksi PCR dilakukan pada totalvolume 27 l yang mengandung 1,0 l DNAtemplate, 12,5 l FastStart PCR Master (RocheCat No. 04710436001), 1,0 l masing-masingprimer dan 9,5 l distilled water. Amplifikasidilakukan pada mesin MJ Mini PersonalThermalcycler Biorad model PTC-1148 dengankondisi predenaturasi pada suhu 94OC selama5 menit, diikuti 36 siklus dengan kondisi reaksidenaturasi 94OC selama 1 menit, annealingpada 35OC selama 30 detik, dan polimerisasipada suhu 72OC selama 1 menit. Pada bagianakhir ditambahkan dengan polimerisasitambahan pada suhu 72OC selama 5 menit.Setelah reaksi selesai, sebanyak 5 l produkPCR dicampur dengan 2 L loading dye (blue/orange loading dye) dan dielektroforesis padagel agarose 1% (Gibco BRL Cat.No. 5510UA)yang telah diisi Ethium bromide solution 1,5 ml/

145

25 ml (Promega Cat.No. H5041), bersamadengan Marker 100 bp DNA Ladder (Invitrogen,Cat.No.10380-012). Elektroforesis dilakukanpada tegangan 100V selama 30 menit. Visualisasiband /pita yang muncul dilakukan dengan UVtransilluminator dan difoto dengan kameradigital FE-270 7,1 Megapixel.

Analisis DataData yang diperoleh dari hasil penelitian

dianalisis secara deskriptif, pita yang terbentukdikonversikan dalam bentuk matriks n x t (n =jumlah tipe pita, t = jumlah isolat) denganmetode sistematik numerik, dan dianalisisdengan Ssm serta UPGMA dalam programMultivariate Statistical Package (MVSP) 3.1(Sembiring, 2002).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil identifikasi variasi molekuler isolatEscherichia coli O157:H7 dengan metode RAPDseperti tersaji pada Gambar 1 dengan gambarangrafik representatifnya pada Gambar 2, sertavariasi band / pita yang terbentuk secararingkas tersaji pada Tabel 1.

Setelah dilakukan perhitungan variasijumlah pita yang muncul pada Gambar 1 dan2. didapat hasil seperti tersaji pada Tabel 1.

Hasil PCR-RAPD pada Gambar 1 yangdikonversi dengan grafik representatif Gambar2, serta hasil perhitungan fragmen pita yangterbentuk seperti tersaji pada Tabel 1 di atas,terlihat adanya variasi fragmen dan jumlah pitadiantara ke-20 isolat yang diuji. Hasil inimemperlihatkan adanya penempelan primerpendek RAPD A-01, A-02, A-03, dan A-04 yangberbeda-beda pada masing-masing isolat.Adanya variasi penempelan primer ini, dapatdigunakan sebagai petunjuk adanya perbedaanvariasi sekuen dari DNA genom masing-masingisolat. Dari 20 isolat yang diuji ditemukanadanya jumlah band/pita yang bervariasi antara1 pita sampai 6 pita. Fragmen pita yangterbentuk juga bervariasi mulai dari 200 bpsampai 2366 bp dengan 20 macam genotipe.Glick and Pasternak (2003) mengungkapkanbahwa primer/oligonukleotida pendek yangdigunakan dalam reaksi RAPD akanmembentuk pasangan di banyak tempat denganDNA kromosom. Jumlah fragmen DNA yangteramplifikasi akan tergantung pada primer dan

Tabel 1. Fragmen dan Jumlah Pita Isolat E. coli O157:H7 Hasil PCR-RAPD.

No

1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.

Isolat

ATCCKL 52(7)KL 87(7)KL 30(4)KL 45(1)KL 48(2)KL 85(1)KL 83(5)KL 24(5)KL 68(1)KL 106(3)KL 55(6)MK 35MK 19(8)/4M 14(4)M 17(1)DS 21(4)DS 16(2)SM 25(1)SM7(1)

Asal isolat

feses manusiafeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses manusia klinisfeses ayamfeses ayamfeses manusia non-klinisfeses manusia non-klinisdaging sapidaging sapifeses sapifeses sapi

Total

DaerahPengambilan

USAKarangasemDenpasarBadungDenpasarBadungKarangasemKarangasemBadungBadungNegaraBadungDenpasarDenpasarBadungBadungPasar BadungPasar BadungBadungBadung

Fragmen pita(bp)

1100; 7001100;800;5001721;1100;700;5001721;700;4141721;1100;900;500;2621100;800;6001721;1100;900;737;5001721;1100;900;737;414;2621776;1127;737;5387001808;1200;800;553;5002366;13001100;8001808;1100;500;2501100;600;3001500;1100;500;3001400;1100;429;2001400;1100;4291000;600;3421100

