Londrina 2014

SUPLEMENTACAO DE SOBREMESA LACTEA PROBIÓTICA COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

PROTEÍNA DO SORO DE LEITE

CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE LEITE

CAMILA FREDERICO

Londrina 2014

SUPLEMENTACAO DE SOBREMESA LACTEA PROBIÓTICA COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

PROTEÍNA DO SORO DE LEITE

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Ciência e Tecnologia de Leite. Orientadora: Profa. Dra. Cínthia Hoch Batista de Souza Co-orientador: Prof. Dr. Helio Hiroshi Suguimoto

CAMILA FREDERICO

Londrina, 18 de agosto de 2014.

Cínthia Hoch Batista de Souza Universidade Norte do Paraná

Lina Casale Aragon-Alegro Universidade Norte do Paraná

Dr. Leandro Freire dos Santos

CAMILA FREDERICO

SUPLEMENTACAO DE SOBREMESA LACTEA PROBIÓTICA COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE

PROTEÍNA DO SORO DE LEITE

Dissertação apresentada à UNOPAR – Unidade Piza, Centro de Pesquisa em Ciências Agrárias como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Ciência e Tecnologia de Leite, conferido pela banca examinadora constituída pelos professores:

Dedico este trabalho a minha filha Luisa.

"Não existem sonhos impossíveis para aqueles que realmente acreditam que o poder realizador reside no interior de cada ser humano, sempre que alguém descobre esse poder algo antes considerado impossível se torna realidade." (Albert Einstein)

AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar meus caminhos, me fortalecer e permitir a realização de mais um

sonho.

A toda minha família, pelo amor, carinho, incentivo e apoio nas minhas escolhas.

A minha orientadora Profa. Dra. Cínthia Hoch Batista de Souza, pela atenção,

paciência e ensinamentos durante a realização deste trabalho.

As técnicas do laboratório do Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e

Derivados da UNOPAR, Flávia Kawahigashi e Geyci de Oliveira Colognesi, e à aluna

de iniciação científica Danielle Carla Uliana, pela contribuição na realização das

análises deste trabalho.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a

Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior Particular (FUNADESP)

pelas concessões das bolsas PROSUP e de iniciação científica, respectivamente.

A Arla Foods Ingredients, pela doação do concentrado proteico de soro utilizado na

elaboração das sobremesas.

Enfim, a todos aqueles que realmente torceram e que de alguma forma contribuíram

para a realização deste trabalho.

FREDERICO, Camila. Suplementação de sobremesa láctea probiótica com diferentes concentrações de proteína do soro de leite. 2014. 52 f. Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite – Centro de Pesquisa em Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.

RESUMO

A importância de consumir alimentos nutritivos e saudáveis faz com que a população busque produtos que contenham constituintes benéficos à saúde. O concentrado protéico de soro (WPC), cujos constituintes possuem uma variedade de fatores e compostos que auxiliam na prevenção de doenças, é uma interessante alternativa para utilização no mercado de produtos lácteos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um flan probiótico suplementado com WPC e com o microrganismo Lactobacillus acidophilus La-5. Foram produzidas quatro formulações, todas suplementadas com La-5: F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC). Foram realizadas análises físico-químicas (pH, acidez livre titulável e composição centesimal), microbiológicas (determinação das populações de La-5 e contaminantes - coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva, bolores e leveduras), além de aceitação sensorial e avaliação da textura dos produtos. As populações de La- variaram de 9,40 log UFC/g (F4, dia 1) a 8,53 log UFC/g (F1, dia 28), no entanto, apresentaram-se acima de 8,50 durante todo o período de armazenamento (28 dias). Não foram observados microrganismos contaminantes ao longo do armazenamento refrigerado. Para todas as formulações, observou-se aumento significativo na acidez ao longo do armazenamento (p<0,05) e os valores de pH apresentaram redução estatisticamente significativa (p<0,05). As diferentes concentrações de WPC influenciaram na textura das formulações. A formulação F4 apresentou aumento significativo na dureza (p<0,05) ao longo do armazenamento. Todas as formulações apresentaram excelente aceitabilidade na análise sensorial, sem diferenças estatisticamente significativas após o 7° e o 14° dia (p>0,05). A obtenção de uma sobremesa probiótica enriquecida com o WPC é possível, pois a adição do mesmo não influenciou negativamente as populações de La-5, e também não interferiu quanto à aceitação sensorial do produto, embora algumas formulações tenham se apresentado mais firmes, em função da presença de maiores concentrações de WPC.

Palavras-chave: Concentrado proteico de soro. Lactobacillus acidophilus. Produto lácteo.

FREDERICO, Camila. Suplementação de sobremesa láctea probiótica com diferentes concentrações de proteína do soro de leite. 2014. 52 f. Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite – Centro de Pesquisa em Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.

ABSTRACT

The importance of intake nutritious and healthy food makes people search for products that contain beneficial health constituents. The whey protein concentrate (WPC), whose constituents have a variety of factors and compounds that help to prevent diseases, it is an interesting alternative for use in the dairy market. The objective of this study was to develop a probiotic flan supplemented with WPC and the microorganism Lactobacillus acidophilus La-5. Four formulations, all supplemented with La-5, were produced: F1 (control, without WPC addition), F2 (1.5% of WPC), F3 (3% of WPC) and F4 (4.5% of WPC). Physico-chemical analysis (pH, titratable acidity and chemical composition), microbiological (populations of La-5 and contaminants - total coliforms, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positive, yeasts and molds), sensory acceptance and texture evaluation of the products were carried out. La-populations ranged from 9.40 log CFU / g (F4, 1 day) to 8.53 log CFU / g (F1, 28), however, were above 8.50 log CFU / g during the whole storage period (28 days). No contaminating microorganisms were observed during refrigerated storage. For all formulations, there was a significant increase in acidity during storage (p <0.05) and pH values showed a statistically significant reduction (p <0.05). Different concentrations of WPC influenced the texture of the formulations. The formulation F4 showed an increase in hardness (p<0.05) during storage. All formulations showed excellent acceptability in sensory analysis, with no statistically significant differences after 7 and 14 days (p>0.05). The production of a probiotic dessert enriched with WPC is possible, since this ingredient did not influence the populations of La-5 and the acceptance of the product, although some formulations have been presented firmer, according to WPC concentrations. Keywords: Whey protein. Lactobacillus acidophilus. Dairy Product.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 9

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 10

2.1 Soro de leite bovino .................................................................................. 10

2.2 Proteínas do soro ..................................................................................... 11

2.3 Probióticos ................................................................................................ 13

2.4 O gênero Lactobacillus e a cepa Lactobacillus acidophilus ...................... 15

2.5 Mercado de alimentos lácteos .................................................................. 16

2.6 Sobremesas lácteas suplementadas com proteínas do soro de leite bovino

....................................................................................................................................17

3 OBJETIVOS ............................................................................................. 18

4 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 19

5 ARTIGO .................................................................................................... 25

6 CONCLUSÃO ........................................................................................... 42

7 ANEXOS................................................................................................... 48

7.1 Protocolo de aprovacao do comite de etica em pesquisa da universidade

norte do parana (Parecer nº 579.932) ....................................................................... 49

7.2 Modelo de ficha utilizada na analise sensorial.......................................... 52

9 1 INTRODUÇÃO

A indústria de alimentos desenvolve, através de novas tecnologias e

formulações, que sejam capazes de satisfazer as necessidades do consumidor,

cada vez mais exigente por produtos que contenham características funcionais de

saúde e que atendam às suas expectativas sensoriais (KOMATSU; BURITI; SAAD,

2008).

O mercado de sobremesas lácteas prontas para consumo tem apresentado

considerável crescimento, devido à utilização de ingredientes inovadores e sistemas

tecnológicos aplicados nas indústrias de laticínios que proporcionam novas

alternativas às sobremesas clássicas, permitindo produtos com novos sabores e

maior valor nutritivo. Neste contexto, alimentos ricos em proteínas de alto valor

biológico como as proteínas do soro de leite, bem como a adição de microrganismos

probióticos, que estão associados a muitos efeitos benéficos à saúde do

consumidor, são alvos de frequentes investigações (ALVES et al., 2014).

