Embed Size (px)
Citation preview
AKTIVITAS DAN SEKUEN PEPTIDA ACE INHIBITOR
SUSU KERBAU (Bubalus bubalis) FERMENTASI
SKRIPSI
MUHAMAD ROSIDI AFRIYANSAH
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2019 M/ 1440 H
AKTIVITAS DAN SEKUEN PEPTIDA ACE INHIBITOR
SUSU KERBAU (Bubalus bubalis) FERMENTASI
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
MUHAMAD ROSIDI AFRIYANSAH
11140960000047
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA 2018 M / 1439 H
ABSTRAK
MUHAMAD ROSIDI AFRIYANSAH. Aktivitas dan Sekuen Peptida ACE
inhibitor Susu Kerbau (Bubalus bubalis) Fermentasi. Dibimbing oleh SRI
YADIAL CHALID dan SITI NURBAYTI.
Dadih diketahui memiliki berbagai macam manfaat biologis, yaitu antioksidan,
antibakteri, dan ACE inhibitor. Manfaat dadih yang menarik perhatian yaitu
sebagai ACE inhibitor dengan menghambat kerja angiotensin converting enzim
(ACE) yang berperan penting dalam pengaturan tekanan darah. Penelitian ini
bertujuan untuk menentukan aktivitas ACE inhibitor dengan metode hippuryl-
histidyl-leucine menggunakan spektrofotometer UV-Visible. Purifikasi peptida
ACE inhibitor dengan menggunakan high performance liquid chromatography
dengan mode reversed-phase. Peptida ACE inhibitor ditentukan sekuen asam
amino dengan menggunakan liquid chromatography mass spectroscopy-QP2020
dan protein sequencer PPSQ-31A. Delapan peptida yang berhasil dipurifikasi dari
susu kerbau fermentasi. Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln dengan
massa molekul sebesar 727 Da merupakan fragmen dari κ-kasein f87-93 yang
memiliki aktivitas ACE inhibitor tertinggi mencapai 93,101 % dan memiliki nilai
IC50 sebesar 42,0199 µM. Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln merupakan sekuen novel
peptida ACE inhibitor yang belum pernah dilaporkan.
Kata kunci: Peptida ACE inhibitor, dadih, Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln, susu
kerbau.
7
ABSTRACT
MUHAMAD ROSIDI AFRIYANSAH. Activity and Sequence of ACE
inhibitory Peptide of Fermented Buffalo Milk (Bubalus bubalis). Supervised by
SRI YADIAL CHALID and SITI NURBAYTI.
Dadih was known to has various biological benefits, such as antioxidants,
antibacterials, and ACE inhibitors. Dadih as ACE inhibitor interested in this
research. Function of dadih as ACE inhibitor was done by bioactive peptides. This
study aims to determine ACE inhibitory activity by hippuryl-histidyl-leucine
method using UV-Visible spectrophotometer. Purification of ACE inhibitory
peptide is using high performance liquid chromatography in reversed-phase mode.
ACE inhibitory peptide determined amino acid sequences using liquid
chromatography mass spectroscopy-QP2020 and Protein Sequencer PPSQ-31A.
Eight peptides that successfully purified from fermented buffalo milk and
heptapeptide Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln with molecular mass of 727 Da was a
fragment of κ-casein-f87-93 became peptide with high inhibition activity reached
93,101 % and had IC50 value amount 42,0199 µM, whereas Ala-Val-Arg-Ser-Pro-
Ala-Gln is sequence of novel ACE inhibitory peptide.
Keywords: ACE inhibitory peptide, dadih, Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln, buffalo
milk.
viii
KATA PENGANTAR
Bismillahirrahmaanirrohim
Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh
Alhamdulillahi Robbil ‘Aalamin. Puji dan syukur penulis haturkan
kehadirat Allah SWT, karena atas rahmat dan karunia-Nya penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga selalu
dilimpahkan kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW. Penelitian berjudul
Aktivitas dan Sekuen Peptida ACE Inhibitor dari Susu Kerbau (Bubalus
bubalis) Fermentasi yang dilakukan di Laboratorium Fungsi dan Keamanan
Hewan, Fakultas Ilmu Hewan, Sekolah Kedokteran Hewan, Universitas Kitasato,
Jepang. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat kelulusan dalam menempuh
pendidikan Strata 1 (S1). Dalam penulisan skripsi ini, penulis mendapat banyak
bantuan, bimbingan, dan arahan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, dalam
kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terimakasih kepada:
1. Dr. Sri Yadial Chalid, M.Si. selaku pembimbing I yang senantiasa
memberikan ilmu pengetahuan, pengalaman, bimbingan, nasihat, motivasi,
arahan kepada penulis, dan juga kesempatan kepada penulis untuk menimba
ilmu di Universitas Kitasato, Towada, Jepang.
2. Dr. Siti Nurbayti, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberikan ilmu
pengetahuan, dukungan, bimbingan, nasihat, pengalaman dan arahan kepada
penulis selama penelitian ini.
3. Prof. Keizo Arihara, Ph.D selaku pembimbing selama penelitian di
Laboratorium Fungsi dan Keamanan Pangan, Fakultas Ilmu Hewan, Sekolah
Kedokteran Hewan, Universitas Kitasato, Jepang yang senantiasa
memberikan ilmu dan bimbingannya selama penelitian.
4. Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku ketua prodi kimia Fakultas Sains dan
Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
5. Dr. Agus Salim, M.Si. selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta.
6. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si selaku pembimbing akademik, atas bimbingan,
dukungan, dan masukannya selama perkuliahan.
ix
7. Kedua orangtua, Asmaka Gunawan dan Wasirah yang selalu memberikan
dukungan kepada penulis baik secara materil maupun moril, dan juga selalu
memberikan semangat dan motivasi kepada penulis.
8. Farhan R. A., M. Rusydi H., Isni S., Deni P., M. Fajar dan teman-teman
Program Studi Kimia UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2014 yang
selalu memberikan semangat, doa, dan motivasi bagi penulis.
9. Dimas A. N., Rahmat H., M. Syauqi, M. Alfatih H. dan teman-teman
Program Studi Kimia UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2016 yang
selalu memberikan semangat, doa, dan motivasi bagi penulis.
10. Issei Yokoyama, Hiroshi Sekiguchi, Komiya Yusuke, dan teman-teman di
Laboratorium Fungsi dan Keamanan Pangan, Fakultas Ilmu Hewan, Sekolah
Kedokteran Hewan, Universitas Kitasato, Jepang.
11. Seluruh staff laboratorium kimia Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan dukungan.
Penulis berharap semoga skripsi ini bisa bermafaat bagi kita semua.
Jakarta, Januari 2019
Penulis
x
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii
DAFTAR ISI. ......................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ................................................................................................. 1
1.2 Rumus Masalah ................................................................................................ 5
1.3 Hipotesis .......................................................................................................... 5
1.4 Tujuan .............................................................................................................. 6
1.5 Manfaat ............................................................................................................ 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 7
2.1 Dadih ................................................................................................................ 7
2.2 Peptida Bioaktif ............................................................................................... 9
2.3 Hipertensi ....................................................................................................... 12
2.4 Antihipertensi ................................................................................................. 14
2.5 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor ................................................................... 17
2.6 Peptide Sequencing ........................................................................................ 23
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 27
3.1 Waktu dan Tempat ......................................................................................... 27
3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................... 27
3.3 Diagram Alir Penelitian ................................................................................. 29
3.4 Prosedur Penelitian ........................................................................................ 30
3.4.1 Preparasi Sampel ..................................................................................... 30
3.4.2 Ekstraksi Peptida Fraksi Larut Air (water soluble fractions) .................. 30
3.4.3 Fraksinasi Etanol Bertingkat ................................................................... 31
3.4.4 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor ............................................................ 31
3.4.5 Identifikasi Sekuen Peptida ACE Inhibitor ............................................. 34
xi
3.4.6 Uji Aktivitas ACE Inhibitor secara in Vitro ............................................ 35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 37
4.1 Dadih dan Aktivitas ACE Inhibitor Fraksi Air .............................................. 37
4.1.1 Karakteristik Dadih ................................................................................. 37
4.2.2 Aktivitas ACE Inhibitor Fraksi Air ......................................................... 39
4.2 Fraksinasi Etanol Bertingkat .......................................................................... 41
4.3 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor ................................................................... 44
4.3.1 Ekstraksi Fase Padat (SPE) ..................................................................... 44
4.3.2 Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography ................ 47
4.4 Peptida ACE Inhibitor ................................................................................... 50
4.4.1 Penentuan Sekuen Peptida ACE Inhibitor .............................................. 50
4.4.2 Peptida Sintesis ........................................................................................ 56
4.5 Mekanisme Reaksi Degradasi Edman Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln........... 61
BAB V PENUTUP ............................................................................................... 66
5.1 Simpulan ........................................................................................................ 66
5.2 Saran .............................................................................................................. 66
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 67
LAMPIRAN.. ....................................................................................................... 76
xii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. (a) Proses pembuatan dadih; (b) Dadih .............................................. 7
Gambar 2. Fungsi peptida bioaktif yang berasal dari protein susu dan target
kesehatan potensial .......................................................................... 11
Gambar 3. Reaksi pengubahan angiotensin I menjadi angiotensin II ................ 13
Gambar 4. Penghambatan ACE oleh penghambat ACE (ACE inhibitor) .......... 15
Gambar 5. Reaksi hidrolisis HHL oleh ACE ..................................................... 16
Gambar 6. Sejarah perkembangan metode ekstraksi fase padat ......................... 19
Gambar 7. Skema alat HPLC ............................................................................. 22
Gambar 8. Diagram sekuenator protein .............................................................. 24
Gambar 9. Mekanisme reaksi degradasi Edman ................................................ 26
Gambar 10. Diagram alir penelitian .................................................................... 29
Gambar 11. Susu kerbau fermentasi (dadih) yang telah di-freeze dry ................ 37
Gambar 12. Aktivitas ACE inhibitor fraksi etanol .............................................. 42
Gambar 13. Aktivitas ACE inhibitor fraksi metanol hasil ektraksi fase padat .... 46
Gambar 14. Data spektoskopi massa fraksi BIV-3…………………………....... 51
Gambar 15. Urutan protein induk κ-Kasein Susu Kerbau (Bubalus bubalis) ..... 53
Gambar 16. Aktivitas ACE inhibitor peptida sintesis ......................................... 57
Gambar 17. Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (A), captopril (B) dan
lisinopril (C) .................................................................................... 58
Gambar 18. Reaksi PITC dengan heptapetida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln .... 62
Gambar 19. Siklisasi katalitik asam senyawa intermediet feniltiourea ............... 63
Gambar 20. Reaksi penguraian derivat feniltiourea menjadi anilin-
metiltiazolinon dan heksapeptida Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln .......... 64
Gambar 21. Penataan ulang derivatif ATZ membentuk PTH-alanin .................. 65
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Perbandingan komposisi susu kerbau dan sapi ........................................ 8
Tabel 2. Kandungan asam amino dadih ................................................................. 8
Tabel 3. Bioaktivitas sekuen dan sumber peptida ................................................ 10
Tabel 4. Urutan/sekuen asam amino peptida ACE inhibitor dari susu dan
produk fermentasinya.............................................................................. 12
Tabel 5. Tingkat kemampuan ACE inhibitor ....................................................... 17
Tabel 6. Perbandingan format alat yang digunakan dalam ekstraksi fase padat .. 20
Tabel 7. Fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi dari setiap analit ......... 48
Tabel 8. Data seluruh fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi hasil
fraksinasi 2 (HPLC tahap 2, fraksinasi 2) ............................................... 49
Tabel 9. Data hasil analisa sekensing peptida ACE inhibitor Fraksi BIV-3 ......... 52
Tabel 10. Data estimasi sekuen peptida ACE inhibitor fraksi BIV-3 ................... 53
Tabel 11. Data sekuen peptida ACE inihibitor .................................................... 54
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil freeze dry susu kerbau fermentasi ........................................ 76
Lampiran 2. Data analisis RP-HPLC dan LCMS dari eluat katrid HLB ........... 77
Lampiran 3. Data aktivitas ACE inhibitor fraksi air .......................................... 80
Lampiran 4. Data aktivitas ACE inhibitor fraksi etanol ..................................... 81
Lampiran 5. Data aktivitas ACE inhibitor eluat katrid HLB metanol ................ 82
Lampiran 6. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap
pertama ............................................................................................. 83
Lampiran 7. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap
kedua ................................................................................................ 85
Lampiran 8. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap
ketiga ................................................................................................ 88
Lampiran 9. Data aktivitas ACE inhibitor oleh peptida sintesis ......................... 89
Lampiran 10. Data aktivitas ACE inhibitor heptapeptida AVRSPAQ ............... 90
Lampiran 11. Prosedur penambahan bahan uji aktivitas ACE inhibitor ............. 91
Lampiran 12. Data aktivitas ACE inhibitor susu fermentasi menggunakan
BAL berbeda .................................................................................... 92
Lampiran 13. Data spektroskopi massa fraksi BIV-3 ......................................... 93
Lampiran 14. Pembuatan Larutan Substrat HHL 7,6 mM dan NaCl 608 mM
sebanyak 5 mL (35 tabung uji) ........................................................ 94
Lampiran 15. Pembuatan larutan BSA dan larutan ACE .................................... 95
Lampiran 16. Produk degradasi Edman dari heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-
Ala-Gln ............................................................................................. 96
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Hipertensi merupakan suatu penyakit yang dikenal luas sebagai penyakit
kardiovaskular di mana kondisi tekanan darah sistolik di atas 140 mmHg dan
tekanan darah diastolik di atas 90 mmHg. Tekanan darah sistolik normal yaitu 120
dan tekanan darah diastolik yaitu 80 mmHg. Penyakit hipertensi juga diketahui
sebagai silent killer (WHO, 2012). Sebanyak 45% kematian karena penyakit
jantung dan 51% kematian karena stroke disebabkan oleh penyakit hipertensi
(WHO, 2013). Prevalensi hipertensi yang terus meningkat setiap tahunnya
menjadi masalah utama pada negara berkembang dan negara maju (Fitrianto et al.,
2014). Prevalensi hipertensi di dunia sebesar 40%, sementara di Indonesia
prevalensi hipertensi berada pada persentase 26,5% (Badan Penelitian dan
Pengembangan Kesehatan; WHO, 2013). Prevalensi hipertensi diprediksi akan
meningkat dalam beberapa tahun mendatang, sehingga diperlukan tindakan untuk
menanggulanginya.
Terapi penyakit hipertensi adalah dengan menggunakan obat-obatan
golongan diuretik atau kombinasi obat-obatan golongan diuretik dan ACE
inhibitor. Obat golongan diuretik yang sering digunakan adalah hidroklorotiazid
dan furosemid (Fitrianto et al., 2014). Obat golongan ACE inhibitor sintesis
seperti captopril, enalapril, dan lisinopril (Natesh et al., 2004). Penggunaan obat-
obatan antihipertensi sintesis dapat menimbulkan efek samping yang dapat
mempengaruhi kesehatan penderita, seperti alergi, batuk kering, tidak nafsu
makan dan gangguan ginjal (Pan et al., 2016).
2
Tindakan pencegahan yang lebih aman dapat dilakukan dengan cara
mengkonsumsi makanan dan minuman yang memiliki kemampuan sebagai
antihipertensi atau menghambat kerja ACE di dalam tubuh. Makanan, minuman
dan sumber pangan tinggi protein yang difermentasi maupun diproses dengan
menggunakan enzim memiliki khasiat sebagai ACE inhibitor dan antihipertensi,
seperti kacang kedelai fermentasi (Okamoto et al., 1995), hidrolisat berbagai
macam daging (Arihara et al., 2001; Mirdhayati et al., 2016; Stadnik dan Keska,
2015), hidrolisat protein ikan (Ghassem et al., 2013; Wu et al., 2008), hidrolisat
protein susu kerbau (Abdel-Hamid et al., 2017), hidrolisat protein susu sapi
(Abubakar, 2004), susu fermentasi (Chen et al., 2014; Saito et al., 2000) dan
organisme laut (Lee dan Hur, 2017; Pan et al., 2016).
Susu merupakan salah satu produk peternakan yang diketahui memiliki
banyak manfaat, seperti yang telah disebutkan dalam Al Qur’an Surah Al-
Mu’minun ayat 21:
ا في بطونها ولكم فيها منافع كثيرة ومنها وإن لكم في النعام لعبرة نسقيكم مم
تأكلون
Artinya: Dan sungguh pada hewan-hewan ternak terdapat suatu
pembelajaran bagimu. Kami memberi minum kamu dari (air susu) yang ada dalam
perutnya, dan padanya juga terdapat banyak manfaat untukmu, dan sebagian
darinya kamu makan (QS Al-Mu’minun: 21).
Surah Al-Mu’minun ayat 21 ini menjelaskan bahwa susu yang dihasilkan
oleh hewan ternak memiliki manfaat bagi kesehatan manusia, yaitu sebagai
sumber protein, peptida bioaktif, kalsium, dan fosfor. Beberapa manfaat dari susu
sebagai pangan fungsional dapat ditingkatkan dengan cara fermentasi. Penelitian
3
mengenai manfaat dari susu fermentasi diantaranya sebagai anti-inflamasi, anti-
hemolitik, antimutagenik, antimikroba (Peres et al., 2017), antioksidan (Chalid
dan Hartiningsih, 2013; Mann dan Hati, 2017), antihipertensi (ACE inhibitor)
(Abdel-Hamid et al., 2017; Chen et al., 2014; Saito et al., 2000), antitumor (Biffi
et al., 1997), dan imunomodulator (LeBlanc et al., 2002). Manfaat susu
fermentasi sebagai ACE inhibitor menjadi fokus pada penelitian ini, di mana
peptida ACE inhibitor dari susu fermentasi merupakan target penelitian.
Yamamoto et al. (1999) menemukan 3 sekuen peptida ACE inhibitor dari
susu yang difermentasi dengan Lactobacillus helveticus CPN4. Peptida ACE
inhibitor yang ditemukan yaitu Tyr-Pro, Ile-Pro-Pro dan Val-Pro-Pro dengan
nilai IC50 masing-masing sebesar 720 µM, 5 µM dan 9 µM. Li et al. (2015) juga
mengidentifikasi dua peptida ACE inhibitor baru dari susu fermentasi dengan
kapang Kluyveromyces marxianus. Sekuen peptida ACE inhibitor baru yaitu Val-
Leu-Ser-Arg-Tyr-Pro dan Leu-Arg-Phe-Phe masing-masing memiliki nilai IC50
sebesar 36,7 µM dan 116,9 µM, serta memiliki massa molekul sebesar 734,5 Da
dan 582,4 Da.
Abdel-Hamid et al. (2017) menemukan bahwa retentat susu kerbau skim
yang dihidrolisis dengan enzim papain menghasilkan peptida ACE inhibitor baru
dengan sekuen Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Lys, Ile-Pro-Pro-Lys, Ile-Val-Pro-Asn,
dan Gln-Pro-Pro-Gln. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa sekuen peptida
ACE inhibitor terdiri atas 2-8 asam amino, residu prolin pada sekuen peptida,
memiliki residu asam amino hidrofobik (valin, leusin, isoleusin dan fenilalanin),
massa molekul peptida kurang dari 1 kDa, dan memiliki aktivitas ACE inhibitor
dengan nilai IC50 kurang dari 100 µM. Penelitian tentang sekuen peptida ACE
4
inhibitor juga lebih banyak dilakukan dengan menggunakan susu sapi fermentasi,
sementara susu fermentasi ternak lain seperti kerbau masih belum banyak diteliti.
Kandungan protein susu kerbau (kasein 3,2 % dan protein whey 0,6 %) lebih
tinggi dibandingkan dengan protein susu sapi (kasein 2,8 % dan protein whey 0,6
%) (Surono, 2015a). Tingginya kadar kasein susu kerbau menjadi potensi sebagai
sumber peptida bioaktif hasil degradasi protein secara enzimatik, maupun
fermentasi menggunakan mikroorganisme.
Dadih merupakan susu kerbau fermentasi secara spontan pada tabung
bambu. Fermentasi dilakukan oleh bakteri asam laktat (BAL) spesies
Lactobacillus casei subsp. casei dan Lactobacillus plantarum yang berasal dari
tabung bambu dan daun pisang penutup bambu (Imai et al., 1987). Fermentasi
berlangsung selama 48 jam (Sugitha, 1995; Surono, 2015a). Dadih terbukti secara
in vitro mempunyai aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 44,86 ppm
(Chalid dan Hartiningsih, 2013). Protein dadih fraksi <3 kDa juga dilaporkan
memiliki aktivitas ACE inhibitor sebesar 99,3 % (Chalid et al., 2018).
