의학석사학 청구논문

갯지 이 유래 단백질 분해효소의

과발 에 한 연구

Studies on the over-expression

of a proteolytic enzyme from polychaeta

in the Yellow Sea

2006년 2월

인하 학교 학원

의학과 (생화학 공)

최 선 애

의학석사학 청구논문

갯지 이 유래 단백질 분해효소의

과발 에 한 연구

Studies on the over-expression

of a proteolytic enzyme from polychaeta

in the Yellow Sea

2006년 2월

지도교수 장정순

이 논문을 의학석사학 논문으로 제출함

인하 학교 학원

의학과 (생화학 공)

최 선 애

이 논문을 최선애의 석사학 논문으로 인정함

2006년 2월

주심

부심

원

- I -

국문 요약

본 실험에서는 한국 서해의 강화도 갯벌에 서식하는 흰이빨 참갯지렁이

(Periserrula leucophryna)의 재조합 단백질의 대량생산을 위해 T7과

trc, Shine-Dalgarno(SD) sequence 구조, fusion protein으로서의 발현

조건, codon usage와 host 시스템 등 최적 조건을 실험하였다. 이들 중

PLSP3의 최적 발현에서 가장 중요한 요인은codon usage를 바꾸는 것이

었다. Polychaeta와 E. coli 사이의 codon usage의 차이는 약 17.6%로

polychaeta protease의 발현이 낮게 나타날 것으로 생각된다. 아미노산

잔기 사이에서, arginine의 코돈 사용빈도는 polychaeta와 E. coli 사이에

매우 다르게 나타났다. Arginine은 polychaeta는 AGA가 많이 사용하는

반면 E. coli는 CGC를 많이 사용한다. 그리고 3개의 arginine이 단백질

분해효소의 N-말단에 존재한다. 그러므로 이것은 Arg-tRNAArg의 불충분

한 공급이 되게 되므로 단백질 분해효소의 번역에 낮은 수준으로 존재한

다. 이러한 arginine codon(AGA를 CGC)으로 바꾸어 줌으로써 E. coli에

서 사용되는 arginine codon으로 바꾸었고, E. coli의 rare codon을 포함

하는 E. coli Rosetta를 사용하여, PLSP3 MR2의 재조합 단백질의 발현

수준이 현저하게 증가하였다. Plasmid 실험에서는 재조합 PLSP3의 쉬운

정제와 N-말단에 6개의 histidine tag와 cspA 프로모터를 가진 pColdI을

사용하였다. 그 결과, 재조합 단백질의 발현수준이 대조군과 비교하였을

때 50배 이상 증가하였다. 재조합 PLSP3는 Ni-chealating agarose

chromatography에 의해 정제되었고, 재조합 단백질이 정확하게 발현되

었음이 아미노산 분석에 의해 확인되었다. 이러한 결과에서 재조합 단백

질의 중요한 요인 중 하나가 codon usage임을 알 수 있었다.

재조합 PLSP3는 inclusion body로 발현됨으로 활성을 가진 PLSP3를

얻기 위해 다양한 refolding 방법이 시행되었다. Refolding 방법 중,

HEPES buffer를 사용한 dilution 방법이 가장 효과적이었다. 그러나 활

성을 가진 PLSP3의 수율이 refolding PLSP3가 Benzamidine-Sepharoe

affinity chromatography에 결합함에도 불구하고, 매우 낮게 나타났다.

- II -

Abstract

In this study, we described the optimal conditions for the mass

production of the recombinant protein of the proteolytic enzyme

(PLSP3) from the Korean polychaeta, Periserrula leucophryna living

in the tidal mud flats of Kwangwha island in the Korean West Sea

(Yellow Sea) using the different kind of promoters such as T7 and trc,

the structure of Shine-Dalgarno (SD) sequence, expression type such

as fusion protein, change of the codon usage and host system.

Among them, the most important parameters for the optimal

expression of PLSP3 was the change of the codon usage. The mean

difference of the codon usage between polychaeta and E. coli was

about t 17.6% which might be too low to express the polychaeta

protease. Among the amino acid residues, the codon frequency of

arginine was very different between polychaeta and E. coli. The

main codon for Arg was AGA and CGC for polychaeta and E. coli,

respectively, and three Arg were located in N-terminal region of

the protease. Thus, this caused the low level of protease

translated because of the insufficient supply of Arg-tRNAArg. By

changing these arginine codons (AGA to CGC) that was the main

Arg codon used in E. coli, and using E. coli Rosetta that contained

the rare codon of E. coli, the expression level of the recombinant

enzyme of PLSP3 MR2 was increased remarkably. Among the

plasmids examined, we used pColdI in order to purify the

recombinant PLSP3 conveniently and express in the large amount

because pColdI have six histidine tags in N-terminal region and

cspA promoter. As a result, the expression level of the

recombination protein was increased by more than 50-fold when

compared to the control. Recombinant PLSP3 was purified by

Ni-chealating agarose chromatography, and confirmed that the

recombinant protein was expressed correctly by amino acid

- III -

analysis. From these results, one of the important parameters for

the expression of the recombinant protein was the adjustment of

the codon usage.

The recombinant PLSP3 was expressed in the inclusion body, so

that the various refolding methods were examined to get the active

PLSP3. Among the refolding methods, dilution method using HEPES

buffer was the efficient method we examined, however, the yield

of active PLSP3 was too low even though the refolded PLSP3 was

bound to Benzamidine-Sepharose affinity chromatography.

- IV -

목 차

서 론 ...................................................................................................... 1

실험방법

1. 시약 및 재료 ................................................................................. 7

2. 실험 방법

2-1. Competent cell의 제조와 형질 전환 ..................................... 8

2-2. 단백질 분해 효소의 순도 및 분자량 측정 .............................. 8

2-3. pT7-7 promoter를 이용한 PLSP3 유전자의 발현 최적화..... 9

2-4. 대장균과 갯지렁이의 코돈 사용빈도 확인 및 site direct

mutation ................................................................................ 11

2-5. Refolding & purification ...................................................... 14

결과

1. pT7-7 promoter를 이용한 PLSP3 유전자의 발현 최적화........... 19

2. 대장균과 갯지렁이의 코돈 사용빈도 확인 및 site direct mutation

................................................................................................... 23

3. Refolding & purification ............................................................. 29

고찰 ...................................................................................................... 38

참고문헌 ............................................................................................... 40

- V -

List of Table

Table. 1. Classification of protease by mode of action ................. 2

Table 2. Fibrinolytic enzyme (Plasminogen activation) .................. 4

Table 3. Fibrinolytic enzyme (plasmin like activity) ...................... 4

Table 4. Nucleotide sequences of SD and spacer region of pT10R

series plasmids .................................................................... 20

Table 5. Site direct mutagenesis sequence of PLSP3, PLSP MR2

and PLSP3 MR2 .................................................................. 25

Table 6. Comparison of solubility of unfolding method ............... 30

Table 7. Amino sequence of pColdI PLSP3 MR2 digested by factor

Xa analysis was determined by MALDI-MS .................... 35

Table 8. Substrate specificities of the protease ........................... 37

- VI -

List of Figure

Fig. 1. Distribution of enzyme sales ................................................. 2

Fig. 2. SDS-PAGE and Western blot analysis of E. coli BL21(DE3)

harboring pT10R-12 vector .................................................. 22

Fig. 3. SDS-PAGE of E. coli BL21(DE3) harboring pT7 PLSP3 MR1

& pT7 PLSP3 MR2 vector ................................................... 26

Fig. 4. Transformation and expression of recombinant pColdI

PLSP3 MR2 in E. coli Rosetta(DE3) .................................... 28

Fig. 5. Unfolding folding method of pColdI PLSP3 MR2 ............... 31

Fig. 6. SDS PAGE of the recombinant protease by Ni-chelating

agarose chromatography ....................................................... 33

Fig. 7. SDS PAGE of the digested recombinant protease by Factor

Xa ............................................................................................ 33

Fig 8. SDS-PAGE of refolding with unfolding pColdI PLSP3 MR2

.................................................................................................. 35

Fig. 9. SDS PAGE of the recombinant protease by p-Benzamidine

Sepharose chromatography ................................................... 37

- 1 -

서 론

효소는 생체내의 세포, 조직, 기관 내에서 물질 반응을 촉매하는 물질

로서, 세포, 조직, 기관, 혹은 개체에 따라 그 종류와 수, 그리고 각각의

역할 또한 다양하며, 그 특성은 기질에 대한 특이성, 물질 반응의 촉매효

과, 그리고 대사의 조절 현상으로 설명할 수 있다(Nicholas, 1999). 그

중에서도 프로테아제(protease)는 단백질의 펩타이드 결합(peptide bond)

을 분해하는 효소로써, 매우 특이적이고, 선택적인 단백질의 변형과, 효소

원 활성화, 혈액응고, 혈전용해, 분비성 단백질의 막을 통한 이동, 지혈작

용이나 염증 반응, 정상적인 세포의 생리적 기능이나 병든 세포의 병리

작용 등 실로 다양하고 복잡한 기능을 갖고 있으며, 활성자리의 구조에

따라 세린 프로테아제(serine protease). 시스테인 프로테아제(cystein

protease), 아스파르트산 프로테아제(aspartic protease), 메탈로 프로테

아제(metallo protease)로 구분하고, 기질에 작용하는 위치에 따라 exo-

peptidase와 endo-peptidase로 구분된다(Table. 1). 프로테아제의 기질

에 대한 특이성과 선택적인 작용성, 그리고 다양한 기능으로 인해 프로테

아제는 여러 목적으로 연구가 진행되어 왔으며, 식품가공, 세제, 가죽의

손질, 의약품 등 다양한 방면으로 활용되고 있다(Poldermens, 1990). 특

히 근래 들어 이러한 프로테아제의 개발과 이용이 증가하고 있고, 오래

전부터 이용되어진 음식과 세제 분야에서의 프로테아제의 활용 외에, 최

근에는 렌즈 세척이나, 가죽공연, 의약품에 이르기까지 그 활용 폭은 더

욱 넓어지고 있다.

