Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
STUDIE VAN DE INFLAMMATIE EN
MORFOLOGISCHE VERANDERINGEN
GEASSOCIEERD MET INTRADUCTALE
BORSTTUMORPROGRESSIE IN NF-ΚB
REPORTER MUIZEN
Aantal woorden: ±16 500
NIELS VANDER ELST
Studentennummer: 01203388
Promotor: Prof. dr. Evelyne Meyer
Promotor: Jonas Steenbrugge
Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde
Academiejaar: 2017 – 2018
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid
of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen
inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid
voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef
VOORWOORD
Via deze weg wil ik graag mijn dank betuigen aan iedereen die op één of andere manier betrokken is
geweest bij mijn Masterproef II van het academiejaar 2017-2018. Dit is in de eerste plaats Jonas
Steenbrugge, een PhD-student van de vakgroep Farmacologie, Toxicologie en Biochemie (Faculteit
Diergeneeskunde, Universiteit Gent), die mij dagelijks begeleidde bij het uitvoeren van de experimenten en
het schrijven van dit werk. Zijn overtuiging en enthousiasme om een goed en betrouwbaar muismodel voor
borstkankeronderzoek te ontwikkelen hebben mij steeds opnieuw weten te motiveren. Daarnaast wil ik
graag Prof. dr. Evelyne Meyer bedanken, omdat zij steeds heeft gezorgd voor de nodige begeleiding en
ondersteuning. Zonder haar geduld en expertise zou het niet mogelijk geweest zijn om deze Masterproef II
tot een goed einde te brengen. Ten slotte wil ik ook graag Kristel Demeyere bedanken, omdat ook zij altijd
voor mij klaar stond indien ik prangende vragen had. Haar kennis en expertise aangaande flowcytometrie,
alsook de hulp die zij bood tijdens verschillende experimenten, hebben een grote meerwaarde betekend in
deze Masterproef II.
Daarnaast wil ook nog graag alle partners bedanken die op één of andere manier hebben bijgedragen tot
mijn onderzoek en het ontstaan van deze Masterproef II. Het intraductaal Py230 muismodel kadert in een
groter project waarin wordt gezocht naar een betrouwbaar diermodel voor borstkankeronderzoek. In dit
project zijn naast de Faculteit Diergeneeskunde van de Universiteit Gent, ook Kom Op Tegen Kanker en de
Universiteit Antwerpen betrokken. Daarnaast wil ik ook het Laboratorium voor Experimenteel
Kankeronderzoek van het UZ Gent bedanken, omdat zij zo vrij waren om mij gebruik te laten maken van de
nodige apparatuur voor het immunohistochemisch aankleuren van verschillende coupes.
INHOUDSOPGAVE
DEEL A : LITERATUURSTUDIE
1. INLEIDING ................................................................................................................................................ 8
1.1. Kanker in België ..................................................................................................................................... 8
1.1.1. Incidentie ...................................................................................................................................... 8
1.1.2. Borstkanker in cijfers .................................................................................................................... 8
1.2. De tumorgenese .................................................................................................................................... 9
1.3. De verschillende types borsttumoren ................................................................................................... 9
1.3.1. Het ductaal carcinoom in situ (DCIS) en het invasief ductaal carcinoom (IDC) .......................... 10
1.3.2. Het lobulair carcinoom in situ (LCIS) en het invasief lobulair carcinoom (ILC) ........................... 10
1.4. Tripel negatieve borsttumoren ........................................................................................................... 10
1.5. De genen BRCA-1 en BRCA-2............................................................................................................... 10
1.6. De voornaamste risicofactoren van borstkanker ................................................................................ 11
1.7. Mammatumoren bij de teef ................................................................................................................ 12
2. HET TUMORALE MICROMILIEU .............................................................................................................. 13
2.1. Drie stromale componenten met samen acht sleutelfuncties ............................................................ 13
2.1.1. Stimuleren van celdeling en -groei (tumorpromotie) ................................................................ 14
2.1.2. Ongevoeligheid voor antigroeifactoren ..................................................................................... 14
2.1.3. Resistentie aan celdood ............................................................................................................. 14
2.1.4. Replicative immortaliteit ............................................................................................................ 14
2.1.5. Angiogenese ............................................................................................................................... 15
2.1.6. Invasie en metastase .................................................................................................................. 15
2.1.7. Destructie door immuuncellen vermijden (immuno-evasie) ..................................................... 15
2.1.8. Modificatie van het cellulair metabolisme ................................................................................. 15
2.2. Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma ....................................................................... 16
2.2.1. TNF-α .......................................................................................................................................... 16
2.2.2. IL-6 .............................................................................................................................................. 16
2.2.3. IL-10 ............................................................................................................................................ 16
2.2.4. TGF-β .......................................................................................................................................... 16
2.2.5. CCL2 (MCP-1) .............................................................................................................................. 17
2.2.6. BAFF ............................................................................................................................................ 17
2.2.7. IL-1β ............................................................................................................................................ 17
2.2.8. MIP-2 (CXCL2) ............................................................................................................................. 18
2.3. Conclusie ............................................................................................................................................. 18
3. DE LINK TUSSEN NF-κB, INFLAMMATIE EN KANKER ............................................................................... 19
3.1. Van DNA tot homo- of heterodimeer ................................................................................................. 19
3.2. De verschillende pathways voor activatie van NF-κB ......................................................................... 21
3.3. De relatie van NF-κB met inflammatie en kanker ............................................................................... 22
3.3.1. Direct effect van NF-κB op tumorvorming ................................................................................. 23
3.3.2. Indirect effect van NF-κB op tumorvorming ............................................................................... 23
3.3.3. De mogelijkheden van NF-κB in antitumorale therapieën ......................................................... 23
4. HET BORSTKANKER MUISMODEL ........................................................................................................... 24
4.1. De Py230 tumorcellijn ......................................................................................................................... 24
4.2. Het intraductaal muismodel ............................................................................................................... 25
4.3. Conclusie en toekomstvisie ................................................................................................................. 26
5. METEN VAN INFLAMMATIE VIA BIOLUMINESCENTIE ............................................................................. 27
5.1. Bioluminescentie in muismodellen ..................................................................................................... 27
5.2. Meting van bioluminescentie .............................................................................................................. 28
5.3. Factoren die de bioluminescente beeldvorming beïnvloeden ............................................................ 28
6. DE ROL VAN MMP-9, VEGF, CHI3L1 EN LCN2 OP DE TUMORGENESE ...................................................... 29
6.1. Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9) ................................................................................................... 29
6.2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) ......................................................................................... 29
6.3. Chitinase 3-like 1 (CH3L1) ................................................................................................................... 30
6.4. Lipocaline 2 (LCN-2) ............................................................................................................................ 30
DEEL B : EXPERIMENTEN
1. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................................................. 31
1.2. Cultuur van Py230 mammatumorcellen ............................................................................................. 31
1.3. Selectie van NF-κB Luc+ transgene muizen ......................................................................................... 31
1.4. Intraductale injectie van Py230 mammatumorcellen in de melkklier ................................................ 31
1.5. Analyse van primaire tumorgroei en geassocieerde lokale en systemische veranderingen .............. 32
1.6. Histologische evaluatie van primaire mammatumor, milt en metastasen ......................................... 32
1.7. Immunohistochemie ........................................................................................................................... 32
1.8. Flowcytometrie ................................................................................................................................... 33
1.9. Expressie van MMP-9, VEGF, CHI3L1 en LCN2 .................................................................................... 35
1.10. Statistische analyse ............................................................................................................................. 35
1.11. Tijdlijn van het Py230 intraductale tumor experiment ....................................................................... 36
2. RESULTATEN .......................................................................................................................................... 37
2.1. Primair mammatumorvolume en gewicht van primaire mammatumoren, milt en axillaire
lymfeknopen ..................................................................................................................................................... 37
2.2. H&E lichtmicroscopie en Ki67 IHC van de primaire mammatumoren ................................................ 38
2.3. Evolutie van NF-κB-activiteit tijdens de primaire tumorgroei ............................................................ 41
2.3.1. In vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren ......................... 41
2.3.2. Ex vivo bioluminescentie NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren en de axillaire
lymfeknopen ................................................................................................................................................. 41
2.4. CD45, CD163, Ly6G en CD8a IHC evaluatie in de primaire mammatumoren ..................................... 43
2.5. Flowcytometrische evaluatie van de lokale immuuncelinflux in de primaire mammatumoren ........ 45
2.5.1. Methodiek .................................................................................................................................. 45
2.5.2. Resultaten .................................................................................................................................. 49
2.6. Matrixdegradatie en vaatvorming in het tumoraal milieu (lokaal) en serum (systemisch) ................ 50
2.6.1. Evolutie van MMP-9 in de primaire mammatumor en serum ................................................... 50
2.6.2. Evolutie van VEGF in de primaire mammatumor en serum ....................................................... 51
2.6.3. CD31 IHC evaluatie van de tumorale vaatvorming..................................................................... 51
2.7. Evolutie van CHI3L1 en LCN2 in de primaire mammatumor, milt, axillaire lymfeknopen en serum .. 52
2.7.1. CHI3L1 ........................................................................................................................................ 52
2.7.2. LCN2 ........................................................................................................................................... 52
3. DISCUSSIE ............................................................................................................................................... 54
3.1. Bespreking van de primaire tumorgroei en -progressie ..................................................................... 54
3.2. Bespreking van de lokale inflammatoire respons ............................................................................... 54
3.3. Bespreking van de tumor-geassocieerde veranderingen in de milt en lymfeknopen ........................ 55
3.4. Vergelijking van het Py230 en 4T1 intraductale muismodel ............................................................... 56
4. CONCLUSIE ......................................................................................... Fout! Bladwijzer niet gedefinieerd.7
LITERATUURLIJST .................................................................................................................................... 58
BIJLAGEN
Bijlage I : Scorerooster muizen ....................................................................................................................... 64
7
SAMENVATTING
Borstkanker is de meest voorkomende vorm van kanker in België en treft jaarlijks ongeveer 10 500
Belgische vrouwen, waarvan 1 op de 10 uiteindelijk sterft. In de strijd tegen deze ziekte is er nood aan
goede en betrouwbare diermodellen die het preklinische testen van nieuwe therapeutica mogelijk
maken. In deze masterproef werden tripel negatieve Py230 mammatumorcellen intraductaal
geïnoculeerd in het derde paar melkklieren van lacterende C57Bl/6 Tyr-/- NF-κB-luc+ muizen. Deze
reportermuizen werden op voorhand gescreend en geselecteerd op de aanwezigheid van het
luciferase-gen dat gekoppeld is aan de genexpressie van NF-κB om in vivo opvolging van de tumor-
geassocieerde inflammatoire respons mogelijk te maken. Onze resultaten tonen aan dat het
intraductale Py230 model tot 3 weken post-inoculatie representatief is voor het ductaal carcinoma in
situ stadium, waarbij de tumorcellen in de melkkliergangen aanwezig zijn. Vervolgens evolueert dit
verder tot het invasief ductaal carcinoma stadium, waarbij de tumorcellen het vetweefsel rondom de
melkkliergangen invaderen. Een lokale en systemische inflammatoire respons volgen op de
exponentiële tumorgroei, waarbij het absolute aantal immuuncellen tijdens de tumorprogressie sterk
stijgt en hun percentuele samenstelling onderling verandert. Er vinden ook systemische
veranderingen plaats, waaronder een vergroting van de milt en axillaire lymfeknopen, en een stijging
van de prognostische biomerkers chitinase 3-like 1 en lipocaline 2. De geïnoculeerde Py230
mammatumorcellen zijn weinig agressief en vertonen geen metastasen vooraleer het humaan
eindpunt van 2,0 cm³ op 6 weken post-inoculatie wordt bereikt. Deze studie kon daarmee aantonen
dat ons Py230 muismodel een beter klinisch en meer ethisch alternatief biedt voor het intraductale
4T1-model en de klassieke 'fat pad'-injectie.
ABSTRACT
Breast cancer is the most common form of cancer in Belgium and affects about 10 500 Belgian women
each year, of which 1 in 10 eventually die. In the fight against this disease, there is a need for good
and reliable animal models that enable preclinical testing of new therapeutics. In this master thesis,
triple negative Py230 mammary tumor cells were inoculated intraductally in the third gland pair of
lactating C57Bl/6 Tyr -/- NF-κB-luc+ mice. These reporter mice were screened and selected for the
presence of the luciferase gene that is linked to the expression of NF-κB, allowing to follow-up the
tumor-associated inflammatory response in vivo. Our results show that the intraductal Py230 model
is up to 3 weeks post-inoculation representative for the ductal carcinoma in situ stage, in which the
tumor cells are located in the milk gland ducts. Thereafter, an evolution to the invasive ductal
carcinoma stage was observed, characterized by tumor cell invasion into the adipose tissue of the
mammary gland. A local and systemic inflammation were detected as a response to the exponential
tumor growth and further investigation showed that whereas the absolute number of immune cells
increases strongly, their percental ratio changes over time. In addition, systemic changes including
enlargement of the spleen and axillary lymph nodes, as well as an increase in the recently discovered
immune-associated biomarkers chitinase 3-like protein 1 and lipocalin 2 were also observed.
Moreover, the inoculated Py230 mammary tumor cells are not very aggressive and do not develop
metastases prior to the human end point of 2,0 cm³ at 6 weeks post-inoculation. This study therefore
proved that our Py230 mouse model offers a better clinical and more ethical alternative to the
intraductal 4T1 model and the classic 'fat pad' injection.
8
DEEL A: LITERATUURSTUDIE
1. INLEIDING
1.1. Kanker in België
1.1.1. Incidentie
In België worden er jaarlijks ongeveer 65 000 nieuwe gevallen van kanker geregistreerd (Stichting
tegen kanker, 2017). Kanker komt meer voor bij mannen dan vrouwen. Momenteel maakt 1 man op
3 en 1 vrouw op 4 een vorm van kanker door voor de leeftijd van 75 jaar. De ziekte doet zich vooral
voor in de populatie ouderen: ongeveer 75% van de mannen en 64% van de vrouwen zijn minstens 60
jaar op het ogenblik van de diagnose. De meest voorkomende vorm van kanker bij mannen is
prostaatkanker (23%), gevolgd door longkanker (16%) en dikke darmkanker (7,5%). Bij vrouwen valt
op dat borstkanker (36%) veruit het meest voorkomende kankertype is. Op de tweede en derde plaats
volgen respectievelijk dikke darmkanker (14%) en longkanker (8,5%). Als het onderscheid tussen de
geslachten niet in rekening wordt gebracht, zijn de meest voorkomende kankers: borstkanker (16%),
dikke darmkanker (13%), longkanker (13%) en prostaatkanker (12%). Deze cijfers worden grafisch
weergegeven in Fig. 1.
1.1.2. Borstkanker in cijfers
Per jaar worden er ongeveer 10 500 nieuwe gevallen van borstkanker vastgesteld bij Belgische
mannen en vrouwen (Stichting tegen kanker, 2017). De ziekte heeft een mortaliteit van ongeveer 10%
bij vrouwen en 15% bij mannen, wanneer een periode van vijf jaar na de diagnose in rekening wordt
gebracht. Er overlijden ongeveer 2300 mensen per jaar aan de gevolgen van deze ziekte. Borstkanker
is de meest voorkomende vorm van kanker bij de Belgische bevolking. Ongeveer één vrouw op negen
Fig. 1: Incidentie van de meest frequente kankertypes bij mannen (links), mannen en vrouwen (midden) en
vrouwen (rechts). (Bron: http://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker, laatst
bijgewerkt op 16 november 2017).
9
zal de ziekte voor haar 75ste levensjaar doormaken. Hoewel borstkanker niet frequent voorkomt bij
mannen, wordt de diagnose toch jaarlijks 80 keer gesteld in dit geslacht. Opnieuw valt op dat
borstkanker zich vooral voordoet in de oudere populatie: 75% van alle borstkankers wordt
gediagnosticeerd bij vrouwen ouder dan 50 jaar. Bovenstaande cijfers worden voorgesteld in Fig. 2.
1.2. De tumorgenese
De ontstaanswijze van een tumor kan opgedeeld worden in meerdere fasen: (1) initiatie, (2) promotie
en (3) progressie (Chiers, 2015). Tijdens de eerste fase, de initiatie, zal er schade zijn aan het erfelijk
materiaal in een cel, zonder dat deze schade hersteld wordt. Dit type cel wordt een kanker stamcel
genoemd. De DNA-schade leidt vervolgens tot (a) het overmatig aflezen van proto-oncogenen of (b)
het onderdrukken van tumor suppressie genen. In de daaropvolgende fase, de promotie, is een
stimulus nodig die deze kanker stamcel aanzet tot deling en groei. Tijdens deze fase ontstaan
bijkomende mutaties waardoor de tumorcellen hun immortaliteit verwerven. Een voorbeeld hiervan
is het verlengen van de chromosomale telomeren. Vervolgens is er groei en expansie van de tumor.
Deze fase wordt de tumorprogressie genoemd. Als de tumor gescheiden blijft van het omgevende
weefsel en enkel lokaal groeit, wordt dit een goedaardige of benigne tumor genoemd. Een tumor kan
daarnaast ook kwaadaardig of maligne zijn, doordat ze een invasieve groei in het omgevende weefsel
vertoont. Wanneer een tumor in staat is om in de bloed- of lymfevaten door te breken, kunnen
tumorcellen uitzaaien. Dit proces wordt metastasering genoemd. Een maligne tumor heeft typisch
een slechtere prognose dan een benigne tumor.