A utilização das proteínas do soro de leite bovino tem sido muito bem aceita na

formulação de alimentos, pois este componente, quando ingerido estimula a síntese

protéica, possui atividade antimicrobiana, antiviral, anticâncer, reduz a gordura

corporal, além de promover o aumento da atividade imunomoduladora (SGARBIERI,

2004). Além disso, podem melhorar as características finais em alguns produtos,

visto que possui propriedades tecnológicas como a gelificação, emulsificação e

formação de espumas. Os microrganismos probióticos podem auxiliar na redução da

intolerância à lactose; na inibição de microrganismos patogênicos; prevenção de

diarréia; redução dos níveis de colesterol; aumento da resposta imunológica; além

de poder exercer efeitos anticarcinogênicos (OHATA et al. 2005; OLIVEIRA et al.

2002; PAGNO et al., 2009; SAARELA et al., 2002).

A adição do soro de leite bovino às sobremesas lácteas proporciona tanto

vantagens econômicas pela utilização deste subproduto, quanto qualitativas, tais

como melhoria nas qualidades sensoriais e na estabilidade dos produtos. O flan é

uma sobremesa obtida a partir do leite e outros ingredientes como açúcar, aroma e

essência, que através da ação de agentes espessantes ou gelificantes adquire

consistência semi-sólida (NUNES et al., 1998).

Portanto, desenvolver um produto que promova melhoria na qualidade de vida

da população torna-se um atrativo às pesquisas e representa uma opção de

tecnologia para a fabricação de novos produtos com alegação funcional.

10 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Soro de leite bovino

O soro de leite é um subproduto de importância relevante na indústria de

laticínios, pois em média, 10 litros de leite produzem um quilograma de queijo e nove

litros de soro (OLIVEIRA; BRAVO; TONIAL, 2012). Em 2012, a produção mundial de

soro foi de 190 milhões de toneladas (MILKPOINT, 2012).

O soro contém as proteínas solúveis do leite, lactose, gordura, sais minerais e

caseínas residuais. Cerca de 55% de todos os nutrientes presentes no leite estão

presentes no soro (ALVES et al., 2014; CAMARGO et al., 2000).

A recuperação das proteínas do soro de leite bovino tem o relevante papel na

preservação da qualidade do meio ambiente, pois o soro do queijo é um dos

poluentes líquidos que mais contribuem para a alta carga poluidora das indústrias de

laticínios, quando descartado de maneira incorreta, tendo uma demanda bioquímica

de oxigênio (DBO) que varia entre 27 a 60 g de O2/L enquanto a demanda química

de oxigênio (DQO) é de 50 a 102 g de O2/L. A DBO avalia a quantidade de oxigênio

necessária para ocorrer a oxidação da matéria orgânica por via biológica, enquanto

a DQO, avalia a quantidade de oxigênio para a oxidação da matéria orgânica

através de um agente químico (ANTUNES, 2003; PRAZERES; CARVALHO; RIVAS,

2012).

No Brasil, existem leis para regulamentar o tratamento dos efluentes gerados por

laticínios, entre elas é importante citar a Resolução Federal nº 357 de 17/03/05 do

Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), que foi complementada pela

Resolução Federal nº 430 de 13/05/11, que dispõe sobre a classificação dos corpos

de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece

as condições e padrões de lançamento de efluentes (águas residuárias), ficando

estabelecido que o descarte de efluentes de qualquer fonte poluidora somente

poderá ser feito direta ou indiretamente, nos corpos de água, após o devido

tratamento e desde que obedeçam as condições, padrões e exigências dispostas na

resolução como pH entre 5 a 9, temperatura inferior a 40°C, ausência de materiais

flutuantes, entre outros (BRASIL, 2005; BRASIL, 2011).

Esses efluentes, se lançados in natura nos cursos d’água provocam resultados

desastrosos para o meio ambiente, devido ao caráter extremamente orgânico

desses resíduos, sendo altamente poluentes, em consequência do consumo do

oxigênio dissolvido da água. Este oxigênio retirado da água pelas bactérias e outros

11 microrganismos, faltará para suprir a demanda de peixes e outros organismos

aquáticos, acarretando a morte dos mesmos por asfixia (BARBOSA et al., 2009). Considerando o seu alto teor de água e a finalidade de agregar valor ao produto

e a seus derivados, o soro pode ser concentrado. O produto concentrado é

classificado, então, de acordo com o teor de proteína, e pode ter aplicações

diversas, devido as suas características nutricionais e tecnológicas, que vão do seu

uso como ingrediente alimentício à produção de medicamentos. Na indústria

alimentícia, o soro do leite concentrado pode ser utilizado para melhorar as

propriedades tecnológicas e funcionais dos alimentos, promovendo a gelatinização,

emulsificação e formação de espuma. As características de gelificação permitem a

aplicação do soro como ingrediente em carne processada; como formador de

espumas pode ser utilizado em produtos lácteos. Como emulsificante, os

concentrados proteicos de soro encontram ampla aplicação na formulação de

molhos para saladas, bebidas nutricionais e sopas (ALVES et al., 2014).

2.2 Proteínas do soro

Nas últimas décadas, diversas pesquisas vêm demonstrando as qualidades

nutricionais das proteínas solúveis do soro do leite (OHATA et al., 2005;

SGARBIERI, 2004). As proteínas do soro são extraídas da porção aquosa do leite

gerada durante o processo de fabricação do queijo, no qual a caseína é precipitada

no seu ponto isoelétrico pela ação da renina, sendo o líquido remanescente

chamado de soro doce, ou também pode ser obtido por precipitação ácida, sendo

chamado de soro ácido (HARAGUCHI; ABREU; PAULA, 2006; PELEGRINE;

CARRASQUEIRA, 2008).

As principais proteínas presentes no soro são a -lactoglobulina e a -

lactalbumina. A -lactoglobulina representa aproximadamente 50% do teor total de

proteína de soro de queijo bovino, e a -lactalbumina 25%. Além destas duas

classes de proteínas, o soro do leite bovino apresenta outras proteínas como a

lactoperoxidase e lactoferrina, que possuem características antioxidantes, promovem

o fortalecimento do sistema imunológico humano e apresentam efeitos anti-

cancerígenos (SGARBIERI, 2004).

Para a recuperação destas proteínas presentes no soro de leite bovino, a técnica

mais utilizada é a ultrafiltração, processo pelo qual os componentes de baixa massa

12 molecular (lactose, sais e água), permeiam através das membranas de ultrafiltração,

que retêm as moléculas de proteína (ALVES et al., 2014; FOX; MCSWEENEY,

1998).

O Japão e a Europa foram os pioneiros no uso de soro como fonte de muitos

compostos com propriedades medicinais. Várias funções ou atividades fisiológicas

têm sido descobertas ou atribuídas às proteínas do soro. Estudos recentes

indicaram que a ingestão de proteínas do soro de leite, especialmente de proteínas

de soro de leite hidrolisadas, promove a utilização da glicose sanguínea e a síntese

de glicogênio nos músculos esquelético e cardíaco, devido à ativação do

transportador de glicose-4 (GLUT-4). Quando ativadas as moléculas de GLUT-4

migram para a membrana plasmática, tornando-se disponíveis para captar a glicose

presente no meio circulante e transportá-la para o interior das células, promovendo

assim, o efeito anti-hiperglicêmico, de combate ao diabetes ou ao pré-diabetes

(McGREGOR; POPPITT, 2013).

Outros efeitos benéficos atribuídos às proteínas do soro também estão descritos

na literatura. Os peptídeos derivados da lactoferrina oferecem proteção ao sistema

cardiovascular, pois possuem atividade anticoagulante inibindo a agregação de

plaquetas, além de serem sequestrantes de radicais livres, atividade

imunomoduladora atribuídas às imunoglobulinas, pois a mesma estimula o

crescimento de linfócitos e macrófagos (McGREGOR; POPPITT, 2013, SGARBIERI,

2004). A lactoferrina também apresenta atividade antimicrobiana, que ocorre porque

a lactoferrina tem capacidade de quelar o ferro disponível no ambiente, inibindo,

dessa forma e a proliferação de bactérias. A atividade antiviral também têm sido

demonstrada pela lactoferrina, pois esta libera peptídeos com ação inibitória ao vírus

da hepatite C (SGARBIERI, 2004).