생체 유래 단백질 분해효소의 사용 분야 중에서 빠질 수 없는 부분이

바로 제약ㆍ의약분야인데, 앞에서도 언급했듯이 생체 내에서 많은 역할을

하는 것이 단백질 분해 효소인 만큼, 치료제나 치료보조제의 용도로 많이

사용되고 있고, 또 많은 연구가 진행되고 있다. 의약용의 프로테아제는

혈액 응고 및 혈전의 용해에 가장 많이 사용되고 있는데, 이는 혈액의 응

고와 용해에 의해 생체 내에서 이루어지는 평형이 여러 가지 병적인

- 2 -

Table. 1. Classification of protease by mode of action. (Alan, 1994)

Fig. 1. Distribution of enzyme sales. (Mala et al., 1998)

- 3 -

원인으로 인하여 균형이 깨질 경우 혈전이 형성되어 혈관을 막게 됨으로

써, 뇌혈관이 막히고 뇌혈전증으로 반신불수나 전신 마비 증상을 일으키

며, 심장혈관이 막힐 경우 심장마비로 인한 사망에 이르게 되기 때문이

다. 이러한 혈전은 우리 몸에서 필연적으로 생성ㆍ분해가 반복되게 되는

데, 이러한 혈전의 형성은 여러 가지 효소들의 연속 작용에 의해 발생하

며, 특히 프로테아제의 기능이 많은 몫을 차지한다. 혈전의 지혈과 조직

재생 작용, 세포결합, 세포분리, 세포이동, 세포증식 등 체내 여러 가지

기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(Sarah et al., 1999). 혈전 생성의

조절은 혈전의 형성과정에서의 조절과 형성 후 분해 과정에서의 조절작용

이 있는데, 혈전분해 과정은 플라스민이라는 세린 계열 프로테아제의 작

용에 의해 이루어지는 것으로 알려 졌으며, 이는 혈액 내에서 플라스미노

겐이라는 전구물질의 형태로 존재하고, 혈전이 형성된 장소에서 부분적

가수분해에 의해 플라스민으로 활성화되어 혈전을 분해한다 (Robert et

al., 1994). 그러나 이러한 혈전용해 작용이 원활하게 이루어지지 않은 경

우 혈전증 (Thrombosis) 이 발생되어 심혈관 질환을 일으키며 증세에 따

라서 치명적일 수도 있다. 이러한 혈전증을 치료하기 위하여 사람의 플라

스미노겐 활성인자로 알려진 것은, 조직유형 플라스미노겐 활성인자

(tissue type plasminogen activator, t-PA), 유로키나아제 (urokinase,

UK), 스트렙토키나아제 (streptokinase, SK) 및 이들 단백질의 mutant

등을 사용하고 있으며 이들 단백질 분해효소들은 플라스미노겐을 활성화

시켜 플라스민을 형성하여 혈전을 용해시킨다 (Table 2).

이상과 같이 혈전 용해제로서 Streptokinase, t-PA 및 Urokinase 등

이 개발되어 사용되어져 왔다. 그러나 Streptokinase (상품명 VaridaseⓇ, Lederle Lab.) 는 전신 출혈 등의 부작용뿐만 아니라 미생물 유래의 단

백질로서 항체를 형성하는 문제점까지 보고되어 있어 현재에는 많이 사용

되고 있지 않는 실정이다.

이러한 Plasminogen activator 와는 별개로 한국, 중국을 포함하는 동

양권에서는 한의학 및 민간요법으로 혈전성 질환을 치료하는 방법이 전해

지고 있으며 현재 붉은 지렁이 추출물 등과 같은 천연물 등이 실제로 이

용되고 있지만 아직 과학적인 연구는 체계적으로 진행되고 있지 않은 실

정이다. 이러한 천연물 유래의 혈전성 질환 치료제로는 뱀독에서 분리한

피브롤라제 (fibrolase), 아트록사제 (atroxase), 레베타제 (lebetase), 바

- 4 -

Table 2. Fibrinolytic enzyme (Plasminogen activation)

Protein Source 작용 비고

Streptokinase 미생물 ThrombolysisChest pain, Hemorrhage, Anaphylaxis,

Fever, Hypotension, Nausea 등의 부작용

APSAC 미생물 Thrombolysis기존의 SK의 부작용을 줄이기 위하여 active

site의 serine을 anisoylation 시킨 mutant

Staphylokinase 미생물 ThrombolysisSK보다 fibrin에 대한 특이성이 크다고 보고

되어 있지만 아직 실용화 되지 않았음

t-PA Human Thrombolysis피브린 특이성 높음, 빠른 작용, 출혈 특히

뇌출혈 부작용, 가격 비쌈

Urokinase Human Thrombolysist-PA와 작용 기전 유사, 그러나 t-PA에 비해

특이성 낮음, 전신 출혈 등의 부작용

Prourokinase Human Thrombolysis피브린 특이성 높음, t-PA에 의해 출혈 등의

부작용 적음, 현재 임상 시험 중

실라제 (basilase) 등과 Bacillus 균주 분리한 나토키나제 (Nattokinase)

및 붉은 지렁이에서 분리한 룸브로키나제 (Lumbrokinase) 등이 알려져

있다 (Table 3). 이들 혈전 치료제들은 플라스미노겐 활성인자와는 달리

피브린에 직접 작용하여 피브린 혈전을 용해하는 프로테아제로서 플라스

미노겐 활성인자에 비해 출혈과 같은 부작용이 적은 것으로 알려져 있다.

따라서 플라스민과 유사한 활성을 갖는 효소의 탐색이나, 혹은 플라스미

노겐의 활성화인자의 기능을 갖는 효소의 탐색이 많이 이루어졌으며, 이

는 뱀독 (Jüri et al., 1998; Xiuxia et al., 2001; Lobo et al., 2001;

Manning, 1995) 이나, 지렁이 (Mihara et al., 1991; Roch et al., 1991;

Leipner et al., 1993; Jeon OH et al., 1995; Terazija et al., 1998),

사마귀 (Bum-soo et al., 1999) 등의 개체로부터 이러한 효소를 얻으려

Table 3. Fibrinolytic enzyme (plasmin like activity)

Protein Source 비고

Fibrolase 뱀혈액내의 억제 인자에 의해 활성이 억제되지 않음

현재 미국의 Chiron과 Merck 사에서 개발 중

Atroxase 뱀

Lebetase 뱀

Basilase 뱀

Nattokinase 미생물 현재 경구용으로 개발되어 시판 중

Lumbrokinase 지렁이 현재 경구용으로 개발되어 시판 중

- 5 -

는 연구가 많이 이루어졌고, 특히 뱀독의 지혈방지 기능이나 지렁이의 조

직재생과 관련하여 이 개체들에 대한 연구가 많이 이루어졌다.

뱀독에서 분리한 Fibrinoase 는 AlfermeraseⓇ 라는 상품명으로 개발

되어 현재 Phase II 까지 진행 중인 것으로 보고되어 있다. 나토키나제

는 Bacillus 가 대두박을 이용하여 생장할 때 만들어 내는 혈전용해 효소

로서 피브린 혈전에 직접적이고 강력한 혈전 분해 능력을 갖고 있는 혈전

용해효소로 주로 우리나라와 일본을 중심으로 활발하게 연구가 진행되고

있으며 생산이 비교적 쉽고 열에 안정한 특성을 가지고 있는 것으로 보고

되어 있다. 현재 국내 바이오벤처 기업이 혈전용해 활성을 갖는 기능성

식품 나토키나제 원료에 대한 미 FDA 규격을 통과하고 제품화에 성공,

본격적인 미국 시장 진출에 나서고 있는 것으로 알려지고 있다.

이상에서처럼 플라스미노겐 활성화를 통한 혈전 용해에 관련한 혈전 용

해제에 대한 광범위한 연구가 진행되고 있으나 피브린에 직접 작용하여

혈전을 용해하는 혈전 용해제에 대해서는 아직 연구가 많이 진행되어 있

지 않다.

생물 산업과 의약품소재로서의 재조합 단백질 생산에 사용되는 숙주세

포로는 생물공학의 초기에 가장 큰 부류를 이루었던 미생물과 그 외에도

동식물 및 곤충세포에 이르기까지 다양한 생물종이 이용되고 있는 가운

데, 아직까지도 Escherichia coli는 가장 보편적인 숙주세포로 각광을 받

고 있다. 그 이유는 상당히 저렴하게 고밀도로 배양이 가능하며 생리학

에 대한 수십 년간의 기초연구결과가 축적되어 있다는 점과 기계적인 단

위공정(예 differential centrifugation 등) 만으로도 상당량의 정제효과를

얻을 수 있기 때문이다.

진핵세포 유래의 단백질을 E. coli에서 발현키는 여러 이유로 어려운데

예를 들면 코돈 사용빈도(codon usage)의 차이가 있다. 코돈 사용빈도는

코돈이 특정 아미노산으로 전사되는 정도를 말하는데, 진핵 세포에서 사

용하는 코돈은 대장균에서 사용하는 코돈과 많은 차이가 있다 (Regina

M. et al. 2005). 따라서 E. coli를 이용하여 재조합 단백질을 만들 때,

codon usage를 고려해 주어야 한다. 대부분의 진핵세포의 단백질은 대장

균에서 사용빈도가 낮아 코돈을 대장균에서 흔히 사용되는 코돈으로 교체

해주거나 이에 상응하는 tRNA를 동시에 발현시켜주는 균주 E. coli

Rosetta 등을 사용해야 한다. 즉 대장균에서 가장 효율적으로 발현되도록

- 6 -

유전자 조작 및 cellular engineering을 해 주어야 하는 것이다.

또한 E. coli를 재조합 단백질을 만들 때, 작고 monomeric 단백질은

unfold된 상태에서 자발적으로 그들의 활성구조를 이루게 된다(Kim,

P.S., et al. 1982). 그러나 large protein의 경우 E. coli에서 과잉발현

될 경우 완전한 접힘이 일어나지 않아서 과잉 발현된 단백질들이 활성이

없는 aggregate된 상태, 즉 내포체(inclusion body) 형태로 발현이 된다

(Jaenicke, R. 1987).

일반적으로 이렇게 발현된 내포체는 생물학적 활성을 가진 native한

단백질로 재생시키기 위해서는 발효액으로부터 세포를 분리하여 파쇄 후

원심분리를 통해 내포체를 pellet 형태로 얻는 방법으로 시작한다. 이

pellet을 여러 차례 세척하여 불순물을 제거한 후, 변성제를 첨가함으로

써 응집된 형태의 단백질을 random coil 형태로 용해시키는데 일반적으

로 8M urea, 6M Guanidine-HCl 같은 chaortropes, 또는 SDS(sodium

dodecyl sulfate)와 같은 계면활성제가 사용되며 때때로 강한 염기 환경

(pH>12)에서 수행되기도 한다.(Dyr, J. E. et al. 1997)

이렇게 완전히 unfolding된 단백질 용해액에서 변성제와 환원제를 제

거하면서 correct folding을 유도하는 것이다(Guise, A. D. et al. 1996).

이를 위해 희석(dilution), 투석여과(diafiltration), 투석(dialysis), 탈염

column 등을 이용하게 된다. 이때의 최적조건은 단백질의 종류에 따라

상당히 다양하며 refolding efficiency를 결정짓는 중요한 부분이기도 하

다. 이처럼 내포체 단백질 재생방법은 여러 단계로 이루어진 다단계 방

법으로 알려져 있다(Lowe, E. G. et al. 1987).