1.3. De verschillende types borsttumoren
Borstkanker wordt ingedeeld aan de hand van het weefsel van oorsprong en het type groei (Stichting
tegen kanker, 2017). Een borsttumor kan ontstaan uit het epitheel van de melkafvoergangen (ductaal)
of het epitheel van de melkklieren (lobulair). In enkele zeldzame gevallen kan een borsttumor ook
ontstaan uit het stromaal weefsel, zoals het vetweefsel. Het type groei kan, zoals eerder aangehaald,
lokaal of invasief zijn. Wanneer een borsttumor lokaal groeit, wordt dit in situ groei genoemd. Er wordt
Fig. 2: Incidentiecijfers, geslachtsverdeling, mortaliteit en leeftijdsdistributie van borstkanker in de
Belgische bevolking. (Bron: http://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker, laatst
bijgewerkt op 16 november 2017).
10
een onderscheid gemaakt in: (1) het ductaal carcinoom in situ (DCIS), (2) het lobulair carcinoom in situ
(LCIS), (3) het invasief ductaal carcinoom (IDC) en (4) het invasief lobulair carcinoom (ILC).
1.3.1. Het ductaal carcinoom in situ (DCIS) en
het invasief ductaal carcinoom (IDC)
Bij een DCIS ontstaat de tumor uit het
epitheel van de melkklierafvoergangen. In dit
vroege stadium van borstkanker groeien de
cellen lokaal in de melkkanalen. Frequent
zullen de tumorcellen een invasief karakter verwerven en zich verspreiden in het onderliggende
mesenchymale weefsel. Deze situatie wordt een IDC genoemd. Dit type borstkanker
vertegenwoordigt 70 à 80 % van de vastgestelde borstkankers en is dus het meest voorkomende type.
1.3.2. Het lobulair carcinoom in situ (LCIS) en het invasief lobulair carcinoom (ILC)
De ontstaanswijze van een LCIS en ILC is analoog aan deze van een DCIS en IDC, behalve dat deze
tumor ontstaat uit de epitheelcellen van de melkklieren. ILC’s vertegenwoordigen ongeveer 10 à 15%
van de vastgestelde borstkankers.
1.4. Tripel negatieve borsttumoren
Wanneer een borsttumor gecategoriseerd wordt als tripel negatief, zijn er op de tumorcellen geen
oestrogeen- (ER), progesteron- (PR) en humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren (HER2) aanwezig
(Stichting tegen kanker, 2017). Deze diagnose volgt meestal na immunohistochemisch onderzoek van
een biopt. Doordat de tumorcellen geen receptoren voor deze hormonen dragen, zijn de
therapeutische mogelijkheden beperkt. ER, PR en HER2 receptorblokkers kunnen de tumorgroei dan
niet afremmen. Schmadeka et al. (2014) beschreven dat ongeveer 12 tot 24% van alle
borstcarcinomen tripel negatief zijn. Eveneens beschreven zij dat vrouwen met een tripel negatieve
borsttumor, sneller hervallen na therapie en bovendien een grotere kans hebben om metastasen te
ontwikkelen. Dent et al. (2007) onderzochten 1601 vrouwen met borstkanker, waarvan 180 vrouwen
een tripel negatieve borstkanker hadden. 33,9% van deze vrouwen hervielen na therapie, dit was
slechts 20,4% in de groep zonder tripel negatieve borsttumor.
1.5. De genen BRCA-1 en BRCA-2
“Breast cancer gene 1 and 2 (BRCA-1 en -2)” zijn twee genen die coderen voor verschillende tumor
supressor eiwitten. Hoewel beide genen verschillende proteïnen aanmaken, behoren ze toch tot
dezelfde pathway. Mutaties in deze genen leiden tot defecten in de DNA-herstelmechanismen,
waardoor fouten in het genoom van de cel onvolledig worden hersteld. Mutaties in BRCA-1 en 2
bevorderen hierdoor de tumorinitiatie. Volgens Murphy C.G. et al. (2010) verhogen mutaties in deze
genen de kans op borstkanker met een factor 20 tot 30. Morris J. L. et al. (2010) toonden aan dat 50
– 65% van de vrouwen met een deletiemutatie in BRCA-1, borstkanker ontwikkelen voor de leeftijd
van 70 jaar. Voor BRCA-2 zou dit 13 – 23% bedragen. Hierbij moet vermeld worden dat BRCA-1 en -2
ook het risico op ovariumkanker aanzienlijk verhogen. Mutaties in de BRCA-1 en -2 genen zijn erfelijk
en kunnen zowel langs vaders- als moederszijde aan de nakomelingen worden doorgegeven.
Fig. 3: Illustratie van de melkklieren en -
kanalen van de borst (Bron:
http://www.kanker.be/alles-over-
kanker/alle-types-kanker/borstkanker).
11
Tegenwoordig zijn testen beschikbaar om mutaties in de BRCA-1 en -2 genen op te sporen, zodat er
preventieve maatregelen kunnen genomen worden bij personen met een verhoogd risico.
Regelmatige screening aan de hand van een mammografie of het preventief afzetten van de borsten
zijn hier enkele voorbeelden van.
1.6. De voornaamste risicofactoren van borstkanker
Desreux J. et al. (2011) beschreven de belangrijkste risicofactoren voor borstkanker waaraan Belgische
vrouwen worden blootgesteld. De toename van het relatief risico van elk van deze factoren wordt
weergegeven in Grafiek 1.
Een eerste belangrijke risicofactor is de veroudering van de Belgische bevolking. De DNA-
herstelmechanismen worden minder efficiënt naarmate de leeftijd van een individu stijgt. Hierdoor
stapelen mutaties zich op en stijgt de kans op tumorinitiatie. Bovendien daalt de werking van het
immuunsysteem, waardoor een tumor gemakkelijker kan groeien en metastaseren. Een tweede
risicofactor is het nemen van de anticonceptiepil. De literatuur hieromtrent is echter niet éénduidig.
Een rechtstreeks verband aantonen tussen het gebruik van de anticonceptiepil en borstkanker is
moeilijk, omdat de meeste borstkankers voorkomen bij oudere vrouwen die niet meer aan
anticonceptie doen. Over het algemeen wordt aangenomen dat de anticonceptiepil het risico op
borstkanker licht verhoogt. Dit risico daalt echter weer na het stopzetten van de
anticonceptietherapie. Er werd wel een duidelijk verband aangetoond tussen borstkanker en het
nemen van hormoonpreparaten tijdens de menopauze. Oestrogeenpreparaten, en in het bijzonder
progesteronderivaten, zijn sterke promotoren van kanker stamcellen met oestrogeen- en/of
progesteronreceptoren. Aangezien oudere vrouwen een hoger risico hebben op de aanwezigheid van
dergelijke tumor-geïnitieerde cellen in de borst, versnelt deze hormoontherapie hun tumorpromotie
en -progressie. Het effect is wel proportioneel afhankelijk van de ingenomen dosis en de duur van de
behandeling.
Andere risicofactoren die Desreux J. et al. (2011) aanhalen zijn obesitas, lichaamsbeweging, voeding,
en vitamine D. Bij obese vrouwen worden er meer androgenen omgezet tot oestrogenen in de perifere
vetcellen en is er meer productie van insuline-like growth factor 1 (IGF-1). Dit bevordert de
ontwikkeling van borstkanker. Een tekort aan lichaamsbeweging zorgt eveneens voor een toename
Grafiek 1: De toename van het relatief risico van enkele borstkanker-geassocieerde risicofactoren. (Bron:
DESREUX J. et al. (2011), Le cancer du sein en Belgique: pourquoi sommes-nous les premiers en Europe?,
Revue medical de Liège, 66 : 5-6, p. 231 – 237.)
12
van perifeer geproduceerd oestrogeen en daarnaast wordt er ook een verminderde werking van het
immuunsysteem en de menstruele cyclus waargenomen. Een voeding rijk aan dierlijk vet, vlees,
zuivelproducten en gesuikerde dranken verhogen aanzienlijk het risico op borstkanker. Vrouwen met
een Mediterraans of Aziatisch dieet hebben respectievelijk tot 15% en 30% minder kans om
borstkanker te ontwikkelen. Bovendien zou een tekort aan vitamine D het risico op borstkanker
verhogen, omdat de actieve vorm ervan een rol speelt bij apoptose van mammaire cellen. Ten slotte
verhogen ook alcoholgebruik, een lage socio-economische status, stress, nachtwerk en tabaksgebruik
het risico op borstkanker.
1.7. Mammatumoren bij de teef
Hadzijusufovic et al. (2017) publiceerden een uitgebreide studie waarbij mammatumoren van de mens
vergeleken werden met deze van de teef. Net zoals bij de vrouw zijn mammatumoren het meest
voorkomende tumortype bij de teef. Ongeveer 50% van de mammatumoren bij de hond is benigne,
terwijl de overige 50% reeds metastasen vertonen in de regionale lymfeknopen en/of de longen
(Sleeckx et al., 2011). Tumoren zijn beschreven in alle vijf klierparen van de teef, hoewel het laatste
klierpaar frequenter is aangetast. Op het moment van aanbieden zijn er echter in 70% van de gevallen
meerdere klieren aangetast, waarbij de tumoren vaak verschillen in grootte en ontwikkelingsstadia.
Dit proces wordt ‘multistep carcinogenesis’ geheten (Fig. 4) en is het gevolg van mutaties in
verschillende oncogenen en/of tumor suppressie genen in de mammaire cellen van hetzelfde dier.
De manier waarop mammatumoren bij de hond worden geclassificeerd, is identiek aan de indeling die
wordt gehanteerd bij de mens. Analoog aan de vrouw zijn de meeste maligne tumoren ductaal
invasieve carcinomen van epitheliale oorsprong (Sorenmo et al., 2003). Ook bij de teef zijn er erfelijke
mutaties gekend in de BRCA-1 en -2 genen, die sterk gelijken op de gekende deletiemutaties van de
mens. De diagnostische methoden voor borstkanker bij de mens kunnen eveneens aangewend
worden bij de hond. In de praktijk wordt hier echter weinig
gebruik van gemaakt, omdat dierenartsen rekening moeten
houden met de financiële mogelijkheden van de eigenaar.
Er kan dus geconcludeerd worden dat mammatumoren bij de
teef goed gelijken op deze van de mens (Uva et al., 2009). De
belangrijkste redenen hiervoor zijn: de gelijkaardige
pathofysiologie, éénzelfde classificatie en het gebruik van
dezelfde diagnostiek. Het muismodel dat in deze masterproef
wordt beschreven voor humane borstkanker, kan dus ook
gebruikt worden als model voor de teef.
Fig. 4: Multistep carcinogenesis bij een teef. (Bron: HADZIJUSUFOVI
E. et al. (2017), Comparing Human Breast Cancer with Canine
Mammary Cancer, Jensen-Jarolim E. (eds) Comparative Medicine,
Springer).
13
2. HET TUMORALE MICROMILIEU
Er wordt in de literatuur steeds meer belang gehecht aan het stromaal milieu rondom een tumor. Dit
milieu speelt immers een belangrijke rol in het ontwikkelingsproces van een tumor. Daarom wordt nu
besproken waaruit dit stromale milieu bestaat en op welke manier deze componenten een invloed
hebben op de tumorinitiatie, -promotie en -progressie.
2.1. Drie stromale componenten met samen acht sleutelfuncties
Het stromaal milieu waarin de tumorcellen zich bevinden wordt typisch ingedeeld in drie cellulaire
componenten: (1) de angiogene vasculaire cellen (AVC), (2) de infiltrerende immuuncellen (IIC) en
(3) de kanker geassocieerde (“cancer associated”) fibroblasten (CAF). Deze drie celtypes kunnen
volgens Douglas H. et al. (2012) in totaal op acht manieren inwerken op tumorcellen, namelijk door:
- cytokines te secreteren die hun celdeling en -groei stimuleren (tumorpromotie),
- ze ongevoelig te maken voor antigroeifactoren,
- ze ongevoelig te maken voor celdood,
- hun vermogen tot celdeling oneindig te maken (replicatieve immortaliteit),
- angiogenese te stimuleren,
- hun invasie en metastasering te stimuleren,
- hun destructie door immuuncellen te vermijden (immuno-evasie),
- hun cellulair metabolisme te beïnvloeden.
In Fig. 5 worden deze drie celtypes met bovenstaande inwerkingsmechanismen afgebeeld.
Fig. 5 (Douglas et al., 2012): Angiogene vasculaire cellen (AVC), infiltrerende immuuncellen (IIC) en kanker
geassocieerde fibroblasten (CAF) vormen de drie types stromale cellen rond een tumor die op acht
verschillende manieren kunnen inwerken op een tumor.
14
2.1.1. Stimuleren van celdeling en -groei (tumorpromotie)
Het stimuleren van celdeling en -groei kan zowel door AVC, ICC en CAF gebeuren. De relatie van AVC
met tumorgroei is vanzelfsprekend. Als er meer ingroei is van bloedvaten (neovascularisatie) worden
er meer voedingsstoffen (o.a. zuurstof) aangevoerd naar de tumor. Neovascularisatie is een
belangrijke voorwaarde opdat de tumor kan blijven groeien. De IIC spelen eveneens een belangrijke
rol in de tumorgroei door hun cytokineproductie. Voorbeelden van gesecreteerde signaalmoleculen
zijn epidermale groeifactoren (EGF), transforming growth factor-β (TGF-β), tumor necrosis factor-α
(TNF-α), fibroblast growth factor (FGF), interleukines (IL), chemokines, histamine en heparine. Net
zoals de IIC, zijn ook de CAF in staat om cytokines te produceren. De best gekende is insuline like
growth factor 1 (IGF-1). Daarnaast kunnen CAF ook epitheliale-mesenchymale transitie (EMT)
stimuleren door secretie van TGF-β. Dit dedifferentiatie mechanisme zorgt ervoor dat epitheliale
cellen van hun basaalmembraan loskomen en zich verder verspreiden in het onderliggende
mesenchymale weefsel. EMT is van groot belang bij de metastasering van epitheliale tumoren zoals
borstcarcinomen.
2.1.2. Ongevoeligheid voor antigroeifactoren
Ongevoeligheid voor antigroeifactoren is aangetoond bij zowel ICC als CAF. Normaal worden deze
factoren geproduceerd door cellen wanneer ze bij contact met naburige cellen of extracellulaire
matrix. Door dit para- of juxtacrien signaal wordt de celcyclus geremd. De IIC secreteren echter
verschillende proteolytische enzymen die in staat zijn om cel-cel en cel-matrix verbindingen te
verbreken. Hierdoor valt het inhiberend signaal van de naburige cel of extracellulaire matrix weg en
worden cellen gestimuleerd om zich te vermeerderen. Daarnaast is in verschillende studies
aangetoond dat de groei van kankercellen in een niet-tumoraal stroma geremd wordt. Normale
fibroblasten zijn dus in staat zijn om de groei van tumorcellen te remmen. Dit is niet meer het geval
voor de CAF, omdat er in het tumoraal milieu een soort van “herprogrammering” van de fibroblasten
plaatsvindt, waarvan het mechanisme nog niet is opgehelderd.
2.1.3. Resistentie aan celdood
Resistentie tegenover celdood is een belangrijke stap in de tumorgenese. Enerzijds bestaat deze uit
een intrinsieke resistentie tegenover de cel-eigen apoptose, maar anderzijds ook uit een extrinsieke
resistentie tegenover afdoding door cytotoxische cellen (CD8+ T-cellen, NK-cellen). Zowel AVC, IIC als
CAF werken dit in de hand. AVC kan door vascularisatie de tumorcellen laten ontsnappen aan
apoptose, een geprogrammeerde celdood die normaal zou optreden als gevolg van hypoxie en een
tekort aan voedingsstoffen. De rol van IIC is als volgt: epitheelcellen bezitten een homeostatisch
mechanisme dat apoptose veroorzaakt wanneer ze het contact verliezen met hun basaalmembraan
en hun omgevende cellen. IIC zijn in staat om deze bindingen na te bootsen, waardoor epitheelcellen
toch kunnen loskomen uit hun lamina epithelialis. Daarnaast is ook aangetoond dat tumor
geassocieerde monocyten en macrofagen cytokines produceren, die de overleving van kankercellen
promoot. CAF produceren IGF-1 en 2, die via paracriene weg de resistentie tegen celdood stimuleren.
Daarnaast produceren ze ook moleculen die een positieve invloed hebben op de vorming van een
neoplastische extracellulaire matrix.
2.1.4. Replicative immortaliteit
Tumorcellen bezitten de eigenschap dat ze oneindig lang kunnen blijven delen. Normaliter verliezen
de chromosomale uiteinden, de zogeheten telomeren, na elke replicatie een stukje DNA. Als deze
telomeren na een aantal delingen te kort zijn geworden, stopt de celcyclus. Dit proces van veroudering
noemt men celsenescentie. Tumorcellen bezitten echter de typische eigenschap dat ze deze
15
telomeren kunnen verlengen waardoor oneindig lang kunnen blijven delen. Tot op heden blijft de rol
van AVC, IIC en CAF in dit proces onduidelijk. Er wordt wel aangenomen dat deze van ondergeschikt
belang is, daar replicatieve immortaliteit voornamelijk ontstaat tijdens tumorinitiatie en -promotie.
2.1.5. Angiogenese
Angiogenese is onmisbaar tijdens tumorprogressie. Zonder de ingroei van nieuwe bloedvaten kan een
tumor niet expanderen. Historisch gezien achtte men de tumor terecht verantwoordelijk voor de
productie van angiogene groeifactoren. Daarnaast spelen echter ICC en CAF ook een belangrijke rol
bij tumorale angiogenese. De IIC en CAF produceren verschillende moleculen die angiogenese
stimuleren. Dit zijn o.a. vascular endothelial growth factor (VEGF), TNF-α, TGF-β, IL-8 en verschillende
matrix metalloproteinasen (MMP). Tumor geassocieerde macrofagen (TAM) spelen hierin een
belangrijke rol door de productie van VEGF. Stockmann et al. (2008) toonden aan dat tumorgroei
geremd kon worden door een deletie van het VEGF-gen in deze macrofagen. Ook mastcellen zouden
een belangrijke rol spelen via de productie van eveneens VEGF, naast angiopoietine-1, IL-8, histamine
en heparine (Bergers et al., 2000).