Aktivitas antibakteri juga ditunjukkan oleh dadih dengan efektivitas
penghambatan bakteri sebesar 66,46 % untuk E. coli dan 84,27 % untuk S. aureus
(Soenarno et al., 2013). Penelitian tentang potensi dadih sebagai pangan
fungsional masih terbatas, sehingga peneliti tertarik mengetahui lebih lanjut
potensi dadih untuk dikembangkan sebagai pangan fungsional dengan manfaat
menurunkan tekanan darah tinggi.
Penelitian yang dilakukan meliputi proses ekstraksi peptida dadih dengan
air, fraksinasi dengan etanol secara bertingkat, ektraksi fase padat dengan katrid
HLB Oasis®, pemurnian peptida ACE inhibitor dengan RP-HPLC, penentuan
5
sekuen peptida ACE inhibitor metode Degradasi Edman, dan pengujian aktivitas
ACE inhibitor. Pemurnian dan identifikasi sekuen peptida ACE inhibitor
dilakukan berdasarkan dengan metode Jang dan Lee (2005). Nilai penghambatan
peptida dadih diuji dengan metode Cushman dan Cheung (1971) yang
dimodifikasi oleh Arihara et al. (2001).
1.2 Rumusan Masalah
1. Berapa massa molekul peptida ACE inhibitor hasil purifikasi susu
kerbau fermentasi?
2. Bagaimana sekuen peptida ACE inhibitor hasil purifikasi susu kerbau
fermentasi?
3. Bagaimana aktivitas ACE inhibitor dari peptida ACE inhibitor dari
susu kerbau fermentasi?
1.3 Hipotesis
1. Massa molekul peptida ACE inhibitor yang berhasil dipurifikasi dari
dadih susu kerbau sebesar kurang dari 1 kDa.
2. Sekuen peptida ACE inhibitor dari dadih susu kerbau terdiri atas 3-10
molekul asam amino dan terdapat residu prolin (Pro) atau asam amino
hidrofobik terminal-N pada sekuen peptidanya.
3. Aktivitas ACE inhibitor dari peptida hasil purifikasi susu kerbau
fermentasi memiliki aktivitas ACE inhibitor yang bagus dengan nilai
IC50 di bawah 100 µM.
6
1.4 Tujuan
1. Menentukan massa molekul peptida ACE inhibitor susu kerbau
fermentasi.
2. Menentukan sekuen peptida ACE inhibitor dari susu kerbau
fermentasi.
3. Menentukan aktivitas peptida ACE inhibitor susu kerbau fermentasi.
1.5 Manfaat
Penelitian ini dapat memberikan informasi mengenai potensi dadih sebagai
pangan fungsional yang memiliki kemampuan untuk mencegah penyakit
hipertensi.
7
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Dadih
Dadih adalah salah satu jenis produk olahan susu kerbau yang merupakan
kearifan lokal dari Sumatera Barat dan memiliki potensi menjadi pangan
fungsional (Chalid dan Hartiningsih, 2013). Masyarakat asli Sumatera Barat
menyebutnya dengan nama dadiah. Dadih banyak dikenal oleh masyarakat
Sumatera Barat, Bengkulu, Jambi (Afriani dan Rahayu, 2009; Surono dan
Hosono, 1996). Umumnya dadih dikonsumsi oleh masyarakat Sumatra Barat
sebagai lauk dan makanan selingan (Surono, 2016).
Gambar 1. (a) Proses pembuatan dadih; (b) Dadih (Surono, 2015b)
Dadih dibuat secara tradisional dari susu kerbau (Bubalus bubalis) dituang
ke dalam bambu (Gambar 1) dan kemudian ditutup dengan daun pisang yang
dilayukan, serta dibiarkan mengalami fermentasi secara alami pada suhu ruang
selama 24 – 48 jam (Sugitha, 1995; Surono, 2015a). Proses fermentasi susu
kerbau dilakukan pada suhu ruang (26 – 27oC) dan menghasilkan dadih berupa
gumpalan. Pembuatan dadih tidak melalui proses pasteurisasi pada susu kerbau
dan tanpa penambahan kultur starter (Surono, 2015a, 2015b).
Susu kerbau yang menjadi bahan utama pembuatan dadih ini
menyebabkan produk yang dihasilkan lebih tebal dan kental, karena kandungan
8
padatan total lebih tinggi dibandingkan dengan susu sapi. Hal ini juga sebagai
konsekuensi dari kandungan lemak dan kasein yang lebih tinggi dalam susu
kerbau (Tabel 1.) (Surono, 2015a). Kualitas dadih yang baik yaitu berwarna putih,
konsistensi menyerupai yoghurt, serta memiliki aroma susu asam yang khas
(Usmiati et al., 2011), memiliki ketebalan dan kekentalan yang berbeda, tekstur
yang lembut, rasa yang enak, dan memiliki kebaruan dari segi nutrisi seperti
peptida bioaktif (Surono, 2016).
Tabel 1. Perbandingan komposisi susu kerbau dan sapi
Kandungan Persentase komposisi susu (%)
Sapi Kerbau
Lemak 3,7 7,4
Kasein 2,8 3,2
Protein Whey 0,6 0,6
Laktosa 4,8 4,8
Abu 0,7 0,8
Padatan Total 12,7 17,2
Sumber : Surono, 2015a
Soenarno et al. (2013) menemukan bahwa kandungan bakteri asam laktat
(BAL) yaitu sebanyak 2,8 x 105 cfu/g (colony forming unit per-gram). Dadih
memiliki aktivitas antibakteri dengan efektivitas penghambatan bakteri sebesar
66,46 % terhadap E. coli dan 84,27 % terhadap S. aureus. Kandungan asam amino
dadih ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Kandungan asam amino dadih
Asam Amino Persentase (%) Asam Amino Persentase (%)
Asam aspartate 0,96 Alanin 0,4
Asam glutamate 2,69 Tirosin 0,64
Serin 0,67 Metionin 0,3
Histidin 0,3 Valin 0,74
Glisin 0,29 Fenilalanin 0,64
Threonin 0,56 Isoleusin 1,12
Arginin 0,33 Lisin 0,95
Sumber : Soenarno et al., 2013
9
2.2 Peptida Bioaktif
Peptida bioaktif adalah fragmen dari protein yang tersusun atas 2-20 asam
amino yang memiliki pengaruh positif terhadap fungsi biologis dan kesehatan
tubuh manusia. Peptida bioaktif terbentuk dari protein melalui tiga cara, antara
lain adalah proses hidrolisis oleh enzim proteolitik pencernaan di dalam tubuh,
fermentasi oleh bakteri proteolitik, dan hidrolisis dengan enzim yang diisolasi dari
mikroorganisme atau pun yang berasal tanaman, seperti papain dan bromelain,
sehingga protein akan terhidrolisis membentuk fragmen-fragmen peptida yang
lebih pendek dari protein induknya dan memiliki bioaktivitas dan juga multifungsi
(Pritchard, 2012).
Peptida bioaktif dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tumbuhan
(Moayedi et al., 2016; Nishibori et al., 2013), daging (Stadnik dan Keska, 2015),
susu (Korhonen, 2009), dan organisme laut (Khirzin et al., 2015; Wijesekara dan
Kim, 2010). Peptida bioaktif memiliki berbagai aktivitas biologi yang berdampak
positif bagi kesehatan. Bioaktivitas peptida bergantung beberapa faktor seperti
tipe kultur starter, enzim, sekuen peptida, waktu fermentasi, faktor penyimpanan
dan lama waktu hidrolisis apabila menggunakan enzim. Peptida memiliki aktivitas
biologi seperti antioksidan, antihipertensi, antimikroba, antikolestrol,
antitrombotik, imunomodulator, dan opiod (Korhonen, 2009). Sekuen peptida
dengan berbagai bioaktivitas dan sumber proteinnya dapat dilihat pada Tabel 3.
10
Tabel 3. Bioaktivitas sekuen dan sumber peptida bioaktif
Sekuen Peptida Bioaktivitas Sumber Referensi
KVLPVPQ Antioksidan Susu Fermentasi
Hernández-
Ledesma et al.,
2005
LGLNGDDVN Antioksidan Belut conger Ranathunga et
al., 2006
PYSFK Antioksidan Kulit ikan karper
rumput Cai et al., 2015
YPFP Opioid Susu fermentasi Mohanty et al.,
2016
YQQPVLGPVR Imunomodulator Susu sapi Kayser dan
Meisel, 1996
PPHMLP α-amilase inhibitor Kacang pinto Ngoh dan Gan,
2016
YSMYPP ACE inhibitor Ikan gabus Ghassem et al.,
2013
ITTNP ACE inhibitor Miosin babi Arihara et al.,
2001
IPP Antihipertensi, ACE
inhibitor Susu fermentasi
Yamamoto et al.,
1999
VPP Antihipertensi, ACE
inhibitor Susu fermentasi
Yamamoto et al.,
1999 V= Valin, P= Prolin, H= Histidin, L= Leusin, N= Asparagin, Y= Tirosin
Walther dan Sieber (2011) menyatakan bahwa sumber utama peptida
bioaktif adalah susu dan produk fermentasi. Kandungan protein yang tinggi pada
susu dan proses degradasi protein menjadi peptida dengan susunan 2–20 asam
amino dengan bantuan bakteri asam laktat. Dua hal itu yang menjadi alasan jika
susu dan produk fermentasi dapat dikatakan sebagai sumber utama peptida
bioaktif.
Korhonen (2009) dalam ulasannya menyebutkan fungsi peptida bioaktif
dari susu fermentasi dan target potensi kesehatan. Terdapat tujuh target kesehatan
yang dapat diperoleh dari konsumsi peptida bioaktif seperti kesehatan pencernaan,
kesehatan tulang, kesehatan jantung, kesehatan gigi, manajemen berat badan,
imunitas dan kontrol emosi, ingatan, serta stress (Gambar 7). Kesehatan jantung
merupakan salah satu target kesehatan yang dapat diperoleh dengan
mengkonsumsi susu dan susu fermentasi. Peptida bioaktif akan berperan sebagai
11
antitrombotik, antrikolestrol, antioksidan, dan ACE inhibitor. Peptida sebagai
ACE inhibitor ini akan menjadi fokus utama dalam penelitian ini.
Gambar 2. Fungsi peptida bioaktif yang berasal dari protein susu dan target
kesehatan potensial (Korhonen, 2009)
Peptida ACE inhibitor yang berasal dari susu dan produk fermentasi ini
telah banyak diteliti baik pengujian secara kimia (in vitro) maupun terhadap
hewan uji menggunakan spontaneously hypertensive rat (in vivo) (Abubakar,
2004; Saito et al., 2000). ACE yang berperan dalam regulasi peningkatan tekanan
darah dapat diinhibisi oleh peptida ACE inhibitor. Peptida ACE inhibitor akan
berikatan dengan sisi aktif yang terdapat pada ACE melalui residu terminal
karbon. Dekonformasi atau pengubahan susunan protein dialami oleh ACE,
sehingga pengikatan angiotensin I dapat dicegah (López-Fandiño et al., 2006;
Ryan et al., 2011). Peptida ACE inhibitor juga telah banyak diteliti dan
diidentifikiasi sekuen peptidanya seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.
12
Tabel 4. Sekuen asam amino peptida ACE inhibitor dari susu dan produk
fermentasinya
Sekuen Peptida Fragmen Protein IC50 (µM) Referensi
VLGPVRGPFP β-CN f197–206* 137 Quirós et al., 2007
LHLPLP β-CN** f133–138 5,5 Quirós et al., 2007
LVYPFPGPIPNSLPQNIPP β-CN f58–76 5,2 Quirós et al., 2007
VLSRYP κ-CN f31- 36 36,7 Li et al., 2015
LRFF αs1-CN f21-24 116,9 Li et al., 2015
IPP β-CN f74-76 5
Yamamoto et al.,
1999
IPP κ-CN f108-110 5
Yamamoto et al.,
1999
VPP β-CN f84-86 9
Yamamoto et al.,
1999
IPA β-LG*** f78-80 141 Abubakar, 2004
V= Valin, P=Prolin, A=Alanin, F=Fenilalanin
*fragmen protein, ** β-CN = β-casein, *** β-LG= β-lactoglobulin
Peptida ACE inhibitor umumnya mengandung residu asam amino prolin
(Pro, P) atau asam amino hidrofobik yang ada pada bagian terminal karboksil
(López-Fandiño et al., 2006). Peptida-peptida yang berhasil diidentifikasi pada
penelitian sebelumnya (Tabel 4.) memiliki residu asam amino prolin atau asam
amino hidrofobik pada sususan peptida. Prolin tahan terhadap degdradasi enzim
pencernaan dan dapat melewati saluran pencernaan, sehingga dapat diserap oleh
usus halus dan masuk ke dalam aliran darah (Yamamoto et al., 1999).
2.3 Hipertensi
Hipertensi merupakan suatu penyakit yang dikenal luas sebagai penyakit
kardiovaskular. Tekanan darah sistolik dan diastolik berada di atas 140/90 mmHg.
Hipertensi termasuk penyakit jenis penyakit tidak menular (PTM). Sebanyak
45% kematian karena penyakit jantung dan 51% kematian karena stroke
disebabkan oleh penyakit hipertensi (WHO, 2013). Peningkatan tekanan darah
tinggi ini berkaitan erat dengan peningkatan resiko terhadap penyakit jantung
koroner, stroke, serta penyakit organ target lainnya (Fitrianto et al., 2014).
13
Penyebab kasus hipertensi yang diketahui hanya sekitar 5-10 %, selebihnya masih
belum diketahui penyebabnya. Penyebab hipertensi yang telah diketahui yaitu
karena adanya penyakit ginjal, kelainan endokrin, asupan garam yang tinggi, dan
stres oksidatif (Iskandar, 2007).
Penyakit hipertensi berkaitan erat dengan regulasi tekanan darah
dipengaruhi oleh sistem renin angiotensin (RAS) yang terdapat dalam tubuh.
Sistem RAS melibatkan proses pengubahan angiotensin I menjadi angiotensin II
oleh angiotensin converting enzyme (ACE) (Yusuf, 2008). Persamaan reaksi dari
pengubahan angiotensin I menjadi angiotensin II oleh ACE dapat diihat pada
Gambar 3 (Siemerink et al., 2010).
Gambar 3. Reaksi pengubahan angiotensin I menjadi angiotensin II (Siemerink et
al., 2010)
Angiotensin I yang merupakan dekapeptida dengan sekuen Asp-Arg-Val-
Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu diubah oleh ACE menjadi angiotensin II yang
merupakan oktapeptida dengan sekuen Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Reaksi
14
tersebut merupakan reaksi hidrolisis enzimatik. Angiotensin II merangsang
terjadinya sekresi aldosteron yang menyebabkan terjadinya retensi natrium
ekstraseluler. Retensi natrium ekstraseluler mengakibatkan terjadinya peningkatan
volume cairan ekstraseluler, sehingga terjadi peningkatan tekanan darah atau
hipertensi (Yusuf, 2008).
Terapi penyakit hipertensi dilakukan dengan mengkonsumsi obat-obatan
sintetik dari golongan diuretik atau pun kombinasi golongan diuretik dengan ACE
inhibitor (Fitrianto et al., 2014). Obat-obatan yang termasuk dalam golongan
ACE inhibitor diantaranya seperti captopril, enalapril dan lisinopril. Penggunaan
obat-obatan antihipertensi sintesis dapat menimbulkan efek samping yang dapat
mempengaruhi kesehatan penderita, seperti alergi, lesu, mual, sakit kepala, diare,
batuk kering, tidak nafsu makan dan gangguan ginjal (Pan et al., 2016). Konsumsi
obat-obatan sintetik dapat dikurangi dengan mengkonsumsi makanan dan
minuman sehat yang mampu menurunkan tekanan darah tinggi (antihipertensi),
agar resiko penyakit lain akibat penggunaaan obat sintetik dapat dihindari
(Arihara, 2013; Moayedi et al., 2016).
2.4 Antihipertensi
Antihipertensi merupakan suatu kemampuan dari senyawa atau zat aktif
untuk menghambat kerja dari ACE pada reaksi pengubahan angiotensin I menjadi
angiotensin II. Senyawa yang memiliki kemampuan sebagai penghambat ACE ini
biasa disebut dengan ACE inhibitor. Mekanisme penghambatan ACE oleh suatu
senyawa yang berperan sebagai ACE inhibitor ditunjukan pada Gambar 4. Sistem
renin angiotensin (RAS) ini merupakan sistem regulasi tekanan darah.
Angiotensinogen diubah menjadi angiotensin I oleh enzim renin, selanjutnya
15
angiotensin I akan diubah oleh ACE menjadi angiotensin II. Pengubahan
angiotensin I akan dihambat oleh ACE inhibitor untuk mencegah terjadinya
peningkatan tekanan darah (Li et al., 2004).
Gambar 4. Penghambatan ACE oleh penghambat ACE (ACE inhibitor) (Li et al.,
2004)
ACE inhibitor atau senyawa yang memiliki kemampuan antihipertensi ini
banyak ditemukan pada peptida bioaktif. Angiotensin I dan angiotensin II juga
termasuk peptida. Peptida bioaktif dengan susunan 2 sampai dengan 20 asam
amino yang merupakan fragmen hasil degradasi protein oleh enzim proteolitik
pencernaan, fermentasi oleh bakteri proteolitik, dan enzim yang disekresi oleh
mikroorganisme atau tanaman (Pritchard, 2012). Peptida ACE inhibitor ini
bertindak dengan dua tahap, pertama peptida berikatan langsung dengan sisi aktif
ACE (inhibitor kompetitif) atau keduanya berikatan pada sisi aktif ACE inhibitor
(inhibitor nonkompetitif) dan kemudian memodifikasi susunan protein serta
mencegah substrat (angiotensin I) berikatan dengan sisi aktif dari ACE (Arihara,
2013).
16
Aktivitas ACE inhibitor dapat diuji dengan menggunakan metode
Cushman dan Cheung (1971). Metode Cushman dan Cheung (1971) merupakan
suatu metode pengujian aktivitas ACE inhibitor oleh senyawa yang memiliki
kemampuan menghambat kerja ACE dengan menggunakan substrat hipuril-
histidil-leusin (HHL). Substrat HHL akan dihidrolisis oleh ACE membentuk asam
hipurat dan dipeptida histidil-leusin (Gambar 5) . Asam hipurat yang terbentuk
diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 228 nm.
Konsentrasi dari asam hipurat yang terbentuk akan berkurang apabila terdapat
senyawa ACE inhibitor di dalam sistem pengujian, namun konsentrasi asam
hipurat yang terbentuk akan tinggi apabila tidak ada ACE inhibitor.
Gambar 5. Reaksi hidrolisis HHL oleh ACE (Cushman dan Cheung, 1971)
Tingkat kemampuan menghambat kerja ACE terdiri atas beberapa kategori
yaitu penghambatan lemah (weak inhibition) dengan persentase penghambatan
sebesar 20 – 60 % pada konsentrasi di atas 100 µM, penghambat cukup baik
(moderate inhibition) dengan persentase penghambatan di bawah 80 % pada 100
µM atau memiliki nilai IC50 sekitar 10 - 60 µM, penghambatan kuat (strong
17
inhibition) dengan persentase penghambatan mencapai 99 % pada konsentrasi 100
µM atau memiliki nilai IC50 sekitar 0,4 – 1 µM, dan penghambatan sangat kuat
(very strong inhibition) dengan persentase penghambatan sempurna pada 100 µM
atau memiliki nilai IC50 di bawah 140 nM (Huang et al., 2003). Tabel tingkat
kemampuan ACE inhibitor ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Tingkat kemampuan ACE inhibitor
Kategori % inhibisi Konsetrasi (µM) IC50
Penghambatan lemah (weak
inhibition) 20 – 60 % >100 µM >100 µM
Penghambatan cukup baik
(moderate inhibition) <80 % 100 µM 10 - 60 µM
Penghambatan kuat (strong
inhibition) 99 % 100 µM 0,4 – 1 µM
Penghambatan sangat kuat
(very strong inhibition) 100 % 100 µM <140 nM
Sumber: Huang et al., 2003
2.5 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor
Purifikasi merupakan metode pemurnian suatu campuran zat untuk
menperoleh senyawa murni dan bebas dari campuran senyawa lain. Purifikasi
suatu peptida atau protein harus disesuaikan dengan jenis protein, karena masing-
masing jenis protein dan peptida memiliki sifat dan kharakteristik yang khas
(Scopes, 1994). Purifikasi peptida ACE inhibitor dilakukan untuk memurnikan
suatu peptida yang memiliki aktivitas ACE inhibitor dari suatu campuran peptida
hasil degradasi protein bahan pangan oleh fermentasi atau pun hidrolisis
enzimatik.