본 실험에서는 강화도 갯벌에서 서식하는 혈전 분해 능력을 가진 갯지

렁이 단백질 분해 효소를 이용하여 혈전분해능을 가지는 단백질을 얻는

과정에서의 많은 제약점을 극복할 수 있도록 대장균을 이용하여 과발현

시킬 것이다. 갯지렁이를 이용하여 혈전분해능을 가지는 단백질을 얻을

때의 제약점으로는 갯지렁이를 봄에서 가을 사이에만 잡을 수 있고, 잡

을 수 있는 개체 수의 한계 등이 있다. 이러한 제약점을 극복하기 위한

방법으로 재조합 단백질을 이용한 갯지렁이 단백질 분해효소의 생산 방

법을 모색하게 되었다.생산성을 증가 할 수 있게 하는 발현 시스템 및

내포체 단백질의 refolding에 관한 연구를 수행하였다.

- 7 -

실험방법

1. 시약 및 재료

시료인 단백질 분해효소는 재료로 사용한 서해특산 (강화도) 흰이빨 참

갯지렁이로 강화도 초지진 앞 갯벌에서 채취하였다

Acrylamid, sodium dodecyl sulfate (SDS), TEMED, bromophenol

blue, Coomassie brilliant blue G, β-mercaptoethanol, benzmdine,

Triton X-100, Dithiotreithol (DTT), hydrogen peroxide,

p-Aminobenzamidine-Sepharose, fibrinogen, plasmin, trypsin,

prothrombin, Ampicillin, kanamycine은 Sigma에서 구입하였고,

Acrylamide, N,N-cethyene-bisacrylamide, ammonium persulfate

(APS), protein assay solution, PVDF (polyvinylidene difluoride)

membrane, electrophoresis standard marker는 Bio-Rad 제품을 사용

하였고, Ni-chelating agarose는 Peptron 제품을 사용하였다. IPTG

(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside), X-gal, restriction enzyme,

DNA ligase 등은 Promega 제품을 사용하였다. Factor Xa는 Invitrogen

제품을 사용하였다. p-Aminobenzamidine-Sepharose, Ni-chelating

agarose 와 Glutathione-Sepharose 는 Pharmacia 사 (미국) 의 제품을

구입하여 사용하였다.

pETM30 plasmid와 E. coli Rosetta(DE3)는 인하대학교 의과대학 박

성혁 교수님으로부터 제공받았고, pHPS9, pUBJ, pRB374 plasmid 와

pT7-7 plasmid는 대구대학교 최 장원 교수님으로부터 제공받았고,

pGEX-KG plasmid 는 Pharmacia 사 (미국) 의 제품을 구입하여 사용하

였다. pColdI plasmid는 Takara 사 (일본) 의 제품을 구입하여 사용하였

고 PCR용 primer의 제작은 Genotech에 주문 제작하였다.

SeakemⓇ LE Agarose 는 BMA 사 (미국) 제품을 LB는 Difco 사 (미

국) 제품을 구입하여 사용하였다. 단백질 분해효소의 합성기질 S-2222

(Bz-Ile-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA), S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA),

S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S-2302(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA),

S-2390(H-D-Val-Phe-Lys-pNA), S-2403(pyroGlu-Phe-Lys-pNA)와

S-2423(Ac-Ile-Glu-Gly-Arg)는 Chromogenix 제품을 구입하여 사용하

- 8 -

였다. Centriprep PM10, Centricon YM 10 및 YM 10 ultrafiltration

membrane은 Millipore 제품을 구입하여 사용하였으며, 그 밖에 사용한

시약은 일급 또는 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

2. 실험 방법

2-1. Competent cell의 제조와 형질 전환

E. coli의 형질전환은 chemical transformation 방법을 사용하였다. 하

루밤 배양한 E. coli strain을 50ml Luria-Bertani(LB, Difco)배지에 1%

가 되도록 접종하여, 600nm에서 O.D값이 0.4~0.8이 될 때까지 37℃에

서 진탕배양하고 배양액을 0℃에 10분간 방치하였다. 그 후 4℃에서

3500rpm으로 10분간 원심분리한 후 침전된 균체를 냉각된 16.7ml의

TB(10mM PIPES, 15mM CaCl2, 250mM KCl, 55mM MnCl2) 완충액에

현탁시킨 후 0℃에 10분간 방치하였다. 그 후 4℃에서 3500rpm으로 10

분간 원심분리 한 후, 냉각된 4ml의 TB 완충액에 현탁시켜 competent

cell로 사용하였다. Compeptent cell과 ligation 한 DNA 용액을 9 :

1(v/v)로 혼합하여 0℃에서 30분간 방치하고 42℃에서 90초간 heat

shock을 가한 뒤 37℃에서 1시간동안 outgrowth 하였다. 그리고 이를

X-gal, 0.1M IPTG와 amplicillin(100ug/ml, sigma)이 첨가된 LB 한천평

판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 군락이 형성되도록 배양하였

다.

2-2. 단백질 분해 효소의 순도 및 분자량 측정

2-2-1. 전기 영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

정제한 단백질 분해 효소를 전기영동하여 그 순도를 결정하였다.

Laemmli (Laemmli, 1970)의 방법을 수정하여 Bio-Rad Minitan 전기 정

동 kit에 15% acrylamide separating gel과 4% stacking gel이 되도록

만든 vertical slab gel (7 X 8cm) 에 정제한 단백질 분해 효소를 가하여

전개 하였다. Stacking 시에는 80V, separating 시에는 120V의 직류 정

전압을 가하여 약 2 시간동안 전개 하였다. 전개한 후 0.025% Cooma-

ssie Brilliant Blue-R 250 (CBB-R), 40% metanol, 7% acetic acid로

구성된 염색용액에 전기영동이 끝난 젤을 넣고 교반기 위에서 30분간 염

- 9 -

색을 실시하였다. 염색이 끝난 후, 5% methanol과 7% acetic acid의 탈

염색 용액에 넣어 교반기 위에서 30분간 탈염색 시킨 후, 젤 상에서 염색

된 단백질을 확인하였다.

이 때, 표준 단백질로는 phosphrylase (94 kDa), BSA (67kDa),

ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), Trypsin inhibitor

(20 kDa) 및 α-lactalbumin (14.4 kDa)을 사용 하였으며, 이 표준 단백

질의 분자량의 log 값과 이들 단백질의 상대적 이동도 (Rf)를 측정하여

plotting 한 후 표준 직선식으로부터 정제한 단백질 분해 효소의 분자량

을 측정하였다.

2-2-2. 단백질 정량 (Bradford 법)

단백질 정량은 0~5ug의 범위에서 bovine serum albumin(BSA)을 표

준 단백질로 하고 Bradford 방법으로 정량하였다.

2-3. pT7-7 promoter를 이용한 PLSP3 유전자의 발현 최적화

2-3-1. pT7-7 promoter를 이용한 발현

① pT7-7 vector에서 변형된 PLSP3 유전자 (10F 서열)의 발현

pT7-7 vector에서 PLSP3 유전자의 original 서열을 이용한 발현 시

(pT710V series vectors) 단백질 발현양은 미미한 정도였으므로 mRNA

이차구조를 변화시킨 10F 서열을 이용하여 pT7-7 vector에서 단백질

발현을 시도하였다.

② SD (Shine-Dalgarno) 및 Spacer 염기 변화 (T7 promoter)

A. Random SD sequence

SD SpacerRan3-1 CTAGATTAATTAAAATTTTRRRRRRNNNNNNAT TATG------Ran10-2 TAATTAATTTTAAAAYYYYYYNNNNNNTAAT AC

XbaI TCTAGA R (A, G), Y (T, C) NdeI CATATG AGATCT N (A, C, G, T) GTATAC

SD SpacerRan3-1 CTAGATTAATTAAAATTTTRRRRRRNNNNNNAT TATG------Ran10-2 TAATTAATTTTAAAAYYYYYYNNNNNNTAAT AC

XbaI TCTAGA R (A, G), Y (T, C) NdeI CATATG AGATCT N (A, C, G, T) GTATAC

- 10 -

대장균에서 PLSP3 유전자의 발현에 좋은 영향을 주는 5'-UTR 서열을

찾기 위하여 pT7-7 vector에 존재하는 서열을 상기와 같이 설계된

oligomer cartridge로 교체하였다. 즉 일반적으로 5'-upstream region에

AT-rich 서열의 존재는 mRNA 이차구조를 풀어주는데 효율적이라고 알

려져 있으므로 AT-rich block을 TTAATTAAAATTTT로 설계하여 도입

하였고, ribosome 30S subunit의 16S rRNA와 결합하는 purine-rich 서

열인 Shine-Dalgarno 서열은 6 개로 고정하고 A 또는 G 염기가 무작위

로 들어가도록 설계하였다. 또한 spacer region은 가장 효율이 좋은 거리

인 9개 염기로 고정하고 - 1 triplet은 ATT로 하였으며 나머지 6 개 염

기는 A, C, G, T 염기가 무작위로 들어가도록 합성하였다. 합성한

oligomer를 original PLSP3 유전자의 mature form에 결합시켜 pT7-7

vector로 도입하여 단백질 합성을 유도하고 western blot에 의해 관심의

band가 검출되는 지를 확인 한 다음, 얻어진 클론들의 염기서열을 분석

하여 5'-UTR 서열과 mRNA 이차구조 및 단백질 발현간의 상관관계를

조사하였다.

B. Cloning strategy

합성한 Ran3-1과 Ran10-2 oligomer 각각을 polynucleotde kinase

와 ATP를 사용하여 인산기를 결합시긴 다음, 동량을 취하여 100℃에서

5 분간 heating 후 서서히 annealing 되도록 방치하였다.

PLSP3 유전자 원래 서열이 들어있는 10V-3 plasmid를 NdeI &

HindIII로 잘라 약 0.7 kb DNA 절편을 회수하고, annealed double

strand Ran3-1/10-2 oligomer와 결합한 다음, XbaI & HindIII로 다시

잘라 0.7 kb 정도 크기의 random SD 서열이 결합된 PLSP3 유전자를

확보하였다. 이미 같은 제한효소로 잘라 준비된 pT7-7 vector와 다시

ligation에 의해 결합시킨 다음, E. coli BL21(DE3) 균주로 도입하여

vector 크기보다 커진 클론들을 확보하여 제한효소 처리에 의해 도입된

insert DNA를 확인한 후, DNA 염기서열을 분석하였다.