2.1.6. Invasie en metastase
Er werd aangetoond dat alle celtypes (AVC, IIC en CAF) een rol spelen tijdens invasie en metastasering.
Door de sterke expressie van VEGF in tumoren, verliest het endotheel haar tight junctions. Bijgevolg
is de barrière tussen de verschillende AVC eerder zwak, zodat tumorcellen gemakkelijker in de
bloedbaan komen. Dit proces wordt zeker bevorderd wanneer in de tumor ook een hoge interstitiële
druk heerst na expansie. Daarbij zorgt een onvoldoende ingroei van bloedvaten voor de expressie van
hypoxie geïnduceerde transcriptiefactoren (HIF). Deze HIF brengen op hun beurt VEGF en NO-
synthase tot expressie, die beiden metastasering bevorderen. De IIC produceren verschillende MMP,
die de cel-cel en cel-matrix verbindingen afbreken. Hierdoor kunnen tumorcellen loskomen van hun
omgeving en naar de bloed- of lymfevaten migreren. De CAF produceren cytokines die metastase en
invasie stimuleren, het belangrijkste cytokine hierbij is TGF-β.
2.1.7. Destructie door immuuncellen vermijden (immuno-evasie)
De AVC spelen een belangrijke rol in immuno-evasie. Dit komt omdat het tumoraal endotheel geen
massale T-cel inflammatie ondersteunt. Zo kunnen er bijvoorbeeld in tumoren geen hoog endotheliale
venules (HEV) waargenomen worden. Dit zijn vasculaire structuren die van belang zijn voor een
massale instroom van lymfocyten in lymfeknopen of zwaar ontstoken weefsels. Daarnaast worden
ook moleculen waargenomen die inflammatie van het endotheel tegengaan, met een lager aantal
receptoren op het endotheel tot gevolg. De IIC, in het bijzonder macrofagen, spelen eveneens een rol
in immuno-evasie via de productie van immunosuppressieve cytokines. Deze cytokines inhiberen CD8+
T-cel proliferatie en infiltratie. Een andere manier waarop deze TAM-immuunreacties stil leggen, is
door de productie van chemokine (C-C motief) ligand 22 (CCL22). Dit zorgt voor een influx van
regulatorische T-cellen (Treg), waardoor inflammatie afneemt. De Treg worden eveneens aangetrokken
door chemokine ligand 2 (CCL2) en TGF-β die geproduceerd worden door CAF in het tumoraal stroma.
2.1.8. Modificatie van het cellulair metabolisme
Momenteel is enkel de rol van CAF in het cellulair metabolisme beschreven. Volgens Rattigan et al.
(2012) zouden CAF een atypische vorm van aerobe glycolyse stimuleren via zuurstofradicalen
geproduceerd door tumorcellen. De CAF produceren in ruil de glycolyse metaboliet pyruvaat, die
vervolgens door de tumorcellen gebruikt wordt als brandstof voor celproliferatie.
16
2.2. Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma
Cytokines vormen een belangrijk communicatiemiddel tussen tumorcellen en het stroma. Bovendien
hebben ze meerdere functies en kan één cytokine verschillend inwerken op een tumor.
2.2.1. TNF-α
TNF-α speelt een belangrijke rol tijdens de tumorprogressie omdat het een transcriptiefactor is van
NF-κB. Door NF-κB produceert de cel anti-apoptotische moleculen, waardoor de cel langer kan
overleven. Daarnaast kan NF-κB ook op andere manieren tumorgenese stimuleren (o.a. via
inflammatie), dit wordt besproken in het onderdeel 3. De link tussen NF-κB, inflammatie en kanker
(zie verder). TNF-α zou ook de productie van genotoxische moleculen zoals NO en ROS stimuleren.
Deze radicalen kunnen het DNA beschadigen en op deze manier bijdragen aan tumorinitiatie. Andere
manieren waarop TNF-α kan bijdragen aan tumorgenese zijn angiogenese, metastasering en T-cel
suppressie.
2.2.2. IL-6
IL-6 draagt bij aan de tumorgenese door inflammatie en anti-apoptotische factoren. Bovendien
stimuleert IL-6 tumorale groei, via expressie van genen die de celcyclus stimuleren. Berger et al. (2004)
toonden aan dat er een polymorfisme bestaat in de promotorregio van het IL-6 gen tussen
verschillende etnische groepen. Er werd in deze studie een verband aangetoond tussen expressie van
IL-6, prevalentie van borstkanker en een slechte prognose na metastasering.
2.2.3. IL-10
IL-10 is een cytokine met een anti-inflammatoire werking, omdat het de expressie van NF-κB inhibeert.
Daardoor daalt de afdoding door cytotoxische T-cellen (CD8+ T-cellen en NK-cellen). De tumor kan
bijgevolg ongehinderd blijven groeien. Er is eveneens beschreven dat tumorcellen IL-10 produceren
om immuno-evasie te veroorzaken (Mannino M.H. et al, 2015). Daarnaast wordt IL-10 geproduceerd
door TAM en bevordert het bovendien invasie en metastasering. Hoewel het overwegend
protumoraal werkt, is de rol ervan paradoxaal. IL-10 gaat namelijk de secretie van TNF-α en IL-6 tegen.
Op deze manier wordt tumorigenese afgeremd.
2.2.4. TGF-β
TGF-β vertoont enerzijds veel gelijkenissen met IL-10 door zijn identieke, anti-inflammatoire werking.
Een bijkomende functie van TGF-β is anderzijds Treg proliferatie, die tumorgroei bevordert door
afremming van de CD8+ T-cel responsen. Hoewel TGF-β dus antitumoraal kan werken, is dit niet
éénduidig. TGF-β werkt ook EMT in de hand. Daarnaast is beschreven dat TGF-β een rol speelt bij
invasie, angiogenese en metastasering. De rol van TGF-β in tumorprogressie is dus opvallend complex.
17
2.2.5. CCL2 (MCP-1)
CCL2, of nog monocyt chemotactisch proteïne-1 (MCP-1), is een molecule die monocyten aantrekt
tijdens ontstekingsprocessen. Omdat CCL2 ook tot expressie gebracht wordt in het tumoraal
micromilieu, zorgt het voor een accumulatie van macrofagen. Soria et al. (2008) toonden aan dat CCL2
in borstcarcinomen een belangrijke rol speelt tijdens tumorprogressie en metastasering. Een
recentere studie beschrijft eveneens de rol van CCL2 op de groei van borstkankercellen (Tsuyada et
al., 2012). De TAM worden momenteel beschouwd als één van de belangrijkste cellen die
tumorprogressie stimuleren, dus CCL2 is een protumoraal cytokine.
2.2.6. BAFF
B-cell activating factor (BAFF) is een cytokine dat fysiologisch tot expressie gebracht wordt door CD4+
T-cellen. Het helpt B-cellen om te zetten in plasmacellen. Pelekanou V. et al. (2008) ontdekten voor
het eerst dat BAFF continu tot expressie gebracht werd in borstcarcinomen. De rol van BAFF in
borstkanker was toen nog onduidelijk. Het waren uiteindelijk Walters S. et al. (2009) die beschreven
dat BAFF een belangrijke protumorale functie vervult. Meer specifiek veroorzaakt BAFF expansie van
Treg cellen, waardoor T-cel responsen worden afgeremd.
2.2.7. IL-1β
IL-1β wordt tot expressie gebracht in verschillende types kankercellen, ook in borstkanker. Bij knock-
out muizen voor IL-1β werd een vermindering van de tumorgenese en angiogenese waargenomen.
Daarom wordt aangenomen dat IL-1β een belangrijke rol speelt tijdens tumorpromotie en -progressie.
Veruit de belangrijkste functie van IL-1β is het bevorderen van metastase. Dit komt omdat IL-1β
structurele veranderingen kan veroorzaken bij tumorcellen, waardoor cel-cel verbindingen (E-
cadherine) worden verbroken. De tumorcellen krijgen daarnaast ook een fibroblastoïd karakter. Door
Fig. 6: De rol van TNF-α, IL-6 en IL-10 op tumorgenese en het inflammatoir micromilieu.
18
deze twee aanpassingen verwerven ze gemakkelijker een maligne karakter (De Marco et al., 2016).
Ten slotte stimuleert IL-1β ook het inflammatoir micromilieu.
2.2.8. MIP-2 (CXCL2)
Macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) is een cytokine dat geproduceerd wordt door
macrofagen en chemotactisch inwerkt op polymorfonucleaire neutrofiele leukocyten. Soms wordt
MIP-2 ook chemokine ligand 2 (CXCL2) genoemd. MIP-2 is een cytokine dat angiogenese en
metastasering van borstcarcinomen bevordert (Nuray et al., 2015).
2.3. Conclusie
De interactie tussen een tumor en de tumor omgeving is uitermate complex. De tumor en de
verschillende cellen van het stroma beïnvloeden elkaar door de productie van cytokines. Merk op dat
de rol van ieder cytokine niet éénduidig is en vaak onvolledig werd opgehelderd. Dit illustreert de
noodzaak aan een in vivo preklinisch model voor onderzoek naar borstkanker. Het is immers
onmogelijk om de complexe interacties tussen het stroma en de tumor in vitro na te bootsen.
Fig. 7: De rol van IL-1β, BAFF, MIP-2, TGF-β en CCL2 op tumorgenese en het inflammatoir micromilieu.
19
3. DE LINK TUSSEN NF-κB, INFLAMMATIE EN KANKER
NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) is een transcriptiefactor die tot
expressie gebracht kan worden in bijna alle celtypes onder invloed van bepaalde stimuli. Deze stimuli
kunnen bestaan uit: cytokines, vrije radicalen, zware metalen, UV-straling en bacteriële of virale
antigenen (Hoesel et al., 2013). In deze rubriek wordt in eerste instantie de moleculaire structuur van
de proteïnen behorende tot de NF-κB familie besproken. Vervolgens komen de drie pathways aan bod
die NF-κB kunnen activeren. Daarna wordt het verband gelegd van NF-κB met kanker en inflammatie.
Ten slotte wordt kort besproken wat de mogelijkheden zijn om NF-κB te gebruiken in antitumorale
therapieën.
3.1. Van DNA tot homo- of heterodimeer
De verschillende proteïnen van de NF-κB pathway en het geassocieerde IκB kinase-complex worden
voorgesteld in Fig. 8. Er wordt een opdeling in drie families gemaakt: de NF-κB familie (A), de IκB
familie, dit zijn endogene inhibitoren van NF- κB (B) en het IκB kinase complex of IKK (C).
Fig. 8: De verschillende proteïnen van de NF-κB pathway en het geassocieerde IκB kinase-complex volgens
Hoesel et al. (2013). (A) De vijf leden van de NF-κB familie, (B) De verschillende IκB familieleden (inhibitoren
van NF-κB) en (C) het IKK-complex.
20
Uit Fig. 8A volgt dat, de NF-κB familie uit vijf proteïnen bestaat: RelA (p65), RelB, C-Rel, p105 en p100.
Deze laatste twee worden proteolytisch verder verwerkt tot respectievelijk p50 en p52. Wat opvalt is
dat al deze proteïnen een zogeheten Rel homoloog domein (RHD) bevatten. Dit domein is nodig om
de NF-κB proteïnen onderling homo- of heterodimeren te laten vormen en bovendien is RHD ook
verantwoordelijk voor de binding aan promotoren in het DNA (May et al., 1997). Bijkomend kunnen
in de structuur van p105 en p100 zogeheten “ankyrine repeats” (ANK) waargenomen worden. Deze
komen ook voor bij IκBα van de IκB familie, dit zijn inhibitoren van NF- κB (Fig. 8B). De verschillende
IκB familieleden binden typisch met de dimeren van de NF-κB familie, waardoor ze inactief worden.
Deze situatie komt voor in een cel die zich in een niet-ontstoken en niet-tumoraal milieu bevindt
(Hayden et al., 2012). Bovendien zorgt deze binding ervoor dat er een shift optreedt van de NF-κB
dimeren van de kern naar het cytosol (Birbach et al., 2002).
Wanneer p105 en p100 echter proteolytisch verwerkt worden tot respectievelijk p50 en p52, komen
daarnaast ook nog kleine segmenten met ANK vrij. De plaats waar p105 en p100 worden geknipt is
weergegeven met zwarte pijlen in Fig. 9A. Deze kleine segmenten kunnen binden met het DNA dat
codeert voor de verschillende proteïnen van NF-κB, waardoor transcriptie hiervan onmogelijk wordt.
Op deze manier wordt een systeem van negatieve feedback bekomen (Hayden et al., 2008). Wat
bovendien ook nog opvalt, is dat dimeren van p50 en p52 kunnen binden aan het transactivatie
domein (TA) van RelA, RelB en c-Rel. Hierdoor worden ze translationeel actief. Wat opvalt is dat BCL-
3 uit de IκB familie deze TA-domeinen ook bevat. Hierbij moet de opmerking gemaakt worden dat
deze p50 en p52 dimeren daarnaast ook hun functie als transcriptiefactor behouden. Ze binden dus
ook nog aan promotoren van andere genen. Dit alles wordt schematisch weergegeven in Fig. 9.
Fig. 9: De complexe functies van p105 en p100 na proteolyse tot p50, p52 en ANK-segmenten.
21
Er kan dus aangenomen worden dat activatie van NF-κB op twee manieren kan ontstaan (Hayden et
al., 2008). De eerste is het loslaten van de IκB proteïnen van de NF-κB dimeren, waardoor er een shift
zal plaatsvinden van de dimeren van het cytosol naar de kern. De tweede manier is partiële degradatie
van p105 en p100 tot p52, p50 en de ANK-segmenten zoals hierboven besproken. Deze proteolyse is
slechts mogelijk na ubiquitinisatie van p105 en p100, die op zijn beurt slechts kan doorgaan na dubbele
fosforylatie van deze eiwitten door het IKK-complex. Dit IKK-complex werkt enzymatisch en bestaat
uit drie proteïnen weergegeven in Fig. 8C. Dit zijn 2 enzymen met een kinase activiteit nl. IKKα en IKKβ
en een structureel proteïne IKKγ, of nog NEMO.
Ten slotte moeten hier nog enkele randopmerkingen gemaakt worden (Oeckinghaus et al., 2009). Ten
eerste hebben de verschillende dimeren van de NF-κB familie een verschillende affiniteit voor
verschillende promotoren in het DNA. Met andere woorden kan dus gezegd worden dat iedere dimeer
een voorkeur heeft voor binding met een welbepaalde promotor. De verschillende NF-κB monomeren
hebben bovendien ook nog verschillende plaatsen waar fosforylatie en andere post-translationele
modificaties, zoals “folding” van het proteïne, mogelijk zijn. Hieruit wordt bijgevolg besloten dat de
NF-κB pathway heel complex in elkaar zit en moeilijk op te helderen is.
3.2. De verschillende pathways voor activatie van NF-κB
Volgens Hoesel et al. (2013) zijn er drie verschillende pathways om NF-κB te activeren. (1) De
gebruikelijke, (2) de minder gebruikelijke en (3) de atypische activatie. Deze drie manieren van
activatie zijn weergegeven in Fig. 10.
De gebruikelijke manier, weergegeven in Fig. 10A, kan starten door binding van lipopolysacchariden
(LPS), interleukine 1β (IL-1β) en tumor necrosis factor α (TNFα) aan respectievelijk toll-like receptoren
(TLR), interleukine-1 receptoren (IL-1β) en tumor necrosis factor receptoren (TNFR). Binding van zo
een ligand aan dit type receptoren leidt tot activatie van het IKK-complex, dat op zijn beurt NF-κB zal
fosforyleren. Vervolgens ontstaat er een ubiquitinisatie van het IκB proteïne dat aan het NF-κB dimeer
is gebonden, waardoor het wordt afgebroken door proteasomen. Daardoor komt dan het NF-κB
dimeer vrij, vindt er een shift plaats naar de kern en kan het binden op zijn promotor.
Fig. 10: De gebruikelijke (A), de minder gebruikelijke (B) en de atypische activatiewegen van NF-κB volgens
Hoesel et al. (2013).
22
De minder gebruikelijke weg voor activatie kan starten door binding van B cell activatie factor (BAFFR),
lymfotoxine β-receptor ligand (LTβR), CD40 en receptor activator voor nucleaire factor kappa B (RANK)
aan zijn overéénstemmende receptor. Binding van ligand aan receptor zal het NF-κB induceerbaar
kinase (NIK) activeren, dat opgebouwd is uit tweemaal IKKα (Fig. 10C). Dit NIK kan dan op zijn beurt
p100 fosforyleren. Vervolgens zal deze, eveneens na ubiquitinisatie, uitéénvallen in p52 en een ANK-
segment door proteolyse. Dit dimeer p52/RelB dimeer ondergaat dan een shift van cytosol naar kern,
waar het op zijn promotor zal binden. Deze manier van activatie wordt weergegeven in Fig. 10B.
Ten slotte is er nog een atypische manier om NF-κB te activeren, voorgesteld in Fig. 10C. Deze manier
van activeren wordt onder andere gebruikt indien de cel aan hevige genotoxische stress wordt
onderworpen. Dit soort stress zorgt ervoor dat NF-kappa-B essential modulator (NEMO) zich naar de
kern kan begeven, waar het zal binden met ataxia telangiectasia mutated checkpoint kinase (ATM).