Jumlahpita

23435356415224344331

67


146

DNA genom yang digunakan, sehingga metodeRAPD dapat digunakan untuk mengetahuikarakteristik dari seluruh genom ataupunkromosom suatu individu. Prist and Austin(1993) mengungkapkan bahwa produk RAPDyang dipisahkan dengan gel agarose secaraelektroforesis akan menjadi sebuah sidik jari /fingerprint dari suatu strain yang dicirikan olehsejumlah pita yang muncul pada gel. Pendapatyang sama juga ditegaskan oleh Franklin et al.(1999) yang menyatakan bahwa individu dengankarakter sekuennya yang berbeda, akanmemiliki tempat penempelan primer yangberbeda dan menghasilkan spektrum fragmen

yang berbeda pula, sehingga keadaan ini akanmenciri pada individu dengan karakter genetikyang berbeda, atau merupakan suatu sidik jari.Akurasi RAPD sebagai salah satu metodegenotyping yang cukup handal telah dibuktikanoleh Vogel et al., (2004) yang menemukanbahwa metode RAPD memiliki nilai resolusiyang tinggi hampir sama dengan metodeFluorescent Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP) dan Pulsed-Field GelElectrophoresis (PFGE). Memperhatikanadanya variasi jumlah pita dan variasi fragmenpita yang terbentuk diantara ke-20 isolat E. coliO157:H7 yang diuji, maka dapat disimpulkan

Gambar 1. Profil genom DNA isolat E. coli O157:H7 dengan metode RAPD pada agarose 1%.Kolom 1 kontrol positip : ATCC 43894; 2 sampai 12 Feses manusia klinis yaitu; kolom2: KL52(7); 3: KL87(7); 4: KL30(4); 5: KL45(1); 6: KL(48(2); 7: KL85(1); 8: KL83(5);9: KL24(5); 10: KL68(1); 11: KL106(3); dan kolom 12: KL55(6); kolom 13 sapai 14Feses ayam yaitu; kolom 13: MK35; 14: MK19(8)/4; kolom 15 sampai 16 Feses manusianon-klinis yaitu; kolom 15: M14(4)/ dan kolom 16: M17(1); kolom 17 sampai 18 Dagingsapi yaitu; kolom 17: DS21(4) dan kolom 18: DS16(2); kolom 19-20 Feses sapi yaitu;kolom 19: SM25(1) dan kolom 20: SM7(1). M: Marker 100 bp DNA Ladder; K-: Kontrolnegatif.


147

bahwa metode RAPD yang digunakan cukuphandal sebagai metode genotyping yangmenggambarkan adanya variasi genetik darimasing-masing isolat.Kajian lebih lanjut yang didasarkan atas polapita yang terbentuk berupa hasil analisisberbentuk dendogram yang menunjukkantingkat kemiripan/ similaritas di antara ke-20isolat E. coli O157:H7 lengkap dengan nilaipersentase kemiripannya (% similaritas) sepertitersaji pada Gambar 2.

Dendogram Gambar 2 menunjukkan bahwadari 20 isolat lokal E. coli O157:H7 dengan asalsampel berbeda yakni isolat asal feses manusiaklinis (penderita dengan gangguan fungsi ginjal),

isolat asal feses manusia non-klinis, isolat asalfeses sapi, feses ayam dan daging sapi terbagikedalam 15 klaster dengan 19 titik percabangan(node). Klaster 1 terdiri atas ATCC 43894 danKL-68(1) dengan tingkat similaritas 96,6%.Klaster 2 yaitu SM-7(1) dengan tingkatsimilaritas 94,9% terhadap klaster 1; klaster 3yaitu KL-87(7) dengan tingkat similaritas 90,8%terhadap klaster 1 dan 2; klaster 4 yaitu KL-30(4) dengan tingkat similaritas 89,7% terhadapklaster 3, 2 dan 1, demikian seterusnya denganklaster 5 (terdiri dari KL-52(7) dan MK-35)sampai klaster 15(KL-106(3)) dengan tingkatsimilaritasnya masing-masing. Gambar 2menunjukkan tingkat similaritas diantara ke-