- 11 -

Ran3-1(10-2) 10V-3 (3.66 kb) ↓ kination ↓ NdeI & HindIII↓ Annealing elution of insert partds Ran3-1/10-2 (0.7 kb)

pT7-7 (2.47 kb) ligation↓XbaI & HindIII XbaI & HindIII

elution of vector fraction(2.47 Kb) elution of the fused product

(0.7 Kb)

ligationtransformationscreening & sequencing

pT10R series vector (~ 3.2 kb)

Ran3-1(10-2) 10V-3 (3.66 kb) ↓ kination ↓ NdeI & HindIII↓ Annealing elution of insert partds Ran3-1/10-2 (0.7 kb)

pT7-7 (2.47 kb) ligation↓XbaI & HindIII XbaI & HindIII

elution of vector fraction(2.47 Kb) elution of the fused product

(0.7 Kb)

ligationtransformationscreening & sequencing

pT10R series vector (~ 3.2 kb)

C. 단백질 발현 및 분석

각각의 pT10R series vector를 갖는 BL21(DE3) 균주를 ampicillin이

첨가된 LB 배지에서 overnight 배양한 후, 그 다음날 신선한 배지 10ml

에 1/100(0.1ml) 정도로 희석하여 접종한 후, 37℃에서 배양하였다. 세포

밀도(OD600)가 0.8에 도달할 때까지 키운 다음, IPTG를 1mM이 되게

첨가하여 15℃에서 단백질 발현을 유도하였고, 6시간동안 발현 시킨 후,

세포 배양액 100ul를 취하여 원심분리에 의해 cell pellet을 확보하였다.

이렇게 얻어진 pellet에 sample buffer(0.05M Tris-HCl, pH6.8, 0.1M

DTT, 2% SDS, 10% glycerol, 0.1% bromophenol blue) 20ul를 첨가하

여 세포들을 파쇄한 다음, 15% SDS-PAGE에 각각의 시료 10ul loading

하여 단백질을 분석하였다. 또한 이를 이용하여 western blot을 이용하여

분석하였으며, 또한 단백질 발현을 하는 클론들의 SD 및 spacer 서열과

free energy의 관계를 분석하였다.

2-4. 대장균과 갯지렁이의 코돈 사용빈도 확인 및 site direct mutation

2-4-1. 코돈 사용빈도(codon usage) 확인

코돈 사용빈도는 코돈이 특정 아미노산으로 전사되는 정도를 말한다.

코돈 사용빈도 특성은 유전자의 기능이나 발현정도와 진화의 흔적등과 같

- 12 -

은 요소에 의해서 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Joseph Bockhorst.

et al. 2003). 따라서 다모류인 갯지렁이와 과발현 시스템에서 사용할 E.

coli의 코돈 사용빈도는 17.61%로 매우 낮다. 그 중 특히 E. coli 의

arginine의 codon은 CGC, CGT codon이 76%정도 차지하는데 반해서,

갯지렁이는 E. coli 에 거의 존재하지 않는 AGA, AGG가 67%를 차지한

다. 이러한 차이는 tRNA의 낮은 보유율을 보이게 되며, 결국

over-expression의 저해를 불러일으키게 된다. 이를 극복하기 위해서

PLSP3의 arginine부분을 site-direct mutagenesis의 방법으로 point

mutation 하였다.

2-4-2. site direct mutation

A. PCR amplification

PLSP-3의 mature protease의 N-말단 쪽에 존재하는 GCGAGGCAA

(ARQ)의 arginine 부분을 먼저 CGC로 mutation 한 후, 그 뒤에 존재하

는 ATGAGAAGAACC(MRRT)의 arginine을 CGC로 mutaion 하였다.

첫 번째 부분의 arginine의 point mutation을 위해 사용한 프라이머는

다음과 같다.

․ PLSP3 M_R1 F

5'-GGCCAGGACGCCCGCCAAGGTGAATTCC-3‘ (28mer)

․ PLSP3 M_R1 R

5'-GGAATTCACCTTGGCGGGCGTCCTGGCC-3‘ (28mer)

위의 프라이머를 이용하여 PCR을 하였다. PCR에 사용된 polymerase는

Pfu 기능을 가지는 Pfu polymerase(intron)를 사용하였고, template는 pT7

PLSP3를 사용하였다. Site direct point mutation을 하기 위해 94℃에서 5

분간 pre-denaturation을 한 후, 94℃에서 1분간 denaturation을 하고, 6

5℃에서 1분간 annealing을 한 후, 72℃에서 12분간 extension하였으며 위

의 cycle을 14번 반복하였다.

PCR 후 DpnI을 처리 한 다음 agarose-extraction을 하여 ligase로

ligation 한 후, E. coli JM109에 transformation 하였다.

두 번째 부분의 arginine의 point mutation은 첫 번째 mutation 된 DNA를

template로 사용하였고, 아래의 primer를 사용하였다.

- 13 -

․ PSLP3 M_R2 F

5'-GCAGGTGGGCATGCGCCGCACCACAAGCTCCC-3‘ (33mer)

․ PSLP3 M_R2 R

5'- GGGAGCTTGTGGTGCGGCGCATGCCCACCTGCC-3‘ (33mer)

첫 번째 부분의 mutation과 같은 방법으로 PCR을 한 후 sequencing을

통해서 point mutation이 일어난 유무를 확인하였다.

B. 단백질 발현 및 분석

이렇게 얻은 point mutation된 발현벡터를 E. coli Rosetta(DE3)에 형

질 전환 시킨 후, 형질전환된 E. coli Rosetta(DE3) 균주를 1mM IPTG

에 의해 0 ~ 20 시간 단백질 발현을 유도하였다.

2-4-3. pColdI으로의 재구축

세 개의 arginine codon 을 point mutation 후 pColdI vector로

transformation 하였다. pCold DNA는 cold shock 단백질을 코드하는

cspA 유전자를 기본으로 구축되어 있으며 cspA promoter, 5'-UTR,

cspA 단백질의 N 말단을 코드하는 부분을 포함하고 있다. cspA

promoter에서의 transcription은 37℃에서도 이루어지지만 그 하류인

5‘-UTR이 37℃에서는 상당히 불안정하므로 효율적인 translation이 이루

어지지 않는다. 그러나 온도를 37℃에서 15℃로 내리면 5’-UTR의 구조

가 상당히 안정되어, 그 결과 translation 효율이 상승하여 저온에서 고효

율로 단백질의 합성을 하는 vector이다.

A. PCR amplification & fusion protein 구성

pColdI에 transformation 하기 위해서 먼저 pColdI과 pT7 PLSP3

MR2를 NdeI과 HindIII를 이용해서 잘라 pColdI의 경우 3.6 kb 크기의

DNA 절편과, pT7 PLSP3 MR2의 PLSP3 MR2 부분인 약 0.7 kb 부분

을 agarose gel에서 elution 하였다. 준비된 vector 및 insert DNA를

T4 DNA ligase를 이용하여 붙인 다음, 대장균(E. coli BL21 Rosetta

(DE3))으로 도입하여 형질전환체를 얻었다. 이런 형질 전환체들을 키워

plasmid를 추출하여 size selection에 의해 vector 크기보다 커진 클론들

- 14 -

을 선별하여 제한효소 NdeI & HindIII로 잘라 insert DNA 도입 여부를

확인하였고, 최종적으로 염기서열 분석에 의해 open reading frame을 확

인하였다.

pColdI PLSP3 MR2

NdeI, HindIIINdeI, HindIII

elution of vector

primer faction

elution of mature form

4.4kb linear vectormature form(702bp)

ligation

transformation

screening & sequencing

pColdI series vector (~5.1kb)

B. 단백질 발현 및 분석

이렇게 얻은 point mutation된 발현벡터를 E. coli Rosetta(DE3)에 형

질 전환 시킨 후, 형질전환된 E. coli Rosetta(DE3) 균주를 각각 37℃에

서 키운 후 OD600에서 0.8정도 자랐을 때, 각각 15℃와 37℃에서 1mM

IPTG에 의해 0 ~ 20 시간 단백질 발현을 유도하였다

2-5. Refolding & purification

2-5-1. Inclusion body의 용해 방법

① 환원제로 glutathione을 사용한 unfolding

pColdI과 재조합한 PLSP3 MR2를 가진 E. coli Rosetta (BL21) 균주

를 100ug/ml의 ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 overnight 배양하고,

그 다음날 신선한 배지 200㎖에 1/100(2㎖) 정도로 희석하여 접종한 후,

- 15 -

37℃에서 배양하였다. 세포밀도(OD600)가 0.8에 도달할 때까지 키운 다

음, IPTG를 1mM이 되게 첨가하여 15℃에서 단백질 발현을 유도하였고,

24시간동안 발현 시킨 후, 세포 배양액을 원심분리하여 균체를 모은 후,

영하 70℃에서 보관하였다. 보관된 cell pellet 1.5g당 50mM의

Tris-HCl(pH8.0)과 100mM의 NaCl과 5mM의 EDTA, 0.1%의 NaN3,

0.5%의 Triton-X 100과 1mM의 DTT가 함유된 완충용액 10ml에 세포

균체를 suspension한 후, sonication을 30초 실시 한 다음, 2분 동안 얼

음에 방치하였다. 이 과정을 5번 반복한 후, 원심분리하여 soluble 부분

과 insoluble(pellet) 부분을 구분하였다. Pellet을 위의 완충용액에 다시

녹인 후 10mM의 MgSO4와 0.1mg/ml이 되도록 lysozyme을 넣어 준 후,

실온에서 20분간 놓아두었다. 그 후 sonication을 반복 실시한 후 원심분

리하여 상층액과 침전물을 구분하였다. 침전물은 Triton-X 100이 없는

위의 완충용액에 씻어준 후 원심분리 하여 상층액과 침전물을 구분해 놓

았다.

침전물에 100mM의 Tris-HCl(pH8.0), 50mM의 glycine, 8M의 urea,

5mM의 oxidized glutathione과 0.5mM의 reduced glutathione의

unfolding buffer에 녹여주었다. 이것을 하루 밤동안 suspension 해 주었

다. Suspension한 inclusion body를 원심분리하여 침전물과 상층액을 구

분하였다.

② DTT를 이용한 unfolding

위의 방법대로 보관한 cell pellet 1.5g당 25mM NaCl, 50mM Tris

pH8.2, 1mM DTT, 0.27 mg/ml lysozyme가 함유된 suspension buffer

10㎖에 suspension 시킨다. 10분 동안 실온에서 방치 한 후, sonication

을 30초 실시 한 후, 2분 동안 얼음에 방치하였다. 이 과정을 5번 반복하

였다. Sonication이 끝난 후, 원심분리하여 soluble 부분과 insoluble

(pellet) 부분을 구분해 놓았다. Insoluble한 것을 2.5M Urea, 1%

Triston X-100가 함유된 washing buffer(10ml)에 suspension 한 후,

원심분리하여 pellet을 회수하였다. 회수된 pellet을 50mM Tris HCl

pH8.2, 8M Urea, 10mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM DTT가 함유된

resuspension buffer(10ml)에 suspension 하였다. Suspension 한 것을

22℃에서 18시간 stirring 하였다. 그 후, 원심분리하여 상층액을 회수하

- 16 -

고, 침전물을 1ml의 resuspension buffer에 suspension 하였고 각 단계

의 샘플을 채취하여 15% SDS-PAGE로 분석하였다.