Proses purifikasi ini merupakan tahap penting untuk memperoleh peptida
ACE inhibitor. Tahapan purifikasi peptida ACE inhibitor terdiri atas beberapa
proses pemisahan dan pengujian aktivitas ACE inhibitor dilakukan pada setiap
fraksi hasil yang diperoleh dalam proses pemisahan. Purifikasi peptida dilakukan
18
oleh Mirdhayati et al. (2016) untuk mengidentifikasi peptida ACE inhibitor dari
hidrolisat protein daging kambing kacang menggunakan beberapa tahapan seperti
ultrafiltrasi, kromatografi permeasi gel dan reversed phase high performance
liquid chromatography (RP-HPLC).
Li et al. (2015) menggunakan metode purifikasi dengan tahapan
pemurnian seperti sentrifugasi, kromatografi penukar ion, ultrafiltrasi dan RP-
HPLC. Penelitian kali ini menggunakan dua tahapan pemurnian, yaitu ekstraksi
fase padat (SPE) dan RP-HPLC. Pemilihan tahapan purifikasi karena lebih
sederhana.
Ekstraksi Fase Padat (Solid Phase Extraction)
Ekstraksi fase padat atau solid phase extraction (SPE) merupakan suatu
metode preparasi sampel yang melibatkan fase cair dan fase padat. Metode
ekstraksi fase padat menggantikan metode ekstraksi cair-cair dalam analisis
lingkungan dan biologi (Płotka-Wasylka et al., 2016). Metode SPE dapat juga
digunakan dalam analisis toksikologi (Rahmatia, 2016). Ekstraksi dan pemisahan
zat dalam sampel makanan dan minuman dapat dilakukan dengan menggunakan
metode ekstraksi fase padat (Andrade-eiroa et al., 2016). Ekstraksi fase padat
dapat memisahkan zat dalam sampel dengan memanfaatkan prinsip dasar
kromatografi cair. Proses yang terlibat dalam ektraksi fase padat adalah
kromatografi frontal selama tahap ekstraksi (ekstraksi senyawa yang dilakukan di
awal tahap) dan kromatografi pemindahan selama tahap desorpsi (ekstraksi
senyawa yang dilakukan pada tahap desorpsi) (Hennion, 1999).
Metode ekstraksi fase padat telah banyak mengalami perkembangan
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6. Masa awal penggunaan alat ekstraksi
19
fase padat menggunakan alat yang sangat besar, seperti tabung logam. Kebutuhan
volume pelarut elusi yang banyak dan massa sorben yang besar hingga mencapai
1,5 kg. Alat ektraksi fase padat terus mengalami perkembangan menjadi alat yang
lebih sederhana dengan keuntungan yang lebih banyak, serta kebutuhan dari
kedua aspek, yaitu pelarut elusi dan sorben yang kecil.
Gambar 6. Sejarah perkembangan metode ekstraksi fase padat (Płotka-Wasylka
et al. 2016)
Płotka-Wasylka et al. (2016) memaparkan bahwa ada 5 format dalam
ekstraksi fase padat, antara lain format katrid (cartridges), cakram (disks), ujung
pipet (pipette tips), pelat multi-sumur (multi-well plates), dan campuran sorben-
sampel (sorbent mixed with sample). Format dari berbagai alat ekstraksi fase
padat ini memiliki keuntungan dan kerugiannya masing-masing seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 4. di bawah ini.
20
Tabel 6. Perbandingan format alat yang digunakan dalam ekstraksi fase padat
Format Keuntungan Kerugian Aplikasi
Katrid - Kemungkinan persiapan di
laboratorium
- Kemungkinan penggabungan
beberapa kolumn
- Biaya rendah
- Luas area pemampang
kecil
- Laju alir lambat
- Volume kekosongan
tinggi/besar
- Penyumbatan
Cakram - Volume pelarut elusi kecil
- Laju alir lebih cepat tanpa efek
penyaluran
- Volume kekosongan lebih kecil
- Luas permukaan besar perunit
massa butiran
- Kemungkinan untuk
melewatkan tahap penyaringan
- Kemungkinan untuk
diintegrasikan
- Volume terobosan yang
lebih kecil
- Biaya lebih mahal dari
pada katrid
- Analisis
lingkungan
Ujung
Pipet
- Konsumsi waktu dan sederhana
- Volume sampel dan pelarut
elusi sangat kecil
- Waktu ekstraksi pendek
- Kemampuan untuk
memperlakukan banyak sampel
oleh penggunaan mikropipet
penyaluran multi
- Faktor pemulihan (recovery)
tinggi
- Automasi muda
- Penyumbatan
- Limbah plastik yang
tinggi
- Riset biologi
Pelat
Multi-
sumur
- Persiapan sangat cepat untuk
jumlah sampel yang besar
- Konsumsi waktu dan tenaga
kerja yang rendah
- Laju alir cepat tanpa efek
penyaluran
- Bioanalisis
Sorben
dicampur
sampel
- Volume pelarut elusi kecil
- Massa sorben yang dibutuhkan
kecil
- Efektivitas ekstraksi
tergantung pada
pemilihan sorben yang
tepat
- Analisis
lingkungan
Sumber : Płotka-Wasylka et al., 2016
Format ekstraksi fase padat yang digunakan dalam penelitian ini adalah
format katrid (cartridge) atau Oasis® HLB extraction cartridge. Katrid HLB ini
direkomendasikan untuk ekstraksi, pemisahan zat, pembersihan zat farmasi, dan
produk dalam fase air (hidrofilik) (Andrade-eiroa et al., 2016). Format ini
menggunakan sorben Oasis® HLB 60 μm yang mengandung resin yang dibuat
dari sebuah ko-polimer dari divinilbenzena (hidrofobik monomer) dan vinil
pirolidinon (hidrofilik monomer). Spesifikasi dari sorben polimer resin, antara
21
lain luas permukaan spesifik sebesar 816 m2/g, diameter pori rata-rata sebesar 82
Å, volume pori total sebesar 1,32 cm3/g, diameter partikel rata-rata sebesar 54,1
μm, dan kandungan partikel sangat kecil <0,1 %. Prinsip yang digunakan adalah
memanfaatkan prinsip kromatografi cair dengan melibatkan proses kromatografi
frontal yang terjadi selama proses ekstraksi, artinya proses ekstraksi analit
dilakukan pada saat awal proses.
Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography
Kromatografi adalah metode pemisahan komponen campuran berdasarkan
dengan distribusi senyawa dalam dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase
gerak dalam kromatografi umumnya berwujud gas atau cair, sementara fase
diamnya adalah cair atau padat (Fessenden dan Fessenden, 1986). High
performance liquid chromatography (HPLC) adalah salah satu jenis teknik
pemisahan menggunakan kromatografi cair. HPLC dapat dibagi menjadi dua,
yaitu normal phase-HPLC dan reversed phase-HPLC (Harvey, 1962).
Perbedaan yang mendasar antara dua jenis HPLC ini adalah pada
kepolaran fase gerak dan fase diam yang digunakan dalam sistem HPLC. HPLC
dengan fase normal menggunakan fase diam polar dan fase geraknya yaitu non-
polar, sementara HPLC fase terbalik menggunakan fase diam non-polar dan fase
gerak polar. Perbedaan fase HPLC ini akan mempengaruhi jenis zat atau senyawa
yang akan dipisahkan. Normal phase HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi
fase normal dapat digunakan untuk memisahkan senyawa non-polar, seperti asam
lemak dan biodiesel. Reversed phase-HPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi
fase terbalik digunakan dalam prosedur pemisahan senyawa polar, seperti peptida.
22
Interaksi antara fase diam, fase gerak, dan analit akan mempengaruhi
pemisahan zat. Analit yang dibawa oleh cairan fase gerak dan melalui kolom yang
berisi fase diam. Interaksi ini akan membuat analit terdistribusi dalam dua fase
dan terjadi pemisahan. Senyawa analit akan terpisah sesuai dengan kepolarannya
terhadap fase diam dan waktu retensi untuk sampai ke detektor oleh fase geraknya
(Harvey, 1962).
Proses pemisahan senyawa yang terjadi dalam alat HPLC (Gambar 7)
diawali dengan proses elusi oleh fase gerak dengan laju alir yang dapat
diprogram. Program untuk laju alir dapat dilakukan dengan mengatur pump
solvent manager sesuai kondisi yang diinginkan. Fase gerak membawa analit
yang diinjeksi untuk melewati kolom dan pemisahan senyawa analit terjadi pada
kolom. Campuran fase gerak dan analit selama melewati kolom dibawa menuju
detektor dan dikonversi menjadi data elektrik berupa kromatogram (Chawla dan
Ranjan, 2016).
Gambar 7. Skema alat HPLC (Chawla dan Ranjan, 2016)
23
2.6 Peptide Sequencing
Peptide sequencing merupakan suatu metode penentuan struktur primer
dari rantai biopolimer peptida. Penentuan urutan protein ini melibatkan pemutusan
ikatan peptida yang diikuti dengan identifikasi asam amino (Bodanszky, 1998).
Banyak peptida yang dapat diurutkan dengan menggunakan spektroskopi massa
dengan teknik ionisasi antara ESI (electronspray ionization) atau MALDY
(matrix-assisted laser desorption ionization) yang terhubung dengan penganalisa
massa TOF (time of flight) (McMurry, 2008). Metode lain yang umum digunakan
adalah metode Degradasi Edman seperti yang digunakan dalam penelitian Arihara
et al. (2001) dan Mirdhayati et al. (2016). Metode ini merupakan metode secara
kimia dalam penentuan urutan peptida atau sekuen peptida dengan menggunakan
alat protein sequencer atau protein sequenator (Edman dan Begg, 1967).
Metode degradasi Edman didasarkan pada terminal N (ujung terminal
amino) dari protein dipotong satu-persatu dengan reaksi kimia. Residu asam
amino yang terbentuk oleh pemotongan dapat diuji dengan menggunakan
kromatografi dengan detektor UV dan spektroskopi massa. Identifikasi dengan
menggunakan spektroskopi massa dapat diintegrasikan dengan metode
bioinformatika yang berdasarkan pada basis data. Kelemahan dari metode
degradasi Edman adalah polipeptida yang dapat ditentukan urutannya tidak lebih
dari 50-60 residu asam amino (McMurry, 2008).
24
Gambar 8. Diagram sekuenator protein (Edman dan Begg, 1967)
Secara garis besar, diagram dari sekuenator peptida atau pengurut peptida
ditunjukkan pada Gambar 8. Edman dan Begg (1967) mamaparkan bahwa
biagram sekuenator protein ini terdiri atas bejana reaksi atau tempat dimana reaksi
pendegradasian peptida ada pada tabung silinder (A) yang terpasang/terhubung
pada batang dari motor elektrik (B). Tabung silinder ini akan berputar secara
terus-menerus, oleh karena itu larutan dan pelarut yang masuk akan menyebar dan
membentuk lapisan tipis pada dinding tabung.
Larutan dan pelarut masuk melalui saluran asupan (feed line) (R) yang ada
pada bagian bawah tabung. Pelarut ekstrak akan naik ke alur di mana pelarut
ekstrak ini diambil dan dikeluarkan melalui saluran limbah (S). Bejana reaksi
ditutup dengan bell jar (Q) dan sistem akan divakumkan dengan pompa vakum
(P). Reagen dan pelarut disimpan di dalam reservoir (C) dan terhubung dengan
bejana reaksi melalui katup perakitan (D). Reservoir berada di dalam kondisi
konstan dengan nitrogen bertekanan rendah yang disediakan oleh tabung nitrogen
(H) dan regulator tekanan (K). Saluran hasil dan limbah dapat diatur dengan kanal
3 jalur (E) yang dapat dialirkan ke pengumpul fraksi (F) atau kontainer limbah
25
(G). Katup perakitan (D) dan katup gas (M dan N) dioperasikan dengan selenoida,
sementara kanal 3 jalur (E) dan pengumpul fraksi (F) oleh motor elektrik. Seluruh
fungsi alat diprogram dengan unit elektronik.
Reaksi degradasi Edman diawali dengan reaksi yang terjadi antara peptida
dengan fenil isotiosianat (PITC) (Gambar 9). Gugus amina terminal peptida (N-
terminal) akan mengalami reaksi adisi nukleofilik dengan menyerang karbon pada
gugus isotiosianat pada fenil isotiosianat, sehingga mengalami kondensasi
membentuk senyawa yaitu derivatif N-feniltiourea (1). Senyawa derivat
mengalami siklisasi secara katalitik dengan adanya trifluoroasetat di mana gugus
tiol (-SH) akan membentuk ikatan dengan karbon (karbon-karbonil peptida),
sehingga membentuk senyawa feniltiourea siklik (2). Senyawa feniltiourea
mengalami pengubahan molekul yang disebabkan pergerakan elektron bebas pada
gugus hidroksi (-OH), secara bersamaan gugus amina (-NH-) mengalami
pelepasan dengan mengikat hidrogen. Reaksi ini membentuk senyawa anilina-
tiazolinon (ATZ) derivatif dan peptida dengan rantai yang lebih pendek (3).
26
Gambar 9. Mekanisme reaksi degradasi Edman (McMurry, 2008)
Anilina-tiazolinon (ATZ) derivatif mengalami penantaan ulang dalam
kondisi asam membentuk senyawa isomer yaitu N-feniltiohidantoin (PTH) (4)
(McMurry, 2008). Senyawa PTH dari hasil degradasi ini dianalisis dengan
kromatografi dengan detektor spektroskopi UV pada panjang gelombang 269 nm.
27
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini telah dilakukan selama 6 bulan, yaitu sejak bulan Februari
sampai dengan bulan Agustus 2018 di Laboratorium Fungsi dan Keamanan
Pangan, Fakultas Ilmu Hewan, Sekolah Kedokteran Hewan, Universitas Kitasato,
Towada-shi, Aomori, Jepang. Preparasi sampel dilakukan di Balai Besar
Penelitian dan Pengembangan Pasca-panen Pertanian, Bogor, Jawa Barat,
Indonesia.
3.2 Alat dan Bahan
Alat
Peralatan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas,
kertas saring Advantec D150 mm. water bath, oven, pH meter, magnetic stirrer,
centrifuges, vortex, neraca analitik, hot plate, micro pipette, micro tube, rotary
evaporator, freeze drier (Eyela, Tokyo Rikakikai, Co. Tokyo, Jepang), freezer,
spektrofotometer UV-Vis Perkin-Elmer Lambda 500, penyaring syringe Milex®
HV 0.45 μm (Toyo Roshi Kaisha, Tokyo, Japan), katrid ekstraksi fase padat
(Oasis® HLB Extraction Cartridge, Waters, Milford, Massachusetts, USA),
reversed phase HPLC (kolom CAPCELL PAK C18, MGII 4.6 mmID × 150 mm;
Shiseido, Tokyo, Japan), reversed phase HPLC (kolom X BridgeTM BEH 130,
C18, 3,5 μm, ukuran 2.1 ID × 100 mm; Waters, Dublin, Irlandia), LCMS-QP2020
(Shimadzu-Biotech) dan penentu urutan protein otomatis (model PPSQ-31A;
Shimadzu-Biotech) yang dilengkapi dengan deteksi online PTH-asam amino.
28
Bahan
Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah 10 L dadih
susu kerbau yang diperoleh dari peternak kerbau di Kabupaten Agam, Bukit
Tinggi, Sumatra Barat. Bahan kimia yang akan digunakan adalah hippuryl-L-
histidyl-L-leucine (HHL) (Sigma-Aldrich Co), angiotensin converting enzyme
(ACE) dari paru-paru kelinci (ACE, EC 3.4.15.1), etanol, metanol, asam format,
asetonitril, asam klorida, natrium hidroksida, ammonium bikarbonat, etil asetat,
trietilamina, buffer natrium tetraboraks, dan peptida sintetis (LPV, GVSKVK,
STPTTE, AVRSPAQ, SLSQS dan VEPT) (BEX Co., Ltd., Tokyo).
29
3.3 Diagram Alir Penelitian
Gambar 10. Diagram alir penelitian
Uji Aktivitas
ACE inhibitor
Fraksi Etanol
Fraksi Metanol
Ekstraksi Fase Padat
Peptida ACE inhibitor
Reversed-phase High Performance
Liquid Chromatography
Filtrasi Freeze drying
Dadih Bubuk
Dadih Fraksi Air
Susu kerbau
fermentasi
selama 2 hari
Fraksinasi Etanol Bertingkat
99,5; 75; 50; 25 dan 0 %
Peptide Sequencing
Uji Aktivitas ACE inhibitor secara In Vitro
Sintesis Peptida
Peptida ACE inhibitor
Sintetis
30
3.4 Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap. Tahap pertama dalam penelitian
ini adalah proses preparasi sampel dadih dan uji aktivitas ACE inhibitor. Tahap
kedua yaitu purifikasi peptida ACE inhibitor. Tahap purifikasi ini dilakukan
beberapa kali proses fraksinasi untuk mendapatkan fraksi paling aktif yang
kemudian dilanjutkan untuk tahap penentuan sekuen peptida ACE inhibitor.
Tahap terakhir yaitu identifikasi untuk penentuan sekuen peptida ACE inhibitor
dadih susu kerbau dan uji aktivitas ACE inhibitor peptida sintetis.
3.4.1 Preparasi Sampel
Total sebanyak 10 L susu kerbau difermentasi di dalam 50 batang bambu
dengan panjang ruas 20 – 25 cm dan diameter 8 – 12 cm. Masing-masing bambu
diisi sebanyak 150 – 200 mL susu kerbau. Fermentasi dilakukan selama 48 jam di
dalam bambu dan ditutup dengan menggunakan daun pisang. Susu kerbau
fermentasi dibekukan. Dadih yang telah membeku kemudian di-freeze dry hingga
susu kerbau fermentasi membentuk padatan.
3.4.2 Ekstraksi Peptida Fraksi Larut Air (water soluble fractions)
Sebanyak 208 g susu kerbau fermentasi (dadih) dalam bentuk bubuk
dilarutkan dengan akuades sebanyak 1 L. Campuran diaduk dengan menggunakan
batang pengaduk selama 30 menit dan diletakkan di dalam waterbath hangat.
Campuran disaring dengan menggunakan kertas saring Advantec diameter 150
mm. Supernatan dikumpulkan dan dilakukan proses freeze drying. Dihasilkan
bubuk dadih larut air sebanyak 21,087 g. Bubuk dadih sebanyak 0,125 g
dilarutkan dengan 2,5 mL akuades. Larutan diencerkan menjadi 2, 4, 8, dan 16
kali volumenya. Masing-masing larutan dadih diuji aktivitas ACE inhibitor.
31
3.4.3 Fraksinasi Etanol Bertingkat
Sebanyak 10 g bubuk dadih difraksinasi secara bertingkat dengan pelarut
etanol 99,5, 75, 50, 25, dan 0 %. Bubuk dadih dilarutkan dengan menggunakan
100 mL etanol 99,5 % dan diaduk selama 5 menit. Larutan disaring dengan
menggunakan kertas saring Advantec diameter 150 mm. Filtrat yang dihasilkan
kemudian dikumpulkan dan residu padat dilarutkan kembali dengan etanol 75 %
dan proses yang sama dilakukan untuk pelarut etanol dengan konsentrasi 50, 25,
dan 0 %, hingga dihasilkan filtrat.
Filtrat dari setiap fraksi etanol dipekatkan dengan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 50 oC dan kondisi vakum. Konsentrat hasil pemekatan
dikumpulkan dan dilakukan proses freeze-drying. Dihasilkan bubuk fraksi etanol
bertingkat.
Bubuk fraksi etanol dilarutkan kembali dengan 20 mL air. Larutan diambil
sebanyak 1 mL dan kemudian diencerkan hingga 5 kali volumenya. Larutan diuji
aktivitas ACE inhibitor. Sisa fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi
digunakan untuk tahap ekstraksi fase padat (SPE).
3.4.4 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor
Purifikasi peptida ACE inhibitor dilakukan berdasarkan metode Jang dan
Lee (2005) dan kemudian dikembangkan oleh Mirdhayati et al. (2016). Tahap
purifikasi menggunakan ekstraksi fase padat (SPE) metode HLB Extraction
Cartridge dan RP-HPLC. Langkah-langkah dari proses purifikasi peptida ACE
inhibitor dibahas di bawah ini.
32
3.4.4.1 Ekstraksi Fase Padat (SPE) Metode HLB extraction cartrtidge
Kolom HLB Extraction Cartridge disiapkan dan dielusi menggunakan
metanol 100 % sebanyak 40 ml. Proses elusi dilakukan sebanyak 5 kali atau setara
dengan volume 200 mL metanol. Kolom HLB Extraction Cartridge yang telah
dielusi dengan metanol, kemudian dielusi kembali dengan menggunakan air
dengan volume dan proses yang sama. Kolom HLB Extraction Cartridge siap
digunakan.