Gambar 2. Grafik representative profil genom DNA isolat E. coli O157:H7 dengan metode RAPDpada agarose 1%. Kolom 1 kontrol positip : ATCC 43894; 2 sampai 12 Feses manusiaklinis yaitu; kolom 2: KL52(7); 3: KL87(7); 4: KL30(4); 5: KL45(1); 6: KL(48(2); 7:KL85(1); 8: KL83(5); 9: KL24(5); 10: KL68(1); 11: KL106(3); dan kolom 12: KL55(6);kolom 13 sapai 14 Feses ayam yaitu; kolom 13: MK35; 14: MK19(8)/4; kolom 15sampai 16 Feses manusia non-klinis yaitu; kolom 15: M14(4)/ dan kolom 16: M17(1);kolom 17 sampai 18 Daging sapi yaitu; kolom 17: DS21(4) dan kolom 18: DS16(2);kolom 19-20 Feses sapi yaitu; kolom 19: SM25(1) dan kolom 20: SM7(1). M: Marker100 bp DNA Ladder; K-: Kontrol negatif.


148

20 isolat yang diuji berada pada kisaran 75,1sampai 96,6%. Kisaran yang cukup tinggitersebut menunjukkan adanya peluang untukditemukannya kesamaan DNA atau DNA-DNArelatednes dari isolat E. coli O157:H7 yang diuji.Pendapat ini didukung oleh Rosello-Mora danAmann (2001) yang mengungkapkan bahwasecara umum suatu organisme di dalam spesiesprokariotik dapat dikelompokkan ke dalamstrain yang sama bilamana memiliki kemiripangenom 70% atau lebih besar. Dijelaskan lebih

lanjut bahwa DNA-DNA relatednes dengantingkat kemiripan > 70 % cenderung memilikikesamaan sekuen gen 16S rDNA >97%.

Ditemukannya tingkat kemiripan yangtinggi (96,6%) antara isolat E. coli O157:H7 asalfeses manusia klinis dengan isolat asal feses sapi,demikian juga antara isolat asal manusia klnisdengan isolat asal feses ayam, mengindikasikanhewan sapi ataupun ayam berpotensi sebagaisumber penularan dari agen zoonosis E. coliO157:H7. Nataro dan Kaper (1998) menyatakan

Gambar 2. Dendogram similaritas antara isolat E. coli O157:H7. Dendogram dibuat berdasarkansimple matching coefficient (Ssm) dan alogorythm unweighted pair-group method witharithmetic average (UPGMA).


149

bahwa hewan sapi, kambing, domba, babi,kucing, anjing dan unggas merupakan reservoiralamiah dari E. coli O157:H7, yang dapatberpindah ke manusia melalui makanan atauminuman yang terkontaminasi.

Adanya kemiripan yang tinggi antara isolatasal feses sapi, feses ayam, daging sapi, fesesmanusia non-klinis maupun manusia klinis,menunjukkan isolat E. coli O157:H7 yangdiisolasi berpeluang besar bersifat zoonosis yaknidapat menular dari hewan / produk hewansebagai reservoirnya ke tubuh manusia denganataupun tanpa menunjukkan gejala klinis.Kesimpulan terjadinya penularan dengan tanpamemperlihatkan gejala klnis ini padapenderitanya didukung dengan ditemukannyakemiripan yang cukup tinggi (89,7%) antaraisolat M14(4) dan M17(1) dengan isolat penderitaklinis hemodialisis KL-52(7) dan KL-48(2), sertaisolat asal feses ayam MK-35. Disamping itu,ditemukan juga kemiripan yang tinggi antaraisolat E. coli O157:H7 asal manusia dengan

gejala klinis (penderita hemodialisis) dengankarakteristik penderita seperti pada Tabel 2dengan isolat asal hewan (feses sapi dan fesesayam) ataupun dengan isolat yang berasal daridaging sapi.

Data pada Tabel 2 menegaskan bahwa isolatE. coli O157:H7 dapat diisolasi dari penderitasekalipun tanpa adanya kontak dengan hewansapi, babi,ayam, kambing ataupun dombasebelum si pasien menderita gagal ginjal untukpertama kalinya, walaupun kausa gagal ginjaltidak semata-mata disebabkan oleh agen infeksiE. coli O157:H7. Hasil penelitian ini mengin-dikasikan kemungkinan dapat terjadinyatransmisi agen secara horizontal dari orang keorang. Nataro dan Kaper (1998) menyatakanbahwa sekalipun hewan sapi, kambing, domba,babi, kucing, anjing dan unggas merupakanreservoir alamiah dari E. coli O157:H7, yangdapat berpindah ke manusia melalui makananatau minuman yang terkontaminasi, namunpeluang terjadinya perpindahan agen dari orangke orang juga dapat terjadi.

Tabel 2. Karakteristik Penderita Klinis Hemodialisis di RSUP Sanglah Positip E.coli O157:H7

No

1.

2.

3.

4.

5.

6.7.

8.