많은 양의 unfolding된 단백질을 얻기 위해 washing 후의

resuspension buffer의 조성을 달리하였다. 대조군으로 원래의 buffer 조

성(50mM Tris HCl pH8.2, 8M Urea, 10mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM

DTT)을 사용하였으며, 두개의 실험군으로 0.1%의 SDS(방법 1)를 첨가

하였고, 다른 하나는 Tris-HCl buffer의 pH를 9.5(방법 2)로 올려서 사

용하였다. 대조군과 각 실험군의 원심분리 후의 상층액(10ml)과 침전물

(1ml)을 회수하여 15%의 SDS-PAGE로 분석하였다.

2-5-2. Ni-chelating agarose 크로마토그래피

Ni-chelating Agarose는 폴리히스티딘 잔기를 가진 재조합 단백질에서

의 니켈 금속-친화 크로마토그래피 매트릭스이다. pColdI의 경우 앞에 히

스티딘을 6개가지고 있는 구조로서 니켈 금속-친화 크로마토그래피에 결

합할 수 있는 능력을 가지고 있다.

Factor Xa를 처리한 재조합된 PLSP3를 Ni-chelating agarose

chromatography를 하면 Factor Xa에 의해 잘라진 His-tag 부분이

resin에 결합하여, resin이 결합하지 않은 flow-through된 분획이

PLSP3가 된다.

0.5M의 NaCl과 5mM의 imidazole이 포함된 20mM Tris-HCl 완충용

액(pH9.5; Binding buffer)으로 평형시키고, Factor Xa로 처리한 단백질

용액을 컬럼에 전개한 후, 완충용액을 흘려주어 280nm에서 흡광도가

0.05 이하가 될 때까지 씻어 주었다. 씻어준 컬럼을 0.5M의 NaCl과

50mM의 imidazole이 포함된 20mM Tris-HCl 완충용액(pH9.5;

washing buffer)으로 씻어 주었다. 그 후 0.5M의 NaCl과 200mM의

imidazole이 포함된 20mM의 Tris-HCl 완충용액(pH8.0)으로 흘려주어

Ni-column과 결합한 재조합 단백질을 용출시켰고 각 fraction은 5ml씩

분획하였다.

2-5-3. Factor Xa 처리

Ni-chelating agarose에서 정제한 재조합 단백질의 N-말단 부분에 6

개의 His-tag를 가지고 있고 이 부분은 Factor Xa에 의해 잘려질 수 있

- 17 -

다.

Factor Xa를 처리하기 전에 TCA를 이용하여 단백질의 활성을 없게 만

든 다음 Factor Xa를 처리하기 위해 TCA를 처리한 재조합 단백질을 정

량한 후, 1mg당 5U와 10U의 Factor Xa를 처리하였다. 이때 1mM의

CaCl2와 100mM의 NaCl이 포함된 50mM의 Tris-HCl 완충용액(pH9.5)

으로 실시하였고 단백질과 Factor Xa를 넣은 후 22℃에서 16시간동안

처리하였다.

2-5-4. 단백질 분해효소의 아미노산 서열 분석

① N-terminal 분석

단백질 분해 효소의 N-terminal 아미노산 서열 분석을 위하여 효소를

정제한 후 정제한 효소 20ul를 15% seperating gel과 4% stacking gel

로 이루어진 SDS-PAGE를 통해 전개를 하였다. 전개가 끝난 gel을 단백

질 전이 buffer(10mM CAPS/10% methanol, pH11.0)에 적셔둔 fiber

pad와 filter paper가 올려진 cassette 위에 올려놓고, 100% methanol에

1시간 동안 적셔둔 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane을 올

린 후, 그 위에 filter paper와 fiber pad를 다시 쌓아서 gel과

membrane이 잘 밀착하도록 cassette를 설치하였다. 이를 Novex S cell

Blot module을 이용해서 gel 상에 있는 단백질을 300mA의 정전류로 1

시간동안 전기영동하여 PVDF membrane으로 blotting을 하였고,

blotting이 끝난 PVDF membrane은 Coomassie brilliant blue R-250이

들어있는 염색액에 약 1분간 담궈 염색시킨 후 50% methanol 용액에 넣

어서 탈색하였다. PVDF membrane에서 단백질이 염색된 부분만을 선택

적으로 절단하여 한국기초과학지원연구원에 N-terminal 아미노산 서열

분석을 의뢰하였다.

② MALDI-MS 방법

Factor Xa의 처리한 sample을 15% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동

한 후, PLSP3 band 만을 오려내어 LC-MS방법을 이용한 아미노산 분석

을 프로테옴텍에 의뢰하였다.

- 18 -

2-5-5. 재조합 단백질의 HEPES buffer를 이용한 refolding 방법

회수된 insoluble한 부분의 sup을 50mM HEPES buffer pH9.5,

10mM Mg(CH3COO)2, 50mM KCl, 2mM DTT, 0.1mM

Benzamidine(buffer A)의 buffer에 약 1 : 150 정도의 비율로 넣어 실온

에서 1시간 동안 stirring 해 주었다.

2-5-6. p-Aminobenzamidine-Sepharose 친화성 크로마토그래피

Buffer A에 희석한 과발현 단백질들을 0.2mM benzamidine 및 0.5M

염화나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH8.2)으로 미리 평형

시킨 p-Aminobenzamidine-Sepharose 컬럼에 전개한 후 완충용액을 흘

려주어 280nm에서 흡광도가 0.05 이하가 될 때까지 씻어 준 후, 2mM

benzamidine 및 0.5M 염화나트륨을 포함하는 50mM Tris HCl 완충용액

(pH8.2)을 흘려주어 결합되어 있는 refolding 된 단백질 분해효소를 용출

하였다. 단백질의 용출 속도는 시간당 10ml이었으며, 각 분획은 3ml씩

받았다. 각 분획의 단백질 분해 활성을 측정한 후, 활성을 갖는 분획만을

모아 Centriprep PM 10을 사용하여 농축하였으며, -70℃에서 냉동 보관

하였다.

2-5-7. 단백질 분해 효소의 활성 측정법

단백질 분해 효소가 갖는 기질에 대한 특이성, 즉 P1 site에 대한 특이

성은 정제된 protease 10ul, 에 합성 기질을 80ul 의 활성 측정 buffer

(0.1M Tris-HCl, pH9.5/5mM CaCl2) 및 5 ul 의 합성기질 (4mM, 70%

ethanol 에 용해) 을 넣어 주었다. 37℃에서 각 시간 별로 반응 시킨 후,

405nm에서 p-nitroanilide (p-NA) 생성을 측정하였다. Protease 1 unit

은 37℃에서 1분간 1umole의 p-NA를 생성하는데 필요한 효소의 양으로

정의하였으며, 이때 p-NA의 absorption coefficient는 10,000cm-1M-1를

생성된 p-NA의 양 계산에 사용하였다.

- 19 -

실험 결과

1. 대장균에서 pT7-7 promoter를 이용한 PLSP3 유전자

의 발현 최적화

1-1. T7 promoter를 이용한 발현

1-1-1. pT7-7 vector에서 변형된 PLSP3 유전자 (10F 서열)의 발현

우선 T7 발현벡터의 전사개시 부분부터 PLSP3 단백질의 9번째 아미

노산까지의 이차구조의 free energy 값은 아래와 같다

- Original : -22 Kcal/mole

+1 XbaI

M

GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG

I V G G Q D A R Q

ATTGTAGGAGGCCAGGACGCCAGGCAA (93bp)

-10F 서열 : -22 Kcal/mole

+1 XbaI

M

GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG

I V G G Q D A R Q

ATTGTAGGTGGACAGGATGCAAGGCAA (93bp)

원래의 서열 및 10F 서열간에 큰 차이가 없는 것으로 분석되었다. 이

는 PLSP3 유전자 자체의 9번째 아미노산까지의 free energy는 원래 서

열의 경우 -4.9 Kcal/mole이며, 변형된 서열(10F 서열)은 -2.1

Kcal/mole로서 원래 서열보다는 free energy가 positive 방향, 즉 이차

구조의 형성이 깨지는 구조를 갖는 것으로 분석되었다. 그러나 pT7-7

vector의 전사개시부분과 결합하였을 때 free energy의 차이가 없는 것

은 pT7-7 의 5'-UTR (untranslated region) 차이에 기인하는 것으로 생

- 20 -

각되며, 세포 내에서는 어떤 영향을 주는지 단백질 발현을 시도하였으나

단백질 발현 수준에는 큰 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. 이는 발

현하려고 하는 유전자의 이차구조도 중요하지만 promoter 다음의

5'-UTR에 의해 mRNA 이차구조는 영향을 받는 것으로 보인다. 따라서

PLSP3 유전자의 발현을 위한 가장 좋은 5'-UTR 서열을 찾기 위하여

SD 서열 및 spacer region의 서열을 무작위로 합성하여 PLSP3 유전자

발현에 좋은 영향을 주는 찾기 위한 실험을 시도하였다.

1-1-2. SD (Shine-Dalgarno) 및 Spacer 염기 변화 (T7 promoter)

Ligation을 한 후 형질전환하여 vector 크기보다 커진 클론들을 확보하

여 제한효소 처리에 의해 도입된 insert DNA를 확인한 후, DNA 염기서

열을 분석하였다 (Table 3).

염기서열을 분석한 결과 SD site와 spacer region, methaonine site가

모두 존재하는 것을 확인 할 수 있었다.

Table 4. Nucleotide sequences of SD and spacer region of pT10R series

plasmids.

clone No.

Restriction enzyme

XabI & HindIII

(0.7kb)

SD & Space regionG value

(Kcal/mole)

Exp. Level

(western

blot)

T7 promoter taagAAGGAG ATATACAT ATG - 22.0 0

pT10R-4 ○ ttttGGAAAG GGTGGTATT ATG - 22.3 medium

pT10R-12 ○ ttttAAAGGG GGAAGGATT ATG - 20.8 high

pT10R-15 ○ ttttAGGAAG AAGTCAATT ATG - 20.9 high

pT10R-16 ○ ttttGAAGAG ATTGTTATT ATG - 19.4 high

pT10R-17 ○ ttttGAGGAG AATTCCATT ATG - 21.4 low

pT10R-18 ○ ttttGRRRRG NNNNNNATT ATG low

pT10R-19 ○ ttttGAGGAG AATTCCATT ATG - 21.4 low

pT10R-20 ○ ttttGAGGGG CCTGCCATT ATG - 26.2 low

pT10R-22 ○ ttttGRRRRG NNNNNNATT ATG low

pT10R-25 ○ ttttGGGGGG CGGTAAATT ATG - 22.1 low

pT10R-26 ○ ttttAGGAAG AAGTCAATT ATG - 20.9 medium

pT10R-27 ○ ttttGAGGAG GCAGCAATT ATG - 21.0 medium

- 21 -

C. 단백질 발현 및 분석

각각의 pT10R series vector를 갖는 BL21(DE3) 균주를 IPTG에 의해

6 시간 단백질 발현을 유도한 후 형성된 단백질을 western blot에 의해

분석하였다. 그림 5에서 보듯이 항원항체 반응 결과, pT10R-4, 12, 15,

16에서 강한 signal이 검출되었으며, pT10R-17, 19, 20에서는 약한

band가, pT10R-22, 25, 26, 27에서는 중간 정도의 signal로 band들이

검출되었다. 단백질 발현양은 PAGE 상에서는 볼 때 소량이며, 대장균 자

체 단백질과 같은 크기에서 발현되는 것으로 보여 확실하게 구분은 가지

않지만, 활성을 갖는 serine protease 효소가 생산되었다는 것을 확인할

수는 있었다.