Fraksi etanol 75 % disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10
menit. Supernatan diambil sebanyak 5 mL pada lapisan atas dan dimasukkan ke
dalam kolom HLB Extraction Cartridge. Sampel dielusi dengan fase gerak
metanol secara bertingkat 0, 25, 50, 75, dan 100 %. Dihasilkan eluat dari masing-
masing konsentrasi metanol.
Eluat dari setiap konsentrasi metanol dipekatkan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 48 oC dan kondisi vakum. Konsentrat dari setiap eluat di-
freeze-drying. Dihasilkan bubuk dari masing-masing konsentrasi metanol. Bubuk
eluat setiap konsentrasi metanol diuji aktivitas ACE inhibitor. Eluat dengan
aktivitas ACE inhibitor tertinggi dilanjutkan ke tahap RP-HPLC.
3.4.4.2 Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)
Sistem Operasi dan Kondisi HPLC Tahap Pertama dan Kedua
HPLC dioperasikan dengan laju alir 0,8 mL/menit dan proses analisis
dilakukan selama 15 menit. Kolom yang digunakan yaitu kolom CAPCELL PAK
C18 , MGII 4.6 mm × 150 mm (Shiseido, Tokyo, Japan). Elusi dilakukan dengan
sistem isokratik (konsentrasi pelarut konstan) dengan konsentrasi 5 % eluen B
(0,05% asam format dalam asetonitril) dalam eluen A (0,05% asam format dalam
33
akuades). Serapan peptida diukur menggunakan UV detector pada panjang
gelombang 215 nm. Fraksi dikumpulkan dengan interval waktu pengambilan
setiap 30 detik (HPLC tahap pertama), interval waktu pengambilan 60 detik
(HPLC tahap kedua-fraksinasi 1) dan waktu pengambilan berdasarkan puncak
serapan (HPLC tahap kedua-fraksinasi 2).
Preparasi Sampel dan Analisis HPLC Tahap Pertama dan Kedua
Fraksi aktif yang diperoleh dari ekstraksi fase padat sebanyak 400 μL
diencerkan dengan 1600 μL asetonitril 5%. Campuran di-vortex salama sekitar 30
detik. Campuran sampel diambil dengan suntikan sebanyak 500 μL. Penyaring
Milex® HV 0.45 μm (syringe filter) dipasangkan pada suntikan yang telah terisi
dengan sampel.
Sampel diinjeksikan ke dalam RP-HPLC inlet dan analisis dilakukan.
Fraksi setiap interval waktu pengambilan dikumpulkan dalam fraction collector
tubes. Fraksi-fraksi dikumpulkan dan dilakukan uji aktivitas ACE inhibitor.
Diperoleh fraksi aktif RP-HPLC tahap pertama.
Fraksi aktif RP-HPLC tahap pertama difraksinasi kembali dengan sistem
yang sama. Fraksi-frakis dikumpulkan dan dilakukan uji aktivitas ACE inhibitor.
Diperoleh fraksi aktif HPLC tahap 2.
Sistem Operasi dan Kondisi HPLC Tahap Ketiga dan Ke-empat
HPLC dioperasikan dengan laju alir 0,4 mL/menit dan proses analisis
dilakukan selama 15 menit. Kolom yang digunakan yaitu kolom X BridgeTM BEH
130, C18, 3,5 μm, ukuran 2.1 mm × 100 mm (Waters, Dublin, Irlandia). Elusi
dilakukan dengan sistem isokratik (konsentrasi pelarut konstan) dengan
konsentrasi 5 % eluen B (0,08 % NH4HCO3 dalam asetonitril) dalam eluen A
(0,08 % NH4HCO3 dalam air). Serapan peptida diukur menggunakan UV detector
34
pada panjang gelombang 215 nm. Fraksi dikumpulkan berdasarkan puncak
serapan.
Analisis HPLC Tahap Ketiga dan Ke-empat
Fraksi aktif HPLC tahap kedua difraksinasi kembali. Fraksi-fraksi
dikumpulkan dalam fraction collector tubes dan dilakukan uji aktivitas ACE
inhibitor. Diperoleh fraksi aktif HPLC tahap 3. Fraksi aktif HPLC ketiga
difraksinasi lebih lanjut dengan sistem HPLC yang sama (untuk memperoleh hasil
HPLC ke-empat) dan dilakukan uji aktivitas ACE inhibitor.
3.4.5 Identifikasi Sekuen Peptida ACE Inhibitor (Mirdhayati et al., 2016)
Identifikasi Massa Molekul Peptida
Fraksi aktif dari tahap HPLC dikonfirmasi berat molekul peptidanya
dengan menggunakan LCMS-QP2020 dengan teknik ESI (electron spray
ionization). Sebanyak 50 μL diinjeksi menggunakan suntikan yang dilengkapi
dengan penyaring Milex® HV 0.45 μm (syringe filter). Analisis spektroskopi
massa dengan menggunakan LCMS-QP2020 dilakukan. Diperoleh data massa
molekul dari fraksi aktif HPLC.
Peptide Sequencing
Fraksi aktif ditentukan sekuen peptidanya dengan metode degradasi
Edman dengan menggunakan pengurut protein otomatis (automatic protein
sequencer, model PPSQ-31A; Shimadzu-Biotech) yang dilengkapi dengan deteksi
online PTH-asam amino.
Fraksi aktif HPLC dilarutkan dalam larutan asetonitril 40% dan di-vortex
hingga larut. Fraksi aktif dipipet ke dalam membran polivinilidena florida aktif.
Fraksi aktif yang telah terserap pada membran dikeringkan selama 10 menit dan
35
proses sekuensing dimulai secara otomatis. Hasil degradasi dianalisa kromatografi
dengan UV detector pada panjang gelombang 269 nm untuk serapan PTH-asam
amino yang terbentuk selama degradasi.
3.4.6 Uji Aktivitas ACE Inhibitor secara in Vitro (Cushman & Cheung
(1971) yang dimodifikasi oleh Arihara et al. (2001))
Uji Aktivitas ACE Inhibitor
Larutan sampel peptida dadih (15 μL) dicampur dengan 125 μL buffer Na-
borat 100 mM (pH 8,3) yang mengandung 7,6 mM Hip-His-Leu dan 608 mM
NaCl. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 2 menit dan
setelahnya dipra-inkubasi selama 5 menit pada suhu 37 oC. Reaksi dimulai dengan
penambahan 50 μL ACE 50 mU. Campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu
37oC.
Blanko digunakan akuades sebanyak 50 μL. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 125 μL HCl 1 N. Asam hipurat yang dilepaskan selama reaksi
diekstraksi dengan menambahkan 750 μL etil asetat ke dalam campuran dan
dikocok dengan vortex. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm
selama 10 menit.
Sebanyak 500 μL lapisan atas dikumpulkan dan dikeringkan pada suhu
90oC selama 30 menit. Asam hipurat yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan
1 mL air dan diukur besarnya absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 228 nm. Prosedur penambahan bahan uji ACE inhibitor dapat dilihat
pada Lampiran 11. Aktivitas ACE inhibitor dihitung menurut persamaan berikut:
36
% Aktivitas penghambatan = 𝐶−𝐴
𝐶−𝐵 × 100 %.........................................................(1)
Keterangan :
A= absorbansi sampel,
B= absorbansi blanko,
C= absorbansi kontrol (sampel diganti dengan akuades).
Penentuan Nilai IC50
Larutan sampel peptida ACE inhibitor sintetis dibuat dengan variasi
konsentrasi 5, 10, 20, 40 dan 80 μM dari larutan induk 1000 μM. Perlakukan
dilanjutkan berdasarkan dengan prosedur pengujian aktivitas ACE inhibitor. Data
aktivitas diolah secara statistika untuk menentukan persamaan y = a ln (x) + b
(persamaan logaritmik). Variabel Y merupakan aktivitas ACE inhibitor (untuk
IC50, y = 50) dan x merupakan konsentrasi peptida ACE inhibitor, sehingga di
peroleh persamaan sebagai berikut:
Jika y = 50, maka x = IC50
ln (x) = 50−𝑏
𝑎
ln (IC50) = 50−𝑏
𝑎…………………….…………………………………...………..(2)
Sehingga,
IC50 = e^(50−𝑏
𝑎)………………………………………………………………….(3)
37
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Dadih dan Aktivitas ACE Inhibitor Fraksi Air
4.1.1 Karakteristik Dadih
Susu kerbau (Bubalus bubalis) difermentasi secara tradisional di dalam
batang bambu selama 48 jam pada suhu ruang. Produk hasil fermentasi susu
kerbau adalah dadih yang memiliki warna putih seperti produk susu fermentasi
pada umumnya. Susu kerbau fermentasi (dadih) di-freeze dry dan menghasilkan
padatan berwana putih kekuningan (Gambar 11). Penyusutan terjadi selama
proses freeze dry, susu kerbau fermentasi yang sebelumnya sebanyak 10 L (atau
kurang lebih sekitar 10 kg) menghasilkan sebanyak 821 g padatan dadih setelah
proses freeze dry.
Gambar 11. Susu kerbau fermentasi (dadih) yang telah di-freeze dry
Kandungan lemak yang tinggi membuat padatan dadih cenderung basah,
karena selama proses freeze dry hanya molekul air yang hilang. Dadih yang telah
di-freeze dry memiliki aroma masam yang khas dan sama dengan aroma dadih
sebelum di-freeze dry. Aroma dadih ini berasal dari asam laktat, asetaldehida,
38
aseton, diasetil, dan senyawa karbonil lainnya yang merupakan hasil dari
fermentasi susu kerbau (Surono, 2015a).
Warna dadih sebelum di-freeze dry yaitu berwarna putih dan berubah
menjadi kekuniangan setelah di-freeze dry. Perubahan warna menjadi kekuningan
diakibatkan kepekatannya meningkat setelah proses freeze dry, tetapi warna dadih
sebelum proses freeze dry yang berwarna putih menunjukkan jika dadih memiliki
kualitas yang baik (Usmiati et al., 2011).
Susu kerbau diketahui telah difermentasi oleh bakteri asam laktat alami
dari susu kerbau, bambu dan daun pisang (Surono dan Hosono, 2000). Bakteri
asam laktat yang telah ditemukan di dalam dadih, antara lain Lactobacillus casei
subsp. casei, Lactobacillus plantarum (Imai et al., 1987), Lactococcus sp.,
Leuconostoc sp. (Surono dan Nurani, 2001), Lactobacillus brevis, dan
Lactobacillus acidophilus (Afriani et al., 2011). Yurliasni et al. (2014)
menemukan bahwa ada mikroorganisme lain yang terlibat selama proses
fermentasi susu kerbau. Jamur seperti kapang ditemukan dan terindikasi sebagai
Endomyces lactis (Surono et al., 1983). Spesies khamir juga ditemukan dalam
dadih, antara lain Candida tropicalis, Geotricum candidum dan Saccharomyces
cerevisiae (Roostita et al., 2013).
Kompleksivitas mikroorganisme yang berperan dalam proses fermentasi
dadih sangat memungkinkan adanya kebaruan nutrisi susu kerbau. Menurut
Sisriyenni dan Zurriyati, (2004) aktivitas BAL pada dadih mampu menurunkan
kadar laktosa, sehingga dapat dikonsumsi oleh penderita laktosa intoleran. BAL
yang berperan selama fermentasi juga menghasilkan enzim proteolitik
ekstraseluler (Savijoki et al., 2006). Enzim proteolitik ekstraselular berperan
39
dalam degradasi protein susu kerbau menjadi peptida-peptida dengan rantai
sederhana (Sisriyenni dan Zurriyati, 2004; Widodo, 2003).
Surono (2015a) menyatakan bahwa kadar kasein dan protein whey susu
kerbau masing-masing sebesar 3,2 % dan 0,6 %. Persentase kadar kasein susu
kerbau lebih tinggi dibandingkan susu sapi dengan kadar 2,8 %. Kadar kasein
susu kerbau yang tinggi diduga berpotensi sebagai sumber peptida bioaktif. Kadar
kasein yang tinggi dan fermentasi dengan mikroorganisme yang kompleks
memungkinkan untuk menghasilkan peptida baru, dalam hal ini peptida ACE
inhibitor. Dugaan ini pun diperkuat oleh Savijoki et al. (2006) yang menyatakan
bahwa setiap spesies BAL menghasilkan enzim ekstraseluler yang juga khas dan
memiliki sistem proteolitik yang berbeda. Enzim yang khas dari setiap BAL
menyebabkan pemotongan posisi ikatan peptida yang khas juga. Ini merupakan
hal yang mendasari perkiraan fermentasi susu kerbau secara alami menghasilkan
peptida baru yang belum dilaporkan sebelumnya.
4.1.2 Aktivitas ACE Inhibitor Fraksi Air
Dadih hasil freeze dry diekstraksi peptidanya. Tahap ekstraksi dilakukan
berdasarkan dengan kelarutan protein dan peptida di dalam pelarutnya. Protein
umumnya memiliki kelarutan di dalam air, asam, basa, larutan garam konsentrasi
rendah, dan etanol (Poedjiadi dan Supriyadi, 2005). Peptida dengan rantai asam
amino yang pendek hasil degradasi protein oleh mikroorganisme juga terdapat
dalam dadih. Air dipilih sebagai pelarut awal dalam tahap ekstraksi protein dan
peptida yang terdapat dalam dadih.
Ekstraksi dilakukan dengan melarutkan sebanyak 208,45 g dadih bubuk
dengan 1 L air. Penggunaan air sebagai pelarut ekstraksi dimaksudkan untuk
40
melarutkan protein dan peptida tanpa mengekstraksi lemak dan asam lemak yang
terkandung di dalam dadih. Hasil ekstraksi diperoleh sebanyak 21,72 g bubuk
dadih fraksi air. Dadih fraksi air diuji aktivitas ACE inhibitor. Aktivitas ACE
inhibitor fraksi air yang tertinggi sebesar 47,177% dengan konsentrasi 5 mg/mL
(Lampiran 4).
Pihlanto et al. (2010) melaporkan bahwa susu sapi skim yang difermentasi
dengan menggunakan 25 spesies bakteri asam laktat yang berbeda menunjukkan
beberapa hasil aktivitas ACE inhibitor. Aktivitas ACE inhibitor tertinggi
ditunjukkan oleh susu yang difermentasi dengan menggunakan Lactobacillus
casei 17 yaitu sebesar 74 %. Susu yang difermentasi dengan Leuconostoc
mesenteroides spp. Cremoris 358 dan Leuconostoc mesenteroides spp. Cremoris
356 masing-masing memiliki aktivitas sebesar 68 dan 64 %. Susu yang
difermentasi dengan Lactobacillus acidophilus dan Lactobacillus jenseni ATCC
25258 masing-masing memiliki aktivitas sebesar 63 dan 72 %. Susu skim yang
difermentasi dengan beberapa spesies bakteri asam laktat lainnya memiliki
aktivitas 2 – 57 % dan terdapat beberapa yang tidak memiliki aktivitas ACE
inhibitor (Lampiran 12). Hal ini juga memperkuat dugaan jika setiap spesies
bakteri asam laktat menghasilkan enzim proteolitik ekstraseluler khas yang dapat
menghidrolisis ikatan peptida yang khas juga. Kekhasan dari pemotongan enzim
ekstraseluler mempengaruhi produksi peptida yang berbeda dan memiliki aktivitas
ACE inhibitor yang berbeda, serta memungkinkan adanya peptida baru yang
diproduksi.
Jiang et al. (2006) melaporkan bahwa hidrolisat kasein susu kerbau rambut
panjang Himalaya (Bos grunniens) yang dihidrolisis secara enzimatis
41
menggunakan campuran enzim pepsin-tripsin memiliki aktivitas ACE inhibitor
sebesar 58,5 %. Aktivitas ACE inhibitor dari hidrolisat kasein susu kerbau
rambut panjang lebih tinggi dibandingkan dengan dadih. Hal ini diperkirakan
karena penggunaan substrat kasein dan dihidrolisis dengan enzim yang spesifik,
sedangkan penelitian ini susu kerbau difermentasi secara spontan dan alami. Hasil
pengujian aktivitas ACE inhibitor tahap awal dari dadih fraksi air dapat dipastikan
jika dadih yang merupakan produk susu kerbau fermentasi memiliki aktivitas ACE
inhibitor, sehingga dapat dikonsumsi sebagai pangan fungsional antihipertensi.
4.2 Fraksinasi Etanol Bertingkat
Fraksinasi dengan etanol bertingkat bertujuan untuk mengekstraksi peptida
berdasarkan dengan kelarutan dan distribusi yang berbeda di dalam variasi
konsentrasi etanol. Variasi konsentrasi etanol yaitu 99,5, 75, 50, 25 dan 0 %.
Konsentrasi etanol tertinggi yang digunakan yaitu etanol 99,5 %, karena pada
konsentrasi tersebut diharapkan mampu melarutkan peptida dan protein pada
fraksi air. Pengunaan etanol absolut dikhawatirkan akan mengendapkan peptida
dan protein. Hasil pengujian masing-masing fraksi konsentrasi etanol ditampilkan
pada Gambar 12.
42
Gambar 12. Aktivitas ACE inhibitor fraksi etanol
Data hasil pengujian aktivitas ACE inhibitor diperoleh aktivitas tertinggi
yaitu fraksi etanol dengan konsentrasi 75 %. Fraksi etanol 75 % memiliki aktivitas
ACE inhibitor sebesar 70,042%. Fraksi etanol 50 % dan fraksi etanol 99,5 %
memiliki aktivitas ACE inhibitor masing-masing sebesar 26,08 % dan 5,62 %,
sementara dua fraksi yang lainnya tidak memiliki aktivitas ACE inhibitor.
Aktivitas ACE inhibitor fraksi etanol 75% yang tinggi diduga karena adanya grup
protein atau peptida yang memiliki kandungan residu prolin tinggi, karena residu
prolin merupakan karakteristik dari peptida ACE inhibitor (López-Fandiño et al.,
2006). Kandungan prolin yang tinggi juga merupakan karakteristik dari kasein.
Golongan protein ini serupa dengan prolamin yang memiliki kandungan
prolin dan nitrogen amida derivat glutamin di mana grup ini memiliki kelarutan
yang tinggi dalam etanol 60% - 70% (v/v) (Shewry dan Halford, 2002). Ada
kemungkinan grup protein atau peptida yang di dalamnya memiliki residu prolin
dan glutamin terekstraksi selama fraksinasi dengan etanol 75%, sehingga
5.622
70.042
26.068
0 00
10
20
30
40
50
60
70
80
99.5 75 50 25 0
Ak
tivit
as A
CE
in
hib
ito
r(%
)
Fraksi etanol (%)
43
memiliki aktivitas ACE inhibitor tertinggi dibandingkan dengan fraksi yang
lainnya.
Ektraksi menggunakan air pada tahap sebelumnya memungkinkan adanya
komponen selain protein dan peptida, seperti laktosa dan mineral. Ini
menunjukkan jika fraksi air masih berupa campuran komponen yang larut air.
Proses fraksinasi dengan variasi konsentrasi etanol mampu mendistribusikan
komponen campuran akibat adanya perbedaan interaksi dan konsentrasi pelarut.
Fraksi mineral yang terkandung dalam susu terdiri atas kation dan anion.
Fraksi mineral susu yang berupa kation yaitu magnesium, kalsium, natrium dan
kalium. Fraksi mineral susu berupa anion yaitu fosfat anorganik, sitrat dan klorida
(Gaucheron, 2005). Fraksi mineral ini tereliminasi di awal fraksinasi etanol.
Fraksi mineral yang berupa kation dan anion berinteraksi dengan gugus hidroksil
(-OH) pada etanol yang dapat membentuk parsial positif (δ+) dan parsial negatif
(δ-). Interaksi ini mampu membuat fraksi mineral susu terdistribusi pada etanol
99,5 %.
Laktosa termasuk komponen yang kemungkinan juga terdapat di dalam
fraksi air. Fraksinasi etanol mampu memisahkan komponen laktosa dengan
protein dan peptida. Laktosa memiliki sifat yang sangat sedikit larut dalam etanol
100 - 50 % (Machado et al., 2000). Tahap awal fraksinasi dengan menggunakan
etanol 99,5 – 50 % akan membuat laktosa tertahan pada residu akibat dari sifat
kelarutannya. Laktosa akan lebih banyak larut dalam etanol 45 – 0 %.