Marshall (2004) observou que as proteínas do soro do leite inibiram o

aparecimento e o crescimento de tumores em animais e humanos devido à

estimulação da síntese de glutationa. A redução da gordura corporal em humanos

também foi estudada por este autor. Este efeito ocorre pois as proteínas do soro são

ricas em cálcio, e o aumento do cálcio dietético reduz as concentrações dos

hormônios calcitrópicos e a redução destes hormônios diminui a deposição de

gordura nos tecidos adiposos.

Além dos benefícios descritos anteriormente, estas proteínas também estão

relacionadas ao incremento da síntese muscular, devido à composição das mesmas

13 que são ricas no aminoácido leucina, importante para a síntese de proteínas

musculares (DIDERIKSEN et al., 2011).

A suplementação da dieta de atletas utilizando proteínas do soro tem sido uma

prática cada vez mais utilizada por profissionais da área da saúde esportiva, pois a

proteína do soro tem rápida digestão e absorção intestinal, o que proporciona

elevação da concentração de aminoácidos no plasma, que por sua vez estimula a

síntese protéica nos tecidos (TERADA et al., 2009).

As proteínas do soro de leite bovino também possuem várias aplicabilidades na

indústria de alimentos, sendo utilizadas para incremento das características finais

em alguns produtos, visto que possuem propriedades funcionais como a gelificação,

emulsificação e formação de espumas, entre outras (ANTUNES; CAZETTO; BOLINI;

2005; OHATA et al. 2005; PAGNO et al., 2009). Por esses motivos, tais proteínas

vêm sendo utilizadas no preparo de vários alimentos como pães, bebidas e

sobremesas, pois além de seus benefícios para a saúde, promovem efeitos positivos

sobre a textura, sabor e cor destes alimentos (EL-GARAWANY; SALAM, 2004;

PELEGRINE; CARRASQUEIRA, 2008; VALDUGA et al., 2006).

As proteínas do soro podem ser adicionadas a diferentes alimentos lácteos

como mousse, sorvetes, iogurtes e leites fermentados (ANTUNES; CAZETTO;

BOLINI, 2005; BURITI; CASTRO; SAAD, 2010; CAMARGO et al., 2000; OHATA et

al., 2005; VIDIGAL et al., 2012).

2.3 Probióticos

Sabe-se que, o uso de microrganismos probióticos aumenta de maneira

significativa os benefícios dos alimentos (HAMILTON-MILLER, 2004).

A atual definição aceita para probióticos internacionalmente é a de que são

microrganismos vivos, administrados em quantidades adequadas, que conferem

benefícios à saúde do hospedeiro (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION

OF UNITED NATIONS; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001; SANDERS,

2003).

O termo probiótico é de origem grega e significa “para a vida”. Um

microrganismo probiótico deve atender a várias exigências para receber esta

classificação como apresentar resistência ao ambiente ácido estomacal, à bile e às

enzimas pancreáticas, adesão às células da mucosa intestinal, capacidade de

colonização do intestino, onde deverão promover o equilíbrio da microbiota

14 intestinal. Para a obtenção dos efeitos desejados as bactérias probióticas devem

estar presentes em quantidades adequadas nos produtos, apresentando populações

entre 106–107 UFC/g ou mL do alimento (TALWALKAR et al., 2004; VINDEROLA;

REINHEIMER, 2000).

Os probióticos são utilizados na medicina humana na prevenção e tratamento de

doenças. Estudos demonstraram que os probióticos atuam na regulação da

microbiota intestinal, como imunomoduladores por melhorarem a produção de

macrófagos e estimular a produção de células supressoras (IANNITTI; PALMIERI;

2010) e na inibição da carcinogênese, devido à conversão de potenciais substâncias

pré-carcinogênicas em compostos menos nocivos (SANDERS, 2003). Além destes

benefícios, os probióticos também controlam as infecções intestinais, estimulam a

motilidade intestinal com consequente alívio da constipação, melhoram a absorção

de determinados nutrientes (NAKAMURA; OMAYE, 2012), melhoram a utilização de

lactose e o alívio dos sintomas de intolerância a esse açúcar e promovem a

diminuição dos níveis de colesterol por produzirem inibidores da síntese deste

(SANDERS, 2003).

A utilização de culturas probióticas reforça as defesas naturais do hospedeiro.

Os probióticos agem pelos seguintes mecanismos de ação: produção de compostos

com atividade antimicrobiana, como as bacteriocinas; formação de uma barreira

protetora no trato gastrintestinal, ocasionando a competição por nutrientes e por

sítios de adesão, estimulo da imunidade do hospedeiro, por meio do aumento das

células T e dendríticas (BOIRIVANT; STROBER, 2007).

Culturas probióticas com boas propriedades tecnológicas não devem alterar

características sensoriais e físico-químicas adequadas ao produto, além de ser

estáveis e viáveis durante o armazenamento (SOUZA et al., 2008).

Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são mais

frequentemente empregadas como probióticos em alimentos. A opção por esses

microrganismos pode ser atribuída ao fato deles serem isolados de todas as porções

do trato gastrintestinal do humano saudável (SHAH, 2007). O íleo terminal e o cólon

parecem ser os locais de preferência para a colonização intestinal dos lactobacilos e

bifidobactérias, respectivamente (BIELECKA et al., 2002; SAARELA et al., 2000).

15 2.4 O gênero Lactobacillus e a cepa Lactobacillus acidophilus

O gênero Lactobacillus foi isolado e classificado no ano de 1901 por Otto

Kandler e Norbet. Atualmente já se conhece mais de 100 espécies e subespécies

desse gênero. A multiplicação destes microrganismos pode ocorrer em temperaturas

de até 45°C, sendo a faixa entre 35 e 40°C, a variação de temperatura adequada

para uma ótima multiplicação. Sua tolerância à acidez varia de 0,3% a 1,9% de ácido

láctico, com pH ótimo entre 5,5 e 6,0 (GIRAFFA; CHANISHVILI; WIDYASTUTI,

2010, SHAH, 2007).

Segundo Vásquez et al. (2005), os microrganismos pertencentes ao gênero os

Lactobacillus fazem parte de um vasto grupo de bactérias Gram-positivas, não

esporuladas e estão presentes na forma de bastonetes ou cocobacilos, sendo

anaeróbios ou aeróbios. Os lactobacilos são classificados em: obrigatoriamente

homofermentativos; facultativamente heterofermentativos e obrigatoriamente

heterofermentativos. O Lactobacillus acidophilus é homofermentativo.

Os microrganismos Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius,

Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus brevis são as espécies mais comuns isoladas do intestino

humano (BERNARDEAU et al., 2008), sendo a cepa La-5 de Lactobacillus acidophilus, uma cepa cujo efeito benéfico é reconhecido cientificamente (JAIN et

al., 2004; WANG et al., 2004). Esta cepa é aprovada pela Agência Nacional de

Vigilância (ANVISA) para utilização em alimentos no Brasil (ANVISA, 2008).

O Lactobacillus acidophilus é considerado um microrganismo probiótico em

razão dos benefícios relacionados ao consumo, sendo muito utilizado na indústria de

laticínios, na fabricação de diversos produtos, podendo apresentar inúmeras

aplicações na nutrição humana como suplementos alimentares, suspensões orais,

comprimidos, iogurtes, leites fermentados e queijos. Diversos trabalhos

demonstraram a utilização da cepa Lactobacillus acidophilus La-5 em alimentos

como mousse (BURITI; CASTRO; SAAD, 2010), queijo petit-suisse (PEREIRA et al.,

2010), queijo minas frescal (SOUZA; SAAD, 2009), pudins (HELLAND; WICKLUND;

NARVHUS, 2004), iogurtes (BEDANI et al., 2014) e sorvete de iogurte (AHMADI et

al., 2012).