Dit enzym zal NEMO ook weer ubiquitiniseren en vervolgens verhuist dit complex opnieuw naar het
cytosol. Daar kan deze het IKK complex activeren en vervolgens aansluiten bij de gebruikelijke weg.
3.3. De relatie van NF-κB met inflammatie en kanker
NF-κB maakt integraal onderdeel uit van de inflammatoire respons (Ben-Neriah et al., 2011). Deze
transcriptiefactor komt voor in alle celtypes van multicellulaire organismen en kan dus overal in het
lichaam tot expressie gebracht worden. NF-κB induceert cytokines die de inflammatie verder in de
hand helpen. Dit zijn o.a. TNF-α, IL-1β, IL-6 en IL-8, die reeds hoger werden besproken onder 2.2.
Cytokines: de brug tussen tumorcellen en het stroma. De verschillende antigenen die deze
ontstekingsreactie kunnen induceren werden ook eerder besproken onder de rubriek 3.2. De
verschillende pathways voor activatie van NF-κB.
De rol van NF-κB in tumoren is dubbel. In eerste instantie helpt NF-κB voor het ontstaan van een
inflammatoire respons die cytotoxische (CD8+) T-cellen naar de tumorale omgeving aantrekken. Deze
cytotoxische cellen helpen vervolgens de getransformeerde cellen af te doden. Deze situatie gaat
echter maar op bij een acute inflammatoire respons. Bij een chronische inflammatoire respons werd
beschreven dat NF-κB net de tumorprogressie in de hand werkt. Meer nog, als de cytotoxische cellen
er niet in slagen de tumorcellen af te doden, ontstaat een soort van evenwicht tussen deze twee
celtypes. In de meerderheid van de gevallen kan de tumor uiteindelijk ontsnappen aan het
immuunsysteem. In deze situatie van chronische inflammatie worden typisch lagere concentraties van
NF-κB aangetroffen. Die concentraties werken net pro-oncogeen in plaats van pro-inflammatoir.
Hiervoor zijn volgens Hoesel et al. (2013) verschillende verklaringen:
(1) NF-κB resulteert in een verhoging van anti-apoptotische factoren waardoor cellen langer leven.
Inderdaad kunnen cellen die potentieel oncogeen zijn na bijvoorbeeld DNA-mutaties, hierdoor langer
overleven.
(2) In het feit dat de inflammatoire respons die gepaard gaat met NF-κB ook neutrofielen aantrekt.
Deze aangeboren afweer granulocyten zouden mogelijks reactieve zuurstofradicalen vrijstellen, die
genotoxisch zijn voor DNA en op deze manier kunnen zorgen voor tumor-initiatie.
(3) In het feit dat NF-κB zorgt voor een verhoging van vascular endothelial growth factor (VEGF) en
zijn receptoren. Dit zorgt voor angiogenese in de tumor waardoor deze gemakkelijker kan groeien en
metastaseren.
23
3.3.1. Direct effect van NF-κB op tumorvorming
In principe kan een tumor ontstaan doordat er mutaties zijn in de genen van NF-κB. Andere
mogelijkheden voor het ontstaan van een tumor, door toedoen van NF-κB, zijn: mutaties in de genen
van de verschillende expressiewegen of een verhoging van NF-κB in het micromilieu van de cel. In
2012 ontdekten Jiao et al. mutaties in de genen van IKKβ, IκBα, IκBε en de verschillende genen van de
NF-κB familie bij humane borstkankers. Ondertussen zijn tal van andere mutaties in deze genen
bekend bij verschillende types tumoren van verschillende organen.
3.3.2. Indirect effect van NF-κB op tumorvorming
In principe kunnen tumoren ook ontstaan door interactie van NF-κB met andere transcriptiefactoren.
Dit is bijvoorbeeld het geval voor STAT3 en p53 (Didonato et al., 2012). Er werd bewezen dat STAT3
indirect de structuur van RelA kan beïnvloeden door acetylatie, waardoor NF-κB langer in de kern
aanwezig zou zijn. Bovendien is ook bewezen dat RelA, p53 afhankelijke transactivatie kan
verminderen. Hierdoor wordt p53-afhankelijke apoptose onderdrukt.
Naast interactie tussen NF-κB en transcriptiefactoren, werden ook andere interacties gevonden met
feedbackmechanismen, kinases en microRNA (Hoesel et al., 2013). Dit type van interacties is echter
te complex en de bespreking valt buiten de scope van deze masterproef.
3.3.3. De mogelijkheden van NF-κB in antitumorale therapieën
Aangezien NF-κB een belangrijke rol speelt in tumorinitiatie en -progressie, zou deze transcriptiefactor
mogelijks een aanknopingspunt kunnen betekenen voor nieuwe antitumorale therapieën. Er kan
bijvoorbeeld gesteld worden dat NF-κB zou kunnen toegediend worden aan kankerpatiënten, om de
tumorale inflammatie op te drijven. Hierdoor worden er meer cytotoxische (CD8+) cellen naar de
tumorhaard aangetrokken en zou het immuunsysteem de tumorcellen mogelijks kunnen afdoden.
Deze behandeling zou een goede aanvulling zijn op de huidige immuuntherapie, die steeds meer aan
belang wint. Toch kan het ook tegenaangewezen zijn om NF-κB aan kankerpatiënten te gaan
toedienen. Dit is bijvoorbeeld het geval wanneer patiënten behandeld worden met een
chemotherapeuticum of na radiotherapie. Chemotherapeutica zorgen voor het afdoden van snel
delende cellen. Radiotherapie heeft als doel de tumorcellen af te doden na bestraling. Doordat NF-κB
zorgt voor het verhogen van anti-apoptotische factoren, zou resistentie tegenover het
chemotherapeuticum of de radiotherapie kunnen optreden, met therapiefalen tot gevolg.
Naast NF-κB zelf zouden ook NF-κB inhibitoren gebruikt kunnen worden (Didonato et al., 2012).
Belangrijk is dat er rekening wordt gehouden met het stadium van de tumor waarin deze potentiële
geneesmiddelen worden toegediend. Het is wenselijk deze toe te dienen tijdens de chronisch
inflammatoire fase die zorgt voor tumor-initiatie en overleving van de tumor-geïnitieerde cellen. Het
is echter tegenaangewezen deze de patiënt te verschaffen tijdens eliminatie van de tumor door het
immuunsysteem, omdat ze inflammatie onderdrukken. Daardoor worden er minder cytotoxische T-
cellen naar de tumor aangetrokken en worden de tumorcellen minder gemakkelijk afgedood.
24
4. HET BORSTKANKER MUISMODEL
In het experimentele deel van deze masterproef wordt gebruik gemaakt van C57Bl/6 Tyr-/- NF-κB-luc+
reportermuizen als model voor borstkanker bij de mens. Meer nog, er zullen via de tepelopening
Py230 tumorcellen geïnoculeerd worden in de melkklierafvoergangen van lacterende muizen. Dit
wordt een intraductale injectie genoemd. De karakteristieken van de gebruikte tumorcellijn en het
intraductaal muismodel worden in deze rubriek beschreven.
4.1. De Py230 tumorcellijn
Py230 tumorcellen werden geïsoleerd uit C57Bl/6 muizen door deze intraductaal in te spuiten met
een oplossing van oncogene virussen, nl. polyomaviridae (Bao et al., 2015). Oncogene virussen zijn in
staat om geïnfecteerde cellen tumoraal te ontaarden. In de C57Bl/6 muizen vormden zich na de
infectie spontane tumoren, die vervolgens werden geïsoleerd. Daarna werden deze geïsoleerde
tumoren enzymatisch behandeld (met o.a. trypsine en EDTA) tot een homogene suspensie van
individuele cellen werd bekomen. Vervolgens werd een monoklonale celpopulatie bekomen uit de
polyklonale celmassa, door gebruik te maken van een reeks toenemende verdunningen. De graad van
deze verdunningen is afhankelijk van het aantal cellen in de startpopulatie en hun levensvatbaarheid.
Daarnaast kan er eventueel nog op bijkomende kenmerken geselecteerd worden. Zo werd voor de
Py230 tumorcellen geselecteerd voor tripel negativiteit (zie ook verder) en epitheliaal origine. Nadat
de verdunningen waren aangemaakt, werden aliquots van de suspensie in welletjes gebracht en
geïncubeerd. Voor het experimentele deel van deze masterproef werden de Py230 tumorcellen niet
zelf aangemaakt, maar aangekocht van een commerciële verdeler.
Het waren Bao et al. (2015) die als eerste de
karakteristieken van de Py230 tumorcellijn beschreven.
Na isolatie, inoculeerden zij opnieuw C57Bl/6 muizen met
Py230 tumorcellen en zagen dat de gevormde mammaire
tumoren histologisch identiek waren aan de tumoren
geïnduceerd door het polyomavirus (Fig. 11). Er moet
echter rekening worden gehouden met de receptoren die
voorkomen op deze tumorcellijn. Polyomavirus-
geïnduceerde mammatumoren kunnen drager zijn van
één of meerdere types hormoonreceptoren, nl.
oestrogeenreceptoren (ER) en progesteronreceptoren
(PR). Deze receptoren en hun belang werden reeds eerder besproken in 1.4. tripel negatieve
borsttumoren. De Py230 tumorcellijn werd echter geselecteerd op tripel negativiteit, wat dus wil
zeggen dat ze geen ER, PR en humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren (HER2) draagt. Bao et al.
(2015) beschreven echter dat in vitro tripel negatieve Py230 tumorcellen, ER en/of PR positieve
tumoren kunnen vormen in vivo, wanneer deze in lage aantallen (104 cellen of minder) worden
geïnoculeerd (Fig. 12). Hiermee moet dus rekening gehouden worden in het experimentele deel van
de masterproef, aangezien we een muismodel beogen voor tripel negatieve borsttumoren bij de
mens.
Fig. 11 (Bao et al., 2015): Een ductaal
carcinoma in situ ontstaan na intraductale
injectie van Py230 tumorcellen (1) versus
deze geïnduceerd door polyomavirus (2).
25
4.2. Het intraductaal muismodel
Anatomisch is de borstklier ruwweg samengesteld uit twee compartimenten: het stromale en
luminale compartiment, gescheiden door de basaalmembraan van het melkklierepitheel (Fig. 13). De
tumorprogressie van borstkanker wordt echter klassiek bestudeerd door tumorcellen te injecteren in
het stromale compartiment van de borstklier, het zogeheten vetkussen. Deze laatste dankt zijn naam
aan het feit dat dit compartiment voor het grootste deel is opgebouwd uit vetcellen. Het luminale
compartiment bestaat echter uit melkproducerend epitheel en klierafvoergangen. Deze epitheliale
kanalen winnen steeds meer aan terrein als inoculatieplaats voor tumorcellen. De micro-omgeving in
dit compartiment beïnvloedt evenzeer de tumorcelprogressie. Meer nog, zoals eerder aangehaald in
1.3. De verschillende types borsttumoren, ontstaan bijna alle borstkankers bij de mens uit het epitheel
van de melkklieren en de melkklierafvoergangen. Er is eerst een ‘in situ’ situatie vooraleer de
tumorcellen de basaalmembraan doorbreken en zich in het onderliggende stromale compartiment
verder verspreiden. Het is dus wel degelijk van belang om deze stap in rekening te brengen indien we
een representatief muismodel willen ontwikkelen voor humane borstkanker. Steenbrugge et al.
(2016) vergeleek de intraductale injectie van BALB/c muizen met 4T1 tumorcellen ten opzichte van
een injectie in het vetkussen. Zij kwamen tot de conclusie dat primaire mammatumoren zich op
vergelijkbare wijze ontwikkelen, maar een initieel, langzamere groei vertonen. Deze onderzoekers
vonden daarboven ook sterke aanwijzingen dat de epitheliale micro-omgeving wel degelijk een
invloed heeft op de primaire tumorgroei in een immunocompetent muismodel.
Fig. 12 (Bao et al., 2015): Immunohistochemische coupes van polyomavirus-geïnduceerde
mammatumoren en mammatumoren ontstaan na intraductale injectie van 104 Py230 tumorcellen. De
coupes tonen een kleuring voor respectievelijk oestrogeenreceptoren, progesteronreceptoren en
humaan epidermaal groeifactor 2 receptoren.
26
4.3. Conclusie en toekomstvisie
Het gebruik van Py230 tumorcellen in C57Bl/6 muizen werd reeds beschreven in de literatuur (Biswas
et al., 2014). Daarentegen werd de intraductale injectie ervan in deze muizenstam nog nooit eerder
uitgevoerd. Deze masterproef heeft dan ook tot doel om de intraductale injectie van deze tumorcellijn
in immunocompetente, C57Bl/6 reportermuizen voor NF-κB te bestuderen en beschrijven, zodat op
termijn de werking van nieuwe, potentiële antitumorale geneesmiddelen in vivo kan worden
geëvalueerd, voorafgaand aan klinische studies op borstkankerpatiënten.
Fig. 13 (Steenbrugge et al., 2016): Een schematische weergave van de melkklier. Het stromale compartiment
bestaat hoofdzakelijk uit vetcellen, terwijl het luminale compartiment vooral uit (myo)epitheelcellen
bestaat. Beide compartimenten worden gescheiden door de basaalmembraan van het melkklierepitheel.
27
5. METEN VAN INFLAMMATIE VIA BIOLUMINESCENTIE
In de vorige rubriek werd het verband tussen NF-κB, inflammatie en tumorgroei besproken. In de
experimenten van deze masterproef willen we dit type inflammatie indirect meten aan de hand van
bioluminescentie in Py230 intraductaal geïnoculeerde NF-κB reportermuizen. Dit wordt in deze
rubriek besproken.
5.1. Bioluminescentie in muismodellen
Bioluminescentie is een reactie die in de natuur frequent voorkomt. In dit type van reacties vindt er
steeds een oxidatie van een substraat plaats, waardoor fotonen worden uitgezonden wat wordt
waargenomen als een lichtsignaal. Voorbeelden van organismen die aan bioluminescentie doen, zijn:
sommige algen, sommige diepzeevissen en vuurvliegjes. Bij deze laatstgenoemde diersoort is de
wetenschap erin geslaagd om het verantwoordelijke gen te identificeren en aan te wenden voor
experimentele doeleinden (Carlsen et al., 2002). Het meest gebruikte gen is het luc-gen van de Noord-
Amerikaanse Photonius pyralis. Een ander en minder gebruikt gen, is het ruc-gen van Renilla
reniformis. Beiden zenden licht uit van een welbepaalde golflengte. Voor luciferase (van het luc-gen)
is dit groen licht met een golflengte van 562 nm, voor het renilla luciferase (van het ruc-gen) is dit
blauw licht met een golflengte van 482 nm. Een ander belangrijk verschilpunt is het substraat van
beide enzymen. Luciferase zet het D-luciferine om tot oxyluciferine met behulp van zuurstof, ATP en
magnesium. Deze reactie wordt weergegeven in Fig. 14. Het renilla luciferase heeft geen cofactoren
nodig. Een nadeel van deze reactie is echter de instabiliteit van het substraat coelenterazine (Akiko et
al., 2004). In de experimenten van deze masterproef wordt daarom gebruik gemaakt van luciferase
en D-luciferine.
Concreet zal bij de in vivo experimenten gebruik gemaakt worden van C57BL/6 muizen, waarbij via
“knock-in” strategieën het luc-gen gekoppeld werd aan het NF-κB gen. Het principe is ook
weergegeven in Fig. 14. Na inoculatie van de tumorcellen ontstaat inflammatie. Tijdens deze
inflammatie wordt het NF-κB gen afgelezen en is er transcriptie van het luc-gen. Daardoor ontstaat
luciferase op de plaats van inflammatie. Als dan het substraat D-luciferine toegediend wordt aan de
muizen, zal deze in aanwezigheid van het lokaal vrijgestelde luciferase, zuurstof, ATP en magnesium,
Fig. 14: De expressie van het luc-gen, gekoppeld aan het NF-κB gen. Na toedienen van het substraat D-
luciferine treedt een lichtreactie op. Deze vrijgestelde bioluminescentie is dus indirect een maat voor NF-κB
activatie.
28
omgezet worden in oxyluciferine. Tijdens deze reactie is er een emissie van fotonen en dit lichtsignaal
kan dan gemeten worden. Een bijkomend voordeel van deze techniek is de opvolging van de
tumorgroei in functie van de tijd, zonder dieren op te offeren.
5.2. Meting van bioluminescentie
De fotonen die ontstaan tijdens de bioluminescente reactie, zijn in staat om weefsels te penetreren
van enkele mm tot cm dik. Een toestel dat uitgezonden fotonen kan waarnemen bestaat uit twee
hoofdcomponenten: een donkere kamer en een lichtgevoelige camera (Akiko et al., 2004). In de
donkere kamer worden de muizen onder gasanesthesie geplaatst. Het is belangrijk dat deze kamer
lichtdicht is, zodat de lichtgevoelige camera geen fotonen meet van buitenaf. Het toestel neemt eerst
een anatomische foto van de verdoofde muis. Daarna worden de uitgezonden fotonen in de weefsels
gemeten door de lichtgevoelige camera. De detectoren in deze camera meten de hoeveelheid fotonen
uitgezonden per lichaamsoppervlakte. Voor de meting van het luciferase signaal is een lichtfilter van
562 nm ideaal. Dit signaal wordt dan omgezet in een tweedimensionaal beeld en vervolgens op de
anatomische foto van de muis gesuperponeerd. Door middel van een kleurschaal wordt de intensiteit
van de lichtreactie weergegeven. Op deze manier wordt dan de mate van inflammatie (NF-κB
activatie) zichtbaar, samen met de anatomische lokalisatie ervan.