Protein dan peptida bisa terdistribusi di seluruh fraksi etanol, karena
adanya interaksi molekuler yang terjadi selama fraksinasi. Hasil aktivitas ACE
inhibitor (Gambar 12) juga mengindikasikan adanya protein dan peptida ACE
44
inhibitor pada setiap fraksi etanol, kecuali fraksi 25 dan 0 % yang memang tidak
memiliki aktivitas ACE inhibitor. Fraksi mineral dan laktosa terlihat memiliki
dampak terhadap aktivitas ACE inhibitor dari setiap fraksinya. Hal ini pun
terbukti dalam data aktivitas ACE inhibitor. Konsentrasi etanol yang mampu
melarutkan kedua jenis kandungan senyawa yang disebutkan sebelumnya
memiliki aktivitas yang rendah dan ada yang tidak memiliki aktivitas. Fraksi
etanol 75% yang memiliki aktivitas ACE inhibitor tertinggi dilanjutkan ke tahap
ekstraksi fase padat (solid phase extractions).
4.3 Purifikasi Peptida ACE Inhibitor
4.3.1 Ekstraksi Fase Padat (SPE)
Prinsip ekstraksi fase padat yang diterapkan yaitu prinsip yang sama
dengan kromatografi cair dengan melibatkan proses kromatografi frontal. Proses
kromatografi frontal adalah pengambilan senyawa analit di awal-awal proses
setelah preparasi kolom HLB (katrid HLB Oasis®) selesai. Analit yang dielusi
dengan pelarut-pelarut tertentu akan ditampung atau dikumpulkan berdasarkan
konsentrasi eluennya.
Mekanisme ekstraksi fase padat dari HLB Oasis® dengan fase hidrofilik-
hidrofobik yang seimbang. Mekanisme ini termasuk ke dalam mekanisme mode
terbalik (reverse-phase) dan HLB Oasis® memang merupakan sorben yang sangat
populer (Andrade-eiroa et al., 2016; Gilart et al., 2014). Mode terbalik memang
efektif untuk mengekstraksi peptida dan molekul-molekul yang memiliki
kepolaran.
Protein atau peptida dengan rantai pendek dan massa molekul 3 kDa atau
jauh lebih rendah dari massa molekul itu yang menjadi target. Pengumpulan pada
45
awal proses sangat memungkinkan, karena interaksi antara peptida dengan fase
stasionernya sangat rendah. Ini memudahkan molekul-molekul peptida terelusi
oleh fase gerak. Molekul protein dan peptida dengan massa molekul yang jauh
lebih besar akan tertahan di fase stasioner, akibat interaksi antara sorben dengan
protein dan peptida yang meningkat.
Sorben dari HLB Oasis® memang mempengaruhi proses ekstraksi. Dua
komponen monomer penyusun resin memiliki pengaruh masing-masing.
Komponen hidrofilik (monomer vinil-pirolidinon/VPD) menawarkan tingkat
kebasahan yang baik pada resin dan kecepatan transfer massa yang tinggi dari
larutan encer. Komponen hidrofobik (monomer divinil-benzena/DVB)
memberikan retensi mode terbalik untuk analit (Gilart et al., 2014).
Pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dalam proses ekstraksi fase
padat dibedakan konsentrasinya. Ini dimaksudkan untuk memberikan perbedaan
interaksi antara fase gerak dengan molekul peptida dan protein yang terelusi.
Kepolaran menjadi salah satu faktor utama yang mempengaruhi proses elusi.
Perbedaan konsentrasi dapat mengatur kepolaran sesuai dengan kebutuhan untuk
mendapatkan analit yang diinginkan.
Fase gerak pertama yaitu air atau pelarut metanol 0 %. Proses elusi tahap 1
ini, molekul peptida yang memiliki kepolaran yang tinggi dan peptida yang
memiliki massa molekul kecil yang terelusi. Peptida dengan massa molekul yang
besar dan memiliki tingkat kepolaran yang sangat tinggi dapat terelusi. Eluat
tahap 1 dikumpulkan. Tahap 2, tingkat kepolaran fase gerak diturunkan dengan
cara meningkatkan konsentrasi metanol menjadi 25 %.
46
Peptida dengan kepolarannya lebih sedikit lebih rendah dari peptida-
peptida sebelumnya yang terelusi oleh fase gerak metanol 25%. Eluat tahap 2
ektraksi juga dikumpulkan. Tahap 3, 4 dan 5 yang masing-masing menggunakan
metanol 50, 75 dan 100 %. Konsentrasi metanol yang semakin tinggi perlahan
menurunkan kepolarannya dan mempengaruhi interaksi dengan peptida dan
protein. Pengaruh-pengaruh dari perbedaan konsentrasi dan interaksi mampu
memisahkan campuran peptida yang komplek dari fraksi etanol 75 %. Eluat dari
masing-masing fraksi diuji aktivitas penghambatannya dan hasilnya ada pada
Gambar 13.
Gambar 13. Aktivitas ACE inhibitor fraksi metanol hasil ektraksi fase padat
Data hasil pengujian diperoleh aktivitas ACE inhibitor dari eluat metanol
0 – 100 % secara berurutan yaitu 64,87%, 43,82%, 78,30%, 18,30%, dan 0%. Dari
kelima fraksi eluat diperoleh sebanyak tiga eluat fraksi metanol yang memiliki
aktivitas yang tertinggi dan dipilih untuk dilanjutkan ke tahap berikutnya, yaitu
purifikasi dengan menggunakan RP-HPLC.
0
18.309
78.305
43.827
64.873
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 75 50 25 0
Akti
vit
as A
CE
inhib
itor
(%)
Eluat fraksi metanol (%)
47
HLB Oasis® juga pernah digunakan sebagai media ekstraksi dan
pembersihan senyawa golongan antibiotik tetrasiklin dari otot, ginjal, dan hati
babi, yaitu senyawa klortetrasiklin (Cherlet et al., 2006). Li et al. (2006) juga
pernah melakukan analisis senyawa golongan tetrasiklin, sulfonamid, kuinolon,
dan senyawa golongan xenobiotik lain dari udang dengan menggunakan HLB
Oasis dalam proses ekstraksi dan pembersihan senyawanya.
4.3.2 Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography
Fraksi yang diperoleh dari tahap ekstraksi fase padat dilanjutkan ke tahap
fraksinasi menggunakan reversed phase-high performance liquid chromatografi
(RP-HPLC). Fraksi yang menjadi analit dalam tahap fraksinasi ini merupakan 3
eluat yang memiliki aktivitas ACE inhibitor tertinggi, yaitu fraksi HLB Metanol
0, 25, dan 50 %. Tahap fraksinasi dengan menggunakan RP-HPLC yang terdiri
dari beberapa proses analisis instrumentasi.
Fraksinasi dengan high performance liquid chromatografi mode terbalik
pertama dijalankan dengan menggunakan kolom CAPCELL PAK C18, MGII 4.6
mm×150 mm (Shiseido, Tokyo, Japan) dengan laju alir 0,8 mL/menit dan
dioperasikan selama 15 menit/proses. Hasil fraksinasi dikumpulkan setiap waktu
interval 30 detik dan diuji aktivitas ACE inhibitor. Apabila diperhatikan
berdasarkan data spektrum dan kromatogram pada analisis RP-HPLC, molekul
peptida yang terfraksinasi dari ketiga eluat fraksi metanol diperkirakan memiliki
kisaran massa molekul mulai dari 100 Da – 2000 Da (Lampiran 2).
Hasil pengujian aktivitas ACE inhibitor ditunjukkan pada Lampiran 6.
Hasil pengujian ini diseleksi berdasarkan dengan fraksi yang memiliki aktivitas
48
tertinggi dalam menginhibisi ACE dari masing-masing eluat. Aktivitas ACE
inhibitor tertinggi dari HLB metanol 0, 25 dan 50 % ditunjukan pada Tabel 7.
Tabel 7. Fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi dari setiap analit
Fraksi Sampel Fraksi Label Waktu Retensi (menit) % Inhibisi
HLB Metanol 0% 6 A 2.5 – 3.0 94.656
HLB Metanol 25% 8 B 3.5 – 4.0 39.94
HLB Metanol 25% 12 C 5.5 – 6.0 42.16
HLB Metanol 50 % 19 D 9.0 – 9.5 39.46
Data hasil pengujian menunjukkan bahwa eluat memiliki aktivitas ACE
inhibitor tertinggi untuk setiap fraksi yaitu pada kisaran 39,46 – 42,16 %, kecuali
untuk fraksi HLB metanol 0 % yang memiliki aktivitas hingga mencapai 94,656
%. Tingginya aktivitas ACE inhibitor fraksi HLB metanol 0 % dibandingkan
dengan fraksi yang lain diperkirakan karena tingginya konsentrasi peptida ACE
inhibitor yang terfraksinasi pada waktu retensi 2,5 – 3,0 menit. Hal ini dapat
dilihat dari data spektrum dan kromatogram fraksi HLB metanol 0 % yang
memiliki intensitas yang tinggi dan puncak kromatogram yang melebar. Ini
menunjukkan eluat pada waktu retensi 2,5 – 3,0 memiliki kadar peptida yang
tinggi (Lampiran 2a). Empat fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor yang diperoleh
diberikan label fraksi A, B, C, dan D. Fraksi yang diperoleh dari proses fraksinasi
HPLC tahap pertama dilanjutkan ke tahap fraksinasi berikutnya dengan sistem
operasi dan kolom yang sama.
HPLC tahap kedua terdiri atas dua proses fraksinasi, yaitu fraksinasi 1 dan
fraksinasi 2. Fraksinasi 1 dilakukan dengan sistem operasi dan kolom yang sama,
namun waktu interval pengumpulan fraksi diubah menjadi 1 menit. Fraksinasi 1
bertujuan untuk menentukan fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi pada
waktu retensi analisisnya. Fraksinasi 1 diperoleh fraksi A pada waktu retensi 1,0 –
2,0 menit, B pada 1,0 – 2,0 menit, C pada 7,0 – 8,0 menit, dan D pada 10,0 – 11,0
49
menit (Lampiran 7a). Fraksi (fraksinasi 1) yang diperoleh difraksinasi kembali
dengan sistem operasi dan kolom yang sama (fraksinasi 2). Hasil fraksinasi 2 dan
aktvitas ACE inhibitor ditunjukkan pada Lampiran 7b. Data hasil fraksinasi RP-
HPLC 2 diseleksi yang memiliki aktivitas penghambatan terbaik. Hasil seleksi
ditunjukkan pada Tabel 8.
Tabel 8. Data seluruh fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor tertinggi hasil
fraksinasi 2 (HPLC tahap 2, fraksinasi 2)
Label Sampel Fraksi Waktu Retensi (menit) % Inhibisi
A AI 1.4 - 1.8 12.64
AII 1.8 - 2.2 21.69
B BIV 3.4 - 3.9 31.454
C CIII 5.6 - 5.9 33.123
D DIV 9.1 - 9.3 28.605
Data aktivitas ACE inhibitor tertinggi menunjukkan bahwa didapatkan
sebanyak 5 fraksi dengan aktivitas ACE inhibitor terbaik dari setiap label sampel.
Aktivitas ACE inhibitor fraksinasi 2 pada HPLC tahap kedua memiliki aktivitas
yang relatif lebih rendah dibandingkan dengan HPLC tahap pertama, namun tidak
signifikan. Ini diduga karena proses fraksinasi menyebabkan peptida-peptida ACE
inhibitor yang berada pada waktu retensi yang sama di HPLC tahap pertama
mengalami pemisahan pada waktu retensi yang berbeda pada HPLC tahap 2
fraksinasi 2. Peptida yang pada tahap sebelumnya berada dalam satu waktu retensi
saling berkolabasi dalam menginhibisi ACE. Fraksinasi lanjutan membuat peptida
mengalami pemisahan dan memberikan aktivitas ACE inhibitor yang sedikit lebih
rendah, namun memiliki kemurnian yang lebih baik.
Fraksi HPLC tahap kedua fraksinasi 2 dilanjutkan ke analisis HPLC tahap
ketiga. Di tahap ini, sistem operasi diubah (laju alir 0,4 mL/menit), kolom X
BridgeTM BEH 130, C18 3,5 μm, 2.1 × 100 mm (Waters, Dublin, Irlandia) dan
penggunakan fase gerak juga dilakukan perubahan. Fraksi dikumpulkan dan
50
kemudian diuji aktivitas ACE inhibitor. Hasil pengujian aktivitas ACE inhibitor
terdapat pada Lampiran 8.
Dari data analisis High performance liquid chromatografi mode terbalik
tahap ketiga, diperoleh beberapa fraksi yang memiliki aktivas tertinggi. Fraksi-
fraksi yang diperoleh pada tahap ini antara lain adalah sampel label A diperoleh
sebanyak dua fraksi, yaitu AI-2 dan AII. Sampel B diperoleh empat fraksi, yaitu
BIV-1α, BIV-1β, BIV-2, dan BIV-3. Sampel C dan D diperoleh masing-masing satu
fraksi, yaitu CIII dan DIV. Fraksi ini selanjutnya dianalisis dengan menggunakan
protein sequencer untuk menentukan sekuen peptida ACE inhibitor.
4.4 Peptida ACE Inhibitor
4.4.1 Penentuan Sekuen Peptida ACE Inhibitor
Delapan fraksi aktif sebagai ACE inhibitor berhasil diperoleh setelah
beberapa tahap purifikasi menggunakan RP-HPLC. Fraksi aktif dari hasil
purifikasi dikonfirmasi massa molekulnya dengan analisis kromatografi cair-
spektroskopi massa (LCMS) dengan teknik ESI (electron spray ionization). Fraksi
aktif yang telah dianalisis dengan spektroskopi massa dilanjutkan ke tahap
penentuan sekuen peptida. Metode degradasi Edman menjadi dasar reaksi dalam
penentuan sekuen dari peptida dan dalam penelitian kali ini adalah penentuan
peptida ACE inhibitor.
Fraksi BIV-3 dipilih untuk menjadi salah satu contoh dalam penentuan
sekuen peptida atau peptide sequencing. Pemilihan BIV-3 dikarenakan
menunjukkan data spektroskopi masa dan data reaksi degradasi (data penentuan
sekuen) yang baik. Hasil analisis spektroskopi massa dari fraksi BIV-3
menunjukkan nilai m/z sebesar 728,30 yang merupakan nilai m/z dari ion molekul
51
[M+H+]. Teknik ESI mempengaruhi pembentukan ion molekulnya dengan
penambahan ion H+ di dalam molekul yang artinya ada penambahan massa
molekul sebesar 1 Da, sehingga molekul peptida ACE inhibitor dari fraksi BIV-3
diduga memiliki massa molekul sebesar 727 Da. Hasil analisis spektroskopi
massa ditunjukan pada Gambar 14.
Gambar 14. Data spektoskopi massa fraksi BIV-3
Analisis data penentuan sekuen peptida ACE inhibitor juga dapat
dikatakan bergantung pada data yang diperoleh selama penentuan sekuen peptida
ACE inhibitor dengan menggunakan automatic protein sequencer model PPSQ-
31A (Shimadzu, Biotech). Data yang dihasilkan analisis ini merupakan data nilai
absorbansi senyawa PTH-asam amino (N-feniltiohidantoin-asam amino) pada
panjang gelombang 269 nm yang diterima selama proses reaksi degradasi Edman
(Bodanszky, 1998; Champe et al., 2010).
Data absorbansi senyawa PTH-asam amino dikonversikan ke dalam
bentuk konsentrasi dari senyawa PTH-asam amino yang teranalisis pada setiap
52
tahap degradasi peptida dan menjadi data estimasi dari asam amino (dalam bentuk
berat; pmol). Data hasil penentuan sekuen peptida ACE inhibitor untuk fraksi BIV-
3 ditunjukkan pada Tabel 9.
Tabel 9. Data hasil analisa sekensing peptida ACE inhibitor Fraksi BIV-3
Asam
Amino
Berat Setiap Tahap Degradasi Edman (pmol)*
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Asp 0 2.75 4.31 0 6.64 7.54 8.12 6.15 5.82
Glu 7.31 7.32 1.96 5.48 4.42 4.06 14.91 3.39 2.84
Asn 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Gln 2.35 1.24 1.87 11.58 2.17 2.36 56.67 9.94 7.41
Ser 0 0 0 62.82 2.02 0 0 0 0
Thr 0 0 0 0 0 0 0 0 0
His 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Gly 9.13 5.13 4.03 7.08 4.78 5.51 4.87 4.12 4.09
Ala 699.64 12.48 2.71 8.72 2.48 260.14 17.55 2.19 0
Tyr 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Arg 14.72 7.36 164.01 28.1 12.61 8.02 2.78 0 0
Met 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Val 2.43 558.62 8.88 0 0 0 0 0 0
Pro 0 16.47 4.9 2.79 160.9 16.43 16.43 0 0
Trp 0 0 0 1.99 0 0 0 0 0
Phe 1.89 0 0 0 0 0 0 0 0
Lys .7.22 0 6.18 2.97 2.23 0 0 0 1.9
Ile 2.36 0 0 0 0 0 0 0 0
Leu 0 0 0 0 1.59 0 0 0 0
*pmol = pikomol
Data asam amino (pmol) yang berhasil dianalisis dalam setiap tahap
degradasi diolah oleh sistem penentuan sekuen peptida otomatis yang terinstal,
sehingga didapatkan data estimasi sekuen peptida dan data nilai evaluasi. Data
hasil penentuan urutan peptida yang ditunjukkan oleh Tabel 9, menggambarkan
jika pada tahap pertama degradasi asam amino alanin terdeteksi dengan berat yang
terdeteksi 699,64 pmol.
Alanin terinterpretasi pada tahap pertama ini akibat terbentuknya senyawa
hasil reaksi degradasi Edman, yaitu PTH-alanin (N-feniltiohidantoin-alanin) yang
terdeteksi selama analisis kromatografi dengan detektor UV-Vis pada panjang
gelombang 269 nm. Tahap degradasi kedua juga dengan proses yang sama,
sehingga asam amino yang terdeteksi adalah valin. Arginin, serin, prolin, alanin
dan glutamin menjadi produk dari degradasi pada tahap berikutnya (Tabel 9).
53
Berdasarkan data yang didapatkan, estimasi sekuen peptida ACE inhibitor dari
fraksi BIV-3 ditunjukkan pada Tabel 10.
Tabel 10. Data estimasi sekuen peptida ACE inhibitor fraksi BIV-3
Estimasi Sekuen Tahap Degradasi Edman
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1st Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Trp Tyr
2nd Arg Pro Lys Gln Leu Ile Glu Phe Phe
3rd Lys Glu Glu Ala Asp Asp Gly Gly Met
4th Phe His Ser Trp Asn Phe Thr Lys Gly
Tingkat Keandalan (%) 100 100 100 100 100 100 53.6 11 5.4
Data estimasi sekuen peptida ACE inhibitor dari fraksi BIV-3 disimpulkan
bahwa sekuen peptida ACE inhibitor adalah Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
(AVRSPAQ). Hasil ini didapat berdasarkan dengan data estimasi yang muncul
dengan tingkat keandalan (degree of reliability) dari asam amino pada setiap
tahap degradasinya yang sebagian besarnya memiliki tingkat mencapai 100 %.
Sekuen heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln yang merupakan fraksi BIV-3
ini juga terdeteksi dalam LCMS dengan massa ion molekul [M+H+] dengan nilai
m/z sebesar 728,30 Da atau memiliki massa molekul sebesar 727 Da (Gambar
14). Massa molekul ini merupakan massa molekul dari heptapeptida Ala-Val-Arg-
Ser-Pro-Ala-Gln (AVRSPAQ) yang merupakan fragmen dari protein κ-Kasein
F87-93 dari susu kerbau (Bubalus bubalis) (Gambar 15).
κ-Kasein (Protein Induk) Susu Kerbau (Bubalus bubalis)
1 MMKSFFVVT ILALTLPFLG AQEQNQEQPI RCEKEERFFN DKIAKYIPIQ YVLSRYPSYG
61 LNYYQQKPVA LINNQFLPYP YYAKPAAVRS PAQILQWQVL PNTVPAKSCQ AQPTTMTRHP
121 HPHLSFMAIP PKKNQDKTEI PTINTIVSVE PTSTPTTE ENTVATLEAS SEVIESVEPT
181 NTAQVTSTVV
Gambar 15. Urutan protein induk κ-Kasein susu kerbau (Bubalus bubalis)
(Kishore et al., 2014)
Seluruh fraksi aktif yang didapatkan selama proses purifikasi
menggunakan RP-HPLC juga dilakukan penentuan sekuen peptida ACE inhibitor.
54
Sekuen peptida ACE inhibitor yang berhasil dianalisis dengan protein sequencer
dari keseluruhan fraksi aktif dapat dilihat pada Tabel 11.