또한 단백질 발현을 하는 클론들의 SD 및 spacer 서열과 free energy

의 관계를 분석하면 Table 3에서 보듯이 pT7-7 vector로 도입된

PLSP3 유전자의 전사개시부터 9 번째 아미노산 coding 부위까지 free

energy는 - 22 Kcal/mole로 분석되었다. 무작위 서열이 도입된 클론들

의 염기서열 분석 결과 SD 서열은 다양한 purine rich(A/G) 서열로 나타

났으며, 특히 western blot에서 높은 활성을 보이는 클론들, 즉

pT10R-12, 15, 16의 경우 free energy 값이 각각 - 20.8, - 20.9, -

19.4 Kcal/mole로써 control 보다 positive 방향으로 이차구조가 파괴되

는 것으로 분석되었다. 따라서 좀 더 이차구조의 free energy 값이

positive 방향으로 향하는 클론들을 선별한다면 높은 수준으로 단백질 발

현이 가능할 것으로 사료된다. 나머지 클론들의 단백질 발현 정도는 대체

로 이차구조의 파괴정도에 비례하는 것으로 나타났다.

높은 활성으로 단백질을 발현하는 클론 중 pT10R-12를 갖는 대장균을

시간별로 발현 양상을 조사한 결과, 그림 3에서 보듯이 단백질 발현은 2

시간 때부터 시작하여 23 시간까지 stable하게 발현되고 있음을 보여주

며, 특히 4 시간부터 12 시간까지가 현저하게 높은 활성을 갖는 단백질

이 합성되는 것으로 분석되었다. SD 및 spacer region의 염기조성 등

fibrinolytic 활성을 갖는 PLSP3 유전자, 즉 serine protease를 대장균에

서 발현 최적화를 위한 실험을 수행하였지만, 아직도 양적인 면에서 만족

할만한 수준으로 발현이 되질 않았다.

- 22 -

(A) Time course induction : 2, 4, 6, 8 hr

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10lane 1 : pT7-7 (C)

2 : pT710V-20 (I)

3 : pT10R-12 (C, 2h)

4 : " (I, 2h)

5 : " (C, 4h)

6 : " (I, 4h)

7 : " (C, 6h)

8 : " (I, 6h)

9 : " (C, 8h)

10 : " (I, 8h)

(B) Time course induction : 10. 12, 23 hr

1 2 3 4 5 6 7 8

lane 1 : pT7-7 (C)

2 : pT710V-20 (I)

3 : pT10R-12 (C, 10h)

4 : " (I, 10h)

5 : " (C, 12h)

6 : " (I, 12h)

7 : " (C, 23h)

8 : " (I, 23h)

(C) Induced samples by time intervals

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10lane 1 : MW marker

2 : pT710V-20 (I)

3 : pT10R-12 (C, 2h)

4 : " (I, 2h)

5 : " (C, 4h)

6 : " (I, 6h)

7 : " (C, 8h)

8 : " (I, 10h)

9 : " (C, 12h)

10 : " (I, 23h)

Fig. 2. SDS-PAGE and Western blot analysis of E. coli BL21(DE3)

harboring pT10R-12 vector. E. coli BL21(DE3)/pT10R-12 were induced at

37℃ for time intervals, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 23 hr.

- 23 -

2. 대장균과 갯지렁이의 코돈 사용빈도 확인 및 site direct mutation

2-1. 코돈 사용빈도(codon usage) 확인

다모류인 갯지렁이와 과발현 시스템에서 사용할 E. coli의 코돈 사용빈

도를 http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html에서 확인한 결과 17.61%

로 매우 낮게 나타났다. 그 중 특히 E. coli 의 arginine의 codon은

CGC, CGT codon이 76%정도 차지하는데 반해서, 갯지렁이는 E. coli 에

거의 존재하지 않는 AGA, AGG가 67%를 차지한다. 이러한 차이는

tRNA의 낮은 보유율을 보이게 되며, 결국 over-expression의 저해를 불

러일으키게 된다. N-말단 쪽의 염기서열에서 아미노산이 합성이 일어나

지 않으면, 다음 방향으로 전사가 더 이상 이루어지지 않게 된다. 따라서

전사가 잘 일어나게 하기 위해서는 N-말단 쪽의 아미노산이 잘 합성이

되어야 한다. Arginine의 경우 N-말단 쪽에 3개가 존재하게 되는데,

arginine의 서열이 AGG와 AGA로 갯지렁이의 코돈 사용빈도가 67%인데

비해서, E. coli에서의 코돈 사용빈도가 고작 8% 인 것으로 나타났다. 따

라서 E. coli에 존재하는 AGG와 AGA의 tRNA가 부족하여 전사가 되지

않을 가능성이 많을 것으로 생각된다. 따라서 E. coli 의 arginine의 코돈

사용빈도가 38%인 CGC 코돈으로 바꾸어 주면 tRNA의 부족이 일어나지

않아 전사가 잘 일어나게 될 것으로 예상하고 있다.

2-2. site direct mutation

A. PCR amplification & fusion protein 구성

첫 번째 arginine 쪽에 돌연변이를 일으키기 위해서 proof reading의

기능을 가지는 pfu polymerase를 사용하여 PCR 한 결과 그림 12A에서

보는 것과 같이 약 3.2kb의 유전자가 증폭되었다. 이것을 E. coli JM109

에 도입하였다. 도입된 형질전환체들로부터 plasmid를 분리하여 제한효소

NdeI & HindIII로 잘라 확인하였다.

이 plasmid가 site direct mutagenesis가 일어났는지를 확인하기 위해

서 서열 분석을 한 결과, 첫 번째 부분의 AGG가 CGC로 돌연변이가 일

- 24 -

어났음을 확인 할 수 있었다.

첫 번째 arginine 부분이 silent mutation이 일어난 재조합 DNA를 주

형으로 하여 두 번째, 세 번째 부분의 arginine(AGAAGA)이 silent

mutation되게 위와 같은 방법으로 PCR하여 돌연변이(CGCCGC)가 일어

나게 하였다. 증폭된 유전자의 크기는 약 3.2kb이고, 이것을 E. coli

JM109에 도입한 후, 도입된 형질전환체들로부터 plasmid를 분리하여 제

한효소 NdeI & HindIII로 잘라 확인하였다. 그 결과 약 0.7kb에서 insert

DNA가 나타났고, 약 2.5kb에서 pT7이 확인되었다. PLSP3의 부분이

나타난 clone을 서열분석한 결과 두 번째와 세 번째 arginine의 부분에서

silent mutation이 일어났음을 확인하였다(Table 5).

B. 단백질 발현 및 분석

단백질을 1mM의 IPTG를 이용해서 발현시킨 결과, pT7 PLSP3 MR1

에서는 point mutation을 일으키지 않은 clone과 차이가 없게, 발현의 정

도가 육안으로 확인 할 수 없었다. 그러나 총 3개의 arginine의 silence

mutation을 시킨 pT7 PLSP3 MR2의 경우는 약 30kDa 에서 단백질의

발현이 일어났음을 육안으로 확인 할 수 있었다(Fig. 13). 이것은 E. coli

와 polychaeta의 codon usage의 차이가 단백질의 과다발현에 영향을 주

었음을 나타낸 것이라 할 수 있다. 그러나 더 많은 양의 단백질의 발현과

정제의 편리성을 위하여 N-말단에 6개의 histidine을 가진 pColdI의 벡

터로 바꾸었다.

- 25 -

Table 5. Site direct mutagenesis sequence of PLSP3, PLSP MR2 and

PLSP3 MR2.

Sequence

PLSP3

M I V G G Q D A R Q G E F P W Q V G M

ATGATTGTAGGAGGCCAGGACGCCAGGCAAGGTGAATTCCCCTGGCAGGTGGGCATG

R R T T S

AGAAGAACCACAAGC

PLSP3

MR1

M I V G G Q D A R Q G E F P W Q V G M

ATGATTGTAGGAGGCCAGGACGCCCGCCAAGGTGAATTCCCCTGGCAGGTGGGCATG

R R T T S

AGAAGAACCACAAGC

PLSP3

MR2

M I V G G Q D A R Q G E F P W Q V G M

ATGATTGTAGGAGGCCAGGACGCCCGCCAAGGTGAATTCCCCTGGCAGGTGGGCATG

R R T T S

CGCCGCACCACAAGC

- 26 -

lane 1 : LMW

2 : pT7 PLSP3 MR1 (I 0h)

3 : pT7 PLSP3 MR1 (I 2h)

4 : pT7 PLSP3 MR1 (I 4h)

5 : pT7 PLSP3 MR1 (I 6h)

6 : pT7 PLSP3 MR1 (I 20h)

1 2 3 4 5 6

A. pT7 PLSP3 MR1 / E. coli Rosetta

1 2 3 4 5 6

lane 1 : LMW

2 : pT7 PLSP3 MR2 (I 0h)

3 : pT7 PLSP3 MR2 (I 2h)

4 : pT7 PLSP3 MR2 (I 4h)

5 : pT7 PLSP3 MR2 (I 6h)

6 : pT7 PLSP3 MR2 (I 20h)

B. pT7 PLSP3 MR2 / E. coli Rosetta

Fig 3. SDS-PAGE of E. coli BL21(DE3) harboring pT7 PLSP3 MR1 & pT7

PLSP3 MR2 vector. E. coli Rosetta(DE3)/pT7 PLSP3 MR1 & E. coli

Rosetta(DE3)/pT7 PLSP3 MR2 were induced at 37℃ for time intervals,

0, 2, 4, 6, 20 hr.

- 27 -

2-5. pColdI으로의 재구축

A. PCR amplification & fusion protein 구성

pColdI의 vector와 재조합하기 위해서 pT7 PSLP3 MR2를 NdeI과

HindIII를 이용하여 잘라낸 후 PLSP3 MR2의 DNA가 들어가 있는 부분

을 agarose elution(0.7kb) 하였다. pColdI vector도 역시 NdeI과

HindIII를 이용하여 잘라낸 후 agarose elution(3.6 kb) 하였다.

Elution 한 DNA를 ligase를 이용하여 붙인 후에 E. coli JM109에 도

입한 후, 도입된 형질전환체들로부터 plasmid를 분리하여 제한효소 NdeI

& HindIII로 잘라 확인한 결과 PSLP3 MR2의 DNA가 들어가 있는 것을

확인 할 수 있었다. PLSP3의 부분이 나타난 clone을 서열분석한 결과

두 번째와 세 번째 arginine의 부분에서 silent mutation이 일어났음을

확인하였다.