5.3. Factoren die de bioluminescente beeldvorming beïnvloeden
Volgens Akiko S. et al. (2004) zijn er een aantal belangrijke factoren waar rekening mee moet
gehouden worden bij bioluminescente beeldvormingstechnieken. Dit zijn (a) het aantal cellen die het
luciferase gen tot expressie brengen, (b) de promotor van het gen, (c) de beschikbaarheid van
cofactoren (ATP, O2 en Mg2+), (d) de tijd tussen toediening van D-luciferine en de meting, (e) de aard
en diepte van de weefsels die overwonnen moeten worden door de fotonen en (f) de aanwezigheid
van pigment in de huid of haren.
In ons experiment zullen we werken met C57BL/6 Tyr-/- albino muizen die het gen voor tyrosinase niet
dragen en bijgevolg niet in staat om pigment aan te maken. Op deze manier wordt de interferentie
van pigment uitgeschakeld (Kocher et al., 2013).
Een andere factor waar rekening mee gehouden moet worden is de aanwezigheid van een
achtergrondsignaal (Carlson et al., 2002). De onderzoeksgroep kon eerder reeds een verhoogde
luminescentie waarnemen in de lymfeknopen van de hals, de thymus en de Peyerse platen van de
Fig. 15A & B: Het imaging toestel (Bron: https://www.ugent.be/di/di07/nl/dienstverlening/gentherapie) en
een foto genomen door dit toestel na injectie subcutaan (linker muis) en intrarenaal (rechter muis) van
luciferase-positieve tumorcellen (Bron: Akiko S. et al., 2004).
29
darm. Ook werd vastgesteld dat bioluminescentie in bepaalde organen (lever, milt, nieren en hart)
minder gemakkelijk te meten was. De verklaring van Carlson et al. (2002) hiervoor, was dat het
hemoglobine in deze goed doorbloedde organen zorgt voor een absorptie van het uitgezonden licht.
Dit is een illustratie dat bioluminescentie afhankelijk is van de aard en de diepte van het weefsel dat
overwonnen moet worden, zoals eerder aangehaald.
6. DE ROL VAN MMP-9, VEGF, CHI3L1 EN LCN2 OP DE TUMORGENESE
In het experimentele deel van deze masterproef zullen we vier glycoproteïnen meten die met
tumorgroei en metastase worden geassocieerd. Dit zijn matrix metalloproteïnase 9 (MMP-9), vascular
endothelial growth factor (VEGF), chitinase 3-like 1 (CH3L1) en lipocaline 2 (LCN2). Deze tumor
geassocieerde glycoproteïnen winnen steeds meer aan belang omdat ze een potentieel
aangrijpingspunt vormen voor antitumorale therapieën. In deze rubriek wordt hun rol tijdens de
tumorgenese beschreven.
6.1. Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9)
Matrix metalloproteïnse-9 (MMP-9), soms ook gelatinase B geheten, is een proteolytisch enzym dat
typisch geassocieerd wordt met tumorprogressie en metastasering (Daniele et al., 2016). Dit
glycoproteïne kan geproduceerd worden door tumorcellen, maar ook door cellen van het omgevende
stroma. Doordat MMP-9 een proteolytische activiteit heeft, kan ze de extracellulaire matrix afbreken
in de directe omgeving van de tumor, waardoor tumorale groei gemakkelijker kan doorgaan.
Bovendien is MMP-9 in staat om onder andere collageen type IV en laminine-5 af te breken, twee
structurele eiwitten die voorkomen in de basaalmembraan van epithelia. Daardoor kunnen
tumorcellen gemakkelijker de basaalmembraan doorbreken, waardoor ze een meer invasief karakter
krijgen. Het is bovendien al langer geweten dat MMP-9 ook angiogenese stimuleert via de productie
van VEGF (Toi et al., 1996). In conclusie geschiedt de rol van MMP-9 op de tumorale groei door:
(1) het bevorderen van tumorprogressie door afbraak van de ECM,
(2) het stimuleren van maligne transformatie door een verhoogde invasiviteit, en
(3) de inductie van VEGF-expressie met tumorale angiogenese tot gevolg.
6.2. Vascular endothelial growth factor (VEGF)
Vascular endothelial growth factor (VEGF) is een glycoproteïne dat een sleutelrol speelt in de tumorale
groei door de inductie van tumorale angiogenese (Carmeliet, 2005). Zonder de productie van VEGF
kan een tumor niet groter worden dan 1 à 2 millimeter, omdat er dan onvoldoende nutriënten en
zuurstof worden aangevoerd. Men spreekt van een ‘angiogene switch’ wanneer een tumor onder
invloed van hypoxie en andere factoren (bv. MMP-9, zie voor) VEGF begint te produceren, waardoor
een ingroei van bloedvaten in en rond de tumor ontstaat en ze haar exponentiële groei ongehinderd
kan voortzetten. De bloedvaten die ontstaan ten gevolge van tumorale VEGF-expressie zijn structureel
en functioneel abnormaal. Ze vormen geen typische arteriolen, venulen en capillairen, waardoor ze
lekken op meerdere plaatsen en een hoge interstitiële druk veroorzaken. Daardoor is de tumorale
bloedvoorziening suboptimaal, ontstaat hypoxie en wordt de productie van VEGF verder
gestimuleerd. Een vicieuze cirkel wordt zo in stand gehouden. VEGF heeft dus één relevante functie,
nl. de inductie van:
(1) tumorale angiogenese
30
6.3. Chitinase 3-like 1 (CH3L1)
Chitinase 3-like 1 (CH3L1) is een glycoproteïne dat zijn naam heeft gekregen omdat het structureel
sterk verwant is met chitinase. Chitine komt voor in de celwanden van schimmels en in het exoskelet
van sommige insecten. Chitinase wordt daarom door dieren gebruikt om chitine van schimmels te
verteren of het exoskelet van vorm te laten veranderen. Doorheen de evolutie is dit chitinase gen zijn
enzymatische activiteit verloren en kreeg het nieuwe functies. Recent werd beschreven dat CH3L1 een
rol zou spelen bij chronische inflammatie, idiopathische longfibrose en verschillende tumoren. Het
waren uiteindelijk Cohen N. et al. (2017), die aantoonden dat CH3L1 verhoogd tot expressie wordt
gebracht door borstkanker-geassocieerde fibroblasten. Zij konden eveneens een verhoogde expressie
van deze merker aantonen in muriene longmetastasen. Cohen N. et al. (2017) besloten daarom dat
CH3L1 een belangrijke rol speelt in de tumorgenese, omdat dit glycoproteïne:
(1) angiogenese induceert,
(2) chemotactisch inwerkt op macrofagen,
(3) tumorgroei versnelt, en
(4) zorgt voor een verminderde influx van CD8+ T-cellen.
6.4. Lipocaline 2 (LCN-2)
Lipocaline 2 (LCN2) is een proteïne dat behoort tot de familie van de lipocalines. Lipocalines zijn
beschreven als regulatoren van imuunresponsen en het celmetabolisme. Bovendien zouden ze van
belang zijn in het ijzertransport en de synthese van prostaglandines (Shi H. et al., 2008). Lipocalines
zijn eveneens van belang bij het ontstaan van sommige pathologiën, waarbij de rol van LCN2 op de
tumorgenese het best is beschreven. Yang J. et al. (2009) toonden aan dat LCN2 verhoogd tot expressie
gebracht wordt in humane borstcarcinomen. Zij beschreven eveneens dat er minder E-cadherine op
de tumorcellen kon worden aangetroffen na blootstelling aan LCN2. Er werd daarom geconcludeerd
dat LCN2, epitheliaal-mesenchymale transitie (EMT) bevordert. Dezelfde onderzoeksgroep
publiceerde in 2013 dat een verhoging van LCN2 gepaard gaat met een verhoging van vascular
endothelial growth factor (VEGF). De auteurs besloten daarom dat LCN2 eveneens van belang is bij
tumorale angiogenese. Andere onderzoeksgroepen (Leng X. et al., 2009; Shi H. et al., 2008) kwamen
tot dezelfde conclusie als Yang J. et al. (2009). LCN2 wordt als pro-oncogeen beschouwd omdat het
zorgt voor de stimulatie van:
(1) tumorprogressie,
(2) tumorale angiogenese, en
(3) metastasering via EMT.
Fig. 16: De ‘angiogene switch’ onder invloed van VEGF. (Bron:
https://www.nemokennislink.nl/publicaties/stik-er-toch-in/ ,
geraadpleegd op 18 februari 2018).
31
DEEL B: EXPERIMENTEN
1. MATERIALEN EN METHODEN
1.2. Cultuur van Py230 mammatumorcellen
Muriene Py230 mammatumorcellen werden aangekocht bij een erkende verdeler voor cellijnen
(ATCC) en vermeerdert in celcultuurflessen, waarbij het medium (F-12K Medium met 1%
penicilline/streptomycine, 5% foetaal kalfsserum en 0.1% MITO+ Serum Extender) twee maal per
week werd ververst. Na één week werd een sub-celcultuur aangelegd. De tumorcellen werden
geoogst na toevoeging van trypsine-EDTA (0.25%). Het wassen van de celsuspensie geschiedde door
centrifugatie (250 g, 5 minuten, 37°C) en resuspensie van de pellet in PBS. De geoogste Py230
mammatumorcellen werden geteld met een Bürker telkamer.
1.3. Selectie van NF-κB Luc+ transgene muizen
Vrouwelijke C57Bl/6 albinomuizen uit ons eigen kweekprogramma werden gescreend op de
aanwezigheid van het NF-κB-gekoppelde luciferase gen. Dit gebeurde door intraperitoneale injectie
van 200 μl D-luciferine in PBS (2mg/100μl), isofluraan anesthesie en bioluminescente beeldvorming
aan de hand van het ‘In Vivo Imaging System’ (IVIS Lumina II®) (Fig. 15A&B en 17A&B). De muizen
werden conventioneel gehuisvest in een faciliteit met gecontroleerde temperatuur- en relatieve
vochtigheid onder een 12 uur licht / donker cyclus. Voedsel en water waren ad libitum beschikbaar.
Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door de Commissie ethiek van dierproeven van de
Universiteit Gent (erkenningsnummer: EC2017_80).
1.4. Intraductale injectie van Py230 mammatumorcellen in de melkklier
De gescreende NF-κB luc+ C57Bl/6 muizen werden geanestheseerd aan de hand van een
intraperitoneale injectie van 10 μg/kg buprenorfine en isofluraan-gasanesthesie (2-3% voor inductie,
1-1,5% voor onderhoud en steeds aangevuld met zuurstof). Intraductale injectie van tumorcellen kan
enkel uitgevoerd worden bij lacterende muizen. Paring vond daarom 5 weken voor de start van het
experiment plaats. Wanneer de pups 12 tot 14 dagen oud waren, werden ze gespeend. Eén uur hierna
werden de muizen intraductaal geïnoculeerd met 105 Py230 mammatumorcellen, gesuspendeerd in
Fig. 17A & B: Screening van vrouwelijke C57Bl/6 albinomuizen uit ons eigen kweekprogramma. De muizen
werden na intraperitoneale injectie van D-luciferine in het IVIS Lumina II® toestel geplaatst onder isofluraan
gasanesthesie (linker foto). Bij de middelste muis werd geen bioluminescente lichtreactie waargenomen
(rechter foto), deze muis is dus geen drager van het luciferase gen.
32
een 100 μl koud mengsel van PBS en Matrigel® in een verhouding 1:10 v/v. Injectie gebeurde door
gebruik te maken van een stomp gemaakte 32G naald, na minimale excisie van de tepeltop.
1.5. Analyse van primaire tumorgroei en geassocieerde lokale en systemische
veranderingen
De groei van de primaire mammatumoren werd wekelijks opgevolgd aan de hand van een digitale
schuifpasser. Het tumorvolume werd dan berekend door lengte, breedte en hoogte met elkaar te
vermenigvuldigen. Het humaan eindpunt werd op een tumorvolume van 2 cm³ vastgelegd. Gewichts-
en lichaamstemperatuurveranderingen werden eveneens wekelijks bijgehouden. Daarnaast werden
ook andere parameters beoordeeld om het welzijn van de muizen in te schatten, dit waren
bijvoorbeeld gedrag en vachtkwaliteit. Een scorerooster is toegevoegd als Bijlage I.
Bioluminescentie beeldvorming werd uitgevoerd op zowel de primaire mammatumoren in vivo als de
verschillende organen ex vivo. Deze metingen gebeurden met het IVIS Lumina II-systeem, dat reeds
werd besproken in ‘Deel A: 5. Meten van inflammatie via bioluminescentie’. De muizen kregen eerst
een intraperitoneale injectie van 200 μl D-luciferine in PBS (2 mg/100 μl). Bioluminescentie werd 10
minuten na deze injectie gemeten en uitgedrukt in de logaritmische eenheid flux, een eenheid die het
aantal fotonen weergeeft dat per seconde op de detector inslaat. Om de flux densiteit te berekenen
werd er vervolgens gedeeld door gemeten oppervlakte, in dit geval de regio van het derde klierpaar.
De totale flux densiteit laat toe om de luminescente reactie van de primaire mammatumoren op
verschillende tijdstippen te vergelijken, omdat deze waarden onafhankelijk zijn van de absolute
oppervlakte waarover werd gemeten (normalisatie per cm2).
Op drie tijdstippen, nl. 11 dagen, 3 en 6 weken vond er opoffering plaats van telkens enkele muizen.
Deze werden eerst verdoofd door intraperitoneale injectie van 1 ml ketamine (100 mg/kg) en xylazine
(10 mg/kg). Na enkele minuten werden deze dan geëuthanaseerd via cervicale dislocatie. Primaire
mammatumoren, milt, lymfeknopen, longen en lever werden gedissecteerd en in het IVIS Lumina II-
toestel geplaatst om de bioluminescentie ex vivo te bepalen. Alle gedissecteerde organen werden
daarna gewogen. Vlak voor de cervicale dislocatie werd er eveneens een intracardiale punctie
uitgevoerd om bloed te bekomen, dat vervolgens werd gecentrifugeerd (19000 g, 1 uur, 4°C). Het
bekomen serum werd daarna gepipetteerd naar een nieuw epje.
1.6. Histologische evaluatie van primaire mammatumor, milt en metastasen
(lymfeknoop, long en lever)
Alle organen en weefsels werden gefixeerd in een 4% gebufferde formaldehyde-oplossing gedurende
24 uur. Deze werden daarna bewaard in 70% ethanol om vervolgens ingebed te worden in paraffine.
Aan de hand van een microtoom werden coupes van 5 μm gesneden en vervolgens
gedeparaffiniseerd, gehydrateerd en gekleurd met Hematoxyline & Eosine (H&E). De coupes werden
opnieuw gedehydrateerd en gemonteerd op een draagglas om ze onder de lichtmicroscoop te
beoordelen.
1.7. Immunohistochemie
Voor immunohistochemische kleuringen (IHC) werden coupes van 2-3 μm gedeparaffiniseerd en
behandeld onder druk bij 95°C met een citraatbuffer (10 mM tri-natriumcitraat aangevuld met 0,05%
Tween-20, pH 6) gedurende 30 minuten voor antigeenretrieval. De draagglaasjes werden vervolgens
afgekoeld tot kamertemperatuur (KT) gedurende 30 minuten, waarna endogene peroxidase-activiteit
werd geblokkeerd met 3% H2O2 in methanol (voor Ki67, CD45, Ly6G, CD163 en CD31) of 0,6% H2O2 in
methanol (voor CD8a) gedurende 10 minuten bij KT. Serumvrije proteïneblokker werd gedurende 10
33
minuten bij KT aangebracht om aspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren. De draagglaasjes werden
vervolgens geïncubeerd met verdund primair antilichaam gedurende 1 uur bij KT. Na de nodige
wasstappen werden de draagglaasjes met het secundaire antilichaam geïncubeerd gedurende 15
minuten indien anti-muis of 30 minuten indien anti-rat, eveneens bij KT. Daarna werd een di-amino-
benzidine (DAB) buffer aangebracht gedurende 10 minuten, waarna werd gewassen met gedestilleerd
water. Ten slotte werden de preparaten gekleurd met hematoxyline en opnieuw gedehydrateerd. De
wasstappen werden uitgevoerd met een tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 2 minuten bij
KT en telkens drie maal herhaald. Alle incubatie- en wasstappen vanaf de blokkering van de
peroxidase-activiteit tot de stap waar DAB op de preparaten wordt gebracht, werden uitgevoerd op
een schudder aan 20 rpm in een gesloten preparaathouder voor microscoopglaasjes (vochtige kamer
door papier gedrenkt in TBS).
De gebruikte primaire antilichamen zijn samen met hun verdunning en doelwitcel weergegeven in
Tabel 1. De secundaire antilichamen waren anti-muis antistoffen voor CD45, Ly6G, CD8a en anti-konijn
antistoffen voor Ki67, CD163 en CD31.
1.8. Flowcytometrie
Op de drie tijdstippen van opoffering (11 dagen, 3 en 6 weken) werden drie primaire mammatumoren
willekeurig geselecteerd en onderworpen aan een flowcytometrische analyse. Eerst werd een
‘gentleMACS’-digestie (Miltenyi®) uitgevoerd. De primaire mammatumoren werden in kleine stukjes
van 2-4 millimeter gesneden en samen met 2,5 ml van een commercieel bereid enzymmengsel (tumor
dissociatie kit; Miltenyi®) overgebracht in een gentleMACS C-tube, waarna het programma
m_impTumor_02 werd uitgevoerd door het gentleMACS toestel. Na beëindiging van dit programma
werd de gentleMACS C-tube ontkoppeld van de dissociator en gedurende 40 minuten geïncubeerd bij
37°C aan 40 rpm. Daarna werd de C-tube terug aangekoppeld en werd het m_impTumor_02
programma twee maal achter elkaar uitgevoerd. Ten slotte werd de suspensie dan overgeheveld naar
een MACS SmartStrainer (70 μm).