Lactobacillus acidophilus promove efeitos benéficos reconhecidos

cientificamente como: melhora a digestão da lactose devido a fermentação

bacteriana que reduz a concentração de lactose, efeitos anticarcinogênicos por

16 reduzir os níveis de enzima intestinal associada ao câncer e aumentar imunidade,

prevenção da diarréia associada ao uso de antibióticos, erradicação de patógenos,

(devido a produção de ácido lático, competição de nutrientes e também por inibir sua

adesão ao epitélio), diminuição dos níveis de colesterol por meio da inibição da

absorção do colesterol e também pela supressão da reabsorção de ácidos biliares e

diminuição do risco de doenças cardiovasculares (SANDERS, 2003).

Estudos com produtos contendo Lactobacillus acidophilus La-5 e seu uso em

humanos já foram realizados. Jain et al. (2003) observaram 90 pacientes por 10

dias, tratados com cápsulas contendo L. acidophilus La-5, Bifidobacterium lactis Bb-

12, Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus, e observaram a

diminuição de imunossupressão por antibióticos e também a diminuição da

incidência de infecções. Wang et al. (2008) observaram que o L. acidophilus La-5 juntamente com B. lactis Bb-12 adicionados a um iogurte e administrado em

humanos por 6 semanas exerceu efeito inibitório sobre o microrganismo

Helicobacter pylori.

2.5 Mercado de alimentos lácteos

Durante a última década, o interesse das indústrias e consumidores por

alimentos funcionais tem aumentado de maneira significativa, suportados pela

influencia positiva que estes alimentos exercem sobre algumas funções biológicas

do organismo humano. Neste cenário, os produtos lácteos com alegação funcional

foram responsáveis entre 2005 e 2010, por quase 43% do mercado mundial de

produtos funcionais, sendo que na América Latina houve expansão de 32% ao ano

entre 2005 e 2007 (CROWLEY, 2008; ÖZER, KIRMACI, 2010).

Os produtos lácteos constituem um dos principais veículos carreadores de

bactérias probióticas. O aumento deste mercado revitalizou este setor pela

introdução de produtos caracterizados não só pelo seu alto valor nutritivo e sabor

agradável, mas também pela sua capacidade de exercer efeitos positivos sobre a

saúde do consumidor (CASIRAGHI et al., 2007).

Segundo Freitas (2012), o aumento da renda dos brasileiros favoreceu o

aumento do consumo de produtos lácteos e um levantamento da Associação

Brasileira dos Produtores de Leite, relatou um aumento de 23% no consumo per

capita de lácteos nos últimos anos. Desde 2005, o consumo per capita desses

produtos aumentou 52%; em 2010 o avanço foi de 16%. A demanda por outros

17 derivados, como iogurtes, bebidas lácteas e leite condensado aumentou 53% em

2011.

2.6 Sobremesas lácteas suplementadas com proteínas do soro de leite bovino

As sobremesas lácteas são boas matrizes para a incorporação de culturas

probióticas e outros produtos funcionais como o prebiótico inulina e o WPC. A

adição de ingredientes inovadores promove novas alternativas às sobremesas

clássicas, obtendo assim produtos com novos sabores e que proporcionam maiores

benefícios à saúde do consumidor (BURITI; CASTRO; SAAD, 2010).

O efeito da adição de concentrado protéico de soro também foi avaliado na

textura e nas características sensoriais e aceitabilidade de sobremesas lácteas

elaboradas sem gordura, em estudo realizado por Vidigal et al. (2012) os autores

obtiveram resultados satisfatórios quanto a aceitação sensorial do produto.

Tendo em vista que o uso dessas proteínas em sobremesas lácteas pode

influenciar seus atributos funcionais e nutricionais, além de suas características

intrínsecas, o a investigação do emprego destes compostos nesse tipo de produto

torna-se um importante alvo de pesquisas.

Portanto, o desenvolvimento de uma sobremesa com proteínas do soro de leite

bovino e adicionada de microrganismo probiótico representa uma opção de

tecnologia para a fabricação de novos produtos com alegação funcional.

18 3 OBJETIVOS

Desenvolver uma sobremesa probiótica tipo flan, enriquecida com diferentes

concentrações de concentrado protéico de soro.

Avaliar as populações de Lactobacillus acidophilus La-5 nas sobremesas

desenvolvidas até o 28º dia de armazenamento dos produtos.

Verificar a influência dos diferentes níveis de concentrado protéico de soro sobre

a viabilidade de Lactobacillus acidophilus La-5, as características físico-químicas,

sensoriais e de textura dos produtos.

19 4 REFERÊNCIAS

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25 5 ARTIGO

Sobremesa láctea probiótica suplementada com concentrado protéico de soro:

influência na viabilidade de Lactobacillus acidophilus e avaliação das características de textura, físico-químicas e sensoriais

FREDERICO, C.1; ULIANA, D. C.1; SUGUIMOTO, H. H.1; SANTANA, E. H. W.1;

ARAGON-ALEGRO, L. C.1; SOUZA, C. H. B.1*

1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de

Leite e Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.

* Corresponding author: C. H. B. Souza

E-mail: cinthiahoch@yahoo.com.br

Tel.: +55 43 3371-7993

Fax: +55 43 3371-7834

Running headline: Sobremesa láctea probiótica suplementada com proteína.

26

RESUMO

A importância de consumir alimentos nutritivos e saudáveis faz com que a população busque produtos que promovam benefícios à saúde. O concentrado protéico de soro (WPC), cujos constituintes possuem uma variedade de fatores e compostos que auxiliam na prevenção de doenças, é uma interessante alternativa para utilização no mercado de produtos lácteos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um flan probiótico suplementado com WPC e com o microrganismo Lactobacillus acidophilus La-5. Foram produzidas quatro formulações, todas suplementadas com La-5: F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC). Foram realizadas análises físico-químicas (pH, acidez livre titulável e composição centesimal), microbiológicas (determinação das populações de La-5 e contaminantes - coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva, bolores e leveduras), além de aceitação sensorial e avaliação da textura dos produtos. As populações de La- variaram de 9,40 log UFC/g (F4, dia 1) a 8,53 log UFC/g (F1, dia 28), no entanto, apresentaram-se acima de 8,50 durante todo o período de armazenamento (28 dias). Não foram observados microrganismos contaminantes ao longo do armazenamento refrigerado. Para todas as formulações, observou-se aumento significativo na acidez ao longo do armazenamento (p<0,05) e os valores de pH apresentaram redução estatisticamente significativa (p<0,05). As diferentes concentrações de WPC influenciaram na textura das formulações. A formulação F4 apresentou aumento significativo na dureza (p<0,05) ao longo do armazenamento. Todas as formulações apresentaram excelente aceitabilidade na análise sensorial, sem diferenças estatisticamente significativas após o 7° e 14° dia (p>0,05). A obtenção de uma sobremesa probiótica enriquecida com o WPC é possível, pois a adição do mesmo não influenciou negativamente as populações de La-5, e também não interferiu quanto à aceitação sensorial do produto, embora algumas formulações tenham se apresentado mais firmes, em função da presença de maiores concentrações de WPC. Palavras-chave: Concentrado proteico do soro. Lactobacillus acidophilus. Produto lácteo.

27 1. INTRODUÇÃO

O mercado de sobremesas lácteas prontas para consumo tem apresentado

considerável crescimento, devido à utilização de ingredientes inovadores e sistemas

tecnológicos aplicados nas indústrias de laticínios que proporcionam novas

alternativas às sobremesas clássicas, permitindo a produção de produtos com novos

sabores e maior valor nutritivo.

Além disso a indústria alimentícia tem desenvolvido, produtos que promovam

características funcionais de saúde e que atendam suas às expectativas sensoriais

dos consumidores (KOMATSU; BURITI; SAAD, 2008).

Neste contexto, alimentos ricos em proteínas de alto valor biológico como as

proteínas do soro de leite, bem como a adição de microrganismos probióticos, que

são associados a muitos efeitos benéficos à saúde do consumidor, são alvos de

frequentes investigações (NIKAEDO; AMARAL; PENNA, 2004).