9

10

11

Kode

KL-52(7)

KL-87(7)

KL-30(4)

KL-45(1)

KL-48(2)

KL-85(1)KL-83(5)

KL-24(5)

KL-68(1)

KL-106(3)

KL-55(6)

Alamat

Karangasem

Jl. ArjunaNo. 19,DenpasarMambal,BadungJl. TukadBalian,DenpasarTuban,BadungKarangasemKarangasem

JimbaranBadungNusa DuaBadung

Negara

PelagaBadung

Gejala Klinis(sebelum cuci

darah)

Muntah, mencret,dingin

Radang ginjal

Sakit pinggang

Mual, mencret,sesak

Mual, mencret,batu ginjalMual. mencretMual, mencret,gatal-gatalKomplikasi

Bengkak,komplikasijantungOperasi ginjal(infeksi)Mencret, infeksiginjal

Telah cucidarah

Maret 2009

2007

Juli 2007

2007

Juli 2008

2 tahun2,5 tahun

6 bulan

1,5 tahun

1 tahun

6 bulan

Kontak langsung denganhewan sebelum cuci darah

pertama kali

Sapi Babi Kambing/ Unggas/Domba Ayam

+ + - +

- - - +

- - - -

- - - -

+ + - +

+ + - -- +

- - - -

- - - +

- - - -

+ + - +

Keterangan

Petani

PNS (DinasSosialProp.Bali)TukangPNS (GuruSD)

Swasta

SwastaPNS

Ibu RumahTanggaSwasta

Pegawai BankMandiriPenjual satebabi


150

Adanya kemiripan dari isolat lokal denganisolat referen (kontrol ATCC 43894)mengidentifikasikan bahwa isolat lokal hasilisolasi dan identifikasi berpeluang besarmemiliki sifat patogenitas yang serupa dengankejadian awal ditemukanya wabah E. coliO157:H7, dimana isolat referen tersebut berasal.Tingkat kemiripan/similaritas yang tinggiantara isolat kontrol ATCC 43894 dengan isolatasal feses manusia klinis KL 68(1) yang riwayatpenderitanya sempat mengadakan kontakdengan ayam dan isolat asal feses sapi SM 7(1)sebesar 96,6%, mencerminkan bahwa agenzoonosis tersebut dapat ditemukan pada hospesayam, sapi serta manusia. Sekalipun ayambukan merupakan reservoir utama sepertihalnya pada sapi, namun Schoeni dan Doyle(1994) membuktikan bahwa agen E. coliO157:H7 secara efektif dapat berkolonisasi padaayam umur 1 hari dengan dosis hanya 2,6 x 101

CFU, serta dibuktikan juga kolonisasi dapatbertahan sampai 11 bulan apabila ditantangdengan dosis 108 CFU. Peluang sapi ataupunayam sebagai reservoir yang dapatmemindahkan agen E. coli O157:H7 ke manusiadiperkuat oleh hasil penelitian Chinen et al.,(2009) yang berhasil menemukan bahwa 19 dari279 (6,8%) sampel burger sapi dan ayam serta,4 dari 39 (10,3%) sampel karkas ayam diketahuipositip E. coli O157.

SIMPULAN

Hasil analisis keragaman genetik DNAgenom dari isolat lokal E. coli O157:H7 denganmetode RAPD menunjukkan bahwa 1). DNAgenom isolat lokal memiliki kemiripan denganDNA genom E. coli O157:H7 ATCC 43894 antara75,1% - 96,6%; 2). Ditinjau dari sisi epidemiologimolekuler, ternak sapi dan ayam terbuktisebagai reservoir yang dapat memindahkanagen zoonosis E. coli O157:H7 ke manusia.

SARAN

Untuk lebih memastikan hasil pengujian,maka dipandang perlu dilakukan konformasiDNA genon dengan analisis 16S RNA ataupundengan metode genotyping lainnya sepertiFluorescent Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP) dan Pulsed-Field GelElectrophoresis (PFGE).

UCAPAN TERIMAKASIH

Pada kesempatan ini penulis mengucapkanterimakasih kepada Bapak Prof. Supar, APUatas bantuannya memberikan isolat kontrolATCC 43894, disamping itu penulis jugamengucapkan terimakasih kepada pihakLembaga Penelitian dan PengabdianMasyarakat Univeritas Gadjah Mada yang telahmendanai proyek penelitian ini melalui danaPenelitian Hibah Doktor Tahun Anggaran 2009dengan Kontrak No. LPPM-UGM/1104/2009tanggal 19 Mei 2009, dan pihak Dikti melaluidana Penelitian Hibah Bersaing TahunAnggaran 2009 dengan Kontrak No. 1491B.3/H14/HM/2009 tanggal 16 April 2009 serta danaBeasiswa Pendidikan Pasca Sarjana (BPPS)untuk mahasiswa program Doktor.