De MACS SmartStrainer werd daarna met 10 ml RPMI 1640 gewassen en overgebracht naar een
nieuwe Falcontube, die vervolgens werd gecentrifugeerd (7 min., 450G). Na afgieten van het
supernatans werd de pellet geresuspendeerd in 1 ml RPMI 1640 waarvan 100 μl werd overgebracht
in een welletje van een 96-well plaat (met V-bodem). De suspensie werd dan een eerste keer geteld
aan de hand van de flowcytometer (Analis®, Cytoflex). Daarna werd er opnieuw gecentrifugeerd (7
min., 450G) en werd de cel pellet opgelost in Fc-Blok (BD®), dat 1/10 werd verdund in Facsbuffer (voor
Primair antilichaam Verdunning Merker voor
Anti-Ki67 1:50 Tumorcellen
Anti-CD45 1:1000 Immuuncellen
Anti-Ly6G 1:1000 Neutrofielen
Anti-CD163 1:500 Protumorigene macrofagen
Anti-CD31 1:2000 Endotheelcellen
Anti-CD8a 1:50 Cytotoxische T-cellen
Tabel 1: Weergave van de aangewende primaire antilichamen met respectievelijk hun gebruikte verdunning
en doelwitcel voor de immunohistochemische evaluatie van de primaire mammatumoren.
34
500 ml Facsbuffer werd 5 g BSA en 365 mg EDTA-dinatriumzout opgelost in PBS met 500 μL 10%
natriumazide).
Vervolgens werd 100 μL van elke celsuspensie in de 96-well plaat gebracht en 10 minuten lang
geïncubeerd bij 4°C. De 96-well plaat werd dan opnieuw gecentrifugeerd (5 min., 450G) en na afgieten
van het supernatans werd dan 100 μL van de drie verschillende primaire antilichaamcombinaties
toegevoegd aan elke celsuspensie (Tabel 2). Een deksel werd op de plaat gebracht en deze werd dan
gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 4°C. Daarna werd gecentrifugeerd (5 min., 450G) en gewassen
(200 μl Facsbuffer). Ten slotte werd, enkel indien het primair antilichaam niet direct geconjugeerd
was, 100 μL secundair toegevoegd aan de welletjes (Tabel 2) en 15 minuten geïncubeerd bij 4°C.
Opnieuw werd daarna gecentrifugeerd aan 450G gedurende 5 minuten. Na het uitvoeren van een
nieuwe wasstap werd 100 µl Facsbuffer toegevoegd aan elke well en 2 µl propidiumiodide (PI) voor
elke celsuspensie toegevoegd aan een welletje zonder antilichamen.
Antilichaam
(Primair)
Label Verdunning
Primair
Antilichaam
(Secundair)
Verdunning
Secundair
Merker voor
Anti-CD45 Biotine 1:200 Streptavidine PE 1:333 Immuuncellen
Anti-CD45 Biotine 1:200 Streptavidine eFluor 1:80 Immuuncellen
Anti-F4/80 APC 1:20 / / Macrofagen
Anti-Ly6G APC 1:10 / / Neutrofielen
Anti-CD3 FITC 1:50 / / T-cellen
Anti-CD4 PE 1:80 / / Helper T-cellen
Anti-CD8a APC 1:80 / / Cytotoxische T-cellen
Antilichaamcombinaties
Combinatie 1 Anti-CD45 + Anti-F4/80
Combinatie 2 Anti-CD45 + Anti Ly6G
Combinatie 3 Anti-CD45 + Anti-CD3 + Anti-CD4 + Anti-8a
Tabel 2: Weergave van de primaire antilichamen met hun doelwitcel en aangewende verdunning voor
flowcytometrische detectie van verschillende types immuuncellen in de primaire mammatumoren.
Fluorescentie van CD45-positieve immuuncellen geschiedde door toevoeging van een secundair met
streptavidine-gemerkte fluorochromen. De verschillende antilichaamcombinaties zijn eveneens
weergegeven.
35
1.9. Expressie van MMP-9, VEGF, CHI3L1 en LCN2
Een deel van de geïsoleerde primaire mammatumoren, milten en axillaire lymfeknopen werden met
een mixer gehomogeniseerd. Cellulaire eiwitten werden geëxtraheerd door dit homogenaat te
mengen met 300 μl lysebuffer (1% Nonidet P40, 10 mM Tris-HCl met pH 7,4, 200 mM NaCl, 5 mM
EDTA en 10% glycerol), aangevuld met proteaseremmers (100 μM fenylmethylsulfonylfluoride); 0,15
μM aprotinine; 2,1 μM leupeptine en 1 mM geoxideerd L-glutathion). De mengsels werden overnacht
bewaard bij -20°C en de volgende dag gecentrifugeerd (19000 g, 1 uur, 4°C). Het supernatans werd
overgebracht in een nieuw epje en hierop werden vervolgens de eiwitconcentraties bepaald aan de
hand van coomassie blauw kleuring en spectrofotometrie. Lysaten en sera werden bewaard bij -80°C
en ontdooid bij KT voor verdere analyse via ELISA. De lichtabsorptie werd gemeten bij een golflengte
van 450 en 550 nm (optische densiteit, OD). Een correctie voor optische imperfecties werd uitgevoerd
door de OD-waarden bekomen bij 550 nm af te trekken van deze bij 450 nm. De concentraties van
MMP-9, VEGF, CHI3L1 of LCN2 werden in de stalen bepaald door de gemeten optische densiteit af te
lezen op de corresponderende standaardcurve.
1.10. Statistische analyse
Analyse van de variantie (ANOVA) met Tukey HSD als post-hoc test werd gebruikt voor de analyse van
de gegevens bekomen na meting van meer dan twee tijdspunten. Eénzijdige T-testen werden gebruikt
om de P-waarden van de gegevens tussen 2 tijdspunten of parameters te berekenen.
Normaalverdeling van de gegevens werd steeds gecontroleerd. Indien nodig, werd een log10-
transformatie uitgevoerd om een normaalverdeling te kunnen bekomen. P-waarden onder 0,05
werden als statistisch significant beschouwd. Alle statistische analyses werden uitgevoerd in
Graphpad®.
36
1.11. Tijdlijn van het Py230 intraductale tumor experiment
37
2. RESULTATEN
2.1. Primair mammatumorvolume en gewicht van primaire mammatumoren, milt en
axillaire lymfeknopen
Onderstaande grafieken (Fig. 18A-D) tonen volume- en gewichtsverandering van de primaire
mammatumoren en de gewichtsveranderingen van de milt en de axillaire lymfeknopen. Het
tumorvolume werd niet-invasief bepaald via een schuifpasser, waardoor er voor die parameter meer
tijdspunten zijn dan voor de overige drie parameters. Deze laatsten werden bepaald na opoffering van
telkens 5 muizen per tijdstip, nl. op 11 dagen, 3 weken en 6 weken post-intraductale injectie van de
Py230 mammatumorcellen.
Het gemiddelde tumorvolume was op 6 weken significant groter (P < 0.001; n = 5) dan dat van de vijf
vroegere tijdspunten (Fig. 18A). Het gemiddelde tumorgewicht was op 6 weken ook significant (P <
0.01; n = 5) groter dan dat van beide vroegere tijdspunten (Fig. 18B). Het humaan eindpunt dat was
Fig. 18A tot D: Evolutie van primair tumorvolume (A) en gewicht van de primaire mammatumor (B), de milt (C)
en de axillaire lymfeknopen (D). ). ** staat voor P < 0.01 en *** staat voor P < 0.001.
A B
v
C D
38
vastgelegd op een tumorvolume van 2,0 cm³ of indien ulceratie van de primaire mammatumoren zou
plaatsvinden, werd bereikt bij 3 van de 8 muizen op 6 weken post-inoculatie (p.i.). Het langer
aanhouden van de muizen was daarom ethisch onaanvaardbaar. Daarnaast werd eveneens een sterke
miltvergroting vastgesteld tussen 3 en 6 weken p.i. (Fig. 18C). Op 6 weken p.i. was er ook een
vergroting van de axillaire lymfeknopen zichtbaar, maar de vergroting tussen 11 dagen en 3 weken
ging niet in stijgende lijn (Fig. 18D). Er kon voor deze beide, laatste fenomenen geen significantie
worden aangetoond.
2.2. H&E lichtmicroscopie en Ki67 IHC van de primaire mammatumoren
Om de primaire mammatumorgroei microscopisch te bestuderen, werd naast H&E ook een IHC
uitgevoerd voor het nucleair proteïne Ki67, als merker voor cellulaire proliferatie. De onderstaande
representatieve beelden illustreren dat op 11 dagen p.i. de Py230 mammatumorcellen volledig
gelokaliseerd waren in de melkkliergangen (Fig. 19A-D). Op 3 weken p.i. was dit aantal in de
melkkliergangen duidelijk toegenomen (Fig. 19E-H). Vanaf 6 weken p.i. was er een duidelijke
doorbraak van de tumorcellen in het onderliggende mammair vetweefsel zichtbaar (Fig. 19I-J).
A B
39
C D
E F
G H
40
Fig. 19A tot J: Hematoxyline & Eosine (H&E) lichtmicroscopie en Ki67 IHC op paraffinecoupes van de primaire tumoren op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i.. Ki67 is een
proliferatiemerker en kleurt de kernen van delende cellen (o.a. tumorcellen) aan.
I J
41
2.3. Evolutie van NF-κB-activiteit tijdens de primaire tumorgroei
2.3.1. In vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren
De in vivo bioluminescentie op 6 weken p.i. was significant (P < 0.05; n = 5) hoger dan deze gemeten
op de 6 vroegere tijdspunten (Fig. 20).
2.3.2. Ex vivo bioluminescentie NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren en de axillaire
lymfeknopen
Op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i. werden telkens enkele muizen opgeofferd en van zowel de primaire
mammatumoren als de axillaire lymfeknopen werd de ex vivo bioluminescentie gemeten. Voor de
primaire mammatumoren was er een duidelijke trend tot stijging van de NF-κB activiteit in functie van
de tijd (Fig. 21A). Echter, voor de axillaire lymfeknopen was dit enkel het geval voor de verandering
tussen 3 en 6 weken p.i. (Fig. 21B). Er kon voor beide ex vivo metingen geen significantie worden
aangetoond.
A
Fig. 20: Evolutie van de in vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren. * staat
voor P < 0.05.
42
Fig. 21A en B: Evolutie van de ex vivo bioluminescentie van NF-κB activiteit in de primaire mammatumoren
(A) en de axillaire lymfeknopen (B).
B
43
2.4. CD45, CD163, Ly6G en CD8a IHC evaluatie in de primaire mammatumoren
IHC merker (I), evolutie (E) en lokalisatie (L)
11 Dagen p.i.
3 Weken p.i.
6 Weken p.i.
I: CD45 (immuuncellen) E: Toename op 6 weken L: Tumoraal Stroma
I: CD163 (M2-macrofagen) E: Toename op 6 weken L: Tumoraal Stroma
44
IHC merker, evolutie en lokalisatie
11 Dagen p.i.
3 Weken p.i.
6 Weken p.i.
I: Ly6G (neutrofielen) E: Toename op 6 weken L: Primaire tumor
I: CD8a (Cytotoxische T-cellen) E: Toename op 6 weken L: Primaire tumor
45
2.5. Flowcytometrische evaluatie van de lokale immuuncelinflux in de primaire
mammatumoren
Om de immunologische samenstelling van de primaire tumoren beter te bestuderen, werd naast IHC
ook een flowcytometrische analyse uitgevoerd. De manier waarop de bekomen data werden
geanalyseerd is relatief complex, en wordt daarom eerst toegelicht.
2.5.1. Methodiek
2.5.1.1. “Gating strategy”
Onderstaand is de ‘gating strategy’’ zoals werd toegepast voor een representatieve muis weergegeven
(Fig. 22A-I). Deze werd voor alle muizen en alle tijdspunten steeds aangehouden.
Eerst wordt celdebris geëxcludeerd op basis van forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC). Onder
celdebris worden alle partikels uit het tumorweefsel verstaan die geen cellen zijn, maar wel door de
flowcytometer werden gedetecteerd. Dit zijn bijvoorbeeld de collageen- en elastinevezels van de
extracellulaire matrix. Debris heeft typisch een lage FSC, waardoor deze populatie gemakkelijk
uitgesloten kan worden door te ‘gaten’ op een dotplot waarin FSC werd uitgezet tegenover SSC (Fig.
22A).
Vervolgens worden celaggregaten uitgesloten aan de hand van de hoogte (Height, H) versus
oppervlakte (Area, A). Wanneer een enkelvoudige cel doorheen de laser in de flowcytometer passeert,
is de gemeten verhouding tussen H van die cel en haar A min of meer constant. Met andere woorden:
hoe hoger de cel, hoe groter haar oppervlak. Wanneer A dan wordt uitgezet tegenover H in een dot
plot, zullen alle enkelvoudige cellen op een rechte vallen. Celaggregaten hebben typisch een hogere
A gemeten voor een bepaalde H, waardoor deze kunnen worden uitgesloten op een dotplot (Fig. 22B).
In de volgende stap (Fig. 22C) worden enkel de cellen geselecteerd die positief zijn voor het
fluorochroom waarmee het primair of eventueel secundair antilichaam gelabeld is (Tabel 2). De grens
voor een positief signaal werd ingesteld aan de hand van twee negatieve controles nl. de
autofluorescentie en het isotype. De autofluorescentie is de fluorescentie gemeten op dezelfde
celsuspensie, maar zonder toevoeging van antistoffen. Het isotype is de fluorescentie gemeten op de
celsuspensie met toevoeging van isotype-controle antistoffen om aspecifieke binding na te gaan. De
fluorescentie intensiteit die hoger is dan deze beide negatieve controles wordt beschouwd als een
(A) (B)
46
positief signaal. Hierbij werd steeds een maximale overlapping van 5% tussen de negatieve controles
en het staal toegelaten.
2.5.1.2. Afbakening van de populatie macrofagen
Het aandeel macrofagen binnen de populatie immuuncellen wordt bepaald zoals weergegeven in
onderstaand histogram (Fig. 22D). Binnen de CD45+ populatie werd gekeken naar bijkomende APC
fluorescentie. APC is immers het fluorochroom dat werd gekoppeld aan antistoffen tegenover F4/80,
een moleculaire merker op de celmembraan van macrofagen (Tabel 2). Voor de afbakening werd
opnieuw een overlap van maximaal 5% tussen het isotype en het staal toegelaten.
2.5.1.3. Afbakening van de populatie neutrofielen
Analoog aan de afbakening van macrofagen, werd ook het aandeel neutrofielen in de primaire tumor
bepaald zoals weergegeven in onderstaand histogram (Fig. 22E). Het belangrijkste verschil hier is dat
het APC-fluorochroom nu werd gekoppeld aan antistoffen gericht tegenover Ly6G, een moleculaire
merker voor neutrofielen (Tabel 2).
(C)
(D)
47
2.5.1.4. Afbakening van de CD3+, CD4+ en CD8+ T-cellen
Aan de celsuspensie van de primaire tumoren werden fluorochroom-gemerkte antistoffen
toegevoegd voor CD45, CD3, CD4 en CD8. In deze combinatie aan antilichamen, werd gewerkt met
CD45 antistoffen gekoppeld aan eFluor in plaats van PE (Tabel 2). De afbakening van CD45+ cellen is
opnieuw weergegeven in onderstaand histogram (Fig. 22F). De overige antistoffen tegenover CD3,
CD4 en CD8 werden fluorescent gemerkt met respectievelijk FITC, PE en APC (Tabel 2).
Vervolgens werd binnen deze CD45+ populatie, de CD3+ lymfocyten bepaald. De afbakening tussen
het isotype en de CD3+ celpopulatie was echter niet éénduidig (Fig. 22G). De grens werd daarom
geverifieerd via ‘backgating’ vanuit de CD4+ en CD8+ celpopulatie, aangeduid met een rode kleur (Fig.
22H). Opnieuw werd een maximale overlapping tussen isotype en staal van 5% gerespecteerd.
(F)
(E)
48
In de laatste stap wordt dan de APC fluorescentie uitgezet tegenover die van PE (Fig. 22I). T-
helpercellen zijn PE positief en APC negatief, terwijl dit omgekeerd is voor de cytotoxische T-cellen.
(G) (H)
(I)
Fig. 22A tot I: “Gating strategy” van de flowcytometrische evaluatie voor de lokale immuuncelinflux in de
primaire mammatumoren.
49
% Dode cellen
(PI+ / All Single Cells) x 100
27,46
17,92
22,97
13,63
21,63
PI+ niet gemeten
12,22
31,64
18,26
2.5.2. Resultaten
2.5.2.1. Het percentage immuuncellen, macrofagen en neutrofielen in de primaire
mammatumoren
Het percentage CD45+ cellen (immuuncellen) werd berekend op het totaal aantal enkelvoudige cellen,
na exclusie van debris en celaggregaten. Binnen deze populatie immuuncellen werd dan gekeken naar
het aandeel (percentage) viabele (PI-) macrofagen en neutrofielen.
2.5.2.2. Het percentage CD3+, CD4+ en CD8+ cellen in de primaire mammatumoren
Het percentage CD3+ cellen (T-cellen) werd berekend binnen de populatie CD45+ cellen
(immuuncellen). Binnenin deze populatie immuuncellen werd dan gekeken naar het percentage CD4+
en CD8+ T-cellen, dit zijn respectievelijk de T-helpercellen en cytotoxische T-cellen. Er vond geen
flowcytometrische analyse plaats van T-cellen op 11 dagen p.i., omdat deze aan de hand van de IHC
coupes weinig belangrijk werden geacht op dit vroege tijdspunt.