O soro contém as proteínas solúveis do leite contém lactose, gordura, sais

minerais e caseínas residuais, apresentando cerca de 55% de todos os nutrientes

presentes no leite (CAMARGO et al., 2000, ALVES et al., 2014). As principais

proteínas do soro são a -lactoglobulina (50%) e a -lactalbumina (25%). Além

destas o soro do leite bovino apresenta outras proteínas como a lactoperoxidase e

lactoferrina (SGARBIERI, 2004).

A utilização das proteínas do soro de leite bovino tem sido muito bem aceita na

formulação de alimentos, pois este componente pode estimular a síntese protéica,

possuir atividades antimicrobiana, antiviral, anticâncerigenas, auxiliar na redução da

gordura corporal, além de promover o aumento da atividade imunomoduladora

(SGARBIERI, 2004). Além disso, podem melhorar as características finais em alguns

produtos, visto que possuem propriedades funcionais como a gelificação,

emulsificação e formação de espumas.

Outra maneira de promover a saúde do consumidor é a adição de

microrganismos probióticos as sobremesas lácteas. Probióticos são microrganismos

vivos, que administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde

do hospedeiro podendo promover a melhora nas características sensoriais e de

textura além da estabilidade dos produtos (FOOD AND AGRICULTURE

ORGANIZATION OF UNITED NATIONS; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001;

SANDERS, 2003). Os microrganismos probióticos podem auxiliar na redução da

intolerância à lactose, na inibição de microrganismos patogênicos, prevenção de

28 diarréia, redução dos níveis de colesterol sanguíneo e aumento da resposta

imunológica, além de poder exercer efeitos anticarcinogênicos (OHATA et al. 2005;

OLIVEIRA et al. 2002; PAGNO et al., 2009; SAARELA et al., 2002).

Um microrganismo probiótico deve atender a várias exigências para receber esta

classificação, como apresentar resistência ao ambiente ácido estomacal, à bile e às

enzimas pancreáticas, adesão às células da mucosa intestinal e capacidade de

colonização do intestino, onde deverão promover o equilíbrio da microbiota presente

neste local. Para a obtenção dos efeitos desejados as bactérias probióticas devem

estar presentes em quantidades adequadas nos produtos, apresentando populações

entre 106–107 UFC/g ou mL do alimento (TALWALKAR et al., 2004; VINDEROLA;

REINHEIMER, 2000).

As sobremesas lácteas são boas matrizes para a incorporação de culturas

probióticas e outros produtos funcionais como o WPC. A adição de ingredientes

inovadores promove novas alternativas às sobremesas clássicas, obtendo assim

produtos com novos sabores e que proporcionam maiores benefícios à saúde do

consumidor (BURITI; CASTRO; SAAD, 2010).

No entanto, poucos estudos apresentam o desenvolvimento e a avaliação das

características sensoriais e de textura de sobremesas lácteas tipo flan contendo

proteínas do soro e microrganismos probióticos.

Tendo em vista que o uso dessas proteínas pode influenciar os atributos

funcionais e nutricionais da sobremesa, além de suas características intrínsecas e

da sobrevivência do microrganismo probiótico, a investigação do emprego destes

compostos nesse tipo de produto torna-se um importante alvo de pesquisas.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver uma sobremesa láctea tipo

flan suplementada com diferentes concentrações de concentrado protéico de soro e

adicionada do microrganismo probiótico Lactobacillus acidophilus La-5. As

características físico-químicas, sensoriais, de textura e a viabilidade de La-5 foram

avaliadas.

2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Preparo do inóculo contendo a cultura probiótica

A cultura probiótica utilizada nos experimentos foi Lactobacillus acidophilus La-5

(Christian Hansen, Valinhos, Brasil), do tipo DVS (direct vat set), fornecida pelo

29 fabricante na forma liofilizada e armazenada congelada após a abertura do pacote,

conforme instruções do mesmo. A adição de La-5 aos produtos foi realizada após

uma etapa de pré-incubação da cultura. Para isso, 3 gramas de cultura foram

dissolvidas em 60 mL de leite UHT integral (Polly, Londrina, Brasil), sob condições

assépticas. Após esse procedimento, o inóculo foi incubado a 37°C, pelo período de

2 horas. Esta etapa foi realizada com o objetivo de obter populações iniciais mínimas

de 6,00 log UFC/g nos produtos.

2.2 Elaboração da sobremesa tipo flan Para a elaboração das sobremesas lácteas tipo flan foram empregados os

seguintes ingredientes: açúcar refinado (União, Sertãozinho, Brasil), leite UHT

integral (Polly, Londrina, Brasil), aroma de baunilha (Dr. Oetker, São Paulo, Brasil),

goma xantana (Danisco, Cotia, Brasil), gelatina sem sabor incolor (Dr. Oetker, São

Paulo, Brasil), concentrado protéico de soro (WPC, Lacprodan 80, Arla Food

Ingredients Sonderhoj, Dinamarca) e cultura probiótica Lactobacillus acidophilus La-

5 (Christian Hansen, Hoersholm, Dinamarca). Foram produzidas 4 formulações de

sobremesas lácteas tipo flan (em triplicata), de acordo com as variáveis

apresentadas na tabela 1. Os produtos foram obtidos de acordo com as etapas

descritas na figura 1.

Tabela 1. Ingredientes e suas respectivas quantidades utilizadas para cada formulação de sobremesa láctea tipo flan estudada.

Ingredientes

Quantidade Formulações

F1* F2 F3 F4 Leite UHT integral 255 mL 255 mL 255 mL 255 mL Goma xantana 0,1 g 0,1 g 0,1 g 0,1 g Gelatina sem sabor 3,7 g 3,7 g 3,7 g 3,7 g Açúcar 50,20 g 50,20g 50,20 g 50,20 g Aroma de baunilha 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL WPC** - 4,63 g 9,27 g 13,90 g Probiótico*** 3 g 3 g 3 g 3 g – : Ausência. * F1: formulação controle, sem adição de WPC. ** WPC (Lacprodan 80, Arla Food Ingredients Sonderhoj, Dinamarca). *** Lactobacillus acidophilus La-5 (Christian Hansen, Hoersholm, Dinamarca).

30 Figura 1. Fluxograma para a fabricação das sobremesas lácteas tipo flan.

* Processo realizado em batedeira (Arno, São Paulo Brasil). ** Em copos plásticos com volume de 140 mL (Copobrás, Içara, Brasil).

2.3 Períodos de armazenamento e amostragem As formulações desenvolvidas foram armazenadas refrigeradas a 5±1°C por um

período de 28 dias para realização das análises. Durante esse período, foram

realizadas análises de textura, microbiológicas e físico-químicas, semanalmente.

Além disso, foram realizadas as análises centesimal (no dia após a produção) e

sensorial (após 7 e 14 dias de armazenamento).

2.4 Determinação dos parâmetros microbiológicos 2.4.1 Determinação das populações de Lactobacillus acidophilus La-5

Decorridos os tempos de armazenamento descritos no item 2.3, porções de 25

gramas de flan foram homogeneizadas com 225 mL de água peptonada 0,1%

(diluição 10-1), utilizando-se um “Bag Mixer” (Interscience, St. Nom, França).

Pesagem dos ingredientes

Resfriamento em banho de gelo até 40°C sob agitação constante *

Adição da gelatina, goma, aroma de baunilha e pré

inóculo

Resfriamento em banho de gelo até 14°C

Embalagem** e armazenamento sob refrigeração (5±1°C)

Pasteurização (leite, açúcar e WPC) a 90°C/20 minutos

31 Diluições decimais subsequentes foram preparadas, utilizando-se o mesmo diluente.

Para a quantificação da cultura probiótica Lactobacillus acidophilus La-5, alíquotas

de 1 mL de cada diluição das amostras foram transferidas para placas de Petri

esterelizadas. Posteriormente adicionou-se ágar DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS),

fundido e resfriado a cerca de 45°C. As placas foram incubadas a 37°C por 48 horas

(INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, 1995).

2.4.2 Avaliação das populações de microrganismos contaminantes Foram avaliadas as populações dos seguintes microrganismos contaminantes:

coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva, bolores e

leveduras. As amostras foram preparadas de acordo com o descrito no item 2.4.1.