His-tag factor Xa NdeI PLSP3 MR2CATCATCATCATCATCATATCGAAGGTAGGCATATGATTGTAGGAGGCCAGGACGCCCGCCAA H H H H H H I Q G R H M I V G G Q D A R Q

GGTGAATTCCCCTGGCAGGTGGGCATGCGCCGCACCACAAGC G E F P W Q V G M R R T T S

B. 단백질 발현 및 분석

확인된 clone을 E. coli Rosetta에 형질전환 시킨 후 재조합 단백질의

발현을 유도한 결과 15℃와 37℃ 모두에서 약 30kDa 부근에서 단백질의

발현이 유도됨을 알 수 있었다. 재조합 단백질의 크기는 앞에 6개의

histidine이 있다고 할지라도 그 크기가 작아 원래의 PLSP3 MR2의 단백

질 크기와 구분이 가지는 않았다. 그러나 재조합 단백질 발현의 증가는

앞에서 실험한 다른 벡터에서의 재조합 단백질의 증가보다 더 많이 발현

이 된 것이 육안으로 관찰되었다(Fig. 5).

- 28 -

1 2 3 4 5 6

lane 1 : LMW 2 : pColdI PLSP3 MR2 (I 0h)

3 : pColdI PLSP3 MR2 (I 2h) 4 : pColdI PLSP3 MR2 (I 4h)

5 : pColdI PLSP3 MR2 (I 6h) 6 : pColdI PLSP3 MR2 (I 20h)

1 2 3 4 5 6

15℃ 37℃

Fig. 4. Transformation and expression of recombinant pColdI PLSP3 MR2

in E. coli Rosetta(DE3).

SDS-PAGE analysis of the pColdI PLSP3 MR2 in E. coli Rosetta(DE3) cells

grown at various temperatures, 15℃ and 37℃.

- 29 -

3. Refolding & purification

3-1. Inclusion body의 용해 방법

단백질의 발현을 유도한 후, 침전물을 suspension 완충용액으로 풀어

준 후 원심 분리한 것을 분석한 결과 상층액에서 단백질이 나오지 않고,

침전물에서 단백질이 있는 것을 확인하였다. 이것은 단백질들이 세포 밖

으로 분비가 되지 않고, 세포체에 형성되는 inclusion body를 형성하는

것을 의미한다. Inclusion body의 경우 보통 작은 세포의 안에서 인위적

으로 첨가한 IPTG에 의해 단백질이 만들어지는 것으로 보통 잘못된 접힌

구조를 갖게 되고, 활성이 없는 상태로 형성이 되게 된다. 활성이 있는

상태로 만들어주기 위해서는 먼저 단백질의 misfolding 상태를 풀어 주어

야 한다.

3-1-1. 환원제로 glutathione을 사용한 unfolding

실험방법 2-9-1-①의 방법으로 처리한 샘플을 각각의 단계에서

sampling한 것을 15% SDS-PAGE로 분석 한 결과, inclusion body를

8M의 urea 및 glutathione을 이용하여 unfolding 한 것의 상층액과 침전

물에서 거의 동일한 양이 나왔다. 이는 unfolding 되지 않은 단백질의 양

이 많아 회수율이 떨어지는 것으로 생각되었다. 실험 과정 중 8M의 urea

를 처리하였을 때, 단백질이 unfolding 되면 투명하게 나타나는데 반해,

용해액이 불투명하게 나타나는 것으로 보아 unfolding이 제대로 되지 않

은 것으로 생각되었다.

3-1-2. DTT를 이용한 unfolding

Inclusion body로 형성된 단백질을 unfolding하기 위해서 8M의 urea

를 사용해서 하루 밤 동안 50mM Tris HCl pH8.2, 8M Urea, 10mM

NaCl, 2mM EDTA, 1mM DTT가 포함된 buffer에서 suspension 하였

다. 그 후에 원심분리를 하여 unfolding된 단백질과 침전물을 분리하였다.

그러나 침전물의 양이 많아서 많은 손실이 있었다. 이것을 해결하기 위해

buffer의 조성을 0.1%의 SDS의 첨가와 Tris-HCl의 buffer의 pH를 9.5

- 30 -

로 높여서 실험하였다. 그 결과, 0.1%의 SDS의 첨가는 단백질의 더 많은

unfolding에 관여하지만, Tris-HCl buffer의 pH를 9.5로 올린 실험보다

는 unfolding의 증가를 적게 가져오는 것으로 나타났다. 0.1%의 SDS 첨

가에서는 unfolding된 단백질(soluble)대 침전물이 10.2인데 비해서 pH를

높여준 방법에서는 21.58로 현저한 증가를 가지고 왔다. 따라서 재조합

단백질의 unfolding을 이 방법에 의해서 실시하였다.

Table 6. Comparison of solubility of unfolding method.

soluble/insoluble insoluble/soluble

control 4.74 0.21

method 1 10.20 0.09

method 2 21.58 0.04

- 31 -

lane 1 : LMW

2 : pColdI PLSP3 MR2 soluble

3 : " first sonication sup

4 : " second sonication sup

5 : " washing sup

6 : " 8M urea ppt

7 : " sup

1 2 3 4 5 6 7

A. The unfolding method which uses glutathion.

1 2 3 4 5 6

lane 1 : LMW

2 : pCold PLSP3 MR2 0h

3 : " 20h

4 : " soluble

5 : " washing

6 : " insoluble

B. Solubility of recombinant protease from pCodI PLSP3 MR2.

(soluble : supernatnat, insoluble : pellet)

lane 1 : LMW 2 : 0h 3 : 20h

4 : soluble 5 : washing 6 : control sup

7 : control ppt 8 : method 1 sup 9 : method 1 ppt

10 : method 2 sup 11 : method 2 ppt

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

C. Dissolving method of pColdI PLSP3 MR2 change to increase

dissolving rate of recombinant protein.

Fig. 5. Unfolding folding method of pColdI PLSP3 MR2.

- 32 -

3-2. Ni-chelating agarose 크로마토그래피

8M urea에 녹인 재조합 단백질을 Ni-chelating agarose 크로마토그래

피로 정제하였다. 재조합 단백질의 N-말단에 존재하는 histidine tag가

Ni-chelating agaros와 결합할 수 있다. 재조합 단백질을 평형 시킨 컬럼

에 전개를 하면 결합하지 않은 재조합 단백질들이 빠져나오는 것을 볼 수

있다. 그 후 imidazole의 농도를 50mM로 높여주어 결합하지 않은 단백

질이 빠져나올 때까지 씻어주었다. 그 후 imidazole의 농도를 200mM로

높여 준 후 결합한 단백질을 용출 시킨 결과 단백질이 용출되었음을 확인

할 수 있었다.

3-3. Factor Xa 처리 및 N 말단 분석

p-benzamidine에 의해 결합된 양이 적어서 N-말단 분석에 쓰일 시료

를 Histidine tag가 부착되는 Ni-column을 이용하였다. Ni column은

pColdI PLSP3 MR2에 N-말단에 존재하는 6개의 Histidine을 가지고 있

어서, Ni column에 결합할 수 있다. pColdI PLSP3 MR2를 Ni-column에

결합 시킨 후, elution 시키면 Ni-coulmn과 결합한 pColdI PLSP3 MR2

가 결합하였다. 이때도 역시 제대로 folding 되지 않은 재조합 단백질은

결합하지 않고, folding된 단백질만 결합하였다. Elution 한 재조합 단백

질의 경우 autolysis가 잘 일어나기 때문에 TCA를 처리하여 활성을 잃게

만들어 autolysis를 없게 하고, 단백질의 농축효과도 가져올 수 있었다.

TCA를 처리한 재조합 단백질에 Factor Xa를 처리한 것을 15% SDS-

PAGE로 전기영동 한 결과 재조합 단백질이 두개의 부분으로 나누어지는

것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 factor Xa의 양을 단백질 1mg당 5U

과 10U의 처리 모두에서 같은 결과를 가지고 왔다. Factor Xa의 처리

후 SDS-PAGE 상의 위쪽의 밴드는 histidine tag가 잘리지 않은 부분으

로 생각되고, 아래쪽의 밴드는 Factor Xa에 의해서 histidine tag가 잘려

진 부분이라고 생각된다. 이 아래쪽의 밴드를 N-말단 분석에 사용하였다.

- 33 -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

lane 1 : LMW

2 : pColdI PLSP3 MR2 I-p

3 : " I-s

4 : lane 3 - Ni column flowthrough

5 : " binding buffer 1

6 : " washing buffer 1

7 : " 3

8 : " eluent 1

9 : " 2

10 : " 3

11 : " 4

12 : " 5

Fig. 6. SDS PAGE of the recombinant protease by Ni-chelating agarose

chromatography.

1 2 3 4

lane 1 : LMW

2 : Ni-column eluent

3 : " Factor Xa 처리 (5U/mg)

4 : " Factor Xa 처리 (10U/mg)

Fig. 7. SDS PAGE of the digested recombinant protease by Factor Xa.

- 34 -

3-4. 단백질 분해효소의 아미노산 서열 분석

3-4-1. N-terminal 분석

2-6-4-①의 방법으로 만든 샘플을 한국기초과학연구원에 보내 시료

분석 한 결과 factor Xa 처리 전 샘플의 N-말단 분석은 MDHKVHH

HHHHI으로 나타났다. 이것으로 보아 pColdI과 재조합된 단백질을 알 수

는 없지만, pColdI 플라스미드의 부분이 발현된 것으로 생각된다. 재조합

된 PLSP3 MR2를 알아보기 위해 실시한 factor Xa의 처리 후의 분석에

서는 잘려진 부분과 잘려지지 않은 부분의 간격이 너무 좁고 양이 적어

PVDF membrane에 transfer가 되더라도 구분이 안 되었다. 따라서 이

문제를 해결하기위해 2-7-4-②의 방법으로 아미노산의 분석을 하였다.

② MALDI-MS 방법

잘라낸 SDS-PAGE의 밴드를 프로테옴텍에 MALDI-MS의 방법으로 아

미노산 분석을 의뢰하였다. 그 결과 Gene bank에서 일치하는 것을 찾을

수는 없었다(아직 PLSP3는 Gene bank에 등록 되지 않았음). 그 대신

PLSP3의 서열과는 일치하는 결과를 보여주었다. 또한 아미노산이 시작하

는 부분이 histidine으로 시작하지 않고 isoleucine으로 시작하는 것으로

보아 factor Xa에 의해 N-말단 쪽의 histidine tag가 제거된 것으로 생각

된다. 또한 pColdI으로 재조합 시킨 후 발현이 되는 것이 갯지렁이 유래

의 PLSP3와 아미노산 서열이 일치하는 것으로 단백질의 발현이 잘 일어

났음을 알 수 있었다.