% Immuuncellen
(CD45+ / All Single Cells) x 100
1 5,26
2 3,48
3 3,82
4 9,62
5 6,11
6 8,54
7 59,89
8 36,91
9 38,78
Tijd Post - inoculatie Muisnummer
11 dagen
3 weken
6 weken
% Macrofagen in CD45+ % Neutrofielen in CD45+
(F4/80+ / CD45+) x 100 (Ly6G+ / CD45+) x 100
40,88 4,04
43,68 2,40
41,25 0,80
15,95 0,46
35,16 0,67
34,95 1,92
25,93 2,92
21,84 28,49
25,28 6,51
Tabel 3: Het percentage immuuncellen, macrofagen en neutrofielen in de primaire mammatumoren.
50
2.6. Matrixdegradatie en vaatvorming in het tumoraal milieu (lokaal) en serum
(systemisch)
2.6.1. Evolutie van MMP-9 in de primaire mammatumor en serum
De onderstaande grafieken geven de MMP-9 concentratie weer in de primaire mammatumor en
serum. In de primaire mammatumor is er op 6 weken p.i. een significante (P < 0.001; n = 5) stijging
van de MMP-9 concentratie ten opzichte van alle andere tijdspunten (Fig. 23A). Bovendien stijgt de
MMP-9 concentratie in functie van de tijd. Op 6 weken p.i. is de concentratie van MMP-9 in serum
ook significant verschillend (P < 0.05; n = 5) van deze op 3 weken en van de concentratie gevonden in
serum van gezonde muizen, maar niet van deze op 11 dagen (Fig. 23B). De concentraties van MMP-9
zijn hoger in serum dan in de primaire mammatumor.
% T - cellen in CD45+
(CD3+ / CD45+) x 100
4 8,65
5 4,48
6 4,04
7 20,15
8 26,24
9 32,00
6 weken
Tijd Post - inoculatie Muisnummer
3 weken
% T - cellen in CD45+
(CD3+ / CD45+) x 100
4 8,65
5 4,48
6 4,04
7 35,04
8 26,24
9 32,00
6 weken
Tijd Post - inoculatie Muisnummer
3 weken
Fig. 23A & B: Evolutie van de MMP-9 concentraties in de primaire mammatumor (A) en serum (B). * staat
voor P < 0.05 en *** staat voor P < 0.001.
A B
% T - cellen in CD45+ % T - Helpercellen in CD3+ % Cytotoxische T - cellen in CD3+
(CD3+ / CD45+) x 100 (CD3+CD4+ / CD45+) x 100 (CD3+CD8+ / CD45+) x 100
8,65 65,97 7,64
4,48 48,60 4,67
4,04 44,33 7,22
35,04 36,52 45,13
26,24 23,27 51,93
32,00 31,79 51,04
Tabel 4: Het percentage CD3+, CD4+ en CD8+ cellen in de primaire mammatumoren.
51
2.6.2. Evolutie van VEGF in de primaire mammatumor en serum
Onderstaande grafieken zijn een weergave van de concentratie van VEGF in de primaire mammatumor
(Fig. 24A) en het serum (Fig. 24B). De concentraties van VEGF in de primaire mammatumor en het
serum gemeten 6 weken p.i. zijn significant (P < 0.05; n = 5) verschillend van alle andere tijdstippen,
behalve voor de concentratie gemeten in gezonde melkklieren. De concentratie van VEGF is hoger in
de primaire mammatumor dan in het serum.
2.6.3. CD31 IHC evaluatie van de tumorale vaatvorming
Om de groei van bloed- en lymfevaten (aanvullend op VEGF) als parameter te kunnen bestuderen,
werd een IHC uitgevoerd voor CD31. Dit is een moleculaire merker die voorkomt op de celmembraan
van endotheelcellen. Een toename van de CD31 kleuring is zichtbaar 6 weken p.i. en is zowel in de
primaire mammatumor als het tumoraal milieu gelokaliseerd.
11 Dagen p.i. 3 Weken p.i. 6 Weken p.i.
Fig. 24A & B: Evolutie van de VEGF concentraties in de primaire mammatumor (A) en serum (B). * staat voor
P < 0.05.
A B
Fig. 25: IHC kleuring voor CD31 op 11 dagen, 3 en 6 weken p.i.
52
2.7. Evolutie van CHI3L1 en LCN2 in de primaire mammatumor, de milt, de axillaire
lymfeknopen en serum
2.7.1. CHI3L1
Onderstaande grafieken geven de evolutie van de concentratie van CHI3L1 weer in de primaire
mammatumor, het serum, de milt en de axillaire lymfeknopen. In de primaire mammatumor is er geen
enkele trend, noch enige significantie waar te nemen (Fig. 26A). Er is daarentegen een significante (P
< 0.001; n = 5) stijging van CHI3L1 te zien in serum, 6 weken p.i. (Fig. 26B). Op 11 dagen en 6 weken
p.i. is er ook in de milt een significante (P < 0.05; n = 5) stijging van CHI3L1, maar enkel ten opzichte
van de waarden die werden gemeten in gezonde muizen (Fig. 26C). Verder zijn er ook hogere waarden
gemeten in de axillaire lymfeknopen, maar dit is opnieuw zonder significantie (Fig. 26D).
Fig. 26A tot D: Evolutie van de CHI3L1 concentraties in de primaire mammatumor (A), serum (B), milt (C) en
axillaire lymfeknopen (D). * staat voor P < 0.05 en *** staat voor P < 0.001.
2.7.2. LCN2
Onderstaande grafieken geven de evolutie van de concentratie LCN2 in de primaire mammatumor,
het serum, de milt en de axillaire lymfeknopen. Deze zijn op 6 weken p.i. steeds significant (P < 0.001,
P < 0.01 of P < 0.05; n = 5) verschillend van alle andere gemeten tijdspunten en van de concentratie
gevonden in gezonde muizen (Fig. 27A-D). De gemiddelde concentratie gemeten 6 weken p.i. is
vergelijkbaar in de primaire mammatumor en het serum. Op dit tijdstip is de gemiddelde concentratie
in de milt ongeveer de helft hiervan. In de lymfeknopen is deze lager, nl. gemiddeld 0.2 x 106 pg/ml.
A B
C D
53
Fig. 27A tot D: Evolutie van de LCN2 concentraties in de primaire mammatumor (A), serum (B), milt (C) en
axillaire lymfeknopen (D). * staat voor P < 0.05; ** staat voor P < 0.01 en *** staat voor P < 0.001.
A B
C D
54
3. DISCUSSIE
3.1. Bespreking van de primaire tumorgroei en -progressie
De groei van de primaire tumoren in de tijd vertoonde een exponentieel verloop. Op 6 weken p.i.
waren de primaire tumoren sterk toegenomen, zowel in volume als in gewicht. Het langer aanhouden
van de muizen was ethisch onaanvaardbaar aangezien het tumorvolume dan de vooropgestelde grens
van 2,0 cm³ zou overschrijden. Deze toename in tumorvolume en -gewicht was in overeenstemming
met de waargenomen lokale groei via de kwalitatieve H&E histologie en Ki67 IHC. De coupes toonden
eveneens aan dat dit intraductaal muismodel tot 3 weken p.i. representatief was voor de situatie van
een ductaal carcinoma in situ (DCIS) bij de mens. Tussen 3 en 6 weken p.i. evolueerde de DCIS tot een
invasief ductaal carcinoma (IDC), zoals besproken sub 1.3.1. in de literatuurstudie van deze
masterproef. De doorbraak in het onderliggend mammair bind- en vetweefsel kon bovendien
gecorreleerd worden met de significante toename van MMP-9, een enzyme dat verantwoordelijk
wordt geacht voor extracellulaire matrixdegradatie (Bergers et al., 2000).
Bijkomend kon uit de evolutie van de VEGF concentratie in de primaire tumoren, en de bijhorende
kwalitatieve CD31 IHC detectie besloten worden dat er ook een sterke lokale angiogenese plaatsvond
op 6 weken p.i. Deze bloedvatvorming is cruciaal voor de toevoer van zuurstof en nutriënten naar de
exponentieel groeiende mammatumorcellen. Desondanks ontstaan er in veel mammatumoren
hypoxemische regio’s gekenmerkt door necrose (Steenbrugge et al., 2016). Histologie van de primaire
tumoren in dit model toonde echter geen duidelijke tekenen van hypoxie-geïnduceerde necrose. Er
kan dus aangenomen worden dat de exponentiële groei toch voldoende opgevangen wordt door
VEGF-gemedieerde angiogenese.
Een onverwachte observatie was dat er, ondanks de evolutie van DCIS naar IDC stadium met
bijhorende matrixdegradatie en angiogenese, geen macroscopisch waarneembare metastasen
aanwezig waren tot op het humaan eindpunt 6 weken p.i.
3.2. Bespreking van de lokale inflammatoire respons
Een exponentiële toename van het bioluminescent signaal voor NF-kB, gecorreleerd met de sub 3.1
beschreven tumorgroei, was zichtbaar in de primaire tumoren zowel in als ex vivo. Dit wijst op een
toename van de lokale inflammatie in functie van de tijd. In tegenstelling tot de in vivo data, was deze
toename niet significant bij de ex vivo metingen. Nochtans werd verwacht dat het bioluminescent
signaal net sterker zou zijn na dissectie van de organen. Een verklaring is de lange tijdsduur tussen de
injectie van D-luciferine (het substraat voor luciferase geproduceerd door de gastheercellen) en de ex
vivo metingen, met uitwerking van het D-luciferine en dus een verlies van bioluminescent signaal. In
vivo ‘imaging’ van de tumorale inflammatie, waarbij het bioluminescent signaal voor NF-kB
gegenereerd wordt door de gastheer (en dus niet door de mammatumor cellijn), werd nog niet
beschreven bij een intraductaal muismodel.
Uit de flowcytometrische analyse van de primaire mammatumoren kon besloten worden dat: 1) het
aantal immuuncellen in de primaire mammatumor en het micromilieu toenamen in functie van de
tumorprogressie, 2) er een percentuele daling was van het aandeel macrofagen binnen de populatie
immuuncellen, 3) neutrofielen slechts een klein percentage vormden van de totale populatie
immuuncellen, maar er wel een stijging was 6 weken p.i., 4) T-cellen het sterkst stijgend type
immuuncellen waren en 5) er binnenin deze populatie T-cellen een verschuiving plaatsvond van T-
helpercellen naar cytotoxische T-cellen. Hierbij moet er een belangrijke opmerking gemaakt worden,
nl. dat het absolute aantal macrofagen wél degelijk steeg in functie van de tijd, maar dat deze
populatie relatief daalde binnen de sterker stijgende totale populatie aan immuuncellen.
55
Deze toename aan een lokale inflammatoire respons werd kwalitatief bevestigd via IHC. Meer
specifiek was er binnenin deze stijgende populatie immuuncellen een toename zichtbaar aan M2-
macrofagen, neutrofielen en cytotoxische T-cellen (CD45 als algemene leukocytmerker; CD163, Ly6G
en CD8a, respectievelijk). Niettegenstaande dat de kwantitatieve stijging aan neutrofielen beperkt
was, mag deze daarom niet als onbelangrijk worden beschouwd. Recent werd namelijk aangetoond
dat neutrofielen samen met T-cellen de metastasering van borstkanker kunnen bevorderen (Coffelt
et al., 2015; Wculek et al., 2015). Cytotoxische T-cellen waren percentueel het sterkst stijgende
immuunceltype in de primaire mammatumoren . Deze zeer belangrijke bevinding wijst op een
uitgesproken inflammatoire en antitumorale respons vermits cytotoxische T-cellen de tumorale groei
kunnen inhiberen door inductie van apoptose (Bakshi et al., 2014). Merk op dat tumorcellen hiervoor
dan wel gevoelig moeten zijn, wat soms niet meer het geval is omdat ze het benodigde mechanisme
kunnen uitschakelen (Debatin, 2004). Bovendien staat de waargenomen absolute stijging van M2-
macrofagen in contrast met de toename aan cytotoxische T-cellen, omdat M2-macrofagen net een
anti-inflammatoire en pro-tumorigene functie hebben (Allavena et al., 2008).
3.3. Bespreking van de tumor-geassocieerde veranderingen in de milt en lymfeknopen
Het gewicht van de milt en de axillaire lymfeknopen was toegenomen 6 weken p.i., alhoewel niet-
significant. Een mogelijke verklaring hiervoor is de beperkte steekproefgrootte in deze “proof-of-
concept” studie. Er was wel een trend zichtbaar in de toename van het tumorvolume en -gewicht
enerzijds en het gewicht van de milt en axillaire lymfeknopen anderzijds. Hoe groter de primaire
tumoren werden, hoe groter de milt en axillaire lymfeknopen. Dit fenomeen kan verklaard worden
door het op gang komen van een systemische inflammatie geassocieerd met progressie van de
primaire tumoren (Steenbrugge et al., 2016). De toegenomen serumconcentraties van CHI3L1 en LCN2
waren een bevestiging voor deze hypothese. Beide laatst vermeldde biomerkers werden relatief
recent ontdekt en worden momenteel als prognostische ‘tool’ voor menselijke borstkankerpatiënten
voorgesteld (Johansen et al., 2006; Bauer et al., 2008; Wan G. et al., 2017). Om na te gaan of dit ook
toepasbaar was in ons muismodel, werden CHI3L1 en LCN2 concentraties bepaald in lysaten van zowel
de primaire tumoren, axillaire lymfeknopen en milt en vergeleken met deze in serum. CHI3L1 bleek
daarbij een goede systemische merker voor tumorprogressie, indien gemeten in lysaten van de milt
of in serum. Echter, deze biomerker was niet geschikt voor de beoordeling van de lokale
tumorprogressie, aangezien de concentraties in de primaire tumor niet-significant verschilden van de
concentraties op de vroegere tijdspunten noch van gezonde muizen. In de axillaire lymfeknopen was
wel een stijging in functie van de tijd, maar opnieuw niet significant, wat te wijten is aan de beperkte
steekproefgrootte. Daarentegen was LCN2 wel een goede systemische én lokale biomerker voor
tumorprogressie, omdat deze op 6 weken p.i. in alle gemeten weefsels significant verschillend was
van deze op de vroegere tijdspunten en van gezonde muizen. Ook hier was er een stijging in functie
van de tijd, behalve voor de concentraties in lysaten van de milt. LCN2 kon dus ook gecorreleerd
worden aan de tumorprogressie, zowel lokaal als systemisch.
56
3.4. Vergelijking van het Py230 en 4T1 intraductale muismodel
De Meyer-groep beschikt momenteel over twee intraductale, immunocompetente muismodellen:
het 4T1 model (Steenbrugge et al., 2016) en het nieuwe Py230 model beschreven in deze masterproef
(Vander Elst et al., 2018). Er zijn een aantal belangrijke gelijkenissen en verschilpunten tussen deze
muismodellen. De beide modellen worden in Tabel 5 samenvattend vergeleken.
Steenbrugge et al. (2016) Vander Elst et al. (2018)
Tripel negatieve
mammatumorlijn 4T1 (BALB/c-afgeleid) Py230 (C57BL/6-afgeleid)
Muislijn BALB/c C57BL/6 Tyr-/- NF-κB-luc+
Inoculatiedosis 4,6 x 104 mammatumorcellen,
gesuspendeerd in 100 μl PBS en
Matrigel (1:10)
105 mammatumorcellen
gesuspendeerd in 100 μl PBS en
Matrigel (1:10)
Tijdstip inoculatie 1 uur na spenen van de pups 1 uur na spenen van de pups
Luciferase expressie Ja, tumorcel Ja, transgene NF-κB muis
Tumorgroei Evolutie van DCIS tot IDC stadium
< 3 weken p.i. DCIS stadium blijft minimaal 3
weken behouden
Metastasering op 6 weken p.i. Ja Neen
Splenomegalie Relevante toename
vanaf 4-5 weken p.i.
Relevante toename
vanaf 6 weken p.i.
CHI3L1 in primaire tumor en
serum Relevante toename
vanaf 4-5 weken p.i.
Geen toename lokaal, wel
relevante toename in serum
vanaf 6 weken p.i.
LCN2 in primaire tumor en serum Relevante toename
vanaf 4-5 weken p.i.
Relevante toename
vanaf 6 weken p.i.
Zoals volgt uit Tabel 5, is een belangrijk voordeel van het Py230 intraductale muismodel dat het DCIS
stadium langer (nl. tot 3 weken p.i.) behouden blijft dan bij het 4T1-model. Dit doet zich ook voor bij
de humane patiënt met triple negatieve borstkanker (TNBC) en vormt dus een belangrijk aspect van
dit preklinische model met het oog op screening van succesvolle, vroegtijdige therapieën (Virnig et al.,
2009; Schmadeka et al., 2014). Het Py230 muismodel kan op basis van de preliminaire data uit deze
masterproef reeds voorzichtig worden aanbevolen als potentiële screeningstool voor de werking van
kandidaat antitumorale geneesmiddelen. Meer specifiek voor geneesmiddelen die ingrijpen op de
evolutie van het DCIS naar het IDC stadium door deze hetzij te verhinderen, hetzij te verlaten.
Bovendien biedt het Py230-muismodel ook een ethisch voordeel ten opzichte van het agressievere
4T1 model, omdat het uitblijven van metastasen ervoor zorgt dat de dieren minder ziek zijn. Dit
resulteert daardoor in minder vroegtijdige euthanasie, waardoor de uitval van proefdieren lager is.
Bovendien moeten er ook minder analgetica worden toegediend.