Para a determinação de S. coagulase positiva, alíquotas de 1 mL de cada diluição

das amostras foram transferidas para placas Petrifilm™ Staph Express (3M) e

incubadas a 37°C por 24 horas. Alíquotas de 1 mL de cada diluição das amostras

serão transferidas para placas Petrifilm™ Yeasts and Moulds Count Plates

(Petrifilm™ YM, 3M Microbiology, St. Paul, EUA) para contagem de bolores e

leveduras;; e para placas denominadas Petrifilm™ EC, para contagem de coliformes

totais e E. coli. As placas Petrifilm™ EC foram incubadas a 37°C por 24 e 48 horas,

para contagem de coliformes totais e de E. coli, respectivamente. As placas

Petrifilm™ YM e Petrifilm™ foram incubadas a 25°C por 5 dias, de acordo com as

instruções do fabricante (SILBERNAGEL; JECHOREK; CARVER, 2003).

2.5 Determinação da acidez e pH Para todas as formulações desenvolvidas, foram realizadas as análises de

acidez livre titulável e pH (Tec 3MP, Tecnal, Piracicaba, Brasil), de acordo com

metodologia preconizada pela Association of Official Agricultural Chemists (AOAC,

1995), nos tempos de armazenamento descritos no item 2.3. Todas as análises

foram realizadas em triplicata.

2.6 Determinação da composição centesimal As determinações de proteínas, lipídios, cinzas e umidade foram realizadas para

todas as formulações de flans produzidas, no dia seguinte à produção, de acordo

com metodologia preconizada pela Association of Official Agricultural Chemists

(AOAC, 1995). O teor de carboidratos foi calculado por diferença. Todas as análises

32 foram realizadas em triplicata.

2.7 Análise do perfil de textura instrumental O perfil de textura das sobremesas foi determinado através de teste de

compressão de amostras, utilizando-se probe cilíndrico acrílico TA3/100, com

25,4mm de diâmetro. As amostras foram mantidas em suas embalagens originais

sob refrigeração a 5±1°C até o momento da análise. Foram avaliados os parâmetros

dureza e adesividade em texturômetro Texture Analyser CT3 (Middleboro, EUA),

controlado por computador. Os dados foram coletados através do software Texture

CT V1.4 Build 17. Todas as análises foram realizadas em quadruplicada,

obedecendo às seguintes condições de testes, estabelecidas por Corrêa, Castro e

Saad (2008): velocidade de compressão: 1mm/s, distância: 10 mm.

2.8 Análise sensorial Após aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade

Norte do Paraná (Anexo I), a análise sensorial das sobremesas lácteas tipo flan foi

realizada após 7 e 14 dias de armazenamento dos produtos. A análise sensorial foi

conduzida segundo o delineamento de ordenação em blocos casualizados com 50

provadores não treinados, empregando-se teste de aceitação, utilizando-se escala

hedônica estruturada de 9 pontos, com variação de gostei muitíssimo (ou 9 pontos) a

desgostei muitíssimo (ou 1 ponto). Além da aceitação sensorial, a análise de

intenção de compra dos produtos também foi realizada (Anexo II). (DUTCOVSKY,

2013; LAWLESS; HEYMANN, 1999). As amostras foram servidas aos provadores

em porções de 5 gramas. O delineamento empregado foi o de blocos incompletos

balanceados, com apresentação monádica das amostras.

2.9 Análise estatística A normalidade dos resultados e a homogeneidade de variâncias foram avaliadas

através do teste de Shapiro-Wilks e Brown-Forsythe, respectivamente, adotando-se

α de 0,05. Quando a homogeneidade de variância não foi observada, os dados

foram tratados através de análise de variância não-paramétrica, com aplicação do

teste de Kruskal Wallis e o teste de Mann Whitney U para identificação dos

contrastes (p<0,05) (BOWER, 1997; BOWER, 1998b). Quando a homogeneidade de

variâncias foi observada, procedeu-se à análise de variância paramétrica e

33 consequente aplicação do teste de Tukey para a identificação das diferenças

significativas entre as médias (p<0,05) (BOWER, 1997; BOWER, 1998a; BOWER,

1998b; CALLEGARI-JAQUES, 2003). Para as comparações entre os diferentes

períodos de armazenamento para uma mesma formulação: quando a

homogeneidade de variância não foi observada, os dados foram tratados pela

análise de variância não-paramétrica, com aplicação do teste de Friedman e o “LSD

rank” para identificação dos contrastes (p<0,05) (BOWER, 1998b). Quando houve a

homogeneidade de variâncias, procedeu-se a análise de variância (ANOVA) para

medidas repetidas e aplicação do teste de Tukey para detectar as diferenças

significativas (p<0,05) entre as médias (BOWER, 1998a).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Análises físico-químicas

A tabela 2 apresenta os resultados da análise centesimal obtidos para todas as

formulações. Os valores de lipídios, cinzas, umidade e carboidratos não difeririam

estatisticamente entre as formulações desenvolvidas (p>0,05), isto se deve ao fato

da concentração dos ingredientes ser a mesma para todas as formulações, pois

apenas a concentração de WPC variou. Por outro lado, as formulações

apresentaram diferença estatisticamente significativa (p<0,05) com relação à

concentração de proteína, devido à suplementação com WPC.

Tabela 2. Composição centesimal e umidade (média* ± desvio - padrão) obtidos para os flans F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC), após 1, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento a 5±1°C.

Flans Proteína Lipídios Cinzas Umidade Carboidratos F1 4,16±0,25a 3,70±0,45a 1,99±0,02a 76,85±3,35a 13,31±2,71a F2 4,67±0,13b 3,53±0,37a 2,03±0,01a 77,55±1,11a 12,22±1,27a F3 F4

6,15±1,03c 7,68±0,17d

3,73±0,11a 3,61±0,40a

2,03±0,01a 2,05±0,00a

73,40±1,21a 74,05±0,98a

14,69±1,78a 12,62±1,23a

a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes formulações. * Valores em %

34

Os resultados obtidos nas análises de pH e acidez livre titulável estão

apresentados na tabela 3.

Tabela 3. Parâmetros físico-químicos (média ± desvio-padrão) obtidos para os flans F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC), após 1, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento a 5±1°C.

Flans Tempo de armazenamento (Dias)

pH Acidez livre titulável (%)

1 4,98±0,09Aa 0,19±0,02Aa 7 4,50±0,19Ab 0,23±0,02Ab

F1 14 4,23±0,05Ac 0,28±0,03Ac 21 4,26±0,05Acd 0,32±0,03Ad 28 4,05±0,03Ad 0,34±0,03Ad

1 5,08±0,05Aa 0,15±0,01Ba 7 4,30±0,06Ab 0,19±0,01Bb

F2 14 4,22±0,04Ac 0,23±0,02 Bc 21 4,13±0,03Aad 0,27±0,03 Bd 28 4,05±0,04Ae 0,30±0,03 Bd 1 5,18±0,03Aa 0,18±0,02Aa 7 4,42±0,04Ab 0,24±0,02ACb

F3 14 4,28±0,02Ac 0,28±0,03Abc 21 4,18±0,03Ad 0,31±0,03Acd 28 4,13±0,03Be 0,33±0,03ABd 1 4,91±1,02Aa 0,22±0,03Ca 7 4,56±0,34 Aab 0,26±0,03Cb

F4 14 4,26±0,02Ab 0,29±0,01Ac 21 4,22±0,04Ab 0,33±0,02Ad 28 4,18±0,05Bb 0,35±0,03Ad

A,B,C: letras maiúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0,05) entre as diferentes formulações avaliadas no mesmo período de armazenamento. a,b,c,d,e: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes períodos de armazenamento para cada formulação avaliada.

Para todas as formulações, observou-se aumento significativo na acidez ao

longo do armazenamento (p<0,05), provavelmente devido à produção de ácido lático

pelo microrganismo probiótico Lactobacillus acidophilus La-5. No presente trabalho as diferentes concentrações de WPC, não foram o fator

desencadeante da diminuição do pH dos produtos, pois a queda do pH

provavelmente ocorreu devido a produção de ácido lático. Diferentemente, Buriti et

al. (2010) observaram que formulações de mousse produzidas com maior

quantidade de WPC apresentaram aumento significativo no valor do pH.

