Summer Research

清華大學生命科學系 04級

孫敏瑜891645

Introduction2002 年暑假我來到位於高雄的國立中山大學 - 卓忠隆老師的分子生物實驗室。卓老師讓我跟著他的得意門生 - 陳錦苡學長做一些簡單的分生實驗，以練習基本技術為主。錦苡學長的研究主題是 : 利用抑制性扣減雜交 (Suppressor Subtractive hybridization ， SSH) 找出調控大鼠腦幹死亡過程的基因。學長利用 SSH 建構了相關基因的 cDNA library 。而我所要做的就是將這些 gene cloned ，確定 insert 是正接或反接，然後送定序，可供後續研究用。我總共 cloned 了兩個 gene: GMF-β 及 s100 。原料 : 網狀腹外側核（ rostral ventrolateral medulla（ RVLM ))cDNA

實驗過程

(1) 以 RVLM 的 cDNA ，加入欲 clone gene 的 primer(f&r) ， 再加入 Taq polymerase ， run PCR 。(2)Run electrophoresis ， check 有產物。(3) 使用 kit 來 purify PCR product 。(4) 以分光光度計來測量 DNA 的濃度及純度。(5)Run electrophoresis ，與 marker 對照確定是我要的 DNA 片段。(6) 將這些純化的產物保存在 -200C 冰箱。

實驗過程

(7) 接下來要準備 transformation 了， 所以我要自己製作 agar plate(with amp & w/o amp) 還有自己製作 competent cell ( 來源 : e.coli JM-109) 。(8)   Ligation: 將純化的 PCR 產物與本實驗所用的 pGEM T easy vector 進行 ligation 。(9)Transformation

(10) 從 plate 上挑菌 ( 藍白篩選法 ) 挑白色菌，種到含有 LB medium 的試管中，培養 16-20hr 。(11) 隔日，抽 plasmid ，以 EcoR I 切 3hr ，再以 electrophoresis 確定是否有成功 insert 。

實驗過程

(12) 成功 insert 的那幾管菌，再重新培養到新的試管中。(13) 以 kit 抽 plasmid ，此時抽出的 plasmid 較純， 送定序 check 是正接 or 反接。(14) 本來想利用 insert 上的 restriction enzyme 切位與vector 上的切位，使用適當的 restriction enzyme 來切， 可判斷是正接或反接。但上網查了一下 GMF-B 及 s100 上的切位，發現所需要的 enzyme 實驗室沒有。所以還是送定序來確定是正接或反接 ( 因為兩者的序列可在網上查到 ) 。

實驗流程

competent cell製 作

送 定 序

重 新 培 養 菌kit plasmid用 抽

restriction enzyme用 切 割electrophoresis

insert確 定 有成 功

plasmid抽

藍 白 篩 選挑 菌種 菌

Transformation

PCR ligation將 產 物 進行

kit PCR用 純 化 產 物DNA以 分 光 光 度 計 測 的 濃 度 及 純 度

-20C保 存

electrophoresischeck有 產 物

RVLM(cDNA)PCR

GMF-B放 大 片 段

實驗結果

1. GMF-β(1)   PCR 產物由電泳圖來看量還算夠

實驗結果

(2)   Transformation 效率不高， 可能是我做的competent cell 效率不夠強， 或是 ligation 效果不夠好 。(3)   restriction enzyme 切割結果 :

實驗結果

大部分都有成功 insert ， 我從這些成功的 insert 中挑了四管，再純化 plasmid 。

(4) 送定序(5) 定序結果 : 四個 recombined plasmid 都是正接的

定序圖

實驗結果

2. s100(1)   PCR 產物由電泳圖來看量還算夠

實驗結果(2)Transformation 效率不高， 可能是我做的 competent cell 效率不夠強， 或是 ligation 效果不夠好。 (3)restriction enzyme 切割結果 :

實驗結果

相當奇怪 !! 切出的片段有的不一樣長，只好將 plasmi

d 再做一次 PCR ，確定有 insert 到正確片段 ( 學長教的 ) 。

實驗結果由圖看 no.3 是錯的， no.1 有兩條 band 也怪怪的，所以只有 2.4.5.6 比較有可能成功。學長說 no.1 的情形可能是最初 PCR 時，溫度沒有設好，所以 primer

不專一的接到別的片段，所以純化時也連這些片段一起純化。

ligation 後產生兩種 recombined DNA ，使 transformation 後有兩種菌產生 : 含有 S100 及另一種 insert 的菌。為了確定，我又重挑了四管菌 :no9-12 。

實驗結果

抽 plasmid 切割後，與之前的 no.2 切割片段及 plasmi

d PCR 產物比較，發現竟然不一樣長…可見果然有 insert 到錯誤的 DNA 片段

實驗結果因為後來純化 plasmid 的 kit 沒了， 而且暑假也結束了， 所以來不及將 s100 送定序 -- 交給其他學長姐完成 。

感想

這是我第一次進入實驗室做實驗，覺得非常新鮮又滿興奮的。想到那些課本上描述的神奇實驗，如今我可以親自動手操作，就覺得很有成就感。這一次我的重心是放在基本操作的練習上，一整個暑假幾乎就是反覆的 PCR. 抽 plasmid. 電泳… . 。以後等我學習了生

化、分生，更有基礎之後，我很期待可以開始真正的研究。