Tabel 5: Vergelijking tussen het 4T1-model (Steenbrugge et al., 2016) en het Py230-model dat wordt
beschreven in deze masterproef (Vander Elst et al., 2018). Beiden zijn intraductale, immunocompetente
muismodellen ontwikkeld door de Meyer-groep.
57
Een huidige tekortkoming van het Py230-muismodel is de nog onvolledige karakterisatie van de
antitumorale inflammatie en de beperkte steekproefgrootte. Met het oog op het onderzoeken van de
aanwezige immuunresponsen in dit immunocompetente muismodel, zouden bepalingen van de
cytokineprofielen zowel lokaal (in de primaire mammatumoren) als systemisch (in serum) een sterke
meerwaarde bieden. Op deze manier kan een beter inzicht verkregen worden in de antitumorale
inflammatie van het Py230-muismodel, complementair aan de H&E en IHC evaluaties (kwalitatief) en
de flowcytometrische data (kwantitatief). Ook moet het tijdstip waarop de overgang van een DCIS
naar een IDC plaatsvindt, nog beter gekarakteriseerd worden. Daarvoor zouden nog bijkomende
experimenten moeten worden uitgevoerd met opoffering op 4 en 5 weken p.i. om ook op deze
tussentijdstippen een histologische evaluatie van de DCIS-IDC transitie mogelijk te maken. Bovendien
werd er geen flowcytometrische analyse uitgevoerd van de primaire mammatumoren in het
intraductale 4T1 muismodel (Steenbrugge et al., 2016), waardoor de vergelijking van de lokale en
systemische inflammatoire respons met het Py230-muismodel momenteel onvolledig kan worden
gemaakt.
Tot slot werd er vanuit gegaan dat de mammatumorcellen tripel negatief blijven. Nochtans is geweten
dat in vitro tripel negatieve Py230 tumorcellen, ER en/of PR positieve tumoren kunnen vormen in vivo,
wanneer deze in lage aantallen (104 cellen of minder) worden geïnoculeerd (Bao et al., 2015). Hoewel
er in deze ‘proof-of-concept’ studie nooit minder dan 104 cellen werden geïnoculeerd, is de
afwezigheid van ER en/of PR nooit geverifieerd via IHC.
4. CONCLUSIE
Op basis van de data gegenereerd in het kader van deze masterproef is dit nieuwe
immunocompetente, intraductale Py230-muismodel tot 3 weken p.i. representatief voor de situatie
van een DCIS van tripel negatieve borsttumoren bij de mens. Na 3 weken p.i. gaat deze situatie over
naar het IDC stadium, maar zonder het ontstaan van duidelijke metastasen 6 weken p.i.. Op dat tijdstip
werd eveneens het humaan eindpunt bereikt. Het DCIS stadium blijft dus relatief lang behouden,
waardoor dit innovatieve, preklinische model potentieel gebruikt kan worden voor het uittesten van
nieuwe antitumorale therapieën die o.a. een effect beogen op de DCIS-IDC transitie. Naast de
exponentiële tumorgroei en -progressie, werd ook een sterke lokale en systemische inflammatie
waargenomen. Het absolute aantal immuuncellen in de primaire tumoren nam sterk toe in functie van
de tijd, waarbij ook de lokale relatieve verhouding tussen de verschillende types immuuncellen
veranderde. Ook systemisch trad er een primaire tumor-geassocieerde inflammatie op, gekenmerkt
door o.a. splenomegalie, evenals een stijging in de concentratie van de recent ontdekte tumorale
biomerkers CHI3L1 en LCN2 in serum.
58
LITERATUURLIJST
- AKIKO S., KLAUNBERG B., TOLWANI R. (2004), Overview: in vivo bioluminescence imaging,
comperative medicine, vol. 54, N°6, pp. 631-634.
- ALLAVENA P., SICA A., SOLINAS G., PORTA C., MANTOVANI A. (2008), The inflammatory micro-
environment in tumor progression: The role of tumor-associated macrophages, Critical Reviews in
Oncology/Hematology, Vol. 66, Issue 1, pp 1-9.
- BAKSHI R.K., COX M.A., ZAJAC A.J. (2014), Cytotoxic T Lymphocytes. Encyclopedia of Medical
Immunology. Springer, New York, NY.
- BAO L. et al. (2015), Multipotent luminal mammary cancer stem cells model tumor heterogeneity,
Breast Cancer Research, 17 : 137.
- BAUER M. et al. (2008), Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) is a predictor of poor
prognosis in human primary breast cancer, Breast Cancer Res Treat., vol. 108(3), pp. 389 - 397.
- BEN-NERIAH Y., KARIN M. (2011), Inflammation meets cancer with NF-κB as the matchmaker,
Nature Immunology, vol. 12, pp. 715-723.
- BERGERS et al. (2000), Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during
carcinogenesis, Nat. Cell Biol., Vol. 2, pp. 737-744.
- BERGERS F.G. et al. (2004), The interleukin-6 gene: a susceptibility factor that may contribute to
racial and ethnic disparities in breast cancer mortality, Breast Cancer Res. Treat., Vol. 88, pp. 281–
285.
- BERGERS G. et al. (2000), Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during
carcinogenesis, Nature cell biology, vol. 2, pp. 737-744.
- BIRBACH A. et al. (2002), Signalling molecules of the NF-kappa B pathway shuttle constitutively
between cytoplasm and nucleus, Journal of Biological Chemistry, vol. 277, pp. 10842-10851.
- BISWAS T. et al. (2014), Attenuation of TGF-β signalling supports tumor progression of a
mesenchymal-like mammary tumor cell line in a syngeneic murine model, Cancer Letters, vol. 346,
p. 129-138.
59
- CARLSON H. et al. (2002), In vivo imaging of NF-κB activity, The Journal of Immunology, vol. 168,
pp. 1441-1446.
- CARMELIET P. (2005), VEGF as a key mediator of angiogenesis in cancer, Oncology, vol. 69, Suppl.
3, pp. 4-10.
- CHIERS K. (2015), Oncology [course text], Ghent University, Merelbeke.
- CHIN A.R., WANG S.E. (2014), Cytokines driving breast cancer stemness, Mol Cell Endocrinol., Vol.
382(1), pp. 598-602.
- COFFELT S.B. et al. (2015), IL-17-producing γδ T cells and neutrophils conspire to promote breast
cancer metastasis, Nature, vol. 522(7556), pp. 345-348.
- COHEN N. et al. (2017), Fibroblasts drive an immunosuppressive and growth-promoting
microenvironment in breast cancer via secretion of Chitinase 3-like 1, Oncogene, vol. 36, pp. 4457–
4468.
- DANIELE A. et al. (2016), Clinical and prognostic role of matrix metalloproteinase-2, -9 and their
inhibitors in breast cancer and liver diseases: A review, The International Journal of Biochemistry
& Cell Biology, Vol. 77, Part A, pp. 91-101.
- DEBATIN K.M. (2004), Apoptosis pathways in cancer and cancer therapy, Cancer Immunol.
Immunother., vol. 53, n° 153.
- DE MARCO P. et al. (2016), GPER signalling in both cancer associated fibroblasts and breast cancer
cells mediates a feedforward IL1β/IL1R1 response, Nature, Vol. 6, Art. 24354.
- DENT R. et al. (2007), Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence,
Clin. Cancer Res., vol. 1 n°13(15 Pt. 1), pp. 4429-4434.
- DESREUX J. et al. (2011), Le cancer du sein en Belgique: pourquoi sommes-nous les premiers en
Europe?, Revue medical de Liège, vol. 66, pp. 231 – 237.
- DIDONATO A. J. et al. (2012), NF-Κb and the link between inflammation and cancer, immunological
reviews, vol. 246, pp. 379-400.
60
- DOUGLAS H., COUSSENS L. M. (2012), Accessoiries to the crime: Functions of cells recruited to the
tumor microenvironment, cancer cell, March 2012, pp. 309-319.
- DOUGLAS H., COUSSENS L.M. (2012), Accessories to the crime: functions of cells recruited to the
tumor microenvironment, Cancer Cell, Vol. 21, pp. 309-321.
- HADZIJUSUFOVI E. et al. (2017), Comparing Human Breast Cancer with Canine Mammary Cancer,
Jensen-Jarolim E. (eds) Comparative Medicine, Springer).
- HAYDEN M.S.M., GHOSH S.S. (2008), Shared principles in NF-κB signaling, cell, vol. 132, pp. 344-
362.
- HAYDEN M.S.M., GHOSH S.S. (2012), NF-κB, the first quarter-century: remarkable progress and
outstanding questions, Genes Development, vol. 26, pp. 203-234.
- HOESEL B., SCHMID J.A. (2013), The complexity of NF-κB signalling in inflammation and cancer,
Molecular cancer, vol. 12, article 86.
- JANG J. et al. (2009), Lipocalin 2 promotes breast cancer progression, PNAS, vol. 106, no. 10, pp.
3913–3918.
- JANG J. et al. (2013), Lipocalin 2 is a novel regulator of angiogenesis in human breast cancer, The
FASEB Journal, vol. 27, no.1 , pp. 45-50.
- JIAO X. et al. (2012), Somatic mutations in the Notch, NF-KB, PIK3CA, and Hedgehog pathways in
human breast cancers, Genes Chromosomes Cancer, vol. 51, pp. 480-489.
- JOHANSEN J.S. et al. (2006), Serum YKL-40, a new prognostic biomarker in cancer patients?, Cancer
Epidemiol Biomarkers, vol. 15(2), pp. 194–202.
- KATANOV C. et al. (2015), Regulation of the inflammatory profile of stromal cells in human breast
cancer: prominent roles for TNF-α and the NF-κB pathway, Stem Cell Res Ther., Vol. 6, Art. 87.
- KATSMAN A. et al. (2009), Chemosensitization and immunosensitization of resistant cancer cells
to apoptosis and inhibition of metastasis by the specific NF-kappaB inhibitor DHMEQ, Current
Pharmalogical Design, vol. 15, pp. 792-808.
61
- KOCHER B., PIWNICA-WORMS D. (2013), Illuminating cancer systems with genetically engineered
mouse models and coupled luciferase reporters in vivo, cancer discovery, June 2013, pp. 616-629.
- KOHNO T. et al. (2003), Interleukin-10–mediated inhibition of angiogenesis and tumor growth in
mice bearing VEGF-producing ovarian cancer, Cancer Res., Vol. 63, pp. 5091–5094.
- LENG X. et al. (2009), Inhibition of Lipocalin 2 Impairs Breast Tumorigenesis and Metastasis, Cancer
Research, vol. 69, pp. 8579-8584.
- LIN W.W., KARIN M. (2007), A cytokine-mediated link between innate immunity, inflammation,
and cancer, J. Clin. Invest., Vol. 117(5), pp. 1175-1183.
- LIOU G-Y., STORZ P. (2010), Reactive oxygen species in cancer, Free Radical Biology & Medicine
journal, vol. 44, pp. 479-496.
- MANNINO M.H. et al. (2015), The paradoxical role of IL-10 in immunity and cancer, Cancer Letters,
vol. 367, pp. 103-107.
- MAY MJ et al. (1997), Rel/NF-kappa B and I kappa B proteins: an overview, Semin Cancer Biology,
vol. 8, pp. 63-73.
- MORRIS J. L., GORDON O.K. (2010), Positive Results: Making the Best Decisions When You're at
High Risk for Breast or Ovarian Cancer, Amherst, N.Y.: Prometheus Books.
- MURPHY C.G., MOYNAHAN M.E. (2010), BRCA gene structure and function in tumor suppression:
a repair-centric perspective, Cancer J., vol. 16(1), pp. 39-47.
- OECKINGHAUS A., GHOSH S.S. (2009), The NF-κB family of transcription factors and its regulation,
Cold Spring Harbour Perspective in Biology, vol. 1, article 000034.
- PELEKANOU V. et al. (2008), Expression of TNF-superfamily members BAFF and APRIL in breast
cancer: Immunohistochemical study in 52 invasive ductal breast carcinomas, BMC Cancer, vol. 8,
N°76.
- RATTIGAN et al. (2012), Lactate is a mediator of metabolic cooperation between stromal
carcinoma associated fibroblasts and glycolytic tumor cells in the tumor microenvironment, Exp.
Cell Res., Vol. 318, pp. 326-335.
62
- RATTIGAN Y.I. et al. (2012), Lactate is a mediator of metabolic cooperation between stromal
carcinoma associated fibroblasts and glycolytic tumor cells in the tumor microenvironment,
experimental cell research, vol. 318, pp. 326-335.
- RIHACEK M. et al. (2015), B-Cell Activating Factor as a Cancer Biomarker and Its Implications in
Cancer-Related Cachexia, BioMed Research International, Article ID 792187.
- SCHMADEKA R., HARMON B.E., SINGH M. (2014), Triple-negative breast carcinoma: current and
emerging concepts, Am J Clin Pathol., Vol. 141(4), pp. 462-477.
- SHI H. et al. (2008), Lipocalin 2 promotes lung metastasis of murine breast cancer cells, Journal of
Experimental & Clinical Cancer Research 2008, vol. 27, Art. 83.
- SORIA G., BEN-BARUCH A. (2008), The inflammatory chemokines CCL2 and CCL5 in breast cancer,
Cancer Lett., Vol. 267, pp. 271-285.
- STEENBRUGGE J. et al. (2016), Comparison of the adipose and luminal mammary gland
compartment as orthotopic inoculation sites in a 4T1-based immunocompetent preclinical model
for triple-negative breast cancer, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, vol. 21. p.
113-112.
- STICHTING TEGEN KANKER (2017), Borstkanker – Algemeen, Laatst bijgewerkt op 16 november
2017, van https://www.kanker.be/alles-over-kanker/alle-types-kanker/borstkanker.
- STOCKMANN C. et al. (2008), Macrophage expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha
suppresses T-cell function and promotes tumor progression, Nature, vol. 456, pp. 814-818.
- STOCKMANN et al. (2008), Deletion of vascular endothelial growth factor in myeloid cells
accelerates tumorigenesis, Nature, Vol. 456, pp. 814-818.
- TOI et al. (1996), Clinical significance of the determination of angiogenic factors, European Journal
of Cancer, 32A, pp. 2513-2519.
- TSUYADA et al. (2012), CCL2 mediates cross-talk between cancer cells and stromal fibroblasts that
regulates breast cancer stem cells, Cancer Res., Vol. 72, pp. 2768-2779.
63
- VIRNIG B.A. et al. (2009), Diagnosis and management of ductal carcinoma in situ (DCIS), Evidence
Report/Technology Assessment, AHRQ Publication, No.09-E018 (185), pp. 1–549.
- WALTERS S. et al. (2009), Increased CD4+Foxp3+ T cells in BAFF-transgenic mice suppress T cell
effector responses, The Journal of Immunology, Vol. 182(2), pp. 793-801.
- WAN G. et al. (2017), Elevated YKL-40 expression is associated with a poor prognosis in breast
cancer patients, Oncotarget, vol. 8(3), pp. 5382–5391.
- WCULEK S.K., MALANCHI I. (2015), Neutrophils support lung colonization of metastasis-initiating
breast cancer cells, Nature, vol. 528(7582), pp. 413 – 417.
- WOLPE S. D. et al. (1989), Identification and characterization of macrophage inflammatory protein
2, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 86, pp. 612-616.
64
BIJLAGEN
Bijlage I : Scorerooster muizen
Scorerooster voor het opvolgen van lacterende C57BL/6 Tyr-/- NF-κB-luc+ muizen na een intraductale
injectie met 105 Py230 tumorcellen. Wanneer een score hoger dan 3 wordt vastgesteld, kregen de
muizen onmiddellijk analgetica toegediend. Een score hoger dan 5 resulteert in euthanasie.
Kooinummer:
(OK/NOK)
(OK/NOK)
(OK/NOK)
(OK/NOK)
(OK/NOK)
Variabele
score
0 dagen
(27/10)
score
4 dagen
(31/10)
score
11 dagen
(7/11)
score
2 weken
(10/11)
score
3 weken
(17/11)
score
4 weken
(24/11)
score
5 weken
(1/12)
score
6 weken
(8/12)
Lichaamsgewicht (g)
0: normaal
1: <10% gewichtsverlies
2: 10-20% gewichtsverlies
3: > 20% gewichtsverlies
Tumor L3 (L)
Tumor L3 (B)
Tumor L3 (H)
Tumor R3 (L)
Tumor R3 (B)
Tumor R3 (H)
Tumor L4 (L)
Tumor L4 (B)
Tumor L4 (H)
Tumor R4 (L)
Tumor R4 (B)
Tumor R4 (H)
0: tumor kleiner dan 2 cm3, niet geülcureerd
3: tumor groter dan 2 cm3 of geülcureerd
Lichaamstemperatuur (rectaal, °C)
Body condition score
0: >3
1: 2-3
2: 2-1
3: 1
Uitzicht
0: normaal
1: onverzorgde vacht
2: abnormaal haarkleed, oog of neusvloei
3: abnormale houding, zeer afwijkend haarkleed
Gedrag
0: normaal
1: licht afwijkend
2: verminderde activiteit, minder alert
3: zelfmutilatie, hyperactiviteit, immobiliteit
Reactie op stimulus
0: normaal
1: milde verhoogde of verlaagde reactie
2: matig abnormale respons
3: apathie of agressief
Incisieplaats
0: mooi gesloten, niet gezwollen, pijnlijk of rood
1: mooi gesloten, licht gezwollen, pijnlijk of rood
2: lichte wonddehiscentie, matig tot sterk gezwollen, pijnlijk of rood
3: totale wonddehiscentie, infectie, automutilatie, zeer pijnlijk
TOTALE SCORE
Inoculatie R3
Euthanasiedatum
Serum
Inoculatie L4
Inoculatie R4
Gebruik tumor L3
Gebruik tumor R3
Geboortedatum
Aantal pups
Inoculatie L3