3-5. 재조합 단백질의 HEPES buffer를 이용한 refolding 방법

8M urea에 의해서 unfolding 된 단백질을 refolding 시키기 위해서

150배의 50mM HEPES buffer pH9.5, 10mM Mg(CH3COO)2, 50mM

KCl, 2mM DTT, 0.1mM Benzamidine의 buffer에 refolding 시켰다.

150배 양의 buffer를 넣어 주게되면 8M urea의 농도가 53mM로 낮아지

게 되어 urea에 의해 unfolding되었던 것이 refolding되게 된다. 이렇게

refolding된 단백질을 합성기질을 이용한 단백질 분해활성을 측정하였을

때 삼일이 지난 후에 단백질을 분해하는 것이 관찰되었다.

- 35 -

Table 7. Amino sequence of pColdI PLSP3 MR2 digested by factor Xa

analysis was determined by MALDI-MS

sequence1 - 8 IVGGQDAR9 - 19 QGEFPWQVGMR47 - 61 ETVSNLILTVGDTNR47 - 72 ETVSNLILTVGDTNRNDNEGTEQDLR62 - 72 NDNEGTEQDLR73 - 77 VSLLR62 - 84 NDNEGTEQDLRVSLLRQHPGYNR

121 - 131 TAVVSGWGTLR174 - 190 YNTDACQGDSGGPLVVK

<Compare the PLSP3' amino acid sequence with MALDI-MS' amino acid

sequence result>

IVGGQDARQG EFPWQVGMRR TTSSLFCGAI VIGTRWIMSA AHCTDRETVS NLILTVGDTN RNDNEGTEQD LRVSLLRQHP GYNRITLDND ISLLQTSTAI GLNADVVAAC SPADSDFTGR TAVVSGWGTL RSGGPCCPTQ LQYVQVPVIS NAECNSVDYP GDITDGMLCA GDRYNTDACQ GDSGGPLVVK TSGLFQVIGI VSWGIGCASD YAGVYARVTT YMDWIGNIN

1 2

lane 1 : LMW

2 : dilution with buffer A

Fig 8. SDS-PAGE of refolding with unfolding pColdI PLSP3 MR2.

Refolding method with buffer A(50mM HEPES buffer pH9.5, 10mM

Mg(CH3COO)2, 50mM KCl, 2mM DTT, 0.1mM Benzamidine)

- 36 -

3-6. p-Aminobenzamidine Sepharose 친화성 크로마토그래피

Refolding된 재조합 단백질을 affinity column인 p-benzamidine

sepharose를 이용하여 정제하였다. 정제 중에서 loading 된 단백질들 중

일부가 washing fraction에서 빠져 나오는 것이 보이는데, 이것은 정확하

게 refolding 되지 않은 단백질들이 약하게 결합을 하고 있다가 washing

buffer에 의해 빠져 나오는 것으로 생각된다. Refolding 되어

p-benzamidine sepharose에 결합 하는 단백질의 양이 적어서 농축 후에

SDS-PAGE를 실시하였다. SDS-PAGE 상에서 결합된 단백질이 보이는

데, 완벽한 folding이 되지 않아서 많은 loss가 일어난 것으로 생각된다.

3-7. synthetic substrate 분석

100mM의 Tris-HCl(pH9.5) 80ul에 100mM의 CaCl2 5ul를 넣은 후

2mM의 여러 가지 합성 기질들을 넣어, 각 기질에 대한 효소의 활성을

측정하였고, 가장 높은 활성을 보인 기질에 대한 상대적 활성으로 나타내

었다. p-benzamidine sepharose로 얻은 재조합 단백질을 이용하여

synthetic substrate의 분해 활성을 측정한 결과 S-2390(Val-Phe-Lys)

에서 가장 높은 활성을 보였고 S-2222(Benz-Ile-Glu-Arg)와

S-2266(Val-Leu-Arg)에서 활성을 보였다. 재조합한 단백질 역시 native

한 갯지렁이 단백질 분해효소와 마찬가지로 arginine이나 lysine 같은

basic 아미노산 부위를 분해하는 것을 알 수 있었다. 그러나 native한 갯

지렁이 단백질 분해 효소와는 달리 활성을 나타내는데 걸리는 시간이 길

게 나타났으며, 그 활성의 정도도 떨어졌다. 그 이유는 단백질의 양이 적

고, refolding 시킨 단백질에 완벽한 refolding이 일어나지 않은 것으로

추측된다.

- 37 -

Table 8. Substrate specificities of the protease.

Substrate Sequence Enzyme Activity(%)S-2222 Benz-Ile-Glu-Arg factor Xa 87.1S-2266 Val-Leu-Arg Serine protease 48.4S-2288 Ile-Pro-Arg t-PA 48.4S-2302 Pro-Phe-Arg kallikerein 80.6S-2390 Val-Phe-Lys plasmin 100.0S-2403 pyroGlu-Phe-Lys plasmin 1.6S-2423 Ac-Ile-Glu-Gly-Arg endotoxin 6.5

Substrate specificity of recombinant protease was determinded with

various of chromogenic substrate by standard assay method.

1 2 3 4 5 6

lane 1 : LMW

2 : refolding

3 : p-benzamidine sepharose flow-through

4 : washing 1

5 : 2

6 : eluent conc.

Fig. 9. SDS PAGE of the recombinant protease by p-Benzamidine

Sepharose chromatography.

- 38 -

고 찰

갯지렁이 유래의 단백질 분해 효소의 생산성을 증가시키기 위한 발현벡

터를 구성하였다. 이 중 최적의 발현 시스템은 T7 promoter를 이용한 발

현 벡터였다. 그러나 이렇게 만든 재조합 단백질의 발현을 유도시켰을

때, SDS-PAGE상에서 재조합 단백질의 보이지 않았지만, Western blot

을 이용한 실험에서 재조합 단백질이 생산됨을 알 수 있었다. 그러나 단

백질의 발현이 만족할 만큼 잘 일어나지 않았다. 그 이유는 진핵생물인

갯지렁이의 코돈 사용빈도와 원핵생물인 대장균의 코돈 사용빈도가 다르

기 때문인 것으로 생각되었다. 갯지렁이와 대장균의 코돈 사용빈도의 유

사도는 17.61%로 매우 낮게 나타났는데, 특히 arginine의 사용빈도는 현

저히 낮게 나타나는데, N-말단 쪽에 arginine이 3개 (8, 19, 20 번) 가

집중되어 있으며 특이 18, 19 번에 연속한 arginine의 존재는 대장균에서

PLSP3 의 translation 중 Arg-tRNA의 공급이 원활하게 이루어지지 않

는 attenuation mechanism 이 진행되어 translation 이 잘 일어나지 않

았을 것이라 생각된다. 이런 문제를 해결하기 위해서 N-말단 쪽의 3개의

arginine의 codon을 대장균에서 사용빈도가 높은 CGC로 돌연변이 시킨

후, 대장균의 rare codon을 많이 포함하는 E. coli Rosetta(DE3)를 이용

하여 발현 시켰다. 그 결과 코돈 사용빈도를 고려하지 않고 발현 시켰을

때보다 발현율이 향상되었으나 가장 큰 문제가 inclusion body를 형성하

는 것이었다. 단백질의 재조합은 여러 가지의 조건이 있으나 모든 단백질

이 같은 성질을 가지고 있지 않기 때문에 unfolding된 재조합 단백질을

folding 시키기 위해서는 다양한 조건으로 실험해야 하는 어려움이 있다.

다양한 방법을 사용한 결과 inclusion body로 형성된 것을 해결하기 위

해서 unfolding 시킨 inclusion body를 HEPES buffer를 이용한

unfolding 된 단백질을 급격하게 희석시키는 방법을 사용하였다. 그 결과

HEPES buffer를 사용한 후 이것을 affinity chromatography인

p-aminobenzamidine-Sepharose에서 정제한 결과 적은 양이 결합하였

다. Affinity chromatography에 적은 양이 결합된 것으로 보아, 적은 양

만이 refolding이 일어났음을 알 수 있었다. 이런 결과는 합성기질을 이

용한 활성 실험에서 기질을 분해하는 속도가 느리게 나타나는 것이 정확

- 39 -

히 refolding된 단백질의 양이 적기 때문이라는 것을 확인 할 수 있었다.

HEPES로 dilution 시키는 방법이 가장 좋은 결과를 가지고 왔기는 하지

만, 아직 refolding 수율이 낮게 나타났다. 이는 갯지렁이 단백질 분해 효

소가 기존의 다른 단백질들과는 다른 특징을 갖고 있기 때문인 것으로 생

각된다.

갯지렁이 유래의 단백질 분해 효소의 생산성을 증가시키기 위해서 첫

번째 문제인 재조합 단백질의 양을 증가시키는 것을 해결하였지만 아직

풀어야 할 문제가 많이 남아 있는 것으로 생각되었다. 그것은 가장 중요

한 요소인 활성을 가지는 것으로 이 문제를 해결하기 위해서는 다른 종류

의 발현 시스템을 선택하고 선택된 방법을 최대한 활용하여 inclusion

body를 형성하지 않고, soluble한 형태로 발현하는 시스템을 찾는 것이

가장 좋은 해결책으로 생각된다. 이 방법을 모색하면서, 현재의 과 발현

된 재조합 단백질의 refolding도 여러 가지 방법으로 실험 해 보아야 할

것으로 사료된다.

- 40 -

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http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html

감사의 글

실험실에서의 생활이 벌써 3년째가 흘러갔습니다. 힘들긴 하였지만 돌

이켜보면 진정한 학문의 자세와 인내하는 것, 보람이 무엇인지를 느낄 수

있었던 소중한 시간이었습니다. 지금의 저는 아직 완전하진 않지만 처음

의 제 모습보다 많은 것을 배웠고 발전 하였습니다. 시작과는 달리 끝은

항상 아쉬움을 남깁니다. 아쉬움을 뒤로한 채 논문을 마치며 부족한 점이

많은 제가 무사히 대학원 생활을 마쳐 논문을 쓸 수 있도록 힘이 되어주

신 모든 분들게 진심으로 감사의 말씀을 드립니다. 부족한 저를 이끌며

학문의 방향에 대해 아낌없는 깨우침과 가르침을 주신 장정순 교수님께

감사드립니다. 또한 처음 실험실에 왔을 때부터 한가지씩 실험을 가르쳐

주신 주한승 박사님께 감사의 말씀을 드립니다. 저의 실험이 난관에 봉착

했을 때, 벡터와 균주 등 다양한 방법을 제시해 주신 박성혁 교수님께 감

사의 말씀을 드리며, 저의 부족한 지식을 채워 주신 김종욱 교수님, 유승

현 교수님, 장준혁 교수님께 감사드립니다. 또 바쁘신 중에도 저의 논문

심사를 맡아주신 강재승 교수님 감사합니다.

또한 저의 실험실 생활에 활력을 주신 실험실 동료들께 감사드립니다.

지금까지의 3년이 발판이 되어, 앞으로 저의 연구에 큰 힘이 되어 줄 것

입니다.