Os valores de pH apresentaram redução estatisticamente significativa (p<0,05)

35 em todas as formulações durante todo o período de armazenamento dos produtos.

Valores de pH semelhantes foram encontrados em pesquisas realizadas com

sobremesas lácteas adicionadas de microrganismos probióticos. Pereira et al. (2010)

elaboraram um queijo petit-suisse contendo L. acidophilus La-5 e Bifidobacterium sp. BL04 e observaram diminuição do pH (4,84 - 4,45) ao longo do período de

armazenamento dos produtos. Irkin e Guldas (2011) observaram variações de pH

entre 4,0 e 5,0 para pudim de cacau elaborado com os probióticos L. acidophilus LAFTI L10, L. casei LAFTI L26 e Bifidobacterium spp. LAFTI B94.

Patel, Parekh e Subhash (2008) elaboraram um mousse de chocolate probiótico

com L. paracasei NCDC 22, e os valores de pH variaram de 6,57 (primeiro dia) para

5,90 (28º dia), enquanto a acidez variou de 0,27 a 0,71, neste mesmo período.

Da mesma forma, Ribeiro et al. (2012) observaram, em estudo desenvolvido

com petit-suisse adicionado de Lactobacillus acidophilus, um decréscimo gradual

nos valores do pH, igualmente ao observado para as formulações de flan estudadas

neste trabalho.

3 Análises microbiológicas 3.1 Microrganismos indicadores de contaminação coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva, bolores e leveduras

No presente trabalho, optou-se pela não adição de conservantes aos produtos,

para que não ocorresse uma possível interferência desses ingredientes sobre a

viabilidade do microrganismo probiótico La-5. No entanto, a ausência dos

conservantes não provocou comprometimento microbiológico dos produtos

analisados, uma vez que em todas as formulações, não foram detectadas contagens

positivas de bolores e leveduras, bem como de coliformes totais, Escherichia coli e

Staphylococcus coagulase positiva.

3.2 Populações de Lactobacillus acidophilus La-5 As populações da cultura probiótica Lactobacillus acidophilus La-5 obtidas para

os diferentes formulações de flans estudadas estão apresentadas na tabela 4

36

Tabela 4. Populações de Lactobacillus acidophilus La-5 (média ± desvio-padrão) obtidas para os flans F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC), após 1, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento a 5±1°C.

Populações de Lactobacillus acidophilus La-5 (log UFC/g)

Flans Tempo de

armazenamento (dias)

F1* F2 F3 F4

1 9,30±0,02Aa 9,16±0,04Ba 9,19±0,02Ba 9,40±0,05Aa

7 9,08±0,12ABab 8,96±0,09Ab 9,07±0,02Aa 9,26±0,08Ba

14 8,95±0,02Abc 8,94±0,04Ab 8,96±0,01Aab 9,12±0,13Bab

21 8,84±0,22Ac 8,92±0,04Ab 8,71±0,32Ab 8,89±0,41Aab

28 8,53±0,38Ad 8,88±0,05Ab 8,61±0,34Ab 8,61±0,38Ab

* Formulação controle. A,B: letras maiúsculas diferentes sobrescritas na mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes flans avaliados no mesmo período de armazenamento. a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes períodos de armazenamento para cada flan avaliado.

As populações de L. acidophilus La-5 mantiveram-se acima do mínimo exigido

pela legislação brasileira, que preconiza o mínimo de 6 log UFC de probiótico por

grama de alimento, durante toda sua vida de prateleira (ANVISA, 2008), embora

todas as formulações tenham apresentado redução estatisticamente significativa ao

longo do armazenamento (p<0,05).

Na última semana de armazenamento o microrganismo probiótico ainda se

manteve no padrão exigido, apresentando populações de 8,53 log UFC/g; 8,88 log

UFC/g; 8,61 log UFC/g e 8,61, para F1, F2, F3 e F4, respectivamente. Quando as

amostras foram comparadas entre si, as formulações F1 e F4 apresentaram as

maiores populações de La-5, F1 no dia 1, e F4 nos dias 7 e 14 (p<0,05).

Diferente dos resultados obtidos neste trabalho, no qual o WPC não exerceu

função importante para a multiplicação de La-5, alguns estudos demostraram que a

adição de WPC em leite fermentado contribui para a viabilidade de microrganismos

probióticos, por contribuir com nutrientes necessários como peptídeos e aminoácidos

para a multiplicação dos probióticos (JANER; PELÁEZ; REQUENA, 2004; MARTÍN-

DIANA et al., 2003).

Os resultados obtidos estão de acordo com trabalhos que desenvolveram

37 sobremesas lácteas probióticas. Helland Wicklund e Narvhus (2004) obtiveram

populações de L. acidophilus La - 5, variando entre 7 e 8 log UFC/g em pudins

armazenados sob refrigeração (4-6°C) durante 21 dias. Silva et al. (2012)

elaboraram um flan de chocolate e encontraram populações de L. casei de 109

UFC/g durante 15 dias de armazenamento a 4°C.

Além dos efeitos benéficos que o WPC pode proporcionar a saúde quando

adicionados aos alimentos, ele também pode aumentar a tolerância das bactérias

probióticas durante a passagem pelo trato gastrintestinal. Kos et al. (2000)

concluíram que o WPC exerceu efeito protetor sobre a cepa La-5, sugerindo que a

adição de WPC a um alimento com microrganismo probiótico pode auxiliar a manter

sua viabilidade durante o processo digestivo, fazendo com que os microrganismos

cheguem viáveis até seu local principal de ação, o intestino.

3.3 Análise de textura instrumental Os resultados obtidos na análise de textura instrumental para os parâmetros

dureza e adesividade estão apresentados na tabela 5.

Os testes instrumentais de textura são baseados em força de compressão,

simulando assim a mastigação entre os molares, quando características de textura,

como consistência e adesão ao palato são percebidas. A dureza ou firmeza

representa a força necessária para comprimir o alimento entre os dentes molares ou

entre a língua e o palato. A adesividade define-se como a força necessária para a

remoção do alimento que aderiu ao palato, lábios e dentes durante a mastigação

(FOX; GUINCE; McSWEENEY, 2000).

As formulações F1, F2, F3 e F4 apresentaram aumentos significativos da dureza

durante todo período de armazenamento. A formulação F4, apresentou valores de

dureza significativamente mais elevados quando comparada às formulações F1, F2

e F3, provavelmente devido à maior porcentagem de WPC adicionado nesta

formulação (4,5%).

38 Tabela 5. Análise de textura (média ± desvio-padrão) obtidos para os flans F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC), após 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento a 5±1°C.

Flans Tempo de armazenamento (Dias)

Dureza (N)

Adesividade (mJ)

F1 7 1,70±0,06Aa 0,05±0,06Aa 14 2,09±0,44Aab 0,20±0,14Ab 21 2,67±0,26Ab 0,25±0,17Ab 28 2,51±0,14Ab 0,10±0,08Ac

F2 7 1,86±0,18Aa 0,18±0,05Ba 14 1,31±0,08Bb 0,25±0,26Aa 21 1,65±0,17Ba 0,25±0,13Aa 28 2,37±0,13Ac 0,55±0,54Bb

F3 7 1,77±0,10Aa 0,70±0,22Ca 14 1,82±0,09Aa 0,80±0,52Ba 21 2,01±0,18Bab 1,80±0,54Bb 28 2,12±0,14Ab 0,80±0,23Ca

F4 7 4,69± 0,33Ba 1,98±0,83Da 14 5,49±0,29Bb 1,80±0,26Ca 21 5,10±0,28Cc 1,58±0,28Cb 28 5,03±0,41Cc 2,58±1,83Dc * Formulação controle. A,B,C,D: letras maiúsculas diferentes sobrescritas na mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes flans avaliados no mesmo período de armazenamento. a,b,c: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0,05) entre os diferentes períodos de armazenamento para cada flan avaliado.