Tabel 11. Data sekuen peptida ACE inihibitor
Fraksi Sekuen Peptida Protein Induk Fragmen Massa Molekul (Da)
AI-2 GVSKVK β-Kasein F109-114 616
AII TNTAQ κ –Kasein F180-184 533
BIV-1α STPTTE κ-Kasein F153-158 634
BIV-1β VEPT κ-Kasein F149-152 444
BIV-2 SLSQS β-Kasein F179-183 520
BIV-3 AVRSPAQ κ-Kasein F87-93 727
CIII LPV β-Kasein F186-188 327
DIV LSQSKV β-Kasein F180-184 561
V= Valin, S= Serin, R= Arginin, K= Lisin, T= Treonin, Q= Glutamin
P= Prolin, G= Glisin, E= Asam glutamat, L= Leusin, N= Asparagin
Data hasil sekuensing peptida ACE inhibitor, ada sebanyak 8 peptida yaitu
Leu-Pro-Val (LPV), Ser-Leu-Ser-Gln-Ser (SLSQS), Val-Glu-Pro-Thr (VEPT),
Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu (STPTTE), Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
(AVRSPAQ), Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys (GVSKVK), Thr-Asn-Thr-Ala-Gln
(TNTAQ) dan Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val (LSQSKV). Peptida-peptida ini
ditentukan dengan berdasarkan hasil dari analisa spektroskopi massa, analisa data
degradasi Edman pada tahap sekuensing, dan pemeriksaan di basis data protein
dari susu kerbau. Sekuen peptida yang berhasil dipurifikasi ini sebagian besar
memiliki residu prolin pada sekuen peptidanya. Ini sesuai dengan pendapat
López-Fandiño et al. (2006) yang menyatakan bahwa peptida ACE inhibitor
memiliki residu prolin pada sekuen peptidanya. Pengaruh aktivitas juga
disebabkan oleh asam amino pada terminal-C yang memiliki muatan positif pada
gugus ε-amino seperti lisin dan arginin (Cheung et al., 1980). Ada satu peptida
yang memiliki lisin pada terminal-C yaitu Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys (GVSKVK).
Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val (LSQSKV) memiliki residu lisin pada posisi ke-lima
(posisi 2 dari terminal-C) yang diduga muatan positif pada gugus ε-amino sedikit
mempengaruhi aktivitasnya. Peptida ini juga memiliki asam amino hidrofobik
55
pada terminal-N yang mempengaruhi aktivitas ACE inhibitor (Cheung et al.,
1980; López-Fandiño et al., 2006)
Yamamoto et al. (1994) berhasil mengisolasi peptida ACE inhibitor
dengan sekuen Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln
dan Pro-Pro-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-
Gln dari β-Kasein dengan masing-masing nilai IC50 sebesar 39 µM dan 25 µM.
Dua peptida ini diisolasi dari susu sapi yang diproduksi dengan proteinase
ekstraseluler dari Lactobacillus helveticus CP790. Apabila diperhatikan dari dua
sekuen peptida ACE inhibitor ini mencangkup 3 peptida ACE inhibitor yang
berhasil teridentifikasi dalam penelitian ini, yaitu Leu-Pro-Val, Ser-Leu-Ser-Gln-
Ser, dan Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val.
Sekuen tripeptida Leu-Pro-Val juga memiliki kemiripan sekuen dengan
sekuen Leu-Pro-Val-Pro-Gln yang diisolasi dari BSMR yang dihidrolisis dengan
enzim papain (Abdel-Hamid et al., 2017). Sekuen tripeptida Leu-Pro-Val juga
memiliki kemiripan sekuen dengan Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro dan Lys-Val-Leu-
Pro-Val-Pro-Gln yang diisolasi dari hidrolisat kasein susu sapi yang diproduksi
dengan proteinase ekstraseluler dari Lactobacillus helveticus CP790 (Maeno et
al., 1996). Tripeptida Leu-Pro-Val juga memiliki kemiripan dengan oktapeptida
Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys yang diisolasi dari hidrolisat susu lembu
berbulu panjang (Jiang et al., 2006).
Sekuen tetrapeptida Val-Glu-Pro-Thr memiliki kemiripan dengan sekuen
peptida yang diisolasi dari BSMR yang dihidrolisis dengan enzim papain, yaitu
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr (Abdel-Hamid et al., 2017). Empat peptida ACE
inhibitor yang lain seperti Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu, Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-
56
Gln, Gly-Val-Seri-Lys-Val-Lys, Thr-Asn-Thr-Ala-Gln masih belum ditemukan
adanya sekuen yang memiliki kemiripan dengan peptida ACE inhibitor yang
pernah dilaporkan sebelumnya (Hayes et al., 2007; Meisel, 1998; Nielsen et al.,
2017; Yamamoto, 1997; Yamamoto dan Takano, 1999). Empat peptida ini dapat
dipertimbangkan menjadi sekuen peptida ACE inhibitor baru yang berhasil
dipurifikasi dari susu kerbau fermentasi (dadih) yang merupakan subyek baru
dalam penelitian terkait.
4.4.2 Peptida Sintesis
Peptida yang teridentifikasi selanjutnya akan menjadi bio-template untuk
sintesis peptida ACE inhibitor. Ada enam peptida yang menjadi bio-template
dalam penelitian ini, yaitu Leu-Pro-Val (LPV), Ser-Leu-Ser-Gln-Ser (SLSQS),
Val-Glu-Pro-Thr (VEPT), Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu (STPTTE), Ala-Val-Arg-Ser-
Pro-Ala-Gln (AVRSPAQ), dan Gly-Val-Seri-Lys-Val-Lys (GVSKVK). Pemilihan
peptida yang menjadi bio-template ini berdasarkan perwakilan dari peptida yang
mirip dengan peptida yang sudah dilaporkan sebelumnya dan peptida baru yang
belum pernah dilaporkan. Perwakilan peptida ini masing-masing sebanyak 3. Leu-
Ser-Gln-Ser-Lys-Val (LSQSKV) tidak dipilih karena memiliki kemiripan dengan
dengan Ser-Leu-Ser-Gln-Ser (SLSQS), sementara Thr-Asn-Thr-Ala-Gln
(TNTAQ) memiliki kepolaran yang tinggi dan sudah diwakili oleh dua peptida
polar lainnya yaitu Ser-Leu-Ser-Gln-Ser (SLSQS) dan Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu
(STPTTE).
Peptida-peptida ini diuji aktivitas penghambatannya terhadap ACE secara
in vitro dengan digunakan konsentrasi 1000 µM pada tahap awal sebelum
57
pengujian untuk mendapatkan nilai IC50. Data hasil pengujian aktivitas ACE
inhibitor ditunjukan pada Gambar 16.
Gambar 16. Aktivitas ACE inhibitor peptida sintesis
Data hasil pengujian aktivitas ACE inhibitor diperoleh peptida dengan
aktivitas tertinggi yaitu heptapeptida dengan sekuen Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
(Gambar 16). Pengujian aktivitas ACE inhibitor digunakan peptida sintesis
dengan konsentrasi 1000 µM. Hasil pengujian aktivitas ini juga dapat disimpulkan
jika lima peptida sintesis memiliki nilai IC50 lebih dari 1000 µM, karena pada
pengujian aktivitas ini ke-lima peptida memiliki aktivitas di bawah 50% pada
konsentrasi 1000 µM.
Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln yang memiliki aktivitas
tertinggi sebesar 93,103%, sehingga hanya peptida ini yang diuji nilai IC50.
Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln memiliki nilai IC50 sebesar 42,019
µM (Lampiran 9). Dari hasil ini, heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
24.796
9.6774
44.474
16.529
26.087
93.103
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
LPV VEPT SLSQS STPTTE GVSKVK AVRSPAQ
Akti
vit
as P
engh
amb
atan
AC
E (
%)
Sekuen Peptida
58
termasuk peptida ACE inhibitor yang cukup baik, karena memiliki nilai IC50 di
bawah 100 µM (Huang et al., 2003).
Gambar 17. Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (A), captopril (B) dan
lisinopril (C)
Sekuen heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (Gambar 16A)
dibandingkan dengan ACE inhibitor sintesis, seperti captopril (Gambar 16B) dan
lisinopril (16C). Perbandingan dilakukan dengan melihat interaksi molekular dari
captopril dan lisinopril dengan ACE, seperti interaksi ikatan hidrogen dan
interaksi logam-ligan (ikatan kompleks). Interaksi molekular yang terjadi pada
dua ACE inhibitor sintesis diduga dapat terjadi pada heptapeptida Ala-Val-Arg-
Ser-Pro-Ala-Gln.
Peptida ACE inhibitor umumnya memiliki residu prolin di dalam
sekuennya (Cheung et al., 1980; López-Fandiño et al., 2006). Captopril dan
Lisinopril memiliki terminal prolin pada ujung molekulnya yang berinteraksi
dengan sisi aktif pada ACE. Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln juga memiliki residu
59
prolin pada posisi ke-lima pada heptapeptida. Residu prolin pada heptapeptida
Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln kemungkinan mengalami interaksi yang sama
dengan sisi aktif ACE, meskipun posisi prolin pada Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
dengan captopril dan Lisinopril berbeda. Ini sesuai dengan argumentasi Rohrbach
et al. (1981) yang menyatakan bahwa residu prolin pada urutan ke-tiga hingga
urutan terakhir dalam sekuen peptida ACE inhibitor juga mampu meningkatkan
afinitas pengikatan dengan ACE.
Gugus karbonil sentral yang ada di antara gugus sulfhydril dan terminal
prolin pada captopril akan membentuk ikatan hidrogen dengan dua residu histidin
pada ACE. Oksigen yang merupakan bagian karboksilat terminal prolin
membentuk ikatan hidrogen dengan residu tirosin, glutamin dan lisin pada ACE
(Natesh et al., 2004). Interaksi ikatan hidrogen ini juga diduga terbentuk pada
gugus karbonil yang dimiliki residu serin pada urutan ke-empat peptida dan
bersebelahan dengan residu prolin pada Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln. Ikatan
hidrogen yang terjadi pada oksigen karboksilat dari terminal prolin yang dimiliki
captopril tidak dimiliki oleh peptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln. Ini bisa
dijadikan alasan dari perbedaan kekuatan ACE inhibitor antara captopril dengan
Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln.
ACE memiliki ion Zn2+ di dalam molekul yang berlaku sebagai sisi aktif.
Ion Zn2+ membentuk ikatan kovelen kordinasi dengan sulfhydryl bebas pada
captopril, sementara pada lisinopril ikatan kovalen koordinasi terbentuk antara
ion Zn2+ dengan gugus karboksil dari fenilalanin yang terjadi di dalam docking
simulation (Natesh et al., 2004). Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
memiliki residu arginin yang pada molekulnya terdapat dua gugus amina yang
60
dapat mendonorkan pasangan elektron bebasnya. Dua gugus amina pada residu
arginin ini diduga berkesempatan menjadi ligan yang akan berikatan koodinasi
dengan ion Zn2+ pada sisi aktif ACE.
Kemampuan peptida ACE inhibitor juga dipengaruhi beberapa faktor lain
yang mampu meningkatkan kekuatan aktivitas penghambatannya terhadap ACE.
Asam amino yang memiliki rantai cabang (valin, leusin, dan isoleusin) dan asam
amino hidrofobik pada terminal-N juga dapat meningkatkan pengikatan ACE
(Cheung et al., 1980). Heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln memang tidak
memiliki asam amino rantai cabang pada terminal-N, namun di posisi kedua
terdapat residu yang memiliki rantai cabang, yaitu residu valin. Informasi ini
dapat diasumsikan jika rantai cabang pada residu dengan posisi terdekat dengan
terminal-N juga mampu meningkatkan pengikatan dengan ACE.
Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (Maeno et al., 1996) dan Ser-Val-Leu-Ser-Leu-
Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (Yamamoto et al., 1994) memiliki
residu valin pada posisi kedua dalam sekuen peptidanya dan keduanya memiliki
nilai IC50 masing-masing sebesar 5 µM dan 39 µM. Nilai IC50 dari kedua peptida
ini memang lebih kecil dibandingkan dengan Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln, hal
ini tentunya dipengaruhi oleh faktor lain yang dimiliki dua peptida tersebut. Hasil
perbandingan secara molekuler antara heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
dengan dua senyawa obat ACE inhibitor dan peptida-peptida yang dilaporkan
pada penelitian sebelumnya memberikan informasi bagaimana Ala-Val-Arg-Ser-
Pro-Ala-Gln mampu menginhibisi ACE dan aktivitas ACE inhibitor-nya. Ala-
Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln juga dapat dipertimbangkan menjadi peptida ACE
inhibitor baru, karena belum ada laporan terkait sekuen peptida yang sama
61
sebelumnya (Hayes et al., 2007; Meisel, 1998; Nielsen et al., 2017; Yamamoto,
1997; Yamamoto dan Takano, 1999).
Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln memiliki nilai IC50 sebesar 42,019 µM.
Captopril diketahui memiliki nilai IC50 sebesar 21 – 25 nM (Salmenkari et al.,
2017; Xin et al., 2003). Aktivitas ACE inhibitor dari captopril masih jauh lebih
tinggi dibandingkan dengan Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln yang berhasil
dipurifikasi dari susu kerbau fermentasi. Sintesis Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
sebagai kandidat obat antihipertensi diperlukan pertimbangan lebih lanjut lagi,
karena dosis yang digunakan akan sangat tinggi untuk mencapai aktivitas yang
sama dengan obat komersial seperti capropril. Susu kerbau fermentasi (dadih)
yang mengandung peptida ACE inhibitor, seperti Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
ini lebih mengarah kepada pangan fungsional antihipertensi dibandingkan sebagai
kandidat obat untuk menggantikan obat komersial lain, seperti captopril dan
lisinopril.
4.5 Mekanisme Reaksi Degradasi Edman Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
Degradasi Edman menjadi reaksi yang mendasari penentuan sekuen.
Reaksi degradasi Edman dikenal juga dengan reagensia Edman. Reaksi ini
dilakukan dengan mengolah peptida dengan reagen fenil-isotiosianat (PITC).
Reaksi antara fenil-isotiosianat dengan gugus amina (–NH2) pada ujung nitrogen
atau terminal-N dari peptida menyebabkan terjadinya pemutusan asam amino
terminal-N dari peptidanya dan membentuk feniltiohidantoin (PTH) (Fessenden
dan Fessenden, 1986; McMurry, 2008). Reaksi ini terjadi dalam setiap tahap
penentuan sekuen peptida, salah satunya yaitu heptapeptida ACE inhibitor Ala-
Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln.
62
Degradasi Edman diawali dengan bereaksinya PITC dengan heptapeptida
Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln di dalam pelarut trietilamina dan pH 8. Gugus
amina pada alanin terminal-N yang memiliki pasangan elektron bebas berinteraksi
dengan karbon pada gugus tiosianat (–N=C=S) pada senyawa fenil isotiosianat.
Reaksi ini merupakan jenis reaksi adisi nukleofilik (Bodanszky, 1998; McMurry,
2008). Tahap pertama reaksi ini menghasilkan senyawa N-feniltiourea-Ala-Val-
Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (Gambar 18).
Gambar 18. Reaksi PITC dengan heptapetida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
N-feniltiourea-Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln yang terbentuk dari reaksi
adisi nukleofil pada tahap pertama mengalami reaksi siklisasi dalam katalis asam.
Asam yang digunakan yaitu triflouroasetat (TFA) Siklisasi terjadi antara karbon
dari gugus karbonil (C=O) asam amino terminal-N dengan gugus tiol (–SH ) yang
memiliki pasangan elektron bebas. Atom belerang (S) terikat dengan karbon
63
karbonil, sementara oksigen karbonil akan mengikat ion hidrogen (H+) dari TFA
dan membentuk gugus hidroksil (–OH). Reaksi yang terjadi ditunjukkan pada
Gambar 19.
Gambar 19. Siklisasi katalitik asam senyawa intermediet feniltiourea
Gugus hidroksil (–OH) pada senyawa intermediet N-feniltiourea yang
memiliki pasang elektron bebas mengalami pergeseran elektron. Pergeseran
elektron ini menyebabkan terjadinya pembentukkan gugus karbonil yang
terprotonasi (C=OH+). Pergeseran elektron ini tidak hanya menyebabkan
pembentukan ikatan rangkap antara C dengan O, namun gugus amina dari residu
valin mengalami pemutusan badan feniltiourea dan mengikat ion hidrogen dari
64
asam di dalam sistem reaksi. Gugus karbonil yang terprotonasi mengalami
pelepasan ion hidrogen dan membentuk senyawa derivatif anilina-tiazolinon
(ATZ), yaitu anilina-metiltiazolinon. Pengikatan ion hidrogen oleh gugus amina
valin menyebabkan pembentukan peptida yang lebih pendek dan valin menjadi
asam amino terminal-N, sehingga terbentuk heksapeptida Val-Arg-Ser-Pro-Ala-
Gln. Reaksi ditunjukkan pada Gambar 20.
Gambar 20. Reaksi penguraian derivat feniltiourea menjadi anilin-metiltiazolinon
dan heksapeptida Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
Anilina-metiltiazolinon (derivatif ATZ) mengalami penataan ulang dalam
kondisi asam membentuk senyawa isomer N-feniltiohidantoin-alanin (PTH-
alanin). Penataan ulang diawali oleh nitrogen dari anilina (-N=C-) yang memiliki
ikatan rangkap. Ikatan rangkap (ikatan π) dari nitrogen akan menyerang karbon
dari gugus karbonil. Penyerangan nitrogen memicu terjadinya pelepasan ikatan
65
antara atom belerang dengan karbon karbonil. Atom belerang yang bermuatan
negatif membentuk ikatan rangkap dengan karbon yang sebelumnya berikatan
rangkap dengan nitrogen. Reaksi penataan ulang ditunjukkan pada Gambar 21.
Gambar 21. Penataan ulang derivatif ATZ membentuk PTH-alanin
PTH-alanin yang terbentuk terelusi dan dianalisa kromatografi dengan
detektor UV pada panjang gelombang 269 nm. Heksapeptida Val-Arg-Ser-Pro-
Ala-Gln kembali didegradasi dengan mekanisme yang sama sebagai degradasi
tahap kedua dan seterusnya.
66
BAB V
PENUTUP
5.1 Simpulan
Delapan peptida berhasil dipurifikasi dari susu kerbau fermentasi, antara
lain yaitu Leu-Pro-Val (LPV), Ser-Leu-Ser-Gln-Ser (SLSQS), Val-Glu-Pro-Thr
(VEPT), Ser-Thr-Pro-Thr-Thr-Glu (STPTTE), Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
(AVRSPAQ), Gly-Val-Ser-Lys-Val-Lys (GVSKVK), Thr-Asn-Thr-Ala-Gln
(TNTAQ), dan Leu-Ser-Gln-Ser-Lys-Val (LSQSKV). Heptapeptida Ala-Val-Arg-
Ser-Pro-Ala-Gln (AVRSPAQ) dengan massa molekul sebesar 727 Da yang
merupakan fragmen dari κ-kasein-f87-93 menjadi peptida dengan aktivitas
penghambatan tertinggi mencapai 93,101 % dan memiliki nilai IC50 sebesar
42,0199 µM. serta merupakan sekuen peptida ACE inhibitor baru.
5.2 Saran
Kajian lebih lanjut terkait dengan aktivitas antihipertensi secara in vivo
dengan menggunakan SHR (spontaneous hypertensive rats) dan kajian secara
komputasi atau in silico untuk mengetahui interaksi molekular lebih mendalam
yang terjadi antara heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (AVRSPAQ)
dengan ACE dan dibandingkan dengan Lisinopril dan captopril. Variasi
heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln (AVRSPAQ) juga dapat dimodifikasi
sekuennya dengan dilakukan pemotongan residu asam amino, terminal-C dan
terminal-N.
67
DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Hamid, M., Otte, J., De Gobba, C., Osman, A., & Hamad, E. (2017).
Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity and antioxidant capacity
of bioactive peptides derived from enzymatic hydrolysis of buffalo milk
proteins. International Dairy Journal, 66, 91–98.
https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2016.11.006
Abubakar, A. (2004). Isolasi Peptida Anti Hipertensi dari Protein Susu.
J.Indon.Trop.Agric, 3(29), 121–128.
Afriani, R., & Rahayu, P. (2009). Potensi bakteri asam laktat dadih dari
Kabupaten Kerinci sebagai biopreservatif pangan. Laporan Penelitian.
Afriani, Suryono, & Lukman, H. (2011). Karakteristik Dadih Susu Sapi Hasil
Fermentasi Beberapa Starter Bakteri. Agrinak, 01, 36.