DAFTAR PUSTAKA

Acheson DWK. 2000. How Does Escherichiacoli O157:H7 Testing in Meat Compare withWhat We Are Seeing Clinically ?. Journalof Food Protection. 63 (6): 819-821.

Centers for Disease Control and Prevention.2000. Escherichia coli O157:H7. Availablefrom: URL: http://www.cdc.gov/ncidod/dmd/disease info/escherichiacoli.g.htm.

Chinen I, Epsteyn S, Melamed CL, Aguerre L,Espinosa EM, Motter MM, Baschkier A,Manfredi E, Miliwebsky E, Rivas M. 2009.Shiga Toxin_Producing Escherichia coliO157 in Beef and Chicken Burgers, andChicken Carcass in Buenos Aires,Argentina. International Journal ofMicrobiology. 132: 167-171.

Difco TM . 2009. E.coli H Antiserum H7. citedDesember 11, 2010. Available from: URL:http://catalog.bd.com

Drastini Y. 2007. Kajian VerocytotoxigenicEscherichia coli (VTEC) pada Ternak diIndonesia. Disertasi. Universitas GadjahMada. Yogyakarta.

Fahdil Al-Darahi K, Mahdi LK, Tariq Al-NaibK, Jubreal J. 2008. Molecular Characteriza-tion of E. coli O157:H7 Strains Using Ran-dom Amplified Polimorphic DNA (RAPD).Journal Dohuk Univ. 11(1): 198-204.

Franklin RB, Taylor DR, Mills AL. 1999.Characterization of Microbial CommunitiesUsing Randomly Amplified PolymorphicDNA (RAPD). Journal of MicrobiologicalMethods. 35: 225-235.


151

Glick R, Pasternak JJ. 2003. MolecularBiotecnology; Principles and Applications ofRecombinant DNA. 3rdEd. ASM Press.Washington DC.

Hill WE, Jinneman KC. 2000. Principles andApplication of Genetic Techniques forDetection, Identification, and subtyping ofFood-Associated Pathogenic Microorganismin The Microbiological Safety and Qualityof Food. Vol. II (ed) Barbara, M.Lund,T.C.Baird-Parker, and G.W. Gould. AspenPublishers, Inc. Gaithersburg, Maryland.

Nataro JP, Kaper JB. 1998. DiarrheagenicEscherichia coli. Clinical MicrobiologyReviews. 11(1): 142-201

Oxoid, 2010. E.coli O157 Latex Test Kit. citedDesember 11, 2010. Available from: http://www.oxoid.com

Priest B, Austin B. 1993. Modern BacterialToxonomy. 2ndEd. Chapman & Hall.London.

Rosello-Mora R, Amann R. 2001. Review. TheSpecies Concep for Prokaryotes. FEMSMicrobiology Reviews. 25: 39-67.

Qiagen. 2007. QIAamp DNA Mini and BloodMini Handbook. 2nd Ed. Sample & AssayTechnologies.

Sambrook J, Russel DW. 2001. MolecularCloning: A Laboratory Manual. 3rdED. ColdSpring Harbor Laboratory Press. New York.

Schoeni JL, Doyle MP. 1994. VariableColonization of Chickens PerorallyInoculated with Escherichia coli O157:H7and Subsequent Contamination of Eggs.Journal of Applied EnvironmentalMicrobiology. 60: 2958-2962

Sembiring L. 2002. Sistematika Mikrobia.Petunjuk Praktikum. LaboratoriumMikrobiologi Fakultas Biologi UniversitasGadjah Mada. Yogyakarta.

Suardana IW, Artama WT, Asmara W,Daryono BS. 2010. Identifikasi Escherichiacoli O157:H7 serta Deteksi Gen Shiga LikeToxin 1 dan 2 Asal Feses Hewan, Dagingdan Feses Manusia. Jurnal Veteriner. 11(4):264-270.

Vogel BF, Fussing V, Ojeniyl B, Gram L,Ahrens. 2004. High Resolution Genotypingof Listeria Monocytogenes by FluorescentAmplified Fragment Length PolymorphismAnalysis Compared to Pulsed-Field GelElectrophoresis, Random AmplifiedPolymorphic DNA Analysis, Ribotyping,and PCR-Restriction Fragment LengthPolymorphism Analysis. Journal of FoodProtection. Vol 67(8): 1656-1665.


Documents

Studi Epidemiologi Agen Zoonosis Escherichia Coli