Antunes, Motta e Antunes (2003) descreveram que o aumento da concentração

proteica nos alimentos promove o aumento da dureza, sendo assim quanto maior a

quantidade de WPC, maior será a força necessária para a ruptura do gel.

Vidigal et al. (2012) avaliaram a influência do WPC na qualidade sensorial de

sobremesa láctea diet e os resultados relativos ao atributo dureza foram

semelhantes ao presente estudo. Os autores observaram um aumento da

intensidade do atributo dureza devido ao aumento da concentração de WPC.

Diferentemente dos resultados obtidos neste estudo, e nos estudos descritos

anteriormente, Ohata et al. (2005) avaliaram a adição de WPC em mousse de

maracujá e concluíram que quanto maior a concentração de WPC, maior a

quantidade de ar incorporado ao alimento e consequentemente menor a firmeza do

produto.

Para o atributo adesividade todas as formulações apresentaram aumento

39 significativo durante todo período de armazenamento (p<0,05). Os valores de

adesividade observados para a formulação F4 foram mais elevados que as demais

formulações. Provavelmente, tal fato também se deve à maior concentração de WPC

na formulação.

A adição de WPC em diferentes porcentagens nas formulações resultou em

diferenças na textura instrumental, principalmente para F4, devido às propriedades

das proteínas do soro. Sabe-se que uma das principais propriedades destas

proteínas é a capacidade de gelatinização, processo que ocorre com a agregação

de proteínas (interações proteína-proteína), gerando, portanto um produto mais

firme, que varia conforme a quantidade de proteína (ANTUNES, 2003).

3.4 Análise sensorial Os valores médios das notas atribuídas pelos provadores na análise sensorial às

diferentes formulações de flans avaliadas após 7 e 14 dias de armazenamento

refrigerado são apresentados na tabela 6.

Tabela 6. Média das notas (média ± desvio padrão)* obtidas na análise sensorial realizada após 7 e 14 dias de armazenamento refrigerado (5±1ºC) dos flans F1 (controle, sem adição de WPC), F2 (1,5% de WPC), F3 (3% de WPC) e F4 (4,5% de WPC).

Formulação Período de armazenamento (Dias)

7 14 F1 F2

7,62±1,26Aa 7,66±1,33Aa

7,73±1,08Aa 7,50±1,27Aa

F3 7,26±1,27Aa 7,46±1,40Aa F4 6,88±1,47Aa 7,76±1,12Aa

* Média das notas apresentadas por 50 provadores para cada flan em cada período de armazenamento. A: letras maiúsculas iguais sobrescritas na mesma coluna indicam que não houve diferenças significativas (p>0,05) entre as diferentes formulações em cada período de armazenamento (7 e 14 dias). a: letras minúsculas iguais sobrescritas na mesma linha indicam que não houve diferenças significativas (p>0,05) para uma mesma formulação após 7 e 14 dias de armazenamento refrigerado.

Mesmo não sendo detectados microrganismos contaminantes em todas as

formulações a analise sensorial foi realizada somente ate o 14º dia, para garantir a

segurança dos provadores, pois os produtos desenvolvidos não continham

conservantes.

40

Os resultados obtidos demostraram que todas as formulações foram bem

aceitas pelos provadores, pois as notas médias variaram de 6 a 7, o que

corresponde, na escala hedônica às classificações “gostei ligeiramente” a “gostei

regularmente”, respectivamente. Não houve diferença significativa de aceitação

entre as amostras para um mesmo período de armazenamento (p>0,05). Da mesma

forma, quando as formulações foram avaliadas ao longo do período de

armazenamento (7 e 14 dias), também não foram detectadas diferenças

estatisticamente significativas (p>0,05). Dessa forma, a adição de diferentes

concentrações de WPC, não afetou na aceitabilidade dos flans estudados neste

trabalho. Diferentemente, Nikaedo, Amaral e Penna (2004), em seu trabalho de

caracterização tecnológica de sobremesas lácteas achocolatas contendo proteína do

soro e mistura de gomas, observaram que a formulação contendo menor quantidade

de WPC, foi considerada melhor entre os provadores.

Com relação à frequência de distribuição das notas, nos dias 7 e 14, a

porcentagem de notas que estavam acima de 5 (“não gostei nem desgostei”) foram

96% e 98%, respectivamente (Figuras 2 e 3).

Figura 2. Frequência das notas obtidas na análise sensorial realizada após 7 dias de armazenamento refrigerado (5±1ºC) dos flans F1 a F4. Veja a Tabela 1 para descrição das formulações.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Freq

ueên

cia

das

nota

s

Notas

F1 F2 F3 F4

41

Figura 3. Frequência das notas obtidas na análise sensorial realizada após 14 dias de armazenamento refrigerado (5±1ºC) dos flans F1 a F4. Veja a Tabela 1 para descrição das formulações.

Muitos provadores fizeram comentários quanto a textura mais firme da

formulação F4, isto mostra que a diferença na concentração de WPC, promoveu a

percepção de maior firmeza por parte dos provadores, resultados também

verificados nas determinações de dureza instrumental (Tabela 5).

Os resultados indicaram que todas as formulações obtiveram desempenho

sensorial parecidos no 7º e 14º dia, sem diferença estatisticamente significativa

(p>0,05), indicando que as diferentes concentrações de WPC não interferiram na

aceitação sensorial dos produtos.

De acordo com Souza et al. (2013) para que o produto seja considerado aceito

por suas propriedades sensoriais e importante que o mesmo obtenha um índice de

aceitabilidade de no mínimo 70%. Pelos dados relatados anteriormente quanto a

intenção de compra do produto, todas as formulações tiveram excelente

aceitabilidade.

Quanto à intenção de compra dos produtos, no 7º dia, a porcentagem de

provadores que afirmaram que comprariam os produtos foram 84%, 90%, 76% e

74%, para F1, F2, F3 e F4, respectivamente. Para o 14º dia, as porcentagens de

provadores que afirmaram que comprariam os flans F1, F2, F3 e F4 foram 85%,

90%, 80% e 88%, respectivamente.

Ares, Gimenes e Gambaro, (2008) descreveram que pessoas com maior

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Freq

uênc

ia d

as n

otas

Notas

F1 F2 F3 F4

42 conhecimento nutricional, tem maior intenção de compra por alimentos funcionais.

Resultados de elevados valores de aceitabilidade ocorrem quando há expectativas

de benefícios para a saúde (CROWLEY; GABOURY; WITT, 2002).

5. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos revelaram que a cepa probiótica Lactobacillus acidophilus La-5 apresentou excelente adaptação à matriz do flan, uma vez que as

populações obtidas para esse microrganismo estavam acima do mínimo exigido pela

legislação brasileira vigente para alimentos probióticos durante todo o

armazenamento, para as quatro formulações estudadas. A obtenção de uma

sobremesa probiótica enriquecida com o WPC é possível, pois a adição do mesmo

não influenciou negativamente as populações de La-5, e também não interferiu

quanto à aceitação sensorial do produto, embora algumas formulações tenham se

apresentado mais firmes, em função da presença de maiores concentrações de

WPC.

6. REFERÊNCIAS

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48 7 ANEXO

7.1 PROTOCOLO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA

UNIVERSIDADE NORTE DO PARANÁ (PARECER Nº 579.932)

49

50

51

52

7.2 MODELO DE FICHA UTILIZADA NA ANÁLISE SENSORIAL

Nome:………....................………………………………………………........Data:..…/...…/...…

Amostra ..........

Você está recebendo uma amostra de flan. Por favor, prove a amostra, e em seguida, avalie usando a

escala abaixo para descrever o quanto você gostou ou desgostou do produto.

1 - Desgostei muitíssimo

2 - Desgostei muito

3 - Desgostei regularmente

4 - Desgostei ligeiramente

5 - Não gostei nem desgostei

6 - Gostei ligeiramente

7 - Gostei regularmente

8 - Gostei muito

9 - Gostei muitíssimo

O que você mais gostou na amostra?.......................................................................................................

O que você menos gostou na amostra?....................................................................................................

Comentários:........................................................................................................................ .....................

..................................................................................................................................................................

Intenção de compra.

Você compraria o produto?

( ) Sim

( ) Não

Obrigada pela sua participação!!!