Aguilar-Toalá, J. E., Santiago-López, L., Peres, C. M., Peres, C., Garcia, H. S.,
Vallejo-Cordoba, B., … Hernández-Mendoza, A. (2017). Assessment of
multifunctional activity of bioactive peptides derived from fermented milk
by specific Lactobacillus plantarum strains. Journal of Dairy Science, 1–11.
https://doi.org/10.3168/jds.2016-11846
Andrade-eiroa, A., Canle, M., Leroy-cancellieri, V., & Cerdà, V. (2016). Trends
in Analytical Chemistry Solid-phase extraction of organic compounds : A
critical review ( Part I ). Trends in Analytical Chemistry, 80, 641–654.
https://doi.org/10.1016/j.trac.2015.08.015
Arihara, K. (2013). Relevance of peptides bioactivity in foods. In Proteomics in
foods (pp. 447–463). Springer.
Arihara, K., Nakashima, Y., Mukai, T., Ishikawa, S., & Itoh, M. (2001). Peptide
inhibitors for angiotensin I-converting enzyme from enzymatic hydrolysates
of porcine skeletal muscle proteins. Meat Science, 57, 319–324.
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. (2013). Riset Kesehatan Dasar
(RISKESDAS) 2013. Laporan Nasional 2013, 1–384. https://doi.org/1
Desember 2013
Biffi, A., Coradini, D., Larsen, R., Riva, L., & Di Fronzo, G. (1997).
Antiproliferative effect of fermented milk on the growth of a human breast
cancer cell line. Nutrition and Cancer, 28(1), 93–99.
https://doi.org/10.1080/01635589709514558
Bodanszky, M. (1998). Kimia Peptida. (T. Sutomo, Ed.). Bandung: Penerbit ITB.
Cai, L., Wu, X., Zhang, Y., Li, X., & Ma, S. (2015). Purification and
characterization of three antioxidant peptides from protein hydrolysate of
grass carp ( Ctenopharyngodon idella ) skin. Journal of Functional Foods,
16, 234–242. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.04.042
68
Chalid, S. Y., & Hartiningsih, F. (2013). Potensi Dadih Susu Kerbau Fermentasi
Sebagai Antioksidan dan Antibakteri. Semirata FMIPA UNILA, 369–376.
Chalid, S. Y., Nurbayti, S., & Pratama, A. F. (2018). Karakterisasi dan Uji
Aktivitas Protein Susu Kerbau (Bubalus bubalis) Fermentasi sebagai
Angiotension Converting Enzyme ( ACE ) Inhibitor. Jurnal Ilmu
Kefarmasian Indonesia, 16(2), 214–224.
Champe, P. C., Harvey, R. A., & Ferrier, D. R. (2010). Biokimia: Ulasan
Bergambar. (L. Y. Rahman & F. Dany, Eds.) (3rd ed.). Jakarta: ECG.
Chawla, G., & Ranjan, C. (2016). Principle, Instrumentation, and Applications of
UPLC: A Novel Technique of Liquid Chromatography. Open Chemistry
Journal, 3(1).
Chen, Y., Liu, W., Xue, J., Yang, J., Chen, X., Shao, Y., & Kwok, L. (2014).
Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of Lactobacillus
helveticus strains from traditional fermented dairy foods and
antihypertensive effect of fermented milk of strain H9. Journal of Dairy
Science, (1), 1–13. https://doi.org/10.3168/jds.2014-7962
Cherlet, M., Backer, P. De, & Croubels, S. (2006). Control of the keto-enol
tautomerism of chlortetracycline for its straightforward quantitation in pig
tissues by liquid chromatography – electrospray ionization tandem mass
spectrometry, 1133, 135–141. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.08.008
Cheung, H.-S., Wang, F.-L., Ondetti, M. A., & Cushman, D. W. (1980). Binding
of Peptide Substrates and Inhibitors of Angiotensin-converting Enzyme -
Importance of The COOH-Terminal Dipeptide Sequence. Journal of
Biological Chemistry, 255(2), 401–405.
Cushman, D. W., & Cheung, H.-S. (1971). Spectrophotometric Assay and
Properties of The Angiotensin-Converting Enzyme of Rabbit Lung.
Biochemichal Pharmacology, 20, 1637–1648.
Edman, P. V., & Begg, G. (1967). A Protein Sequenator. European Journal of
Biochemistry, 1(1), 80–91. https://doi.org/10.1111/j.1432-
1033.1967.tb00047.x
Fessenden, R. J., & Fessenden, J. S. (1986). Kimia Organik. (A. H. Pudjaatmaka,
Ed.) (3rd ed.). Penerbit Erlangga.
Fitrianto, H., Azmi, S., & Kadri, H. (2014). Penggunaan Obat Antihipertensi pada
Pasien Hipertensi Esensial di Poliklinik Ginjal Hipertensi RSUP DR. M.
Djamil Tahun 2011. Jurnal Kesehatan Andalas, 3(1), 45–48.
Gaucheron, F. (2005). The Mineral of Milk. Reproduction, Nutrition,
Development, 45(6), 473–483. https://doi.org/10.1051/rnd
Ghassem, M., Babji, A. S., Said, M., Mahmoodani, F., & Arihara, K. (2013).
69
Angiotensin I-Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Snakehead Fish
Sarcoplasmic Protein Hydrolysate. Journal of Food Biochemistry, 38, 140–
149. https://doi.org/10.1111/jfbc.12031
Gilart, N., Marcé, R. M., Borrull, F., & Fontanals, N. (2014). Trends in Analytical
Chemistry New coatings for stir-bar sorptive extraction of polar emerging
organic contaminants, 54, 11–23. https://doi.org/10.1016/j.trac.2013.10.010
Harvey, D. (1962). Modern Analytical Chemistry. Analytical Chemistry (Vol. 34).
https://doi.org/10.1021/ac60187a708
Hayes, M., Stanton, C., Fitzgerald, G. F., & Ross, R. P. (2007). Putting microbes
to work: Diary fermentation, cell factories and bioactive peptides. Part II:
Bioactive peptide functions. Biotechnology Journal, 2(4), 435–449.
https://doi.org/10.1002/biot.200700045
Hennion, M. (1999). Solid-phase extraction : method development , sorbents , and
coupling with liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 856, 3–
54. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(99)00832-8
Hernández-Ledesma, B., Miralles, B., Amigo, L., Ramos, M., & Recio, I. (2005).
Identification of antioxidant and ACE-inhibitory peptides in fermented milk.
Journal of the Science of Food and Agriculture, 85(6), 1041–1048.
https://doi.org/10.1002/jsfa.2063
Huang, L., Sexton, D. J., Skogerson, K., Devlin, M., Smith, R., Sanyal, I., Parry,
T., Kent, R., Enright, J., Wu, Q., Conley, G., Deoliveira, D., Morganelli, L.,
Ducar, M., Wescott, C., Ladner, R. C. (2003). Novel Peptide Inhibitors of
Angiotensin-converting Enzyme 2 *, 278(18), 15532–15540.
https://doi.org/10.1074/jbc.M212934200
Imai, K., Tekeuchi, M., Sakane, T., & Ganjar, I. (1987). Bacterial Flora in Dadih.
IFO Research Communications, 13, 13–16.
Iskandar, Y. (2007). Tanaman Obat yang Berkhasiat Sebagai Antihipertensi.
Bandung.
Jang, A., & Lee, M. (2005). Purification and identification of angiotensin
converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates. Meat Science,
69, 653–661. https://doi.org/10.1016/j.meatsci.2004.10.014
Jiang, J., Chen, S., Ren, F., Luo, Z., & Zeng, S. S. (2006). Yak Milk Casein as a
Functional Ingredient : Preparation and Identification of Angiotensin-I-
Converting Enzyme Inhibitory Peptides. Journal of Dairy Research, 74, 18–
25. https://doi.org/10.1017/S0022029906002056
Kayser, H., & Meisel, H. (1996). Stimulation of human peripheral blood
lymphocytes by bioactive peptides derived from bovine milk proteins. FEBS
Letters, 383(1–2), 18–20.
70
Khirzin, M. H., Yuliana, N. D., Fawzya, Y. N., & Chasanah, E. (2015). The
Activity of Angiotensin Converting Enzyme ( ACE ) Inhibitor and Collagen
Peptide Antioxidant from Gama Sea Cucumber (Stichopus variegatus). JPB
Kelautan Dan Perikanan, 10(1), 27–35.
Kishore, A., Mukesh, M., Sobti, R. C., Kataria, R. S., Mishra, B. P., & Sodhi, M.
(2014). Analysis of genetic variations across regulatory and coding regions
of kappa-casein gene of Indian native cattle (Bos indicus) and buffalo
(Bubalus bubalis). Meta Gene, 2, 769–781.
https://doi.org/10.1016/j.mgene.2014.10.001
Korhonen, H. (2009). Milk-derived bioactive peptides: From science to
applications. Journal of Functional Foods, 1(2), 177–187.
https://doi.org/10.1016/j.jff.2009.01.007
LeBlanc, J. G., Matar, C., Valdéz, J. C., LeBlanc, J., & Perdigon, G. (2002).
Immunomodulating Effects of Peptidic Fractions Issued from Milk
Fermented with Lactobacillus helveticus. Journal of Dairy Science, 85(11),
2733–2742. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(02)74360-9
Lee, S. Y., & Hur, S. J. (2017). Antihypertensive peptides from animal products ,
marine organisms , and plants. Food Chemistry, (February).
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.02.039
Li, G.-H., Le, G.-W., Shi, Y.-H., & Shrestha, S. (2004). Angiotensin I–converting
enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their
physiological and pharmacological effects. Nutrition Research, 24(7), 469–
486. https://doi.org/10.1016/j.nutres.2003.10.014
Li, H., James, P., Turnipseed, S. B., & Cui, W. (2006). Analysis of veterinary
drug residues in shrimp : A multi-class method by liquid chromatography –
quadrupole ion trap mass spectrometry, 836, 22–38.
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.03.025
Li, Y., Sadiq, F. A., Liu, T., & Chen, J. (2015). Purification and identification of
novel peptides with inhibitory effect against angiotensin I-converting enzyme
and optimization of process conditions in milk fermented with the yeast
Kluyveromyces marxianus. Journal of Functional Foods, 16, 278–288.
https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.04.043
López-Fandiño, R., Otte, J., & Camp, J. Van. (2006). Physiological , chemical and
technological aspects of milk-protein-derived peptides with antihypertensive
and ACE-inhibitory activity, 16, 1277–1293.
https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2006.06.004
Machado, J. J. B., Coutinho, J. A., & Macedo, E. A. (2000). Solid-liquid
equilibrium of α-lactose in ethanol/water. Fluid Phase Equilibria, 173(1),
121–134. https://doi.org/10.1016/S0378-3812(00)00388-5
71
Maeno, M., Yamamoto, N., & Takano, T. (1996). Identification of an
Antihypertensive Peptide from Casein Hydrolysate Produced by a Proteinase
from Lactobacillus helveticus CP790. Journal of Dairy Science, 79(8), 1316–
1321. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(96)76487-1
McMurry, J. (2008). Organic Chemistry (7th ed.). USA: Thomson.
Meisel, H. (1998). Overview on milk protein-derived peptides. International
Dairy Journal, 8(5–6), 363–373. https://doi.org/10.1016/S0958-
6946(98)00059-4
Mirdhayati, I., Hermanianto, J., Wijaya, C. H., Sajuthi, D., & Arihara, K. (2016).
Angiotensin converting enzyme ( ACE ) inhibitory and antihypertensive
activities of protein hydrolysate from meat of Kacang goat ( Capra aegagrus
hircus ). J Sci Food Agric, 96(November 2015), 3536–3542.
https://doi.org/10.1002/jsfa.7538
Moayedi, A., Mora, L., Aristoy, M., Hashemi, M., Safari, M., & Toldrá, F.
(2016). ACE-Inhibitory and Antioxidant Activities of Peptide Fragments
Obtained from Tomato Processing By-Products Fermented Using Bacillus
subtilis : Effect of Amino Acid Composition and Peptides Molecular Mass
Distribution. Applied Biochemistry and Biotechnology.
https://doi.org/10.1007/s12010-016-2198-1
Mohanty, D. P., Mohapatra, S., Misra, S., & Sahu, P. S. (2016). Milk derived
bioactive peptides and their impact on human health – A review. Saudi
Journal of Biological Sciences, 23(5), 577–583.
https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2015.06.005
Natesh, R., Schwager, S. L. U., Evans, H. R., Sturrock, E. D., & Acharya, K. R.
(2004). Structural Details on the Binding of Antihypertensive Drugs
Captopril and Enalaprilat to Human Testicular Angiotensin I-Converting
Enzyme †,‡. Biochemsitry, 43, 8718–8724.
https://doi.org/10.1021/bi049480n
Ngoh, Y., & Gan, C. (2016). Enzyme-assisted extraction and identification of
antioxidative and a -amylase inhibitory peptides from Pinto beans. FOOD
CHEMISTRY, 190, 331–337.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.05.120
Nielsen, S. D., Beverly, R. L., Qu, Y., & Dallas, D. C. (2017). Milk bioactive
peptide database: A comprehensive database of milk protein-derived
bioactive peptides and novel visualization. Food Chemistry, 232, 673–682.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.04.056
Nishibori, N., Kishibuchi, R., Sagara, T., Itoh, M., & Horie, Y. (2013).
Angiotensin-I converting enzyme ( ACE ) inhibitory activity of aqueous
extract prepared from fermented brown rice : A potential functional food for
management of hypertension, 4(2), 237–245.
72
Okamoto, A., Hanagata, H., Kawamura, Y., & Yanagida, F. (1995). Anti-
hypertensive substances in fermented soybean , natto, 39–47.
Padghan, P. V, Mann, B., & Hati, S. (2017). Purification and Characterization of
Antioxidative Peptides Derived From Fermented Milk ( Lassi ) by Lactic
Cultures. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 0(0),
0. https://doi.org/10.1007/s10989-017-9608-2
Pan, S., Wang, S., Jing, L., & Yao, D. (2016). Purification and characterisation of
a novel angiotensin-I converting enzyme (ACE)-inhibitory peptide derived
from the enzymatic hydrolysate of Enteromorpha clathrata protein. Food
Chemistry, 211, 423–430. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.05.087
Pihlanto, A., Virtanen, T., & Korhonen, H. (2010). Angiotensin I converting
enzyme (ACE) inhibitory activity and antihypertensive effect of fermented
milk. International Dairy Journal, 20(1), 3–10.
https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.07.003
Płotka-Wasylka, J., Szczepańska, N., de la Guardia, M., & Namieśnik, J. (2016).
Modern trends in solid phase extraction: New sorbent media. Trends in
Analytical Chemistry, 77, 23–43. https://doi.org/10.1016/j.trac.2015.10.010
Poedjiadi, A., & Supriyadi, F. M. T. (2005). Dasar-Dasar Biokimia (2nd ed.).
Jakarta: UI Press.
Pritchard, S. R. (2012). Isolation and characterisation of bioactive peptides
derived from milk and cheese. Tesis. University of Western Sydney.
Quirós, A., Ramos, M., Muguerza, B., Delgado, M. A., Miguel, M., Aleixandre,
A., & Recio, I. (2007). Identification of novel antihypertensive peptides in
milk fermented with Enterococcus faecalis, 17, 33–41.
https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2005.12.011
Rahmatia, T. U. (2016). Metode SPE Sebagai Alternatif Terbaru Dalam Analisis
dan Pemurnian Senyawa Obat. Farmaka, 14(2), 151–170.
Ranathunga, S., Rajapakse, N., & Kim, S. (2006). Purification and
characterization of antioxidative peptide derived from muscle of conger eel (
Conger myriaster ), 310–315. https://doi.org/10.1007/s00217-005-0079-x
Rohrbach, M. S., Williams, E. B., & Rolstad, R. A. (1981). Purification and
substrate specificity of bovine angiotensin-converting enzyme. Journal of
Biological Chemistry, 256(1), 225–230.
Roostita, L. B., Putranto, W. S., & Zaenal Mustofa, A. (2013). Pemanfaatan Yeast
(Khamir) Sebagai Biopreservasi Pangan Yang Ramah Lingkungan. In
Prosiding Seminar. Jakarta (pp. 7–8).
Ryan, J. T., Ross, R. P., Bolton, D., Fitzgerald, G. F., & Stanton, C. (2011).
Bioactive peptides from muscle sources: Meat and fish. Nutrients, 3(9), 765–
73
791. https://doi.org/10.3390/nu3090765
Saito, T., Nakamura, T., Kitazawa, H., Kawai, Y., & Itoh, T. (2000). Isolation and
Structural Analysis of Antihypertensive Peptides That Exist Naturally in
Gouda Cheese. Journal of Dairy Science, 83(7), 1434–1440.
https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(00)75013-2
Salmenkari, H., Holappa, M., Forsgard, R. A., Korpela, R., & Vapaatalo, H.
(2017). Orally administered angiotensin-converting enzyme-inhibitors
captopril and isoleucine-proline-proline have distinct effects on local renin-
angiotensin system and corticosterone synthesis in dextran sulfate sodium-
induced colitis in mice. Journal of Physiology and Pharmacology, 68, 355–
362.
Savijoki, K., Ingmer, H., & Varmanen, P. (2006). Proteolytic systems of lactic
acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol, 71, 394–406.
https://doi.org/10.1007/s00253-006-0427-1
Scopes, R. K. (1994). Protein Purification: Principles and Practice (3rd ed.).
New York: Springer Press.
Shewry, P. R., & Halford, N. G. (2002). Cereal seed storage proteins: structures,
properties and role in grain utilization. J Exp Bot, 53(370), 947–958.
https://doi.org/10.1093/jexbot/53.370.947
Siemerink, M., Schebb, N. H., Lienser, A., Perchuc, A.-M., Schoni, R., Wilmer,
M., … Vogel, M. (2010). Development of a fast liquid chromatography/mass
spectrometry screening method for angiotensin- converting enzyme (ACE)
inhibitors in complex natural mixtures like snake venom. Rapid Commun.
Mass Spectrom, 24(24), 3567–3577. https://doi.org/10.1002/rcm
Sisriyenni, D., & Zurriyati, Y. (2004). Kajian kualitas dadih susu kerbau di dalam
tabung bambu dan tabung plastik. Jurnal Pengkajian Dan Pengembangan
Teknologi Pertanian, 7(2), 171–179.
Soenarno, M. S., Polii, B. N., Febriantosa, A., & Hanifah, R. (2013). Identifikasi
Peptida Bioaktif dari Olahan Susu Fermentasi Tradisional Indonesia Sebagai
Bahan Pangan Fungsional untuk Kesehatan Biopeptide Identification of
Indonesian Fermented and Processed Milk as Functional Food, 01(3), 191–
195.
Stadnik, J., & Keska, P. (2015). Meat and fermented meat products as a source of
bioactive peptides. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 14(3), 181–90.
https://doi.org/10.17306/J.AFS.2015.3.19
Sugitha, I. M. (1995). Dadih makanan tradisional Minang. Manfaat dan
khasiatnya. Dalam Widyakarya Nasional Khasiat Makanan Tradisional.
Kantor Menteri Negara Urusan Pangan RI. Jakarta. Hal, 532–540.
Surono, I. S. (2015a). Indonesian Dadih. In A. K. Puniya (Ed.), Fermented Milk
74
and Dairy Products (First, pp. 377–399). CRC Press. Retrieved from
https://www.researchgate.net/publication/289557326
Surono, I. S. (2015b). Traditional Indonesian dairy foods. Asia Pac J Clin Nutr,
24(December), 26–30. https://doi.org/10.6133/apjcn.2015.24.s1.05
Surono, I. S. (2016). Ethnic Fermented Food and Beverages of Indonesia. Jakarta.
https://doi.org/10.1007/978-81-322-2800-4
Surono, I. S., & Hosono, A. (1996). Antimutagenicity of milk cultured with lactic
acid bacteria from dadih against mutagenic Terasi. Milchwissenschaft, 51,
493.
Surono, I. S., & Hosono, A. (2000). Performance of dadih lactic cultures at low
temperature milk application. In Proceeding of The Ninth Animal Science
Congress of AAAP. Asian-Aust. J. Anim. Sci (Vol. 13, pp. 495–498).
Surono, I. S., & Nurani, D. (2001). Exploration of indigenous dadih lactic bacteria
for probiotic and starter cultures. Domestic Research Collaboration Grant-
URGE-IBRD World Bank.
Surono, I. S., Saono, J. K. D., Tomomatsu, A., Matsuyama, A., & Hosono, A.
(1983). Traditional milk products made from buffalo milk by use of higher
plants as coagulants in Indonesia. Jap. J. Dairy Food Sci, 32.
Usmiati, S., Broto, W., & Setiyanto, H. (2011). Karakteristik Dadih Susu Sapi
yang Menggunakan Starter Bakteri Probiotik. JITV, 16(2), 140–152.
Walther, B., & Sieber, R. (2011). Serum 25-Hydroxyvitamin D Levels in Subjects
with Reduced Glucose Tolerance and Type 2 Diabetes – The Tromsø OGTT-
Study. International Journal of Vitamin and Nutrition Research, 81(5), 317–
327. https://doi.org/10.1024/0300
WHO. (2012). Noncommunicable Diseases. New Delhi.
https://doi.org/10.1056/NEJMra1109345
WHO. (2013). A global brief on Hypertension : Silent killer, global public health
crisis. Geneva: WHO Press. Retrieved from
www.who.int/about/licensing/copyright_form/en/index_html
Widodo. (2003). Bioteknologi Industri Susu. Depok: Leticia Press.
Wijesekara, I., & Kim, S. (2010). Angiotensin-I-Converting Enzyme ( ACE )
Inhibitors from Marine Resources : Prospects in the Pharmaceutical Industry,
1080–1093. https://doi.org/10.3390/md8041080
Wu, H., He, H. L., Chen, X. L., Sun, C. Y., Zhang, Y. Z., & Zhou, B. C. (2008).
Purification and identification of novel angiotensin-I-converting enzyme
inhibitory peptides from shark meat hydrolysate. Process Biochemistry,
43(4), 457–461. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2008.01.018
75
Xin, Z. H., Ma, H. L., Wu, S. Y., & Dai, C. H. (2003). Determination of the
inhibitory activity of angiotensin-converting enzyme inhibitor captopril by
high performance capillary electrophoresis. Yao Xue Xue Bao= Acta
Pharmaceutica Sinica, 38(11), 843–845.
Yamamoto, N. (1997). Antihypertensive Peptides Derived from Food Protein.
Biopoly, 43, 129–134.
Yamamoto, N., Akino, A., & Takano, T. (1994). Antihypertensive effect of the
peptides derived from casein by an extracellular proteinase from
Lactobacillus helveticus CP790. Journal of Dairy Science, 77(4), 917–922.
Yamamoto, N., Maeno, M., & Takano, T. (1999). Purification and
Characterization of an Antihypertensive Peptide from a Yogurt-Like Product
Fermented by Lactobacillus helveticus CPN4. Journal of Dairy Science,
82(7), 1388–1393. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(99)75364-6
Yamamoto, N., & Takano, T. (1999). Antihypertensive peptides derived from
milk proteins. Die Nahrung, 43(3), 159–164.
https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-3803(19990601)43:3<159::AID-
FOOD159>3.0.CO;2-R
Yurliasni, Zakaria, Y., & Usman, Y. (2014). Nilai Nutrisi Dadih yang
ditambahkan Khamir Asal Dadih ( Nutritive value of dadih added with yeast
of dadih origin ), 14(2), 139–146.
Yusuf, I. (2008). Hipertensi Sekunder. Medical Review, 21(3), 71–79.
76
LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil freeze-dry susu kerbau fermentasi
77
Lampiran 2. Data analisis RP-HPLC dan LCMS dari eluat katrid HLB
a. Hasil fraksinasi RP-HPLC HLB Metanol 0 %
- Data spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 215 nm
- Data kromatogram LCMS
78
b. Hasil fraksinasi RP-HPLC HLB Metanol 25 %
- Data spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 215 nm
- Data kromatogram LCMS
79
c. Hasil fraksinasi RP-HPLC HLB Metanol 50 %
- Data spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 215 nm
- Data kromatogram LCMS
80
Lampiran 3. Data aktivitas ACE inhibitor fraksi air
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.232 0.102
2 0.232 0.1
1 0.277 0.099
2 0.276 0.103
1 0.315 0.104
2 0.291 0.097
1 0.313 0.09
2 0.311 0.095
1 0.327 0.112
2 0.31 0.112
5
2.5
1.25
0.625
Konsentrasi (mg/mL)
0.3125
0.351
0.347
0.232
0.2765
0.303
0.312
0.3185
UlanganAbsorbansi
IC50
5.350799053
47.177
29.234
18.511
14.425
12.289
0.101
0.101
0.1005
0.0925
0.112
0.349
Rerata Absorbansi% Inhibisi
y = 7.5214x + 9.7545
R² = 0.9989
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6
Ak
tiv
ita
s P
engh
am
ba
tan
AC
E
(%)
Konsentrasi (mg/mL)
Aktivitas Penghambatan ACE Dadih Fraksi Air
% Inhibisi
Linear (% Inhibisi)
47.177
29.234
18.511
14.42512.289
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2 4 8 16
Akti
vit
as P
engham
bat
an A
CE
(%
)
Faktor Pengenceran
81
Lampiran 4. Data aktivitas ACE inhibitor fraksi etanol
Contoh perhitungan % inhibisi dari fraksi etanol 75 %
% inhibisi = (𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)
(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜) 𝑥 100%
= (0,247 − 0,164)
(0,247−0,1285) 𝑥 100%
= 70,042 %
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.236 0.115
2 0.244 0.13
1 0.156 0.118
2 0.172 0.139
1 0.219 0.126
2 0.214 0.134
1 0.262 0.14
2 0.257 0.146
1 0.279 0.133
2 0.297 0.137
0.2165 0.13 26.0680.247
Etanol 25% 0.2595 0.143 0
Etanol 99.5%
0.247
0.24 0.1225
0.247
5.622
Etanol 75% 0.164
Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
0.1285
Etanol 0% 0.288 0.135 0
70.042
Etanol 50%
82
Lampiran 5. Data aktivitas ACE inhibitor eluat katrid HLB metanol
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.27 0.115
2 0.261 0.13
1 0.23 0.118
2 0.231 0.139
1 0.127 0.126
2 0.155 0.134
1 0.18 0.14
2 0.191 0.146
1 0.167 0.133
2 0.141 0.137
Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
18.309
Metanol 50% 0.141 0.13 78.3050.262
Metanol 100%
0.251
0.2655 0.1225
0.2565
0
Metanol 25% 0.1855 0.143 43.827
Metanol 0% 0.154 0.135 64.873
Metanol 75% 0.2305 0.1285
83
Lampiran 6. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap
pertama
a. HLB Metanol 0 %
b. HLB Metanol 25 %
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.297 0.089
2 0.29 0.09
1 0.099 0.099
2 0.099 0.099
1 0.216 0.091
2 0.216 0.1
1 0.271 0.101
2 0.271 0.112
1 0.335 0.104
2 0.344 0.094
1 0.325 0.105
2 0.325 0.10310
5 0.0895 0
6 0.099 94.656
7 0.0955 36.41
8 0.1065 7.84
9 0.099 0
0.271
0.3395
UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
Waktu Retensi (menit) Fraksi % Inhibisi
2 - 2.5 0.2935
2.5 - 3 0.099
3 - 3.5 0.2160.292
0.2780.285
3.5 - 4
4 - 4.5
4.5 - 5 0.325 0.104 0
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.249 0.104
1 0.193 0.099
1 0.214 0.112
1 0.237 0.111
1 0.25 0.112
1 0.195 0.112
1 0.267 0.109
1 0.215 0.104
1 0.225 0.111
1 0.282 0.1
0.267 0.109
0.282 0.1 0
4.5 - 5 10 0.237 0.111 12.803
6 - 6.5 13 0
6.5 - 7 14 0.215 0.104 26.733
7 - 7.5 15 0.225 0.111 21.11
7.5 - 8 16
5 - 5.5 11 0.25 0.112 3.83
5.5 - 6 12 0.195 0.112 42.16
0.255
0.2560.2555
3.5 - 4 8 0.193 0.099 39.94
4 - 4.5 9 0.214 0.112 28.92
Waktu Retensi (menit) Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
3 - 3.5 7 0.249 0.104 4.29
84
c. HLB Metanol 50 %
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.243 0.092
1 0.255 0.098
1 0.218 0.103
1 0.275 0.097
1 0.231 0.094
1 0.238 0.101
1 0.219 0.106
1 0.226 0.102
1 0.193 0.104
1 0.274 0.106
5 - 5.5 11
5.5 - 6 12
7 - 7.5 15
Waktu Retensi (menit) Fraksi
0.219
0.226
0.193
0.274 0.106
0.104
0.102
0.106
0.231 0.094
0.255 0.098
6.5 - 7 14 0.275 0.097 0
12.74
7.5 - 8 160.251
0.238 0.101 8.67
8 - 8.5 22.7
8.5 - 9 16.78
9 - 9.5 39.46
9.5 - 10 0
17
18
19
20
0
6 - 6.5 13 0.218 0.103 22.3
0.251
0.243 0.092
0.251
5.03
% InhibisiUlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
85
Lampiran 7. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap kedua
a. Fraksinasi RP-HPLC 1
Fraksi A
Fraksi B
Fraksi C
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
Rerata Absorbansi% Inhibisi
0.249
0.09 17.61
33.133
8.75
0.221
0.194
0.235
0.251
0.232
0.09
0.083
0.089
0.095
0.113
0.221
0.194
0.235
0.251
0.089
0.083
0.095 0
4.0 - 5.0 0.232 0.113 12.5
1
2
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi
0.0 - 1.0
0.249
1.0 - 2.0
2.0 - 3.00.249
3.0 - 4.0
3
4
5
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.255 0.103
0.233 0.105
0.257 0.11
0.262 0.105
0.257 0.11 1.34
3.0 - 4.0 4 0.262 0.105 0
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
0.0 - 1.0 1
0.259
0.255 0.103
0.259
2.56
1.0 - 2.0 2 0.233 0.105 16.88
2.0 - 3.0 30.259
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.214 0.1
1 0.224 0.101
1 0.21 0.1
1 0.249 0.108
1 0.253 0.105
1 0.21 0.11
1 0.226 0.123
1 0.191 0.118
1 0.241 0.117
1 0.24 0.116
Waktu Retensi (menit) Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
0.0 - 1.0 1
0.246
0.214 0.1
0.246
21.918
1.0 - 2.0 2 0.224 0.101 15.172
2.0 - 3.0
8 0.191 0.118 42.969
8.0 - 9.0 9 0.241
3 0.21 0.1 24.658
3.0 - 4.0 4 0.249 0.108 0
0.117 3.876
9.0 - 10.0 10 0.24 0.116 4.615
4.0 - 5.0 5 0.253 0.105 0
5.0 - 6.0 60.246
0.21 0.11 26.471
6.0 - 7.0 7 0.226 0.123 16.26
7.0 - 8.0
86
Fraksi D
b. Fraksinasi RP-HPLC 2
Fraksi A
Fraksi B
Fraksi C
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.257 0.109
0.26 0.108
0.255 0.108
0.243 0.109
0.224 0.106
0.221 0.107
0.25 0.112
0.246 0.112
0.2560.2225 0.1065 18.881
11.0 12.0 12 0.248 0.112 1.09
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
8.0 - 9.0 9
0.243
0.2585 0.1085
0.2495
0
9.0 - 10.0 10 0.249 0.1085 0.355
10.0 - 11.0 11
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.296 0.096
0.29 0.096
0.266 0.1
0.282 0.105
0.326 0.1
0.307 0.102
21.69
0.3165 2.27
0.322
0.3210.32151.8 - 2.2 AII 0.1025
2.2 - 3.0 AIII 0.101
Absorbansi Rerata Absorbansi
0.293
0.274
Waktu Retensi (menit) Fraksi
1.4 - 1.8 AI 0.096
% Inhibisi
12.64
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.255 0.103
2 0.248 0.104
1 0.285 0.111
2 0.278 0.11
1 0.259 0.108
2 0.262 0.111
1 0.224 0.116
2 0.238 0.115
1 0.252 0.102
2 0.227 0.106
1 0.24 0.107
2 0.245 0.104
Waktu Retensi (menit) Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
2.6 - 2.9 BI
0.284
0.2515 0.1035
0.284
18.006
2.9 - 3.2 BII 0.2815 0.1105 1.44
3.2 - 3.4 BIII 0.2605 0.1095 13.467
3.4 - 3.9 31.454
3.9 - 5.0 BV 0.2395 0.104 27.722
5.0 - 6.0 BVI 0.2425 0.1055 23.249
BIV0.284
0.231 0.1155
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.23 0.113
0.239 0.114
0.251 0.109
0.244 0.116
0.216 0.105
0.21 0.109
0.265 0.114
0.27 0.114
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
4.8 - 5.3 CI
0.264
0.2345 0.1135
0.2655
23.684
5.3 - 5.6 CII 0.2475 0.1125 11.765
5.6 - 5.9 CIII0.267
0.213 0.107 33.123
5.9 - 6.3 CIV 0.2675 0.114 0
87
Fraksi D
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.307 0.102
0.317 0.102
0.295 0.103
0.307 0.112
0.285 0.106
0.275 0.106
0.257 0.107
0.263 0.106
0.296 0.108
0.286 0.118
0.3220.3215
0.321
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
8.6 - 8.8 DI 0.312 0.102 4.328
8.8 - 8.95 DII 0.301 0.1075 9.579
8.95 - 9.1 DIII 0.28 0.106 19.258
9.1 - 9.3
9.3 - 9.6 DV 0.291 0.113 14.628
DIV 0.26 0.1065 28.605
88
Lampiran 8. Data aktivitas ACE inhibitor dari Fraksinasi RP-HPLC tahap ketiga
Fraksi A
Fraksi B
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.353 0.103
0.347 0.1
0.312 0.103
0.307 0.104
0.349 0.102
0.349 0.102
0.319 0.101
0.316 0.1010.9 - 1.1 AII 0.3175 0.101 12.07
0.3490.351
0.347
0.8 - 1.2 AI-2 0.3095 0.1035 16.09
2.5 - 2.9 AI-3
0.4 - 0.8 AI-1 0.35 0.1015 0.404
Waktu Retensi (menit)
0.349 0.102 0
FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
0.254 0.102
0.234 0.105
0.257 0.105
0.254 0.102
0.248 0.098
0.234 0.102
Waktu Retensi (menit) FraksiAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
1.3 - 1.7 BIV-1
0.297
0.244 0.1035
0.3025
29.397
1.8 - 2.0 BIV-2 0.2555 0.1035 23.6180.308
2.8 - 3.2 BIV-3 0.241 0.1 30.37
89
Lampiran 9. Data aktivitas ACE inhibitor oleh peptida sintesis
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.245 0.09
2 0.221 0.1
1 0.256 0.093
2 0.265 0.092
1 0.198 0.096
2 0.194 0.09
1 0.232 0.097
2 0.265 0.097
1 0.226 0.095
2 0.235 0.094
1 0.118 0.103
2 0.115 0.106
STPTTE 0.2485 0.097 16.529
Fraksi UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi
LPV 0.233 0.095 24.796
0.1165 0.1045
GVSKVK 0.2305 0.0945 26.087
0.274
0.2830.2785
AVRSPAQ
VEPT 0.2605 0.0925 9.6774
SLSQS 0.196 0.093 44.474
93.103
90
Lampiran 10. Data aktivitas ACE inhibitor heptapeptida AVRSPAQ
Penentuan nilai IC50 heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-Ala-Gln
y = 12,859 ln(x) + 1,9312
y = 50 % dan x = IC50
ln(x) = (𝑦 − 𝑏)
𝑎
ln(IC50) = 50−1,9312
12,859
ln(IC50) = 3,73814449
IC50 = e3,73814449
= 42,01994935
Sampel Blanko Kontrol Sampel Blanko Kontrol
1 0.255 0.111
2 0.254 0.093
1 0.245 0.105
2 0.226 0.099
1 0.214 0.097
2 0.211 0.097
1 0.205 0.104
2 0.196 0.097
1 0.185 0.107
2 0.181 0.091
Konsentrasi (µM) UlanganAbsorbansi Rerata Absorbansi
% Inhibisi IC50
5
0.297
0.2545 0.102
0.297
21.795
42.0199
10 0.2355 0.102
40 0.2005 0.1005 49.109
80 0.183 0.099 57.576
31.538
20 0.2125 0.097 42.250.297
y = 12.859ln(x) + 1.9312
R² = 0.99440
10
20
30
40
50
60
70
0 20 40 60 80 100
AK
tivit
as
Pen
gh
am
bata
n (
%)
Konsentrasi (µM)
Aktivitas ACE inhibitor Heptapeptida AVRSPAQ
ACE inhibitory activity
Log. (ACE inhibitory
activity)
91
Lampiran 11. Prosedur penambahan bahan uji aktivitas ACE inhibitor
Keterangan Blanko
(µL)
Kontrol
(µL)
Sampel
(µL)
Peptida Antihipertensi 15 - 15
Akuades - 15 -
Substrat HHL 125 125 125
BSA 10 mg/mL 10 10 10
ACE 50 mU - 50 50
Akuades 50 - -
HCl 125 125 125
Etil Asetat 750 750 750
Total 1.075 1.075 1.075
92
Lampiran 12. Data aktivitas ACE inhibitor susu fermentasi menggunakan BAL
berbeda
Sumber: Pihlanto et al. (2010)
93
Lampiran 13. Data spektoskopi massa fraksi BIV-3
94
Lampiran 14. Pembuatan Larutan Substrat HHL 7,6 mM dan NaCl 608 mM
sebanyak 5 mL (35 tabung uji)
NaCl 608 mM (0,608 M)
𝑀 = 𝑚
𝑀𝑅𝑥
1000
𝑉
0,608 𝑀 = 𝑚
58,5 𝑔/𝑚𝑜𝑙𝑥
1000
5 𝑚𝐿
𝑚 = 0,608 𝑀 𝑥 58,5
𝑔𝑚𝑜𝑙
𝑥 5 𝑚𝐿
1000
𝑚 = 0,17784 𝑔
HHL 7,6 mM (0,0076 M)
Dengan asumsi 12 % atau 0,6 mL air sudah mampu melarutkan sempurna
NaCl, sehingga volume yang mampu melarutkan HHL sebanyak 4,4 mL.
𝑀 = 𝑚
𝑀𝑅𝑥
1000
𝑉
0,0076 𝑀 = 𝑚
429,47 𝑔/𝑚𝑜𝑙𝑥
1000
4,4 𝑚𝐿
𝑚 = 0,0076 𝑀 𝑥 429,47
𝑔𝑚𝑜𝑙
𝑥 4,4 𝑚𝐿
1000
𝑚 = 0,014361 𝑔
Prosedur lembuatan larutan substrat
1. Ditimbang sebanyak 0,014361 g HHL dan 0,17784 g NaCl.
2. HHL dan NaCl dimasukkan ke dalam gelas kimia 10 mL.
3. Campuran dilarutkan dengan menggunakan larutan buffer borat pH 8,3
dalam keadaan dingin.
4. Campuran larutan substrat diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut
sempurna.
95
Lampiran 15. Pembuatan larutan BSA dan larutan ACE
Pembuatan Larutan BSA 10 mg/mL (Sediaan larutan BSA sebanyak 50 mL)
Konsentarsi Larutan BSA = Massa BSA
Volume Air
= 500 mg
50 mL
= 10 mg/mL
Pembuatan Sediaan Larutan ACE 50 mU (Dalam Larutan BSA 10 mg/mL)
- Persamaan/rumus pengenceran
𝑉1𝑥𝑀1 = 𝑉2𝑥𝑀2
1 𝑚𝐿𝑥1000 𝑚𝑈 = 𝑉2𝑥50 𝑚𝑈
𝑉2 = 1000 𝑚𝑈. 𝑚𝐿/50 𝑚𝑈
𝑉2 = 20 𝑚𝐿
Keterangan: V1 = Volume awal larutan ACE
V2 = Volume akhir larutan ACE
M1 = Konsentrasi awal larutan ACE
M2 = Konsentrasi larutan ACE yang diinginkan
Volume akhir larutan ACE dengan konsentrasi 50 mU adalah 20 mL dari
sediaan larutan ACE 1 mL dengan konsentrasi 1000 mU (1 U). Larutan
pengenceran menggunakan larutan BSA 10 mg/mL.
96
Lampiran 16. Produk degradasi Edman dari heptapeptida Ala-Val-Arg-Ser-Pro-
Ala-Gln
Keterangan : 1. N-feniltiohidantoin-alanin
2. N-feniltiohidantoin-valin
3. N-feniltiohidantoin-arginin
4. N-feniltiohidantoin-serin
5. N-feniltiohidantoin-prolin
6. N-feniltiohidantoin-alanin
7. N-feniltiohidantoin-glutamin
![ARTIODACTYLA - trafficj.org · [Lowland Anoa] Bubalus mindorensis . ミンドロスイギュウ (タマラオ) [Tamaraw; Tamarou; Mindoro Buffalo ] Bubalus quarlesi . ヤマアノア](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5b7e15ec7f8b9ac7298ba16a/artiodactyla-lowland-anoa-bubalus-mindorensis-.jpg)
